JPH1087491A - 転写調節因子阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害作用に基ずく転写
調節因子ＮＦ−ｋＢの活性化の阻害剤、すなわち、ＮＦ
−ｋＢを阻害することによる、炎症性サイトカインの産
生異常や細胞接着分子の発現増加によって引き起こされ
る疾患などの予防治療剤を提供することである。 【解決手段】 次の一般式（１） 【化１】 で示される置換されたイソキノリン誘導体またはその酸
付加塩を有効成分とするＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤、
ＮＦ−ｋＢ活性化抑制剤、炎症性サイトカイン産生抑制
剤、炎症性細胞接着分子発現抑制剤、および慢性関節リ
ウマチ予防治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＦ−ｋＢ燐酸化
酵素阻害剤作用に基づく転写調節因子ＮＦ−ｋＢの活性
化の阻害剤、すなわち、ＮＦ−ｋＢを阻害することによ
る、炎症性サイトカインの産生異常や炎症性細胞接着分
子の発現増加によって引き起こされる疾患等の予防治療
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体が順応できない刺激（起炎性刺激）
に遭遇した時、障害された組織から種々の反応媒介物質
が産生され、炎症が惹起される。中でも、ＩＬ−１，Ｉ
Ｌ−６，ＩＬ−８等のインターロイキン類やＴＮＦ（腫
瘍壊死因子）等の炎症性サイトカイン、およびＩＣＡＭ
−１，ＩＣＡＭ−２，ＶＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−２，Ｅ
ＬＡＭ等の炎症性細胞接着分子は、自己免疫疾患を始め
とする免疫異常に起因する種々の疾患において、関わっ
ていることが明らかになってきている。

【０００３】例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の
関節液中のＩＬ−６濃度が局所の炎症所見と相関する
〔Hirano, et al.,Eur.J.Immunol., 18,1797, (1988);D
i Giovine,F.S.ら Rheumatol. Int., 9: 259,(1990); R
ooney, M. ら Rheumatol. Int.,10: 217,(1990) 〕、血
清中のＩＬ−６濃度が全身的なRA疾患活動性と相関する
〔Eastgate, J.A.ら Lancet, 8613: 706,(1988) 〕、Ｉ
Ｌ−８が関節炎、乾癬、喘息、敗血症等の多くの炎症性
疾患で産生異常が認められている（岡本秀一, 臨床免
疫, 27(Suppl.16): 80-85, (1995) 〕、また、慢性関節
リウマチ（ＲＡ）患者の罹患関節においては、滑膜細
胞、組織マクロファージ、血管内皮細胞などにＩＣＡＭ
−１の強い発現が見られている〔Hale,P.L. らArthriti
s Rheum.,32:22-30,(1989)〕。さらに、ＩＣＡＭ−１、
Ｅ−selectin等、炎症反応に深く関与している細胞接着
分子に関しては、中和抗体で機能を抑制することにより
炎症症状が改善すること、臓器移植時の拒絶反応の制御
にも使えることが明らかになってきている〔特開平６−
２０９７７８；細胞工学 別冊 接着分子ハンドブック
秀潤社:p139-144,p229-234, (1994); Isobe, M. ら Sci
ence ,255: 1125-1127 (1992) 〕。

【０００４】炎症のごく早期段階でＩＬ−１、ＴＮＦな
どの炎症性サイトカインが炎症部位より産生され〔Baum
ann,H.らImmunol.Today,15:74-80,(1994) 〕、ＩＬ−
１，ＴＮＦにより血管内皮細胞上に炎症性細胞接着分子
のＩＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１，ＥＬＡＭ−１等の産生
が増強され、炎症細胞が炎症部位に浸潤する〔Shimizu,
Y.らImmunol.Today,13:106-112,(1992) 〕。同時に炎症
部位より産生されるＩＬ−８等の走化性因子によって、
好中球やＴ細胞が炎症部位に浸潤する〔Matushima,K.ら
Cytokine,1:2-13,(1989)〕。さらに、単球系の細胞を始
めとする浸潤細胞によって、ＩＬ−６の産生が亢進し症
状を増悪する〔Van Snick,J らAnnu.Rev.Immunol.,8:23
5-278(1990) 〕等のことが明らかにされてきている。

【０００５】これまで多くの抗炎症剤が使用されている
が、種々の炎症性サイトカインの産生、または炎症性細
胞接着分子の発現を抑制するものとしては、いまだに有
効なものは出現していない。ＮＳＡＩＤ（非ステロイド
抗炎症剤）類は、アラキドン酸代謝においてシクロオキ
シゲナーゼを阻害することにより、プロスタグランジン
の産生を抑制するのみで、直接サイトカインの産生は阻
害しない。ステロイド類は、複数のサイトカインの産生
を抑制はするが、ホルモン性の副作用が大きい。また、
サイトカイン抗体あるいはＩＬ−１受容体アンタゴニス
トの類は、特定のサイトカインの活性を抑制するが、複
数のサイトカインの機能を直接抑制することはできな
い。ＩＣＡＭ−１に対する抗体も、臓器移植時の拒絶反
応抑制などで効果が報告されているが、抗体であるので
特異性が高く、ＩＣＡＭ−１の作用は抑制するが、他の
接着分子や、ましてサイトカインの産生には直接の作用
はない。

【０００６】最近、ＩＬ−６、ＩＬ−８等の炎症性サイ
トカインや炎症性細胞接着分子の遺伝子解析が進み、こ
れらが共通の転写調節因子で制御されていることが明ら
かになってきた〔Shimizu, H. ら Mol.Cell.Biol.,10:
561-568,(1990); Zhang, Y.ら Mol.Cell.Biol.,10: 381
8-3823,(1990); Liebermann, T.ら Mol.Cell.Biol.,10:
2327-2334,(1990); Kunsch, C.ら Mol.Cell.Biol.,13:
6137-6146,(1993)〕。この転写調節因子が、ヌクレア
ファクターカッパービー（ＮＦ−ｋＢ）と呼ばれている
蛋白質である〔Sen, R. ら Cell 46: 705-716 (1986);
Baeuerle, P.A.ら Genes Dev. 3: 1689-1698 (1989); L
enardo, M.J.ら Cell 58: 227-229 (1989)〕。一般的
に、転写調節因子は遺伝子の上流側に存在するプロモー
ターあるいはエンハンサー部分に結合する蛋白質で、複
数の因子によって下流の遺伝子の転写を調節している。

