JPH11243968A - ストレス蛋白質ｈｓｐ４７の発現調節領域およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転
写調節（活性化）領域を明らかにし、それに基づいてＨ
ＳＰ４７の合成を制御し、繊維化を初めとするコラーゲ
ン蓄積による病態の治療剤を提供するものである。 【解決手段】 本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の
ゲノムＤＮＡにおける、転写開始点から上流２８０ｂｐ
及び第１イントロン中の１００ｂｐを含む領域からなる
ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性化領域に関する。
ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御することに
より、共発現するコラーゲンの発現を同時に制御するこ
とができ、肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾
患の治療用の組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストレス蛋白質Ｈ
ＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、転写開始点から上流
−２８０ｂｐまでの領域及び第１イントロン中の９３ｂ
ｐを欠損させてなるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の発現を
制御し得るプロモーター、及び、その塩基配列又はそれ
にハイブリダイズし得る塩基配列を有するポリヌクレオ
チドに関する。本発明のプロモーターにより、ストレス
蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御することができ、共
発現するコラーゲンの発現を同時に制御することができ
る。したがって、本発明は、肝硬変などのコラーゲンの
蓄積による各種疾患を治療するためのストレス蛋白質Ｈ
ＳＰ４７の転写活性の制御、及び、これらのポリヌクレ
オチド若しくはその相補鎖からなる医薬組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】小胞体に局在するストレス蛋白質ＨＳＰ
４７は、コラーゲンに特異性をもち、細胞内におけるプ
ロコラーゲンのプロセシングおよび分泌を助けているコ
ラーゲン特異的分子シャペロンである。

【０００３】ＨＳＰ４７はｃＤＮＡクローニングの結
果、そのアミノ酸配列からセリン型プロテアーゼ阻害剤
のファミリーであるセルピンファミリー（ｓｅｒｐｉｎ
ｆａｍｉｌｙ）に属する蛋白質であることが明らかに
なった。通常、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌ
ｙ）の蛋白質は、分泌されて細胞外でプロテアーゼ阻害
剤として機能するが、ＨＳＰ４７はＣ末端にＲＤＥＬ
（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）からなる小胞体保
持シグナルを持っており、このためＨＳＰ４７は小胞体
に局在している。

【０００４】一方、小胞体に局在する蛋白質は、そのＣ
末端にＫＤＥＬ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）配
列をもつことが知られており、その配列が、シスゴルジ
に存在するＫＤＥＬ受容体にトラップされて、ゴルジか
ら小胞体への逆行輸送の系に乗って戻ってくる、すなわ
ち、小胞体とゴルジのあいだをシャトルのように往復す
ることによって、結果的には小胞体に局在していると考
えられてきた。

【０００６】ＨＳＰ４７はそのＫＤＥＬ配列の代わり
に、ＲＤＥＬ配列をもったものだと考えられる。事実、
ＨＳＰ４７のＣ末端から、遺伝子工学的にＲＤＥＬ配列
を切り出してやると、そのような変異ＨＳＰ４７は、も
はや小胞体の中に留まることができず、細胞外に分泌さ
れてしまった。

【０００７】ＨＳＰ４７は、合成途中のプロコラーゲン
に結合することが確かめられた。このことは、第１にポ
リゾーム分画をとってきて、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈
降すると、さまざまの長さの新生プロコラーゲンが共沈
降してくる。第２に、きわめて短時間だけ［³⁵Ｓ］メチ
オニンでラベルした細胞を、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈
降し、非還元下に電気泳動すると、１本鎖プロコラーゲ
ンの位置に沈降バンドが見られたことから明にされた。

【０００８】これらは、ＨＳＰ４７が合成途上の１本鎖
プロコラーゲンに結合していることを示しているが、一
方、ＨＳＰ４７は３本鎖プロコラーゲンにも結合でき
る。これは、上記の後者の実験で、１本鎖バンドだけで
なく、３本鎖の位置にも共沈降するバンドが検出される
からである。

【０００９】即ち、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７は、プロ
コラーゲンのα鎖が合成されながら小胞体に挿入される
と同時に結合し、２本のα１鎖と１本のα２鎖が３本鎖
を形成した後も、それらの３本鎖プロコラーゲンに結合
していると考えられる。

【００１０】プロコラーゲンの小胞体内での３本鎖形成
はＣ末端から始まる。Ｃ末端まで合成が完了してはじめ
て、３本鎖形成が起こるのである。逆に言えば、Ｃ末端
までポリペプチドが合成されるまでは、それまでに合成
されたα鎖は、それ自身あるいは他のα鎖とフォールデ
ィング（ｆｏｌｄｉｎｇ）したり、凝集したりしては困
るわけである。それを防ぐためのなんらかの機構をそな
えているものと思われる。ＨＳＰ４７は、そのようなα
鎖のホールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）／凝集阻止に分
子シャペロンとして関わっている。

【００１１】ＨＳＰ４７は３本鎖プロコラーゲンに結合
したまま、小胞体からシスゴルジまで輸送され、そこで
プロコラーゲンから解離して、ＨＳＰ４７自身はＫＤＥ
Ｌ受容体に結合して、小胞体へ運び戻され、解離したプ
ロコラーゲンはゴルジ体を順次通過して、細胞表面へ分
泌されるのである。

