JPH11146788A

JPH11146788A - ゲノムマーカーの単離方法

Info

Publication number: JPH11146788A
Application number: JP9331268A
Authority: JP
Inventors: Toshikazu Ushijima; 俊和牛島; Yukinari Yoshida; 幸成吉田; Minako Nagao; 美奈子長尾; Takashi Sugimura; 隆杉村
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 1999-06-02

Abstract

(57)【要約】【課題】被検体間で塩基配列の異なるDNA領域を効率
的に増幅し単離する方法であって、遺伝子型の判定に好
適なゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応産物を調製する
工程を含む方法、および該方法により単離されたDNAを
用いて簡便に遺伝子型を判定する方法を提供することを
課題とする。【解決手段】個体間で差異を示すDNAを増幅し単離す
る方法として、従来のゲノムDNAの制限酵素断片のポリ
メラーゼ連鎖反応産物に代えて、ゲノムDNAを鋳型とし
た選択性の緩いプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応
の反応産物をアンプリコンとして利用する方法を開発し
た。さらに、選択性の緩いプライマーによるポリメラー
ゼ連鎖反応の反応産物は精製・濃縮なしにそのまま用い
た場合でも有効に遺伝子型の判定に用いることができる
ことを見いだした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子工学の分野、
特に、被検体間で塩基配列の異なるDNA領域に相当するD
NAを増幅し単離する方法、および該方法により単離した
DNAを用いる遺伝子型の判定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】個体間で異なるDNAを単離する方法とし
て、IGCR法（Yokota, H. and Oishi, M. Differential
cloning of genomic DNA: cloning of DNA with an alt
ered primary structure by in-gel competitive reass
ociation. Proc. Natl. Acad.Sci. USA.87, 6398-402
(1990)）など幾つかのゲノムサブトラクション法があ
る。これらの方法は、２種類のソース（異なる個体、腫
瘍と正常など）のDNAのうち、片方のDNAソース（テスタ
ー）にのみ存在し、他方のソース（ドライバー）には存
在しないDNA、若しくは二つのソースで大きさが異なるD
NAを同定しようという方法である。少量のテスターDNA
と、大量のドライバーDNAとを混合し、変性・再会合す
ると、テスターDNAの圧倒的多数はドライバーDNA中の相
補鎖と再会合するが、テスターDNAにしか存在しないDNA
は、テスター由来の相補鎖と再会合する（競合的再会
合）。理論的には、a) ドライバーDNAを予めアビジン等
で標識しておき、ドライバー由来のDNAと再会合したDNA
断片を除去する方法、または、b)テスターDNAの両端を
アダプター標識しておき、ベクターへの接合可能性等に
より、テスター同士再会合したDNAを選択する方法、に
より、テスター同士再会合したDNAを選択的に得ること
ができる。しかし、従来のゲノムサブトラクション法で
は、ゲノムの複雑さ故に、再会合のステップが不十分に
なり、再現性のある結果を得ることが困難であった。

【０００３】1993年に発明されたRDA法（Lisitsyn, N.,
Lisitsyn, N. and Wigler, M. Cloning the differenc
es between two complex genomes. Science. 259, 94
6-51(1993)）は、ゲノム全体ではなく、ゲノムの一部を
代表として用いて競合的再会合を行うことにより、従来
のゲノムサブトラクション法では困難であった再現性あ
る結果を得ることに成功した。六塩基認識制限酵素によ
りゲノム全体を切断後、全ての断片にPCRプライマーと
相補的な配列を有するアダプターを接着し、PCRにより
増幅可能な断片のみを得て、それをゲノムの代表（アン
プリコン）として、競合的再会合を行うという原理であ
る。更に、競合的再会合の結果得られるテスター同士が
再会合したDNA断片を、PCR法により選択的に増幅すると
いうのも、RDA法の新規な点であった。この方法により
ヒト多型マーカー、腫瘍での遺伝子変化等が同定されて
きた。本発明者等は、RDA法により分離したゲノムマー
カーは、アンプリコンに対してハイブリダイズする/し
ないの多型を示し、アンプリコンの高密度ドットブロッ
トに使用できることを見いだし、文献に発表した (Toyo
ta, M., Canzian, F., Ushijima, T., Hosoya,Y., Kura
moto, T., Serikawa,T., Imai, K., Sugimura, T. and
Nagao, M. A rat genetic map constructedby represe
ntational difference analysis markers with suitabi
lity for large-scale typing. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 93, 3914-9(1996)）。

【０００４】しかし、従来のRDA法では、ゲノムDNAの制
限酵素断片についてのポリメラーゼ連鎖反応産物をアン
プリコンとして利用しており、このポリメラーゼ連鎖反
応により増幅される範囲の制限酵素断片（これは制限酵
素断片の鎖長や配列に依存する）が、制限酵素断片の約
1/100〜1/10をも占めていた。このためゲノムを代表す
るアンプリコンの中のDNA断片の種類が多すぎ、RDA法に
より単離したゲノムマーカーを、被検体から同様の条件
で調製したアンプリコンに対しハイブリダイゼーション
させ遺伝子型の判定を行うと、検出されるシグナルが薄
いという問題があった。また、遺伝子型の判定に用いる
アンプリコンの調製において、DNAの精製・濃縮が必要
なため、操作が煩雑であり、多くの検体の遺伝子型の判
定の際に大きな障害となっていた。さらに、ゲノムDNA
の制限酵素断片を基にアンプリコンを調製していたた
め、アンプリコンの作成のために多量のゲノムDNAを必
要とし、臨床検査等に不適であった。また、制限酵素に
依存してアンプリコンを作成するために、制限酵素で特
異的に認識される配列における個体間の相違しか検出で
きず、分離できるマーカーの数が限られていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、被
検体間で塩基配列の異なるDNA領域を効率的に増幅し単
離する方法であって、遺伝子型の判定に好適なゲノムDN
Aのポリメラーゼ連鎖反応産物を調製する工程を含む方
法、および該方法により単離されたDNAを用いて簡便に
遺伝子型を判定する方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、個体間で差異を示
すDNAを増幅し単離する方法として、従来のゲノムDNAの
制限酵素断片のポリメラーゼ連鎖反応産物に代えて、ゲ
ノムDNAを鋳型とした選択性の緩いプライマーによるポ
リメラーゼ連鎖反応の反応産物をアンプリコンとして利
用する方法を開発した。この方法において本発明者等は
特に、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動した
際に電気泳動像がスメア状となるようにプライマーおよ
び反応条件を設定してポリメラーゼ連鎖反応を行うこと
で、個体間で差異を示すDNAを効率的に単離することが
できることを見いだした。さらに、本発明者等は、複数
の被検体から調製したゲノムDNAを鋳型に選択性の緩い
プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を行い、その
反応産物に対して単離したDNAをプローブとしてハイブ
リダイゼーションを行った結果、該ポリメラーゼ連鎖反
応の反応産物は精製・濃縮なしにそのまま用いた場合で
も有効に遺伝子型の判定に用いることができることを見
いだした。