【０００７】ＮＦ−ｋＢは、1986年にＳｅｎらにより同
定された蛋白質で〔Sen,R.ら Cell46: 705-716 (198
6)〕、ｐ５０とｐ６５の２つのサブユニットからなり、
ＩＬ−２受容体α鎖，Ｔ細胞受容体β等の受容体、ＩＦ
Ｎβ，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＧＭ−ＣＳＦ，
Ｇ−ＣＳＦ，ＴＮＦα，リンホトキシン等のサイトカイ
ンの発現誘導を担っていることが明らかになってきてい
る〔細胞増殖の制御南江堂:p161-175 (1993)〕。さら
に、ＮＦ−ｋＢは、ＩＣＡＭ−１〔Voraberger, G.ら I
mmunol. 147: 2777-2786 (1991) 〕、ＥＬＡＭ−１〔Wh
elan, J.ら NucleicAcids Res. 19: 2645-2653 (199
1)〕等、炎症反応に深く関与している細胞接着分子の発
現にも関与している。

【０００８】ところで、本発明者らが先の出願（特願平
７−１２５１２８）で記載したように、ＮＦ−ｋＢはエ
イズウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病細胞の原因
ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、サイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）等の宿主内増殖にも関与していることが明らかに
なってきた〔Lenardo, M.J. ら Cell 58: 227-229 (198
9); 藤沢順一ら, 実験医学,11: 1073-1079,(1993); Sam
bucetti, LC.ら EMBOJ.,8: 4251-4258 (1989); Kowali
k, TF.ら Proc Natl Acad Sci USA, 90: 1107-1111,(19
93); Boldogh, I.ら Biochem Biophys Res Commun 197:
1505-1510 (1993) 〕。すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−
１は感染後、ヒト細胞内においてヒトのＮＦ−ｋＢを使
用して、自らの遺伝子増殖を行っているのである。

【０００９】ＨＩＶが自己を複製する際には、ＨＩＶ遺
伝子の中にあるエンハンサーと呼ばれる、転写を活性化
（増強）する配列が重要な働きを行う。 このＨＩＶエ
ンハンサー中にはＮＦ−ｋＢ結合配列が存在し、ＨＩＶ
エンハンサーの転写増強にはＮＦ−ｋＢの活性化が極め
て重要であることも知られている( Bielinska A, Nabel
GJ ら、Science 259: 997-1000, 1990)。

【００１０】現在エイズの発症メカニズムとしては、Ｈ
ＩＶの盛んな増殖がエイズ発症の最大の要因であること
が示唆されており〔Pantaleo, G.ら, Nature 362: 355-
358(1993) ; Embretson, J.ら, Nature 362: 359-362
(1993)〕、ＨＩＶの増殖を抑制する治療薬の開発が進め
られている。ＡＺＴ等の逆転写酵素阻害剤、プロテアー
ゼ阻害剤等が試みられているが、強い毒性の出現や耐性
株の出現等〔Larder B.A., Science 243, 1731, (198
9); Concorder Coordinating Committee, Lancet343, 8
71, (1993) 〕でまだ有効な治療薬は見出されていない
のが現状である。したがって、この転写調節因子ＮＦ−
ｋＢの機能を阻害する化合物は、上記のウイルスの遺伝
子発現を抑制することができ、優れた抗ウイルス剤とな
り得ると期待される。

【００１１】また、ＮＦ−ｋＢは、ＴＮＦ，ＩＬ−１等
により活性化された免疫系細胞、間質系細胞または内皮
細胞でＩＬ−６，ＩＬ−８やＩＣＡＭ−１等の産生を誘
導することが知られている。例えば、ＴＮＦやＩＬ−１
で刺激した線維芽細胞では、ＮＦ−ｋＢが活性化され、
その結果、ＩＬ−６やＩＬ−８の産生が上がる〔Ng SB.
らJ.Biol.Chem.269(29):19020-7,(1994)〕、また、ＴＮ
ＦやＩＬ−１で刺激した血管内皮細胞では、ＮＦ−ｋＢ
が活性化され、その結果、ＩＣＡＭ−１の産生が上がる
〔Ledebur HC. らJ.Biol.Chem.270(2):933-43,(1995)〕
等が知られている。ＲＡ患者に抗ＴＮＦ抗体を投与する
と、患者血清中のＩＬ−６や遊離型のＩＣＡＭ−１が減
少する報告〔Lorez HM. らJ.Immunol.156(4):1646-53(1
996)〕もある。

【００１２】さらに、ＮＦ−ｋＢが細胞接着因子の産生
に深く関わっていることから、ＮＦ−ｋＢの活性を抑制
することで癌転移抑制作用が認められる〔Tozawa K.
ら,Cancer Res.55:4162-67(1995)〕。したがって、各種
炎症疾患等において症状が増悪する過程でＮＦ−ｋＢは
重要な働きをし、ＮＦ−ｋＢの活性を抑制することで治
療予防効果が期待できる〔岡本尚ら, 現代医学,43:615-
21,(1996) 〕。

【００１３】ＮＦ−ｋＢは、休止期の細胞では細胞質に
局在し、ＮＦ−ｋＢの阻害物質であるＩｋＢ（inhibito
r ofＮＦ−ｋＢ）との複合体を形成して不活性の状態で
存在している〔Baeuerle, P.A., ら Science 242: 540-
546 (1988); Zabel, U. ら Cell 61: 255-265 (199
0)〕。すなわち、ＮＦ−ｋＢが細胞質から細胞核内へ移
行することが、ＮＦ-kＢ活性化の必須要件である。細胞
に刺激が加わりＮＦ−ｋＢが活性化する場合、ＮＦ−ｋ
Ｂ・ＩｋＢ複合体に対してプロテインキナーゼＣ（以
下、ＰＫＣと呼ぶ）が作用し、ＩｋＢを燐酸化すること
により複合体よりＩｋＢを分離し、ＮＦ−ｋＢを核内へ
移行させる機構が働くことが、in vitroの実験結果から
明らかにされている〔Ghosh, S. ら Nature 344: 678-6
82 (1990) 〕。

【００１４】また、プロテインキナーゼＡの阻害がＮＦ
−ｋＢの活性化を抑え、ＩＬ−６等のサイトカインの産
生を抑制するという報告もある〔Yu Geng ら,J.Immuno
l.151(12):6692-6700(1993)〕。しかし、ＮＦ−ｋＢの
活性化はＰＫＣを阻害する条件でも起こることが示され
ている〔Meichle, A. ら, J. Biol. Chem. 265:8339-83
43 (1990); Schutze, S ら, Cell 71: 765-776 (1992)
〕ことから、ＮＦ−ｋＢの活性化についてはいまだに
解明されていない。ＩｋＢを燐酸化する酵素は、まだ明
確には同定されていない。

