JPH107580A - コラゲナ−ゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 合成化学薬品と比較して、毒性や副作用また
服用上の制約等、不都合の少ない、新規のコラゲナ−ゼ
阻害剤を提供する。 【解決手段】 卑近な植物である、ヒメオオギズイセン
の球根を粉砕しながら熱水又は冷水で先ず一次抽出し、
更にそれぞれの抽出残渣をメタノ−ルで二次抽出処理す
ること及び熱水抽出残渣については、抽出溶媒を８０％
エタノ−ル、酸性及び塩基性エタノ−ルまた酸性及び塩
基性イソブタノ−ルに変えて抽出処理を行うことによっ
てそれぞれ抽出分画が得られるが、これらの抽出分画は
何れも高いコラゲナ−ゼ活性を示し、内服又は外用の製
剤として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コラゲナ−ゼ阻害活性
を有する新規な物質、詳しくはヒメオオギズイセン（学
名：Ｃｒｏｃｏｓｍｉａ Ｘ ｃｒｏｃｏａｍａｅｆｌ
ｏｒａ Ｎ．Ｂ．Ｂｒ．またはＴｒｉｔｏｎｉａ Ｃｒ
ｏｃｏｓｍｓｅｆｌｏｒａ Ｌｅｍｏｌｎｅ）の根から
抽出して得られる活性成分を含有してなるコラゲナ−ゼ
阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラ−ゲンは、動物の結合組織、例えば
皮膚、骨、靭帯や軟骨などを構成する繊維状のタンパク
質成分であり、ヒトの場合身体の全タンパク質のほぼ３
０％を占める。このような繊維状のコラ−ゲンを構成す
る基本単位は、分子量約３０万、太さ１．５ ｍｍのト
ロポコラ−ゲンであり、グリシン・プロリン・ヒドロキ
シプロリンに富むポリペプチド鎖３本が右巻き三重ラセ
ン状に繰り合わせて構成されてなる安定なコラ−ゲン三
重ラセン構造を呈する。特殊アミノ酸としてヒドロキシ
リシンを含有し、そのヒドロキシル基を介してガラクト
−スやグルコ−スが結合している。生体内ではコラ−ゲ
ンは繊維を形成して存在し、生合成された直後では水溶
性であるが、加齢とともにコラ−ゲン分子間で架橋反応
が生起し不溶性コラ−ゲンに変化していく。

【０００３】コラ−ゲン三重ラセン構造構造を有するタ
ンパク質分子には、１３種の異なるものが知られてお
り、それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、．．．．．．ＸＩＩＩ
型と称されているが、コラ−ゲンタンパク質は、さらに
（１）特異的横紋構造を持つ繊維形成分子群；Ｉ型、Ｉ
ＩＩ型、Ｖ型（主として軟骨以外の組織）、ＩＩ、ＸＩ
型（軟骨組織）、（２）これらの繊維の表面に結合して
いる分子群であるＸＩＩ型（軟骨以外の組織）、ＩＸ型
（軟骨組織）、（３）特殊な会合体を形成している分子
群であるＩＶ型（主として基底板の骨格形成）、ＶＩ型
（細胞外の微細繊維を形成）、ＶＩＩ型（表皮基底細胞
のアンカリングフィラメントを形成）、（４）会合体構
造が未知である分子、Ｘ型（軟骨から骨への移行段階で
暫定的に存在する）、ＶＩＩＩ型（目の角膜や血管の形
成成分）等に分類される。

【０００４】コラ−ゲン繊維は、成長と共にポリペプチ
ド鎖間に橋かけ結合が生じて不溶性となり、動物組織の
骨格構造を構成する主要成分である。その最も基本的な
機能は構造形成であるが、その他細胞の接着、増殖や分
化などに特異的に作用を示すことが明らかになってい
る。なお、コラ−ゲンを変性処理して水溶性としたもの
がゼラチンである。

