JPH11313674A - ヒトbmp−4プロモーターおよびこれを用いた骨関連物質の探索法 - Google Patents

ヒトbmp−4プロモーターおよびこれを用いた骨関連物質の探索法

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JPH11313674A
JPH11313674A JP10120173A JP12017398A JPH11313674A JP H11313674 A JPH11313674 A JP H11313674A JP 10120173 A JP10120173 A JP 10120173A JP 12017398 A JP12017398 A JP 12017398A JP H11313674 A JPH11313674 A JP H11313674A
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Shinji Kawai
伸治 河合
Takeyuki Sugiura
健之 杉浦
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Sanofi Aventis KK
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Nippon Hoechst Marion Roussel Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトBMP蛋白質と同等の骨形成活性または
骨形成阻害活性を有する低分子化合物を探索する方法を
提供することを目的とする。 【解決手段】 ヒトBMP−4プロモーターを含んだ
5′上流遺伝子と適切なレポーター遺伝子を連結させた
組換え発現ベクターを導入した動物細胞を用いて、レポ
ーター活性を指標にしてヒトBMP−4の発現を正また
は負に制御する低分子化合物を探索する方法。本法によ
り得られた低分子化合物およびその誘導体は、ヒトBM
P−4の発現を介した骨・軟骨誘導活性もしくは阻害活
性を有し、骨、軟骨疾患予防・治療剤として有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト骨誘導因子(bone
morphogenetic protein:以降BMPと呼ぶ)−4のプ
ロモーターを含んだ5′上流遺伝子に関する。また、本
発明はヒトBMP−4プロモーターを含んだ5′上流遺
伝子と適切なレポーター遺伝子に組み込んだ組換え発現
ベクターを動物細胞または酵母に導入した細胞集団を用
いて、レポーター活性を指標にしてヒトBMP−4の発
現を正または負に制御する低分子化合物を探索する方法
に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現
在、TGF(transforming growth factor)−βスーパ
ーファミリーに属する骨誘導因子BMPには骨誘導作用
があることが報告されている(Science 150,893-897, 1
965、Science 242, 1528-1534, 1988)。BMPは、B
MP−1からBMP−14まで存在が知られているが、
そのうちBMP−2からBMP−14に骨誘導作用が確
認されている。BMP−2からBMP−14はさまざま
な骨障害、骨疾患の治療・予防に有効と考えられるが、
天然には微量にしか存在せず、治療に使用するよう大量
に入手するためには、組換え型蛋白質を生産する必要が
ある。一般的に、組換え型蛋白質の生産は低分子化合物
の生産よりはるかに多くの費用を要する。また、蛋白質
であるという特性から、医薬品としての物性、投与方法
にも制約がある。こういった点を考慮すると、上記BM
P蛋白質と同等の活性を有した低分子有機化合物が存在
すれば、それはきわめて魅力的な医薬品となることが予
想される。本発明が提供する探索法によって得られる物
質は、骨誘導因子ヒトBMP−4の発現を誘導する効果
を有するので、低分子でありながらヒトBMP−4と同
等の効果を持ちあわせており、極めて有用性が高いと考
えられる。逆にヒトBMP−4が骨・軟骨の過剰形成に
関与している事を示唆した報告(N. Engl. J. Med. 33
5, 555-561, 1996)もある。この場合、ヒトBMP−4
発現を抑制すれば骨過剰形成症を防ぐことができると考
えられる。本発明はヒトBMP−4の発現を抑制し、そ
ういった過剰形成症を防ぐ物質の探索方法をも提供す
る。
【0003】これまで、こういった探索方法としてはマ
ウスBMP−2プロモーターを利用した例が報告(WO97
/15308)されているのみであり、ヒトBMP−4プロ
モーターを利用した例はない。また、マウスBMP−4
プロモーター領域は既にクローニングされているが(Bi