【０００７】即ち、本発明は、被検体間で塩基配列の異
なるゲノムDNA領域に相当するDNAを増幅する方法であっ
て、選択性の緩いプライマーによるポリメラーゼ連鎖反
応産物をアンプリコンとして用いる方法、及び該アンプ
リコンに対し単離したDNAをハイブリダイズさせること
を特徴とする簡便な遺伝子型の判定方法に関し、より具
体的には、（１）被検体間で塩基配列の異なるゲノム
DNA領域を増幅する方法であって、（ａ）選択性の緩い
プライマーを用いて各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリ
メラーゼ連鎖反応を行う工程、（ｂ）工程（ａ）におい
て増幅された各被検体のDNAを混合して、変性後、ハイ
ブリダイゼーションを行う工程、（ｃ）工程（ｂ）にお
けるハイブリダイゼーションにより生成された、単一の
被検体のみに由来する二本鎖DNAを、ポリメラーゼ連鎖
反応により選択的に増幅する工程、を含む方法、（２）
被検体間で塩基配列の異なるゲノムDNA領域を増幅す
る方法であって、（ａ）選択性の緩いプライマーを用い
て各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応
を行う工程、（ｂ）工程（ａ）において増幅された一方
の被検体のDNAの末端をアダプター標識し、標識してい
ない増幅された他の一方の被検体のDNAと混合して、変
性後、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｃ）工程
（ｂ）におけるハイブリダイゼーションにより生成され
た両端にアダプター標識を有する二本鎖DNAを、ポリメ
ラーゼ連鎖反応により選択的に増幅する工程、を含む方
法、（３）ポリメラーゼ連鎖反応産物をアガロースゲ
ル電気泳動した際の電気泳動像がスメア状になる条件下
で、工程(ａ)におけるポリメラーゼ連鎖反応を行う、
（１）または（２）に記載の方法、（４）被検体間で
塩基配列の異なるゲノムDNA領域に相当するDNAを単離す
る方法であって、（ａ）選択性の緩いプライマーを用い
て各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応
を行う工程、（ｂ）工程（ａ）において増幅された各被
検体のDNAを混合して、変性後、ハイブリダイゼーショ
ンを行う工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイ
ゼーションにより生成された、単一の被検体に由来する
二本鎖DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応により選択的に増
幅する工程、（ｄ）工程（ｃ）により増幅されたDNAを
単離する工程、を含む方法、（５）被検体間で塩基配
列の異なるゲノムDNA領域に相当するDNAを単離する方法
であって、（ａ）選択性の緩いプライマーを用いて各被
検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行う
工程、（ｂ）工程（ａ）において増幅された一方の被検
体のDNAの末端をアダプター標識し、標識していない増
幅された他の一方の被検体のDNAと混合して、熱変性
後、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｃ）工程
（ｂ）におけるハイブリダイゼーションにより生成され
た両端にアダプター標識を有する二本鎖DNAを、ポリメ
ラーゼ連鎖反応により選択的に増幅する工程、（ｄ）工
程（ｃ）により増幅されたDNAを単離する工程、を含む
方法、（６）ポリメラーゼ連鎖反応産物をアガロース
ゲル電気泳動した際の電気泳動像がスメア状になる条件
下で、工程(ａ)におけるにポリメラーゼ連鎖反応を行
う、（４）または（５）に記載の方法、（７）配列番
号：１乃至７のいずれかに記載の塩基配列からなるDN
A、（８）被検体の遺伝子型を判定する方法であっ
て、（ａ）（４）乃至（６）のいずれかの方法で単離さ
れたDNAの塩基配列の少なくとも一部を含む配列からな
るプライマーを用いて被検体のゲノムDNAをポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅する工程、（ｂ）工程（ａ）で得
られた増幅産物に対して、（４）乃至（６）のいずれか
の方法で単離されたDNAの塩基配列の少なくとも一部を
含む配列からなるプローブをハイブリダイズさせる工
程、（ｃ）工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション
がおこったか否かを検出する工程、を含む方法、（９）
ハイブリダイゼーションがドットブロットハイブリダ
イゼーションである、（８）に記載の方法、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、被検体間で塩基配列の
異なるゲノムDNA領域に相当するDNAを増幅する方法に関
する。本発明の方法においては、まず、プライマーを用
いて各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反
応を行う（アンプリコンの調製。工程(ａ)）。本発明の
方法において用いられる被検体としては特に制限はな
い。本発明の方法によれば、個体間、組織間、細胞間な
ど様々な被検体の間で異なる塩基配列を増幅することが
できる。被検体の生物種にも特に制限はなく、ヒト、ラ
ット、マウスなどの動物の他、植物や微生物などにも適
用可能である。被検体からのゲノムDNAの単離は、当業
者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、
フェノールクロロホルム法をはじめ、多くの市販のキッ
トにより行うことが可能である。

【０００９】本発明の方法においては、ゲノムDNAの増
幅に用いるプライマーとして、選択性の緩いプライマー
を用いることを特徴とする。本発明において「選択性の
緩いプライマー」とは、ゲノム上の複数のDNA領域を増
幅しうる配列を有するプライマーを指す。従来のRDA法
に用いられていた特定のアダプター配列に相補的な塩基
配列としてのプライマーとは異なる。プライマーは、有
効に多型マーカーを分離するために、GC塩基対に富む配
列で、鎖長は11〜17merであることが好ましい。また、
より多くのDNA断片を用いて競合的再会合（下記の工程
(ｂ)）を行い、より多くの多型を示すDNA断片を分離す
るために、ポリメラーゼ連鎖反応産物がアガロースゲル
電気泳動像においてスメア状（鮮明なバンドではない状
態）を呈するようなプライマーであることが好ましい。

