JPH10513043A - 自動化ｄｎａ塩基配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 自動的にＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、配列中の次の塩基を、その位置における物理的測定値の関数としてのみならず、同一配列内のすぐ近くに事前に決定された塩基の関数として繰り返して決定することから構成される。一般に、コンピュータ・アルゴリズムが用いられる。このアルゴリズムは、前の、および（または）次の位置にある塩基に関する知見をもとに特定位置での期待される測定の値を予測する。予測された測定値を実際の測定値と比較し、さらにその位置で選択された塩基は配列全体で測定される累積誤差を最小にする塩基である。好ましいアルゴリズムでは、並行または連続して、好ましくは複製効果の物理的モデリングと蛍光発光効果の物理的モデリングとを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 自動化ＤＮＡ塩基配列決定法 本発明は、自動化ＤＮＡ塩基配列決定法に関する。 現在、もっとも一般的に利用されているＤＮＡ塩基配列決定の方法はサンガー らによるもので、それが最初に論じられた論文は、Sanger，F.，Nicklen，S and Coulson，A.R．(1977): DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors ．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74; 5463-5467である。サンガーの方法の多様性 は、迅速かつ合理的に未知のＤＮＡ配列を正確に決定することを可能とさせるこ とによって、ゲノム分析に一大革命をもたらした。 サンガーの方法では、配列を決定すべき未知のＤＮＡを溶液に浸して加熱する ことにより、該ＤＮＡを変性またはそれを分割して別々の鎖にする。溶液には、 “プライマ”として知られる人工的に作られた短いＤＮＡ配列を加える。このプ ライマは既知のテンプレートの一小部分に相当する。テンプレート及びプライマ からなる溶液を冷やすと、プライマはテンプレート上の相補的配列に結合する。 また、溶液に適当なポリメラーゼ分子を添加すると、所望の伸長反応として構成 単位が分子に沿って形成される。伸長反応の進行に伴って、結合したプライマが テンプレートの長手方向に沿って伸長していき、テンプレートの配列に相補的な 伸長配列が塩基ごとに徐々に形成される。 反応に使用される構成単位分子には４種類あり、それぞれが塩基Ａ，Ｃ，Ｇ， およびＴのいずれか一つに対応する。特に、構成単位はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ ＧＴＰ、およびｄＴＴＰとして知られるデオキシヌクレオチドであり、これらの ものはいずれもｄＮＴＰと呼ばれる。それ自体にまかせたかたちで、複製反応は 必要とされるｄＮＴＰが使い果たされるまで、あるいは反応停止のための何らか の事態が生ずるまで続く。サンガーの方法では、構成単位の或部分がジデオキシ ヌクレオチド、すなわちｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴ Ｐ（総称的にｄｄＮＴＰ）によって置換される。連続する反応がデオキシヌクレ オチドよりはむしろジデオキシヌクレオチドを利用して起こるとする と、分子は通常通り結合するけれども鎖に沿ってさらに進むべき反応は停止する 。ジデオキシヌクレオチドに対してデオキシヌクレオチドの濃度が相対的に低い ため、与えられた任意の鎖上で反応が停止するのは偶然の確率である。 すべての複製が同一で（プライマによって）開始され、かつ停止位置がまった く確率的なものであることから、その反応によって反応停止の可能性ある位置の 各々に対して多量のクローン化ＤＮＡフラグメントが生成される。 テンプレート、プライマ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびｄｄＮＴＰを反応 試薬の入った単独の容器に加えることで、配列中の各塩基位置を表す一組のフラ グメントが生ずる。もちろん、単一の反応溶液を用いることによってすべてのフ ラグメントの混合物が生成されることになる。それぞれの容器がたった一つの終 了ｄｄＮＴＰを含むこと以外は同一である４つの反応容器を別々に使用すること で、それぞれのボリュームにおいてたった一つの塩基でフラグメントが終了する 。各反応の生成物をポリアクリルアミド・ゲルの別々のレーンに添加（ロード） して電気泳動にかける。それによってフラグメントがゲル上を移動する。短めの フラグメントはより速く移動するので、ゲルに沿って配置されたフラグメントの 配列が生じ、ゲルの読み取りを行うと配列内においてフラグメントの各連続した 群が次の塩基で終了する。フラグメントを視覚化するためには、適当な標識を付 けなければならない。ひとつの方法は放射性標識をｄＮＴＰの一つに付けること であり、これによってゲル上の各フラグメントに放射性標識による印が付く。感 光フィルムをゲル上に置くと、該フィルム上に放射性崩壊産物によって残された 印が暗いバンドとしてネガテイブに現像されて読み取られ、配列が得られる。あ るいは、蛍光色素をプライマまたはジデオキシヌクレオチドに付けてもよい。 サンガーの手法にもとづいたすべての方法において、測定結果は各々がゲル上 にある塩基の一つから読み取られる強度をグラフ化した４つの異なるグラフとし て表される。 現在使用されているもっとも一般的な自動化ＤＮＡ塩基配列決定装置は、ＡＢ Ｉによって製造されたものであり、サンガーの方法に部分的な変更を加えた方法 を用いる。４つの異なる反応量を扱う必要性を避けるために、ジデオキシヌ クレオチドの各々を４種類の蛍光色素のいずれか一つによって標識し、各色素が ４つの塩基のいずれか一つを表すようにする。反応が完了した後、フラグメント をゲル上の一つのレーンに添加し、電気泳動によってソーティングする。つぎに 、このゲルをレーザによって４回走査する。この際、各走査は、適当な狭帯域透 過型フィルタを介して行う。これによって４種類の異なるトレースが生ずる。任 意のトレースに対して、相対的位置に存在するピークがあることは、その位置に 塩基が存在するか、あるいはノイズであることを示す。 色が付いた４本の異なるトレースを調べ、かつ適当なピーク検出用ソフトウエ アを用いることで、原則的に少なくとも当初のテンプレートにある塩基の全配列 を決定することができる。 今まで述べてきた方法が実際に極めて成功している一方で、改善すべき課題が 残されていると信じられている。例えば、自動塩基配列決定装置（自動シークエ ンサー）を用いることでＤＮＡの配列決定がかなり成功する。しかし、患者の遺 伝的疾患を検知することが可能となるようにゲノムＤＮＡにおけるヘテロ接合突 然変異を検出するという非常に厳しい用途においては、現在利用が始まったばか りである。探し求められている突然変異は患者が持つ研究中の遺伝子の２つの複 製のうちのたった一つにある。したがって、検出すべきものは、ゲル上の対応す る位置にある配列のなかの一つの点であり、同等の大きさの２つのピークの存在 はそのＤＮＡにある位置で、正常遺伝子由来の複製物と突然変異遺伝子由来の複 製とからなる２つのコピーがあることを示す。色素標識ターミネーターを用いた 塩基配列決定法（色素標識ジデオキシヌクレオチドを使用）に一般に認められる ピーク間の変動の度合いは、このような求められている用途においてその方法の 限界となる。色素標識プライマを用いた塩基配列決定法（蛍光色素はプライマに 結合）のほうが有用ではあるが、４種類の異なる反応量を取り扱わなければなら ないことから、よりいっそう困難なものとなる。いずれにしても、ピーク間の変 動は相当なものなので結果の解釈が異なったものとなる。 従来の方法では、このようなピーク間の変動を減少させるために、反応の化学 を“改善”する試みがなされている。そのような方法で成功するのは希である。 しかし、ピーク間の変動はけしてランダムに起こるものではないことが知られて いる。数人の患者由来の同一ＤＮＡフラグメントの配列を決定する際、各場合に おいて変動は同一のパターンとなる。最近、Lipshutzらは塩基配列決定法の精度 が改善される実験的方法論を提案している(Genomics 19，417-424，1994)。 