【００１２】また、ＨＳＰ４７は、前述した正常下での
プロコラーゲンのプロセシングに関わる機能の他に、ス
トレス蛋白質としてストレス下におけるコラーゲンの品
質管理の機構をも持っている。すなわち、熱ストレスな
どによってプロコラーゲンに異常が生じると、そのよう
な異常コラーゲンが細胞外マトリックスに蓄積するのを
防ぐため、分泌を阻害する機構を備えている。これがい
わゆる品質管理機構（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ
機構）である。

【００１３】ところで、コラーゲンの３本鎖形成を阻害
する物質として、α，α′−ジピリジルという試薬があ
る。α，α′−ジピリジルは、鉄のキレート剤であり、
これによってプロコラーゲン上のリジン、プロリンのヒ
ドロキシル化が阻害され、Ｏ−グリコシレーションがで
きなくなって、プロコラーゲンの３本鎖形成が抑えられ
るのである。この試薬で細胞を処理し、そのあとで細胞
を放射性のメチオニンでパルスラベルし、さらに種々の
時間チェイスしたあと、細胞抽出液を抗ＨＳＰ４７抗
体、抗コラーゲン抗体で免疫沈降すると、無処理の細胞
では、コラーゲンは６０分後にはほぼすべて細胞外に分
泌されてしまうが、α，α′−ジピリジルで処理した細
胞では、２時間経ってもなおほとんどすべてのプロコラ
ーゲンは細胞内に留まっていることが確認された。

【００１４】このとき、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈降
し、ＨＳＰ４７と共沈降してくるプロコラーゲンの量を
調べると、正常細胞では６０分後にはすべてＨＳＰ４７
から解離していたものが、α，α′−ジピリジルで処理
した細胞では、２時間経ってもやはりＨＳＰ４７に結合
したままであることが明らかにされている。これは、３
本鎖形成ができなくなったような異常なプロコラーゲン
に対して、ＨＳＰ４７はいつまでも結合し続けて、それ
らが細胞外に分泌されるのを防いでいる、すなわち品質
管理機構を担っているからである。

【００１５】さらに、ＨＳＰ４７は、上に述べたように
コラーゲンに特異性をもった分子シャペロンであると考
えることができる。一方、ＨＳＰ４７の著しい特徴は、
それが機能的にコラーゲンと密接な関係をもっているだ
けでなく、その発現自体もまた、コラーゲンと厳密な相
関をもっている点にある。すなわち、コラーゲンを多量
に合成している細胞では、ＨＳＰ４７も多く合成され、
逆にコラーゲンを合成していない細胞では、ＨＳＰ４７
もまったく合成されていない。

【００１６】例えば、細胞の悪性転換（癌化）によって
コラーゲン合成が低下すると、ＨＳＰ４７も同程度に抑
制される。また、マウスのテラトカルチノーマ細胞であ
るＦ９細胞をレチノイン酸などで分化を誘導すると、Ｉ
Ｖ型コラーゲンなどの著しい誘導が見られるが、その時
ＨＳＰ４７も劇的に誘導される。このような機能面だけ
でなく、発現においても、分子シャベロンがその基質と
相関している（永田、「蛋白質 核酸 酵素」、第４１
巻第７号、第８８８頁、１９９６年）。上に述べたよう
なＨＳＰ４７とコラーゲンとの共発現から、病的な状態
においてコラーゲン合成が異常に昂進しているとき、Ｈ
ＳＰ４７も同時に発現の昂進が見られるのではないかと
考えた。これを確かめるため、ラットに四塩化炭素を投
与し、実験的肝硬変モデルを作成した。

【００１７】ラットに四塩化炭素を投与し、２週目から
１２週目まで肝臓を採取する。肝の切片をアザン染色す
ると、コラーゲン繊維は青く染色されるが、正常肝では
血管壁を除いてコラーゲンの染色は見られない。四塩化
炭素を与えて、４週目くらいからコラーゲン繊維の沈着
が見られはじめ、１２週目になると、明らかな偽小葉形
成が見られて、肝硬変症状を呈する。このような肝から
ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析によって、ＨＳ
Ｐ４７およびコラーゲンのｍＲＮＡ量を測定した。正常
ラットでは、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡも、Ｉ型コラーゲ
ン、III型コラーゲンのｍＲＮＡもいずれもほとんど検
出されなかった。これに対して、四塩化炭素を投与する
と、コラーゲンｍＲＮＡの蓄積が増大するとともに、Ｈ
ＳＰ４７のｍＲＮＡも顕著に蓄積しているのが観察され
た。ともに、投与２週間目からすでに顕著に誘導されて
いた。病理標本から肝硬変の進行程度を５段階に分けて
評価し、そのような病状の進行とＨＳＰ４７、コラーゲ
ンのｍＲＮＡ誘導との相関をとると、きわめて高い相関
係数を示し、これらが病状と相関している現象であるこ
とを示した。

【００１８】ＨＳＰ４７を産生しているのが、肝実質細
胞なのか、それとも肝組織に存在する別の細胞であるの
かを調べるため、肝標本をＨＳＰ４７およびＩ型コラー
ゲンに対するアンチセンスを用いたインシトウハイブリ
ッド形成法（ｉｎ ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）によって調べた。その結果、コラーゲンｍＲＮＡを
発現している細胞がまた、ＨＳＰ４７ｍＲＮＡを発現し
ていることが確かめられた。コラーゲンを産生している
のは伊東細胞であることが知られているので、伊東細胞
のマーカーであるデスミンに対する抗体を用いて、イン
シトウハイブリッド形成法（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と免疫染色を同じ細胞に対して試
みたところ、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡを産生しているのは
伊東細胞であることがわかった（永田、環境科学総合研
究所年報、第１５巻、第１３頁、１９９６年）。

