JPH11285387A - 新規なｄｎａ配列及びそれを含むプラスミドベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】良好な複製能を付与し得る複製を司る新規ＤＮ
Ａ配列（遺伝子）、及び該ＤＮＡ配列を含み、サイズが
小さくてコピー数が高く、宿主によらず安定に維持され
る新規プラスミドベクター等を提供する 【解決手段】ＤＮＡ配列からなる、複製を司る新規ＤＮ
Ａ配列、該ＤＮＡ配列を有する優れた複製能をプラスミ
ドベクター等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は、新規なＤＮＡ配列、それ
を含むプラスミドベクター及びそれを利用する遺伝子組
み換え技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換えによって磁性細菌が細胞内
に生成する磁気微粒子上に生理活性タンパク質が発現し
たタンパク質含有磁気微粒子を製造する技術（特開平8-
228782、WO97/35964）において、目的遺伝子を組み込む
プラスミドベクターとして、pRK415などの広域宿主プラ
スミドベクターと呼ばれるものが用いられてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、一般に広域宿
主プラスミドベクターはサイズが大きく、コピー数が低
いことや、宿主によっては安定に維持されないことが知
られており、遺伝子組み換え実験や目的タンパク質を高
発現させる場合、効率が悪くなる。そこで本発明の課題
は、良好な複製能を付与し得る複製を司る新規ＤＮＡ配
列（遺伝子）、及び該ＤＮＡ配列を含み、サイズが小さ
くてコピー数が高く、宿主によらず安定に維持される新
規プラスミドベクター等を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、第一
に、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮ
Ａ配列（以下、複製遺伝子という）を提供する。本発明
は、第二に、該複製遺伝子を有する、複製能を有するプ
ラスミドベクターを提供する。本発明は、該複製能を有
するプラスミドベクターの好ましい態様として、さらに
接合伝達を司るＤＮＡ配列（以下、伝達遺伝子という）
を有し、複製能及び伝達能を有するプラスミドベクター
を提供する。本発明は、該複製遺伝子及び伝達遺伝子を
有するプラスミドベクターの好ましい例として、配列表
に記載の配列番号２の塩基配列で示されるDNA配列から
なるプラスミドベクターpMS-T1を提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
上記の伝達性プラスミドベクターpMS-T1は、磁性細菌MG
T-1（T Matsunaga. etal IEEE Trans. Magnet. 26,5,19
90）から見いだされた。 ［磁性細菌MGT-1の寄託に関する情報］寄託機関 名称：工業技術院生命工学工業技術研究所(National In
stitute ofBioscience and Human-Technology Agency o
f IndustrialScience and Technology) あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５） 寄託日： １９９８年１月３０日 受託番号： ＦＥＲＭ Ｐ−１６６１７

【０００６】本発明の複製遺伝子は上記のプラスミドベ
クターpMS-T1から見出されたもので、配列番号２の配列
の第６６塩基から第２５９９塩基までの配列に相当す
る。該複製遺伝子は高いコピー数、小型のプラスミドベ
クターの調製に有用である。本発明により第二に提供さ
れる複製能を有するプラスミドベクターは該複製遺伝子
を有することを特徴とし、高いコピー数を達成する。こ
のプラスミドベクターは伝達遺伝子を有しても有しなく
てもよい。有しない場合には、エレクトロポレーション
法などにより形質転換することができる。該プラスミド
ベクターにさらに伝達遺伝子を導入することにより、高
い複製能と伝達性を有するプラスミドベクターが得られ
る。プラスミドベクターpMS-T1は第2700塩基から第65塩
基までにmob遺伝子を有するが、伝達に関与する遺伝子
はこれに限定されない。良好な伝達能を付与し得る他の
伝達遺伝子を組み合わせることにより、複製能及び伝達
能がともに優れたプラスミドベクターを新たに調製する
ことができる。このような伝達遺伝子としては、例え
ば、tra遺伝子、移動性機能をコードするmob遺伝子が挙
げられる。このような複製遺伝子及び接合伝達に関与す
るmob遺伝子を備えたプラスミドベクターの具体例が、
配列番号２にＤＮＡ配列が示されたプラスミドベクター
pMS-T1である。

【０００７】本発明のプラスミドベクターは、従来公知
のように遺伝子組み換え技術及びプラスミドベクターの
使用方法に特に限定なく使用することができ、用いられ
る抗生物質耐性遺伝子も特に限定されない。このプラス
ミドベクターが伝達遺伝子を有する場合には、磁性細
菌、大腸菌等を含むグラム陰性菌へ接合によって導入す
ることができ、宿主細胞内で複製するため、各種グラム
陰性菌における遺伝子組み換え実験に用いることができ
る。該プラスミドベクター内に特定のペプチド又はタン
パク質をコードする遺伝子を連結し宿主細胞内で発現さ
せることができる。

【０００８】そこで、本発明は第四に、上記のプラスミ
ドベクターにペプチド又はタンパク質をコードする遺伝
子を導入してなる組み換えプラスミドを提供する。本発
明は、第五に、該プラスミドベクターで形質転換された
グラム陰性菌を提供する。ペプチド又はタンパク質をコ
ードする遺伝子は特に限定されない。例えば、抗原、抗
体、プロテインA、プロテインG等の免疫関連タンパク
質、レクチン、アビジン等の結合能を有するタンパク
質、補酵素、加水分解酵素、異性化酵素、転移酵素、脱
離酵素、制限酵素等の酵素類が挙げられる。遺伝子組み
換えのための宿主は、一般的なグラム陰性菌であれば特
に限定されないが磁性細菌が好ましい。磁性細菌として
は、例えば Magnetospirillum 種の微生物｛例：菌株AM
B-1（FERM BP-5458）、MS-1（IFO 15272;ATCC 31632;DS
M3856）、MSR-1（IFO 15272;DSM6361）｝、及び Desulf
ovibrio種の微生物｛例：菌株RS-1（微工研菌寄13283）
が挙げられる。