Lipshutzは、大量のレコードを有するデータベースをセットアップすることを 提案している。各レコードはＤＮＡ鎖中の特定の塩基配列から構成され、かつ該 特定の塩基配列によって生ずる予想ピークの高さについての情報を伴う。このデ ータベースは、実際には従来の自動塩基配列決定法を用いて大量のＤＮＡのシー クエンシングを行い、さらに任意のシークエンシング・エラーを訂正するために 人間のオペレータによるチェックを受けることにより、実験的に設定される。決 定された配列は可能性のあるすべての５テュープルに分けられ、各５テュープル およびその対応する測定ピークの高さはデータベース内の一つのレコードを表す 。データベースの情報をつぎに分析してどのようにして５テュープルの任意の与 えられた位置でのピークの高さが他の４つの位置でのピークの高さの関数として 変化したかを決定する。この情報をもとに、４つの分類ツリーを構築し、それぞ れが位置５におけるピークの最大の高さがＴ，Ａ，Ｃ，およびＧに対応する。各 分類ツリーは真または偽のいずれか一方である一連のバイナリ・テストからなる もので、それらのテストのほとんどがトレースの高さおよび（または）トレース の高さの比に依存している。従来のシークエンサ・ソフトウエアによって決定さ れた任意の塩基の正当性をチェックするために、第５番目の位置にあるトレース の高さにもとづいて適当なツリーが選択され、該ツリーはトラバースされる。そ の位置での特定の塩基の最初の決定の精度の信頼性測定である。 Lipshutzの方法は配列内の塩基を決定する精度を高めると言われているが、た いへん重要な問題がいまだ残されている。第１に、精度の改善は特に優れたもの ではない。また、本出願人は、ゲノムＤＮＡ中のヘテロ接合突然変異の日常的な 検出に適用する方法を可能とするほどには、十分精度の改善があるとははっきり 言って信じていない。第２に、上記方法は大きなデータベースに完全に依存して おり、例えば研究者が使用されている化学的性質に僅かながら変更を加えたいと 思ったり、あるいは適当な５テュープル実験データが入手できない場合に配列を 調べたいとした場合に、全体的に作り替える必要がある。第３に、分類ツリーの 計算およびデータベースを設定することは、大量の実験的な仕事と大量のコンピ ュータによる作業とを必要とする。６テュープルからなるより一層大きなデータ ベースであっても生成する上記方法の精度の改善を試みる確かな方法は、実験的 にも計算的にも実現不可能であり、特にそのようなデータベースは任意の化学的 性質に対してのみさらにいっそう有用である。最後に、上記方法は計算的に不十 分である。なぜなら、各位置に対する可能性のすべては、それらの可能性のいく つかが、すでに得られた情報からすでに思いもよらないものであると知られてい るか、あるいは不可能であるかどうかに係わらず、検討するからである。 ピーク間の変動（注目すべきことに、どれもLipshutzの提案に反映されない） の理由を以下簡単に説明する。ピーク間変動はランダムに起こるものではなく、 また実際に化学的性質を利用したにもかかわらず一貫性が残っているように見え る事実は、Larderらの文献(Quantitative detection of HIV-1 drug resistance mutations by automated DNA sequencing: Nature October 14 1993，pages 67 1 - 673)に記載されている。ピーク間変動に関与すると考えら得る２つのプライ マ・メカニズムは複製効果および蛍光発光効果である。 蛍光発光効果は、色素の測定された蛍光は該色素が結合したＤＮＡ分子内の点 に隣接した塩基の配列に依存していることから生ずる。色素がＤＮＡに結合する と、この色素は特に溶媒のダンピング効果から部分的にパーティショニングされ 、ＤＮＡ分子それ自体と相互作用する。このパーティショニングの度合いおよび 相互作用の正確な性質は、ＤＮＡの性質、すなわち局所的な塩基配列に依存する 。したがって、色素分子の蛍光は徐々にターミネータに至る塩基配列によって一 般に決定される。 複製効果は統計的効果である。簡単に言うと、複製停止プロセスのランダム性 が意味することは、任意の特定位置で配列が停止する確率はその位置が配列のど れぐらい下流にあるかに依存するということである。例えば、長い配列とそれよ りも短い配列があるとするならば、プライマに近いピークは、該プライマからさ らに離れたピークよりも大である可能性が高いことを意味する。この効果は“Ｔ ７ＤＮＡポリメラーゼおよび色素標識ターミネータを用いたＤＮＡ塩基配列決定 法：色素ターミネータの取り込みおよび終了フラグメントの確率分析 に対する色素およびｄＮＴＰの効果”と題されたＬｅｅらの論文(Lee et al in Nuclic Acids Research，Vol．20，No.．10 2471-2483)によって分析的に調べら れている。 一般に、色素ターミネータの化学的性質を利用した場合、色素プライマーの化 学的性質を利用した場合よりも大きなピーク間変動が見られると予想される。な ぜなら、後者の場合、蛍光発光効果によってさらに変動が加えられるわけではな いからである。 本発明の目的は、従来の問題点を少なくとも緩和することである。 本発明の別の目的は、塩基配列決定上のエラーが少なくない自動ＤＮＡ塩基配 列決定の改善された方法を提供することである。 さらに本発明の別の目的（少なくとも本発明の限定された形態）は、ゲノムＤ ＮＡ内のヘテロ接合突然変異のＤＮＡ塩基配列を自動的に決定することが可能な 方法を提供することである。また、関連した目的（本発明のある程度制限された 形態）として、ＤＮＡフラグメントの混合物を分離することが可能な方法、例え ば異なる２個体の血液が混ざり合った血液試料から２種類のＤＮＡｗｏ分離する 方法を提供する。 本発明によれば、ＤＮＡ鎖の塩基配列を自動的に決定する方法は、 （ａ）鎖内の各位置について、該位置にある塩基を表わす測定値(measurement )を実験的に決定することと、 （ｂ）塩基が知られていると考えられる鎖の一部を含む初期配列から出発し、 成長する鎖に繰り返して塩基を増やしていき、各段階で、新規位置での測定と成 長する配列のすでに決定された塩基の少なくともいくつかに依存した成長する配 列の新規位置に加えるべき塩基を決定することとを含む。 この方法を実行するために使用される特有のアルゴリズムは、当業者によく知 られたものである。一般に、可能性のツリーは覆われている必要があり、該ツリ ーを最初に成長させたのち検索するか、あるいはより効率的に成長と検索とを同 時に行うかのいずれか一方である。並行的に、または逐次的に実行することが考 えられ、リカーシブ（反復）またはノン・リカーシブ・コードのいずれか一方 が用いられる。 好ましくは、方法には、少なくとも各段階で、新規位置で測定を予測すること 、新規位置での実際の測定とその予測された測定とを比較すること、さらにこの 比較の結果として新規塩基を決定することが含まれる。予測測定は成長する配列 のすでに決定された塩基の少なくともいくつかから計算することができる。本出 願人は、実際の測定（好ましい実施態様におけるトレースの高さ）からなる関数 としてよりは、むしろすでに決定された塩基の関数として予測することを発見し 、該配列に沿って個々のエラーが伝わる可能性をより少なくなることから、より 高い精度および安定性が得られる。その効果はあまりにも強力なので、次の位置 の値を予測することに測定値が使用されようとなかろうと、実際に何もないこと が好ましい。 新規位置の予測測定は、可能性のある塩基Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＴの各々に対し て、４つの異なる値から構成される。同様に、各位置での測定は、該位置で各可 能性のある塩基に対して、４つの異なる値から構成される。好ましい実施態様で は、測定は一つのグラフ上で４つの異なるトレースの形態をとる。それで各々の 位置に対する 4つの個々の値が、その位置でトレースの各々の高さを測定するこ とによって決定される。 アルゴリズムを促進させて、そして特有の位置で不可能な塩基候補を考慮する ことで時間が浪費されないようにするために、その位置の実際の値が予測された 最小の値よりも小さいとするならば、方法は自動的に新しい位置の候補者として のベースを拒絶するかもしれない。 