ochemi. Biophys. Acta 1218, 221-224, 1994)、ヒト
BMP−4プロモーター配列はいまだ明らかにされてい
ない。本発明で初めてヒトBMP−4プロモーター配列
を開示した。BMP−4の5′上流DNA全配列のヒト
およびマウス(J. Biol. Chem. 270,28364-28373, 199
5)間の相同性(ホモロジー)は52.2%である。本発
明が提示する探索方法における組換え発現ベクターは、
全てヒト由来のものを使用することが可能であるため、
探索によって得られた物質は実際の臨床でも有効であ
る。さらに我々の構築した組換え発現ベクターは、ヒト
BMP−4遺伝子5′上流域に存在すると考えられる二
種類のプロモーター(プロモーター1およびプロモータ
ー2)を別々もしくは同時に細胞に導入することを可能
にするので、ヒトBMP−4のより精緻な発現制御を可
能にする物質を獲得することが期待できる。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明は配列表配列番号
1において、1番から6774番までの塩基配列を有す
るヒトBMP−4プロモーター領域を含んだDNA、ま
たはそれらの断片に関する。配列表配列番号1はヒトB
MP−4遺伝子の5′上流配列を示す。本発明は配列表
配列番号1のDNAを下記の順により製造する方法に関
する。 (1) 制限酵素EcoRIによるヒト胎盤ゲノムDNA
の消化、(2) アガロースゲル電気泳動による分離、
(3) 分離したEcoRI消化DNA断片の、同酵素で
処理したラムダファージベクターλDASH IIへのクロー
ニング、(4) 上記ベクターのファージへのパッケージ
ング、(5) 大腸菌への感染、ゲノムDNAライブラリ
ー作成、(6) PCR法によるスクリーニング、(7)
プラスミドベクターへのサブクローニング。ここで使用
されるプラスミドベクターには制限がなく、市販されて
いるベクターを使用できる。好ましい例として、pUC
18がある。
【0005】本発明は配列表配列番号1のDNA全長、
あるいは一部をレポーター遺伝子に組み込まれているこ
とを特徴とする組換え発現ベクターに関する。詳しく
は、配列表配列番号1で示されるヒトBMP−4遺伝子
の5′上流遺伝子の適切な領域をレポーター遺伝子の上
流に配置した組換え発現ベクターを構築する。レポータ
ー遺伝子とは本来の生産物の代わりに発現状況を示すも
ので、例えばルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子等が挙げられる。組換え発現ベクターを構築
する基となるベクターに関しては特に制限はなく、市販
のプラスミドベクターを用いることが出来る。好ましい
例として本発明ではpGL3−basicを用いた。pGL
3−basicを用い、ヒトBMP−4プロモーターとルシ
フェラーゼレポーター遺伝子を含んだ組換え発現ベクタ
ーpMSS116(8.2kb)、pMSS118(7.
1kb)およびpMSS119(10.5kb)を得
た。本発明では、これらを組換え発現ベクターとした。
これらベクターをリポソームなどにより、哺乳類細胞、
好ましくはヒト骨芽細胞様細胞、例えばSaOS−2細
胞に導入する必要がある。組換え発現ベクターを導入し
た動物細胞は、耐性マーカーなどを用いて安定発現する
ように選択される。
【0006】本発明は、配列表配列番号1のDNA全
長、あるいは一部をレポーター遺伝子に組み込まれてい
ることを特徴とする組換え発現ベクターを用いた骨関連
物質の探索方法に関する。骨関連物質が骨形成誘導物質
または骨関連物質が骨形成阻害物質である検索方法に関
する。ヒトBMP−4発現を誘導もしくは抑制する低分
子化合物を得るには、この遺伝子発現を調節しているプ
ロモーターを単離し、適切なレポーター遺伝子に連結
し、得られた構造体を適切な哺乳類細胞に導入して検定
系とする方法が考えられる。この検定系中でヒトBMP
−4の発現を調節する物質はプロモーターに作用し、レ
ポーター遺伝子の発現を上昇または下降させるので、簡
単、簡便なレポーター活性の測定によって目的とする物
質の探索を行うことができる。
【0007】上記ベクターを遺伝子導入した動物細胞
は、ハイスループットスクリーニング(high through p
ut screening, Nature, 384, supp, 14-16, 1996)など
を用いた化合物ライブラリー、天然物からの活性物質探
索法として使用できる。この細胞を化合物で適当な時間
処理し、レポーター活性を測定し、活性を上昇もしくは
下降させる物質を探索する。こうして得られた化合物
は、例えば転写因子に作用して直接もしくはシグナル伝
達系の制御により間接的にヒトBMP−4のプロモータ
ーに作用することにより、その発現を調節することがで