【０００５】健常な組織においては、新たに細胞性結合
組織が合成されているが、それに見合うように細胞外マ
トリックスがメタロプロテナ−ゼによって分解されてお
り、全体として新陳代謝は調和がとれている。このよう
なメタロプロテナ−ゼは、結合組織自体や炎症細胞から
遊離されるのであるが、その合成や分泌また分解活性は
厳密に制御されており、特にその活性は特異的な阻害剤
によりコントロ−ルされている。一方一般にコラ−ゲン
代謝疾患と称される疾患があることが知られており、例
えば骨粗鬆症、パジェット病、マルファン症候群、骨形
成不全、小人症、慢性関節リウマチ、変形性関節症など
が挙げられ、全身硬化症やエリトマト−デス等も含めら
れる。これらの疾患は、基本的にはコラ−ゲンの同化、
異化など代謝異常が原因であり、共通する解剖学的且つ
病理学的特徴を持つ結合織や血管の炎症を特徴とし、骨
格組織の萎縮、骨格変形などを伴うとされているが、根
本的には、細胞外マトリックスの吸収がメタロプロテナ
−ゼによって吸収され、その結果結合組織の分解が制御
されず、加速されたことに起因し、ガンや腫瘍の転移や
浸潤にも関与しているとされている。また骨粗鬆症にお
いては、骨の有機マトリックスの９０％以上を構成する
Ｉ型コラ−ゲンの合成と分解との間の動的平衡の失調が
生起しており、事実コラ−ゲン分解産物を追跡すること
によって骨吸収速度が測定され、この疾患の診断に有用
であるとされている。

【０００６】更には、ヒトの皮膚は表皮組織と真皮組織
とから成り、その下部に物理的強度を付与するコラ−ゲ
ンと弾性を付与するエラスチンとからなる網目構造の結
合織が形成されている。紫外線などの外部刺激や老化や
抗原−抗体反応などの内的要因によってコラ−ゲンやラ
スチンなどが分解され、それに見合うコラ−ゲンやエラ
スチン合成が補充されなかった場合に皮膚のたるみやシ
ワが形成されるとみなされている。

【０００７】メタロプロテア−ゼは、活性中心に亜鉛、
コバルト、マンガンなどの金属を含む酵素類の総称であ
り、コラゲナ−ゼ類、ぜラチナ−ゼ類（ＩＶ型コラゲナ
−ゼ類）およびストロメリシン類に分類される。コラゲ
ナ−ゼ類は、セリンプロテア−ゼよりも分子量が大き
く、基質特異性が相異なるＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型
に細分類されるが、例えば、Ｉ型はコラ−ゲンＩ、ＩＩ
およびＩＩＩ型に作用し、ＩＶ型はＩＶ型コラ−ゲンや
ゼラチンを分解する。なお白血球由来のコラゲナ−ゼは
Ｉ型コラゲナ−ゼよりもコラ−ゲン分解作用は強力であ
ることが判っており、コラ−ゲン疾患の発現や進行に大
いにに関与している可能性がある。従って、メタロプロ
テナ−ゼ阻害剤を投与することによって上記したような
疾患の病因を好ましい態様に変性させ、またかかるメタ
ロプロテナ−ゼを外用することによってヒフのタルミや
シワの発生を予防することが期待出来るのであって、数
多くの化合物がこのような目的のためのメタロプロテナ
−ゼ阻害剤として提案されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の多くは、経口投与された場合意図した阻害活性を喪失
するため、医薬品としての開発に到ることはなく、また
皮膚に適用した場合皮膚障害等の副作用を発現するた
め、化粧品やトイレタリ−等に配合するには適していな
い。かかる事情に鑑みて本発明の目的は、内服しても良
好なコラゲナ−ゼ阻害活性を保持しまた皮膚に直接適用
しても皮膚刺激等の副作用が少なく、クリ−ム、ロ−シ
ョンなどの化粧品や石けん、浴用剤などのトイレタリ−
製品に混入可能である天然物由来のコラゲナ−ゼを提供
しようとするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかねてか
ら、合成化学薬品と比較して毒性や副作用また服用上の
制約等不都合の少ない医薬品を開発するべく天然由来の
薬理活性を有する新規な医薬物質の探索と研究を行って
きたが、その過程で漢方薬や民間薬としての種々の生薬
はもとより薬効が認められていない卑近な植物にも注目
し、それらから抽出して得られる生理活性物質を中心に
種々検討を重ねてきた。就中前記した目的を達成するた
めに、本発明者らは種々の薬草や卑近な植物を抽出操作
にかけて、その抽出成分につきコラゲナ−ゼ活性の検討
を行ったが、その結果、これまで単なる雑草の一種とさ
れ、生薬に分類されていなかったヒメオオギズイセンの
球根から水性媒体で抽出することによって得られる特定
のいくつかの抽出分画成分が、従来知られていなかった
顕著に高いコラゲナ−ゼ阻害活性を有することを発見
し、本発明を完成するに到ったものである。