【００１０】ポリメラーゼ連鎖反応の条件としては、通
常、1.5〜5mMマグネシウム濃度で、25〜72度でアニール
し、20〜50サイクルの条件で行うが、高マグネシウム濃
度下(2〜5mM)で、アニーリング温度を各プライマーのTm
値よりも低く設定し、30〜40サイクルで行うことが好ま
しい。これにより、非特異的なアニール反応を促進し、
より多くのDNA断片を増幅することが可能である。

【００１１】これにより増幅されたDNA（アンプリコ
ン）は、マーカー分離のための競合的再会合（下記の工
程(ｂ)）に用いる場合には、通常、精製し、アダプター
の除去を行うが、遺伝子型の判定に用いる場合、ポリメ
ラーゼ連鎖反応産物をそのままドットブロットすること
が可能である。

【００１２】本発明の方法においては、次いで、増幅さ
れた各被検体のDNAを混合して、変性後、ハイブリダイ
ゼーションを行う（競合的再会合。工程(ｂ)）。

【００１３】この工程においては、後述の工程(ｃ)にお
いてテスター同士の二本鎖DNAを選択的に増幅するため
に、まず、被検体の一方を混合前に標識する。標識とし
ては、例えば、アダプター標識、ビオチン標識などが挙
げられるが、これらに制限されない。アダプター標識を
行う場合にはテスター側の被検体のDNAの末端を標識す
る。アダプター標識としては、例えば、プライマー内に
制限酵素用にBamHIの部位が挿入されていた場合には、
後述の表2に記載のオリゴヌクレオチドにより作成した
アダプターが挙げられる。これ以外でも、様々なオリゴ
ヌクレオチドを用いてアダプターを作成することができ
る。テスターDNAへのアダプターの結合は、例えば、上
記工程(ａ)におけるポリメラーゼ連鎖反応のためのプラ
イマー内に制限酵素認識部位を設置すれば、これを制限
酵素消化し、断端DNAをゲル濾過のカラム等で除去後、D
NAライゲースにより接着することにより行うことができ
る。また、プライマー内に制限酵素認識部位を設置しな
くても、平滑末端にアダプターを接着することも可能で
ある。断端DNAの除去は、ゲル濾過以外にも、電気泳動
によるサイズ選択、メンブレンフィルターによる除去
等、様々な方法で行うことが可能である。

【００１４】標識したテスターDNAは過剰量のドライバ
ーDNAと混合する。混合比は、通常、0.01:40〜4:40であ
る。マーカーの分離効率の最適化のため、混合比は上記
工程(ａ)におけるポリメラーゼ連鎖反応の反応産物のゲ
ノム濃縮度（アンプリコンがゲノムのどの程度を代表し
ているか）に依存して適宜選択することが好ましい。競
合的ハイブリダイゼーションの効率を高めるため、混合
後のDNA濃度は、濃縮により高濃度（通常0.1〜2μg/μl
程度）にすることが好ましい。混合DNAの変性は、熱変
性であれば、90〜98度で1〜60分の条件で行う。DNAの損
傷を最小限に抑え、かつ十分な変性を得るためには、95
度で10分程度の条件が好ましい。なお、熱変性以外に
も、アルカリ変性で行うことも可能である。変性後のハ
イブリダイゼーションの条件の一例としては、1M NaCl
の存在下にて67度で10〜60時間である。NaCl濃度を変え
た場合には、それに応じて温度条件を変更することで、
同等の条件を実現することができる。このハイブリダイ
ゼーションにより、ドライバーDNA中に相補的なものが
存在しないテスターDNA（即ち、テスター側の被検体に
特異的なDNA）に限り、テスターDNA同士で二本鎖DNAを
形成する。その他のテスターDNAは、テスターDNAに相補
的な過剰に存在するドライバーDNAと二本鎖DNAを形成す
る。これにより生成したテスター／テスター二本鎖DNA
は両端に標識を有するのに対し、テスター／ドライバー
二本鎖DNAは片端にのみ標識を有する。

【００１５】一方、標識としてビオチン標識を用いる場
合には、ドライバー側の被検体のDNAの標識を行う。標
識は、末端でなくとも良い。ビオチン標識したドライバ
ー側のDNAは標識していないテスター側のDNAと混合して
ハイブリダイゼーションを行う。テスター／ドライバ−
混合比やハイブリダイゼーションは上記アダプター標識
した場合と同様の条件で行うことができる。このハイブ
リダイゼーションの結果生じた、ドライバー／ドライバ
ー二本鎖DNA、ドライバー／テスター二本鎖DNAはビオチ
ン標識されているため、ビオチンとの親和性を有するア
ビジンを固定したビーズなどを用いて反応系から除去す
る。これによりテスター／テスター二本鎖DNAのみを残
存させることができる。なお、互いに親和性を有するも
のであれば、ビオチン−アビジン系以外にも本発明の方
法に適用しうる。

【００１６】本発明の方法においては、次いで、ハイブ
リダイゼーションにより生成された、単一の被検体に由
来する二本鎖DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応により選択
的に増幅する（テスター特異的DNAの選択的増幅。工程
(ｃ)）。

【００１７】標識としてアダプターを用いた場合には、
まず、テスター／ドライバー二本鎖DNAおよびテスター
／テスター二本鎖DNAの、標識の反対側（相補鎖）を充
填する。充填は、例えば、Taqポリメラーゼを利用して
行うことができる。Taqポリメラーゼ以外にも、クレノ
ウ酵素や他のDNAポリメラーゼなどを利用することも可
能である。次いで、標識に対応するプライマーを用いた
ポリメラーゼ連鎖反応を行う。ポリメラーゼ連鎖反応の
反応条件の一例を示せば、94〜98度の変性を1分、70度
でのアニール、及び3分の伸長反応を10〜30サイクルで
ある。ポリメラ−ゼ連鎖反応のサイクル数は、競合的再
会合の結果に応じて適宜選択する。このポリメラーゼ連
鎖反応においては、テスター／ドライバー二本鎖DNAは
片側からのみ伸長反応が起こり、複製されたDNAは次の
反応サイクルでは鋳型とならず一本鎖DNAとして蓄積さ
れる。従って、一次関数的にしか増幅されない。一方、
テスター／テスター二本鎖DNAは、両端から伸長反応が
起こり、複製されたDNAの両方の鎖は、次の反応サイク
ルにおいて再び鋳型DNAとして利用される。このため指
数関数的に増幅される。その結果、このポリメラーゼ連
鎖反応終了時には、テスター/テスターDNA由来の増幅産
物がDNAの大部分を占める。しかしながら、テスター／
ドライバー二本鎖DNA由来の増幅産物（大部分が一本鎖D
NAである）も量的にはある程度含まれる。このため、ポ
リメラーゼ連鎖反応後、マングビーンヌクレアーゼなど
を用いて一本鎖DNAを消化し、その後、第二回目のポリ
メラーゼ連鎖反応を10〜30サイクル行い、目的のDNAを
さらに増幅すると好ましい。