【００１９】このように、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７
は、特に臨床的な観点から、肝硬変、腎繊維化など体内
において繊維化を伴った病変と密接な関係をもち、繊維
化に伴って、コラーゲンの蓄積とともに、ＨＳＰ４７も
急激に合成される。肝硬変などの繊維化は、現在肝移植
などの方法以外には治療の手段がなく、なんらかの方法
でコラーゲンの合成、蓄積を抑えることができれば、こ
れらの疾患の治療に大きな進歩が期待される。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＳＰ４７
の転写調節（活性化）領域を明らかにし、それに基づい
てＨＳＰ４７の合成を制御し、繊維化の治療に役立てる
ためのものである。具体的には、この転写活性化領域を
用いることによって、それに結合する転写因子の探索を
行なうことができる。さらに、転写因子と本転写活性化
領域との相互作用を調節することによって、繊維化を初
めとするコラーゲン蓄積による病態の治療方法及び治療
剤を提供するものである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明は、ストレス蛋白
質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、転写開始点から
上流２８０ｂｐ及び第１イントロン中の約１００ｂｐを
含む領域からなるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性
化領域に関する。ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性
を制御することにより、共発現するコラーゲンの発現を
同時に制御することができる。したがって、本発明は、
肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾患を治療す
るためのストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性の制御に
関する。

【００２２】本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲ
ノムＤＮＡにおける第１イントロン中の塩基配列であっ
て、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはひ
とつ以上の塩基が欠損、付加、置換してなる塩基配列、
又は、その塩基配列にハイブリダイズし得るポリヌクレ
オチド、特にＤＮＡに関する。また、本発明は、これら
のポリヌクレオチド又はその相補鎖からなる医薬組成
物、特にコラーゲンの蓄積による疾患の予防治療剤であ
る医薬組成物に関する。本発明の好ましい医薬組成物と
しては、肝硬変の予防治療剤が挙げられる。さらに、本
発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにお
ける、第１イントロン中の配列番号１に示される塩基配
列を欠損させてなる当該蛋白質の発現を制御し得るプロ
モーター、及び、さらに、転写開始点から上流２８０ｂ
ｐを欠損させてなる前記プロモーターに関する。また、
本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡに
おける、第１イントロン中の配列番号１に示される塩基
配列を欠損させることによるストレス蛋白質ＨＳＰ４７
の転写活性を制御する方法、及び、さらに、転写開始点
から上流２８０ｂｐを欠損させてなるストレス蛋白質Ｈ
ＳＰ４７の転写活性を制御する方法に関する。

【００２３】まず、本発明者は、ＨＳＰ４７の発現制御
が転写レベルであることから、コラーゲンとの共発現に
関わるＤＮＡ上のシスのエレメントを同定する目的でプ
ロモーター解析を行った。マウスのゲノムライブラリー
から、ＨＳＰ４７の全遺伝子をクローニングした（図
１）。ＨＳＰ４７をコードする遺伝子は、第I、第II、
第III、第IV、第Ｖ、及び、第VIの６つのエクソンから
なり、翻訳開始コドンは第III エクソンにあることがわ
かった。

【００２４】第１エクソンから上流約１．７ｋｂのプロ
モーター部分の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
後述するように、この配列の１３７３の位置（ＳａｃI
I）からの約２８０ｂｐ（ＣＣＧＣＧＧＡＡ・・・・Ａ
ＧＴＧＡＧＣＴＧ）がプロモーターとして重要な配列で
あることがわかった。また、第１エクソン領域から第３
エクソン領域までの塩基配列を配列表の配列番号３に示
す。約２００ｂｐまでの領域が第１エクソン領域であ
り、１２５０ｂｐ付近に第２エクソン領域があり、約３
６００ｂｐ付近からが第３エクソン領域である。後述す
る第１イントロン領域の９３ｂｐの塩基配列（配列番号
１参照）は、この配列番号３で示されるポリヌクレオチ
ドの８３６から９２８ｂｐまでの配列である。

【００２５】そして、このマウスのゲノムライブラリー
からのプロモーター領域を、転写開始点から上流５．５
Ｋｂまでをクローニングし、このプロモーター領域のど
の塩基配列がＨＳＰ４７の転写調節に関わっているか
を、ルシフェラーゼアッセイによって調べた。これは、
コラーゲンを産生している細胞では共発現の機構が機能
しており、ベースの転写活性が高いだろうと仮定して、
ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしてプロモーター
上流領域のルシフェラーゼを行うことにした。このアッ
セイはコラーゲンを産生するマウスの繊維芽細胞Ｂａｌ
ｂ／ｃ３Ｔ３を用いて行われた。

【００２６】その結果、転写開始点から上流２８０ｂｐ
までの領域をもてば、基本的な転写活性には十分である
ことが明らかになった（図２）。プロモーター領域を上
流５．５Ｋｂまでのばしてもベースの転写活性は変わら
なかった。しかし、この領域だけでは、コラーゲンとの
共発現を支えることはできず、コラーゲンを作っている
細胞においても、コラーゲン非産生細胞においても活性
の変化はなかった。