【０００９】本発明のプラスミドベクターに、定法に従
い、発現させたい目的遺伝子を組み込むことによって組
み換えプラスミドベクターを構築する。得られた組み換
えプラスミドベクターを、接合伝達、エレクトロポレー
ション法などの遺伝子導入法によって宿主細菌に導入し
形質転換する。宿主細菌を培養、増殖させることによっ
て導入された組み換えプラスミドベクターは宿主内で複
製され、目的遺伝子が転写される事によって目的遺伝子
がコードするタンパク質を大量に得ることができる。特
に、本発明には、特開平8-228782及びWO97/35964に示さ
れたタンパク質含有磁気微粒子作製方法に用いたときに
効果的である。

【００１０】

【実施例】実施例１ I プラスミドの分離 ４LのMSGM培地で培養したMGT-1を、遠心によって集菌し
た。0.1M Tris-HCl緩衝液(pH7.5)で洗浄後、QIAprep-sp
in Miniprep Kit（QIAGEN社）を用いて核酸を抽出し
た。最終的に５００μlのTE緩衝液（10mM Tris-HCl, 1m
M EDTA, pH 8.0）にDNAを溶解し、これを１％TBEゲル
（TBE緩衝液：0.089mM Tris-borate, 0.002MEDTAに１％
w/vの高純度アガロース（GIBCO BRL社）を添加して作
製）に10μlアプライし４０分間電気泳動を行った。ゲ
ルをエチジウムブロマイド溶液で染色し、トランスイル
ミネーターを用いてUV照射したところ、3.5 kb 付近に
プラスミドらしきバンドが確認された。そこでサンプル
を100μlまで濃縮し、切り出し用の1％TAEゲル（TAE緩
衝液：0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTAに１％w/vの高
純度アガロース（GIBCO BRL社）を添加して作製）に全
量アプライし、3.5kb 付近に見られるバンドを切り取り
電気溶出法によってプラスミドpMS-T1を分離した。

【００１１】II プラスミドの制限酵素切断部位の確認 分離したpMS-T1を制限酵素（宝酒造製）で消化し、その
切断部位を確認した。即ち、Bal I,BamH I,Bgl I,Bgl I
I,Dra I,EcoR I,EcoR V,Fsp I,Hinc II,HindIII,Hpa I,
Kpn I,Nco I,Nru I,Pst I,Pvu I,Pvu II,Sac I,Sal I,S
ca I,Sma I,Sph I,Xba I,Xho I それぞれを用いて分離
したpMS-T1を消化後、1%TBEゲル（前述のとおり）を用
いて制限酵素切断パターンを確認した。存在が確認され
た制限酵素切断部位はBal I,BamH I,Dra I,Fsp I,Hinc
II,Nco I,Nru I,Pvu II,Sac I,Sma I,Sph I,Xho I であ
った。またその切断パターンからpMS-T1上に一ヶ所のみ
存在する制限酵素部位（unique site）は、BamH I,Dra
I,Fsp I,Nru I,Pvu II,Sma I,Sph I,Xho Iであった。ま
た、Bal Iは２ヶ所、Hinc II は４ヶ所、Nco Iは３ヶ
所、Sac Iは３ヶ所で切断されることがわかった。ま
た、Bgl I,Bgl II,EcoR I,EcoR V,Hind III,Hpa I,Kpn
I,Pst I,Pvu I,Sal I,Sca I,Xba IはpMS-T1を切断しな
かった。以上の制限酵素切断パターンから、分離したpM
S-T1は、大きさ約3.7kbpであった。

【００１２】III・プラスミドのクローニングとシーク
エンス解析 pMS-T1を一カ所だけ切断するBam HIサイトを用いて、pM
S-T1のサブクローニングを行った。即ち、BamHIで消化
したpMS-T1をBam HIで消化したpUC18に連結し、pMC18を
作製した。次に、Kilo-Sequence 用Deletion Kit （宝
酒造）を用いてpMC18のデリーションクローンを作製し
た。pUC18のマルチクローニングサイト付近に設計され
ているM13プライマーを用いて、ダイデオキシ法による
サイクルシークエンスによってサンプルを調製し、自動
シークエンサー（ABI社）により塩基配列解析を行っ
た。結果を、配列表 配列番号２に示した。また先の制
限酵素切断パターン結果及び全塩基配列の結果を元に作
成したpMS-T1の制限酵素切断部位地図を図１に示す。

【００１３】実施例２ IV タンパク質局在量の比較 （a） 組み換えプラスミドの作製 次に実施例１で得られたプラスミドpMC18と、レポータ
ー遺伝子である蛍ルシフェラーゼ（luc遺伝子、東洋イ
ンキ製）遺伝子を用いて、プラスミドコピー数の違いに
よって目的タンパク質の発現量が増加するか検討した。
即ち、luc遺伝子と磁気微粒子を被覆するリン脂質を
主成分とする有機薄膜上に局在化するタンパク質をコー
ドしたmagA遺伝子（特開平8-228782）の融合遺伝子を組
み込んだプラスミドpMCMLを図2に示す方法で作製した。

