JPH1090265A - 免疫学的梅毒診断試薬の製造方法及び梅毒診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗脂質抗体と抗ＴＰ抗体を一種類の検査で検
出できる免疫学的梅毒診断試薬の製造方法及び梅毒診断
試薬を提供する。 【解決手段】 カルジオリピンを含有する溶媒中で、固
相（例、ポリスチレンラテックス粒子）と梅毒トレポネ
ーマの抗原蛋白質（例、分子量４７ｋＤａ、１７ｋＤａ
又は１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、ト
レポネーマ・パリダム菌より得られた抗原蛋白質）を混
合して、該抗原蛋白質を該固相に担持させることを特徴
とする免疫学的梅毒診断試薬の製造方法、及び得られた
梅毒診断試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的梅毒診断
試薬の製造方法及び梅毒診断試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒は梅毒トレポネーマ（Treponema Pa
llidum）により引き起こされる感染症であり、梅毒に感
染しているか否かは、血液中に梅毒に特異的な抗体が存
在するかどうかで判断される。

【０００３】梅毒に感染した場合、感染者血液中に生成
する抗体は、通常、主として、カルジオリピンと呼ばれ
る脂質に対する抗体（以下、抗脂質抗体という）と、ト
レポネーマパリダム菌の抗原蛋白質に対する抗体（以
下、抗ＴＰ抗体という）である。

【０００４】抗脂質抗体の検査は、梅毒の初期感染患者
で陽性を示すことが多く、また、検査費用が安価である
ため、臨床検査においては、梅毒感染のスクリーニング
検査としてよく用いられている。しかしながら、抗脂質
抗体の場合、抗原が主としてカルジオリピンであるた
め、梅毒以外の疾病（リウマチ、自己免疫疾患など）で
陽性を示すことがあり、いわゆる偽陽性が問題となる。

【０００５】これに対して、抗ＴＰ抗体の検査は、抗原
がトレポネーマパリダム菌に特異的な蛋白質であるた
め、抗脂質抗体の検査の場合よりも、偽陽性が発生せ
ず、また、梅毒に特異性が高いので、確定診断にしばし
ば用いられる。しかしながら、抗ＴＰ抗体の場合、感染
中期以降の患者で陽性を示すことが多く、診断が遅れる
という欠点があり、また、梅毒の治療後においても、抗
ＴＰ抗体は長期に渡って血液中に存在するため、梅毒に
感染していないにもかかわらず、梅毒陽性と判定される
などの問題もある。

【０００６】以上の理由により、現在、臨床検査におい
ては、梅毒の診断には、抗脂質抗体と抗ＴＰ抗体の２種
類の抗体検査が実施され、臨床症状と併せて梅毒の診断
が行われている。

【０００７】次に、それぞれの抗体の検査法を述べる
と、抗脂質抗体の検査法は、一般的には、抗原（カルジ
オリピンを含む脂質）を炭素末に担持させ、血液中の抗
体との抗原抗体反応により生じた炭素末の凝集の度合い
を検出する方法である。また、抗ＴＰ抗体の検査法は、
一般的には、トレポネーマパリダム由来の抗原蛋白質を
動物赤血球などの担体に担持させ、血液中の抗体との抗
原抗体反応により生じた担体の凝集の度合いを検出する
方法である。しかしながら、これらの検査法は用手法で
あるため、手間がかかり、また、検査結果にバラツキが
でるなどの問題が指摘されている。

【０００８】以上のように、現在、梅毒の診断には、そ
の検査操作が非常に煩雑であるという問題にもかかわら
ず、抗脂質抗体と抗ＴＰ抗体の２種類の検査を必要とす
るという問題点が存在している。