例えば、予測された最小限の価値が、その位置におけるその塩基に対する予測 されたトレースの関数として計算される。例えば、最小値は予測値と等しく、あ るいはそれが固定された比率、例えば１．５であってもよい。 その方法の直接的な形態は、成長する配列は、該配列中で最後に付加された塩 基のつぎに新しい塩基が付加されることによって、塩基ごとに作られるものであ ろう。 しかし、その方法は、解読可能であるすべての可能性のある塩基に依存するも のではない。例えば、塩基の一つまたは３つが読取り不可能であるとすると、単 純にそれらの塩基をスキップして、離れた側から読み取りを続けるようにアルゴ リズムを設計することもできよう。それは可能なことである。なぜなら、離れた 側の塩基はすでに知られている塩基から、まだ予測（精度は落ちるが）すること ができるからである。 成長する配列は、初期配列から一方向へ正常に成長する。しかし、両方向に成 長するようにすることも可能である。さらに、複数の開始初期配列によって複数 の成長する配列を形成することができる。それらの配列は、同時に一方向あるい は両方に向かって、互いに連結するまで成長する。この場合のアルゴリズムは、 多数の核形成点から下流および上流方向に成長して複数の分岐点と交わるツリー から構成されるグラフ構造を含むものであってもよい。 アルゴリズムは、“予測（ルックアヘッド）”機能を持つものであってもよい 。これによって現在検討されている特定の塩基を最終的に決定する前にこれから の塩基に対する種々の異なる仮説を検討することが可能となる。その最後に、可 能性のある次の塩基についての仮説をたて、つぎの段階まで予測する任意の段階 で、その段階の次の可能性のある塩基についての仮説をたてて、次の段階の仮説 がたてられた好ましい塩基とは少なくとも部分的に独立して任意の段階の新しい 塩基を決定することが上記方法に含まれる。その代わりとして、あるいはさらに つけ加えて、任意の段階で複数の段階を予測し、複数の可能な塩基配列について の仮説をたて、さらに次の段階の仮説がたてられた好ましい塩基とは少なくとも 部分的に独立して任意の段階の新しい塩基を決定することが上記方法に含まれる 。 各段階で、選択すべき次の塩基は、配列中の事前に決定された少なくともいく つかの塩基に依存し、ことによると同様に（化学的性質に依存して）配列中のそ の後のいくつかの位置にも依存する。選択すべき塩基は、全体として配列の測定 にもっともフィットしたものである。その終わりに、各段階で誤測定値は、新し い位置における予測された測定値と実際の測定値とにもとづいて構成されてもよ く、蓄積された誤測定値は成長する配列の少なくとも一部分に対して保持され、 さらに新しい塩基は該蓄積された誤測定値を最小にする特定塩基にもとづいて決 定される。 原則として、また出現していない配列の１、２、あるいはそれ以上の仮説され た塩基とともに（ルックアヘッドが使用されている場合）“最良”の現行塩基を 見つけるためのすでに決定された塩基のすべてについての情報が使われる。もち ろん、配列の最初の部分にもどってチェックしなければならないこと、および大 量のルックアヘッド仮説を作らなければならないことは、多くの時間を計算に費 やさなければならない。実際には、ルックアヘッド・レベルは制限され、現行の 予測測定値の計算に貢献するすでに決定された塩基の数もまた制限されよう。し たがって、もっとも実用的な実施形態例では、成長する配列の一部分についての み、たぶん決定されるべき現行塩基に先だつ塩基の定数である部分についてのみ 保たれる。 選択される塩基は、今までの配列全体の蓄積された誤測定を最小限にする塩基 あり、あるいはもしルックアヘッドが使用されているならば、今までの決定配列 の蓄積された誤測定と好ましい仮説されたルックアヘッド配列とを最小限にする 塩基である。 測定に用いられる化学的性質に依存して、期待される物理的効果をシミュレー トするために、数新規位置に対する予測された測定値を学的モデルあるいはルッ ク・アップ・テーブルのいずれかを用いて計算してもよい。特に、アルゴリズム は複製効果をシミュレートするためにモデルまたはルック・アップ・テーブルを 使用してもよい。もしターミネータの化学的性質が使用されるならば、例えば色 素標識ターミネータによって、方法は蛍光発光効果をシミュレートするための数 学的モデルまたはルック・アップ・テーブルを含むものとなろう。 時々、化学的性質が正確には知られていない場合があるかもしれないが、トレ ースの勾配の程度および大きさを予測することが可能であろう。その場合、プロ ファイル・フィッティング・アルゴリズムを使用してもよく、好ましい仮説され た塩基配列が、該仮設された塩基配列の各々の位置に対応する予測された測定値 プロファイルにベスト・フィットする配列として決定されよう。 本発明の発明の重要な従属的特徴が、ＤＮＡヘテロ接合性の発見にかかわる。 使用れた方法は各段階で両対立遺伝子由来の鎖を一度に検討すること以外は日常 的なＤＮＡ塩基配列決定に使用されるものとまったく同じである。したがって、 （対立遺伝子の両方で）すでに決定された塩基を使うことによって、各対立遺伝 子上のこの位置で、見つけられる予想測定値をアルゴリズムが予測する。予測し たものを実際の測定値と比較し、さらに現在の位置で一度に両方の対立遺伝子に 対して塩基を割り当てる。通常は、任意の与えられた位置にある塩基の両方が同 じではあるが、しばしば突然変異によって異なったものとなる場合がある。 本発明はまた、別々のＤＮＡ鎖からなる混合物をシークエンスする方法に関す るもので、同時に、既に述べた実験方法を使って鎖のそれぞれを扱う。 本発明はさらに妊婦の胎児（胎仔）の特性を決定する方法に関する。この方法 は、女性（雌）から胎児（胎仔）細胞等の試料を採取し、さらに既に述べた方法 を用いて胎児（胎仔）細胞由来ＤＮＡ鎖の塩基配列を自動的に決定する。 本発明はさらに、既に述べた方法を用いて混合物試料中のＤＮＡ鎖をシークエ ンシングし、第１の試料由来ＤＮＡと第２の試料由来ＤＮＡとの相対比を決定し 、さらにＤＮＡの相対比から身体(body)試料の相対比を決定することが含まれる 混合試料中の第１の身体試料と第２の身体試料との相対比を決定する方法に関す る。 方法が特定の化学的性質に限定されるものではないと理解されるはずである。 それは、プライマが標識され、かつターミネータが標識される時に使用すること ができる。正確に標識することは実験の課題でもある。可能性として螢光標識、 放射線標識、さらに化学ルミネセンス標識することが含まれる。現在の自動塩基 配列決定装置は、ポリアクリルアミドゲル上で分画され、つづいてレーザーによ って走査されるＤＮＡフラグメントを使ってもよい。しかし、それは現在の発明 に欠くことができなくはない、そして必要とされるすべてはＤＮＡの鎖に対する いくつかの自動機構であり、この機構によってＤＮＡ鎖の測定や、個々の塩基を 表す測定法を提供するものである。望ましい方法はサンガーの方法である。 本発明から生ずる多くの具体的に有利な点があり、もっとも広い形式であるか 、もしくはいっそう限定された形式であるかのいずれか一方である。 本方法によって提供されることは以下の点である。すなわち、 １．日常的なゲノム塩基配列決定法の適用における精度の著しい改善。 ２．ヒトの突然変異をスクリーニングする速くて、かつパワフルなＤＮＡ分析技 術の開放。このことは、臨床的ＤＮＡ分析を選択するための方法になる段階で採 用されるかもしれない。 ３．組織から抽出された試料中における汚染ＤＮＡについての検出感度増大。こ のことは、一個体から採取した試料を他のものと混合する重要な法医学的用途で ある。なぜなら、上記方法は完全に分かれたＤＮＡ鎖を個々に識別し、かつシー クエンスすることができる。 ４．いっそう時間のかかる色素プライマの化学作用をもはや必要としないことに よる塩基配列決定の応用にかかる費用の減少。記載した方法を用いた配列決定の 応用例のすべては、精度が改善され、可能性があるミスを調べるための塩基配列 決定の繰り返しに対する必要性が減少した。すでに論じられたように、本発明は ヘテロ接合突然変異の検出のみならず、２種類以上の別のＤＮＡ塩基配列が混合 されている条件下でのＤＮＡ塩基配列決定を可能とする。本発明は全試料ＤＮＡ の５０％よりずっと小さい画分におけるＤＮＡ変異の検出を可能とする。これは 、下記するように、多くの特定の利点を提供する。これは、下記するように、多 くの特定の利点を提供する。 