KR102446941B1 - 서열 변이체 검출 방법 및 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 예를 들어 대상체로부터 취한 핵산 샘플에서 유전자 서열 내 구조적 변이 근처의 희귀 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 구조적 변이를 설명하는 참조 서열 구축물에 대해 리드 (예를 들어, 핵산 리드)를 정렬하는 방법, 구조적 변이 또는 구조적 변이 및 희귀 변이체를 설명하는 참조 서열 구축물을 구축하는 방법, 및 희귀 변이체를 확인하는 정렬 방법을 사용하는 시스템을 포함한다. 방법은 규모조정이 가능하며, 수천개의 염기 길이 또는 그 초과의 염기 길이의 구축물에 대해 수백만개의 리드를 정렬하는데 사용될 수 있다.

Description

서열 변이체 검출 방법 및 시스템 {METHODS AND SYSTEM FOR DETECTING SEQUENCE VARIANTS}

관련 출원

본 출원은 2013년 9월 30일에 둘 다 출원된 미국 특허 출원 번호 61/884,380 및 14/041,850을 우선권 주장하며, 상기 출원 둘 다는 그 전문이 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 샘플 (예를 들어, 유전자 샘플)에 대응하는 연속 서열 리드(read)를 생성시키기 위해 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 서로 정렬하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 샘플에서 변이체를 확인하는 방법에 관한 것이다.

유전학은 분석 과학으로부터 정보 과학으로 발전되어 왔다. 이전에는 과학자들이 핵산을 추출하고 확인하는 방법과 싸워 온 반면, 이러한 기술은 현재는 평범하다. 차세대 서열분석 (예를 들어, 전체-전사체 샷건 서열분석, 파이로시퀀싱, 이온 반도체 서열분석, 합성에 의한 서열분석)은 겨우 수일 이내에 전체 게놈을 포괄하는 수백만개의 리드를 생성시킬 수 있다. 이러한 처리량을 달성하기 위해, NGS 서열분석은 함께 보다 큰 유전자 정보체, 예를 들어 염색체 또는 게놈을 구성하는 보다 작은 핵산 서열에서의 대규모 병렬화를 사용한다. 유전자 샘플에서 시작하여, 핵산 (예를 들어, DNA)이 절단되고, 증폭되며, 극한의 속도로 판독된다. 이들 능력에 비추어, 과학자들은 현재 질환 또는 질환의 위험성을 나타내는 서열 내 유전자좌를 확인하기 위해 (저비용으로) 리드를 정렬하는 방법과 싸우고 있다.

최신 기술 정렬 방법은 중요한 유전자 또는 구조적 정보 (예를 들어, 질환에 대한 바이오마커)에 대해 프로빙될 수 있는 서열을 생성시키기 위해 참조에 대해 중첩 리드를 정렬하는데 대규모 컴퓨팅 능력을 사용한다. 궁극적으로, 서열 정렬의 목표는 서열분석기에 의해 생성된 핵산 리드의 세트를 조합하여, 대상체로부터의 유전자 샘플을 기반으로 대상체의 보다 긴 리드 (즉 콘티그) 또는 심지어 전체 게놈을 달성하는 것이다. 차세대 서열분석기로부터의 서열 데이터는 종종 함께 표적 서열 전체를 나타내는 수백만개의 보다 짧은 서열을 포함하기 때문에, 리드를 정렬하는 것은 복잡하고 컴퓨팅에 있어 고비용이다. 추가적으로, 무작위 서열분석 오차 (즉, 부정확한 서열분석 기계 출력)에 의해 야기되는 서열 왜곡을 최소화하기 위해, 프로빙된 서열의 각각의 부분을 다수회 (예를 들어, 2 내지 100회 또는 그 초과 횟수) 서열분석하여, 생성된 최종 정렬 및 출력 서열에 대한 임의의 무작위 서열분석 오차의 영향을 최소화한다. 최종적으로, 일단 모든 핵산 리드에 대응하는 모든 데이터가 수집되고 나면, 리드는 대상체 서열 전부 (또는 그의 몇몇 일부)를 결정하기 위해 단일 참조 서열, 예를 들어 GRCh37에 대해 정렬된다. 많은 경우에, 개별 리드가 실제로 디스플레이되는 것은 아니며, 오히려 정렬된 서열이 서열로 조립되고, 그 서열이 데이터 파일로 제공된다.

전형적으로, 서열 정렬은 2개의 선형인 서열 정보 스트링들 사이의 쌍별 정렬을 모으는 것에 의해 구축된다. 정렬의 예로서, 2개의 스트링 S1 (서열 12: AGCTACGTACACTACC) 및 S2 (서열 13: AGCTATCGTACTAGC)가 서로에 대하여 정렬될 수 있다. S1은 전형적으로 리드에 대응하고, S2는 참조 서열의 일부분에 대응한다. 서로에 대해, S1 및 S2는 치환, 결실 및 삽입으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 상기 용어는 스트링 S1의 스트링 S2로의 변환과 관련하여 정의된다: 치환은 S2에서의 문자 또는 서열이 S1에서의 동일한 길이의 상이한 문자 또는 서열에 의해 대체되는 경우에 이루어지고, 결실은 S2에서의 문자 또는 서열이 S1의 대응하는 부문에서 "생략되는" 경우에 이루어지고, 삽입은 S2에서는 인접하고 있는 2개 위치 사이에 S1에서는 문자 또는 서열이 발생하는 경우에 이루어진다. 예를 들어, 2개 서열 S1 및 S2는 하기와 같이 정렬될 수 있다. 하기 정렬은 13개의 매치, 1개 길이의 결실, 2개 길이의 삽입 및 1개의 치환을 나타낸다:

(S1) AGCTA-CGTACACTACC (서열 12)

(S2) AGCTATCGTAC- -TAGC (서열 13)

관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열 정렬을 위한 정확한 알고리즘 및 대략적 알고리즘이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 정확한 알고리즘은 최고 점수화 정렬을 찾게 될 것이나, 컴퓨팅에 있어 고비용일 수 있다. 2개의 가장 널리 알려져 있는 정확한 알고리즘은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) (J Mol Biol, 48(3):443-453, 1970) 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman) (J Mol Biol, 147(1):195-197, 1981; Adv. in Math. 20(3), 367-387, 1976)이다. 고토(Gotoh)에 의한 스미스-워터맨의 추가의 개선 (J Mol Biol, 162(3), 705-708, 1982)은 계산 시간을 O(m²n)에서 O(mn)으로 감소시키는데, 여기서 m 및 n은 비교되는 서열 크기이며, 병렬 프로세싱으로 더욱 수정될 수 있다. 생물정보학 분야에서, 이는 종종 스미스-워터맨 알고리즘으로 지칭되는 고토의 변형된 알고리즘이다. 스미스-워터맨 접근법은 병렬 컴퓨팅 자원이 보다 광범위하고 저비용으로 이용가능하게 되기 때문에, 보다 큰 참조 서열에 대하여 보다 큰 서열 세트를 정렬하는데 사용되고 있다. 예를 들어, http://aws.amazon.com에서 이용가능한 amazon.com의 클라우드 컴퓨팅 자원을 참조한다. 모든 상기 학술지 논문은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

스미스-워터맨 (SW) 알고리즘은 서열 내 염기 사이의 중첩을 보상하고 서열 사이의 갭에 벌점을 부여하는 것에 의해 선형인 서열을 정렬한다. 스미스-워터맨은 또한 보다 짧은 서열이 보다 긴 서열을 기재하는 문자 스트링에 걸쳐있을 것을 필요로 하지 않는다는 점에서 니들만-분쉬와는 상이하다. 즉, SW는 하나의 서열이 다른 서열 전체의 리드라고 가정하지 않는다. 추가로, SW는 스트링의 전체 길이에 걸쳐 연장되는 정렬을 찾아야 할 의무가 없기 때문에, 2개 서열 내의 어느 곳에서나 국부 정렬이 시작 및 종료될 수 있다.

SW 알고리즘은 길이 n 및 m의 2개 스트링을 나타내는 n x m 행렬 H에 대해 하기 방정식 (1)의 관점에서 용이하게 표현된다:

상기 방정식에서, s(a_i,b_j)는 매치 가산점 (a_i = b_j인 경우) 또는 미스매치 벌점 (a_i ≠ b_j인 경우)를 나타내며, 삽입 및 결실에는 각각 벌점 W_in 및 W_del이 주어진다. 대부분의 경우, 생성되는 행렬은 0인 요소를 다수 갖는다. 이러한 표시는 행렬의 상위로부터 하위로, 우측으로부터 좌측으로 백트랙을 용이하게 함으로써, 정렬을 확인한다.

일단 행렬이 점수로 완전히 채워지고 나면, SW 알고리즘은 정렬을 결정하기 위한 백트랙을 수행한다. 행렬의 최대값에서 시작하여, 알고리즘은 각각의 셀에 대한 최종 최대값을 컴퓨팅하는데 3개 값 (H_i-1,j-1, H_i-1,j, 또는 H_i,j-1) 중 어느 것이 사용되었는지에 기초하여 백트랙할 것이다. 0에 도달할 경우에, 백트랙은 중단된다. 예를 들어, 선행 기술을 나타내는 것이 아니라 백트랙의 개념 및 백트랙이 판독될 때의 대응하는 국부 정렬에 대해 도시하고 있는 도 3의 B를 참조한다. 따라서, 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "최고 정렬"은 가능한 최소 수를 초과하는 삽입 및 결실을 함유할 수 있지만, 가능한 최대 수보다 훨씬 더 적은 치환을 함유할 것이다.

SW 또는 SW-고토로서 적용되는 경우에, 상기 기술은 동적 프로그래밍 알고리즘을 사용하여 각각 크기 m 및 n인 2개 스트링 S 및 A의 국부 서열 정렬을 수행한다. 이러한 동적 프로그래밍 기술은 매치 점수를 보존하고 연속되는 셀에 대한 재컴퓨팅을 피하기 위해 표 또는 행렬을 사용한다. 스트링의 각각의 요소는 서열의 문자에 대해 색인화될 수 있으며, 즉 S가 스트링 ATCGAA인 경우에, S[1] = A, S[4] = G 등이다. H_i,j (상기)로서 최적 정렬을 나타내는 대신에, 하기 방정식 (2)의 B[j,k]로서 최적 정렬이 나타내어질 수 있다:

최대 함수의 인수 B[j,k]는 하기 방정식 (3)-(5)에서 요약되며, 여기서 미스매치_벌점(MISMATCH_PENALTY), 매치_가산점(MATCH_BONUS), 삽입_벌점(INSERTION_PENALTY), 결실_벌점(DELETION_PENALTY) 및 개방_벌점(OPENING_PENALTY)은 모두 상수이고, 매치_가산점을 제외하고는 모두 음수이다. 매치 인수 p[j,k]는 하기 방정식 (3)으로 주어지고:

삽입 인수 i[j,k]는 하기 방정식 (4)로 주어지고:

결실 인수 d[j,k]는 하기 방정식 (5)로 주어진다:

모든 3개 인수에 있어서, 백트랙이 완료에 이르는 것을 보장하기 위해 [0,0] 요소는 0으로 설정되며, 즉 p[0,0] = i[0,0] = d[0,0] = 0이다.

점수화 파라미터는 다소 임의적이며, 컴퓨팅의 거동을 달성하도록 조정될 수 있다. DNA용 점수화 파라미터 설정의 한 예 (Huang, Chapter 3: Bio-Sequence Comparison and Alignment, ser. Curr Top Comp Mol Biol. Cambridge, Mass.: The MIT Press, 2002)는 다음일 것이다:

매치_가산점: 10

미스매치_벌점: -20

삽입_벌점: -40

개방_벌점: -10

결실_벌점: -5

상기 갭 벌점 (삽입_벌점, 개방_벌점) 사이의 관계는, 갭 개방 대가보다 더 높은 갭 삽입 벌점을 설정하는 것에 의해 갭 개방의 수를 제한하도록 도우며, 즉 갭을 함께 그룹화하는 것을 선호한다. 물론, 미스매치_벌점, 매치_가산점, 삽입_벌점, 개방_벌점 및 결실_벌점 사이의 대안적 관계가 가능하다.

일단 정렬이 완료되고 나면, 정렬된 서열은 변이체를 확인하기 위해 참조 (즉, 유전자 표준)와 비교될 수 있는 서열을 생성시키도록 조립될 수 있다. 변이체는 질환, 질환의 병기, 재발 등과 관련한 통찰을 제공할 수 있다. 아미노산 정렬의 경우에, 조립된 아미노산 서열은 단백질에 관한 진화적 정보 또는 단백질에 관한 기능적 정보를 결정하기 위해 표준과 비교될 수 있다.

최신 기술 정렬 방법, 예를 들어 스미스-워터맨의 한계는, 정렬 알고리즘이 예를 들어 20 내지 1000개 염기 쌍 (bp)의 보다 작은 리드를 그 리드보다 더 크거나 유사한 크기를 갖는 구조적 변이의 존재 하에서 정렬하는데 어려움을 갖는다는 점이다. 구조적 변이는 전형적으로 큰 서열 편차, 예를 들어 100 bp 이상, 예를 들어 전형적으로 1 킬로염기 내지 3 메가염기 길이이다. 구조적 변이체는 중복, 역위, 전위 또는 게놈 불균형 (삽입 및 결실)을 포함할 수 있고, 정의에 의하면 이들은 여러 개를 넘는 염기 쌍에 걸쳐있다. 통상적으로 알려져 있는 구조적 변이는 카피수 변이체를 포함하며 이에 의해 비정상적 수의 특정 게놈 구역 카피가 염색체의 영역에서 중복되어 있다. 이러한 변이는 암뿐만 아니라 자가면역 및 신경계 장애와 연관되었다.