【００２７】次に、下流イントロンを含むプロモーター
領域で同様なルシフェラーゼアッセイを行った。即ち、
この２８０ｂｐの下流に、第１イントロンを含む領域を
つないだところ、イントロン部を含むプロモーター領域
では、それを含まないものに比べて４〜６倍のベースの
転写活性が認められた。また、コラーゲンを産生しない
ヒトの２９３細胞で同様な実験を行ったところ、イント
ロンの有無でベースの転写活性は変わらなかった。この
ことにより、コラーゲンとの共発現を支えているのは、
（２８０ｂｐ＋第１イントロン）の領域であることがわ
かった（図３参照）。即ち、ＨＳＰ４７遺伝子のイント
ロン領域にコラーゲンとの共発現に関わるシスのエレメ
ントが存在することが判明した。

【００２８】第１イントロンは、約３ｋｂときわめて長
いため、そのなかでどの領域が重要なのかを、種々の欠
損変異を作ることによって調べた。その結果、第１イン
トロンのＢｓｔＸＩ−ＳｆｉＩの間のフラグメントが重
要であることがわかった。この部分をさらに細かく調
べ、最終的に図４で示されるＢＳ１４及びＢＳ１８の２
つの欠損変異ではＨＳＰ４７の転写活性化能が見られな
いことが判明した。すなわち、この２つの領域が、上流
２８０ｂｐとともにコラーゲンの共発現に重要であるこ
とが明らかになった（図４）。ＢＳＩ４およびＢＳ１８
を含む約１００ｂｐ（配列番号１参照）を上流２８０ｂ
ｐのプロモーターとつないだところ（ＢＳ２１）、それ
だけでＨＳＰ４７の転写を活性化するのに必要十分であ
ることがわかった。

【００２９】これらの実験で使用した組換えベクターの
地図を図５及び６に示す。図５は、発現ベクターｐＧＬ
２−Ｂａｓｉｃに転写開始点の上流−２８０ｂｐからな
るプロモーターを組み込んだ遺伝子地図（Ｌｕｃ２８
０）を示す。また、図６は、発現ベクターｐＧＬ２−Ｂ
ａｓｉｃに転写開始点の上流−２８０ｂｐ及び第１イン
トロン領域からなるプロモーターを組み込んだ遺伝子地
図（Ｌｕｃ２８０（III)）を示す。

【００３０】即ち、図４のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１
８領域の活性を制御することにより、コラーゲン産生細
胞のコラーゲンの発現を制御できることがわかった。し
たがって、肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾
患は、疾患部位の細胞のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１８
領域の活性をなくすことにより、病態部位におけるコラ
ーゲンの産生を抑制させ、疾患の予防治療を行うことが
可能となる。本発明のコラーゲンの蓄積による疾患の予
防治療剤としては、図４のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１
８領域をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポ
リヌクレオチドを使用することもできる。

【００３１】本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を配
列表に示す。配列表中の塩基の記号として使用されてい
る「Ｈ」はＡ、Ｃ又はＴを示し、「Ｋ」はＧ又はＴを示
し、「Ｍ」はＡ又はＣを示し、「Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔを示し、「Ｒ」はＡ又はＧを示し、「Ｓ」はＣ又はＧ
を示し、「Ｖ」はＡ、Ｃ又はＧを示し、「Ｗ」はＡ又は
Ｔを示し、「Ｙ」はＣ又はＴを示す。

【００３２】

【実施例】つぎに実施例により、本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００３３】実施例１ （マウスのゲノムＤＮＡのクロ
ーニング） マウスＨＳＰ４７のｃＤＮＡ（Ｆ２）をプローブとし
て、マウス肝より調整したゲノムライブラリー（クロン
テック社より購入）を、コロニーハイブリダイゼイショ
ン法によりスクリーニングした。その結果、１．２ｋｂ
のゲノムクローンを得た。これをプローブにしてさらに
遺伝子の全長を釣るべくスクリーニングを行ない、最初
１１個のクローンを得たが、そのうち２個は同じもので
あったので、独立した１０個のクローンを得たことにな
った。最終的にもっとも長く、ＨＳＰ４７の全長をコー
ドしているクローン ４を得ることができた。クローン
４は、約１５ｋｂからなる遺伝子であった。この遺伝
子について、制限酵素地図（図１参照）を作成し、さら
に通常の方法によりＤＮＡシーケンサーによって遺伝子
の配列を決定した。過去のデータに基づいて、得られて
いたｃＤＮＡの配列をもとに、エクソン、イントロン構
造を決定し、最終的に図１に示したようなゲノム地図を
作成した。