本発明は、染色体の異常性を検出することを可能とするもので、どれがトリソ ミー（ダウン症）であるかを検出することが最も重要である。 本発明を現在の侵襲的試料採取法（例えば羊水穿刺あるいはしょう膜柔毛試料 採取）によって得られた胎児細胞に対して本発明を適用することにより、ダウン 症の診断を効率よく行うことができる一方で、その代わりに診断が母体の循環流 動あるいは母体子宮頸管粘液に存在する胎児細胞の異常性の検出にもとづくもの であることが望ましい。 妊娠６週目から相当の数の胎児細胞が循環流動で存在している。ＤＮＡ全体の ５〜１０％がビーズに結合するように、胎児細胞特異的抗体で磁気ビーズを被覆 氏、該磁気ビーズを用いることで胎児細胞を母体静脈血試料から濃縮する。本発 明は原則として胎児ＤＮＡの突然変異を検出すること、そして／あるいは（染色 体の異常性のケースで）標準的な塩基配列の異なったコピー数を検出することに 対して十分敏感であると信じられている。このことは、侵襲的な外科的方法（例 えば羊水穿刺あるいはしよう膜柔毛試料採取）を伴い、かつ母親と胎児両方に対 して罹患率および死亡率は小さいが、明確な危険を伴う出産前ＤＮＡテストから なる既存の方法に本発明が取って変わることを可能にするであろう。本発明は、 そほとんど危険を伴わない単純なしゃ血の手段によって、また現在の方法よりも かなり経済的に、この好ましい形態で実行されよう。母体子宮頸管粘液から得ら れる胎児細胞（８から１０週まで）を胎児ＤＮＡの可能性のある代替供給源とし することができる。このことも、相対的に非侵襲的かつ経済的であり、さらに最 小のリスクで実施できよう。 本発明の方法は、残留疾患の定量をモニターすることが重要である状況下でも 適用可能である。例えば、慢性骨髄性白血病では循環している腫瘍細胞の量が腫 瘍特異的塩基配列および正常患者塩基配列の比較スペクトルによって定量するこ とができよう。さらに、全細胞ＤＮＡの一部としての（ビールスあるいはバクテ リアのような）病原体がロードされている量を定量するこができよう。特に重要 な用途は、予後徴候指標を提供し、かつ治療効率の定量化を可能とする療法の前 そして間のヒトヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の定量化にある。 本発明は多くのやり方で実際に実施されてもよく、またそしていくつかの具体 的実施態様を実施例のかたちで、かつ図面を参照しながら説明する。 図１は、本発明を具体化する連続的な回帰的アルゴリズムを示すフローチャー トである。 図２は、模範的ツリーを示すものであり、そしてどのようにしてこのようなツ リーが検索されるかを示す。 本発明は反復帰納アルゴリズムを利用するもので、前に決定された塩基につい ての情報を各点で利用し、塩基ごとに配列を構築していく。塩基配列の決定は常 に（人工的に作られたプライマ分子に対応している）周知の短い塩基配列によっ て開始され、それによってこの先の導入に対して安定した塩基が提供される。塩 基配列が塩基ごとに構築されるのに伴って、前に決定された、そして比較的ある 特定の塩基についての情報が塩基配列で次の可能性のある塩基について情報を提 供するために使われる。 ここで記述されるアルゴリズムのすべては原則としてすべてのＤＮＡ塩基配列 決定用途のために使われることができる。ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅さ れたゲノムＤＮＡからのヘテロ接合突然変異の検出の特定の場合では、同時に２ つの異なった対立遺伝子の両方ともをシークエンスする必要がある。それぞれの 対立遺伝子上の塩基は変異あるいは染色体の多型があるところ以外は同じである であろう。このような場合、トレース上に認識できるものは２つの別のチャンネ ルにある２つのピークである。このような効果は正確に現在のアルゴリズムによ って扱われることができない。 記述されるアルゴリズムが型通りの塩基配列決定（法）のために使われる時、 アルゴリズムはそれぞれのステージにおいて塩基配列での次の塩基がＡ，Ｃ，Ｇ ，またはＴであるかどうか決定しようと試みる。他方、ヘテロ接合突然変異の検 出の場合において、それらは一度に両方の対立遺伝子を扱い、またそれらは１番 目と２番目の対立遺伝子でのそれぞれの塩基が、例えば、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ま たはＴＴであるかどうか決定しようと試みる。それらは同じく変異があるかも知 れないかどうか、さらに例えば、１番目と２番目の対立遺伝子がそれぞれ塩基Ａ Ｃ、ＡＧ、ＡＴ、あるいはいずれかの他の組み合わせを有するかどうかを考える 。 ヘテロ接合体の症例で合併症が存在するかも知れず、突然変異の集まりに遭遇す るかもしれないと理解することができよう。もしコドン（３つの塩基のグループ ）の中にひとつの突然変異があるなら、あいまい性がない；それで例えばもしア ルゴリズムが最初の位置での２つの対立遺伝子上の塩基がＡＡであり、２番目の 位置での塩基がＧＧであり、そして３番目の位置での塩基がＡＣであると決定す るなら、ＡＧＣである１番目の対立遺伝子にあるコドンとＡＧＡである２番目の 対立遺伝子にあるコドンとを持つ３番目の位置に変異があるに違いないことを知 っている。しかし、互いに隣接して２つ以上の突然変異が存在する場合、あいま い性が生ずるかもしれない。例えば、アルゴリズムが最初の位置での塩基がＡＡ 、２番目の位置での塩基はＧＴ、そして３番目の位置での塩基はＣＡであると決 定するような、そのようなあいまい性が生ずる。ここに、２つの可能性が存在す る。すなわち、個別の対立遺伝子がＡＧＣとＡＴＡであるかも知れないこと、あ るいはそれらがＡＴＣとＡＧＡであるかも知れないこのどちらか一方であ る。 記述される方法は、配列が個別の対立遺伝子のそれぞれの上に組み立てられて いるから、完全な塩基配列のために信頼基準(confidence measure)を与えるであ ろうエラー・タームが蓄積されるので、これらのあいまい性を論ずることができ る。これは、突然変異の単体の対立遺伝子間の配分を含めて、正しい結果に決め るために他の、可能な、配列と比較することができる。 任意の適当な帰納的アルゴリズムでも使用することが可能であり、ちょうど２ つの要求がある。すなわち、アルゴリズムはそれ自身を表すすべての可能性を通 じてシステマティックに検索するいくつかの方法を持つこと、また若干の手段が 特定な位置において、若干数あるいは前にシークエンスされた塩基のすべての関 数として塩基あるいは複数の塩基の正当性について信頼基準を得るために提供さ れることができることである。 可能な配列を検索することについての１つの方法は、それぞれのノードが塩基 配列における所定の位置に存在する塩基についての（あるいはヘテロ接合体の場 合、塩基で）表現であるツリーを構築することである。ツリーの根の部分は塩基 配列における最初の塩基（あるいは複数の塩基）である。ノードの子供は塩基配 列の可能な次の構成要素である。もし特定なノードが１以上の子供を持っている なら、これは次の次の位置においての塩基が異なった可能性の組から選ばれるか も知れないという事実を表す。根の部分から葉の部分までのツリーを通しての経 路が可能な全配列を表す。アルゴリズムは推論機作を使用することによってツリ ーを通して正しい経路を決定する。それぞれのポイントにおいて、推論が次の塩 基（あるいは複数の塩基）について塩基配列で信頼基準の関数として作られる。 信頼基準は、それ自身事前に定まったノードのいくつか、あるいは全部にもと づいている。 信頼基準を決定するために、例えば蛍光発光効果とともにLee の論文に開示さ れたようなモデルを用いて、複製効果をモデル化、かつシミュレートする関数を 設定してもよい。代わりに、これらの効果のいずれかあるいは両方を、例えば事 前の実験から決定された単純な検索テーブルを介して実験的にモデル化すること ができる。これは実際比較的容易である。なぜなら考慮すべき組み合わせの数が 相対的に少ないからである。１つの特有の困難さとしては、蛍光発光効果は測定 塩基前の配列にのみ依存するけれど、テンプレート上の測定した塩基の前後にあ る塩基配列に依存する。このことは、アルゴリズムが理想的に塩基配列内の少な くとも一つの位置で予測（ルックアヘッド）する能力、さらには現在の位置にあ る正しい解釈に決める前に何の効果を持っているかを調べる能力を持たなければ ならないという点で、わずかな合併症を持ち込む。