【００１０】ヒメオオギズイセンは、アヤメ科の多年草
であり、主に鑑賞用として庭園等で栽培されることもあ
るが、温暖な地方では山野のほか田畑のふち、日陰の空
き地や道路沿いなどに自生しているのが認められる。葉
は剣状を呈し、草丈は５０ないし８０ｃｍほどで直立
し、地中には球状の根茎を有する。初夏から夏期にかけ
て茎は上部において２ないし３本に分枝し、多数の紅色
の花を片側的な穂状花房として咲かせる。なお花の径は
２ないし３ｃｍであり、花被はロ−ド状で６枚である。

【００１１】ヒメオオギズイセンは専ら鑑賞用に栽培さ
れてきたのであるが、最近その球根をそのまま内服した
場合特に食道ガン、胃ガンなどの消化器ガンにに有効で
ある（特開昭５７−７４２２）ことまたその全草または
球根の有機溶媒よる抽出物がインフルエンザウイルスな
どに対して抗ウイルス活性を有している（特開昭６０−
７２８２３）ことが報告されている。

【００１２】本発明では、ヒメオオギズイセンの球根を
採取した後、水で洗浄して乾燥するか又は乾燥しない
で、そのまま又は粉砕して水性抽出媒体で抽出する。こ
の際、ヒメオオギズイセンの球根は、通常秋季に、好ま
しくは夏期の終わりから秋季に地下から根茎部を採取
し、凍結乾燥すれば、乾燥・粉砕が効率よく行えるので
好ましい。また抽出に用いる水性媒体としては、冷水や
熱水を含む水、メタノ−ル、エタノ−ル、イソプロパノ
−ル、ブタノ−ル、イソブタノ−ル等のアルコ−ル類、
これらアルコ−ル類と水との混合溶媒、アセトン、メチ
ルイソブチルケトンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸
ブチルなどのエステル類、ジメチルスルホキシド、ヂメ
チルアセトアミド、ジメチルホルムアルデヒドなどの極
性溶媒などが挙げられる。なお、これらの水性媒体は、
適量の酸性またはアルカリ性水溶液を添加して酸性また
はアルカアリ性として用いてもよい。抽出後は、抽出液
を固形不養分から分離後減圧下において濃縮しまたは濃
縮乾固して抽出物とすることができる。

