JPH1075777A - 新規システインプロテアーゼ - Google Patents
新規システインプロテアーゼInfo
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Abstract
が求められる食品や医薬品等の分野に有用な生理活性に
優れた低分子のペプチドを得ることができる、新規な塩
基性タン白質分解酵素及びその製法を提供する。 【解決手段】 本発明は、鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の
魚類の白子を水で抽出して得られるエンド型システイン
プロテアーゼに関する。
Description
例えば、プロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基
質特異性を有し、アルギニンに富んだ低分子のペプチド
を容易に製造することができ、例えば、生理活性ペプチ
ドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他
のプロテアーゼ利用分野において有用なシステインプロ
テアーゼ及びその製法に関し、更に詳しくは、白子由来
の新規なシステインプロテアーゼ及びその製法に関す
る。
は、例えば、プロタミン等の塩基性タン白質を分解する
ことは困難であり、塩基性タン白質の分解方法としては
塩酸を添加して加水分解することが行われている。しか
し、この塩酸分解では、最終生産物に塩素化合物が混入
する危険性があるうえ、アミノ酸単位にまで分解されて
しまうため、分解産物は生理活性を失うという欠点があ
る。
テアーゼとしては、例えば、細菌から単離されたサーモ
リシン(thermolysin)(EC 3.4.24.27)[Adv.Enzymol.4
1,179(1974)]、カビからのペニシロリシン(penicilloly
sin)[Agric.Biol.Chem.55,2191(1991)]が知られている
が、これらの酵素はいずれも金属酵素であり、本発明の
酵素とは本質的に異なる。また、魚の筋肉中より単離さ
れたカテプシンB,L,H[Comp.Biochem.Physiol.96B,No.2,
247(1990)及びComp.Biochem.Physiol.96B,No.4,733(199
0)]が知られているが、、本発明の酵素とは基質特異性
が異なり、収量が少なく、工業的な実用性は乏しい。
術では、塩基性タン白質を効率よく分解して、飲食品、
医薬品等に有用な生理活性に優れた低分子のペプチドを
得ることは困難であった。そこで、安全性の要求される
食品工業及び医薬品分野で利用できる生理活性ペプチド
を安全かつ効率よく得ることができる、新規な塩基性タ
ン白質分解酵素の開発が望まれている。
れる天然素材からの塩基性タン白質をよく分解する酵素
のスクリーニングを鋭意繰り返し研究を重ねた結果、
鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子に強い分解活性
があることを見出し、それから塩基性タン白質に作用す
る酵素を単離、精製し、その酵素的性質を解明して、本
発明を完成した。本発明により得られる酵素は、新規な
エンド型システインプロテアーゼであり、塩基性タン白
質であるプロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基
質特性を有する。
ロタミン等の塩基性タン白質からアルギニンに富んだ生
理活性ペプチドを容易に得ることができるほか、該酵素
は、アンギオテンシンIのC末端のHis-Leu間を切断し、
アンギオテンシンIIに変換するアンギオテンシン変換酵
素の作用も持つため、医薬品への応用が期待される。し
かも、原料である魚類の白子は、食用とされているもの
で安全であり、また、安価に入手できるため製造コスト
も低く、食品工業への応用に最適である。 以下、本発
明の酵素の製法、理化学的性質等について更に詳しく説
明する。
ンプロテアーゼは魚類の白子から採取することができ、
採取することのできる魚類の白子としては、例えば、
鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子を挙げることが
できるが,殊に,白子の重量が大きく、また、水揚げ量
の多い鮭の白子が好適である。これら魚類の白子は,生
鮮品,冷凍品及び塩蔵品のいずれも利用することができ
る。
プロテアーゼを分離採取する方法としては,例えば,鮭
の白子を磨砕処理した後,磨砕物1重量部に対して通常