구조적 변이를 함유하는 서열의 일부분을 나타내는 보다 짧은 리드가 최신 기술을 사용하여 참조 서열에 대해 정렬되는 경우에, 리드가 종종 잘못된 것으로서 폐기되는데, 이는 구조적 변이가 참조에 존재하지 않으므로 참조에 대한 리드의 정렬 점수가 의미있는 리드의 역치 미만이기 때문이다. 다른 경우에, 리드는 정렬되지만, 리드의 특정 서열이 무시되는데, 이는 서열 내 특정한 염기가 구조적 변이 내 돌연변이의 결과인지 또는 단지 "정상" 구조적 변이의 오판독인지의 여부가 불분명하여 정렬 점수가 충분히 낮기 때문이다 (따라서 정렬된 서열이 충분히 "잡음성"인 것으로 가정됨).

추가의 문제는 돌연변이 또는 변이체, 예를 들어 작은 삽입결실 또는 다형성이 구조적 변이에 근접하여 리드에 위치하는 경우에 제시된다. 구조적 변이를 정렬하는 어려움은 돌연변이 및 구조적 변이 둘 다를 함유하는 리드가 "정렬불가능한" 것으로서 폐기되도록 야기할 수 있다. 이러한 리드가 보다 많이 폐기될수록, 돌연변이를 전적으로 놓칠 가능성이 많아진다. 그 결과, 구조적 변이에 가까운 의미있는 희귀 변이체 또는 돌연변이 (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)는 구조적 변이와 연관된 낮은 정렬 점수로 인해 거부될 수 있다. 이들 간과된 변이체는 질환을 조절하는데 있어서 (발견되지 않은) 역할을 할 수 있다.

구조적 변이에 근접한 희귀 변이체를 검출하지 못하는 것은 유전자 분석의 품질을 유의하게 제한하기 때문에, 구조적 변이를 설명하여 희귀 돌연변이 또는 변이체의 보다 우수한 정렬을 가져올 수 있는 서열 정렬 기술에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은, 예를 들어 스미스-워터맨-고토와 같은 선형의 국부 서열 정렬 과정을, 증가된 병렬화, 증가된 속도, 증가된 정확도, 및 전체 게놈에 걸쳐 리드를 정렬하는 능력을 제공하는 다차원 정렬 알고리즘으로 변환하는 알고리즘 및 그의 실행 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 종, 집단 내에 또는 심지어 단일 유기체 내의 상이한 세포 사이에서 유전자 서열의 가변성을 설명할 수 있는 조립된 참조 구축물에 대해 실행된다. 본 발명의 참조 구축물 및 정렬 알고리즘의 특정한 이익은 참조 서열의 특정 위치에 있는 상이한 서열에 매치되는 서열 리드를 정렬하는 능력이다. 즉, 참조 구축물은 서열 리드를 특정 위치에 있는 적어도 2개의 상이한 서열 경로 (예를 들어, 참조 서열에 대해 통상적인 서열을 따르는 한 경로 또는 그 참조 서열에 대해 비통상적인 서열 (예를 들어 돌연변이, 다형성, 구조적 변이체)을 따르는 또 다른 경로) 중 1개에 대하여 정렬되도록 한다.

본 발명의 알고리즘이 서열 정보의 "회고" 유형 분석 (스미스-워터맨에서와 같음)을 제공하기는 하지만, 알려져 있는 선형 방법과 달리, 본 발명의 회고는 복잡하고 긴 서열 리드의 보다 정확한 정렬을 제공하기 위해 다중 경로 및 다중 노드를 포함하면서도 보다 낮은 전체 미스매치, 결실 및 삽입 비율을 달성하는 다차원 공간을 통해 수행된다.

실제로, 본 발명은 삽입, 결실 및 치환을 비롯한, 정렬에서 가능한 서열 변이 모두 또는 거의 모두를 설명하는 분지점에 걸쳐있는 일련의 방향성 비순환 서열에 대해 서열 리드를 정렬함으로써 실행된다. 종종 방향성 비순환 그래프 (DAG)로 나타내어지는 이러한 구축물은 "허용되는" 참조 서열 및 변이체 지명 포맷(variant call format (VCF)) 등재물을 비롯한 이용가능한 서열 데이터베이스로부터 용이하게 조립될 수 있다. 따라서, DAG, 또는 알려져 있는 변이를 고려한 다른 구축물과 조합되는 경우에, 개시된 알고리즘은 정렬 정확도를 크게 향상시키고 통상적인 알고리즘으로는 가능하지 않은 서열 해상을 가능하게 하는 다차원 서열 정렬 접근법을 제공한다. 상기 기술은 사실상 어떠한 서열 정보와도 함께 사용될 수 있으나, 본원에서 논의된 바와 같은 핵산 서열 및 아미노산 서열을 정렬하는데 가장 유용하다.

본 발명은 추가적으로 참조 서열 구축물, 예를 들어 게놈의 각각의 유전자좌에서의 알려져 있는 변이체를 나타내는 DAG를 사용하여 특정 유전자좌에 특정 기본 지명을 하는 방법을 제공한다. 정렬 동안에 서열 리드가 DAG에 대해 정렬되기 때문에, 참조 게놈에 대비한 돌연변이를 알려져 있는 돌연변이의 표와 비교하는 후속 단계가 배제될 수 있다. 개시된 방법을 사용하면, 그것은 간단히 핵산 리드가 DAG 상에 나타나 있는 알려져 있는 돌연변이에 위치되는지를 확인하는 것, 및 그 돌연변이를 지명하는 것의 문제가 된다. 대안적으로, 돌연변이가 알려져 있지 않은 (즉 참조 서열 구축물에 나타나 있지 않은) 경우에, 정렬이 찾아질 것이며, 변이체는 새로운 돌연변이로 확인된다. 상기 방법은 또한 특정 질환 위험성 또는 질환 진행과 같은 추가의 정보를 참조 서열 구축물 내에 혼입되어 있는 알려져 있는 돌연변이와 연관시키는 것을 가능하게 한다. 또한, 정렬 동안에 모든 유전적으로 관련된 결과를 발견할 가능성을 갖는 것에 추가로, 개시된 방법은 정렬을 하는 동시에 다수의 참조 서열에 대한 동시 비교를 가능하게 하는데 요구되는 컴퓨팅 자원을 감소시킨다.

본 발명은 추가적으로 유기체의 서열 내 위치에서의 알려져 있는 변이체를 나타내는 방향성 비순환 그래프 데이터 구조 (DAG)를 구축하는 방법을 포함한다. 상기 DAG는 수천개의 위치에 다수의 서열을 포함할 수 있으며, 각각의 위치에 결실, 삽입, 번역, 역위 및 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 비롯한 다수의 변이체를 포함할 수 있다. "유방암"과 같은 상관된 진단 정보를 사용하여 DAG에서 각각의 변이체를 태그부착함으로써 샘플을 제공하는 환자에 대한 위험성을 확인시키는데 필요한 단계를 감소시키는 것이 또한 가능하다. 일부 실시양태에서, 변이체는 질환의 마커로서의 그 변이체의 우세성을 반영하기 위해 점수화되거나, 가중되거나, 또는 다른 변이체와 상관될 것이다.

본 발명은 추가적으로 본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템을 포함한다. 한 실시양태에서, 시스템은 복수의 서열 (즉, 핵산 서열, 아미노산 서열)을 게놈 또는 게놈의 영역에서 관찰된 변이를 나타내는 참조 서열 구축물 (예를 들어, DAG)과 비교할 수 있는 분포된 프로세서 및 기억장치 네트워크를 포함한다. 상기 시스템은 추가적으로 효율적인 정렬 알고리즘을 사용하여 핵산 리드를 정렬함으로써 연속 서열을 생성시킬 수 있다. 참조 서열 구축물이 대단히 많은 양의 풍부한 정보를 압축하고 있기 때문에, 및 정렬 알고리즘이 매우 효율적이기 때문에, 리드는 상업적으로 입수가능한 자원을 사용하여 전체 게놈 상에 태그부착 및 조립될 수 있다. 상기 시스템은 복수의 리드와 참조 서열 구축물 사이의 복수의 비교를 동시에 실행하는 복수의 프로세서를 포함한다. 비교 데이터는 축적되어 건강 관리 제공자에게 제공될 수 있다. 비교가 컴퓨팅에 있어 다루기 쉽기 때문에, 서열 리드를 분석하는 것이 더 이상 NGS 서열분석과 환자의 유전적 위험성에 대한 의미있는 논의 사이의 장애가 되지는 않을 것이다.

특정 측면에 따르면, 본 발명은 정렬될 서열 내에 상이한 구조적 변이를 설명하는 참조 서열 구축물에 대해 핵산 서열을 정렬하는 방법 및 시스템을 제공한다. 구조적 변이가 참조 서열 구축물에 나타나 있는 경우에, 그 구조적 변이의 일부를 포함하는 서열 리드는 변이를 설명하지 않는 선형 참조 서열로 가능한 경우보다 더 높은 정렬 점수로 참조 서열에 대해 정렬된다. 그 결과, 참조 구축물의 상이한 경로는 유리하게는 큰 알려져 있는 서열 변이 또는 그의 부분을 함유하는 서열 리드가 후속 분석을 위해 구축물에 대해 성공적으로 정렬되게 한다. 서열 리드의 구조적 변이체가 적절하게 정렬되는 경우에, 서열 리드의 일부인 다른 서열 데이터, 특히 구조적 변이체에 근접한 것이 마찬가지로 선형 참조 서열로 가능한 경우보다 더 높은 정렬 점수로 참조 구축물에 대해 정렬된다.

구조적 변이체를 함유하는 리드의 일관된 신뢰할만한 정렬은 포획하지 않으면 비정렬 서열로서 폐기될 서열 데이터의 포획을 가능하게 한다. 이것 때문에, 본 발명의 알고리즘 및 참조 구축물은 구조적 변이에 근접하여 위치한 희귀 변이체를 포획하는데 사용된다. 희귀 변이체는 약 5% 미만, 바람직하게는 약 1% 미만의 빈도로 샘플 또는 집단에서 발생하는 것이다. 본 발명의 목적상, 희귀 변이체는 또한 "나타나지 않는" 변이체, 즉 선형 참조 서열 (기존 방법에서) 또는 본 발명의 참조 구축물인 사용될 참조에 반영되지 않는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, (서열 리드가 구조적 변이체 및 희귀 변이체의 적어도 부분을 포함하도록) 구조적 변이체에 가까운 희귀 변이체는 구조적 변이체와 함께 본 발명의 참조 구축물에 대해 정렬될 것이다. 구조적 변이체의 정렬의 직접적인 결과로서, 구조적 변이체에 가까운 희귀 변이체는 서열 리드 내 구조적 변이체의 참조 구축물에 대한 적절한 정렬 때문에 다수의 달리 잘-정렬된 신뢰할만한 리드에 존재할 것이다. 희귀 변이체의 일관된 존재는 그것을 서열분석 오류보다는 타당한 유전자 변이체로서 인식되도록 야기한다. 본원에 기재된 다중-경로 정렬 접근법의 사용은 선형 참조 정렬 접근법을 사용하여 놓칠 가능성이 있는 희귀 서열 변이의 해상을 가능하게 한다.

도 1a 및 1b는 참조 서열 내 유전자 변이를 나타내는 방향성 비순환 그래프 (DAG)의 구축을 도시한다. 도 1a는 시작 참조 서열 및 결실의 부가를 도시한다. 도 1b는 삽입 및 SNP의 부가를 도시하며, 그에 따라 정렬에 사용되는 최종 DAG로 귀결된다.
도 2는 방향성 비순환 그래프로 나타내어지는 3개의 변이체 지명 포맷 (VCF) 등재물을 도시한다.
도 3의 A는 삽입 사례뿐만 아니라 참조 서열을 설명하는 구축물에 대하여 핵산 서열 리드를 정렬하는 것에 대한 그림 표현을 도시한다.
도 3의 B는 핵산 서열 리드 "ATCGAA"의 적절한 위치를 확인하는데 사용되는 행렬 및 백트랙을 도시한다.
도 4는 병렬 프로세싱을 위한 연상 컴퓨팅 모델을 도시한다.
도 5는 병렬 컴퓨팅의 아키텍처를 도시한다.
도 6a는 구조적 변이의 존재 하에서 희귀 변이체를 도시하는 3개의 핵산 서열, 뿐만 아니라 구조적 변이 및 희귀 변이체 둘 다를 갖는 서열 (S**)과 중첩되는 리드를 도시한다.
도 6b는 구조적 변이 및 희귀 변이체 둘 다를 갖는 서열 (S**)과 중첩되는 리드와 "허용되는" 참조 서열 (S) 사이에 중첩의 결여를 도시한다.
도 6c는 도 6a로부터의 3개의 서열 중 2개를 혼입시키는 DAG를 도시한다.
도 6d는 도 6a로부터의 3개의 서열 중 2개를 혼입시키는 DAG에 대한 리드의 정렬을 도시한다.
도 6e는 도 6a로부터의 서열 중 모든 3개를 혼입시키는 DAG를 도시한다.
도 6f는 도 6a로부터의 서열 중 모든 3개를 혼입시키는 DAG에 대한 리드의 정렬을 도시한다.