【００３４】実施例２ （上流領域を用いたルシフェラ
ーゼアッセイ） ルシフェラーゼアッセイは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写開
始点の上流２８０ｂｐ（第１エクソンの転写開始点より
下流３８ｂｐも含む、以下同じ）の下流にレポーターと
してホタルルシフェラーゼ遺伝子をつなぎ、クロンテッ
ク社より購入したｐＧＬ２ｃｏｎｔｒｏｌのクローニン
グ部位に挿入した。対照としてＳＶ４０ウイルスのラー
ジＴ抗原のプロモーターを持つｐＧＬ２ｃｏｎｔｒｏｌ
（クロンテック社）を用いた（図中に、「ＧＬ２−ｃｏ
ｎｔｒｏｌ」で示す。）また、実施対象群間の導入効率
を補正するために、βガラクトシダーゼ遺伝子をレポー
ターとして、βアクチンのプロモーターの下流につない
だものを同時に細胞に導入した。細胞への導入は、直径
３５ｍｍの培養皿に７万個の細胞を植え込み、翌日調べ
たいプロモーター遺伝子および補正用のβガラクトシダ
ーゼ遺伝子を同時にリン酸カルシウム法で細胞に導入す
る。４時間後に培養液を交換し、４８時間培養した後に
細胞を回収し、凍結−融解によって細胞を壊した後、一
定量（１０μｌ）の細胞抽出液を用いて、ルシフェラー
ゼの活性測定、βガラクトシダーゼ活性を行なった。補
正はβガラクトシダーゼ活性を一定にすることによって
行なった。ルシフェラーゼの活性測定には、基質として
ピッカジーン（東洋インキ社製）１００ｕｌを混合し
て、混合直後より、ルミノメーターで発光を測定して活
性とした。βガラクトシダーゼ活性測定には、基質とし
てＯＮＰＧ（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｂ−Ｄ−ｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を用い、細胞抽出液と混合後、
３７℃で３０分保温後、４２０ｎｍの吸光度を測定して
活性とした。また、第１イントロンを含むプロモーター
活性を調べる場合には、転写開始点の上流２８０ｂｐの
下流に、翻訳開始コドンの前までの第１イントロン全体
（１．５ｋｂ）をつないで、その下流にルシフェラーゼ
遺伝子をつないだものを用いた。

【００３５】実施例３ （第１イントロンを含む場合の
ルシフェラーゼアッセイ） マウスＢａｌｂ細胞、およびヒト２９３細胞をそれぞれ
実施例２と同様の方法によって細胞に導入、同様に酵素
活性を測定する。結果を図３に示す。

【００３６】実施例４ （第１イントロンの一部を欠損
させた場合のルシフェラーゼアッセイ） マウスＢａｌｂ細胞、およびヒト２９３細胞をそれぞれ
実施例２と同様の方法によって細胞に導入、同様に酵素
活性を測定する。結果を図４に示す。

【００３７】実施例５ 図５に示す発現ベクターは、ＳａｃＩ・ＥａｇＩの５．
５ｋｂをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングし、次
に、これをＳａｃＩで切った後低濃度のＡｒａＩで部分
切断して−５．５ｋｂ（ＳａｃＩ）から＋３８ｋｂ（Ａ
ｒａＩ）までを得た。これをｐＧＬ２−ｂａｓｉｃのＳ
ａｃＩ・ＸｈｏＩサイトに挿入してＬＵＣ５．５を作製
した。ＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断して末端平衡処理を
してつなげ。ＬＵＣ２８０（図５）を作製した。