【００１４】luc遺伝子を含んだpGV-CS（東洋インキ
製）をBam HI で消化し Blunting KIt（宝酒造）を用い
て平滑末端化した。一方、magA遺伝子を含んだpUM5AをS
ph Iで切断し、magAプロモーターを含んだmagA遺伝子を
分離した後、Blunting KIt を用いて平滑末端化後、pGV
-CSに接続し pGV-magAを構築した。次にpGV-magAからHi
nd III 及びXho Iサイトを用いてmagA-luc融合遺伝子を
分離した。これをHindIII 及びXho Ｉで消化したpMC18
に接続しpMCMLを構築した。こうして読み枠がずれるこ
となくmagA-luc融合遺伝子は翻訳され、融合タンパク質
を発現、局在化することができる。ここで、pMCML及びp
KML（特開平8-228782参照；pRK415(N.T.Neen. et al.,
Gene 70, 191-197, 1988)）にmagA遺伝子とルシフェラ
ーゼ遺伝子（東洋インキ社製）の融合遺伝子を組み込ん
だプラスミドベクター）は、プロモーター、magA遺伝
子、luc遺伝子の連結状態が全く同じにクローニングさ
れている。また、pMC18のpUC18由来のColE1 oriは磁性
細菌細胞内では働かない。

【００１５】（b)接合伝達体の作製 次に、実施例２で得られたプラスミドpMCML、及びpKML
(特開平8-228782)それぞれの組み換えプラスミドを接合
伝達により野生株AMB-1に導入し、接合伝達体を作製し
た。接合伝達における供与菌体として用いたE.Coli S17
-1はtra遺伝子を有しているため接合伝達を行う際、ヘ
ルパープラスミド無しで接合伝達が可能である。接合伝
達には、MSGM培地で培養した対数期中期から後期の磁性
細菌約８×１０⁷ cells/ml を用い、供与菌体は前日に
プラスミドをHanahan法によって導入し発生したコロニ
ーをかき取って10⁹から10¹⁰ cellsをMSGM培地に懸濁し
た。菌数で1：50（磁性細菌：大腸菌）に両菌体を混合
し、MSGM寒天培地上にスポットし、メイティングを行っ
た。６時間後スポットをメスで切り取り５ml程度のMSGM
培地中に入れ軽く撹拌し、懸濁する事によって菌体を回
収した。pMCMLの懸濁液はアンピシリン 5μg/ml を添加
したMSGM培地に、pKMLの懸濁液はテトラサイクリン2.5
μg/mlを添加したMSGM培地に植菌した。それぞれアルゴ
ンガスを通気し微好気状態にした後、25℃で培養した。
大腸菌はMSGM培地では増殖しないことから、植菌後増殖
した磁性細菌を接合伝達体AMB-1とした。

【００１６】次に、各プラスミドが導入された接合伝達
体AMB-1を4LのMSGM培地で培養し、各接合伝達体AMB-1か
ら磁気微粒子を分離した。AMB-1を集菌し、PBS buffer
で洗浄した。菌体濃度0.1g wet cell/ml を越えない濃
度になるよう、1mM DTTを含んだPBS buffer に懸濁し、
1分間のサイクルで超音波破砕（出力120W）と冷却（氷
温）を５回繰り返すことによって細胞を破砕した。細胞
破砕懸濁液の入った容器の外壁面にNd-Fe-B磁石を固定
し、氷冷しながら１０分間放置し磁気微粒子を懸濁液中
から分離した。分離した接合伝達体由来の磁気微粒子
を、1mM DTTを含んだPBS buffer で洗浄した。

【００１７】ルシフェラーゼ活性は、ピッカジーン発光
キット（東洋インキ製）を用い、ケミルミネッセンスア
ナライザー（東北電子産業製）によって１分間の発光量
を測定し、その積算値からルシフェラーゼ活性及び発現
量を求めた。結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】結果より、pMCML接合伝達体由来の磁気微
粒子分画においてルシフェラーゼ活性値の向上が認めら
れ、両プラスミドにおいて遺伝子のクローニング状態が
全く同じであることから、ルシフェラーゼ活性値の違い
は融合タンパク質の局在量の違いによるものであること
が分かった。

【００２０】実施例３Ｉ プラスミドコピー数の測定 先のルシフェラーゼ活性値の向上がプラスミドコピー数
によるものと判断させたことから、ゲノム上1コピーの
み存在するmagA遺伝子を用いてpMS-T1のコピー数を求め
た。即ち、実施例2で作製したpMCML及びpKML各接合伝達
体を40mlのMSGM培地で 8×10⁷ cells/ml まで培養し
た。各培養液から2×10⁹ cells の菌体を調整し、Curre
nt Protocols in Molecular Biology に記載の方法で各
菌体から全DNAを抽出した。この全DNAサンプルを用い
て、Guixian Xia らの方法（J.Bacteriol 175,13,P4165
-4175. 1993）を参考にしてプラスミドコピー数を求め
た。即ち抽出した各全DNAサンプルに対し、magA遺伝子
をプローブとしたササ゛ンハイフ゛リタ゛イセ゛ーションを行った。プロー
ブ標識及びハイフ゛リタ゛イセ゛ーション検出にはDIG発光検出キット
（ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイム社）を用いた。各サンプルをアガロー
ス電気泳動後、キャヒ゜ラリートランスファーによってナイロンメンブ
ランにブロッティングした。あらかじめ標識しておいた
magA遺伝子をプローブとしてハイフ゛リタ゛イセ゛ーションを行い、メ
ンブランを洗浄した後標識抗体を結合させた。CSPD基質
溶液を加えた後、二波長フライングスポットスキャナー
CS-900(島津理化機械）を用いて定量測定を行った。結
果を表２に示す。