본 발명은, 예를 들어 대상체로부터 취한 핵산 샘플에서 유전자 서열 내 구조적 변이 근처의 희귀 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 구조적 변이를 설명하는 참조 서열 구축물에 대해 리드 (예를 들어, 핵산 리드)를 정렬하는 방법, 구조적 변이 또는 구조적 변이 및 희귀 변이체를 설명하는 참조 서열 구축물을 구축하는 방법, 및 희귀 변이체를 확인하는 정렬 방법을 사용하는 시스템을 포함한다. 방법은 규모조정이 가능하며, 수천개의 염기 길이 또는 그 초과의 염기 길이의 구축물에 대해 수백만개의 리드를 정렬하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 참조 서열 구축물에 대한 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 아미노산 서열)을 정렬하는 방법, 참조 서열 구축물을 구축하는 방법, 및 상기 정렬 방법 및 구축물을 사용하여 정렬 및 조립체를 생성시키는 시스템을 포함한다. 상기 참조 서열 구축물은 하기 기재된 바와 같은 방향성 비순환 그래프 (DAG)일 수 있으나, 참조 서열은 구축물이 정렬용으로 포맷화된다는 전제하에, 종 내 상이한 유기체의 서열의 유전적 가변성을 반영하는 임의의 대표물일 수 있다. 상기 유전적 가변성은 또한 유기체 내의 상이한 조직 또는 세포 사이에 존재할 수도 있다. 일반적으로, 참조 서열 구축물은 샘플링된 서열 사이에 동일한 부분 및 가변적인 부분을 포함할 것이다. 따라서, 상기 구축물은 동일한 서열(들)을 포함하는 위치 (즉, 일부 정규 배열에 따른 것), 및 유전적 가변성을 반영하는 대안적 서열을 포함하는 일부 위치를 갖는 것으로 생각될 수 있다. 본 출원은 추가적으로 상기 구축물 내 위치에 대한 핵산 리드의 정렬에 기초하여 질환 또는 유전자형을 확인하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 유전자 서열분석 및 돌연변이 스크리닝 분야에 광범위하게 적용가능하다.

참조 서열 구축물

핵산 리드를 정렬하고 유전자형 결정하는데 단일 참조 서열을 사용하는 선행 기술 서열 정렬 방법과 달리, 본 발명은 종, 집단 내에 또는 심지어 단일 유기체 내의 상이한 세포 사이에서 유전자 서열의 가변성을 설명할 수 있는 구축물을 사용한다. 유전자 변이의 대표물은 방향성 비순환 그래프 (DAG) (상기에서 논의됨) 행-칼럼 정렬 행렬, 또는 데브루잉(deBruijn) 그래프로 제시될 수 있으며, 이들 구축물은 정렬 알고리즘의 파라미터가 적절하게 설정된다는 전제하에, 본 발명의 정렬 방법과 함께 사용될 수 있다 (하기에서 논의됨).

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 구축물은 방향성 비순환 그래프 (DAG), 즉 방향을 가지며 순환하지 않는 경로를 갖는 것이다. (즉, 서열 경로는 1회 초과로 참조 구축물 상의 위치를 통과할 수 없다.) DAG에서, 서열 내 유전자 변이는 대안적 노드로 나타내어진다. 상기 노드는 보존된 서열, 또는 유전자, 또는 간단히 핵산의 부문일 수 있다. 구축물을 통과하는 상이한 가능한 경로는 알려져 있는 유전자 변이를 나타낸다. DAG는 유기체의 전체 게놈에 대해 구축될 수 있거나, 또는 DAG는 게놈의 일부분, 예를 들어 염색체 또는 보다 작은 유전자 정보 분절에 대해서만 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, DAG는 1000개 초과의 핵산, 예를 들어 10,000개 초과의 핵산, 예를 들어 100,000개 초과의 핵산, 예를 들어 1,000,000개 초과의 핵산을 나타낸다. DAG는 종 (예를 들어, 호모 사피엔스(homo sapiens)) 또는 선택된 집단 (예를 들어, 유방암을 갖는 여성), 또는 심지어 보다 작은 하위집단, 예컨대 동일한 개체 내에서 상이한 종양 세포 사이에서의 유전자 변이를 나타낼 수 있다.

DAG 구축물의 간단한 예가 도 1에서 도시된다. 도 1a에 도시된 바와 같이, DAG는 서열 1: CATAGTACCTAGGTCTTGGAGCTAGTC로서의 도 1a에 도시된 참조 서열로 시작한다. 실제로, 참조 서열은 종종 훨씬 더 길며, 전체 게놈일 수도 있다. 상기 서열은 전형적으로 FASTA 또는 FASTQ 파일로 저장된다. (FASTQ는 차세대 서열분석기로부터 생성된 서열 데이터를 위한 디폴트 포맷이 되었음). 일부 실시양태에서, 참조 서열은 GRCh37과 같은 표준 참조일 수 있다. 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 서열 내 각각의 문자 (또는 기호)는 실제로 뉴클레오티드 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드) 또는 아미노산 (예를 들어, 히스티딘, 류신, 리신 등)에 대응한다.

다음 단계에서, 도 1a의 하부 영상에 도시된 바와 같이, 변이체가 참조 서열에 부가된다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 변이체는 도면에서 선 사이에 있는 참조로부터의 서열 "AG"의 결실, 즉 서열 2이다. 그래프 상에서, 이러한 결실은 결실 전 및 후에서 참조 서열을 노드로 절단하는 것, 및 노드 사이에 2개의 스트링을 삽입하는 것으로 나타내어진다. 상이한 경로가 참조 구축물 내에 대안적 서열을 생성한다. 경로 중 하나는 참조 서열에 대해 통상적인 서열을 나타내고, 경로 중 하나는 참조 서열에 대해 비통상적인 서열을 나타낸다. 도 1a에서, 노드 사이의 한 경로는 참조 서열에 대해 통상적인 서열을 나타내는 반면, 다른 경로는 참조 서열에 대해 비통상적인 결실을 나타낸다. 실제로, 변이체는 1000 게놈스 프로젝트(Genomes Project) 웹사이트에서 찾을 수 있는 것과 같은 변이체 지명 포맷 (VCF) 파일의 등재물을 적용하는 것에 의해 DAG에 지명된다. 각각의 VCF 파일이 특정 참조 게놈에 대해 맞추어져 있기 때문에, 스트링이 어디에 위치되어야 하는지를 확인하는 것은 어렵지 않다. 실제로, 도 2에 디스플레이된 바와 같이, VCF 파일의 각각의 등재물은 참조와 조합되어 별도의 그래프를 생성시키는 것으로 생각될 수 있다. 도 2의 VCF 등재물이 도 1의 VCF 등재물에 대응하는 것은 아님에 주목한다.

도 1b로 이동하여, 특정 위치에서의 삽입 "GG"에 대응하는 제2 VCF 등재물이 첨가되어 확장된 DAG, 즉 서열 3 및 서열 4를 포함하는 것이 생성된다. 다음에, 제3 VCF 등재물이 첨가되어 참조 서열에서 초기의 SNP를 설명하는 확장된 DAG, 즉 서열 5-8을 포함하는 것이 생성될 수 있다. 따라서, 3개의 단계로, 핵산 리드가 정렬될 수 있는 DAG가 생성되었다 (하기에서 논의됨).

DAG 참조 구축물에서, 서열 경로 (참조에 대해 통상적 및 비통상적인 서열)는 둘 다 대상체의 서열에 포함될 수 있는 대안적 서열을 나타내기 때문에 참조 구축물 내 변이체로 간주된다.

실제로, DAG는 각 노드가 스트링, 일련의 모 노드 및 위치에 의해 정의되는 노드의 세트 S로서 컴퓨터 메모리 (하드 디스크, 플래시, 클라우드 메모리 등)에 나타내어진다. 상기 스트링은 노드의 "내용", 즉 서열이며; 모 노드는 그래프 내 다른 노드에 대해 노드의 위치를 정의하고; 노드의 위치는 시스템에서의 일부 정규 배열, 예를 들어 참조 게놈에 대비한 것이다. 참조 서열에 대해 그래프를 엄격하게 정의할 필요는 없지만, 그것은 출력 데이터의 조작을 보다 간단하게 만든다. 물론, S에 대한 추가의 제약은 그것이 루프를 포함할 수 없다는 것이다.

이러한 DAG 방법을 보다 큰 구조로 외삽하면, 주어진 참조 영역에 있어서 유전자 서열 내 알려져 있는 변이를 나타내는 수천개의 VCF 등재물을 혼입시키는 DAG를 구축하는 것이 가능하다. 그럼에도 불구하고, DAG가 보다 커지면서 컴퓨팅이 보다 오래 걸리기 때문에, 많은 적용분야에서 단지 서열의 일부분, 예를 들어 염색체만을 나타낼 수 있는 보다 작은 DAG가 사용된다. 다른 실시양태에서, DAG는 DAG에 의해 포괄되는 집단의 크기를 감소시키는 것, 예를 들어 유방암 내 변이를 나타내는 DAG로부터 삼중 음성 유방암 내 변이를 나타내는 DAG로 가는 것에 의해, 보다 작아질 수 있다. 대안적으로, 전형적으로 DAG의 보다 큰 부분이 샘플 사이에서 일관되도록 하는, 용이하게 확인된 유전자 마커를 기반으로 맞춤제작되는 보다 긴 DAG가 사용될 수 있다. 예를 들어, 아프리카-혈통 여성으로부터의 일련의 핵산 리드를 정렬하는 것은, 동일한 서열에 걸쳐 인간에서 알려져 있는 모든 변이를 설명하는 DAG와 비교하여 아프리카 혈통 여성으로부터의 VCF 등재물을 사용하여 생성된 DAG에 대하여 보다 신속하게 된다. 본 발명의 DAG는 그것이 새롭게 확인된 돌연변이를 혼입시키는데 시간 경과에 따라 변형될 수 있다는 점에서 동적 구축물이라는 것을 인식하여야 한다. 추가적으로, 정렬 결과가 재귀적으로 DAG에 첨가되는 알고리즘이 또한 가능하다.

스트링-대-DAG 정렬의 경우에, 갭 삽입이 훨씬 더 많은 대가를 치름으로써 전체 서열에서 새로운 갭을 개방하는 것 보다는 서열에 대한 정렬을 선호하도록, 갭 벌점이 조정될 수 있다. 물론, (상기에서 논의된) DAG의 개선으로, 돌연변이가 DAG 내에 설명되어 있기 때문에 갭의 발생은 훨씬 더 감소되어야 한다.

정렬 알고리즘

한 실시양태에서, 방향성 비순환 그래프 (DAG)에 대하여 서열 리드를 정렬하기 위한 알고리즘이 사용된다. 배경기술에서 표현된 알고리즘과 달리, 상기 정렬 알고리즘은 DAG (예를 들어, 참조 서열 구축물) 상의 위치에 함유되어 있는 각각의 서열에 대해 최대 점수를 확인하는 것에 의해 C_i,j의 최대값을 확인한다. 실제로, 선행 위치에서 "뒤쪽으로" 탐색하는 것에 의해, 복수의 가능한 경로에 걸친 최적 정렬을 확인하는 것이 가능하다.

본 발명의 알고리즘은 상기에서 논의된 리드 ("스트링"으로도 알려져 있음) 및 방향성 비순환 그래프 (DAG) 상에서 수행된다. 알고리즘을 정의할 목적으로, S를 정렬되는 스트링이라 하고, D를 S가 정렬되는 방향성 비순환 그래프라 한다. 스트링 S의 요소는 1에서 시작하는 지수로 괄호화된다. 따라서, S가 스트링 ATCGAA인 경우에, S[1] = A, S[4] = G 등이다.

DAG의 경우에, 노드 서열의 각각의 문자는 별도의 요소 d로 나타내어질 것이다. d의 선행자는 하기와 같이 정의된다:

(i) d가 그의 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우에, 그의 노드에서 d에 선행하는 문자가 그의 (유일한) 선행자이고;

(ii) d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, d의 노드의 모체인 임의의 노드 서열의 최종 문자가 d의 선행자이다.

모든 선행자의 세트는 다시 P[d]로 나타내어진다.

"최고" 정렬을 찾아내기 위해, 알고리즘은 S의 제1 j 요소와 d에 선행하는 (및 그것을 포함하는) DAG 부분과의 최적 정렬의 점수인 M[j,d] 값을 탐색한다. 이러한 단계는 배경기술 부문의 방정식 1에서 H_i,j를 찾는 것과 유사하다. 구체적으로, M[j,d]를 결정하는 것은 하기에서 정의되는 바와 같이 a, i, e 및 0의 최대값을 찾는 것을 수반한다:

여기서

e = P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j,p*] + 결실_벌점}

i = M[j-1, d] + 삽입_벌점

a = S[j]=d인 경우, P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j-1,p*] + 매치_점수}

S[j]≠d인 경우, P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j-1,p*] + 미스매치_벌점}.