約1〜約10重量部、好ましくは約3〜約8重量部の水
もしくはpH約5〜7の緩衝液を加えて撹拌抽出し,好
ましくは抽出液を再度pH約5〜6に調整した後、得ら
れる抽出水層部を遠心分離し、脂肪を分離除去し,更に
この水層部をケイソウ土,セルロースなどの濾過助剤を
用いて濾過し,清澄な粗酵素液を得る方法を例示するこ
とができる。
縮,減圧濃縮,限外濾過などの適宜な濃縮手段を用い
て、該酵素の活性低下をきたさない温度,例えば,約4
0℃以下の温度で濃縮することにより粗酵素濃縮物とす
ることができる。
澄み液をサンプル前処理用の陰イオン交換樹脂、例えば
SEP−PAK QMA(ミリポア社製)、Q Sep
harose(ファルマシアバイテク社製)など、ある
いはアフィニテイカラム、例えば、Arginine
Sepharose 4B(ファルマシアバイテク社
製)などで溶出し、この溶出液について、例えば、Su
perose 12HR(ファルマシアバイテク社
製)、Shodex PROTEIN KW−803
(昭和電工社製)などのゲル濾過カラムを用いて活性画
分を分取し、単一成分として分離精製することができ
る。
プロテアーゼは、ペプチド及びタンパク質の一次構造に
おけるLys−Arg及びArg−Arg配列を認識し
て、該配列のC末端側を切断する基質特異性を有するエ
ンド型システインプロテアーゼであり、これまで知られ
ていた塩基性タン白質に作用するプロテアーゼとは全く
異なる新規な酵素である。
酵素学的性質について説明する。
至6.5の弱酸性下でペプチド及びタンパク質中の一次
構造におけるLys−Arg及びArg−Arg配列を
認識して、該配列のC末端側を切断する。
記表1に示す。
ド基、Bzはベンゾイル基、Zはベンジルオキシカルボ
ニル基、Sucはサクシニル基、Bocはt−ブチルオ
キシカルボニル基、そしてE(OBzl)はγ−ベンジ
ル−L−グルタミン酸残基をそれぞれ表わす。
−アルギニル−4−メチルクマリル−7−アミド(以
下、Z−Arg−Arg−MCAと表記することがあ
る)に対する活性を100%とした場合の相対活性
(%)。pH6.0及び30℃にて測定。
プトエタノール(5mM)と、金属酵素の影響を除去する
ために、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(1mM)を
添加した。
素は、カテプシンB、Lがよく分解するArg-MCAやBz-Ar
g-MCAをほとんど分解しないが、Lys-Arg及びArg-Arg配
列をよく認識して、該配列のC末端側を切断する基質特
異性を有する。
びArg-Arg配列を認識し切断する特異性は、生体内のプ
ロセシングに関与する酵素として認められているが、今
まで見出されてきた酵素はすべて活性中心がセリンのプ
ロテアーゼ群である。この点からも本発明の酵素がプロ
セシングの作用をもつ全く新規なシステインプロテアー
ゼであると言える。
pHと酵素活性との関係を図1に示す。図1から明らか
なように、本発明の酵素の至適pHは6である。また、
各種pHのリン酸緩衝液(30℃)中での本発明の酵素
の残存活性をプロットした図2から明らかなように、本
発明の酵素の安定pH範囲はpH約3〜pH約6.5の
範囲である。
した結果を図3及び図4に示す。反応はZ-Arg-Arg-MCA
を基質とし、pH6.0のリン酸緩衝液(5mM 2-メルカフ゜ト
エタノール+1mM EDTA)中にて行った。至適温度は10〜60
℃における5分間の活性を測定することにより、また、
熱安定性は上記の緩衝液にて希釈した酵素液をそれぞれ
の温度で10分又は30分間インキュベートした後、3
0℃にて活性を測定することにより決定した。
は30℃〜40℃であり、また、至適温度は40℃であ
って、30℃以下の温度において安定であった。
℃、30分間の加熱で完全に失活する。
各種活性化剤及び阻害剤とともに30℃で30分間前イ
ンキュベートしたものを用いて、合成基質Z-Arg-Arg-MC
Aに作用させたときの残存活性の変化を調べた。その結
果を下記表2に示す。
しないときの酵素活性であり、表中の活性はこのコント
ロールを100としたときの相対活性で示す。**各略記
号の意味は次のとおりである。
シラン−2−カルボニル)−L−ロイシル]−アグマチ
ン PCMB:パラクロロマーキュリー安息香酸 PMSF:フェニルメタンスルフォニルフルオライド TLCK:Nα−トシル−L−リジル−クロロメチルケ
トン APMSF:4−(アミジノフェニル)メタンスルフォ