【００３８】実施例６ 図６に示す発現ベクターは、翻訳開始点直前にＳａｌＩ
サイトをＰＣＲで導入して−５．５ｋｂ（ＳａｌＩ）〜
＋３５８３ｋｂ（ＳｏｌＩＩ）のフラグメントを作り塩
基配列を確認した。これをＧＬ２−ｂａｓｉｃのＳａｃ
Ｉ・ＳｏｌＩサイトに挿入してＬＵＣ５．５（ＩＩＩ）
を作製した。ＸｈｏＩとＳａｃＩＩで切断し、末端平衡
処理をしてつなげＬＵＣ２８０（ＩＩＩ）（図６）を製
造した。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、コラーゲンと共発現するスト
レス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御できるポリヌク
レオチド領域を提供するものであり、これによりコラー
ゲンの蓄積による各種疾患、例えば、肝硬変などの病態
の予防治療を有効に行うことが可能となる。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 由来：マウスゲノム 配列： 1 10 1 20 1 30 1 40 1 50 CCTTTGGCAT CCAGGGCACG CATGGAGGCC CTTGGAAAAC TGGGGGCTTT 50 GGTTGCCTGG AAGTAAGGCC GAGGCCACAC CCTACTCTCT GAT 93 配列番号：２ 配列の長さ：１６５９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 由来：マウスゲノム 配列 1 10 1 20 1 30 1 40 1 50 TGGGCCATCA GGCATGTGAC GCTAGGCCTG GTACCATGAT TTTTTTTTTC 50 TTCTTCTCAA GACCTTTGAC TCTGAGATCT TACCAAGCTA AGATTCCTTC 100 ACGAAGTTCA AAGACGTTGT GGGGCTTCTG AATGATATTA TCATCTGTGG 150 CAGTCACTTG CAAATCCGTA TACTCTCTGA TCCTTTGATT GGGGTCTAAG 200 TCTATTAGGA TCTAATATTT CCCTCAGCCT GAAGTVGGGA AGGCTGVNAG 250 TCCATTCCCT CCCCCATTGT TCTCTATAAC TGCAGAGAAC TCATCTTTTR 300 GGATGCTGAG TGCAAGGATA CATCTGTTCC ACAGGCTCTG CATTTAGRAG 350 AGAGAAAATA CTTATGAGTC TGTTGATTGA ATGTGAGTGA ATGCATACAG 400 GGTCTCTCTG GGRCHNAAGC TGGGVCTCAG TRGCAGGATG CTTTCTTTCC 450 TGGTTTTCCT GAGGATCTGG GTTCCAGCCC CAGTGCACTG AAAARAANNS 500 GAAAAGCCTC TCACTCCACC TCCTCTCTAG TGATGTCCAT CTGTTGTCTG 550 TCATTCCACT ATCAGAAGAT AGGAGGATCC TAAAACAACA GGCCTCACCT 600 ACTGAATTCC CCACTAGCTG CACACACCCC TCACAAAGGA GGTCCTGAAG 650 GCAGGGACTT TGCCCAGTTG TGCAGATTTG TGCACGACAC TAGAATAGTA 700 AATAATACTA TCAGTTAACT CAGGGCTCAA GAAGCTATCT CAGTGTAAGA 750 GGTGGGGTGG GGCGGGAGAG CCTGAGATAG TGAGACCCTG AGCCCCAAGA 800 GGCAATGGAG ATAGGGAGGG AGGGAAGGAG ATAGCAGGGA TGACCCATTT 850 GAGACGGAGA AAGGGGCAGT TAGGACTTAA CATCAACCAA GGGTACTGGC 900 CCAGAAGGAA AGTCACACAA TGCTGTATAT AATTCATCCA GGATGTTCCC 950 TGCTGTATAC TACTTCATGT CCAGTGGAAC CACCTAGGTG TCTGTCTGAA 1000 ATCAGTTCAA GACTTGGTTG CCAGGGTGAG GGTCCAGCTA GAATTCTCAG 1050 GGCCTCTCCT CCCCAGGGAT GTTTCAAGGG TGAACCCTGG TTTGGAGAGG 1100 GACCCCTGCC TCTGACTTTT TCCTAAGGCA AAGGAGAGGG CCCCTGACTA 1150 AGGAGTAGCG TCAGGGGTCC CTGATTAAAG CTTGATAACA GTAGGCAATG 1200 GATCTACTGG GGCAGAGCAG GGTCATGTGG GGCAGAAGGG ATATGTGATC 1250 AGAGCAGGCT TGTGTGGGCA ACCCCGAGAA GACGACAACT CCAGTCCCCG 1300 AGCGCAGGAC TTTGGAGCCT GTCTGCCTTC AGTTCACTCT CGAGTCTAAA 1350 CCCTGCTTTT CCACGTCCAG GACCGCGGAA TCCCAAGAAT GCCCTGGCTC 1400 CCAAGGTCTA GCTGGTGCGG GAGGAGAGTC CCCTCTACCT AGTAGGGCGA 1450 GGGGGCAGTA GGACCCAGGG GCTGGGAGAG AGCCCGCAGG CACAGGGGCG 1500 GGAGCCAGGG TGGTTTGGGG GAGGTCTTTG GCTTTTTTTC TCCTCTCCGA 1550 GCCACGGCGC CCTCCGGAAG CGTTTCCAAC TTTCCAGAAG TTTCTTGGGA 1600 CAGGCAGGAA GGGGGTGGGG CCAGCCATAT ATAGATCCAG GGCCCGGGGC 1650 AGTGAGCTG 1659 配列番号：３ 配列の長さ：４２７０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 由来：マウスゲノム 配列 1 10 1 20 1 30 1 40 1 50 GAGCAGAGCC TGTCTGAGGA GCGATTGCCC TGTCGGTCCC GGAGCAGCCC 50 AGCCCGGCCC AGGTGAGGGG CGGGACGGCC GGGCGATTTG GGGTTGCGCA 100 TTGGCCAAGG GGGAACGGAT CGTCCAAAGC TTGGGGTCCT GACACAGGTG 150 GGCAGTGAAA GATCGGACTT GGAACTGTCA CTTGCCTGGG TTCCCTGGAG 200 CTGCGGTCTA GTACGCGGAC TGCCTGGTAA AGTACGGAGA AGTCTCAGCT 250 CGGGGAAGGT TAAAGGTGGT GAGAGGGAAT GCGTAGAGCT GGGACTAAAT 300 GCTGGTGACC TTCTGCACAA CTGAGAGGGG AGGGGAAARA CCTGACTGTY 350 CCATCGTCCA CCGGGGAAGG GCCAGCTCTG CAGTCCCTAA CTCAGGAGTG 400 GAGGCCCAGG GACCCGCAGT GATTGATCCC AGACCAACCT CCCCACAGGC 450 TGTGTAGGGG GCCTCTGAAC CTAGCACAGG AGGTGTAGAC TTGGTGTCTC 500 ATCTCTAGCT GTTAAGGACC CCCTTGCTTT GGGGAGCAGT CGCTTTTTAA 550 TCAGTATCCT ATGTGGAAGG TGGCCGGACT TGACCAATTA GTTCTGCTTT 600 CACCTCACCC GAAAGGGGTG TCGTCAGGGT CCACAGGCCC TGGGTGACTT 650 GAGTCACCTG GGTCCTTCCG TCCACCCATC TGGTTCCTGC AGGGCGAGGA 700 CTTCCTCTGA GGCTTTGAGG TATCCTGCCT CCAGCTTGGG GGACATTCCT 750 GAGCCTCCAG ACGAAAGGAA GAAGGCATCC ATTCCCTGTA TGGTCTAACG 800 GCCTAGCTAT CAACTTCCTG TGCTTCCTTC TGGGCCCTTT GGCATCCAGG 850 GCACGCATGG AGGCCCTTGG AAAACTGGGG GCTTTGGTTG CCTGGAAGTA 900 AGGCCGAGGC CACACCCTAC TCTCTGATAG TTCTGTACCC ATCCCCCATT 950 TCCGTCTGGT CCTTTGTCTC TCTCCGAGGA TTCCCTGCCG