【００１５】最近、ＮＦ−ｋＢが活性化される際には、
ＮＦ−ｋＢ自身が燐酸化されることが明らかになってき
た〔Mellits, K.H.,ら Nucleic Acids Res. 21: 5059-5
066(1993); Hayashi, T.,ら J. Biol. Chem. 268: 2679
0-26795 (1993); Naumann,M., ら EMBO J. 13: 4597-46
07 (1994); Diehl, J.A., ら J. Biol. Chem. 270:2703
-2707 (1995)〕。このＮＦ−ｋＢを燐酸化する酵素（以
下、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素と呼ぶ）によりＮＦ−ｋＢが
燐酸化を受けると、ＤＮＡに結合するようになることも
確認されている〔Hayashi, T.,ら J. Biol. Chem. 268:
26790-26795(1993); Naumann, M., ら EMBO J. 13: 45
97-4607 (1994) 〕。

【００１６】ＮＦ−ｋＢを燐酸化する酵素としてＮＦ−
ｋＢ燐酸化酵素が知られている〔Hayashi, T.,ら J. Bi
ol. Chem. 268: 26790-26795 (1993) 〕。本酵素は、大
量培養したヒト末梢血リンパ球の細胞質画分から精製さ
れる、ＡＴＰとの結合反応後のゲル電気泳動から推定さ
れる分子量が４３ｋＤａの蛋白リン酸化酵素であり、Ｎ
Ｆ−ｋＢのサブユニットｐ５０とｐ６５、両方のセリン
残基を燐酸化しＮＦ−ｋＢを活性化するものである。Ｎ
Ｆ−ｋＢ燐酸化酵素をＡＴＰと共に３０℃でインキュベ
ートすると、ＮＦ−ｋＢがＤＮＡと結合できるようにな
ることがＥＭＳＡ（Electrophoresis Mobility Shift A
ssay）の実験結果から示されている。

【００１７】本酵素を抑制する阻害剤が得られれば、Ｎ
Ｆ−ｋＢを介した疾患に対する治療が可能になると考え
られる。すなわち、複数の炎症性サイトカイン遺伝子の
転写を抑制し、炎症性サイトカインの異常産生を抑制す
る医薬品、また、細胞接着を介した炎症等に対する抗炎
症剤や癌転移抑制剤、臓器移植の際に用いる免疫抑制
剤、さらに、抗ウイルス予防治療剤としての臨床応用が
考えられる。

【００１８】既に転写調節因子阻害剤としては特開平７
−２９１８５９号公報、特開平７−２９１８６０号公報
があるが、上記発明で用いられている化合物は、ユビキ
ノン誘導体であり、本発明の化合物とは異なる。さら
に、これらの特開平７−２９１８５９号公報、特開平７
−２９１８６０号公報では、ＮＦ−ｋＢなどの転写調節
因子の阻害機構に関しては触れられていない。本発明者
らは、本発明とは異なる化学構造を有するビスインドリ
ールピラン誘導体のＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害活性を見
出し、すでに出願した（特願平７−１２５１２８）。

【００１９】また、一般式（１）で示される化合物のう
ち一部のものについては、特開昭５７−１５６４６３号
公報、特開昭５７−２００３６６号公報、特開昭５８−
１２１２７８号公報、特開昭５８−１２１２７９号公
報、特開昭５９−９３０５４号公報、特開昭６０−８１
１６８号公報、特開昭６１−１５２６５８号公報、特開
昭６１−２２７５８１号公報、特開平２−２５６６１７
号公報、特開平４−２６４０３０号公報、特開平７−４
１４２４号公報に示されるように、血管平滑筋弛緩作
用、血流増加作用、血圧降下作用、脳保護作用、気管支
痙攣抑制作用、気管支収縮抑制作用、活性酸素産生抑制
作用を示し、血管拡張剤、脳循環改善剤、狭心症治療
剤、血圧降下剤、脳心血管系の血栓症の予防治療剤、脳
機能改善剤、気管支平滑筋弛緩剤、マクロファージの活
性酸素産生抑制剤において有効な物質であることは既に
公知である。しかし、一般式（１）で示される化合物が
有する、ＮＦ−ｋＢ活性化抑制作用に基づく炎症性サイ
トカイン産生抑制効果および炎症性細胞接着分子発現抑
制効果は知られていなかった。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、ＮＦ−ｋＢの活性化を阻害する
ことに基づく、炎症性サイトカインの産生異常によって
引き起こされる疾患、さらに、炎症性細胞接着分子発現
異常による疾患等の予防治療剤の開発を最終的な目的と
し、そのためにＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤を提供する
ことである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記ＮＦ
−ｋＢ燐酸化酵素阻害物質に関し、鋭意検索を行ったと
ころ、一般式（１）で示される化合物にＮＦ−ｋＢ燐酸
化酵素を強力に阻害する活性が存在することを見出し、
本発明を完成した。

【００２２】すなわち、本発明は、一般式（１）

【化４】 〔式中、Ｒ₁ は水素、塩素または水酸基を表し、Ｒ₁ が
水素のとき、Ｒ₂ は式（２）

【００２３】

【化５】 （式中、Ａは無置換もしくは炭素に結合する水素が炭素
数１ないし４個のアルキル基で置換されている炭素数２
ないし４個のアルキレン基、Ｒ₃ 、Ｒ₄ は互いに独立し
て水素または炭素数１ないし４個の直鎖または枝分かれ
を有するアルキル基、Ｒ₅ は水素、炭素数１ないし６個
からなる直鎖または枝分かれを有するアルキル基、アミ
ジノ基、カルバモイル基、シクロヘキシル基、あるいは
Ｒ₃ 、Ｒ₄は直接結合して無置換もしくは炭素数１ない
し４個のアルキル基で置換されている炭素数４個以下の
アルキレン基、あるいはＲ₄ 、Ｒ₅ は直接結合し隣接す
る窒素原子とともに複素環を形成する基を表す。）で示
される化合物、または式（３）

【００２４】

【化６】 （式中、Ｒ₆ は水酸基またはアミノ基を表す。）で示さ
れる化合物を表し、Ｒ₁が塩素または水酸基のとき、Ｒ₂
は式（２）で示される化合物のうち、Ａはエチレン
基、Ｒ₃ 、Ｒ₄ は互いに結合したトリメチレン基、Ｒ₅
は水素原子の場合を表す。〕で示される置換されたイソ
キノリン誘導体またはその酸付加塩を有効成分とするＮ
Ｆ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤である。