【００２１】

【表２】 結果より、磁性細菌AMB-1においてpMS-T1はpRK415より
も高コピーなプラスミドであることが分かった。

【００２２】実施例4I 宿主域の確認 (a) 組み換えプラスミドの作製 pMS-T1の宿主域を調べるために、pMS-Amp^r,pMS-Km^r,を
新たに作製した。即ち、BamHIで消化したpMS-T1と、pBR
322からSsp I及びEam1105 I消化によって切り出したア
ンピシリン耐性遺伝子を、それぞれ平滑末端化後にライ
ゲーションしpMS-Amp^r を作製した。また、BamH I消化
したpMS-T1とpUC4KからBamHI消化によって切り出したカ
ナマイシン耐性遺伝子をライゲーションし pMS-Km^r を
作製した。 (b) 大腸菌への遺伝子導入 導入方法は、エレクトロホ゜レーション法を用いた。pMS-Amp^r、pMS-
Km^r各ライゲーションサンプル及び E.Coli DH5αMCR（G
ibco BRL)コンピテントセルをエレクトロホ゜レーション用キュベッ
ト（Gap size 2mm）に入れ、 ECM600(BTX社）を用いてM
CRにDNAを導入した。パルス印加条件は電圧2.5kv,抵抗
値129ohm,とした。導入後 SOC 培地(2%Trypton, 0.5g%
Yeast extract,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,10mM
MgSO4,0.1mM グルコース）1mlに懸濁し１時間振とう培
養した。これをアンピシリンまたはカナマイシンを含ん
だLB寒天培地（ 5g Yeast extract,10g Trypton,10g Na
Cl15g Agar :１Ｌ）に塗布し37℃で培養した。

【００２３】（c) 形質転換体の確認 発生したコロニーを2mLのLB培地で培養し、プラスミド
を抽出した。得られたプラスミドを、pMS-Amp^r はDra I
消化、pMS-Km^rはBamH Iで消化したのちアガロース電気
泳動を行った。エチジウムブロマイドでゲルを染色しトラ
ンスイルミネーターを用いてUV照射したところ、pMS-Amp^rは、3.8
3kbと710 bp 、pMS-Km^rは1.24kbと3.74 kbに分離して
いた。各DNA断片の大きさはシークエンス上で求められ
る理論サイズと一致している。各形質転換体は継代培養
可能であり、プラスミドも得られることからpMS-Amp^r及
びpMS-Km^rは大腸菌で複製可能なプラスミドであること
が示された。またpMS-Amp^r 及びpMS-Km^rそれぞれをHana
han法でE.Coli S17-1に導入したところ、DH5αMCR と
同様にプラスミドの複製が確認された。以上の結果から
pMS-T1は大腸菌で複製することが分かった。

【００２４】（d)宿主域の確認 次に(a)で作製したpMS-Amp^r及びpMS-Km^rを用いて大腸菌
以外の宿主を調べた。導入方法は、エレクトロホ゜レーションまたは
接合伝達法を用いた。エレクトロホ゜レーション法の条件は各供試菌
体用の条件を採用した。接合伝達法は各プラスミドをS1
7-1にHanahan法によって導入し発生したコロニーをかき
取って10⁹から10¹⁰ cells を 0.1M Trisbufferに懸濁し
た。菌数で1:100（供試菌株：大腸菌）になるように両
菌体を混合し、供試菌株の生育寒天培地上にスポット
し、メイティングを行った。メイティング時間は各供試
菌体のDoubling time とした。遺伝子導入後、各供試
菌体をコロニーによって単菌分離しその培養菌体からプ
ラスミドを抽出した。 各供試菌株由来のプラスミドをD
H5αMCRに再形質転換し、プラスミドを抽出及び制限酵
素切断パターンを確認した。その結果Acetobactor xyli
nm, Alcaligenes eutrophus,Caulobacter crescentus,
Pseudomonas fluorescens,Rhodobacter sphaeroides,S
almonella typhimurium,Vibrio cholerae でpMS-Amp^r
またはpMS-Km^rが確認された。以上のように、大腸菌以
外のグラム陰性菌で複製することからpMS-T1は広域宿主
ベクターであることが確認された。

【００２５】実施例5 I ホモロジー解析と複製最小領域の決定 (a) pMS-T1のホモロジー解析 実施例１で得たpMS-T1の全塩基配列を用いてホモロジー
解析を行った。その結果、配列表 配列番号２に記載の
1408塩基から始まる開始コドン(ATG)から2554塩基で終
わる終止コドン（TGA）までの1147塩基で構成されるORF
(Open ReadingFrame) が、Paracoccus sp.164 プラスミ
ドの replication region とホモロジーが認められた。
また、配列番号２に記載の 2700 塩基から始まる開始コ
ドン(ATG)から65塩基で終わる終止コドン(TAA)までの11
06塩基で構成されるORFがBordetella bronchiseptica p
lasmidのmob遺伝子とホモロジーが認められた。