【００１３】なお、コラゲナ−ゼ阻害活性は、以下に述
べる方法で測定した。即ち、５ｍＭのＣａＣｌ₂ を含む
ｐＨ７．４の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを１４４．５
ｕｌを測りとり、これにＩＶ型コラゲナ−ゼ（ほぼ４５
０ ｕｇ／ｍｌ）０．５ｕｌと１５ｍＭ ｐ−アミノフ
ェニル水銀酢酸エステル５ｕｌを加えて混合し、３０℃
にて１時間保持して酵素を活性化する；次にヒメオオギ
ズイセンの球根の抽出物１０ｕｌを加え、引き続き３Ｈ
で標識したヒト胎盤由来のＩＶ型コラ−ゲン（５ｕｇ／
１０ｕｌ）１０ｕｌを加えて混合し、３７℃において１
時間保持する；氷水浴で冷却した後、０．１％ ＢＳＡ
１０ｕｌと１０％ＴＣＡ／０．５％タンニン酸溶液５０
ｕｌとを加えて混合し、再び氷水浴で３０分間冷却す
る；３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液１
５０ｕｌを分離して、シンチレ−タ−Ａを用いたシンチ
レ−ションカウンタ−でカウントして、残存放射線量を
測定して、この測定値からコラゲナ−ゼ阻害率を算出し
更にＩＣ₅₀を求めた。

【００１４】本発明の生理学的活性を有する抽出分画分
は、当該分野で公知である適宜の賦形剤、基剤、希釈
剤、滑剤などと混合して経口投与製剤、非経口投与製剤
や外用剤などの種々の剤形に加工することができるが、
その他クリ−ム、ロ−ション等の化粧品や石鹸、浴用剤
などのトイレタリ−製品に混入、配合することができ
る。好ましくは経口投与剤や外用剤に製剤化する。以下
に実施例を記載して、本発明を詳細に説明する。

【００１５】

【実施例】

【００１６】実施例 １ よく水洗したヒメオオギズイセンの球根２ｋｇを２０リ
ットルの水の中に投じ、適宜の間隔をおいてスパチュラ
で球根を破砕し、最終的に微粉砕させ、そのまま２４時
間放置した。その後ヌッツェで吸引濾過し、濾液をアス
ピレ−タを用いて減圧下濃縮してほぼ１３．５ｇの抽出
物（以下冷水抽出物と称する）を得た。濾取した残渣に
約３倍量のメタノ−ルを加えて約５分間振盪し、その後
２時間放置して濾過し、濾液をアスピレ−タを用いて減
圧下濃縮して、２６．０ｇの抽出物を得た（以下冷水抽
出残渣のメタノ−ル抽出物と称する）。

【００１７】またこれとは別に、よく水洗したヒメオオ
ギズイセンの球根２ｋｇを２０リットルの水の中に投
じ、適宜の間隔をおいてスパチュラで球根を破砕し、最
終的に微粉砕させ、緩徐に沸騰させて、抽出混合液の全
量がほぼ２リットルに成るまで加熱を継続した。なおそ
の間内容物をガラスバ−で攪拌混合した。抽出混合液を
そのまま室温において放冷した後、ヌッツェで吸引濾過
し、不溶固形物を濾去して抽出水溶液を約１．６リット
ルを、更にこの水溶液を減圧下濃縮して固形物質３５．
５ ｇが得られた（以下熱水抽出物と称する）。濾取し
た残渣に約３倍量のメタノ−ルを加えて約５分間振盪
し、その後２時間放置して濾過し、濾液をアスピレ−タ
を用いて減圧下濃縮して、５．５ ｇの抽出物を得た
（以下熱水抽出残渣のメタノ−ル抽出物と称する）。

【００１８】抽出溶媒としてそれぞれ８０％エタノ−
ル、塩酸酸性酢酸エチル、苛性ソ−ダ塩基性酢酸エチ
ル、塩酸酸性イソブタノ−ルおよび苛性ソ−ダ塩基性イ
ソブタノ−ルを用いて、上記したと同じ方法によって抽
出操作を行い、五種類の抽出物を得た（以下それぞれ８
０％ＥｔＯＨ抽出物、酸性ＥｔＯＡｃ抽出物、塩基性Ｅ
ｔＯＡｃ抽出物、酸性ｉ−ＢｕＯＨ抽出物および塩基性
ｉ−ＢｕＯＨ抽出物と称する）。なおこの際、残渣は何
れも廃棄した。