【００１８】なお、誤った増幅（テスター特異的DNAで
ないDNAの増幅）を最小限に抑えるために、上記の工程
(ｂ)および工程(ｃ)からなるサイクルを必要に応じて数
回繰り返すと好ましい。この際、１サイクル目で用いた
標識と異なる標識を用いると、１サイクル目で標識に近
似した配列に挟まれていたためなどの理由により誤って
増幅されたDNAの増幅を２サイクル目において消去する
ことが可能である。

【００１９】一方、上記工程(ｂ)において標識としてビ
オチンを用いた場合には、残存した標識されていないテ
スター／テスター二本鎖DNA（テスター特異的DNA）にア
ダプターを結合し、アダプターに対応するプライマーを
利用したポリメラーゼ連鎖反応により、テスター特異的
DNAを増幅する。

【００２０】用いられるアダプターとしては特に制限は
なく、例えば、アンプリコン作成に使用したプライマー
内に制限酵素部位がある場合には、その部位を持つ任意
のアダプターを用いることが可能である。例えば、制限
酵素用にBamHIの部位が組み込んであるプライマーを用
いた場合、後述の表2に記載のオリゴヌクレオチドによ
り作成したアダプターを用いることが可能である。テス
ター／テスター二本鎖DNA（テスター特異的DNA）へのア
ダプターの結合は、例えば、プライマー内に制限酵素部
位がある場合には、その部位を持つ任意のアダプターを
接着末端のライゲーションにより、一方、プライマー内
に制限酵素部位がない場合には、テスター/ドライバー
の混合前に平滑末端に対しDNAライゲースを作用させる
ことにより行うことができる。テスター／テスター二本
鎖DNAのポリメラーゼ連鎖反応は、上記の工程(ａ)と同
様の条件で行うことが可能である。

【００２１】本発明は、また、被検体間で塩基配列の異
なるゲノムDNA領域に相当するDNAを単離する方法に関す
る。この方法は、上記の増幅方法により増幅されたDNA
を単離する工程（工程(ｄ)）を含む。増幅されたDNAの
単離は、例えば、制限酵素により消化し、断端除去後プ
ラスミドに組み込み、XL1Blue（Stratagene社製）等の
コンピテントセルに形質転換し、多くの形質転換体のイ
ンサートをPCR法により増幅することにより行うことが
可能である。また、この増幅産物をドットブロットし、
同一のフィルターに、上記の工程(a)により得られたア
ンプリコンをブロットしておくことにより、各形質転換
株の異同の確認と同時に、多型の有無が確認できる。単
離されたDNAがテスター側の被検体に特異的なDNAである
か否かの最終的な確認は、上記の工程(ａ)により得られ
たアンプリコンに対するサザンブロット解析やドットブ
ロット解析により行うことができる。

【００２２】また、本発明は、上記の単離方法により単
離されたDNAをプローブとして用いる遺伝子型の判定方
法に関する。本発明の遺伝子型の判定方法においては、
まず、上記の単離方法で単離されたDNAの塩基配列の少
なくとも一部を含む配列からなるプライマーを用いて被
検体のゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅す
る。「単離されたDNAの塩基配列の少なくとも一部を含
む配列からなるプライマー」としては、特に、上記の本
発明の増幅・単離方法においてアンプリコンの調製に用
いたプライマーと同一のプライマーが好ましい。但し、
複数のプライマーにより分離された複数のゲノムマーカ
ーがある場合（例えば、プライマーXにより分離された
マーカーx1, x2, x3と、プライマーYにより分離された
マーカーy1, y2, y3がある場合）には、両プライマー
（XとY）を混合したポリメラーゼ連鎖反応によりアンプ
リコンを調製し、遺伝子型の判定を行うことが可能であ
る。また、３種類以上のプライマーを混合した場合で
も、遺伝子型の判定は行いうる。ポリメラーゼ連鎖反応
は、上記本発明の増幅・単離方法におけるアンプリコン
作成（工程(ａ)）の場合と同一条件で行うことが可能で
ある。

【００２３】次いで、これにより得られたポリメラーゼ
連鎖反応産物に対して、上記の単離方法で単離されたDN
Aの塩基配列の少なくとも一部を含む配列からなるプロ
ーブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション
の方法としては、これに限られないがドットブロットハ
イブリダイゼーションが特に簡便である。具体的な一例
を示せば、96〜384穴プレートでのポリメラーゼ連鎖反
応産物を、プレートと同様に針又はチップを配列した機
械により、ナイロン、ニトロセルロース等のフィルター
にブロットする。異なるプレートでのPCR産物をわずか
ずつずらしてブロットすることで、非常に高密度に検体
をブロットできる。紫外線等により架橋形成した後、ハ
イブリダイゼーション用のフィルターとして使用する。
プローブDNAの標識としては、例えば、「multi prime l
abelling kit」（アマシャム社製）を利用することがで
きる。

【００２４】次いで、ハイブリダイゼーションがおこっ
たか否かを検出する。検出は、例えば、プローブをアイ
ソトープラベルした場合は、X線フィルムへの露光によ
り、蛍光ラベルした場合には、専用の蛍光検出器により
行うことができる。また、DNAチップのセンサーとして
用いて、電流の誘導の有無により、検出することも可能
であると考えられる。検出の結果、シグナルが検出され
れば、プローブDNAと被検体から調製したアンプリコン
がハイブリダイゼーションしたことを示し、これにより
被検体の多型を判定することができる。