【００２６】（b) 複製領域の特定 (b-1)組み換えプラスミドの作製 次に、シークエンスデータ及びホモロジー解析結果を元
に、pMS-T1の複製領域について調べた。即ち、ColE1由
来の複製領域を持ち磁性細菌AMB-1では複製しないプラ
スミドpSUP202(Simon,R et al. Bio/Technology 1 198
3)をベクターとし、 pMS-T1を、配列表 配列番号２に
記載のXho I（第12塩基）及びSac I（第881塩基）消化
によって切り出した約870塩基で構成されるDNA断片(Fr.
870)を連結したpSUP-870を作製した。次に、HincII（第
1203塩基）及びSac I（第2594塩基）消化によって切り
出した約1400塩基で構成されるDNA断片(Fr.1400)を連結
したpSUP-1400を作製し、更にXho I（第12塩基）及びSm
a I（第2974塩基）消化によって切り出した約2960塩基
で構成されるDNA断片(Fr.2960)を連結したpSUP-2960を
作製した。作製した各プラスミドを前述の接合伝達法に
よって磁性細菌AMB-1に導入した。接合伝達体を培養し
た結果、pSUP-2960のみが継代培養可能であり、pSUP-87
0及びpSUP-1400は接合伝達体が得られなかった。この事
からXho I 及びSmaI消化によって得られたDNA断片内
に、pMS-T1の複製領域が存在していることが分かった。

【００２７】（b-2)デリーションクローンを用いた複製
領域の確認。 次に、実施例１のIIIで作製したpMC18のデリーションク
ローンをエレクトロホ゜レーションによってAMB-1に導入したとこ
ろ、pMS-T1のBamHIサイトを起点とした場合、約70塩基
以上デリーションが進行したクローンはAMB-1内では複
製しなかった。(a)のシークエンス解析により、第2700
から第65塩基で構成されるDNA断片は接合に関与するmob
遺伝子をコードする領域であり、更に(b-1)より、第12
塩基から第2974塩基で構成されるDNA断片を含んだpSUP-
2960のみが磁性細菌AMB-1で複製し、(b-2) よりBamHIサ
イトから70塩基以上デリーションが進行したクローンは
複製しないことからpMS-T1の複製には、配列表 配列番
号２に記載の第66塩基から第2599塩基までの 領域が必
要であることが分かった。

【００２８】（b-3)複製領域と抗生物質耐性遺伝子を組
み合わせた組み換えプラスミドの作製 pMS-T1をXho I（第12塩基）及びSma I（第2974塩基）で
消化によって切り出したDNA断片とpBR322からEcoR I及
びEcoT14 I消化によって切り出したテトラサイクリン耐
性遺伝子、それぞれを平滑末端化後にライゲーションし
pMS2960を作製した。これをエレクロホ゜レーションによってDH5α
MCRに導入した所、テトラサイクリン耐性を示すコロニ
ーが得られた。このコロニーを2mlのLB培地で培養し、
プラスミド抽出後Nru I消化におけるDNA分離パターンを
調べた。その結果1.7kbと 2.7kbに分離しており、これ
はシークエンス上で求められる理論サイズと一致してい
た。またpMS2960を保有するMCRは継代培養が可能であ
り、継代株からプラスミドも得られた。

【００２９】（b-4）磁性細菌AMB-1におけるpMS2960の
複製の確認 pMS2960及び磁性細菌AMB-1コンピテントセルをエレクトロホ゜レ
ーション用キュベット（Gap size 1mm）に入れ、ECM600を用
いて導入した。パルス印加条件は電圧1.5ｋｖ，抵抗値1
29Ωとした。パルス印可後、MSGM培地1mlに懸濁し12時
間振とう培養した。これをテトラサイクリンを含んだMS
GM寒天培地（寒天濃度0.7％）に混釈し25℃、嫌気条件
下で培養した。発生した黒色コロニーをテトラサイクリ
ンを含んだMSGM培地に植菌し25℃で培養した。得られた
菌体からプラスミドを抽出し(b-3)と同様にNruI消化に
おけるDNA分離パターンを調べたところpMS2960であるこ
とが分かった。更に、AMB-1から分離したpMS2960をMCR
に再導入したところ、形質転換体が得られた。この事か
らpMS2960は、AMB-1で複製可能でありシャトルベクター
としての機能を維持したプラスミドであることが分かっ
た。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば高いコピー数を実現し得
る新規な複製遺伝子及びこれを含むプラスミドベクター
が提供される。このベクターはサイズが小さくてコピー
数が高く、宿主によらず安定に維持される。特にコピー
数が高いために、これに特定のペプチド又はタンパク質
をコードする遺伝子を導入した組換えプラスミドベクタ
ーで形質転換したグラム陰性菌は該ペプチドやタンパク
質を菌体内に効率良く生成させる。