ニルフルオライド TPCK:N−トシルフェニルアラニルクロロメタン ZPCK:ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル
クロロメタン この結果より、本発明の酵素は、DTT、2−メルカプ
トエタノール及びシスティン塩酸塩により活性は著しく
増加することがわかる。このことから、本発明の酵素の
活性中心には−SH基が関与していることが考えられ
る。また、E−64、モノヨード酢酸、TLCK、ロイ
ペプチンにより完全に阻害されることから、本発明の酵
素の活性中心はシステイン残基であると判断される。
−7−アミド(peptidyl-MCA)の加水分解により生成す
る蛍光性の7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)
の量を蛍光光度計にて定量することによって行った。す
なわち、酵素液20μlと、1mMのジチオスレイトー
ル(DTT)及び1mMのエチレンジアミン四酢酸(E
DTA)を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)を
混合し、30℃,20分間予熱の後,これにジメチルス
ルホオキシド(DMSO)に溶解した10mMのZ-Arg-
Arg-MCAもしくはZ-Phe-Arg-MCAを5μl加え、すばやく
混合し一定時間の蛍光の増加を測定する。
製)により、360nmの励起光を用いて、440nm
で測定する。この際、反応液の液温が30℃になるよう
にセル槽の温度をコントロールする。
の7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)を生成す
ることのできる酵素量を1酵素単位:1カタール(1k
at)として算定し,酵素活性(kat/ml)として表わ
す。また、基質濃度と酵素の反応速度との関係よりK
m:Michaelis定数及びVmax:最大速度を
求める。さらに、最大速度とタン白濃度よりκcat:
モル速度を求める。本発明の酵素のKm値、κcat、
及びκcat/Kmを下記表3に示す。
または緩衝液を用いて抽出された粗酵素液を限外濾過等
により濃縮し、この濃縮液を前記したような陰イオン交
換樹脂やゲル濾過カラムを用いて活性画分を単一成分に
分離精製する。
(pH5.0)を添加混合したのち遠心分離(15000rpm/5mi
n.)し、その上澄液をサンプル前処理用デイスポーザブ
ルカラムSEP−PAK QMA(ミリポア社製)を用
いて20mM酢酸緩衝液と500mM塩化ナトリウム液
の混液で溶出する。次にこの溶出液をSuperose
12HR10/30(ファルマシアバイテク社製)を用
いてゲル濾過し、活性画分を分離した後、その活性画分
をArginine Sepharose4B(ファル
マシアバイテク社製)を用いてアフィニティークロマト
グラフィーし、活性画分を分解する。更に、その活性画
分をShodex PROTEIN KW−803(昭
和電工社製)を用いて単一成分に精製する。
ロテアーゼ活性を示す画分をNative−PAGEに
て電気泳動した結果を図5に示す。図5からも明らかな
如く、本酵素画分は未変性の状態では均一のタン白質で
あることが確認される。精製方法の具体例は後記実施例
1〜6に示すとおりである。
PROTEIN KW−803によるゲル濾過での保
持時間より推定を行ったところ、約67,000であっ
た。また、本発明の酵素にドデシル硫酸ナトリウム塩
(SDS)とβ−メルカプトエタノールを加え、熱湯に
て約3分間加熱し、酵素タンパクを変性させた後、その
相対分子量を不連続のドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドスラブゲル電気泳動法(SDS−PAG
E)(Nature 227,680,1970)により求めたところ、図6
に示した如く約22,300であった。以上の結果よ
り、本発明の酵素は、天然では分子量22,300のサ
ブユニットが3個結合して構成されていることがわか
る。
の酵素の等電点は図7で明らかな如く、3.9であっ
た。
が6、安定pH範囲がpH3〜6.5であり、カテプシ
ンBにやや近い性質も示すが、Bz-Arg-MCAを分解しない
点や、Z-Phe-Arg-MCAよりもZ-Arg-Arg-MCAをはるかによ
く分解する点などカテプシンBとは明確に異なる特異性
を有する。さらに、カテプシンBの分子量(ゲル濾過に
よる)は25,000(ヒト由来)あるいは29,00
0(サケ筋肉由来)であり、本発明の酵素の67,00
0よりかなり小さく、また、等電点は、カテプシンBは