상기 기재된 바와 같이, e는 S의 제1 j 문자와 d를 포함하지 않는 d 이전 DAG 부분과의 최고의 정렬 더하기 추가의 결실_벌점이다. 따라서, d가 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우라면, 하나의 선행자 p만이 존재하고, S의 제1 j 문자와 DAG (p 이전 및 p 포함)와의 정렬 점수는 M[j,p] + 결실_벌점과 같다. d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, 다수의 가능한 선행자가 존재할 수 있고, 결실_벌점은 일정하기 때문에, [M[j,p*] + 결실_벌점]을 최대화하는 것은 S의 제1 j 문자와 최고의 정렬 점수를 갖는 선행자를 선택하는 것과 동일하다.

방정식 6에서, i는 스트링 S의 제1 j-1 문자와 d 이전 및 d 포함 DAG와의 정렬 더하기 삽입_벌점으로써, SW에서의 삽입 인수의 정의와 유사하다 (방정식 1 참조).

추가적으로, a는 S의 제1 j 문자와 d를 포함하지 않는 d 이전 DAG 부분과의 최고의 정렬 더하기 매치_점수 (S의 j번째 문자가 문자 d와 동일한 경우) 또는 미스매치_벌점 (S의 j번째 문자가 문자 d와 동일하지 않은 경우)이다. e에서처럼, 이것은 d가 그의 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우라면, 하나의 선행자, 즉 p만이 존재한다는 것을 의미한다. 그것은 a가 S의 제1 j-1 문자와 DAG (p 이전 및 p 포함)와의 정렬 점수, 즉 M[j-1,p]이며, S의 d 및 j번째 문자가 매치되는지 여부에 따라 미스매치_벌점 또는 매치_점수가 첨가된다는 것을 의미한다. d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, 다수의 가능한 선행자가 존재할 수 있다. 이와 같은 경우, {M[j,p*] + 미스매치_벌점 또는 매치_점수}를 최대화하는 것은 S의 제1 j-1 문자와 최고의 정렬 점수를 갖는 선행자 (즉, M[j-1,p*] 인수 후보 중 최고의 것)를 선택하고, S의 d 및 j번째 문자가 매치되는지 여부에 따라 미스매치_벌점 또는 매치_점수를 첨가하는 것과 동일하다.

다시, 배경기술에서 논의된 SW 알고리즘에서와 같이, 보다 적은 갭 등을 사용한 정렬을 촉진하기 위해 벌점, 예를 들어 결실_벌점, 삽입_벌점, 매치_점수 및 미스매치_벌점이 조정될 수 있다.

상기 방정식에 기재된 바와 같이, 알고리즘은 그 요소에 대한 삽입, 결실 및 매치 점수를 계산하는 것뿐만 아니라 DAG 상의 임의의 선행 노드를 (DAG 방향의 반대로) 뒤쪽으로 탐색함으로써 최대 점수를 찾는 것에 의해서도 각각의 리드에 대한 최대값을 찾는다. 따라서, 알고리즘은 알려져 있는 돌연변이를 함유하는 DAG를 통한 상이한 경로를 이동할 수 있다. 그래프가 방향성이기 때문에, 그래프의 방향에 반대로 움직이는 백트랙은 그래프의 기점 쪽으로 바람직한 변이체 서열을 쫓으며, 최대 정렬 점수로써 높은 확실도 안에서 가장 가능성 있는 정렬을 확인한다. 상기 방정식이 "최대"값으로 나타내어지기는 하였지만, "최대"는 예를 들어 모든 방정식에서 기호를 전환하고 최소값에 대하여 풀이하는 것을 비롯한 임의의 형태의 최적화를 포괄하고자 의도된다.

개시된 알고리즘의 실행을 도 3에 도시하며, 여기서 참조 서열인 서열 10: TTGGATATGGG 및 알려져 있는 삽입 사례인 서열 11: TTGGATCGAATTATGGG (여기서 삽입은 밑줄표시됨)을 나타내는 DAG에 대하여 서열 "ATCGAA"가 정렬된다. 도 3의 A는 DAG와 비교되는 리드의 그림 표현을 도시하는 반면, 도 3의 B는 비교에 대응하는 실제 행렬을 도시한다. 배경기술에서 논의된 스미스-워터맨 기술과 마찬가지로, 본 발명의 알고리즘은 최고 점수를 확인하고 백트랙을 수행하여 리드의 적절한 위치를 확인한다. 도 3의 A 및 B는 또한 본 발명이 구축물에 대하여 스트링의 실제 매치를 생성시키는 반면, 알려져 있는 방법 (예를 들어, SW)은 참조의 잘못된 부분에 대해 스트링을 정렬하거나 또는 충분하게 높은 정렬 점수를 생성시키지 않는다는 이유로 스트링이 정렬에 포함되는 것을 거부하게 될 가능성이 보다 많아진다는 것을 강조하고 있다. 서열 리드가 DAG에 포함되어 있지 않은 변이체를 포함하는 경우에, 정렬된 서열은 갭, 삽입 등으로 기록될 것이다.

참조 서열 구축물의 적용

본 발명의 참조 구축물 및 정렬 알고리즘의 한 이익은 참조 서열 구축물의 특정 위치에 있는 제1 서열 또는 제2 서열에 대해 서열 리드를 정렬시키는 그의 능력이다. 즉, 본 발명의 참조 서열 구축물은 서열 리드를 특정 위치에 있는 적어도 2개의 상이한 서열 경로 (예를 들어, 참조 서열과 동등한 서열을 따르는 한 경로 및 변이체 (예를 들어 돌연변이, 다형성, 카피수 변이)를 포함하는 참조 서열과 동등한 알려져 있는 서열을 따르는 또 다른 경로) 중 1개에 대하여 정렬되도록 한다. 따라서, 서열 내 알려져 있는 변이는 본 발명의 기술을 사용하여 알려져 있는 변이를 함유하는 리드를 변이를 포함하는 서열 경로에 대해 정렬시킴으로써 신뢰할만하게 설명되고 확인될 수 있다.

변이 (또한 변이체로서 지칭됨)는 참조 서열 구축물 내 특정 위치에 2개 이상의 대안적 서열 (즉, 상이한 서열이 2개 이상의 경로를 형성하는 경우에) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 의미에서, 참조 서열 구축물은 여러 참조 집단/데이터 세트와 연관된 서열분석 데이터를 혼입시키기 때문에, DAG 구축물 내 임의의 대안적 서열은 변이체로 간주된다. 구축물의 참조 서열은 DAG에 대한 기준선으로서 사용된 임의의 서열이고, 분석에 사용되는 전형적으로 긴 서열이며, 전체 게놈의 부분 또는 전체 게놈일 수 있다. 참조 서열은 특정 종 (예를 들어 호모 사피엔스)에 대해 통상적인 서열일 수 있거나 또는 특정 환자 집단 (예를 들어 암 환자)에 대해 통상적일 수 있다.

특정 실시양태에서, 변이체는 참조 서열에 대해 통상적인 서열 또는 비통상적인 서열로 간주될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 통상적인 서열 변이체는 기준선으로서 선택된 참조 서열을 따르는 참조 구축물 내 임의의 서열 경로이다. 이에 따라, 서열 변이가 참조 서열에 대해 "통상적"인지 "비통상적"인지의 여부는 기준선 참조 서열로 무엇이 선택되는지에 달려 있다. 예를 들어, 특정 위치에서의 참조 구축물은 정상적인 건강한 개체에 대해 통상적인 제1 서열 경로 및 유방암을 가진 개체에 대해 통상적인 돌연변이를 가진 제2 서열 경로를 포함할 수 있다. 기준선 참조가 유방암 환자에 대해 통상적인 참조 서열인 경우라면, 정상적인 건강한 개체에 대해 지시된 제1 서열 경로가 비통상적인 변이체이고, 유방암 개체에 대한 제2 서열 경로가 통상적인 변이체이다. 기준선 참조가 정상적인 건강한 개체에 대해 통상적인 참조 서열인 것으로 간주되는 경우라면, 정상적인 건강한 개체에 대해 지시된 제1 서열 경로가 통상적인 변이체이고, 유방암 환자에 대해 지시된 제2 서열 경로가 비통상적인 변이체이다.

참조 구축물의 상이한 경로는 유리하게는 큰 알려져 있는 서열 편차를 갖는 서열 리드가 후속 분석을 위해 구축물에 대해 성공적으로 정렬되도록 하는 반면, 전통적인 1차원 참조 서열은 낮은 정렬 점수로 인해 이러한 큰 편차를 거부한다. 종종 구조적 변이체로 지칭되는 큰 알려져 있는 서열 변이는 전형적으로 1 Kb 내지 3Mb 크기이다. 그러나, 본 출원의 목적상, 구조적 변이체는 서열 리드 내 임의의 큰 서열 변이체를 포함할 수 있으며, 이는 그의 크기 때문에 서열 리드가 선형 참조 서열에 대해 정렬되는 것을 방지하거나 또는 참조 서열에 대해 매우 불량하게 (예를 들어 낮은 정렬 점수로) 정렬된다. 특정 실시양태에서, 구조적 변이체의 서열 길이는 약 100 bp, 200, bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800, bp, 1 Kb, 1.1. Kb, 1.2 Kb, 1.3 Kb, 1.4 Kb, 1.5 Kb, 1.6 Kb, 1.7 Kb, 1.8 Kb, 1.9 Kb, 2.0 Kb...2.0 Mb, 2.1 Mb, 2.2 Mb, 2.3 Mb, 2.4 Mb, 2.5 Mb, 2.6 Mb, 2.7 Mb, 2.8 Mb, 2.9 Mb, 3.0 Mb 등이다. 구조적 변이는 이들이 유전적 다양성 및 질환 감수성에 대한 원인이 되므로 대상체에게 중요한 통찰을 제공한다.

본 발명과 달리, 전통적인 정렬 방법 (예를 들어 선형 참조 서열)은 구조적 변이를 확인할 가능성이 없고, 구조적 변이 근처에 위치한 희귀 변이체를 확인할 가능성은 훨씬 더 없다. 희귀 변이체는 주어진 집단에서 낮은 가능성으로 발견되는 임의의 돌연변이 (예컨대 삽입결실 또는 다형성)를 포함한다. 예를 들어, 희귀 변이체는, 예를 들어 25% 이하; 20% 이하; 15% 이하; 10% 이하; 또는 5% 이하의 범위의 부차 대립유전자 빈도를 가질 수 있다. (부차 대립유전자 빈도 (MAF)는 주어진 집단에서 가장 적은 통상적인 대립유전자가 발생하는 빈도를 지칭한다.) 일부 경우에, 희귀 변이체는 아직 확인되지 않은 변이체를 포함하며, 즉 그 변이체는 리드가 정렬되는 참조에는 나타나지 않는다. 일부 경우에, 희귀 변이체는 VCF 파일에 목록화되지 않았다. 정렬 메카니즘의 관점에서, 이러한 변이체는 효과적으로, 샘플의 집단에서 그의 실제 빈도와는 상관없이 전에 결코 관찰된 적이 없다. 구조적 변이체 근처에 위치한 희귀 변이체는 약 리드의 길이만큼, 즉 약 100 bp 이하만큼 구조적 변이체로부터 이격되어 있을 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 이격으로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 구조적 변이체 근처에 위치한 희귀 변이체는 희귀 변이체 사이에서 이격되고, 구조적 변이체는 약 1 bp 내지 약 1 Mbp, 예를 들어 약 10 bp 내지 약 10,000 bp, 예를 들어 약 100 bp 내지 약 1000 bp의 범위일 수 있다.

전통적인 정렬 방법은 2개 인자의 조합 때문에 구조적 변이체 근처의 희귀 변이체를 인식하지 못한다. 첫번째로, 전통적인 정렬 방법은 대상체의 리드를, 구조적 변이 (심지어 그것이 알려져 있더라도)를 고려하지 않은 단일 선형 참조 서열에 대해 정렬한다. 두번째로, 희귀 변이체를 함유하는 거의 모든 리드는 또한 구조적 변이체를 함유할 것이다. 희귀 변이체와 구조적 변이체 사이의 염기 이격이 감소함에 따라, 희귀 변이체를 함유하는 보다 많은 리드가 또한 구조적 변이체를 함유할 것이다. 이들 두 인자는 구조적 변이체 및 희귀 변이체 둘 다를 함유하는 서열 리드가 정렬되지 못하게 될 기회를 유의하게 증가시킨다. 구조적 변이체가 크고 참조 서열에 반영되지 않으므로, 그와 중첩되는 리드는 "정렬불가능한" 것 (즉, 그의 임의의 부분에 매치되기에는 참조와 너무 상이함)으로서 정렬 알고리즘에 의해 거부될 것이다. 그러한 경우에, 구조적 변이체 및 희귀 변이체 둘 다는 폐기된다. 구조적 변이체 및 희귀 변이체를 갖는 리드와 선형 참조 서열 상의 상기 리드의 대응하는 "적절한" 게놈 위치 사이의 매치의 결여는 게놈 상의 부정확한 위치에 대한 리드의 정렬을 유발할 수 있다. 리드 또는 그의 부분이 올바른 일반적 위치에 대해 정렬될지라도, 매칭 알고리즘은 허용가능한 정렬을 달성하려는 시도에 있어서 희귀 돌연변이를 누락시킬 가능성이 있을 것이다. 이것은 변이체가 리드가 정렬되는 참조에는 나타나지 않을 때 특히 가능성이 있다. 희귀 변이체를 간신히 정확하게 정렬하고 그를 함유하는 임의의 리드는 불량한 정렬 품질 및 낮은 수의 정렬 (이들 둘 다는 정렬이 단지 무작위 오류라는 것을 시사함)로 인해 덜 신뢰할만한 것으로 처리될 것이다. 큰 알려져 있는 구조적 변이체가 불량한 판독 신뢰성에도 불구하고 알려져 있다는 이유로 여전히 지명될 수 있지만, 희귀 변이체는 통상적으로 알려져 있는 구조적 변이체와 비교하여 잡음/오류로서 분류되어 폐기된다.