きる。よって、これら化合物は、骨・軟骨疾患予防・治
療剤、もしくは骨転移阻害剤、骨形成過剰症予防・治療
剤として有効である。
【0008】本発明で得られる物質は、骨あるいは軟骨
誘導活性を有するため、整形外科領域(骨折、変形性膝
関節症、変形性股関節症などの変形性関節症、骨関節
炎、半月板損傷などの軟骨損傷、外傷、腫瘍摘出などに
よる骨、軟骨欠損部の再生、脊椎固定術、脊柱管拡大術
などの骨再建、骨形成不全症、軟骨無形成症などの先天
性軟骨、骨疾疾患)または、歯科領域(口蓋裂、下顎骨
再建術、歯槽堤形成術などの骨再建)、さらには骨粗鬆
症などの予防および治療剤として有効である。さらに
は、本発明の物質は美容外科の骨移植の治療などに用い
ることができる。これらの治療には獣医外科領域の治療
等として有効である。一方、本発明により骨あるいは軟
骨誘導阻害物質を得ることも可能である。この場合、骨
・軟骨形成過剰症予防・治療剤として適用される。
【0009】
【実施例】次に実施例を示して、本発明の効果を具体的
に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定
されるものではない。 実施例1 ヒトBMP−4の5′上流遺伝子の単離 数種類の制限酵素(BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, Ps
tI, SacI, SalI, SmaI, SphI, XbaI)を用いてヒ
ト胎盤ゲノムDNA(クロンテック社製品)を消化し、
アガロースゲル電気泳動により分離後、ナイロンメンブ
レンに移し、BMP−4 cDNA(Science, 242, 152
8-1534, 1988)をプローブとして標準的な条件下でサザ
ンハイブリバイゼーションを行った。その結果、使用し
た制限酵素中で、制限酵素EcoRIで消化した場合
に、最長なヒトBMP−4遺伝子を含む約7kbのDN
A断片が得られることが判明した。そこで、ヒト胎盤ゲ
ノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、アガロース
ゲル電気泳動により分離後、約7kb周辺のDNA断片を
アガロースゲルから抽出した。得られたDNA断片は制
限酵素EcoRIで消化したラムダファージベクターλ
DASH II(ストラタジーン社製品)にクローニングし
た。このベクターを Gigapack III XL Extract(ストラ
タジーン社製品)によりin vitroパッケージングし、大
腸菌XL1−Blue MRA(ストラタジーン社製品)に感染さ
せ、ゲノムDNAライブラリーとした。このライブラリ
ーをプールに分け、PCRを用いたスクリーニング法
(Nucleic Acids Research 21, 2627-2631, 1993)、す
なわち、エクソン1に相当する領域に対するPCRプラ
イマー(配列表配列番号2および3)で各プールをPC
R増幅することにより、目的のプールを選択する方法
で、最終的にBMP−4の5′上流遺伝子6.8kbを
獲得した。さらに、この5′上流6.8kb断片をpU
C18ベクター(ファルマシアバイオテク社製品)にサ
ブクローニングした。このベクターを E.coli pKOT 312
と名づけた。E.coli pKOT 312 は 1998年3月30日付け
で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
番号 FERM P−16736として寄託された。
【0010】実施例2 ヒトBMP−4の5′上流遺伝
子のDNA塩基配列決定 得られたヒトBMP−4の5′上流遺伝子のDNA塩基
配列決定は、サンガーらの方法(Proc.Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 74, 5463-5467, 1977)に従い、ファルマシ
ア・バイオテク ALF DNAシークエンサーにて行っ
た。得られた配列を配列表配列番号1に記載する。
【0011】実施例3 ヒトBMP−4プロモーターと
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含んだ組換え発現ベ
クターの構築 図1に示す如く、ヒトBMP−4のプロモーターはマウ
スBMP−4のプロモーター構造と同様にエクソン1の
前(プロモーター1)とエクソン2の前(プロモーター
2)の2つのプロモーターを持つ。そこで、プロモータ
ー1を含んだ領域(図1記載の5′末端からXhoIま
で)を、5′末端に存在するpUC18ベクター由来の
XbaI制限酵素部位を利用して、ルシフェラーゼレポ
ーターベクターpGL3−basic(プロメガ社製品)の
レポーター遺伝子の上流制限酵素部位NheIとXho
Iに挿入し、組換え発現ベクターpMSS116(8.