AGGTGTTTTT 1000 GTAGTGGGTT GCTGTGTAAC AGGACTCCAC AGTGGTCAGC CTGGGAGCTT 1050 TGCTGAAGGC AGAGCCCCGG GAGAAAGCCT GACCTGCTTG AGCCGAAGAA 1100 GGCCCAAGCT GGGCCCTGGT TTCTGCCTCT GCAAAAGCGG TCATCCACCT 1150 CCTTACTCCG GGTACCCACT GGGGACTGGG CCCGACCGGC CTCTGTTCCC 1200 CACGTCTCTA GGGGTTCCCA TTTCTTCACT CTTCTGTTTT CTTTCAGAAT 1250 GAAAAAGGCA GGCAATGATC TCCCTCTGAG GCCCTTTCAA GGTATCTTTA 1300 GACCCCACCA AGTGTCTGAG AAACCCCCTG GTGCTCCTCC CTGCCTCCTG 1350 GCATCTGCTC CCTTACAGGC TTCCCATCAC AGGCTCCCTG GCCCAGTGGT 1400 GGACACGGCC TTTGGCTCTG TGATATCTTA TATTTTTTTG GTTTTGTTTT 1450 GATGGGACTG TAAAATGTCT AACCTTGGCC GGAGGGCTGG CGTTTCCCTG 1500 TGGCAGATGG GCTGGGCTTG CCTGTTGCAG AATGGGCTGC GGGAGGTTGG 1550 CTTGCTTGCA GAGACTTGCC TACTTTCATC CCTAATGCTG GGCTTAACGG 1600 GGTGGCCCTT CTCCCCAGCC CTGCCTGCCC CCTCAGATTT TTGAGGCACA 1650 GTTGTAAAAC TAAAAMCCCY GAGGCTCCTG GATTCCCCCS GCAAATCCTC 1700 CTCACCCCAG GTTCCCAAGC CAGGGCTCCA GGTTCTTACC CTCAGCTGGG 1750 CTATAGAGAT AAAGCAGCTT TTGTCTGCCA CGTCACCAGG GGCCTTGCGG 1800 CTGCCAGAGG AATCCCTAAC TAGTCATTTG GAGCTTTTTG GAGAAGCCCC 1850 TCCCAGCCCC TGGTTGGCTG AGCGTGGGGG CTGTCAAGAT GGTGGGTGCC 1900 ACGTGCCTGT TGATATGATA TTTCCCATCA TGGATCATTT CACTGCTTCA 1950 CTCTCATTTG TGAGTGTACC ATGAGTTACA TGGTCCCCCC TGTTCTTTGA 2000 GGTCTAGTGA GGAAGGAGCC AATCTTGGAC TTGCAGATCC CACCTCTCTT 2050 AAGAGKGAGA GGTCTCACAT TGTTTCCCCA GGCAGCTGTG AGGCTGTGGT 2100 GCCCATCCCC TCGCCCCCTC CATGAGGCTG TGGTCCTCAT TCCCTCATCC 2150 CCTCCATGAG GCCGTGGTCC TCCATCCCCT CAACCCTCCA GGGSCTTTKC 2200 GCTGTTTCTC AAGGTCCCTA GATGGGAAGC AGCCGAGGAG GTATGGGAGC 2250 AGCCCGACCC AGCTATATAG GTTCCTCTCC AAAATNCCTC ACTCTTTCAG 2300 GCAGGCCAGG CTCTCAAGGG GCTTCCAGCA AAGTTTGGAA TTTTCTATCT 2350 TCCTAAAAGT CTGTGAAAGG GGGGGTCTTC CCGATCAGGG GCACCCCGTC 2400 TTCCTCCAGG GTTCTTCCTG AACTTTCGGC TCTGTGGTCT ACTTACCTGA 2450 ACTGCTGCTT GAAGCAGAGG TGGGGAGGGC AAGCTGAGGA GGCTGTGGGA 2500 ACGGAGACCT TTGTGACCCC GTGACTTCAC AAAAGGGGAC AGGGCTTGCC 2550 TTGGGGACTC CTGCTACTGC CGGAGTTTGG GATGGGAACT TGAAGGGATC 2600 TTTGAGGTTC TAGAAGAGAT GATGATGTGG CCATCCCATG GGAGTGCAGA 2650 ATGGAATCTG TGCCTCTGGC TTCCTAAAGG ATGGAGGGAA AGGGTCCNCD 2700 GMCTCCACTG AGCTGTGACT CACCCGCTTC CTCAGGATCT TGCCCTTGTT 2750 TGCTCCCTTA GGAAATCCAT GCCACTTGAA GTTTCTAAAG GCTTGATCCC 2800 AAGAGCGTTT GTCATGGGAT TTCCCATCCA GTTCAGGTGT TTTTTGTTTT 2850 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGTT TTTTGTTGGT AGGTGGGCAG 2900 GCTAAGTCCC TAAGGAAAGA GTCTGAGGCT GGTTGGTAAT GCATGCGAGT 2950 GCACACTCAA GGTCACCCTA GGGGCAGCAG AGTAGAGCAT CTGGGTTCCC 3000 CCATTTTAAT AGTGAACTGG GCAGTAACTT ATTAATGTCT CAGGGCAGAA 3050 TGCAAGGCAC AGAGAGGACC AGCTGACAAA TCCATTCCAC ATTGTGTCCT 3100 CTGCCCAGAC ACCTGTAGAC CCCCAGCCCA GCTGCTGCCT TTCCTAACCA 3150 ACAAAGGCCC TGAGGCTCTA TGAGACTAGA GCCAGATTTC ACAAAGGCCA 3200 ACATGGGTGC CATTCTGGCA GTAGCCCTGA CCCTTAGAAA CAGTTATGCC 3250 AAATGCCAGG CACTGGGATG CTGTAGGGAA CCAGATGTGC TAGATTTCCA 3300 GCCCTAGTGG CTACAGCCTA CTTCAGGACA CCTAGAGAGT CATAATAAGT 3350 GAATAATTAG GTATAAGTGT TGAATGTCCC ATGGGGGACT TCAATAGGTG 3400 GCCTAGTAAT ATACCAAAAA CTTTGTTTTA GGTAAAGAAA TCCAAGAAGG 3450 TCTCTGAGGG GCTGGGTAGC CCTGAGTCAG GTCTGGAATA AAGAACTGAG 3500 TTCTCTTGTT CCTGTCCCCT TGGTGGCTTA GTGGGTCGGC TAGGAAGAAA 3550 TGCATAAACT TCAGGGTGGC TCTCTCTTTC TCTGAAGCCC TCACAGGTCC 3600 TCTGTGGTGC ACACAGCCCA CCTCCCAGCC ATGCGCTCTC TCCTTCTGGG 3650 CACCTTATGC CTCTTGGCCG TGGCCCTGGC AGCCGAGGTG AAGAAACCCC 3700 TAGAGGCGGC AGCCCCTGGT ACTGCGGAGA AGCTAAGTTC CAAGGCGACC 3750 ACACTGGCAG AGCGCAGCAC AGGCCTGGCC TTCAGCCTAT ATCAGGCGAT 3800 GGCCAAAGAC CAGGCGGTGG AGAACATCCT CCTGTCACCC TTGGTGGTGG 3850 CCTCATCCCT GGGTCTTGTG TCACTGGGTG GTAAAGCCAC CACAGCGTCG 3900 CAGGCGAAGG CAGTGCTGAG CGCTGAGAAG CTGCGCGATG AGGAGGTGCA 3950 CACGGGGCTG GGTGAGCTGC TCCGCTCCCT CAGCAACTCC ACTGCGCGCA 4000 ACGTGACCTG GAAACTGGGC AGCCGCCTGT ACGGGCCCAG CTCCGTGAGC 4050 TTCGCCGATG ACTTCGTGCG CAGCAGCAAG CAACACTACA ACTGCGAACA 4100 CTCCAAGATC AACTTCCGAG ACAAGCGCAG CGCCCTGCAG TCCATCAACG 4150 AGTGGGCCTC GCAGACCACG GACGGCAAGC TGCCTGAGGT CACCAAGGAT 4200 GTGGAGCGCA CGGATGGGGC ACTGCTTGTG AACGCCATGT TCTTTAAGCG 4250 TGAGTCTCAG GGATGGGGTG 4270