4.5〜5.5(ヒト及びサケ筋肉由来)であり、本発
明の酵素の等電点3.9とは異なる。
知のプロテアーゼとは別異の新規なシステインプロテア
ーゼであると考えられる。
いて更に具体的に説明する。
0gを添加し、ミキサー等でホモジナイズした。この液
を遠心分離(5000G×20分間)し、上層の水溶液
900gを得た。更に、この水溶液をケイソウ土濾過
し、抽出液880gを得た。この抽出液のpH6.0に
おけるZ−Arg−Arg−MCAを基質とする酵素活
性を測定した結果、78nkat/mlであった(以
下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ
1」と称する)。
の880gに硫酸アンモニウム155gを徐々に加え、
かき混ぜて溶解させた後4℃で15時間静置した。次い
で、遠心分離により不溶物を除き分離液890gを得
た。この分離液に硫酸アンモニウム343gを加えて溶
解し、4℃で15時間静置後遠心分離を行い、析出沈殿
物3gを得た。この沈殿物をpH6.0のリン酸緩衝液
12mlに溶解し、得られた溶液を透析チューブ(Un
ion Carbide corp.社製)を用いて同
じ緩衝液で透析処理して脱塩を行った。その結果、酵素
液18.3gを得た。この酵素液のpH6.0における
Z−Arg−Arg−MCAを基質とする酵素活性を測
定した結果、1200nkat/mlであった(以下、
この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ2」と
称する)。
の0.5gをpH6.0の酢酸緩衝液にて平衡化したセ
ップパックバックAccell QMA 2g(日本ウ
オーターズ・リミテッド社製)に供し、同緩衝液で塩化
ナトリウム濃度が0〜0.6Mまでのグラジエントを行
い、本発明の酵素活性をもつ画分5mlを得た。さらに
同操作を10回繰り返し50mlの同画分を得た。この
分画物の活性は85nkat/ml;31nkat/m
gであった(以下、この抽出液を「サケ白子システイン
プロテアーゼ3」と称する)。
の50mlを限外濾過膜(ウルトラフリー15:日本ミ
リポア社製)にて10倍に濃縮したものを0.5mlづ
つ、pH6.0の酢酸緩衝液(含50mM塩化ナトリウ
ム)にて平衡化した直径1.0cm×30cmのSup
erose 12(ファルマシアバイテク社製)に供
し、同緩衝液にて溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ
画分7mlを得た。この分画物の活性は50nkat/
ml;191nkat/mgであった(以下、この抽出
液を「サケ白子システインプロテアーゼ4」と称す
る)。 実施例5 実施例4で得られたサケ白子システインプロテアーゼ4
を限外濾過膜(ウルトラフリーCLプラス:日本ミリポ
ア社製)にて5倍に濃縮したものを、pH5.0の酢酸
緩衝液にて平衡化した直径1.0cm×10cmのAr
ginineSuperose 4B(ファルマシアバ
イテク社製)に供し、同緩衝液で塩化ナトリウム濃度0
〜0.6Mまでグラジエントを行い、本酵素活性をもつ
画分5mlを得た。この分画物の活性は、47nkat
/ml;555nkat/mgであった(以下、この抽
出液を「サケ白子システインプロテアーゼ5」と称す
る)。
の5mlを限外濾過膜(ウルトラフリーCLプラス:日
本ミリポア社製)にて10倍に濃縮したものを、pH
6.0の酢酸緩衝液(含50mM塩化ナトリウム)にて
平衡化した直径0.8cm×30cmのShodex
PROTEIN KW−803(昭和電工社製)に供
し、同緩衝液にて溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ
画分3mlを得た。この分画物の活性は、23nkat
/ml;1151nkat/mgであった(以下、この
抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ6」と称す
る)。このサケ白子システインプロテアーゼ6の酵素的
性質は前記のとおりである。
分解しにくかった塩基性タン白質をよく分解し、安全性
の要求される食品や医薬品分野等で有用な生理活性ペプ
チドの製造等に応用可能なエンド型システインプロテア
ーゼを、安価に入手できる鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の
魚類の白子から得ることができる。また、本発明の酵素
はアンギオテンシン変換酵素の作用も持つため、今後の
医薬品への応用が考えられる重要な酵素である。