2kb)を構築した。これを図2に示す。また、プロモ
ーター2を含んだ領域(図1記載のXhoIからエクソン
2中のBglIIまで)をpGL3−basicの制限酵素部位X
hoIとBgl IIに挿入して組換え発現ベクターpM
SS118(7.1kb)を得た。これを図3に示す。
さらに、プロモーター1とプロモーター2の両方を含ん
だ領域(図1記載の5′末端からエクソン2中のBglII
まで)を、pMSS116の場合と同様、pUC18ベ
クター由来のXbaI部位を利用してpGL3−basicの制
限酵素部位NheIとBgl IIに挿入し、組換え発現
ベクターpMSS119(10.5kb)を構築した。
これを図4に示す。
【0012】実施例4 ヒトBMP−4プロモーター活
性の測定(組換え発現ベクターのヒト細胞への導入と一
過性発現) ヒトBMP−4組換え発現ベクターを一過性発現させる
ために、上記の各組換え発現ベクター(pMSS11
6、pMSS118およびpMSS119)と遺伝子導
入効率測定用の内部コントロールとしてのシーパンジー
ルシフェラーゼ遺伝子を含んだベクターpRL−SV4
0(プロメガ社製品)を等量混合した。さらに、カチオ
ニックリポソームリポフェクタミン Lipofectamine(ラ
イフテックオリエンタル社製品)と上記DNA溶解液を
混合し、ヒト骨肉腫細胞HOS、MG63、およびSa
OS−2に添加し、トランスフェクションした。ホタル
・ルシフェラーゼ活性およびシーパンジー・ルシフェラ
ーゼ活性はピッカジーンデュアルキット(東洋インキ製
品)によって測定した。この結果を図5に示す。プロモ
ーター活性は、シーパンジー・ルシフェラーゼ活性に対
するホタル・ルシフェラーゼ活性の相対比としてあらわ
した。この結果から本発明の配列表配列番号1のDNA
はプロモーター活性を有することがわかった。
【0013】実施例5 ヒトBMP−4組換え発現ベク
ターのヒト細胞への導入と安定発現 ヒトBMP−4組換え発現ベクターを安定発現させるた
めに、上記の各ベクターとピュロマイシン耐性遺伝子を
含んだベクターpPUR(クロンテック社製品)を1
0:1の割合で混合し、カチオニックリポソーム Lipof
ectamine(ライフテックオリエンタル社製品)と混合
後、ヒト骨肉腫細胞HOSに添加し、トランスフェクシ
ョンした。ピュロマイシン(シグマ社製品)を含んだ培
地で目的の遺伝子が導入された細胞を選択した。
【0014】実施例6 活性低分子化合物のスクリーニ
ング 選択した細胞を96穴プレートに播種し、種々の化合物
ライブラリーの物質で、1〜3日間処理した後、細胞を
細胞溶解剤(プロメガ社製品)で溶解させ、ルシフェラ
ーゼアッセイキット(プロメガ社製品)で酵素活性測定
をする。このようにしてヒトBMP−4の発現を促進も
しくは抑制させる種々の物質を探索することができる。
【0015】
【発明の効果】ヒトBMP−4プロモーターを含んだ
5′上流遺伝子と適切なレポーター遺伝子に組込んだ組
換え発現ベクターを導入した動物細胞を用い、レポータ
ー活性を指標にしてヒトBMP−4の発現を正または負
に制御する低分子化合物を探索することができる。これ
らの低分子化合物およびその誘導体は、ヒトBMP−4
の発現を介した骨・軟骨誘導活性または阻害活性を有
し、骨、軟骨疾患予防・治療剤、骨転移治療剤もしくは
骨形成過剰症予防・治療剤として有用である。
【0016】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:6774 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ゲノムDNA 起源: 生物名:ヒト(Homo sapiens) 組織の種類:ヒト胎盤 配列の特徴:エクソン1からエクソン3までを含んだヒトBMP−4の5′上流 遺伝子配列 配列: GAATTCCTTC CGTAGCTTCA CCAGACACCT AATTGGCCAA GAAGGTTTGA AGACCTGATG 60 TGGTTCTTAA TTGGGGATGG GGAATTAAGG GCTACTGTAT CTATAGGATT ATCTTTTCAC 120 TTGCATAGAC CTATTTGGTG TGTTCAGGGC ATAGTGATAC TATAATTGCC ATATTTAACA 180 GTTTATAAAG TTCAAGCCCA GCATATTCTT TGCCTGTTTA ATGATGTCTT GGTATCAGCC 240 TTTTAATGGT ACTTATCAGC ATAGAAAATG GAAACAAAAT AACTTTTAAA ACAGTAGCTC 300 TCAAGCTTTA GTGTGCTCAG AATGACCAGA GAACCTTGTG AAATATACAG ATTTCTGGGT 360 CCAGATCTGG GGCAGGACCA GGAAGTCTGC ATTTCATCTG CACCCCCACC CTACTCTGAG 420 GCTTATAGTC CTGAGAACAT GCTTTGAAAA AGGCTGTCCC AAGGGCTCGC AGACAGGCTA 480 TTGACCAGCT ACTCTTTCTT GATGTTCTCC