【００２５】そして、上記一般式（１）で示される置換
されたイソキノリン誘導体またはその酸付加塩のうち、
Ｒ₁ が水素のときのＲ₂ が、式（２）において、Ａは無
置換の炭素数２ないし４個のアルキレン基、Ｒ₃ は水
素、Ｒ₄ は水素またはメチル基、Ｒ₅ は水素、メチル
基、アミジノ基、カルバモイル基またはシクロヘキシル
基、あるいはＲ₃ ，Ｒ₄ は直接結合して無置換のエチレ
ン基、あるいはＲ₄ ，Ｒ₅は直接結合し隣接する窒素原
子とともに６員環複素飽和単環を形成する基を表す場合
の化合物であるのが、最も好ましいＮＦ−ｋＢ燐酸化酵
素阻害剤である。また、本発明は、上記一般式（１）で
示される置換されたイソキノリン誘導体またはその酸付
加塩を有効成分とするＮＦ−ｋＢ活性化抑制剤、炎症性
サイトカイン産生抑制剤、炎症性細胞接着分子発現抑制
剤および慢性関節リウマチ治療剤である。

【００２６】本発明において、一般式（１）で示される
具体的な化合物としては、例えば、次の化合物をあげる
ことができる。 （１）１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラ
ジン （２）Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリ
ンスルホンアミド （３）Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンス
ルホンアミド （４）Ｎ−［２−（Ｎ−メチルアミノ）エチル］−５−
イソキノリンスルホンアミド （５）Ｎ−（３−アミノプロピル）−５−イソキノリン
スルホンアミド （６）１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン （７）１−（１−ヒドロキシ−５−イソキノリンスルホ
ニル）ホモピペラジン （８）Ｎ−［２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エチ
ル］−５−イソキノリンスルホンアミド （９）１−（５−イソキノリンスルホニル）−４−アミ
ノピペリジン （１０）Ｎ−［２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エチ
ル］−５−イソキノリンスルホンアミド （１１）１−カルバモイルー４−（５−イソキノリンス
ルホニル）ホモピペラジン （１２）Ｎ−［２−（１−ピペリジル）エチル］−５−
イソキノリンスルホンアミド （１３）１−（５−イソキノリンスルホニル）−４−メ
チルピペラジン （１４）１−（５−イソキノリンスルホニル）−４−ヒ
ドロキシピペリジン （１５）１−（１−クロロ−５−イソキノリンスルホニ
ル）ホモピペラジン （１６）Ｎ−（４ーアミノブチル）−５−イソキノリン
スルホンアミド （１７）１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メ
チルピペラジン

【００２７】本発明で使用する一般式（１）で示される
化合物を得るには、公知の方法、例えば、Morikawa A.
ら J.Med.Chem.,32:46-50(1989) 、特開昭５７−１５６
４６３号公報、特開昭５７−２００３６６号公報、特開
昭５８−１１２１２７８号公報、特開昭５８−１１２１
２７９号公報、特開昭５９−９３０５４号公報、特開昭
６０−８１１６８号公報、特開昭６１−１５２６５８号
公報、特開昭６１−２２７５８１号公報等に記載されて
いる方法により合成することができる。代表例として、
５−イソキノリンスルホン酸クロリドとホモピペラジン
を反応させることにより合成する方法を下記に示す。

【００２８】

【化７】

【００２９】このようにして得られた化合物を有効成分
として、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤を製造することも
可能ではあるが、さらに、シリカゲルカラムや逆相系カ
ラムなどの公知の精製手段を用いて精製し、得られた化
合物を有効成分としてＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤とす
ることが好ましい。かくして得られる一般式（１）で示
される化合物が、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素を阻害すること
は、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素によるｐ５０またはｐ６５の
燐酸化度を測定して検出することができる。以下に、一
つの方法の例を示す。被験化合物をジメチルスルホキサ
イド（以下、ＤＭＳＯと呼ぶ）に１０ｍＭになるように
溶解し、これを原液溶液として、蒸留水で希釈して４０
０μＭの溶液を調製する。比較のためＤＭＳＯを蒸留水
で同濃度になるように希釈したものを用意する。

【００３０】１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、３ｍＭ塩化マンガン
（ＭｎＣｌ₂ ）、５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰおよ
び精製したＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体を
一定量含む２０ｍＭのＮ−２−ハイドロキシエチルピペ
ラジノ−Ｎ−２−エタンスルホン酸緩衝液（以下、ＨＥ
ＰＥＳと呼ぶ）（ｐＨ７．８）に、３，０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ濃度の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを１０μＣｉ添加し、
最終的に１０μｌとする。３０℃で３０分間インキュベ
ートした後、ＳＤＳサンプルバッファー１０μｌを加え
て反応を停止させる。この液を１００℃で５分間沸騰さ
せた後、１０％アクリルアミドよりなるＳＤＳゲル電気
泳動法により分画する。次に、オートラジオグラフィー
で、６５ｋＤａのＮＦ−ｋＢｐ６５サブユニットの位置
を確認し、その部分をＢＡＳ−２０００バイオ・イメー
ジングアナライザー〔富士写真フイルム（株）製〕を用
いて放射能を測定する。阻害化合物を添加しないＤＭＳ
Ｏ溶液の反応による放射能の量を対照に、その低下率に
より阻害活性を求めることができる。

【００３１】ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素は、例えば、上記文
献に従って、種々の細胞・細胞株、組織等から抽出する
ことができる。特に、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素は、林らの
方法〔Hayashi T.ら J. Biol.Chem., 268: 26790 (199
3) 〕に従ってヒトのＴ細胞からＮＦ−ｋＢとの複合体
として得ることができる。すなわち、ヘパリン添加ヒト
末梢血よりＰＢＭＣ（単核球）画分を回収し、培地（Ｒ
ＰＭＩ−１６４０）で洗浄の後、必要に応じて培養を行
い、その後、細胞を回収する。細胞をダウンスホモジナ
イザ−等にて破砕し、１０，０００ｇ，１０分，４℃の
遠心により上清を回収する。この上清を１００，０００
ｇ，３０分の遠心により上清を回収し、Ｓ１００画分と
する。Ｓ１００画分を適当な緩衝液に対して透析し、陰
イオン交換、陽イオン交換、各種アフィニティ−、ゲル
ろ過、密度勾配遠心等を用いて分離を行う。ＮＦ−ｋＢ
燐酸化酵素はＮＦ−ｋＢと複合体を形成していることか
ら、ＥＭＳＡ（Electrophoresis Mobility Shift Assa
y）により含まれている画分を決定することができる。