【０００９】上記問題のうち、操作の煩雑性を解消する
目的で以下の検査法が提案されている。抗脂質抗体の検
査法に関しては、不溶性担体（固相）にカルジオリピ
ン、フォスファチジルコリン又はコレステロールなどを
結合させて得られた試薬と検体（血清）とを反応させ、
試薬と検体中の抗脂質抗体の抗原抗体反応により生じた
不溶性担体の凝集の程度を光学的に測定する方法が提案
されている（特表平４−５０３８６５号公報）が、操作
の煩雑性を十分に解決するには至っていない。また、抗
ＴＰ抗体の検査法に関しては、例えば、特開平４−１２
２８５８号公報に提案されているように、トレポネーマ
パリダム由来の抗原蛋白質を不溶性担体に担持させて得
られた試薬と検体とを反応させ、試薬と検体中の抗ＴＰ
抗体との抗原抗体反応により生じた担体の凝集の度合い
などを検出する方法が開示されると共に、自動分析装置
による測定方法も開示されており、抗ＴＰ抗体測定試薬
も上市され、操作性の煩雑性に関しては改善されつつあ
る。しかしながら、梅毒の診断に抗脂質抗体と抗ＴＰ抗
体の２種類の検査を必要とするという問題に関しては、
改善又は解消されていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するものであり、その目的は、抗脂質抗体と抗
ＴＰ抗体を一種類の検査で検出できる免疫学的梅毒診断
試薬の製造方法及び梅毒診断試薬を提供することにあ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の免疫学的
梅毒診断試薬の製造方法（以下、本発明１という）は、
カルジオリピンを含有する溶媒中で、固相と梅毒トレポ
ネーマの抗原蛋白質を混合して、該抗原蛋白質を該固相
に担持させることを特徴とする。

【００１２】請求項２記載の免疫学的梅毒診断試薬の製
造方法（以下、本発明２という）は、梅毒トレポネーマ
の抗原蛋白質が、遺伝子工学的手法を用いて製造され
た、分子量４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質、分子量１７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質及び分子量１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋
白質からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求
項１記載の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法である。

【００１３】請求項３記載の免疫学的梅毒診断試薬の製
造方法（以下、本発明３という）は、梅毒トレポネーマ
の抗原蛋白質が、トレポネーマ・パリダム菌より得られ
る抗原蛋白質である請求項１記載の免疫学的梅毒診断試
薬の製造方法である。

【００１４】請求項４記載の免疫学的梅毒診断試薬（以
下、本発明４という）は、請求項１〜３のいずれか１項
に記載の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法によって得ら
れる梅毒診断試薬である。

【００１５】本発明に用いられる梅毒トレポネーマの抗
原蛋白質は、一般的には、トレポネーマパリダム菌体を
ウサギの睾丸で培養した後、界面活性剤等で抽出しカラ
ムクロマトグラフィーで精製して得られるものが知られ
ている（特開平２−２３４０６３号公報）が、トレポネ
ーマパリダム菌体より得られた蛋白質であれば、どのよ
うな方法で得られたものであってもよい。

【００１６】また、遺伝子組み換え技術を利用しトレポ
ネーマパリダム菌体の表面抗原蛋白質を生産し、梅毒の
診断薬に使用することが試みられている（特表平２−５
００４０３号公報、特開平７−２８７０１７号公報）
が、本発明においても遺伝子組み換え技術を利用して得
られたトレポネーマパリダム菌体の表面抗原蛋白質（以
下、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質という）も好適に
使用することができる。

【００１７】上記梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質に
は、種々の分子量のものが存在することが知られてお
り、例えば、分子量４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面
抗原蛋白質（Infection and Immunity 57(1),196-203(1
989)）、４４ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質
（Journal of Genetical Microbiology 133,1793-1803
(1987))、４２ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質（Infection and Immunity57(9),2612-2623(1989))
、３５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Inf
ection and Immunity 59(10),3536-3546(1991))、３４
ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Infection
and Immunity 57(11),3314-3323(1989))、１７ｋＤａの
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Infection and Immu
nity 61,1202-1210(1993) ）、１５ｋＤａの梅毒トレポ
ネーマ表面抗原蛋白質（Molecular Microbiology 4,137
1-1379(1990)) などが知られており、これらはいずれも
使用可能である。これらの中でも、梅毒トレポネーマの
主要な表面抗原蛋白質と考えられている、４７ｋＤａの
表面抗原蛋白質（以下、４７ｋＤａ抗原という場合があ
る）、１７ｋＤａの表面抗原蛋白質（以下、１７ｋＤａ
抗原という場合がある）及び１５ｋＤａの表面抗原蛋白
質（以下、１５ｋＤａ抗原という場合がある）からなる
群より選ばれる少なくとも一種が特に好ましい。これら
の表面抗原蛋白質をコードする遺伝子はすでにクローニ
ングされ、アミノ酸配列も決定されているので、遺伝子
工学的手法を用いて生産することが可能である。なお、
これらの表面抗原蛋白質のアミノ酸配列はそれぞれ異な
っており、それぞれ全く別の表面抗原蛋白質である。