AGGAAAACCC AACAAAGGAA TGCCTTTCAT 540 TGAGTAGTAG CAGCATAGGA GCAATAGTTG CTCCTGAATT ATGGGTGGGT TTCCCTCTTC 600 ATCAATGTGC TTTAAGGGTA CAGTTTCATT TGGTCTATCT ACCATGTTCT ATAAAAACAT 660 GAAAATTCAC AGGTAAGTTT GAGATACAGA AAATAACTAA ACTGATTCTT CTCACGAACT 720 CTGATCACTA GGCTGTGGTT GATTTAGCTC TCTAACCAAC AAGTAATTTG TTCTTTGGCA 780 TGAGTAAGGG GGGAAAAGGA GGAGTGGGTA AAAGCAGCTG ATAACAGATG GCTTGCGCCC 840 ATCTAAAATG TGGGGAGAGA AATAAAGCTG TCCCAAGAGA ACTAAAGCTG AGTTCTCTCG 900 TCATATATCT GAAGATTCAT ATCAGGGGTC TAAACATGGT ATGTCGGGTA GCTTAATTGG 960 AAACTCCTGG ACTGTGAGTG TCACAGACTC ATGGATGGGC CAATCAGTGG CCACTTTAGT 1020 GTCTGGGCTG CAGCAAAATG AGACAATAGC TGTCATTCAA AAACCTTTGG AATTAAAAAA 1080 ACCCCGAAAT GACATTGGTG CTTTAAAGTA AAATAAAGTC CTGCCTTTAA GTCCAGCATA 1140 TCACTGTTGT TTCTGAGTTT AAATATTAAG AACCACATTT CGTTAATGAT TAAAACAACA 1200 GTGATTGATT TAGGGGCTCA GTGAGCATTT AATCTGTCCT GACTTCAGGT ACCATGCTAA 1260 AGGAGCACAA TGCCTGATGC TGCAGGAGAA ACATTAGGTA ACTATTTAAT GGAGTTTTAA 1320 TTTTCTGTTA TTATTTTTAA TAATTAATTG TGATTTTGAC TATTTGGAAG CTACAGGTAT 1380 ATTTTGTCCT CCTTTTGGGG TGGTGTTATT GCCCTGCCCT GTTTTAATCA GTGGTTCTTA 1440 GAGAAAGTGA ACTCAGGAGT GACTTAAAAT GAAGGAAGAC GGACTTTGGC TAAAATTACA 1500 ATTAAATAAT CAAATCATTT TCAAATATAA AGGGAGCATG CAGATGATCT GGCCCAATCC 1560 TTTCATTCTG CAGATGAGAA AACTGAGGCT CATAGGAATG AAAAGACTTG CCCAAAGCCA 1620 TACAGCTTGT TTCTGTTGTT TGGTGCATTA GGCCAAAAGA CCTAGGCCTA ATAGATGGAA 1680 AATATGGCAG GATGTCTTGG CCTTGCTCTG ACAGTTGCTT CTCTGATCTC AGATATTTCC 1740 CACCCTTTGT AAATTCTGTG TTCCACACAG GAAGTAGTTC TTGTTTTTTA AATATCGAAG 1800 GTGTATAAAC GTAAAGTTTT TATAGATGAG CCACCCAGGG CCAATATCTG TTTAAGTAAA 1860 GACCTAAATG CTTTGCAGAG ACAGTAAAGT GTCATGTCTG TCCCAGGGAA AGAAATCCAG 1920 GACAGGAAAT GCTCAGTCTT CCAGCACTCC TCTGGCTACC TGGAGCTCAG GCTATGAGCC 1980 TCAACCCCTC CCTGAAGCAT TAGCTCTGGA GCAGAGGCTG TGATTTACTT CAGAGATCTG 2040 GGCAAGTCCC TTTAACCTGG TAGTCCTTCC TTTCCTTGTT TGTAAAACAG AGAGATGAGG 2100 CTGATAGCTC CCTCACAGCT CCATCAGAGG CAGTGTGTGA AATTAGTTCC TGTTTGGGAA 2160 GGTTTAAAAG CCACCACATT CCACCTCCCT GCTAATATGA TTACTAAAAT GTTTTTATAT 2220 GAAAGGGCCA ATTCCTCATC TCCCCTCTTC CTTTAAAAAC AGACCAAGGG GCATCTTTTC 2280 TTGTCTCCCT GTGGCCTAAA AGGTTACTGC TTCTGTGGTT ATCTCCTTGG AAAGACAGAG 2340 TGTCAGGACT CTTAGGTACA CCAAAAATGA ACAAAAAAAT CAACAACAAC CATAACACCA 2400 ACAAAAATAA CTGCTGTGTC GGTTCTTAAG ACGGCTTCTG AGCTAGAAAC