【００３１】

【配列表】 配列番号： １ 配列の長さ： 2534 bp 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 配列の種類： 他の核酸（プラスミドDNA複製領域） ハイポセティカル配列： No アンチセンス： No 起源： 生物名： マグネトスピルラム属(Magnetospirullum) 株名： MGT-1 （FERM P-16617） 直接の起源： CLONE: pMC18 配列の特徴： 特徴を表す記号：rep origin 存在位置：1..2489 特徴を決定した方法：E 配列： CTGCATTGAA TAATTCAAAG TGCATTGAAT AAGGCAGGGT GCATAAGGCG CAGCCTTTCG 60 ATTAACTCCA TTTCCTGCGG CGACAACGTC GCCGCTTGCC CCCCCGACGG GGGTCAAGCG 120 AGGCACAGGG ACCCGCCGCC TCTTGGCGGT GGGTGGCCGC AGCTTGACGC CCGAACACTC 180 CGCCGCCCAA CCCTGCCTGC TCTCCTCTGT TCAATGAAAT TGAACGGAGG AGATGCCTCC 240 CGGCGAGGGC CTTTCTTTCT TGCATAACGT TCATGCTACG TTCCAACGGT TATACCGTAT 300 GAGCGTCGAA CTGTATAATC GTTGAACAGT CGAACCATCC CCCCGCGCCA GCGCGGGGAG 360 CAGGGATGGG TTCGGGGGCC GGAAGTTAGG CAAATCGCGG AGCCGTGGCG CCCTCGGTAC 420 ATCCGCGAAA TCGGTTGACA CTTTGCCCCC AGAACGGCTG CAACCTACCG CTTGGCGACA 480 GCCGCGTGAC GGTACTTTTC CGCTGTGGAT TCGGACACGA ATATCTGTTC AGCAGCCAGG 540 GCGCGGGCGA TCTGGCGACG GCCGAGGCCC TGATGGGCCA ATTCTGTGAT CCGGTCTATG 600 ACCGCTTGGC TCATCGGCAC CCGAGGACCG CCGATACCAG ATTGGCGCAC ATCGCCCATG 660 GTGGGTGGAA CCGAGGGAGC CGGAGCCGGT GCAGATTTCT GCACAGTTGG TTCACGCCGT 720 CGTTCTAGCG CATCGAGACG CTGCACGATC ACGGCGAGCT GATCGTTGAC GTATTGTCGC 780 TCCTCGGACT GCGCAATTGT GATCAGAAAT TCGAGGAGCT CGGCCACGGT GACGCCGCGT 840 CGAAGGGCCA TAGCCTGTAT GTGGTCGCGG ACCGCATCAG GACAGCGAAT CGTCCATCTC 900 GTGTCTGACA CATTCCCGGT TTTTGTCTGA CTCATCGTCG CCCCCAATGT CTGACAGATT 960 CGAGAAAGAG TCATACCGGC TAACGCGAAC GCTGACAACG AATGTCTGAC AAAATGATGA 1020 TTACGTCAGA CATTGATGTC TGCCTAAATC GCAATAGTGT CTGACATGGT TTTTGGCGTT 1080 CCGTATATAA AATATGCGCC AAAATCTAGT GCGTCAGCCA AACGGCAAAC GCAACCAGTT 1140 GACACCATTT CCGGTTTTAT GAGACTGTGA AAAGACCAAA GGCCGCCTTG CGGCGGCCTA 1200 GGTGATTGTG GTCCCGGCGA CCAAGGCTGC GAAAACTTGG CGGTCCAGCA GCAGAGGAAG 1260 CCCGTTTGAA AGGTCCGGCT TGCGCCGGAA CCACCTAATG ACAATAGCAA TTCGCCGCAC 1320 AGTTTTCAAC ACCCAGCCCG CCATGATTCG CGGCGGCGTT GAACGTTGAA CAACAGACGT 1380 CTCAAACAGA CACCCGCAAA CGCGAACGGT ATCGGTTGCA GGATGCAGCC GCTGAACTGC 1440 TGCCGGATTA TCGGGTGCGG CATTGCCACC GCTCAATTGG ATGTGGCTGT GGCGAGTTGG 1500 TCAGCGTTGT TACCAATGGG CAGTCGGCCA ATTTCAAAGG CGTGCAGACC TGCGGCTCGG 1560 TCTGGCACTG CCCAATCTGT TCGGCAAAAA TCAGCAATGT TCGGCGCGGC GAGCTGAACG 1620 AGCTGCTGCG CTGGGGGCGG GAGAGGGAGC TGATCCCGCT GATGGTGACG CTGACAGGCC 1680 ATCACAATGC ACGGATGAGC CTCGCTGAAT GTCTGACGGT GATGAAGAAG GCCAAGCAGA 1740 GCCTTCACCA GTCTGGCCCA TGGAAGCGCC ATGTTGGCCC GGTGGTCGAA GGGCACGTCA 1800 CGGCAACGGA GGTCAATCGG TCACGCCGCC ATGGCTGGCA CGTCCATTTT CACGTCCTGA 1860 TGCTGATTGA GGCCGCCAGC GAGGCCGAAG CGATTGCGCT CGTGACCCGA CACCTCGAAC 1920 CTGAATGGCT CCGGCAGCTT GAGCGCCAAG GCAGCTGGGG CGGCGAACAT GCGTTAGACG 1980 TCCAGGGCGC AGCCGATGCG GATCGGTATG TGGCCAAGTG GGGCGCGGCT GAGGAATTGG 2040 CTCTGTCGGG CGAAAAGCGG GCGCGCGGCG ACGCCGAAAT TAAGGGTCAA ACGCCGTGGG 2100 AATTGTTGGC CGCTGCGGCT GATGGTGACG TCCAGGCTGG CCGCGATTTT GTGGAGTACG 2160 CGACCCTGTT TCATGGCAAA CGCCAGCTCG TTTGGTCGCG AGGACTGAAA GAGCGTGTCG 2220 GCCTCAAGGT GGTGGAAGAC GACGAGGCCG CCGGCGAGCT GGAGGATGTC GCAGATAGCG 2280 CCATCAACGA AGTGGCCGTG TTGCCGAGGC CGACTTGGCG TCACATCGTC CGGCGCAGGC 2340 TCCGCGCGGA TCTGCTGGCC GCCGCTCGTG ATGACGGATT CGATGGCGTC GCGCGGCTGC 2400 TCAATGAGCA TGGCATCGGC GGAGCTATGC CCGGCGGCTG GCGACCAATG CTTAGCGAAT 2460 ATACCGAGCA TATTGCGATG GCTGCGTGAC TCTTTTGGCC CACCGGCCTG AGGGAAATTT 2520 GCCTCGCAGA GCTC 2534