【００２５】本発明の遺伝子型の判定方法は、例えば、
ラット等の実験動物の大きな交配集団でのQTL（quantit
ative trait loci）のマッピングや疫学的解析を行うよ
うな大きさのヒト集団の遺伝子型の決定などに応用する
ことができる。また、DNAチップ技術との複合による臨
床応用も可能である。例えば、基盤上にヒト全染色体を
カバーするゲノムマーカープローブを配置し、患者由来
のアンプリコンとハイブリダイゼーション反応を行うこ
とで、非常に簡易にかつ少量の検体で、患者の遺伝子型
が決定できる。簡便に遺伝子型が決定できれば、日常診
療中に多くの患者の遺伝子型を検査し、データーベース
を構築することができる。そして、薬剤感受性（効果及
び副作用）、疾患感受性（進行速度、合併症の発症）な
ど、ホストの遺伝的要因の関与が大きい因子と遺伝子型
との相関の解析に利用して、遺伝的要因の同定や診療方
針の決定に大きく貢献することが可能である。

【００２６】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明は実施例に制限されるものではな
い。

【００２７】

【実施例】[実施例１] 選択性の緩いプライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応（以下、ポリメラーゼ連鎖反応
を「PCR」と称する）によるアンプリコンの調製 ACI/N及びBUF/Nacラットは、Japan Clea社から購入し
た。戻し交配117匹のラットは全て、雌のACIラットと雄
のF1(ACIxBUF)ラットの交配によって生産した。F2交配
ラットはF1(ACIxBUF)ラットの兄弟（sister-and-brothe
r）交配によってつくられたものである（Canzian, F.,
Ushijima, T., Toyota, M., Hosoya, Y.,Sugimura, T.a
nd Nagao, M. Identification of 29 rat genetic mar
kers byarbitrarily primed polymerase chain reactio
n. Jpn. J. Cancer Res., 87,669-675 (1996)）。DNA
は、プロテインキナーゼKによる消化とRNase処理後、フ
ェノール及びクロロフォルム抽出により、個々のラット
の肝臓から抽出した（Sambrook, J., Fritsch,E. F. &
Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning,eds. J.
Sambrook, E. F.Fritsch & T. Maniatis (Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, New York),pp. 9.14-9.2
3）。プライマーの配列は表１に記載した。オリゴヌク
レオチドはサワデーテクノロジー社，東京より購入し
た。

【００２８】

【表１】まず、アンプリコン調製の条件の検討を行った。具体的
にはPCRのアニール化温度及びPCRプライマーの長さの影
響をテストした。

【００２９】AP-1(9mer)，AP-2(11mer)，AP-3(13mer)，
AP-4(15mer)及びAP-5(17mer)は、溶解温度の変化を最小
にするようにヌクレオチドを連続的に加えることにより
設計した。そのためこれら５つのプライマーのコア配列
は共通である。PCRは、鋳型として同系交配のACI及びBU
FラットのDNAを用いて、95度で1分の変性、50℃または4
0℃で1分のアニール、72度で2分の伸長反応を行った。P
CR産物を0.9%アガロースゲル及び2% NuSieveGTGアガロ
ースゲル上で泳動し、それらのパターンを比較した。そ
の結果、アニール化温度を低くすれば、PCR産物中によ
り多くのフラグメントが存在し、PCR産物のスメア状の
パターンを示すことが明らかとなった(図２)。そこで、
本発明者等は以下の実験において40℃のアニール化温度
を適用した。また、コア配列をランダムに配置したプラ
イマーの長さの比較を行った。その結果、AP1では増幅
不良、AP2では非常に強いバンドが検出された（図
１）。これによりAP-1及びAP-2はPCR産物がスメア状の
パターンを作るには短いことが示された（但し、11mer
でも、塩基配列によってはスメア状のパターンを作るこ
とができる）。その他のプライマーの長さの間に有意な
差異はなかった。そこで、アンプリコンは、BUF及びACI
ラットよりプライマーAP-3及びAP-5を用いて調製した。

【００３０】具体的には、100ngの上記ラットのゲノムD
NAを、300uM 各dNTP，67mM Tris-Cl(pH8.8)，4mM MgC
l₂，16mM (NH₄)₂SO₄，10mM β-メルカプトエタノール，
100ug/mlウシ血清アルブミン，1uMプライマー及び15uTa
qポリメラーゼ(Amersham社製)を含む400ulの反応混合液
中において、PCRにより増幅させた。95度1分、40度1
分、72度2分の反応を、35サイクル程度行った。PCR産物
は、RDA解析のために、フェノール抽出及びエタノール
沈殿により精製した。なお、アンプリコンのドットプロ
ットを用いた遺伝子型の決定（実施例４）を行う際に
は、40ulの反応液中でPCRを行い、その溶液はそれ以上
精製せずに用いた。

【００３１】[実施例２] サブトラクティブハイブリダ
イゼーション及び選択的増幅サブトラクティブハイブリダイゼーション及び選択的増
幅の二サイクルを、テスターとしてBUF由来のアンプリ
コン、ドライバーとしてACI由来のアンプリコンを用い
て行った(図３)。テスターとドライバーの両方のアン
プリコンを、適当な制限酵素(BamHI)で消化した。アン
プリコンの制限酵素部位と末端の間の小さなDNA断端
は、ゲル濾過クロマトグラフィー(cDNAスパンカラム，P
harmacia社製)により除去した。ゲル濾過後の溶液を定
量し、次の段階に用いた。

【００３２】1ugのテスターアンプリコンに対して、500
pmolのJアダプターを、T4 DNAリガーゼを用いて結合さ
せた。末端にJアダプターを結合させた適量のテスターD
NAを、40ugのドライバーDNAと混合した。このDNA混合物
を、フェノール抽出及びエタノール沈殿により精製し、
4ulの3xEE緩衝液(3mM EDTA，3mM EPPS，pH8.0)中に溶解
し、96℃において10分間変性させ、1M NaClの存在下で6
7℃において16乃至36時間再アニール化した。

【００３３】再アニール化した産物の10分の1量を、プ
ライマーとしてJBam24オリゴヌクレオチドを用いてPCR
により、10サイクル増幅を行った。テスター／テスター
及びテスター／ドライバー二本鎖DNAフラグメントは、
それぞれJアダプターを両端及び片方の末端に持ち、そ
れぞれ指数関数的に及び一次関数的に増幅可能である。
一本鎖DNAとして存在する一次関数的に増幅させたDNAフ
ラグメントを、100ユニットのマングビーンヌクレアー
ゼ(NEB)で消化し、残りの二本鎖DNAを再び、JBam24オリ
ゴヌクレオチドを用いて、20乃至30サイクル、PCRによ
り増幅を行った。

【００３４】競合ハイブリダイゼーションの第二サイク
ルは、競合ハイブリダイゼーションの第一サイクルのア
ダプターを、新しいアダプター(NBam)に転換することに
より行った(表２)。