AGATTTTTCT 2460 AACTGTAAAA AACGTGGCCC CAGCCTGTCT GCAGGCCACC TCTGTCTTTA GGCCTTGGGG 2520 GGAGGAGGGA AGTGAGCTCA TTTACTGGGT CTACCTCAGG GTCATCACCA AGGTGTTCTA 2580 CAAAACGCAC TTTAAGAATG TTTTGGAAGG AAATTCACCT TTTAACAGCC CAAGAGGTAT 2640 CTCTCTCTGG CACACAGTTC TGCACACAGC CTGTTTCTCA ACGTTTGGAA ATCTTTTAAC 2700 AGTTTATGGA AGGCCACCTT TTAAACCGAT CCAACAGCTC CTTTCTCCAT ACCCTGATTT 2760 TAGAGGTGTT TCATTATCTC TAATTACTCA GGGTAAATGG TGATTACTCA GTGTTTTAAT 2820 CATCAGTTTG GGCAGCAGTT ACACTAAACT CAGGGAAGCC CAGACTCCCA TGGGTATTTT 2880 TGGAAGGTAC GGCGACTAGT CGGTGCATGC TTTCTAGTAC CTCCGCACGT GGTCCCCAGG 2940 TGAGCCCCAG CCGCTTCCCA GAGCTGGAGG CAGCGGCGTC CCAGCTCCGA CGGCAGCTGC 3000 GGACTCGGCG CTGCCTGGGC TTCCGGGACC CGGGCCTGCT AGGCGAGGTC GGGCGGCTGG 3060 AGGGGAGGAT GTGGGCGGGG CTCCCATCCC CAGAAAGGGA GGCGAGCGAG GGAGGAGGGA 3120 AGGAGGGAGG GGCCGCCGGG GAAGAGGAGG AGGAAGGAAA GAAAGAAAGC GAGGGAGGGA 3180 AAGAGGAGGA AGGAAGATGC GAGAAGGCAG AGGAGGAGGG AGGGAGGGAA GGAGCGCGGA 3240 GCCCGGCCCG GAAGCTAGGT GAGTGTGGCA TCCGAGCTGA GGGACGCGAG CCTGAGACGC 3300 CGCTGCTGCT CCGGCTGAGT ATCTAGCTTG TCTCCCCGAT GGGATTCCCG TCCAAGCTAT 3360 CTCGAGCCTG CAGCGCCACA GTCCCCGGCC CTCGCCCAGG TTCACTGCAA CCGTTCAGAG 3420 GTCCCCAGGA GCTGCTGCTG GCGAGCCCGC TACTGCAGGG ACCTATGGTG AGCAAGGCTA 3480 CCTGGTGAGG GGAGACAGGC AGAGGGGGTC TAGGAGCCTC CTTGGGGGGA AGAAGCTGGT 3540 CACAGGCTGT GACCGAGGCA AAAGGTGGCC TAATTATTTT CCAATAGTGG TGCTGGAGGT 3600 GGGGATGCTG GCGCTGAAAG ACCTTTAAAT ATCGGCTACT GCCCTGCCCA GGCCTTCTCT 3660 GTCCAGCAGT CCCTGGGAGA GTCTCACCTT TGGGAAGTGC GGGGCAGGAG AGCAGAAACA 3720 AGAGAAGCCC TTGGTAGGGG GGTCGTTGGG AAAAACTGTG GGGTCTTGGG CTGAACGCGT 3780 TGCCCACGGG CTGGAGGTTG CGATCCCCGG ACGGAAAGCG CGGGAGGAGG AAGGAGAGAA 3840 CCGGCTCTGA GGTCCAGAGA GAGTGAGGGG GCAGAGCGAC GGCGAGATGG GGAGAGAACA 3900 CCTAGCTGGA GCAGGTTCTG CGGTAGAGAG CGCAGTCCTG CTGGCCTCTG GAGAGTGCGC 3960 GCCGCTCCGG AGGCTGCGTC GAGGGGAGTG TCACCCAATC TGGGCCCCAG CTGGCGGGGC 4020 GCCTGAGAGC TTGCGAACTG CAGTTGCAGG ACGCGCCTTC TCCACGAGCT ATTTTCGTCG 4080 ACTTGCGGAA CCCAAGGAAC CTCGCCTCTA TCATTTCACG GTGTAGGGTC CCTAGAGACG 4140 ACAGCCAAGA TCCCAGGGGC TCCCAGGACG CTTGTTCCTG CGGTGTCGTG TCCTATGGGG 4200 AGTTCCTGGC GGGACGAAAG GCGGACGCGC GGCTCTTCCT GGCCCTCCAG GCCCGGAACC 4260 GACGGGAAAG GTTCCCGTGA TTCCCGAGTC CCTGCAGGCT TCTTCCAGCG GGAGTTGGTC 4320 CGGGGGCCTT AGACGCCTCC AAGCACTGCT TTGGAGGATG GTTTCCAAGG ATCGCGGTTT 