희귀 변이체는 상당한 위험성의 질환을 초래하는 것으로 일반적으로 받아들여지기 때문에, 서열 조립 동안에 희귀 변이체를 검출하는 능력을 최대화하는 것이 매우 중요하다. 본 발명의 참조 구축물은, 본 발명의 참조 구축물이 임의의 알려져 있는 구조적 변이체를 설명할 수 있기 때문에 정렬 과정 동안에 구조적 변이체 및 희귀 변이체의 비정렬을 최소한다. 참조 구축물 내 특정 위치에 적어도 2개의 구조적 변이체를 포함시킴으로써, 본 발명은 구조적 변이체 중 적어도 1개의 일부분을 포함하는 서열 리드가 참조 구축물에 대해 정렬되도록 한다. 즉, 알려져 있는 구조적 변이체의 일부분을 포함하는 서열 리드는 정렬되고 설명되는 반면, 동일한 구조적 변이체는 선형 참조 구조에서는 정렬되지 못할 것이다. 본 발명의 결과는 구조적 변이체를 포함하는 리드가 미스매치보다는 매치로서 처리되기 때문에 높은 정도의 신뢰성 및 정확도로 DAG에 대해 적절하게 정렬될 수 있다는 것이다.

구조적 변이체가 적절하게 정렬되는 경우에, 구조적 변이체를 갖는 서열 리드의 일부인 다른 서열 데이터는 마찬가지로 참조 구축물에 대해 정렬된다. 예를 들어, (서열 리드가 구조적 변이체 및 희귀 변이체의 적어도 부분을 포함하도록) 구조적 변이체에 가까운 희귀 변이체는 구조적 변이체와 함께 참조 구축물에 대해 정렬될 것이다. 따라서, 구조적 변이체 옆의 희귀 변이체는 서열 리드 내 구조적 변이체의 DAG 참조 구축물에 대한 적절한 정렬 때문에 다수의 달리 잘-정렬된 신뢰할만한 리드에 존재할 것이다. 희귀 변이체의 일관된 존재는, 그 변이체가 참조 구축물에 나타나지 않을 지라도, 그것을 서열분석 오류보다는 타당한 유전자 변이체로서 인식되도록 야기한다.

도 6a-6f는 구조적 변이체 근처의 희귀 변이체를 확인하기 위한 본 발명의 참조 구축물의 사용을 도시한다. 도 6a는 각각 50개 뉴클레오티드 길이인 3개의 가설 서열을 요약한다: 참조 서열 S (서열 14), 구조적 변이를 갖는 서열 S* (서열 15), 및 구조적 변이 및 희귀 변이체를 갖는 서열 S** (서열 16). 서열 S* 및 서열 S**는 참조 서열 S에 대해, 제26 위치에서부터 제50 위치에 걸친 알려져 있는 구조적 변이를 포함한다. 실제로, 구조적 변이는 전형적으로 100 bp 초과이다. 도 6a-6f에 도시된 구조적 변이의 길이는 예시적 목적을 위한 것이다. 도 6a-6f 전체에 걸쳐 도시된 바와 같이, 알려져 있는 구조적 변이는 볼드체 및 강조표시되어 있다. 서열 S**는 참조 서열 S에 대해, 위치 23에서 G가 T로 대체된 치환 돌연변이인 희귀 변이체를 포함한다. 도 6a는 또한 제20 위치에서부터 제34 위치에 걸친 서열 S**의 서열 리드 (리드 1로 지칭됨)를 도시한다. 따라서, 리드 1은 구조적 변이체의 일부분 (제26 위치에서부터 제34 위치) 및 제23 위치의 희귀 변이체를 포함한다. 실제로, 서열 리드 및 구조적 변이는 도 6에 도시된 것보다 더 길 가능성이 있다. 추가적으로, 희귀 변이체는 구조적 변이로부터의 추가의 것일 수 있다.

도 6b는 참조 서열 S에 대한 서열 S**의 리드 1의 정렬을 도시한다. 특히, 도 6b는 전통적인 선형 형태의 참조 서열 S에 대해 서열 S**의 리드 1을 정렬할 수 없다는 것을 도시한다. 선형으로 정렬될 때, 리드 1에서 대부분의 뉴클레오티드는 위치 20에서부터 위치 34까지 참조 서열과 상이하다. 미스매치에도 불구하고, 리드 1은 이상적으로는 희귀 및 구조적 서열 변이를 적절하게 밝혀내기 위해 위치 20에서부터 위치 34까지 참조 서열에 대해 정렬될 것이다. 그러나, 높은 수준의 미스매치로 인해, 스미스-워터맨 또는 니들만-분쉬와 같은 알고리즘은 정렬에 실제로 요구되는 사용되는 품질 역치를 충족시킬 점수를 리드 1에 할당할 가능성이 없다. 그 결과, 리드 1은 위치 20에서부터 위치 34까지 선형 참조 서열에 대해 정렬되지 못할 것이고, 리드 1로부터의 데이터는 거부될 것이다. 추가로, 참조 서열이 게놈 (도시된 50개 뉴클레오티드 초과의 다수의 자릿수)에 걸쳐있는 경우에, 리드 1은 참조 서열 상의 또 다른 부정확한 위치에서 보다 높은 매칭 점수를 가질 가능성이 있다.

도 6c-6d는 본 발명의 DAG 참조 구축물을 사용하는, 알려져 있는 구조적 변이체 근처의 알려져 있지 않은 희귀 변이체의 정렬을 도시한다. 도 6c는 참조 서열 S 및 서열 S* 둘 다로부터의 서열분석 데이터를 혼입시키는 DAG를 도시한다. 도 6c에 도시된 바와 같은 DAG 참조 구축물 1은 참조 서열 S에 대해 통상적인 서열 변이체를 따르는 참조 경로 (1) 및 서열 S* 및 S**에 존재하지만 참조 서열 S에 대해 비통상적인 알려져 있는 구조적 변이체를 따르는 참조 경로 (2)를 포함한다. 도 6d는 DAG 참조 구축물 1에 대한 S**의 리드 1의 정렬을 도시한다. 도시된 바와 같이, 리드 1은 알려져 있는 구조적 변이체를 갖는 경로를 따르기 때문에 리드 1은 DAG와 거의 완벽하게 정렬된다. 리드 1과 DAG 참조 구축물 1 사이의 유일한 미스매치는 위치 23에서의 희귀 변이체 (즉, 위치 23에서의 T 치환)이다. 소수 미스매치로 인해, 정렬 알고리즘은 리드 1을 정확한 위치에 대해 정렬할 가능성이 가장 클 것이고, 이러한 정렬은 품질 역치 초과로 점수화될 것이다. 이러한 정렬은 서열 점수의 고품질로 인해 서열 S**에서 희귀 변이체를 신뢰할만하게 확인하도록 한다. 달리 잘 정렬되고 높은 점수화 리드의 일부인 것에 의해, DAG 참조 구축물 1에 대한 리드 1의 정렬은 위치 23에서의 알려져 있지 않은 희귀 변이체를 서열분석 오류가 아닌 타당한 돌연변이로서 확인하도록 한다.

도 6e-6f는 본 발명의 DAG 참조 구축물을 사용하는, 알려져 있는 구조적 변이체 근처의 알려져 있는 희귀 변이체의 정렬을 도시한다. 도 6e에 도시된 바와 같이, DAG는 참조 서열의 위치 23에서의 G-T 치환으로 인한 참조 구축물 내 변이체를 설명하기 위한 참조 경로 (1) 및 (2), 및 위치 26에서부터 위치 50까지의 범위의 알려져 있는 구조적 변이체로 인한 참조 구축물 내 변이체를 설명하기 위한 참조 경로 (3) 및 (4)를 포함한다.

병렬화 기회

스미스-워터맨-고토 알고리즘의 순차적 버전은 대규모 병렬화에 적합화되고 유의하게 변형되었다. 예를 들어, 연상 대규모 병렬성(Associative Massive Parallelism)을 사용하는 스미스-워터맨 (SWAMP)으로 지칭되는 ASC 모델이 미국 특허 공개 번호 2012/0239706에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. SWAMP (및 다른 병렬 프로세싱 시스템)를 위한 병렬화 부분은 임의의 역대각선에 따르는 값이 서로 독립적이라는 사실에서 유래한다. 따라서, 주어진 역대각선에 따르는 모든 셀은 컴퓨팅 자원을 분포시키도록 병렬로 수행될 수 있다. 상기 재귀적 방정식에서 나타난 데이터 의존성은 달성가능한 병렬화의 수준을 제한하지만, 파면 접근법을 사용함으로써 여전히 이러한 유용한 알고리즘의 속도를 증가시킬 것이다. 선 울트라 스파크(Sun Ultra SPARC)에서 워즈니악(Wozniak)에 의해 실행된 파면 접근법 (Comput Appl in the Biosciences (CABIOS), 13(2):145-150, 1997)은 특수 SIMD-유사 비디오 명령을 사용한다. 워즈니악은 SIMD 레지스터를 사용하여 마이너 대각선에 병렬인 값을 저장함으로써, 동일한 기계 상에서의 전통적인 실행에 비해 2배 속도증가를 기록하였다. 워즈니악의 예에 따르면, 코드를 병렬화하는 유사한 방식은 x86 아키텍처에 대해 설정되는 스트리밍 SIMD 확장 (SSE)을 사용하는 것이다. 인텔(Intel)에 의해 설계된 벡터-유사 연산이 소수개 (통상적으로 4, 8 또는 16개)의 값에서 한번에 단일 연산/명령을 완료한다. 많은 AMD 및 인텔 칩이 다양한 버전의 SSE를 지원하는데, 인텔은 그의 현대 칩셋을 위한 고급 벡터 확장(Advanced Vector Extension) (AVX)을 사용하여 이러한 기술을 계속 개발하여 왔다.

다른 실행에서, 로그네스(Rognes)와 시베르그(Seeberg) (Bioinformatics (Oxford, England), 16(8):699-706, 2000)는 SSE의 선행자, MMX SIMD 명령과 함께 인텔 펜티엄 프로세서를 그의 실행에 사용한다. 파얼라인(ParAlign)을 위한 로그네스와 시베르그의 작업으로부터 개발된 접근법 (Bioinformatics, 16(8):699-706, 2000)은 파면 접근법을 사용하지 않는다 (Rognes, Nuc Acids Res, 29(7):1647-52, 2001; Saebo et al., Nuc Acids Res, 33(suppl 2):W535-W539, 2005). 대신에, 그들은 질의 서열에 대해 병렬로 SIMD 레지스터를 정렬함으로써, 사전-컴퓨팅 질의-특이적 점수 행렬을 사용하여 8개의 값을 한번에 컴퓨팅한다. 이러한 방법의 추가의 상세한 설명은 본원에 참조로 포함되는 U.S. 7,917,302에서 찾아볼 수 있다. 로그네스와 시베르그가 SIMD 레지스터를 레이아웃하는 방식에서, 노스 네이버 의존성은 SSE 병렬 "벡터" 계산으로부터 획득되는 잠재적 속도증가의 3분의 1까지를 제거할 수 있었다. 이것을 극복하기 위해, 그들은 SWAT-유사 최적화를 혼입시킨다. 큰 아핀 갭 벌점에서는, 노스 네이버가 대부분의 경우 0이 될 것이다. 이것이 사실인 경우, 프로그램은 파라(Farrar)에 의해 "느린 F 평가"로 지칭되는 (Bioinformatics, 23(2):156-161, 2007) 노스 네이버의 값을 컴퓨팅하는 것을 생략할 수 있다. 로그네스와 시베르그는 방정식 1의 계산 횟수를, 그것이 특정 역치 미만인 경우 생략하는 것에 의해 감소시킴으로써, 그의 알고리즘의 속도를 증가시킬 수 있다. 문헌 [Rognes and Seeberg, Bioinformatics, 16(8):699-706, 2000]에서는 MMX/SSE 명령 및 SWAT-유사 확장을 통해 8-원 벡터를 사용함으로써, 6배 속도증가를 기록하였다.