【００１９】試験実施例 （コラゲナ−ゼ阻害作用） ＩＶ型コラゲナ−ゼとトリチウム標識ヒト胎盤由来ＩＶ
型コラ−ゲンを用いたコラゲナ−ゼ阻害活性の測定 上記実施例において得られた九種類の抽出物、即ち冷水
抽出物、熱水抽出物、冷水抽出残渣のメタノ−ル抽出
物、熱水抽出残渣のメタノ−ル抽出物、８０％ＥｔＯＨ
抽出物、酸性ＥｔＯＡｃ抽出物、塩基性ＥｔＯＡｃ抽出
物、酸性ｉ−ＢｕＯＨ抽出物および塩基性ｉ−ＢｕＯＨ
抽出物について、ＩＶ型コラゲナ−ゼ阻害活性を以下の
方法で測定したが、この際それぞれの抽出物は、精製水
を用いて４、３５２倍、１、０８８倍、２７２倍および
６８倍に希釈して被検定液とした。

【００２０】５ｍＭのＣａＣｌ₂ を含むｐＨ７．４の５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを１４４．５ｕｌを測りと
り、これにＩＶ型コラゲナ−ゼ（ほぼ４５０ｕｇ／ｍ
ｌ）０．５ｕｌと１５ｍＭ ｐ−アミノフェニル水銀酢
酸エステル５ｕｌを加えて混合し、３０℃にて１時間保
持して酵素を活性化する；次にヒメオオギズイセンの球
根の抽出物の被検定液１０ｕｌを加え、引き続き³ Ｈで
標識したヒト胎盤由来のＩＶ型コラ−ゲン（５ｕｇ／１
０ｕｌ）１０ｕｌを加えて混合し、３７℃において１時
間保持する；氷水浴で冷却した後、０．１％ ＢＳＡ１
０ｕｌと１０％ＴＣＡ／０．５％タンニン酸溶液５０ｕ
ｌとを加えて混合し、再び氷水浴で３０分間冷却する；
３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液１５０
ｕｌを分離して、シンチレ−タ−Ａを用いたシンチレ−
ションカウンタ−でカウントして、残存放射線量を測定
して、この測定値からコラゲナ−ゼ阻害率を算出し、得
られた阻害率からＩＣ₅₀（希釈倍率として）を求めた。
これらの結果を下記表１にまとめて示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】表１から明らかなように、本発明に係るヒ
メオオギズイセンの水性抽出物は、上記９種類の何れ
も、コラゲナ−ゼ阻害活性を示したが、特に熱水抽出残
渣のメタノ−ル抽出物と８０％ＥｔＯＨ抽出物は特にＩ
Ｖ型コラゲナ−ゼ阻害活性が顕著に高く、次いで冷水抽
出物、熱水抽出物酸性ＥｔＯＡｃ抽出物が高いＩＶ型コ
ラゲナ−ゼ阻害活性を有し、また塩基性ＥｔＯＡｃ抽出
物やシオブタノ−ル抽出物とも充分実用に供し得る良好
なコラゲナ−ゼ阻害活性を有することが明らかである。

【発明の効果】本発明によれば、ヒメオオギズイセンの
根茎から水性媒体抽出物として、種々の用途に供される
高活性のコラゲナ−ゼ阻害物質が複数種類提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｋ 7/48 7/50 7/50

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒメオオギズイセン（学名：Ｃｒｏｃｏｓ
   ｍｉａ Ｘ ｃｒｏｃｏａｍａｅｆｌｏｒａ Ｎ．Ｂ．
   Ｂｒ．またはＴｒｉｔｏｎｉａ Ｃｒｏｃｏｓｍｓｅｆ
   ｌｏｒａ Ｌｅｍｏｌｎｅ）から抽出して得られる活性
   成分を含有してなるコラゲナ−ゼ阻害剤