4380 GTGAGTTGAA GGCTTTGTGA GAGGTTAAAC CCCCAAAAGA TACATACTTG GTAAACTGAG 4440 GCTACCTGTA AACACATTTC GGCATTAGGA GAAGATTCGA GTAGGGAAGT GAAGGACAAC 4500 CACCCCGAGT TACATTCCTT TCCCCCAATA AAAAGCTCTG GGGATGAAAG TTCTTTTGGC 4560 TTTTATCTTT TCGATTTAAA AATTTGAGAA GAAAATGTGA CTAGAGATGA ATCCTGGTGA 4620 ATCCGAAATT GAAACACAAC TCCCCCTTCC CCTTCCTATC CTCTCGGTTT TAGAACCGCG 4680 CTCTCCCGCC CCAGGAGATT CCTTGGGGCC GAGGGTTTTC CGGGGAACCG GGCGCCCGCC 4740 CCTTCTACTG TCCCTTTGCC CCGCGGGCAC AGCTTGCCTC CGTCTGCTTT CTCTACTTCT 4800 GGACCTCTCC TCGGCGGGCT TTTTAAAGGG CTTCTGCGTC TCAAAACAAA ACAAAAAAAC 4860 CCTTTGCTCT TCCCAACCCT TTCGCAGCCC GCCCCAGCGT GGCGCGGGAC CAGCAAAGGC 4920 GAAAGCGCCG CGGCTCTTGC CGGGCGCGGA CGGTCGCGCA GGGGCGCCCG CGGCCTCCGC 4980 ACCCGGACCT GAGGTGTTGG TCGACTCCGG GCATCCACGG TCGGGAGGGA GGGCTGAGCT 5040 GTTCGATCCT TTACTTTTCT TCCTCAAAGT CTACCTGCCA ATGCCCCTAA GAAGAAAACC 5100 AAGTATGTGC GTGGAGAGTG GGGCGGCAGG CAACCCGAGT TCTTGAGCTC CGGAGCGACC 5160 CAAAGCAGCA ACTGGGAACA GCCTCAGGAA AGGGAGGTCG GGTGGAGTGG GCTTTGGGGC 5220 AGGAGTCATG GGGCCCGGGC CCCGGGGACG ACCTGGCGCT CCCGGCCCTG CTGAACGCTG 5280 AGTTGCGCCT AGTCGGGTTT TCGAAGAGGC CCTTGCGCAG AGCGACCCAC GCGCGCGGCA 5340 GCATCTTCGA TTAGTCAGGA CATCCCAGTA ACTGCTTGAA CTGTAGGTAG GTAAAATTCT 5400 TGAAGGAGTA TTTGCTGCGT GCGACTCTGC TGCTGGTGCA ACGGAGGAAG GGGGTGGGGG 5460 AAGGAAGTGG CGGGGGAAGG ACTGTGGTGG TGGTTTAAAA AATAAGGGAA GCCGAGGCGA 5520 GAGAGACGCA GACGCAGAGG TCGAGCGCAG GCCGAAAGCT GTTCACCGTT TTCTCGACTC 5580 CGGGGAACAT GGTGGGATTT CCTTTCTGCG CCGGGTCGGG AGTTGTAAAA CCTCGGCCAC 5640 ATTAAGATCT GAAAACTGTG ATGCGTCCTT TCTGCAGCGA CGCCTCTTTC TGAATCTGCC 5700 CGGAGCTTCG AGCCCCGGCG TCTGTCCCTC AGCCTGGCAT GGCTTCTTCG GGGGTCTGCT 5760 TTGCATGGGG AGAGGGGCCA CGCAGCGGCG GACTAGGTTT GGGGATTCTC GGTAATGGAC 5820 CCGGAGCAAT GACTAACAGC CGCTCCCTCT CACTTTCCCA CAGCGATCAC CCTCTAACAC 5880 CCTCCCTCCC ATTCCCGGCC CCGCGCGTGA CAAGGTCGGC TGCTTTCAGC CGGGAGCTAG 5940 ATCGGTGGCC CGGCTCTTCG GACCTTAGCG AGCGTTCGCC AAGGGGTGAC TGGCTGTCAT 6000 TGGGAGCAAT ATTTGGCCTT GAGGAGACCC TGGGGAGGAA GTGGCGGGGA GCTCGTGTTT 6060 GCTTGTGTGT GTGTGGGGGG GTAGTGTGTG TAACACGCGC GTGGGCAGGG TCCCTCTGCG 6120 CTTTCCTTTT TAAGTGCCTC TCGGTGGTGA GGCTTTGGGC GGGTGAGACT TTCCCGACCT 6180 CGCTCCCGGC CCCACTTAAG CCGGGTTCGA GCTGGGAGAC GCAGTCCCTT CAGTGCGCCC 6240 CAAATCCTCT GGCTTCAGGT GGCCCGGCGC GGGGGCCCAG CACGACGCAC CGCGCCGAGA 6300 ACCGGGTTCT