파라에 의해 수행된 SSE 작업 (Bioinformatics, 23(2):156-161, 2007)에서는 질의 레지스터에 병렬로 SIMD 레지스터를 라인업하는데 스트리핑 또는 스트라이딩 패턴의 액세스가 사용된다. 그렇게 하는 것은 어떠한 중첩 의존성도 피한다. 다시 SWAT-유사 최적화를 혼입시키는 것 (Farrar, Bioinformatics 23(2):156-161, 2007)은 워즈니악 (CABIOS 13(2):145-150, 1997) 및 로그네스와 시베르그 (Bioinformatics (Oxford, England), 16(8):699-706, 2000) SIMD 실행에 비해 2-8배 속도증가를 달성한다. 블록 치환 행렬, 및 노던 (F) 조건문이 해당 내부 루프 밖으로 이동되는 효율적이고 독창적인 내부 루프는 중요한 최적화이다. 프로세싱을 위한 16개 8-비트 요소의 스트라이딩 메모리 패턴 액세스는 메모리 액세스 시간 역시 개선함으로써, 전체 속도증가에 기여한다.

파라 (Sequence Analysis, 2008)는 그의 작업을 소니(Sony), 도시바(Toshiba) 및 IBM에 의해 제작된 셀 프로세서로 확장하였다. 이러한 셀 프로세서는 하나의 주 코어와 8개의 부 코어를 가진다. 셀 브로드밴드 엔진(Cell Broadband Engine)은 모두 파라의 스트리핑 접근법을 사용하는 스잘코우스키(Szalkowski) 등 (BMC Res Notes 1(107), 2008)의 SWPS3 및 위라완(Wirawan) 등 (BMC Bioinformatics 9 (377) 2008)의 CBESW를 비롯한 여러 추가의 스미스-워터맨 실행의 개발 플랫폼이었다. 루드니키(Rudnicki) 등 (Fund Inform. 96, 181-194, 2009)은 PS3을 사용하여 다수의 데이터베이스 서열에 걸친 병렬화를 사용하는 방법을 개발하였다.

로그네스 (BMC Bioinformatics 12 (221), 2011)는 또한 다수의 데이터베이스 서열을 병렬로 프로세싱하는 SWIPE로 지칭되는 다중-연결 접근법을 개발하였다. 초점은 "일반 CPU"에서 SIMD 접근법을 사용하는 것이었다. 조립 병렬화 스플릿을 사용하는 이러한 조사에서, 병렬로 다수의 데이터베이스 서열을 사용하는 작업은 류(Liu) 등 (BMC Res Notes 2(73), 2009) 및 리고우스키(Ligowski)와 루드니키(Rudnicki) (Eight Annual International Workshop on High Performance Computational Biology, Rome, 2009)의 CUDASW에 기재되어 있는 그래픽 프로세서 장치 (GPU)-기반 툴과 유사하다. 류 등 (BMC Res Notes 3(93), 2010) 및 리고우스키 등 (GPU Computing Gems, Emerald Edition, Morgan Kaufmann, 155-157, 2011)에 의한 CUDASW++2.0을 사용하는 GPU 작업의 다른 실행도 존재하였다.

다른 변형에서는, 소규모 벡터 병렬화 (8, 16 또는 32-원 병렬화)가 병렬로 다수의 서열을 정렬하는 GPU 실행을 통해 접근가능한 계산을 하는데 사용될 수 있다. 이론적인 최고 계산 속도증가는 최적인 m배이다. 96 프로세싱 요소를 사용한 클리어스피드(ClearSpeed) 실행의 96배 속도증가가 이론적 속도증가를 확증해준다.

병렬 컴퓨팅 모델

스미스-워터맨 서열 정렬을 개발하고 확장하는데 사용된 주 병렬 모델은 연상 컴퓨팅(ASsociative Computing) (ASC) (Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994)이다. 스미스-워터맨 알고리즘의 효율적인 병렬 버전이 본원에 기재된다. 본 부문에서는 이러한 모델 및 하나의 다른 모델이 상세히 기재된다.

일부 관련 용어가 본원에 정의된다. 컴퓨터 아키텍처의 플린 분류법(Flynn's Taxonomy)으로부터의 두 가지 관심 용어는 MIMD 및 SIMD로, 두 가지 상이한 병렬 컴퓨팅 모델이다. 다중-명령 다중-데이터 (MIMD) 모델로 분류되는 컴퓨터 클러스터는 극히 대규모인 정렬에서의 메모리 한계를 극복하는 개념-증명으로 사용된다. 부문 8은 MIMD 모델의 용법을 기재한다. ASC로 알려져 있는 확장된 데이터-병렬 단일-명령 다중-데이터 (SIMD) 모델이 또한 기재된다.

다중 명령 다중 데이터 (MIMD)

다중-데이터 다중-명령 모델 또는 MIMD 모델은 현재 이용가능한 대부분의 병렬 시스템을 기재하고 있으며, 현재 인기 있는 컴퓨터 클러스터를 포함하고 있다. MIMD 프로세서는 완전-독립형 중앙 프로세싱 장치 (CPU)를 가지고 있으며, 각각 그 자체의 로컬 메모리를 포함한다 (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994). SIMD 모델과 달리, 각각의 MIMD 프로세서는 비동기로 그 자체의 프로그램을 저장 및 실행한다. MIMD 프로세서는 통신을 가능하게 하는 네트워크를 통해 연결되지만, 사용되는 네트워크는 기계 (클러스터 노드) 사이의 이더넷(Ethernet), 미리넷(Myrinet) 및 인피니밴드(InfiniBand) 연결에 걸쳐 광범위하게 달라질 수 있다. 통신은 단일 장치의 외부로 나가는 SIMD에 비해 훨씬 더 느슨한 통신 구조를 사용하는 경향이 있다. 데이터는 개별 프로세서에 의해 실행되는 그의 개별 프로그램의 제어 하에 비동기로 네트워크를 따라 이동된다. 전형적으로, 통신은 메시지-전달을 지원하는 여러 상이한 병렬 언어 중 하나에 의해 처리된다. 이것을 위한 매우 통상적인 라이브러리는 메시지 전달 인터페이스 (MPI)로 알려져 있다. "SIMD-유사" 방식의 통신이 가능하지만, 데이터 이동은 비동기가 될 것이다. MIMD에 의한 병렬 컴퓨팅은 통상적으로 프로세서에 의해 실행되는 다양한 태스크가 고도로 독립적이지 않은 한 (즉 소위 "당황스럽게도 병렬" 또는 "즐겁게도 병렬" 문제), 광범위한 통신 및 빈번한 동기화를 필요로 한다. 부문 8에서 제시되는 작업은 인피니밴드를 통해 연결되는 AMD 오페론 클러스터를 사용한다.

SIMD와 달리, 메시지-전달에 요구되는 최악-사례 시간은 예측하기가 어렵거나 불가능하다. 전형적으로, MIMD 소프트웨어에 있어서의 메시지-전달 실행 시간은 평균 사례 추정치를 사용하여 결정되는데, 종종 그것은 SIMD에서 전형적인 최악 사례 이론 평가에 의하기보다는 시험에 의해 결정된다. MIMD 소프트웨어에 있어서의 최악 사례가 종종 매우 좋지 않고 드물게 일어나기 때문에, 평균 사례 추정치가 훨씬 더 유용하다. 결과적으로, 특정한 문제에 대한 MIMD에 요구되는 통신 시간은 SIMD에 있어서의 것에 비해 상당히 더 높을 수 있으며, 통상적으로 그러하다. 이것는 필요한 프로세서간 통신의 수를 최소화하고 프로세서 통신 사이의 시간량을 최대화하려는 MIMD 프로그래밍 (특히 메시지-전달이 사용되는 경우)에서의 중요한 목표로 이어진다. 이것은 그래픽 프로세서 또는 GPU를 사용하는 것과 같은 단일 카드 가속 수준에서도 그러하다.

데이터-병렬 프로그래밍은 MIMD 프로그래밍에 중요한 기술이기도 하지만, 본원에서는 모든 태스크가 상이한 데이터에서 동일한 연산을 수행하며, 다양한 임계점에서만 동기화된다. MIMD 시스템을 위한 대부분의 알고리즘은 단일-프로그램 다중-데이터 (SPMD) 프로그래밍 패러다임으로 기록된다. 각각의 프로세서는 동일한 프로그램의 그 자체 사본을 가지고 있어서, 그의 로컬 데이터 상에서 그 프로세서 또는 코어에 특이적인 코드 부문을 실행한다. SPMD 패러다임의 인기는 그것이 상이한 프로세서에 걸쳐 동시에 실행되게 될 다수의 상이한 프로그램을 기록하기가 상당히 어려우면서도, 여전히 단일 문제를 해결하는데 있어서 협력가능하는 사실에서 유래한다. 메모리-집약적이되 컴퓨팅-집약적이 아닌 문제에 사용되는 또 다른 접근법은 부문 8에 제시되어 있는 작업을 사용하여 점보멤(JumboMem)에 의해 수행되는 바와 같이, 가상 메모리 서버를 생성시키는 것이다. 이것은 그의 기본적인 실행에 MPI를 사용한다.

단일 명령 다중 데이터 (SIMD)

SIMD 모델은 PE로 지칭되는 다수의 간단한 산술 프로세싱 요소로 이루어진다. 각 PE는 패치하여 저장할 수 있는 그 자체의 로컬 메모리를 가지나, 프로그램을 컴파일 또는 실행하는 능력은 가지고 있지 않다. 본원에 사용된 용어 "병렬 메모리"는 집합적으로 컴퓨팅 시스템 중 로컬 메모리를 지칭한다. 예를 들어, 병렬 메모리는 SIMD 컴퓨터 시스템 중 로컬 메모리의 집합 (예를 들어, PE의 로컬 메모리), MIMD 컴퓨터 시스템 중 프로세서의 로컬 메모리 집합 (예를 들어, 중앙 프로세싱 장치의 로컬 메모리) 등일 수 있다. 프로그램의 컴파일링 및 실행은 제어 장치 (또는 프론트 엔드)로 지칭되는 프로세서에 의해 처리된다 (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994). 제어 장치는 통상적으로 버스에 의해 모든 PE에 연결된다.

모든 활성인 PE는 제어 장치로부터 수신된 프로그램 명령을 락스텝으로 동기 실행한다. "어떠한 시간 단위에서도, 단일 연산은 각각 상이한 데이터를 조작하는 다중 프로세싱 장치 상에서 동일한 실행 상태에 있다" (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994, page 79). 동일한 명령이 모든 활성인 PE에 의해 병렬로 동시에 실행되기는 하지만, 일부 PE는 임의의 특정한 명령을 생략하도록 허용될 수 있다 (Baker, SIMD and MASC: Course notes from CS 6/73301: Parallel and Distributed Computing-power point slides, (2004)2004). 이것은 통상적으로 일부 PE가 이프(if) 명령을 실행하며 나머지 PE가 다른 부분을 실행하는 "이프-엘스(if-else)" 분지 구조를 사용하여 수행된다. 이러한 모델은 영상 프로세싱 및 행렬 연산과 같이 기껏해야 소수의 동시에 일어날 수 있는 이프-엘스 분지 구조를 갖는 특성상 "데이터-병렬"인 문제에 이상적이다.

데이터는 제어 장치에 의해 모든 활성인 PE로 브로드캐스트될 수 있고, 제어 장치는 또한 제어 장치와 PE 사이의 연결 (통상적으로 버스)을 사용하여 특정한 PE로부터 데이터 값을 획득할 수 있다. 추가적으로, PE 세트는 PE 사이의 병렬 데이터 이동을 제공하는 선형 어레이, 2-D 메시 또는 하이퍼큐브와 같은 상호연결 네트워크에 의해 연결된다. 데이터는 락스텝으로 데이터 이동을 비롯한 명령을 실행하는 PE에 의해 동기 병렬 방식으로 상기 네트워크를 통해 이동된다. PE로 명령을 브로드캐스트하는 것은 제어 장치이다. 특히, SIMD 네트워크는 오늘날 대부분의 병렬 컴퓨터에 의해 사용되는 메시지-전달 패러다임을 사용하지 않는다. 이의 중요한 이점은 SIMD 네트워크 통신이 극히 효율적이고, 통신에 요구되는 최대 시간이 그 특정한 통신을 제어하는 알고리즘의 최악-사례 시간에 의해 결정될 수 있다는 것이다.

이러한 부문의 나머지는 확장된 SIMD ASC 모델을 기재하는데 할애된다. ASC는 이러한 논의를 위한 알고리즘 설계 및 개발의 중심에 있다.

연상 컴퓨팅 모델

연상 컴퓨팅 (ASC) 모델은 굳이어 에어로스페이스(Goodyear Aerospace)에서 닥터 케네스 배처(Kenneth Batcher)에 의해 설계된 STARAN 연상 SIMD 컴퓨터, 및 그의 집중 네이비(Navy)-이용 계승자인 ASPRO를 기반으로 하는 확장된 SIMD이다.

켄트 주립 대학교 컴퓨터 과학부에서 개발된 ASC는 연상 컴퓨팅을 위한 알고리즘 모델이다 (Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994) (Potter, Associative Computing: A Programming Paradigm for Massively Parallel Computers, Plenum Publishing, 1992). ASC 모델은 굳이어 에어로스페이스에 의해 구축된 연상 프로세서인 STARAN 및 MPP 상에서의 작업으로부터 성장하였다. 그것이 현재는 하드웨어에서 지원되지 않고 있지만, 이러한 모델을 위한 컴퓨터를 효율적으로 모의하고 또한 설계하기 위한 연구 노력이 현재 이루어지고 있다.