実際は、望ましいアルゴリズ ムは測定ポイントの後の塩基配列における必要とされる塩基位置に対する各々の 可能性をチェックする。測定値と密接に一致する。このような局所的な塩基配列 のスペースの検索の結果他の測定法を参照することなく単一塩基位置に対する信 頼基準を他の測定法に言及無しでひとつの塩基位置に対する信頼基準に帰すため に使われる。 しかし、一般的な場合では、塩基配列ピークよりも予想のほうがよりいっそう 近接して一致するかもしれないような読み取りを生ずるノイズを予想することが できる。任意の位置にある塩基がいずれかの側に多くの位置の読み取りに対して 効果を示すという事実は、この問題を避けるのに用いることができる。 複製および蛍光発光効果を決定する（または調べる）ために十分な数の周辺配 列が知られている配列内の任意の位置で、予測される測定値を計算し、真の読み 取りと比較することによってピークの可能性がその塩基配列における位置を表し ていると判断することができる。いずれかの所定ポイントにおける塩基配列の特 定な仮説に信頼の度合いを帰すために使うエラー関数を定義することができる。 図１は、図２に示される探索のツリーを構成するための概略的、かつ望ましい 回帰的なアルゴリズムを示す。アルゴリズムは、“ルックアヘッド”あるいは“ ブラインド・パス”機能を取り込む。それによって、塩基配列内でいまだ手を付 けていない塩基に対する実験的な可能性をを試してみることを許すことにより、 使用される複製効果のよりいっそう正確なモデルを可能にする。実際、一つの位 置のルックアヘッドは、通常はかなり満足できるものではあるが、２以上の 位置がかなり可能であるであろう。アルゴリズムはそれが生ずるごとくツリーを 構築し、必要である場合に必要ルック・アヘッドの推測を行う。 最初の部分的な塩基配列のツリーに対して、複製効果のモデリングによって必 要とされる拡張ポイントの右手の塩基の数と等しいツリーをバックアップするス テップの数の読み取りを実証することができる。もし複製効果が、添加される塩 基の両側にある２つの塩基に依存するならば、ルック・アヘッドは２となる。ツ リーのひとつの経路を考えると、我々は予想される測定値を構築する塩基配列に 沿って行く。ひとつの位置について比較は単にエラーの自乗である。比較は、ひ とつの位置のために、清算されるただ誤差である。つづいて、全体として塩基配 列のために単一の誤差あるいは信頼基準を与えるために個々の誤差が加えられる 。同じテストは他の可能な配列の上に実行され、そして選ばれた塩基配列は最も 小さい全体的な誤差を持っている。 検索をいっそう効率的にするために、真の読み取りが予測されたものよりも小 さい経路が、捜索をいっそう効率的にするために、真の読みが予言されるそれら より小さい道が、ノイズがピークを厳密により大きくすることから、拒絶される 。実施形態例では、ただ真の読み取りが予測された読み取りのある少数部（１以 下）である経路のみを省くことによって測定および他のシステマティックなエラ ーを考慮することが望まれよう。 我々はここで図１で概略的に示される望ましいアルゴリズムのいっそう詳細な 論議に方向転換する。例証されたフローチャートは、その位置での２つの対立遺 伝子塩基がなにかを決定する試みがなされる時に塩基配列内の任意の位置で実行 される一連のステップを表す（この図示の目的のために、ヘテロ接合性を仮定し ている）。 システムはステップ２において開始され、さらにステップ４で少なくとも概念 的に、適用可能である可能な塩基対のセットを構築する。この文脈で、塩基対は それぞれの対立遺伝子上の所定の位置においてシークエンスされた塩基である。 したがって、１６種類の可能な塩基対がある。すなわち、ＡＡ，ＣＡ，ＧＡ，Ｔ Ａ，ＡＣ，ＣＣ，ＧＣ，ＴＣ，ＡＧ，ＣＧ，ＧＧ，ＴＧ，ＡＴ，ＣＴ，ＧＴ，Ｔ Ｔである。これらの対の各々はユニークなものであり、左側にある塩基が所定 の対立遺伝子上に現れることから、さらに右側の塩基は他のものの上に現れる。 それで、ＧＡはＡＧと全く異なっている。我々は評価される特定の１対の塩基を “仮説である”と述べる。 ステップ４が決して明示的に実行されないと理解されるであろう。すなわち、 試みられる塩基対仮説の可能なセットを表す。 ステップ６において、アルゴリズムはまだ試みられるべき仮説があるかどうか 決定する。もしそうでなければ、アルゴリズムはすぐに終わり； もしそうであ るなら、それはまだ選択されていない仮説が選ばれるステップ８に動く。この塩 基対仮説はそれからステップ１０においてグローバルなレコードの中にコピーさ れる。再帰にある各細胞はこれまでのところ仮定された塩基配列のグローバルな レコードにアクセスする。それぞれの細胞がそれ自身の子細胞のためにその仮説 を記録することに責任がある。したがって、この実行で、細胞が子細胞を産むこ とができる前に、それはそのローカルな仮説をグローバルなレコードにコピーし なくてはならない。 ステップ１２において、アルゴリズムは複製窓が完全に覆われていたかどうか 決定する。 “複製（ウインドウ）窓”とは複製効果が取るに足りなくはないと考えられる 、現在の位置のいずれかの側にある、塩基配列のその部分である。したがって、 塩基配列の始めにおいてアルゴリズムは仮説の“ブラインド”または“ルック・ アヘッド”ツリーをまず構築し、複製窓の右の側をカバーするのに十分な深さと する。もし窓が覆われていなかったなら、アルゴリズムはステップ２６において 再帰する。このことは、仮説のツリーで次のもっと深いレベルを構築するために ルーチン全体のもう１つのコピーを呼び出すことを伴う。この次のもっと深いレ ベルは、この時点で、ツリーでこれから細胞の現在のノードを分岐させているで あろう。複製窓が完全に覆われれていると、アルゴリズムは覆われた依存性窓の ための蛍光発光読み取りが予測されるステップ１４に動く。 このことは、必要とされる長さ、フラグメント毎の蛍光発光、さらに予測され た蛍光発光読み取りの強度からなるＤＮＡフラグメントの数の計算を伴う。 ステップ１６において、依存している塩基位置のための信頼基準を決定する。 ここで、アルゴリズムは測定値の予測を有し、該測定値それ自身をその予測と比 較する。多くの信頼読みをもたらすことについての方法があるけれども、しかし この実行でもし真の読み取りが予測より低いなら、その中にゼロ信頼を持つと考 えられる。この目的のために、すべてのノイズがポジティブな付加であり、予測 より高い読み取りが距離の平方(square)に比例しているより低い信頼に帰すると 思われる。 ステップ１８において、処理がここで短くされることができるかどうか見るた めテストがなされる。もし信頼レベルがゼロであるなら、継続する必要がないの で、アルゴリズムはただこの細胞を終了する。 もし処理がここで短くされることができないなら、制御がテストが、この特定 の分岐が終了したかどうかについてテストがなされるステップ２０に制御が移る 。我々が再帰しなくてはならないある深さがあり、そしてそれはシングル・ラン で計算されていなければならない塩基配列の量によって決定される。多くのファ クタがこの選択に影響を与えるかも知れない。明らかに、限定要因は読み取りが ある塩基位置の数である可能性が高い。我々が再帰する深さは、複製窓の右側の 幅によって解読される塩基位置の数より大きい。もし分岐がまだ終了していない なら、それ以上の再帰が必要とされる。 分岐が終了すると、つぎにステップ２２で現在の分岐が最も良い塩基配列適合 度であるかどうかを決定するテストを行う。この時点で、現在の分岐が終了し、 さらにそのためのた、そしてそれのための信頼測定値のすべてが蓄積される。こ の蓄積された信頼を、ここでこれまでのところ最も良い分岐に関連したものと比 較する。もし新しいものが前の最良のものよりも高い信頼限界を持っているなら 、最も良い塩基配列レコードはステップ２４において更新され、そしてこの細胞 にたいしてロセスの完了がなされれる。最も良い塩基配列レコードを更新するこ とは現在の分岐と信頼レベルをグローバルなレコードにコピーして、前の最も良 い分岐についてのインフォメーションに上書きすることを伴う。 図１で示されるルーチンは、いままでに到達した配列の位置を示すパラメータ 、さらに現在の分岐上にまだコピーされていないテンプレートの数の測定に よって呼び出されると理解される。再帰ボックスは、適当なパラメータによって ルーチンそのものを呼び出す。