【００１８】上記梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質は、
遺伝子工学的手法を用いて、梅毒菌体遺伝子からクロー
ニングされたものであれば、そのクローニング法はどの
ような方法でもよい。４７ｋＤａ抗原を得るための方法
の例を挙げると、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は、前述
のように公知であるので、例えば、ＰＣＲ法により４７
ｋＤａ抗原に対するＤＮＡを増幅、精製し、これを適当
な発現ベクターに組み込む。このベクターを大腸菌に導
入し、大腸菌に大量生産させる方法が挙げられる。大腸
菌から効率よく４７ｋＤａ抗原を精製するには、ベクタ
ーとして特公平６−８１５９６号公報に記載されている
ようなグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、
ＧＳＴという）遺伝子を含むものを用いるのが好まし
い。この方法を用いる場合は、ＧＳＴ遺伝子の後に４７
ｋＤａ抗原遺伝子を挿入し、大腸菌にＧＳＴと４７ｋＤ
ａ抗原の融合蛋白質として生産させる。十分に生産させ
た後、菌体を破壊し、リゼイドを固定グルタチオンカラ
ムと接触させることにより融合蛋白質を分離する。次い
で、この融合蛋白質を開裂させて４７ｋＤａ抗原を得
る。

【００１９】本発明に用いられる固相としては、従来か
ら免疫学的測定に使用されてきた固相のいずれも使用可
能であり、例えば、プラスチック製マイクロプレート、
ガラスファイバー等や不溶性粒子が挙げられる。上記不
溶性粒子としては、例えば、有機高分子粒子、微生物、
血球、細胞膜片等が挙げられる。

【００２０】上記有機高分子粒子としては、例えば、不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粒子；ポリスチレン、スチレン−スチレンス
ルホン酸塩共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合
体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合
体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビ
ニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粒子
等が挙げられ、特に合成高分子粒子を均一に懸濁させた
ラテックスが好ましい。

【００２１】本発明で用いられるカルジオリピンとして
は、ジフォスファチジルグリセロールの構造式をもつ化
合物であれば、動物の臓器、血液、もしくは植物などか
ら抽出し精製したもの、又は、化学的に合成したものの
いずれを使用しても差し支えなく、通常、動物の心臓よ
り抽出し精製した市販品を使用する。

【００２２】本発明の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法
は、カルジオリピンを含有する溶媒中で、固相と梅毒ト
レポネーマの抗原蛋白質を混合して、該抗原蛋白質を該
固相に担持させる。この担持の機構は物理的吸着によ
る。すなわち、梅毒トレポネーマの抗原蛋白質と固相
は、溶媒中で混合することにより荷電により容易に吸着
が起こる。

【００２３】本発明の製造方法において、カルジオリピ
ンは、梅毒トレポネーマの抗原蛋白質を固相に担持させ
る際に存在しておればよく、あらかじめ、梅毒トレポネ
ーマの抗原蛋白質と混合されていてもよく、また、担持
させる際に使用する緩衝液等の溶媒に含有されていても
よい。

【００２４】梅毒トレポネーマの抗原蛋白質を固相に担
持させる際のカルジオリピンの濃度は、０．１〜１００
０μｍｏｌ／ｌが好ましく、１〜５００μｍｏｌ／ｌが
より好ましい。カルジオリピンの濃度が、低くなると効
果が得られず、また、高くなると、カルジオリピンが梅
毒トレポネーマの抗原蛋白質の固相への吸着に影響を及
ぼし、逆に効果が得られない。

【００２５】上記物理的吸着による反応の反応温度は、
低くなると十分に反応が進行しなくなり、高くなると抗
原蛋白質が変性し抗原性を失う恐れがあるので、０℃〜
５０℃が好ましい。

【００２６】上記物理的吸着による反応のｐＨは、低く
なっても、高くなっても、抗原蛋白質が変性し抗原性を
失う恐れがあるので、４〜１０が好ましい。

【００２７】本発明の梅毒診断試薬は、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法
によって得られる梅毒診断試薬である。