확장된 SIMD 모델처럼, ASC는 동기 데이터-병렬 프로그래밍을 사용함으로써, 다중-태스킹 및 비동기 점-대-점 통신 루팅 둘 다를 피한다. 다중-태스킹은 불필요한데, 어떠한 시간에도 단지 하나의 태스크만이 실행되며, 이러한 태스크의 다수 예는 모든 활성인 프로세싱 요소 (PE)에서 락스텝으로 실행되기 때문이다. SIMD 프로그래머와 마찬가지로 ASC는 MPI 및 다른 MIMD 클러스터 패러다임에서 명시적으로 처리되어야 하는 문제인 부하 균형화, 동기화 및 동적 태스크 스케줄링에 수반된 문제를 피한다.

도 4는 ASC 컴퓨터의 개념 모델을 도시한다. 명령 스트림 (IS)으로도 알려져 있는 단일 제어 장치, 및 각각 그 자체의 로컬 메모리를 갖는 다수의 프로세싱 요소 (PE)가 존재한다. 제어 장치 및 PE 어레이는 브로드캐스트/리덕션 네트워크를 통해 연결되고, PE는 PE 데이터 상호연결 네트워크를 통해 함께 연결된다.

도 4에서 보이는 바와 같이, PE는 그 자체의 로컬 메모리에 위치되어 있는 데이터에 대한 액세스를 갖는다. 데이터는 제자리에서 유지되며, 응답하는 (활성인) PE는 그의 로컬 데이터를 병렬로 프로세싱한다. 연상이라는 용어의 언급은 메모리 주소 이외의 콘텐트에 의해 데이터를 위치시키기 위한 탐색의 용도에 관한 것이다. ASC 모델은 연상 메모리를 사용하지 않는데, 대신 일반 사이클이 탐색-프로세싱-추출인 연상 프로세서이다. 모델의 개관은 문헌 [Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994]에서 이용가능하다.

알고리즘의 표 특성은 그 자체를 ASC 데이터 구조의 자연적인 표 구조로 인하여 ASC를 사용하는 컴퓨팅에 적합하게 한다. 노스 및 노스웨스트 네이버의 데이터의 락스텝 이동을 위한 PE 상호연결 네트워크에 걸친 고도로 효율적인 통신, 및 병렬 컴퓨팅에 걸친 탐색 및 최대값에 있어서의 빠르고 일정한 시간 연상 함수는 SWAMP에 의해 잘 이용되고 있다.

연상 연산은 ASC 모델에 의해 요구되는 추가의 하드웨어로 인해 일정한 시간 내에 실행된다 (Jin et al., 15th International Parallel and Distributed Processing Symposium (IPDPS'01) Workshops, San Francisco, p. 193, 2001). 이들 연산은 어떠한 SIMD-유사 기계에 의해서도 효율적으로 (그러나 덜 신속하게) 수행될 수 있으며, 여러 SIMD 하드웨어 플랫폼 상에서 효율적으로 실행되도록 성공적으로 적합화되어 있다 (Yuan et al., Parallel and Distributed Computing Systems (PDCS), Cambridge, M A, 2009; Trahan et al., J. of Parallel and Distributed Computing (JPDC), 2009). 따라서, SWAMP 및 다른 ASC 알고리즘은 벡터 기계를 비롯한 SIMD와 밀접하게 관련되어 있는 다른 시스템 상에서 효율적으로 실행될 수 있는 바, 이것이 상기 모델이 패러다임으로 사용되는 이유이다.

제어 장치는 프로그램 명령을 패치하여 디코딩하고, 제어 신호를 PE로 브로드캐스트한다. PE는 제어 장치의 지시 하에 그 자체의 로컬 데이터를 사용하여 이들 명령을 실행한다. 모든 PE는 암묵적으로 명령 사이를 동기화하면서 락스텝 방식으로 명령을 실행한다. ASC는 연상 탐색, 최대/최소 탐색 및 응답자 선택/검출의 여러 관련 고속 포괄 연산을 가진다. 이들은 하기 부문에서 기재된다.

연상 함수

SWAMP 알고리즘과 관련된 함수는 하기에 논의한다. 연상 탐색

ASC 알고리즘에서의 기본 연산은 연상 탐색이다. 연상 탐색은 로컬 데이터가 주어진 탐색 키와 매치되는 PE를 동시에 위치시킨다. 매칭 데이터를 갖는 PE는 응답자로 지칭되고, 비-매칭 데이터를 갖는 것은 비-응답자로 지칭된다. 탐색을 수행한 후에, 알고리즘은 이어서 비-응답자를 불능화하는 것에 의해 응답자에만 영향을 주도록 추가의 프로세싱을 제한할 수 있다 (또는 그 반대도 마찬가지임). 추가의 탐색을 수행하는 것은 응답자의 세트를 추가로 정밀화할 수 있다. 연상 탐색은 대각선 내 병렬 작용 내에서 어느 PE가 활성인지를 선택함에 있어서 SWAMP+에 의해 집중적으로 이용된다.

최대/최소 탐색

각 PE가 표준 비교 연산자 (동일, 미만 등)를 사용하여 탐색 키에 대하여 그의 로컬 데이터를 비교하는 단순 탐색 이외에도, 연상 컴퓨터는 또한 응답자 세트를 결정하기 위해 전체 PE 어레이로부터의 데이터가 함께 조합되는 포괄 탐색을 수행할 수도 있다. 가장 통상적인 유형의 포괄 탐색은 응답자가, 데이터가 전체 PE 어레이에 걸쳐 최대값 또는 최소값의 PE인 최대/최소 탐색이다. 최대값은 지금까지 계산된 최고값을 추적하기 위해 그것이 프로세싱하는 모든 대각선에서 SWAMP+에 의해 사용된다. 최대 탐색의 사용은 논리 병렬 작용에서 1회, 정렬마다 m+n회로 빈번하게 이루어진다.

응답자 선택/검출

연상 탐색은 다수의 응답자로 이어질 수 있으며, 연상 알고리즘은 하기 3개의 상이한 모드 중 1개로 그 응답자를 프로세싱할 수 있다: 병렬, 순차적 또는 단일 선택. 병렬 응답자 프로세싱은 각각의 응답자에서 동일한 연산 세트를 동시에 수행한다. 순차적 응답자 프로세싱은 각각의 응답자를 개별적으로 선택함으로써, 각각의 응답자에 대해 상이한 연산 세트를 가능하게 한다. 단일 응답자 선택 (또한 하나뽑기(pickOne)로 알려져 있음)은 프로세싱을 적용받기 위한 하나의 임의적으로 선택되는 응답자를 선택한다. 다수의 응답자에 추가로, 연상 탐색이 응답자로 이어지지 않는 것 또한 가능하다. 이러한 경우를 처리하기 위해, ASC 모델은 탐색에 대한 임의의 응답자가 있었는지를 검출하고, 그 경우 (임의응답자(anyResponder)로 알려져 있음) 별도의 작용 세트를 수행할 수 있다. SWAMP에서는, 정렬될 문자를 함유하는 다수의 응답자가 선택되어, 상기에 언급된 연상 탐색에 기초하여 병렬로 프로세싱된다. 단일 응답자 선택은 최대/최소 탐색을 사용하였을 때 정확히 동일한 최대값을 갖는 다수의 값이 존재하는 경우에 및 그 때에 이루어진다.

PE 상호연결 네트워크

대부분의 연상 프로세서는 어레이 내에서의 병렬 데이터 이동을 가능하게 하는 일부 유형의 PE 상호연결 네트워크를 포함한다. ASC 모델 자체는 어떠한 특정한 상호연결 네트워크도 특정하지 않는데, 사실 많은 유용한 연상 알고리즘은 그것을 필요로 하지 않는다. 전형적으로, 연상 프로세서는 1D 선형 어레이 또는 2D 메시와 같은 간단한 네트워크를 실행한다. 이들 네트워크는 실행하기가 간단하며, 데이터가 동기 방식으로 신속하게 전달되는 것을 가능하게 한다. 예를 들어 1D 선형 어레이이면, SWAMP 알고리즘에서의 PE 사이의 명시적인 통신에 충분하다.

병렬 컴퓨팅 시스템

일반화된 병렬 프로세싱 아키텍처가 도 5에 도시된다. 각각의 구성요소가 직접 연결을 갖는 것으로 도시되어 있기는 하지만, 다양한 요소가 지리적으로는 이격되어 있되 네트워크, 예를 들어 인터넷을 통해 연결되어 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 혼성 구성이 가능하기는 하지만, 병렬 컴퓨터에서의 주 메모리는 전형적으로 단일 어드레스 공간의 모든 프로세싱 요소 사이에 공유되어 있거나, 또는 분포되어 있다, 즉 각각의 프로세싱 요소가 그 자체의 로컬 어드레스 공간을 갖는다. (분포 메모리는 메모리가 논리적으로 분포되어 있다는 사실을 지칭하지만, 종종 그것이 물리적으로 분포되어 있다는 것을 암시하기도 한다.) 분포 공유된 메모리 및 메모리 가상화는 프로세싱 요소가 그 자체의 로컬 메모리 및 비-로컬 프로세서 상의 메모리에 대한 액세스를 갖는 두 가지 접근법을 조합한다. 로컬 메모리에 대한 액세스는 전형적으로 비-로컬 메모리에 대한 액세스보다 더 빠르다.

주 메모리의 각각의 요소가 동일한 대기시간 및 밴드폭으로 액세스될 수 있는 컴퓨터 아키텍처는 균일 메모리 액세스(Uniform Memory Access) (UMA) 시스템으로 알려져 있다. 전형적으로, 공유 메모리 시스템에 의해서만 달성될 수 있는 것이며, 여기서 메모리는 물리적으로 분포되어 있지 않다. 이러한 특성을 갖지 않는 시스템은 비-균일 메모리 액세스(Non-Uniform Memory Access) (NUMA) 아키텍처로 알려져 있다. 분포 메모리 시스템은 비-균일 메모리 액세스를 갖는다.

프로세서-프로세서 및 프로세서-메모리 통신은 별형, 고리형, 트리, 하이퍼큐브, 팻 하이퍼큐브 (노드에 1개 초과의 프로세서를 갖는 하이퍼큐브) 또는 n-차원 메시를 비롯한 무수한 위상의 공유된 (다포트화 또는 다중화) 메모리, 크로스바 스위치, 공유된 버스 또는 상호연결 네트워크를 비롯한 여러 방식으로 하드웨어에서 실행될 수 있다.

상호연결된 네트워크를 기반으로 하는 병렬 컴퓨터는 직접 연결되어 있지 않은 노드 사이의 메시지 전달을 가능하게 하는 루팅을 혼입시켜야 한다. 프로세서 사이의 통신에 사용되는 매체는 대형 다중프로세서 기계에서 계층형일 가능성이 있다. 이러한 자원은 전용 용도로의 구입을 위해 상업적으로 입수가능하거나, 또는 이들 자원은 "클라우드", 예를 들어 아마존 클라우드 컴퓨팅(Amazon Cloud Computing)을 통해 액세스될 수 있다.

컴퓨터는 일반적으로 버스를 통해 메모리에 커플링되는 프로세서를 포함한다. 메모리는 RAM 또는 ROM을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 시스템이 본원에 기재된 함수를 수행하도록 실행가능한 명령을 저장하는 적어도 하나의 유형 비-일시적 매체를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 방법의 수행에 필요한 것으로 또는 가장 적합한 것으로 인식하고 있는 바와 같이, 본 발명의 시스템은 버스를 통해 서로 통신하는 하나 이상의 프로세서 (예를 들어, 중앙 프로세싱 장치 (CPU), 그래픽 프로세싱 장치 (GPU) 등), 컴퓨터-판독가능 저장 장치 (예를 들어, 주 메모리, 정적 메모리 등), 또는 이들의 조합을 포함한다.

프로세서는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 프로세서, 예컨대 인텔 (캘리포니아주 산타 클라라)에 의해 제온(XEON) E7이라는 상표명으로 판매되고 있는 프로세서, 또는 AMD (캘리포니아주 서니베일)에 의해 옵테론(OPTERON) 6200이라는 상표명으로 판매되고 있는 프로세서일 수 있다.