【００３２】ＥＭＳＡはＳｅｎらの方法〔Sen, R.ら Ce
ll 46: 705-716 (1986)〕を参考にして、以下のように
して行うことができる。ただし、これは一例であり、こ
の方法にこだわらない。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム（MgCl₂ ）、５ｍＭジチオスレイトール（DTT
）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl）（ｐＨ
８．０）に、７．０５ｐｍｏｌＮＦ−ｋＢコンセンサス
オリゴヌクレオチド（以下、ＮＦ−ｋＢオリゴと呼ぶ）
（Promega社製）、１０ｕｎｉｔＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（NEW ENGLAND社製）、２２２ＴＢｑ／ｍｍｏ
ｌ濃度の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを１．８５ＭＢｑ添加し、
最終的に２５μｌとする。３７℃で３０分間インキュベ
ートした後に、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）を２５μｌ加え、クイックスピンカ
ラムＧ−５０〔ベーリンガー・マンハイム山之内（株）
製〕を用い、１，１００ｇで１分間遠心し、放射線標識
の入ったＮＦ−ｋＢオリゴを分離する。１００ｍＭ塩化
ナトリウム（ＮａＣｌ）、２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＤ
ＴＴ、１０％グリセロール、０．２４％ノニデットＰ−
４０（ＮＰ−４０）、０．１６％デオキシコレート（Ｄ
ＯＣ）を含む２ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５μｌに、１０μｇ／μｌ濃度のｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄ
Ｃ）ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）〔シグマ（株）製〕を１μ
ｌ加え、試料２μｌを加える。さらに、上記で調製した
ＮＦ−ｋＢオリゴを１万ｃｐｍになるように添加し、最
終的に１０μｌにする。室温で１時間インキューベート
した後に、４％アクリルアミドゲルよりなるネイティブ
ゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィー
にてＮＦ−ｋＢオリゴと結合する画分を決定する。この
画分がＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体が含ま
れている画分である。

【００３３】この画分を回収して酵素阻害剤の評価に供
する。この画分に、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素が存在してい
ることは、燐酸化反応により約６５ｋＤａおよび約５０
ｋＤａの位置に燐酸化されたバンドが検出されることよ
り明らかである。一般式（１）で示される化合物は、常
法により製剤化することができる。すなわち、一般式
（１）で示される化合物またはその酸付加塩と、公知の
医薬上許容される担体とを混合すればよい。上記の担体
としては、例えば、ゼラチン：乳糖、グルコース等の糖
類：コーン、小麦、米、とうもろこし澱粉等の澱粉類：
ステアリン酸等の脂肪酸：ステアリン酸カルシウム、ス
テアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩：タルク：植物
油：ステアリンアルコール、ベンジルアルコール等のア
ルコール：ガム：ポリアルキレングリコール等があげら
れる。

【００３４】これらのうち、液状担体の例としては、一
般に水、生理食塩液、デキストロースまたは類似の糖溶
液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグ
リコール類があげられる。本発明のＮＦ−ｋＢ燐酸化酵
素阻害剤がカプセル剤である場合には、通常ゼラチンを
用いてカプセルを調製し使用することが望ましい。

【００３５】投与方法は、経口投与や非経口投与があげ
られる。経口投与に適した剤形としては、錠剤、カプセ
ル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、エリキシル剤等があげら
れ、非経口投与に適した剤形としては、液剤が例示され
る。非経口的に筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射で投
与する場合、一般式（１）で示される化合物またはその
酸付加塩は、溶液を等張するために、食塩またはグルコ
ース等の他の溶質を添加した無菌溶液として使用され
る。

【００３６】注射により投与する場合には、さらに、滅
菌水、塩酸リドカイン溶液（筋肉内注射用）、生理食塩
液、ブドウ糖溶液、静脈内注射用溶液、電解質溶液（静
脈内注射用）等で溶解することも好ましい。このように
溶解した場合には、通常0.001〜20重量％、好ましくは
0.01〜10重量％の有効成分を含むように調製されること
がある。経口投与が錠剤、カプセル剤、粉剤、または顆
粒剤である場合、0.01〜100 重量％、好ましくは1 〜40
重量％の有効成分を含む例があげられる。経口投与の液
剤の場合、0.01〜20重量％の有効成分を含む懸濁液また
はシロップが好ましい例としてあげられる。この場合、
担体としては、香料、シロップ、製剤的ミセル体等の水
様賦形剤をあげることができる。

【００３７】本発明のＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤の投
与量は、患者の年齢、健康状態、体重、症状の程度、同
時処置があるならばその種類、処置頻度、所望の効果の
性質、あるいは投与経路や投与計画によっても決定され
るが、一般には、非経口投与で0.01〜100mg/kg・日、経
口投与で0.02〜400mg/kg・日があげられる。化合物によ
って投与量は若干異なるが、例えば、実施例に記載した
化合物（１）の場合は、非経口投与では、好ましくは0.
1mg/kg・日以上、さらに好ましくは1mg/kg・日以上、特
に好ましくは2mg/kg・日以上があげられ、経口投与で
は、好ましくは0.5mg/kg・日以上、さらに好ましくは1
または2mg/kg・日以上、特に好ましくは4mg/kg・日以上
があげられる。

【００３８】

【発明の実施の形態】次に、実施例により本発明をさら
に詳細に述べるが、これに限定されるものではない。 （実施例１）まず、ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素
複合体を調製し、ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害活性を測定
する方法の具体例を述べる。 （１）ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体の調製 ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体の調製は、林
らの方法〔Hayashi T.ら J. Biol.Chem., 268: 26790
(1993)〕に準じて行った。すなわち、ヘパリン添加ヒト
末梢血よりＰＢＭＣ画分を回収し、ＲＰＭＩ−１６４０
で洗浄の後、無血清培地ＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ製）に浮遊させた。ＯＫＴ３固層化フラスコ〔ヤンセ
ン協和（株）製〕中で３日間培養し、その後、ＡＩＭ−
Ｖ／０．２ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ インスリン／１％ヒト
血清／７００Ｊｕｒｋａｔ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＩＬ−
２に浮遊させ、ガス透過性カルチャーバッグ（デュポン
社製）中にて１週間培養を行った。培養終了時に遠心に
より細胞（約５×１０⁹ ｃｅｌｌｓ）を回収し、ＮＦ−
ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体調製のための材料と
した。 細胞を３倍量の低張緩衝液〔１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ ，５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．５），４℃〕に浮遊させた後、１０分間静置した。
ダンスホモジナイザーに移して、１０回のストロークで
細胞を破砕し、１０，０００ｇ，１０分，４℃の遠心に
より上清を回収した。この上清を１００，０００ｇ，３
０分の遠心により上清を回収し、Ｓ１００画分とした。