図１のルーチンが実際に稼働する方法の例を図２ に見ることができよう。これはリストアップされた配列、すなわちＣＡＣＡＣＡ と読む１番目の対立遺伝子とＣＡＡＡＡＡと読む２番目の対立遺伝子を解読しよ うと試みることにおいて実行されるであろうオペレーションを示す。プライマは ＣＡであると考えられて、そしてそれぞれの対立遺伝子についてもちろん同じで ある。 我々はツリーの最上部においてノード０で最初の位置からスタートする。この 際、最初の位置をＣＣとし第２の位置をＡＡとする（ここで、それぞれの対の最 初の文字は最初の対立遺伝子を表し、第２の文字は２番目の対立遺伝子における 対応する位置を表す）。 ノード１において、仮説ＡＡ作られる。複製窓が（今まで）覆われていなかっ たので、手順はノード２に再帰する。仮説ＡＡがこの次の位置に対して作られる 。測定値が予測より小さいことがここで見いだされるので、分岐を省略し、さら にもう１つのＡＣの仮説がノード３において作られる。再び、測定は予測より小 さいので、さらにＣＡの仮説がノード４において作られる。同じ結果はここで得 られ、さらに同じくノード５において、ＣＣの仮説が試みられる。ノード１に依 存してそれ以上の仮説が試されていないことから、ＡＣの２番目の仮説がノード １のＡＡに可能な選択肢として作られる。再び、依存性ウインドウは）覆われて いなかったので、塩基配列における次の位置のために塩基ＡＡが仮定されるノー ド７に再帰する。それは可能性であるように思われるので、ノード７の子のすべ てが試みられなければならず、ノード８の仮説ＡＡによって一つのレベルでさら にレベルダウンが開始される。 再び、このことは可能であるように思われ、さらにノード９ないし１２でそれ 以上のレベルダウンが行われる。それぞれのケースで、測定値は予測よりも小さ く、そのすべてが拒絶される。つづいて処理がノード１３において継続し、そこ でＡＣがノード８のＡＡに対して可能な選択枝として試みられる。 ツリーの残りの部分に対して、可能性のすべてが検討されるまで、同様の方法 が続いて行われる。選ばれた塩基配列は最も少なく累積的な誤差を持つ。もちろ んそれは要求される精度で、正しい解決を決定するために必要であるように深い ツリーを再帰するために必要なだけである。ツリー全体の再帰を避けることにつ いての代わりの方法は、部分的に一致しているより短い配列の収集としてシーク エンシングを実行することである。 一実施形態例では、再帰の量は時間的制約のために限定されている必要があろ う。例えば、標準的な状況の下で一つの位置の「ルックアヘッド」が複製効果の 合理的なモデリングを提供する可能性が高いと思われる。また、そうすることは いっそう正確であるかも知れないけれども、成長しているツリーの最上部に再帰 することが毎回絶対的に必要なことではない。塩基配列で次の塩基に与えられる いかなる塩基の効果も、塩基の間の距離が増加するにつれて非常に速く減少する 。それ故に全体的な提案された配列に、現在の位置から遠くにある塩基の貢献を 含め、個々にそれぞれの別の貢献を加算することは、実際にほとんどポイントと はならない可能性が高い。その問題を扱うことについての１つの方法は、効率的 に固定しているとして現在の位置から大きく離れた塩基を考慮することである。 ツリーが、その根の部分として、その固定した配列の最も近くのポイントを用い て再成長することができる。 同じ予測効果に達するために使われる多数の異なったアルゴリズムがあること が理解されよう。唯一必要なことは、その位置での実際の測定値とともに事前に 決定された塩基からの情報を用いて、次の塩基を決定することが可能であるべき であるということである、もしアルゴリズムが「ルックアヘッド」機能を持つな ら、前の塩基と同様に、塩基配列で次の塩基に対して情報が使用されよう。さら に、決定される“次の”塩基は最後に定まった塩基と一緒に必ず連続的である必 要はない。すなわち、既に記載した方法を用いて、例えば同一性が（例えばゲル の上に色素の染みによって）不明瞭にされた２ないし３塩基の位置をとばすこと 、また通常のやり方で継続することは可能性がかなり高い。同様に、適当なツリ ー構造によって、塩基配列に沿って思うままに前方向および後方向に仮定するこ とが可能であろう。 さらに、いくつかの異なったプライマがいくつかの位置においてシークエンス を開始するために一度に導入されてもよい。記述された方法は、プライマに対応 する配列が全体的な配列に結合するまで塩基配列に沿って適当に前方向および後 方向に仮定されることができる。このことは、図２に示すツリーに類似したグラ フ構造が大きくなることによってなされるかもしれないが、多数の核生成ポイン トから上方および下方へ成長して多くのノードと出会う。 システムを、ある特定の周知の外部情報を利用するように設計してもよい。例 えば、トレースの正確な大きさと形状とが知られているとするあんらば、ポイン ト予測がされるかも知れない。このことに対する可能なアルゴリズムは次の通り である。 プライマ配列を仮定 Ｂ： 塩基配列における次の未知の塩基位置について、 ２つの対立遺伝子でそれぞれの可能な１対の塩基（Ｍ、Ｆ）を仮定 for each（Ｍ，Ｆ） if我々が複製効果の右の側をカバーしなかったならば、 Ｂへ再帰： else このポイントで期待されたトレード読み取りを予測。 予測と実際の測定値とを比較して、予測によるコンプライアンスの度合いのレ コードを作る。 if我々がこの現在の分岐が実行不可能であると確信するならば、次の （Ｍ、Ｆ）にジャンプする。 endif if判断すべき配列の終わりでなければ、Ｂへ再帰： else この分岐をこれまでのところ最良であるものと比較する。そして、 二者のうち良い方を保持する。 endif 最も良い分岐を結果として提示。 代わりに、試液の量は知られていないかも知れない、それでトレースの急勾配 と大きさは知られていないかも知れない。しかし、もし試液の比率が知られてい るなら、一般的な形状と最大となるピーク変異の性質は維持されるべきであり、 そして複製効果と蛍光発光効果の計算はパラメータによって表現してもよい。 代わりに、もしシステムが予測されるトレースの形を許すように記述されるな ら、予測の塩基配列の大きさを調整しようと試みることによって個別の読み取り よりもむしろプロフィールにマッチすることができる。我々が分岐全体に沿って 読み取りのプロフィールを考慮す適当なアルゴリズムは次の通りである： プライマ配列を仮定 Ｂ： 塩基配列における次の未知の塩基位置のために： ２つの対立遺伝子でそれぞれ可能な１対の塩基（Ｍ、Ｆ）を仮定： if我々が複製効果の右の側をカバーしなかったなら Ｂに再帰： else for each（Ｍ、Ｆ） このポイントでの期待されるトレースの読み取りを予測。 これらの読み取りを記録 if判断される塩基配列の終わりでなければ、 Ｂに再帰： else 最良に適合するように分岐予測を変更 この分岐をこれまでのところ最良であるものと比較する。そして、 二者のうち良い方を保持する。 最も良い分岐を結果として提示。 この場合に注目すべきことは、変更されたデータ・セットを確認するために十 分な分岐が確実に完了するまで特定の分岐を中止する局所決定を行うことはでき ない。 複製効果の外に標準化するべき追加の情報を提供するためにプライマに追加の プライママーカを使用しても良い。もしそれがされるなら、ただ蛍光発光効果だ けがカバーされる必要があり、“ルックアヘッド”の能力は不必要である。２つ の主な問題はノイズ信号増幅の回避と配列全体を通じて依存関係の連続性の損失 とである。 シグナルを正常化するために、我々はピークを立ち上げるフラグメントの数の 均一的な測定によって信号の大きさを分割するとともに、この測定をプライママ ーカピークの大きさによって利用可能にする。ノイズのプライマ・ピークまたは バックグラウンドＤＮＡシグナルは小さいので、ターミネータ・ピークが顕著で あるとみなされるならばターミネータピークはかなり大きなものとなる。 主な利点は、処理が非常に局所的なことであり、フラグメントの数は前の塩基 から導き出せれる必要がない。このことは効果的な並行アルゴリズムの有効性を 改善する。 手順の速さと有効性を改善するために、連続的であるよりむしろ平行した処理 を利用することは可能であるであろう。多くのプロセッサを利用するために、配 列をいくつかのセクションに分けることが必要である。分割は塩基配列位置によ って、あるいは塩基のタイプによって行われる。 