【００３２】 配列番号２ 配列の長さ： 3741 bp 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 環状 配列の種類： 他の核酸（プラスミドDNA） ハイポセティカル配列： No アンチセンス： No 起源： 生物名： マグネトスピルラム属(Magnetospirullum) 株名： MGT-1 （FERM P-16617） 直接の起源： CLONE: pMC18 ゲノム内での位置： 配列 GGATCCAATC GCTCGAGCGC GAGGTCACAA TTGGAGATGA TCCGCCAGCG CCGAAGCCAT 60 CATAACTGCA TTGAATAATT CAAAGTGCAT TGAATAAGGC AGGGTGCATA AGGCGCAGCC 120 TTTCGATTAA CTCCATTTCC TGCGGCGACA ACGTCGCCGC TTGCCCCCCC GACGGGGGTC 180 AAGCGAGGCA CAGGGACCCG CCGCCTCTTG GCGGTGGGTG GCCGCAGCTT GACGCCCGAA 240 CACTCCGCCG CCCAACCCTG CCTGCTCTCC TCTGTTCAAT GAAATTGAAC GGAGGAGATG 300 CCTCCCGGCG AGGGCCTTTC TTTCTTGCAT AACGTTCATG CTACGTTCCA ACGGTTATAC 360 CGTATGAGCG TCGAACTGTA TAATCGTTGA ACAGTCGAAC CATCCCCCCG CGCCAGCGCG 420 GGGAGCAGGG ATGGGTTCGG GGGCCGGAAG TTAGGCAAAT CGCGGAGCCG TGGCGCCCTC 480 GGTACATCCG CGAAATCGGT TGACACTTTG CCCCCAGAAC GGCTGCAACC TACCGCTTGG 540 CGACAGCCGC GTGACGGTAC TTTTCCGCTG TGGATTCGGA CACGAATATC TGTTCAGCAG 600 CCAGGGCGCG GGCGATCTGG CGACGGCCGA GGCCCTGATG GGCCAATTCT GTGATCCGGT 660 CTATGACCGC TTGGCTCATC GGCACCCGAG GACCGCCGAT ACCAGATTGG CGCACATCGC 720 CCATGGTGGG TGGAACCGAG GGAGCCGGAG CCGGTGCAGA TTTCTGCACA GTTGGTTCAC 780 GCCGTCGTTC TAGCGCATCG AGACGCTGCA CGATCACGGC GAGCTGATCG TTGACGTATT 840 GTCGCTCCTC GGACTGCGCA ATTGTGATCA GAAATTCGAG GAGCTCGGCC ACGGTGACGC 900 CGCGTCGAAG GGCCATAGCC TGTATGTGGT CGCGGACCGC ATCAGGACAG CGAATCGTCC 960 ATCTCGTGTC TGACACATTC CCGGTTTTTG TCTGACTCAT CGTCGCCCCC AATGTCTGAC 1020 AGATTCGAGA AAGAGTCATA CCGGCTAACG CGAACGCTGA CAACGAATGT CTGACAAAAT 1080 GATGATTACG TCAGACATTG ATGTCTGCCT AAATCGCAAT AGTGTCTGAC ATGGTTTTTG 1140 GCGTTCCGTA TATAAAATAT GCGCCAAAAT CTAGTGCGTC AGCCAAACGG CAAACGCAAC 1200 CAGTTGACAC CATTTCCGGT TTTATGAGAC TGTGAAAAGA CCAAAGGCCG CCTTGCGGCG 1260 GCCTAGGTGA TTGTGGTCCC GGCGACCAAG GCTGCGAAAA CTTGGCGGTC CAGCAGCAGA 1320 GGAAGCCCGT TTGAAAGGTC CGGCTTGCGC CGGAACCACC TAATGACAAT AGCAATTCGC 1380 CGCACAGTTT TCAACACCCA GCCCGCCATG ATTCGCGGCG GCGTTGAACG TTGAACAACA 1440 GACGTCTCAA ACAGACACCC GCAAACGCGA ACGGTATCGG TTGCAGGATG CAGCCGCTGA 1500 ACTGCTGCCG GATTATCGGG TGCGGCATTG CCACCGCTCA ATTGGATGTG GCTGTGGCGA 1560 GTTGGTCAGC GTTGTTACCA ATGGGCAGTC GGCCAATTTC AAAGGCGTGC AGACCTGCGG 1620 CTCGGTCTGG CACTGCCCAA TCTGTTCGGC AAAAATCAGC AATGTTCGGC GCGGCGAGCT 1680 GAACGAGCTG CTGCGCTGGG GGCGGGAGAG GGAGCTGATC CCGCTGATGG TGACGCTGAC 1740 AGGCCATCAC AATGCACGGA TGAGCCTCGC TGAATGTCTG ACGGTGATGA AGAAGGCCAA 1800 GCAGAGCCTT CACCAGTCTG GCCCATGGAA GCGCCATGTT GGCCCGGTGG TCGAAGGGCA 1860 CGTCACGGCA ACGGAGGTCA ATCGGTCACG CCGCCATGGC TGGCACGTCC ATTTTCACGT 1920 CCTGATGCTG ATTGAGGCCG CCAGCGAGGC CGAAGCGATT GCGCTCGTGA CCCGACACCT 1980 CGAACCTGAA TGGCTCCGGC AGCTTGAGCG CCAAGGCAGC TGGGGCGGCG AACATGCGTT 2040 AGACGTCCAG GGCGCAGCCG ATGCGGATCG GTATGTGGCC AAGTGGGGCG CGGCTGAGGA 2100 ATTGGCTCTG TCGGGCGAAA AGCGGGCGCG CGGCGACGCC GAAATTAAGG GTCAAACGCC 2160 GTGGGAATTG TTGGCCGCTG CGGCTGATGG TGACGTCCAG GCTGGCCGCG ATTTTGTGGA 2220 GTACGCGACC CTGTTTCATG GCAAACGCCA GCTCGTTTGG TCGCGAGGAC TGAAAGAGCG 2280 TGTCGGCCTC AAGGTGGTGG AAGACGACGA GGCCGCCGGC GAGCTGGAGG ATGTCGCAGA 2340 TAGCGCCATC AACGAAGTGG CCGTGTTGCC GAGGCCGACT TGGCGTCACA TCGTCCGGCG 2400 CAGGCTCCGC GCGGATCTGC TGGCCGCCGC TCGTGATGAC GGATTCGATG GCGTCGCGCG 2460 GCTGCTCAAT GAGCATGGCA TCGGCGGAGC TATGCCCGGC GGCTGGCGAC CAATGCTTAG 2520 CGAATATACC GAGCATATTG CGATGGCTGC GTGACTCTTT TGGCCCACCG GCCTGAGGGA 2580 AATTTGCCTC GCAGAGCTCA CGATAATTTG ACAAGGGCCG TAGGCCCGCA GGCAAATTGT 2640 CTAGTGAGTG TACAATTTTC AAATTCGAAG GTTATTGTAG AGCTGACGCT CTCAAGGTGA 2700 TGACGCCTAT GGCTGACGAT TCTGGCGTCC GGCGGATTGT TTGTCGGATT AGCAAAATCC 2760 ACACGATGGG CGTGCTGAAG GCCCGGTCGA ATCACAATCT CCGAACGCCA GGTCATGACC 2820 AGCTCGCACA TGTTGACCAG GCCAAATCCG CTCAGAATGA AATTCTGATT GGCACCGGCG 2880 ACGCCATGCT CGATGTGCAA TCAGCATTGA AATCGCGGCT GGTCGGCAAC ATTCGAAAAA 2940 ATGGCGTTAT CGCAGTGGAA ATGGTGATGA CAGCCCGGGC GGACTGGTTC GCTGCCGATC 3000 CCGCGCGAGC TGCCGCATTT AAGCAGCGGG TGCTGGACGA GGCGAATGCC AGATATGGGG 3060 CGAATCTCGT AACCGCAGTG TGGCACATGG ATGAAGAGGC TCCCCATCTG CATCTGTATA 3120 TCGTGCCGAT GGACCAACGG GGCAAACTGA ACTGCCGCGC GCAGTTCTCG ACGATGGCGT 3180 CGCTGAAACA ACTCCAGGAT TGGGCTGGCG TGGTCGGCAA TCCACTCGGC CTCGAACGCG 3240 GACGGCCAAA AGTGGAGTTT ATTGTCGATG GCGATGAGCC GCCGGAGAAC CAAAGCCCGG 3300 CGGAATATCG AGCTCAAACC AAACGCGACG CTGAAGCGGC AGCCGCCGCG CGGATCGCTG 3360 CCGAGCGTGA TGCTGCCGAG GCTGCGCGAC TGCTGATTGA GGCTCAGGAG CAGGCCGCCG 3420 CGATCCGCGC GGCCCAGGCT GAAATTATGG CAGAGCGTCG CCAGCTCAAT GAGGATAAGG 3480 CGAGTTTTGC TGAGACGCTG CGTAGCCACA CGAGGGCGAT GGGCCTGGCG TTTCGTTCAT 3540 GGCTGGCCAA TTTCGTCGGC CGCGGCCAGA TGCAGGCTGA TGGAGGGCCA TTGCTGACCT 3600 TTAAAGCCGC ATGCCCCGCC AGTAAGCGAG AGGAGCTACA GTCCGAGCCA GCTAATGCGT 3660 ACGCGCGCCT GGTGGTCGCT CATATGCCTG ATCGTGACGC TCTTGCCGTG CTCGAAACCA 3720 AAAGCGCGGA GGCCAAGGAA T 3741