【００３９】以下、ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素
複合体の調製操作は４℃で実施した。Ｓ１００画分を緩
衝液Ｄ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），２０％
ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ，０．５ｍＭＤＴＴ）＋０．２８ＭＫＣｌ
に対して透析した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ〔フ
ァルマシア バイオテク（株）製〕を詰めたカラム（1.
6 ×10cm）を用意し、緩衝液Ｄ＋０．２８ＭＫＣｌで平
衡化した。このカラムに透析したＳ１００画分をアプラ
イして、その非吸着画分を回収した。

【００４０】その非吸着画分を緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣ
ｌに対して透析し、次のカラムにアプライした。次のカ
ラムとしては、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌであらかじめ
平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（1.6 ×10cm）を用いた。上記の非吸着画分をこのカラ
ムにアプライして、５カラム体積の緩衝液Ｄ＋０．１Ｍ
ＫＣｌで洗浄後、１０カラム体積で０．１〜０．５ＭＫ
Ｃｌのグラジエント溶出を行った。ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−
ｋＢ燐酸化酵素複合体が含まれている画分は、ＥＭＳＡ
（Electrophoresis Mobility Shift Assay）により決定
した。

【００４１】ＥＭＳＡはＳｅｎらの方法〔Sen, R.ら Ce
ll 46: 705-716 (1986)〕を参考にして、以下のように
して行った。すなわち、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭＤ
ＴＴ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に、
７．０５ｐｍｏｌＮＦ−ｋＢオリゴ（Promega 社製）、
１０ｕｎｉｔＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEW ENGL
AND社製）、２２２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ濃度の［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰを１．８５ＭＢｑ添加し、最終的に２５μ
ｌとした。３７℃で３０分間インキュベートした後に、
１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）を２５μｌ加え、クイックスピンカラムＧ−５０
〔ベーリンガー・マンハイム山之内（株）製〕を用い、
１，１００ｇで１分間遠心し放射線標識の入ったＮＦ−
ｋＢオリゴを分離した。

【００４２】１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、２
０ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、０．２４％ＮＰ−
４０、０．１６％ＤＯＣを含む２ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）５μｌに、１０μｇ／μｌ濃度のｐｏｌ
ｙ（ｄＩ−ｄＣ）ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）〔シグマ
（株）製〕を１μｌ加え、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラム分離画分２μｌを加えた。さらに上記で調製し
たＮＦ−ｋＢオリゴを１万ｃｐｍになるように添加し、
最終的に１０μｌにした。室温で１時間インキューベー
トした後に、４％アクリルアミドゲルよりなるネイティ
ブゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィ
ーにて、ＮＦ−ｋＢオリゴと結合する画分を決定した。
この画分がＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合体が
含まれている画分である。ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸
化酵素複合体画分を回収し、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌ
に対して透析した。

【００４３】次に、Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
Ｐ１１〔ワットマン ペーパー（株）製〕（約６ｍ
ｌ）を詰めたカラムを用意し、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣ
ｌで平衡化しておいた。上記の透析したＮＦ−ｋＢ・Ｎ
Ｆ−ｋＢ燐酸化酵素複合体画分をカラムにアプライし、
非吸着画分を回収した。この画分を、あらかじめ緩衝液
Ｄ＋０．１ＭＫＣｌで平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ
Ｈｅｐａｒｉｎ １ｍｌ〔ファルマシア バイオテク
（株）製〕にアプライし、非吸着画分を回収した。

【００４４】ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ 非吸着画
分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０〔グーレースジャパン
（株）製〕で濃縮し、あらかじめ緩衝液Ｄ＋０．１Ｍ
ＫＣｌで平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｈ
Ｒ １０／３０〔ファルマシア バイオテク（株）製〕
にアプライし、ＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素複合
体画分をＥＭＳＡにより決定した。その画分を回収して
酵素阻害剤の評価に供した。この画分に、ＮＦ−ｋＢ燐
酸化酵素が存在していることは、燐酸化反応により約６
５ｋＤａの位置に燐酸化されたバンドが検出できたこと
より明らかである。

【００４５】（２）阻害剤の調製 一般式（１）で示される化合物を、ＤＭＳＯ（ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ製）に１０ｍＭになるように溶解した。これ
を原液溶液として、蒸留水で希釈して４００μＭの溶液
を調製した。比較のためＤＭＳＯを、蒸留水で同濃度に
なるように希釈した。

【００４６】（３）阻害活性の測定方法 １０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、３ｍＭＭｎＣｌ₂ 、５ｍＭＤＴ
Ｔ、０．５ｍＭＡＴＰおよび上記のＮＦ−ｋＢ・ＮＦ−
ｋＢ燐酸化酵素複合体を含む画分をタンパク質として
０．３５μｇ含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）
に、被検化合物溶液２．５μｌ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ濃度の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを１０μＣｉ添加し、最終
的に１０μｌとした。３０℃で３０分間インキュベート
した後、ＳＤＳサンプルバッファー１０μｌを加えて反
応を停止させた。

【００４７】次に、この液を１００℃で５分間沸騰させ
た後、１０％アクリルアミドよりなるＳＤＳゲル電気泳
動法により分画した。次に、オートラジオグラフィー
で、６５ｋＤａのＮＦ−ｋＢの位置を確認し、その部分
を、ＢＡＳ−２０００バイオ・イメージングアナライザ
ー〔富士写真フイルム（株）製〕を用いて、放射能を測
定した。阻害化合物を添加しないＤＭＳＯ溶液の反応に
よる放射能の量を対照に、その低下率により阻害活性を
求めた。ＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害率を表１に示した。

【００４８】

【表１】

【００４９】（比較例１）以下の化合物に関しては、１
００μＭの最終濃度でＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害が認め
られなかった。Ｎ−（６−アミノヘキシル）−５−イソ
キノリンスルホンアミド、Ｎ−［２−モノフォリノエチ
ル］−６−イソキノリンスルホンアミド、Ｎ−［２−
（Ｎ−２−ピリミジニルアミノ）エチル］−５−イソキ
ノリンスルホンアミド、Ｎ−（２−［Ｎ−２−（２−イ
ミダゾリル）］アミノエチル）−５−イソキノリンスル
ホンアミド。