【００２８】以下、上記梅毒診断試薬の測定方法につい
て述べる。本発明の梅毒診断試薬を用いて梅毒に対する
抗体を測定する方法は、従来から免疫学的測定分野で使
用されてきた種々の方法が適用可能であるが、一方法を
挙げると、検体と本発明の試薬を混合し、検体中に含ま
れる抗体と本発明の試薬とを抗原抗体反応させ、生じた
固相の凝集の度合いを光学的手法又は肉眼により測定す
る。

【００２９】上記光学的に測定する方法においては、測
定は散乱光強度、吸光度又は透過光強度を検出する光学
機器で行う。測定の波長は、２５０〜１０００ｎｍが使
用でき、測定方法については、公知の方法に従い、用い
る固相の粒子の大きさ又は濃度の選択、反応時間の選択
などに応じて、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増
加もしくは減少を測定することにより行われる。また、
これらの方法は単独で用いられても併用されてもよい。

【００３０】また、上記の抗原抗体反応に際して、反応
の促進剤として、ポリエチレングリコール（特開昭５８
−４７２５６号公報）やポリグリコシルエチルメタクリ
レート（特開平４−１２２８５８号公報）などを反応系
に存在させても良い。

【００３１】この免疫測定法において、抗原抗体反応の
条件は通常の場合と同様であり、反応媒体としては、各
種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、検体中の抗体を
失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しない
ようなイオン強度やｐＨを有するものであればよい。緩
衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、トリス緩衝液等が挙げられる。反応時のｐＨは、４
〜１０が好ましく、さらに好ましくは６〜８である。反
応時の温度は、１０〜５０℃が好ましく、さらに好まし
くは１５〜４０℃である。反応時間は適宜決められる。

【００３２】

【作用】本発明の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法にお
いては、カルジオリピンを含有する溶媒中で、固相と梅
毒トレポネーマの抗原蛋白質を混合して、該抗原蛋白質
を該固相に担持させるので、上記抗原蛋白質が固相に担
持される際に、同時に、カルジオリピンも固相に担持さ
れるものと考えられる。従って、得られた免疫学的梅毒
診断試薬を用いると、後述の実施例で確認するように、
抗脂質抗体と抗ＴＰ抗体を同時に検出できるものと考え
られる。

【００３３】

【発明の実施の形態】本発明を実施例につき述べ、その
効果を具体的に説明する。以下の実施例及び比較例にお
いては次に示す緩衝液及び検体を使用した。

【００３４】緩衝液 ＰＢ リン酸二水素一ナトリウム・２水和物（ナカライテスク
社製）及びリン酸一水素二ナトリウム・２水和物（ナカ
ライテスク社製）を、リン酸の終濃度が０．１Ｍ、ｐＨ
が７．４となるように精製水を加え、調製した。 ＧＥＭＡ／ＰＢ ＰＢにポリグリコシルエチルメタクリレート（以下、Ｇ
ＥＭＡという、日本精化社製）を１％（Ｗ／Ｗ）となる
ように溶解させて調製した。

【００３５】測定に使用した検体（血清） 抗脂質抗体陽性血清 ＲＰＲ（Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍａ Ｒｅａｇｉｎ；こ
の試薬は、カルジオリピン、レシチンを炭素末に吸着さ
せたもので、被検血清と混合しその凝集の程度を肉眼で
観察し抗体の存在を判定する試薬）テストで陽性を示
し、かつ、ＴＰＨＡテストで陰性を示した血清５検体。
なお、ＲＰＲテスト試薬はＲＰＲテスト化血研（三光純
薬社販売）を使用し、ＴＰＨＡテスト試薬は、セロディ
アＴＰＨＡ（富士レビオ社製造）を使用した（後述のＲ
ＰＲテスト試薬及びＴＰＨＡテスト試薬も同様）。

【００３６】抗ＴＰ抗体陽性血清 ＲＰＲテストで陰性を示し、かつ、ＴＰＨＡテストで陽
性を示した血清５検体。 梅毒抗体陽性血清 ＲＰＲテスト及びＴＰＨＡテストの両方で陽性を示した
血清５検体。

【００３７】参考例１ ４７ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現する
ために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマ
シア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−
４Ｔ−３−４７ｋと命名した。