【００３５】

【表２】様々な量のライゲーション溶液を、40ugのドライバーDN
Aと混合した。自己アニール化産物の変性、再アニール
化及び選択的増幅は、第一サイクルのようにして行っ
た。最終産物をBamHIで消化し断端を除去後、あらかじ
めBamHI（東洋紡社製，東京）で消化、子ウシの腸アル
カリホスファターゼ（東洋紡社製）で処理したpBluescr
ipt IIに接着した。XL1ブルーコンピテント細胞の形質
転換後、T3及びT7プライマーを用いたインサートのPCR
による増幅、並びに、BamHI(NEB)を用いたPCR産物の制
限−消化によって、インサート陽性プラスミドクローン
を選別した。

【００３６】[実施例３] ゲノムマーカーの単離 AP-3又はAP-5を用いたそれぞれの解析により全192クロ
ーンを回収した。クロスハイブリダイゼーションによる
クローンの独立性をテストした後、クローンがBUF及びA
CIラットのアンプリコン上でそれぞれ陽性、陰性のシグ
ナルを示すか否か確認することにより、それぞれの独立
クローンの有効性をテストした。

【００３７】有効性のテストは以下のようにサザンブロ
ット解析で行った。適量のアンプリコンを、2% NuSieve
GTGアガロースゲル(FMC）で泳動した。0.5N NaOH中でゲ
ルを変性させた後、ゲルを１枚のナイロンメンブレン(H
yBond,Amersham社製)にキャピラリーブロットした。プ
レハイブリダイゼーションは、50%ホルムアルデヒド，
0.65M NaCl，1xデンハルト溶液，0.1M PIPES(pH6.8)，
0.1% SDS，5mM EDTA及び100ug/ml 変性サケ精巣DNAを含
むハイブリダイゼーション溶液中で行った。およそ10乃
至50ngのプローブ（独立クローン）を、ランダムなラベ
ルキット(MultiPrime;Amersham社製)を用いて標識し
た。ハイブリダイゼーションを、10%のデキストラン硫
酸塩を添加したハイブリダイゼーション溶液中で、8乃
至20時間行った。50度の2xSSC中で４回フィルターを洗
浄した後、フィルターをコダックXARフィルムに室温で1
0分乃至数晩感光した。

【００３８】その結果、AP-3プライマーを用いた解析に
おいては、回収した103クローン中、40クローンが独立
で、8クローンが多型を示し、AP-5プライマーを用いた
解析においては、83クローン中25クローンが独立で、6
クローンが多型を示すことが判明した（表３）。

【００３９】

【表３】 [実施例４] 単離したゲノムマーカーを用いた遺伝子型
の判定及び染色体マッピング得られたゲノムマーカーをすでに140個のアンカーにつ
いて遺伝子型が決定されている105のF2交配ラット及び1
60個のアンカーについて遺伝子型が決定されている117
の戻し交配ラットの遺伝子型の決定に用いた。アンプリ
コンは、プライマーAP-3を用いたポリメラーゼ連鎖反応
によって異種交配又は戻し交配ラットより調製し、ドッ
トブロットを行った。

【００４０】アンプリコンのドットブロット解析のため
に、10ulのPCR溶液を等量の変性溶液(0.8N NaOH及び50m
M EDTA)と混合し、96ウェルフォーマットに配列させ
た。ほぼ1ul相当量を、Kriplanker device(Washington
University，St.Louis)を用いてドットブロットした。
一つの動物由来の１つのアンプリコンを2カ所にブロッ
トした。ブロットしたDNAをUV光によりフィルター上に
架橋した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイ
ゼーションは実施例３と同様に行った。

【００４１】フィルターをゲノムマーカー（YY3A2）と
ハイブリダイズすることにより、個々のラットから陽性
又は陰性のシグナルが得られた（図４Ｂ）。F2異種交配
ラットの場合、遺伝子型AB及びBB（ACIラット由来の対
立遺伝子を「A」、BUFラット由来の対立遺伝子を「B」
とした）を持つラットからは、共に陽性シグナルが得ら
れた。ホモ接合体(BB)はヘテロ接合体(AB)と比較すると
二倍の濃さのシグナルであり判別可能であったが、判定
エラーを回避するためにABとBBとは同一のグループとし
て分類した。また、連鎖の解析の結果、得られた染色体
上の座位を表４に記載した。単離したゲノムマーカーは
染色体全体にわたってランダムに存在していると考えら
れた。なお、表４中の「BN(Brown Norway)」、「LEW(Le
wis)」、「DON(Donryu)」、「WF(Wistar-Furth)」、「F
344(Fisher344)」、「SD(Sprague-Dawley)」、「WKAH(W
istar King Aptekman Hokkaido)」、「LEK(Long-Evans
Cinamon)」は近交系（純系）ラットの系統名を示す。

【００４２】

【表４】 [実施例５] ゲノムマーカーの配列の解析単離したゲノムマーカー塩基配列の解析を行った。塩基
配列の解析を行った範囲のゲノムマーカーのうち、AP-3
プライマーを用いて単離された「YY3A9」（配列番号：
１）、「YY3C1」（配列番号：２）、AP-7プライマーを
用いて単離された「YY7C8」（配列番号：３）、「YY7D
6」（配列番号：４）、「YY7G11」（配列番号：５）、
「YY7K7」（配列番号：６）、「YY7E1」（配列番号：
７）はGenBankに登録されておらず、新規マーカーと考
えられた。

【００４３】

【発明の効果】本発明の方法は、被検体のゲノムDNAを
制限酵素で処理し、その制限酵素断片にアダプターを接
着し、該アダプターに相補的なプライマーポリメラーゼ
連鎖反応の産物アンプリコンとして利用していた従来の
RDA法と異なり、複数のゲノム領域を増幅しうる選択性
の緩いプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応の産物を
利用する。このため、制限酵素により認識されない塩基
配列の相違をも検出することができ、理論的な制限なく
被検体間で塩基配列に差異のあるDNAを増幅し単離する
ことが可能である。また、遺伝子型の判定に用いるアン
プリコンの調製に要する手間が、従来のRDA法のアンプ
リコンと比較して格段に少ないため、多量の検体処理に
好適である。