【００５０】（実施例２） ＮＦ−ｋＢ活性化（核内移行）抑制作用。 （１）ＲＡ患者由来滑膜細胞の調製法 ヒトリウマチ患者の関節より、肥大化した滑膜細胞を手
術によりかき取り、ピペッティングによりsingle cell
にした後、３７℃，５％ＣＯ₂ インキュベーター内で培
養を行った。

【００５１】（２）ＮＦ−ｋＢの核移行の抑制評価方法 <細胞の調製>滑膜細胞を８ｗｅｌｌのＬａｂ−Ｔｅｋチ
ャンバー（Nunc社製）に、１５００個／３００μｌ／ｗ
ｅｌｌの細胞数になるようにまいた。３７℃，５％ＣＯ
₂ インキュベーター内で２日間培養後、薬剤を投与し培
養を継続した。薬剤の調製は、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃
度になるように溶解し、終濃度で評価濃度になるように
培養液中に加えた。薬剤を投与後、２時間後に遺伝子工
学的に大腸菌で産生させたＴＮＦを１ｎｇ／ｍｌの濃度
になるように細胞に添加した。ＴＮＦで刺激した後、培
養を継続し、３０分後にＬａｂ−Ｔｅｋチャンバーを取
り出し、核内移行の試験に用いた。

【００５２】＜核内移行試験＞Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバ
ーの容器をはずし、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ
（−）に溶解した４．５％パラホルムアルデヒドで細胞
を固定した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００で処理した。ＮＦ−ｋＢｐ６５サブユニ
ットに対する抗体ｐ６５抗体（Ｃ−２０）（サンタクル
ツ社製）溶液を、１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液
（０．１％ＮａＮ３を含む）に１：１００の割合で希釈
し、１次抗体溶液を作製した。１次抗体溶液を固定化し
た細胞に与えて、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ
（−）で洗浄後、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶
液に浸けた。２次抗体溶液はａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ
ＦＩＴＣｃｏｎｊｕｇａｔｅ（カッペル社製）溶液を、
１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液（０．１％ＮａＮ
３を含む）に１：２００の割合で希釈して作製した。２
次抗体溶液を細胞に与えて、３７℃３０分間反応させ
た。

【００５３】ＰＢＳ（−）で洗浄後、風乾させグリセリ
ンを垂らして、カバーグラスをして顕微鏡観察用のプレ
パラートとした。蛍光顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣが結合
したＮＦ−ｋＢｐ６５を検出した結果を以下に示した。
ＴＮＦ刺激により、ＮＦ−ｋＢは核内に移行したが、化
合物（１）を投与した細胞では、ＮＦ−ｋＢが細胞質内
に留まった。比較のために、ＤＭＳＯのみを投与したも
の、およびＴＮＦ刺激を行わなかったものを作製した。
ＤＭＳＯのみを投与したものは、ＴＮＦ刺激によりＮＦ
−ｋＢが核内へ移行するのが認められた。一方、ＴＮＦ
刺激を行わなかったものは、ＮＦ−ｋＢが細胞質に留ま
ったままであった。この結果を図１、図２、および図３
に示す。

【００５４】（実施例３） 炎症性サイトカインの産生抑制評価 実施例２と同様にして、ＲＡ患者の滑膜細胞を、組織培
養用４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に
３０００個／３００μｌ／ｗｅｌｌの細胞数になるよう
にまいた。３７℃，５％ＣＯ₂ インキュベーター内で２
日間培養後、薬剤を投与し培養を継続した。薬剤の調製
は、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度になるように溶解し、終
濃度で評価濃度になるように培養液中に加えた。薬剤を
投与２時間後に、遺伝子工学的に大腸菌で産生させたＴ
ＮＦを、１ｎｇ／ｍｌの濃度になるように細胞に添加し
た。ＴＮＦで刺激した後、培養を継続し、１６時間後に
培養上清を回収した。

【００５５】<サイトカイン測定>培養上清中のサイトカ
インは、ＩＬ−６をh-Interleukin-6 ELISA （ベーリン
ガーマンハイム社）、また、ＩＬ−８をヒトインターロ
イキンー８(IL-8) ELISAキット〔東レ（株）〕を用いて
測定した。

【００５６】<細胞のバイアビリティ測定>培養上清回収
後の細胞にＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5
-diphenyl-2H-tetrazolium・Br）溶液を加えて、細胞の
バイアビリティの測定を行った。培養上清回収後の細胞
に、新鮮な培地を３００μｌ添加、さらに、７．５ｍｇ
／ｍｌＭＴＴ溶液を３０μｌ添加後、３７℃，５％ＣＯ
₂ インキュベーター内で４時間培養した。培養上清を除
去後、フォルマザンを抽出し、５４０ｎｍ（参考波長６
９０ｎｍ）波長の吸光度でフォルマザン量を測定した。
薬剤を添加せず、ＴＮＦ刺激のない画分をバイアビリテ
ィ１００％として、各画分のバイアビリティを算出し
た。

【００５７】<サイトカイン産生の評価>サイトカイン産
生の評価は、ＥＬＩＳＡで測定した値を、その細胞のバ
イアビリティで割り返した値で評価した。その結果を、
表２に示した。

【００５８】

【表２】

【００５９】（実施例４） 製剤例（錠剤） 一般式（１）で示される化合物のいずれか２０ｍｇをそ
れぞれが含んで成る錠剤を、下記の組成により慣用の方
法で調製した。活性成分をコムギデンプンの一部、ラク
トースおよびコロイド状シリカと混合して、その混合物
を篩にかけた。残りのコムギデンプンの一部を湯浴上で
５倍量の水でペースト状にし、その粉末混合物をそのペ
ーストとややプラスチック状の塊ができるまでこねた。
このプラクチック塊を約３ｍｍのメッシュサイズを有す
る篩に通し、得られる乾燥顆粒を再び篩に通した。残り
のコムギ粉、タルクおよびステアリン酸マグネシウムを
混ぜ合わせて、その混合物をそれぞれ１４５ｍｇの重量
および破断ノッチを有する錠剤となるように圧搾した。

【００６０】（実施例５） 製剤例（無菌注射剤） 以下の成分を注射用蒸留水に溶解し、その後、注射用蒸
留水を添加し、必要な最終含量とし、この溶液２ｍｌを
アンプルに密封し、加熱滅菌無菌注射剤を製造した（表
３）。