【００３８】（２）４７ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、４７ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋
白質が発現した大腸菌を超音波処理により菌体を破砕
し、遠心分離により細胞膜、核などを除いた上清に、グ
ルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加
え、一晩放置し、融合蛋白質をグルタチオンセファロー
ス４Ｂに吸着させた。遠心分離により融合蛋白質が吸着
したグルタチオンセファロース４Ｂを回収し、これをカ
ラムに充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流
すことにより融合蛋白質がグルタチオンセファロース４
Ｂから遊離し溶出した。こうして精製された４７ｋＤａ
抗原−ＧＳＴ融合蛋白質溶液にトロンビン溶液を添加
し、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この結
果、４７ｋＤａ抗原、ＧＳＴ及びトロンビンを含む溶液
が得られた。この溶液をグルタチオンセファロース４Ｂ
カラムに流すことによりＧＳＴを除去した。さらにヘパ
リンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を充
填したカラムに流すことにより、トロンビンを除去し、
４７ｋＤａ抗原を得た。

【００３９】参考例２ １７ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により１７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現する
ために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマ
シア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−
４Ｔ−３−１７ｋと命名した。

【００４０】（２）１７ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１７ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、１７ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋
白質が発現した大腸菌を用い、参考例１の（２）４７ｋ
Ｄａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤａ抗原という
表現を、１７ｋＤａ抗原という表現に置き変える他は、
参考例１の（２）と同様に操作して、１７ｋＤａ抗原を
得た。

【００４１】参考例３ １５ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により１５ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現する
ために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマ
シア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−
４Ｔ−３−１５ｋと命名した。

【００４２】（２）１５ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１５ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、１５ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋
白質が発現した大腸菌を用い、参考例１の（２）４７ｋ
Ｄａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤａ抗原という
表現を、１５ｋＤａ抗原という表現に置き変える他は、
参考例１の（２）４７ｋＤａ抗原の製造と同様に操作し
て、１５ｋＤａ抗原を得た。

【００４３】実施例１ 参考例１で得られた４７ｋＤａ抗原を、以下の方法で不
溶性粒子に吸着した。ＰＢ溶液１ｍｌに４７ｋＤａ抗原
（蛋白質濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ加えた。こ
の抗原溶液０．５ｍｌと、カルジオリピンを溶解したエ
タノール溶液（カルジオリピン濃度 １０μｍｏｌ／
ｌ）０．５ｍｌとを混合した。得られたカルジオリピン
含有抗原溶液０．５ｍｌに、平均粒径０．４μｍのポリ
スチレンラテックス（積水化学工業社製、固形分濃度１
０％（Ｗ／Ｖ））懸濁液０．１ｍｌを添加し、室温で１
時間攪拌した。次に、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡ
という）を１％（Ｗ／Ｖ）含有するＰＢ溶液を５ｍｌ添
加し、更に、室温で１時間攪拌した。この液を１５００
０ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈殿物に、
ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）含有するＰＢ溶液を５ｍｌ添加
し、ラテックス粒子を再懸濁し、４７ｋＤａ抗原担持ラ
テックス液からなる本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得
た。

【００４４】実施例２ 実施例１における、４７ｋＤａ抗原の代わりに、参考例
２で得られた１７ｋＤａ抗原を用いたことの他は、実施
例１と同様にして１７ｋＤａ抗原担持ラテックス液から
なる本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００４５】実施例３ 実施例１における、４７ｋＤａ抗原の代わりに、参考例
３で得られた１５ｋＤａ抗原を用いたことの他は、実施
例１と同様にして１５ｋＤａ抗原担持ラテックス液から
なる本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００４６】実施例４ 実施例１における、カルジオリピンを溶解したエタノー
ル溶液（カルジオリピン濃度 １０μｍｏｌ／ｌ）のカ
ルジオリピンの濃度を、１０００μｍｏｌ／ｌとしたこ
との他は、実施例１と同様に操作して、４７ｋＤａ抗原
担持ラテックス液からなる本発明の免疫学的梅毒診断試
薬を得た。

【００４７】実施例５ 実施例１における、カルジオリピンを溶解したエタノー
ル溶液（カルジオリピン濃度 １０μｍｏｌ／ｌ）のカ
ルジオリピンの濃度を、５０００μｍｏｌ／ｌとしたこ
との他は、実施例１と同様に操作して、４７ｋＤａ抗原
担持ラテックス液からなる本発明の免疫学的梅毒診断試
薬を得た。

【００４８】実施例６ ウサギ睾丸で培養したトレポネーマパリダム菌体を、超
音波処理により破砕した。破砕された溶液から界面活性
剤を用いて抗原蛋白質を粗抽出した。このようにして抽
出された抗原蛋白質をイオン交換カラム及びアパタイト
カラムを用いて精製し、トレポネーマパリダム菌体由来
抗原蛋白質を得た。