正常化が適用された並行システムを用いることで、ひとつの塩基をトレース・ データのの厳密にローカルなセットから決定することができる。 明らかに、任意の未知の塩基を仮定しなければならず、それらの塩基はそれら 自身から導き出されるやいなや他のプロセッサによって追い越されるかもしれな い。同様に所定の塩基位置仮説が正しいと決定するするとして、我々は同じく多 くの仮説を除外するかも知れない。例えば、所定の位置が確かにＣＡであると述 べる代わりに、我々はそれが確かに対立遺伝子の１つの上にＧを含まないと述べ ることができよう。 一般に、ある特定の結果での信頼の度合いがプロセッサの間に通り越されるは ずである、しかし我々は、もし局所的な信頼性が優先依存性情報の解析によって 判断されるように、十分に高いなら、正当性を断言することによって物事を単純 化することに決める。 外因的な情報なしで、我々は可能性のグラフとして正しいプレ塩基配列の検索 にアプローチしなければならない。情報が依存性窓が自信を持って記述されるた めに必要な前の塩基位置を決めているプロセッサから中に入るように、我々は情 報と意見が違うツリーの一部を、取り除くか、あるいはより少ないウエイトをか す。 それぞれのノード上のアルゴリズムは回帰的であるか、あるいは明示的にツリ ーデータ構造に基づいていてもよい。ツリーの一部がいかなる点でも捨てられる かも知れないという事実は、可能である場合は、処理を浪費するのを避けること が処置を取るために望ましいことを意味する。回帰的な方法は最も直感的に深さ ファースト検索に適用される。もちろん、ツリー構造を取り込むものなら何でも 、再帰としてうまく働こうとする。それは確立されたツリー構造上で働きを検討 するのにもっとも容易である。 例えば、アルゴリズムがこれらのラインに沿って設計されるかも知れない： （１）それぞれの深さにおいて向こう側に結合したプレ配列仮説のツリー構造を 最初に構築する：（オプション：モデル・データをすぐに決定することができる ツリーの一部分だけを構築）。 （２）それぞれのツリーの深さにおいて、これまでのところ分岐と結び付けられ た信頼基準を計算する。これが続いている間に、ツリーの一部を取り去るメッセ ージが他のプロセッサから到着し、処理を短縮する。 もし塩基位置があるより少数の利用可能なプロセッサがあるなら、処理を最適 に省略してくれるもと信じる最初の割り当てのスキームを選択する。 これらのようなコンピュータ化されたアルゴリズムの応用によって、製造業者 によって従来から克服すべき問題とされてきたピークからピークへの変化はいま や利点となる。可変性は本発明で利用される重要な情報を含んでいる。測定値か ら、我々は両方の対立遺伝子の上にＤＮＡの完全な配列を得ることが可能である 。 それ故に、もし存在しているなら、ヘテロ接合性を同時に検出することができ る。我々は同じくＤＮＡの完全に別の塩基配列の混合物を分析することが可能で ある。最終的に我々は我々の結果の正確さの測定が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡ鎖の塩基配列を自動的に決定する方法であって、 （ａ）前記ＤＮＡ鎖内の各位置について、該位置にある塩基を表す値を実験的 に決定する工程と、 （ｂ）塩基が知られていると考えられる鎖の一部を含む初期配列から出発し、 成長する配列に繰り返して塩基を増やしていき、各段階で、新規位置での測定値 と前記成長する配列の前に決定された塩基の少なくともいくつかとに依存して前 記成長する配列の新規位置に加える新規塩基を決定する工程と を有することを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２．請求項１に記載の方法であって、 各段階で、前記新規位置での測定値を予測し、前記予測された測定値を前記新 規位置での実際の測定値と比較し、さらに前記比較の結果の前記新規塩基を決定 することを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ３．請求項２に記載の方法であって、 前記新規位置の前記予測された測定値は、前記成長する配列の前に決定された 塩基の少なくともいくつかを用いて計算されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩 基配列決定法。 ４．請求項２または３に記載の方法であって、 前記新規位置の前記予測された測定値は、前記鎖の任意の位置の測定値を参照 することなく計算されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ５．請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法であって、 前記新規位置の前記予測された測定値は、各可能な塩基に対して一つが対応す る４つの別々の値を持つものであることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定 法。 ６．請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法であって、 各位置での前記測定値は、前記位置で各可能な塩基に対して一つが対応する４ つの別々の値を持つものであることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ７．請求項６が請求項５に従属した場合の方法であって、 前記新規位置での実際の値が期待された最小の値よりも小さいとするならば、 前記新規位置の候補として塩基が拒絶され、また前記期待された最小の値は、前 記新規位置での前記塩基の予測された値の関数として計算されることを特徴とす る自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ８．請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法であって、 前記成長する配列は塩基ごとに生成されるものであり、前記成長する配列内で 最後に加えられた前の塩基の隣に前記新規塩基が加えられることを特徴とする自 動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ９．請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法であって、 前記成長する配列に加えられる前記新規塩基は、前記成長する配列内で最後に 加えられた前の塩基の隣に加えられる必要はないことを特徴とする自動化ＤＮＡ 塩基配列決定法。 １０．請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法であって、 前記成長する配列は前記初期配列からの鎖に沿って両方向に成長することを特 徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 １１．請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法であって、複数の初期配 列から出発して複数の成長する配列を同時に成長させることを特徴とする自動化 ＤＮＡ塩基配列決定法。 １２．請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法であって、特定の段階で 次に可能な塩基を仮定し、次の段階を予測し、前記次の段階の前記次に可能な塩 基を仮定し、さらに前記次の段階の好ましい仮定された塩基に依存して少なくと も部分的に前記特定の段階の前記新規塩基を決定することを特徴とする自動化Ｄ ＮＡ塩基配列決定法。 １３．請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法であって、特定の段階で 複数の段階を予測し、複数の可能な塩基配列を仮定し、さらに好ましい仮定塩基 配列に依存して少なくとも部分的に前記特定の段階に対して前記新規塩基を決定 する自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 １４．請求項１ないし１２のいずれかで、かつ前記請求項２に従属する一項に記 載の方法であって、前記新規位置での前記予測された測定値と前記実際の測定値 とにもとづいて誤差測度が構築され、前記成長する配列の少なくとも一部分に対 して累積誤差測度が維持され、さらに前記新規塩基は前記累積誤差測度を最小に する特定の塩基にもとづいて決定されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列 決定法。 １５．請求項１２または１３に従属した請求項１４に記載の方法であって、前記 好ましい仮定された塩基または前記好ましい仮定された塩基配列は、それぞれ前 記累積誤差測度を最小にする特定の塩基または配列もとづいて決定されることを 特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 １６．請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の方法であって、 特定の段階で、複数の段階を予測し、複数の可能な塩基配列を仮定し、さらに 好ましい仮定塩基配列に依存して少なくとも部分的に前記特定の段階に対して前 記新規塩基を決定し、前記好ましい仮定塩基配列は該好ましい仮定塩基配列の各 々の位置に対応する予測された測定値プロファイルに最良に適合する配列として 決定されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 １７．請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法であって、 前記測定値は実質的にサンガー法を用いて得られることを特徴とする自動化Ｄ ＮＡ塩基配列決定法。 １８．請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法であって、 前記測定値は改良サンガー法を用いて得られるものであり、反応ターミネータ は各々の塩基にもとづいて個々に標識され、さらにすべてが単一の反応量に混合 されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 １９．請求項１８に記載の方法であって、反応プライマも標識され、前記反応プ ライマからの情報はターミネータ標識測定値を正規化することに利用されること を特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２０．請求項１７ないし１９に記載の方法であって、新規位置に対する予測測定 値は、複製効果をシミュレートした数学的モデルまたはルック・アップ・テーブ ルを用いて計算されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２１．請求項１８に記載の方法であって、前記反応ターミネータは色素標識であ ることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２２．請求項２１に記載の方法であって、前記新規位置の前記予測された測定値 は蛍光発光効果をシミュレートした数学的モデルまたはルック・アップ・テーブ ルを用いて計算されることを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２３．請求項１７に記載の方法であって、前記プライマは色素標識であることを 特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２４．図面を参照して、明確に記述されたようにして自動的にＤＮＡの塩基配列 を決定することを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ２５．妊娠した雌の胎児の特性を決定する方法であって、 胎児の細胞を含む試料を雌から採取し、先行する請求項のいずれか一項の方法 を用いて前記胎児の細胞に由来するＤＮＡ鎖の塩基配列を自動的に決定すること を特徴とする胎児特性決定方法。 ２６．請求項２５に記載の方法であって、前記試料は血液試料であることを特徴 とする胎児特性決定方法。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記試料は、妊娠した雌の静脈血試料 であることを特徴とする胎児特性決定方法。 ２８．請求項２５に記載の方法であって、前記試料は粘液試料であることを特徴 とする胎児特性決定方法。 ２９．請求項２８に記載の方法であって、前記試料は頚管粘液試料であることを 特徴とする胎児特性決定方法。 ３０．請求項２５ないし２９のいずれか一項に記載の方法であって、前記塩基配 列の決定に先だって前記試料に含まれる前記胎児ＤＮＡを濃縮する段階を含むこ とを特徴とする胎児特性決定方法。 ３１．請求項３０に記載の方法であって、前記試料に含まれる前記胎児細胞を濃 縮する段階を含むことを特徴とする胎児特性決定方法。 ３２．請求項３１に記載の方法であって、前記胎児細胞は、細胞特異的抗体を用 いて結合することによって濃縮されることを特徴とする胎児特性決定方法。 ３３．請求項２５ないし３２のいずれか一項に記載の方法であって、前記特性の 決定は、染色体異常を検出することからなることを特徴とする胎児特性決定方 法。 ３４．請求項２５ないし３２のいずれか一項に記載の方法であって、前記特性の 決定は、ＤＮＡ突然変異を検出することからなることを特徴とする胎児特性決定 方法。 ３５．罹患したヒトまたは動物の病原体を検出する方法であって、前記罹患した ヒトまたは動物から病原体を含む試料を採取し、請求項１ないし２４のいずれか 一項に記載した方法を用いて前記病原体由来のＤＮＡ鎖の塩基配列を自動的に決 定することを特徴とする病原体検出方法。 ３６．請求項３５に記載の方法であって、 前記試料に含まれる病原体ＤＮＡのロードを測定することによって存在する病 原体の量を決定する段階を含むことを特徴とする病原体検出方法。 ３７．請求項３５または請求項３６に記載の方法であって、 前記試料は血液試料であることを特徴とする病原体検出方法。 ３８．請求項３５または請求項３６に記載の方法であって、 前記試料は粘液試料であることを特徴とする病原体検出方法。 ３９．請求項３５または３６に記載の方法であって、 前記試料は尿試料であることを特徴とする病原体検出方法。 ４０．請求項３５または３６に記載の方法であって、 前記試料は精液試料であることを特徴とする病原体検出方法。 ４１．請求項３５ないし４０のいずれか一項に記載の方法であって、 塩基配列の決定に先だって前記試料に含まれる前記病原体ＤＮＡを濃縮する段 階を含むことを特徴とする病原体検出方法。 ４２．請求項３６に記載の方法であって、前記病原体ＤＮＡのロードは、全試料 ＤＮＡの比として決定されることを特徴とする病原体検出方法。 ４３．身体試料に含まれる外来ＤＮＡを検出する方法であって、 請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の方法を用いてＤＮＡ鎖の塩基配列 を決定し、前記外来ＤＮＡがどうかを、塩基配列決定された前記試料由来のＤＮ Ａと、外来ＤＮＡを持たないことが知られている別の身体試料からの塩基配列決 定されたＤＮＡとを比較することを特徴とする外来ＤＮＡ検出方法。 ４４．ヘテロ異性体配列を検出する方法であって、 先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を用いて、一対のＤＮＡ鎖の塩基 配列を決定し、各段階で成長する配列の対応する新規位置に加える塩基対を同時 に決定することを特徴とするヘテロ異性体配列検出方法。 ４５．別々に存在する第１のタイプのＤＮＡ鎖と第２のタイプのＤＮＡ鎖とから なる混合物を自動的に塩基配列決定する方法であって、 先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を用いて、別々の鎖の塩基配列を 決定し、各段階において成長する配列の対応する新規位置に加える塩基の割り当 てを決定することを特徴とする自動化ＤＮＡ塩基配列決定法。 ４６．請求項４５に記載の方法であって、第１のタイプのＤＮＡと第２のタイプ のＤＮＡとの相対比を決定することを特徴とするヘテロ異性体配列検出方法。 ４７．混合試料に含まれる第一の身体試料と第２の身体試料との相対比を決定す る方法であって、 請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記混合試料に含 まれるＤＮＡ鎖の塩基配列を決定し、前記第１の試料由来のＤＮＡと前記第２の 試料由来のＤＮＡとの相対比を決定し、さらに前記ＤＮＡの相対比から前記身体 試料の相対比を決定することを特徴とする混合試料相対比決定方法。