【００６１】

【表３】

【００６２】（実施例６） Ｎ−（５−イソキノリンスルホニル）−４−アミノピペ
リジンモノ塩酸塩の合成 ４−アミノピペリジン（２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）の塩
化メチレン溶液（１００ｍｌ）に、５−イソキノリンス
ルホニルクロリド（５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液
（５０ｍｌ）を室温下１０分で滴下した。得られた溶液
を２時間室温にて攪拌した後、水（５０ｍｌ）を加え
た。溶液を分液し、有機層を水（５０ｍｌ）で洗浄し
た。有機層を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにて分離し、（クロロフォルム：メタノ
ール＝１０：１）目的物の遊離体を（１．２ｇ、４．１
ｍｍｏｌ）得た。遊離体に１．１倍等量の１Ｎ塩酸水溶
液を加え、減圧下濃縮した。残さにメタノールを加え、
再結晶して目的物０．９４ｇ（３.２ｍｍｏｌ，収率６
４％）を得た。マススペクトル 理論値：３２７．０８
０５質量単位；測定値：３２７．０８１２。

【００６３】Ｎ−（５−イソキノリンスルホニル）−４
−ヒドロキシピペリジンの合成 ４−ヒドロキシピペリジン（２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）
の塩化メチレン溶液（１００ｍｌ）に、５−イソキノリ
ンスルホニルクロリド（５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶
液（５０ｍｌ）を室温下１０分で滴下した。得られた溶
液を２時間室温にて攪拌した後、水（５０ｍｌ）を加え
た。溶液を分液し、有機層を水（５０ｍｌ）で洗浄し
た。有機層を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにて分離し、（クロロフォルム：メタノ
ール＝１０：１）粗生成物を得た。これにメタノールを
加え、再結晶して目的物０．９３ｇ（４．２ｍｍｏｌ、
収率８４％）を得た。マススペクトル 理論値：２９
２．０８７８質量単位；測定値：２９２．０８８３。

【００６４】４−カルバモイル−１−（５−イソキノリ
ンスルホニル）ホモピペラジンの合成 Ｎ−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン
（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）に、酢酸３０ｍｌ、水２０
ｍｌを加え溶解した。得られた溶液に、イソシアン酸ナ
トリウム（１．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、４０度に
２時間加熱した。生じた沈殿を濾取し、メタノール／水
にて再結晶して目的物１．１ｇ（３．４ｍｍｏｌ、３４
％）を得た。マススペクトル 理論値：３３４．１０９
６質量単位；測定値：３３４．１１０５。

【００６５】

【発明の効果】本発明のリン酸化酵素阻害剤は、ＮＦ−
ｋＢ燐酸化酵素を阻害し、ＮＦ−ｋＢを介した疾患に対
する治療を行うのに有用である。すなわち、複数の炎症
性サイトカイン遺伝子および炎症性細胞接着分子等の転
写を抑制し、ステロイドが惹起するホルモン性の副作用
がない、慢性関節リウマチ等や炎症全般の治療予防剤、
また、臓器移植の際に用いる免疫抑制剤、腎炎などの臓
器炎症等に対する治療予防剤、また、癌転移抑制剤、さ
らに、抗ウイルス剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＮＦ刺激無しの細胞写真である。

【図２】ＴＮＦ刺激有りの細胞写真である。

【図３】化合物（１）１０μＭ処置後ＴＮＦ刺激有りの
細胞写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 401/12 ２４１ Ｃ０７Ｄ 401/12 ２４１ (72)発明者 森川 安理 静岡県富士市鮫島２番地の１ 旭化成工業 株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 〔式中、Ｒ₁ は水素、塩素または水酸基を表し、Ｒ₁ が
   水素のとき、Ｒ₂ は式（２） 【化２】 （式中、Ａは無置換もしくは炭素に結合する水素が炭素
   数１ないし４個のアルキル基で置換されている炭素数２
   ないし４個のアルキレン基、Ｒ₃ 、Ｒ₄ は互いに独立し
   て水素または炭素数１ないし４個の直鎖または枝分かれ
   を有するアルキル基、Ｒ₅ は水素、炭素数１ないし６個
   からなる直鎖または枝分かれを有するアルキル基、アミ
   ジノ基、カルバモイル基、シクロヘキシル基、あるいは
   Ｒ₃ 、Ｒ₄は直接結合して無置換もしくは炭素数１ない
   し４個のアルキル基で置換されている炭素数４個以下の
   アルキレン基、あるいはＲ₄ 、Ｒ₅ は直接結合し隣接す
   る窒素原子とともに複素環を形成する基を表す。）で示
   される化合物、または式（３） 【化３】 （式中、Ｒ₆ は水酸基またはアミノ基を表す。）で示さ
   れる化合物を表し、Ｒ₁が塩素または水酸基のとき、Ｒ₂
   は式（２）で示される化合物のうち、Ａはエチレン
   基、Ｒ₃ 、Ｒ₄ は互いに結合したトリメチレン基、Ｒ₅
   は水素原子の場合を表す。〕で示される置換されたイソ
   キノリン誘導体またはその酸付加塩を有効成分とするＮ
   Ｆ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤。
2. 【請求項２】 一般式（１）のＲ₁ が水素のときのＲ₂
   が、式（２）において、Ａは無置換の炭素数２ないし４
   個のアルキレン基、Ｒ₃ は水素、Ｒ₄ は水素またはメチ
   ル基、Ｒ₅ は水素、メチル基、アミジノ基、カルバモイ
   ル基またはシクロヘキシル基、あるいはＲ₃ ，Ｒ₄ は直
   接結合して無置換のエチレン基、あるいはＲ₄ ，Ｒ₅ は
   直接結合し隣接する窒素原子とともに６員環複素飽和単
   環を形成する基を表す場合の化合物である請求項１に記
   載のＮＦ−ｋＢ燐酸化酵素阻害剤。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の一般式（１）で示され
   る置換されたイソキノリン誘導体またはその酸付加塩を
   有効成分とするＮＦ−ｋＢ活性化抑制剤。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の一般式（１）で示され
   る置換されたイソキノリン誘導体またはその酸付加塩を
   有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の一般式（１）で示され
   る置換されたイソキノリン誘導体またはその酸付加塩を
   有効成分とする炎症性細胞接着分子発現抑制剤。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の一般式（１）で示され
   る置換されたイソキノリン誘導体またはその酸付加塩を
   有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤。
7. 【請求項７】 一般式（１）で示される化合物のうち下
   記に示す化合物またはその酸付加塩。 １−（５−イソキノリンスルホニル）−４−アミノピペ
   リジン １−（５−イソキノリンスルホニル）−４−ヒドロキシ
   ピペリジン １−カルバモイルー４−（５−イソキノリンスルホニ
   ル）ホモピペラジン