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpMS-T1の制限酵素切断部位地図を示
す図である。

【図２】実施例２で行ったプラスミドpMCMLの作製を説
明する図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 神谷 晋司 東京都中央区日本橋一丁目13番１号 ティ ーディーケイ株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配
   列。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ配列を有する、
   複製能を有するプラスミドベクター。
3. 【請求項３】 さらに、接合伝達を司る遺伝子を有し、
   複製能及び伝達能を有する請求項２に記載のプラスミド
   ベクター。
4. 【請求項４】 配列表に記載の配列番号２の塩基配列で
   示されるDNA配列からなる、請求項３に記載のプラスミ
   ドベクター。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載ベクターにペプチ
   ド又はタンパク質をコードする遺伝子を導入してなる組
   み換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組み換えプラスミドで
   形質転換されたグラム陰性菌。
7. 【請求項７】 形質転換されるグラム陰性菌が磁性細菌
   である、請求項６の形質転換グラム陰性菌。
8. 【請求項８】 請求項６又は請求項７に記載の形質転換
   されたグラム陰性菌を増殖させ、前記のペプチドあるい
   はタンパク質を菌体内に生成させることからなる、ペプ
   チド又はタンパク質の製造方法。
9. 【請求項９】 形質転換されたグラム陰性菌が形質転換
   された磁性細菌である、請求項８の製造方法。