【００４４】また、本発明の方法により単離されたDNA
を用いれば、従来のマイクロサテライトマーカーなどの
ように電気泳動過程を経て遺伝子型を決定する必要はな
く、各被検体のポリメラーゼ連鎖反応産物とのハイブリ
ダイゼーションにより簡便に遺伝子型を決定することが
できる。さらに、各被検体のポリメラーゼ連鎖反応産物
はフィルター上に高密度でドットブロットすることが可
能であり、このため大量の被検体について、多くの遺伝
子座を並行して解析することも可能である。ハイブリダ
イゼーションにより遺伝子型を決定できるため、DNAチ
ップとの複合も可能である。

【００４５】

【配列表】（１）出願人の氏名又は名称：萬有製薬株式
会社（２）発明の名称：ゲノムマーカーの単離方法（３）整理番号：Ｂ１−９０１（４）出願番号：（５）出願日：（６）配列の数：７配列番号：1 配列の長さ：160 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 TCATCTAAAAGATGGGGGTTCCATGAGGGTTTCCCTGGGTGTGTGTCAGCATGTCGACTG 60 TTGTTAGAATTATCCCCATCCCCTTCGGTAGCTGTATGGTTACTATTTCATGACTGTAGC 120 TTCCCTGTCCTAGTTGGAAGGCAGAGTCTCACAGCGGTCA 160 配列番号：2 配列の長さ：537 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 AGCTTGATAAGGAATGTCAAGGGAGCTGAATGTATTACTAGTGAAACGCTGAAGAACCGA 60 CTCATGAAGTAGAGTGTCTGATTAGACCTATCACAACTAACAAAGTGGGGGTTCATTCCC 120 ACTTAATTGATGACTAGTTTTAATTTTAATTTGTGATGAGCTTACACTAACGTAACATCA 180 CCTTAAGTCAAAGATAATCTTTGCTTTGTCCTTTTGGTCATTATTAAAACTGGTAAATGT 240 TTAATTAATTTCACTTTAAATTATCTGAATTCACTCATCTGTGGCTATTTTATAAAAATA 300 AAATGGATATTTCTATTTTGATCTTATATACTATAAACTTTAAAAAGAGCCCCATTCCTT 360 AGCCCTAGCAAGATTTCCCTTTACTCTTTAGGGTGTGCCATATACAAGATCAAGTCACCA 420 GCCAGCAGATAGCAATAGTTTTCGTGTTTTTTGTTTCCCTTCTGGATGTTCTGCACTTCG 480 TTTACTCATAAATGCTCTAGCTGGGATGTTCTGTAGAACACTGAATGCAAGTTTACT 537 配列番号：3 配列の長さ：493 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 TGGGAGCTCAGTGGCTTCAGCGACAGAAAATTAATCCCTCATAATTCTACAAACCAGAAT 60 TTCAAAGTCCAAGGTGTCAAGAGAATCAGTTTGTGCTTGAGGGTCTCCCTCCTCGGGCTC 120 TCCTCGGGCCCTCCCTCTGTGTCCTCCTATGGTCAGCCCTGTGTTCGCAGCTCTGCCTAA 180 GCATGTTCTCAAGGTGTCAGCCATCTTGGATGATCTCATTTTATCCCAGTTACCCATTTT 240 CAAGCCCTGTATTGAAAACCGCCATGGGCTGAGGTACTGGGAGTTATGCATCAGCATGAC 300 AGTTCATTCAGCCCGTGACAGTGCCCTAAAAGTCTGAGCACAGCTACAGTCATCATATCC 360 CACCAAGATACCAGCTCAATTGAGTTCCCTTTTATTATATGTGTGTGCAAAAGAGAGAGA 420 GAGAGGGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATATATAATTTGGCAGGCATCAGCTTCT 480 TTTTCCCAGCTTG 493 配列番号：4 配列の長さ：278 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 CTCATTTATGCTTTTTATTTCCCAGTTGGCTTTCCATTCATTTGGAAAAAGTTTTGCATG 60 TTCCTTCAACAAGATATGTCAAAGGATCTGTTATTTGTTCTGATTGAGAATATGCTACTC 120 AATTCCCTATTAGGAGATAAAGTAAATACCAAGAGTGCTAATATAACCTTGAACTCGAAA 180 GTTCAAGGTTAGGAGGGTGGCTCAGTAGTAGGCACACTGTCTCACAAATCCAGGGGTCCT 240 GGAGTCAATTTCTCCAAGCCTACTTCCCTAACCAAAGG 278 配列番号：5 配列の長さ：581 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 GTAGAGAAGGTAGGGGCTACAAAGTTGTGTATGTACACTGGGCATCAAGCACAGAGCAGG 60 GAGGGAGCAATCCTGCCAATTCCAAGATGGGATTTTCGGGGTTTGGACATGTCTAGACTT 120 CACTCTTGTTCGGGCACACTCCCCTTCAGTCGCACTGGCCCCACACGCAAGGGTTTAAAA 180 ACTCGCAAGTAAAGGTCAGAGAAACTGCACTAAAGCTGAGAATAGACAGTTCAAAAGAGC 240 CGGGAAACATCACGTGAGAGGAACAGCTAACAAGCGTTACAAACCCAGCAGGCAGAGCTG 300 CTCAAGTTCTCTCCAGTCACAGCTGGGTTGTTTAGATCAGAAGTGTCCCATAATCAGGGA 360 GGCCTGATTTTCCTGATGTGGTGTTGTTACAATTAGATGTCTGCATGTTCTTGGTTTACT 420 TTTATAAGCCAATGGGCAATAATGTTGAACTTATGAGAATGACATAGGGCTTGAGTCTGT 480 ATTTTATGATTCACTTTGAAAAGGTCCTGTACATTCGTTTGCACACGCAAAAAATAGCAT 540 CATTCCGGGCTCCGTATTTGTACTCGAGGTCAAGCCAACTG 581 配列番号：6 配列の長さ：124 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 GAAGATTTAGGAAGTAGTGAAAGGCTTGAAGGTGATTGCAACCATATAAGACGAACAATA 60 TCAACTGACTGGACCACCCAGAGCTCCCAGAGACTAAACCCCCAACCAAAGAGTATACAT 120 GGAG 124 配列番号：7 配列の長さ：713 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to genomicDNA 配列 CCAGAACACTTACATGGCATGGATGAGGCCCTGCCTTTGGTCCCTGCATCACCAAAAGAA 60 GAAAAAGAGAAGCAGCTGCCCCACTTTACATTCATTCCCACAGCACTTTATCATTTTTCC 120 ATGCCTTCATGATGCCTTCATTATCGTTTAAAACCATGATGCACTTCACAGAACATGTGA 180 TTCATTGACCGTTAGCATGTTTCAGTCTTCATACATTTTCATTACTCCCAAAGAGAACCC 240 TGTATTCAAGGTCAGTCCTCTGTCTTTTTGACTGTGTACAGTCTCACAGGTATGAGCCTC 300 TAAGGGCTAAGACTTAATGTGGTCATCGGCCACTCATTTATTGTCTTTGGAGAAATATCT 360 TTCAAATATTTTCAATTTTAAACTGATGTCTTCTTATATACATTATTAAACTAACATTAA 420 AACTTTCATGTTCCAAGTATAAGACCCTATCAGATATGTACTCCGGTCTTTATTATCCTT 480 CTCTTTGACTAGGTTCAAAGGGAAGAGAACGTTTACAACTAGCCCATTGCTACACATTGT 540 CTGGGATAGTGGATCCTCAGTGGGGGAAAGGGGACATCAAACCAACTTCATAATGTTTGA 600 CTCAGTATTGAAATGCAGGGACAAAAAGGGAGCAGTGACTGAAGAAAAGAAAGGATTGAA 660 GGGTCTACCAACAGCTAACTGAGACAGACGCTGATACTTATAGCCAAGCATTG 713