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のマウスゲ
ノムの遺伝子地図を示すものである。

【図２】図２は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の第１イン
トロンの上流５．５Ｋｂをプロモーターとした場合のル
シフェラーゼアッセイの結果を示すものである。

【図３】図３は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写開始
点から上流２８０ｂｐ及び第１イントロン領域を含むプ
ロモーターを用いた場合のルシフェラーゼアッセイの結
果を示すものである。

【図４】図４は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の第１イン
トロン領域の一部の塩基配列を欠損させたプロモーター
を用いた場合のルシフェラーゼアッセイの結果を示すも
のである。

【図５】図５は、第１エクソン領域の上流２８０ｂｐま
でのプロモーターを組み込んだ発現ベクターｐＧＬ２−
Ｂａｓｉｃを示す。

【図６】図６は、第１エクソン領域の上流２８０ｂｐ及
び第１イントロン領域までのプロモーターを組み込んだ
発現ベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃを示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮ
   Ａにおける第１イントロン中の塩基配列であって、配列
   表の配列番号１に示される塩基配列若しくはひとつ以上
   の塩基が欠損、付加、置換してなる塩基配列、又は、そ
   の塩基配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のポリヌクレオチ
   ド又はその相補鎖からなる医薬組成物。
4. 【請求項４】 相補鎖がアンチセンスである請求項３に
   記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】 医薬組成物が、コラーゲンの蓄積による
   疾患の予防治療剤である請求項３又は４に記載の医薬組
   成物。
6. 【請求項６】 コラーゲンの蓄積による疾患が肝硬変で
   ある請求項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮ
   Ａにおける、第１イントロン中の配列番号１に示される
   塩基配列を欠損させてなる当該蛋白質の発現を制御し得
   るプロモーター。
8. 【請求項８】 さらに、第１エクソンの上流２８０ｂｐ
   を欠損させてなる請求項７に記載のプロモーター。
9. 【請求項９】 ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮ
   Ａにおける、第１イントロン中の配列番号１に示される
   塩基配列を欠損させることによるストレス蛋白質ＨＳＰ
   ４７の転写活性を制御する方法。
10. 【請求項１０】 さらに、第１エクソンの上流２８０ｂ
    ｐを欠損させてなる請求項９に記載のストレス蛋白質Ｈ
    ＳＰ４７の転写活性を制御する方法。