【００４９】このようにして得られた、トレポネーマパ
リダム菌体由来抗原蛋白質（蛋白質濃度：１ｍｇ／ｍ
ｌ）を、実施例１における、４７ｋＤａ抗原蛋白質の代
わりに用いたことの他は、実施例１と同様にしてトレポ
ネーマパリダム菌体由来抗原蛋白質担持ラテックス液か
らなる本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００５０】比較例１ 実施例１における、カルジオリピンを溶解したエタノー
ル溶液（カルジオリピン濃度 １０μｍｏｌ／ｌ）のカ
ルジオリピンの濃度を、０μｍｏｌ／ｌとしたこと（す
なわち、カルジオリピンを含有せず）の他は、実施例１
と同様に操作して、４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液か
らなる免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００５１】比較例２ 実施例１における、４７ｋＤａ抗原（蛋白質濃度：１ｍ
ｇ／ｍｌ）の濃度を、蛋白質濃度：０ｍｇ／ｍｌとした
こと（すなわち、４７ｋＤａ抗原を含有せず）の他は、
実施例１と同様に操作して、免疫学的梅毒診断試薬を得
た。

【００５２】検体の測定 実施例１〜６で得られた、本発明の免疫学的梅毒診断試
薬、及び比較例１、２で得られた免疫学的梅毒診断試薬
を用いて、以下のようにして検体（被検物質）の測定を
した。

【００５３】生化学自動分析装置（日立７０５０形、日
立製作所社製）を用いて測定した。測定操作は、上記検
体２０μｌにＧＥＭＡ／ＰＢ溶液３５０μｌを添加・混
合し、３７℃で５分間保温した。次いで上記免疫学的梅
毒診断試薬の５０μｌを添加・混合し、３７℃で保温し
た。上記梅毒診断試薬溶液添加後８０秒から３２０秒の
間の波長５７０ｎｍの濁度変化量を該検体の反応量とし
た。この測定結果を表１及び２に示した。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】比較例１の免疫学的梅毒診断試薬において
は、担持抗原（４７ｋＤａ抗原）に対する抗体が含まれ
ている抗ＴＰ抗体陽性血清と梅毒陽性血清とは反応する
が、抗脂質抗体陽性血清とは殆ど反応しない。比較例２
の免疫学的梅毒診断試薬においては、担持抗原（カルジ
オリピン）に対する抗体が含まれている抗脂質抗体陽性
血清と梅毒陽性血清とは反応するが、抗ＴＰ抗体陽性血
清とは殆ど反応しない。これに対して、実施例１〜６の
本発明の免疫学的梅毒診断試薬においては、全ての陽性
血清に対して反応している。

【００５７】

【発明の効果】本発明１〜３の免疫学的梅毒診断試薬の
製造方法の構成は、上記の通りであり、本発明により製
造した試薬を用いると、従来２種類の検査法で実施しな
ければならなかった梅毒診断を１種類の検査法で実施で
き、更に、梅毒感染初期においても、精度よく判定でき
る。本発明４の梅毒診断試薬の構成は、上記の通りであ
り、本発明の試薬を用いると、従来２種類の検査法で実
施しなければならなかった梅毒診断を１種類の検査法で
実施でき、更に、梅毒感染初期においても、精度よく判
定できる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルジオリピンを含有する溶媒中で、固
   相と梅毒トレポネーマの抗原蛋白質を混合して、該抗原
   蛋白質を該固相に担持させることを特徴とする免疫学的
   梅毒診断試薬の製造方法。
2. 【請求項２】 梅毒トレポネーマの抗原蛋白質が、遺伝
   子工学的手法を用いて製造された、分子量４７ｋＤａの
   梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、分子量１７ｋＤａの
   梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質及び分子量１５ｋＤａ
   の梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質からなる群より選ば
   れる少なくとも一種である請求項１記載の免疫学的梅毒
   診断試薬の製造方法。
3. 【請求項３】 梅毒トレポネーマの抗原蛋白質が、トレ
   ポネーマ・パリダム菌より得られる抗原蛋白質である請
   求項１記載の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の免
   疫学的梅毒診断試薬の製造方法によって得られる梅毒診
   断試薬。