グラフである。
グラフである。
グラフである。
グラフである。
電気泳動(Native-PAGE)図である。
ラブゲル電気泳動(SDS−PAGE)図である。
の測定結果である。
Claims (2)
- 【請求項1】 ペプチド及びタンパク質の一次構造にお
けるLys−Arg及びArg−Arg配列を認識し
て、該配列のC末端側を切断する基質特異性を有し、分
子量が約67,000(ゲル濾過法による)であり、等
電点が3.9であることを特徴とするエンド型システイ
ンプロテアーゼ。 - 【請求項2】 次の理化学的性質 (1)酵素作用 弱酸性下で塩基性タンパク質もしくはペプチドをよく加
水分解する (2)基質特異性 ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるLys−A
rg及びArg−Arg配列を認識して、該配列のC末
端側を切断する基質特異性を有する (3)至適pH:pH6.0(基質としてZ−Arg−
Arg−MCAを用いて測定、ここでZはベンジルオキ
シカルボニル基であり、MCAは4−メチルクマリル−
4−アミド基である) (4)安定pH範囲:pH3〜6.5のpH域で安定で
ある(基質としてZ−Arg−Arg−MCAを用いて
測定)。 (5)作用適温の範囲:30〜40℃ (6)pH8以上において30分または70℃、30分
で完全に失活する。 (7)阻害、活性化及び安定化 ジチオトレイトール、2−メルカプトエタノール、シス
テイン塩酸塩により活性化され、N−[N−(L−3−
トランス−カルボキシラン−2−カルボニル)−L−ロ
イシル]−アグマチン、モノヨード酢酸、Nα−トシル
−L−リジル−クロロメチルケトン、ロイペプチンによ
り完全に阻害される (8)分子量:約67,000(ゲル濾過法による)、
約22,300(SDS−PAGEによる) 天然では分子量22,300のサブユニットが3個結合
し、構成されている (9)等電点:3.9(等電点電気泳動による)を有す
る請求項1記載のエンド型システインプロテアーゼ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25528196A JP3751086B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 新規システインプロテアーゼ |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25528196A JP3751086B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 新規システインプロテアーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1075777A true JPH1075777A (ja) | 1998-03-24 |
JP3751086B2 JP3751086B2 (ja) | 2006-03-01 |
Family
ID=17276582
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---|---|---|---|
JP25528196A Expired - Fee Related JP3751086B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 新規システインプロテアーゼ |
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JP (1) | JP3751086B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000055196A1 (en) * | 1999-03-17 | 2000-09-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
-
1996
- 1996-09-06 JP JP25528196A patent/JP3751086B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000055196A1 (en) * | 1999-03-17 | 2000-09-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
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