【図面の簡単な説明】

【図１】プライマーの長さがアンプリコンのスメア形成
に及ぼす影響を示す電気泳動像を示す写真である。A,B
はそれぞれACI/N、BUF/Nacのアンプリコンを示す。Mは
サイズマーカー（φX174/HaeIII digest）を示す。

【図２】アニール温度がスメア形成に及ぼす影響を示す
電気泳動像を示す写真である。プライマーはAP3を用い
た。ACIラット、BUFラットの両系統で、アニールの温度
が同一であれば、同一のパターンを示している。50度よ
りは40度の方が、より均一のスメアを呈した。Mはサイ
ズマーカー（φX174/HaeIII digest）を示す。

【図３】AP3及びAP5を用いて調製したアンプリコン、お
よび競合的再会合の産物の電気泳動像を示す写真であ
る。AはACIラット由来のアンプリコン、BはBUFラット由
来のアンプリコン、C1は第一回目の競合的再会合の産
物、C2は第二回目の競合的再会合の産物、Mはサイズマ
ーカー（φX174/HaeIII digest）を示す。各レーンとも
1ugづつのDNAが泳動してある。

【図４】ドットブロット解析におけるゲノムマーカーの
利用例を示す図である。(a) 36x 72 mmのフィルターを4
x 8 区画に仕切り、各区画内のA, B, C, Dの各位置に
一個体由来の一アンプリコンをドットブロットした。
(b) プローブ「YY3A2」でそのフィルターをハイブリダ
イズした。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検体間で塩基配列の異なるゲノムDNA
領域を増幅する方法であって、（ａ）選択性の緩いプラ
イマーを用いて各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラ
ーゼ連鎖反応を行う工程、（ｂ）工程（ａ）において増
幅された各被検体のDNAを混合して、変性後、ハイブリ
ダイゼーションを行う工程、（ｃ）工程（ｂ）における
ハイブリダイゼーションにより生成された、単一の被検
体のみに由来する二本鎖DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応
により選択的に増幅する工程、を含む方法。
【請求項２】被検体間で塩基配列の異なるゲノムDNA
領域を増幅する方法であって、（ａ）選択性の緩いプラ
イマーを用いて各被検体のゲノムDNAを鋳型にポリメラ
ーゼ連鎖反応を行う工程、（ｂ）工程（ａ）において増
幅された一方の被検体のDNAの末端をアダプター標識
し、標識していない増幅された他の一方の被検体のDNA
と混合して、変性後、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイゼーション
により生成された両端にアダプター標識を有する二本鎖
DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応により選択的に増幅する
工程、を含む方法。
【請求項３】ポリメラーゼ連鎖反応産物をアガロース
ゲル電気泳動した際の電気泳動像がスメア状になる条件
下で、工程(ａ)におけるポリメラーゼ連鎖反応を行う、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】被検体間で塩基配列の異なるゲノムDNA
領域に相当するDNAを単離する方法であって、（ａ）選
択性の緩いプライマーを用いて各被検体のゲノムDNAを
鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、（ｂ）工程
（ａ）において増幅された各被検体のDNAを混合して、
変性後、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｃ）工
程（ｂ）におけるハイブリダイゼーションにより生成さ
れた、単一の被検体に由来する二本鎖DNAを、ポリメラ
ーゼ連鎖反応により選択的に増幅する工程、（ｄ）工程
（ｃ）により増幅されたDNAを単離する工程、を含む方
法。
【請求項５】被検体間で塩基配列の異なるゲノムDNA
領域に相当するDNAを単離する方法であって、（ａ）選
択性の緩いプライマーを用いて各被検体のゲノムDNAを
鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、（ｂ）工程
（ａ）において増幅された一方の被検体のDNAの末端を
アダプター標識し、標識していない増幅された他の一方
の被検体のDNAと混合して、熱変性後、ハイブリダイゼ
ーションを行う工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブ
リダイゼーションにより生成された両端にアダプター標
識を有する二本鎖DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応により
選択的に増幅する工程、（ｄ）工程（ｃ）により増幅さ
れたDNAを単離する工程、を含む方法。
【請求項６】ポリメラーゼ連鎖反応産物をアガロース
ゲル電気泳動した際の電気泳動像がスメア状になる条件
下で、工程(ａ)におけるにポリメラーゼ連鎖反応を行
う、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】配列番号：１乃至７のいずれかに記載の
塩基配列からなるDNA。
【請求項８】被検体の遺伝子型を判定する方法であっ
て、（ａ）請求項４乃至６のいずれかの方法で単離され
たDNAの塩基配列の少なくとも一部を含む配列からなる
プライマーを用いて被検体のゲノムDNAをポリメラーゼ
連鎖反応により増幅する工程、（ｂ）工程（ａ）で得ら
れた増幅産物に対して、請求項４乃至６のいずれかの方
法で単離されたDNAの塩基配列の少なくとも一部を含む
配列からなるプローブDNAをハイブリダイズさせる工
程、（ｃ）工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション
がおこったか否かを検出する工程、を含む方法。
【請求項９】ハイブリダイゼーションがドットブロッ
トハイブリダイゼーションである、請求項８に記載の方
法。