CCGGTGCGTG CGCCAGTAGC CCTGGGAGCG CGGCGGCCGC GGGGCACCGG 6360 CCGAGGCTCT GCCGAGCGCC GCCGGGAGCT CCTCCCGGAC CGCTGAGGCT CGGGCGGCGG 6420 ACGCGGAGGT TGGCCTCGCC TGGAGGGGCG GGCCCGCGAG GGGCGGGGGG CTGTGGAGGA 6480 GGGGAGGGCG CGCAGGCCCT TTCGCCGCCT GCCGCGGGAG GGGCCTCGGC GCTCACGTGA 6540 CTCCGAGGGG CTGGAAGAAA AACAGAGCCT GTCTGCGGTG GAGTCTCATT ATATTCAAAT 6600 ATTCCTTTTA GGAGCCATTC CGTAGTGCCA TCCCGAGCAA CGCACTGCTG CAGCTTCCCT 6660 GAGCCTTTCC AGCAAGTTTG TTCAAGATTG GCTGTCAAGA ATCATGGACT GTTATTATAT 6720 GCCTTGTTTT CTGTCAGTGA GTAGACACCT CTTCCTTCCC CCTCCCCGGA ATTC 6774
【0017】配列番号:2 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 起源:なし 生物名:なし 組織の種類:なし 配列の特徴:エクソン1領域に相当するヒトBMP−4
の5′上流遺伝子配列クローニング用順方向PCRプラ
イマー 配列: GGCAGAGGAG GAGGGAGGGA GGGAAGGAGC 30
【0018】配列番号:3 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 起源:なし 生物名:なし 組織の種類:なし 配列の特徴:エクソン1領域に相当するヒトBMP−4
の5′上流遺伝子配列クローニング用逆方向PCRプラ
イマー 配列: GGGACCTCTG AACGGTTGCA GTGAACCTGG 30
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒトBMP−4の5′上流遺伝子6.7kbのエ
クソン・イントロン構造と制限酵素地図である。
【図2】ヒトBMP−4の5′上流遺伝子のプロモータ
ー1を含んだ組換え発現ベクター(pMSS116)で
ある。pGL3−basicの制限酵素部位NheIとXh
oIにプロモーター1領域(配列表配列番号1記載の1
から3361番目の塩基、図1記載の5′末端からXh
oIまで)を挿入した。
【図3】ヒトBMP−4の5′上流遺伝子のプロモータ
ー2を含んだ組換え発現ベクター(pMSS118)で
ある。pGL3−basicの制限酵素部位XhoIとBg
l IIにプロモーター2領域(配列表配列番号1記載の
3361から5645番目の塩基2.3kb、図1記載
のXhoIからエクソン2中のBglIIまで)を挿入し
た。
【図4】ヒトBMP−4の5′上流遺伝子のプロモータ
ー1およびプロモーター2を含んだ組換え発現ベクター
(pMSS119)である。pGL3−basicの制限酵素部
位NheIとBglIIにプロモーター1およびプロモー
ター2領域(配列表配列番号1記載の1から5645番
目の塩基、図1記載の5′末端からエクソン2中のBglI
Iまで)を挿入した。
【図5】ヒトBMP−4プロモーター活性の測定(一過
性発現)の結果である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:91)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列表配列番号1において、1番から6
    774番までの塩基配列を有するヒト骨誘導因子−4プ
    ロモーター領域を含んだDNA、またはそれらの断片。
  2. 【請求項2】 配列表配列番号1のDNAを下記の順に
    より製造する方法。 (1) 制限酵素EcoRIによるヒト胎盤ゲノムDNA
    の消化、 (2) アガロースゲル電気泳動による分離、 (3) 分離したEcoRI消化DNA断片の、同酵素で
    処理したラムダファージベクターλDASH IIへのクロー
    ニング、 (4) 上記ベクターのファージへのパッケージング、 (5) 大腸菌への感染、ゲノムDNAライブラリー作
    成、 (6) PCR法によるスクリーニング、 (7) プラスミドベクターへのサブクローニング。
  3. 【請求項3】 配列表配列番号1のDNA全長、あるい
    は一部をレポーター遺伝子に組み込まれていることを特
    徴とする組換え発現ベクター。
  4. 【請求項4】 請求項3の組換え発現ベクターを用いて
    なることを特徴とする骨関連物質の探索方法。
  5. 【請求項5】 骨関連物質が骨形成誘導物質である請求
    項4の探索方法。
  6. 【請求項6】 骨関連物質が骨形成阻害物質である請求
    項4の探索方法。
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