메모리는 컴퓨터-판독가능 저장 장치를 지칭할 수 있으며, 하나 이상의 명령 (예를 들어, 본원에서 발견되는 임의의 방법론 또는 함수를 구현하는 소프트웨어), 데이터 (예를 들어, 임의의 유형 물리적 대상, 예컨대 환자의 염색체에서 발견되는 유전자 서열을 구현하는 것), 또는 이들 둘 다의 세트가 저장되는 임의의 기계-판독가능 매체를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서는 상기 컴퓨터-판독가능 저장 장치가 단일 매체일 수도 있지만, 용어 "컴퓨터-판독가능 저장 장치"는 하나 이상의 명령 또는 데이터 세트를 저장하는 단일 매체 또는 다중 매체 (예를 들어, 중앙화되거나 분포된 데이터베이스, 및/또는 연관 캐시 및 서버)를 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 따라서, 용어 "컴퓨터-판독가능 저장 장치"는 비제한적으로 고체-상태 메모리 (예를 들어, 가입자 확인 모듈 (SIM) 카드, 보안 디지털 카드 (SD 카드), 마이크로 SD 카드, 또는 고체-상태 드라이브 (SSD)), 광학 및 자기 매체, 및 임의의 다른 유형 저장 매체를 포함하는 것으로 여겨질 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터-판독가능 저장 장치는 유형 비-일시적 매체를 포함한다. 이러한 비-일시적 매체는, 예를 들어 일시적인 파장 및 신호는 배제한다. "비-일시적 메모리"는 신호 자체와 같은 컴퓨터 판독가능 전파 매체는 배제하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 입력/출력 장치는 비디오 디스플레이 장치 (예를 들어, 액정 디스플레이 (LCD) 또는 음극선관 (CRT) 모니터), 문자숫자 입력 장치 (예를 들어, 키보드), 커서 제어 장치 (예를 들어, 마우스 또는 트랙패드), 디스크 드라이브 장치, 신호 생성 장치 (예를 들어, 스피커), 터치스크린, 가속도계, 마이크로폰, 휴대용 무선 주파수 안테나, 및 예를 들어 네트워크 인터페이스 카드 (NIC), 와이-파이 카드 또는 휴대용 모뎀일 수 있는 네트워크 인터페이스 장치를 포함할 수 있다.

샘플 획득 및 제조

본 발명은 생물학적 샘플로부터 회수된 핵산에 대응하는 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 아미노산 서열)을 생성시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생성되는 정보는 대상체로부터 수득된 핵산 물질에 존재하는 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플, 즉 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)이 대상체로부터 수득되며, 상기 핵산은 프로세싱되고 (용해, 증폭 및/또는 정제됨), 상기 핵산은 하기 기재된 방법을 사용하여 서열분석된다. 많은 실시양태에서, 서열분석의 결과는 선형 핵산 서열이 아니라, 대상체에 대해 서열로 재-조립되어야 하는 수천 또는 수백만개의 개별적인 짧은 핵산 리드의 집합이다. 일단 리드가 정렬되어 서열을 생성시키고 나면, 정렬된 서열은, 예를 들어 질환을 나타낼 수 있는 돌연변이를 확인하기 위해 참조 서열과 비교될 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체는 참조 서열 구축물, 즉 상기 기재된 바와 같은 방향성 비순환 그래프 ("DAG")에 대한 리드의 정렬에 기초하여 특정한 돌연변이를 갖는 것으로 확인될 수 있다.

상기 목적들 중 임의의 목적을 위해, 방법은 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 상기 생물학적 샘플은, 예를 들어 혈액, 전혈, 혈장, 눈물, 유두 흡인물, 혈청, 대변, 소변, 타액, 순환 세포, 조직, 생검 샘플, 모낭, 또는 환자의 생물학적 물질을 함유하는 다른 샘플을 포함할 수 있다. 이러한 샘플을 기반으로 한 시험을 수행함에 있어서의 한 가지 문제는 대부분의 경우에 관심 돌연변이를 함유하는 미량의 DNA 또는 RNA만이 샘플 중에 존재할 수 있다는 것이다. 이것은 돌연변이 핵산이 매우 소량으로 존재하는 비-침습성 샘플, 예컨대 협측 스왑 또는 혈액 샘플에서 특히 그러하다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편이 자연적으로 짧을 수 있는데, 즉 샘플 중 관련 핵산의 무작위 전단이 짧은 단편을 생성시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산은 프로세싱의 용이성을 위해, 또는 서열분석 기술이 1000개 미만의 염기, 예를 들어 500개 미만의 염기, 예를 들어 200개 미만의 염기, 예를 들어 100개 미만의 염기, 예를 들어 50개 미만의 염기의 서열 리드만을 서열분석할 수 있기 때문에, 고의로 단편화된다. 본원에 기재된 방법이 가변적인 길이의 서열을 정렬하는데 사용될 수 있기는 하지만, 일부 실시양태에서, 복수의 핵산 리드 대부분은 상기 서열분석 방법을 따를 것이며, 1000개 미만의 염기, 예를 들어 500개 미만의 염기, 예를 들어 200개 미만의 염기, 예를 들어 100개 미만의 염기, 예를 들어 50개 미만의 염기를 포함할 것이다.

핵산은 관련 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 수득될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 다양한 기술, 예컨대 그의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281, (1982)]에 기재된 것에 의해 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다.

먼저 샘플의 추출물을 제조한 다음, 충분하게 순수한 핵산 제제를 수득하기 위해 추가의 단계--즉 차등 침전, 칼럼 크로마토그래피, 유기 용매를 사용한 추출 등--을 수행할 필요가 있을 수 있다. 추출물은 관련 기술분야의 표준 기술을 사용하여, 예를 들어 세포의 화학적 또는 기계적 용해에 의해 제조될 수 있다. 이어서, 임의의 오염성이며 잠재적으로 방해성인 단백질을 변성시키기 위해, 추출물은 예를 들어 여과 및/또는 원심분리에 의하거나, 및/또는 카오트로픽 염, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여, 또는 유기 용매, 예컨대 페놀 및/또는 HCCl₃을 사용하여 추가로 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체 샘플, 예를 들어 혈액 샘플로부터 수집된 RNA, 예를 들어 mRNA를 포함할 수 있다. 일반적인 RNA 추출 방법에 대해서는 관련 기술분야에 널리 알려져 있으며, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 비롯한 표준 분자 생물학 교재에 개시되어 있다. 파라핀 포매된 조직으로부터의 RNA 추출 방법은, 예를 들어 문헌 [Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)]에 개시되어 있다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특히, RNA 단리는 상업적 제조업체, 예컨대 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양물 내 세포로부터의 총 RNA는 퀴아젠 알엔이지(RNeasy) 미니-칼럼을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 RNA 단리 키트는 마스터퓨어(MASTERPURE) 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센터(EPICENTRE), 위스콘신주 매디슨) 및 파라핀 차단 RNA 단리 키트 (암비온, 인크.(Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 샘플로부터의 총 RNA는 RNA Stat-60 (텔-테스트(Tel-Test))을 사용하여 단리할 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는, 예를 들어 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리에 의해 단리할 수 있다.

분석용 서열분석

서열분석은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의할 수 있다. DNA 서열분석 기술은 표지된 종결인자 또는 프라이머 및 평판 또는 모세관에서의 겔 분리를 사용한 전형적 디데옥시 서열분석 반응 (생어(Sanger) 방법), 가역적으로 종결되는 표지된 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 서열분석, 파이로시퀀싱, 454 서열분석, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화, 표지된 클론의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화 후 라이게이션을 사용한 합성에 의한 서열분석, 중합 단계 동안의 표지된 뉴클레오티드 혼입의 실시간 모니터링, 폴로니 서열분석, 및 SOLiD 서열분석을 포함한다. 분리된 분자의 서열분석은 폴리머라제 또는 리가제를 사용한 순차적 또는 단일 연장 반응, 뿐만 아니라 프로브의 라이브러리와의 단일 또는 순차적 차등 혼성화에 의해 보다 최근에 입증되었다. 서열분석 전에는, 샘플 중 핵산의 일부 또는 전부를 증폭시키는 것이 추가적으로 유익할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 관련 기술분야에 알려져 있는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 증폭된다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 한 예는 DNA 또는 RNA를 증폭시키는데 이용될 수 있는 폴리머라제-기반의 합성에-의한-서열인 일루미나(Illumina) 서열분석 (예를 들어, MiSeq™ 플랫폼)이다. DNA에 대한 일루미나 서열분석은 폴드-백 PCR 및 앵커 프라이머를 사용하여 고체 표면 상에서의 DNA 증폭을 기반으로 한다. 게놈 DNA를 단편화하고, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 부가한다. 유동 셀 채널의 표면에 부착되는 DNA 단편을 연장시키고 브릿지 증폭시킨다. 단편은 이중 가닥이 되고, 이중 가닥 분자를 변성시킨다. 고체상 증폭의 다중 사이클 후 변성은 유동 셀의 각각의 채널에서 동일한 주형의 대략 1,000 카피의 단일-가닥 DNA 분자의 수백만개 클러스터를 생성시킬 수 있다. 프라이머, DNA 폴리머라제 및 4개의 형광단-표지된 가역적으로 종결되는 뉴클레오티드를 사용하여 순차적 서열분석을 수행한다. 뉴클레오티드 혼입 후에, 레이저를 사용하여 형광단을 여기시키고, 영상을 포획하고, 제1 염기의 정체를 기록한다. 각각의 혼입된 염기로부터의 3' 종결인자 및 형광단을 제거하고, 혼입, 검출 및 확인 단계를 반복한다. 일루미나 서열분석을 사용하여 RNA를 검출할 때에는, 샘플의 RNA 발현을 결정하기 위해 RNA 단편을 단리 및 증폭시키는 것 이외에는 동일한 방법이 적용된다. 서열분석기를 사용하여 서열을 조사한 후, 그들은 생물학적 서열 및 품질 점수를 저장하기 위한 텍스트-기반 포맷인 FASTQ 파일과 같은 데이터 파일로 출력될 수 있다 (상기 논의 참조).

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 서열분석 기술의 또 다른 예는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에 의해 제공되는 이온 토렌트(Ion Torrent)™ 서열분석이다. 각각의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2009/0026082, 2009/0127589, 2010/0035252, 2010/0137143, 2010/0188073, 2010/0197507, 2010/0282617, 2010/0300559, 2010/0300895, 2010/0301398, 및 2010/0304982를 참조한다. 이온 토렌트™ 서열분석에서, DNA를 대략 300-800개 염기 쌍의 단편으로 전단하며, 단편은 평활 말단이다. 이어서 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 라이게이션시킨다. 어댑터는 단편의 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머로서 작용한다. 단편은 표면에 부착될 수 있고, 단편을 개별적으로 해상할 수 있는 해상도로 부착된다. 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가는 양성자 (H⁺)를 방출하며, 이의 신호가 서열분석 기기에서 검출되고 기록된다. 신호 강도는 혼입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 이온 토렌트 데이터는 또한 FASTQ 파일로 출력될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 서열분석 기술의 또 다른 예는 454™ 서열분석 (로슈(Roche)) (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380)이다. 454™ 서열분석은 파이로시퀀싱을 또한 이용하는 합성에-의한-서열분석 기술이다. DNA의 454™ 서열분석은 2개의 단계를 수반한다. 제1 단계에서, DNA를 대략 300-800개 염기 쌍의 단편으로 전단하며, 단편은 평활 말단이다. 이어서 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 라이게이션시킨다. 어댑터는 단편의 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머로서 작용한다. 단편을, 예를 들어 5'-비오틴 태그를 함유하는 어댑터 B를 사용하여, DNA 포획 비드, 예를 들어 스트렙타비딘-코팅 비드에 부착시킬 수 있다. 비드에 부착된 단편을 유수 에멀젼의 액적 내에서 PCR 증폭시킨다. 그 결과 각 비드 상에 클론 증폭된 DNA 단편의 다중 카피를 얻는다. 제2 단계에서, 비드를 웰 (피코리터 크기)에 포획한다. 파이로시퀀싱을 각각의 DNA 단편에 대해 병렬로 수행한다. 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가는 서열분석 기기에서 CCD 카메라에 의해 기록되는 광 신호를 생성시킨다. 신호 강도는 혼입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 부가 시에 방출되는 피로포스페이트 (PPi)를 사용한다. PPi는 아데노신 5' 포스포술페이트의 존재 하에서 ATP 술푸릴라제에 의해 ATP로 전환된다. 루시페라제는 ATP를 사용하여 루시페린을 옥시루시페린으로 전환시키고, 이러한 반응은 광을 생성시키며, 이를 검출하고 분석한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하는데 파이로시퀀싱이 사용된다. RNA의 파이로시퀀싱은 유사하게 DNA의 파이로시퀀싱에 적용되며, 미시적 비드에 부분적 rRNA 유전자 서열분석을 부착 적용한 다음 부착물을 개별 웰 내에 배치시키는 것에 의해 수행된다. 이어서, 부착된 부분적 rRNA 서열은 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 증폭된다. 문헌 [Sharon Marsh, Pyrosequencing® Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 373, 15-23 (2007)].

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 검출 기술의 또 다른 예는 SOLiD™ 기술 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))이다. SOLiD™ 기술 시스템은 DNA 및 RNA 둘 다의 대규모로 병렬인 차세대 서열분석을 실행하는데 이용될 수 있는 라이게이션 기반 서열분석 기술이다. DNA SOLiD™ 서열분석에서, 게놈 DNA를 단편으로 전단하고, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 부착시켜 단편 라이브러리를 생성시킨다. 대안적으로, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 라이게이션하고, 단편을 원형화시키고, 원형화된 단편을 소화시켜 내부 어댑터를 생성시키고, 어댑터를 생성된 단편의 5' 및 3' 말단에 부착시켜 짝-쌍형성 라이브러리를 생성시킴으로써 내부 어댑터를 도입할 수 있다. 다음으로, 비드, 프라이머, 주형 및 PCR 성분을 함유하는 마이크로반응기에서 클론 비드 집단을 제조한다. PCR 후에, 주형을 변성시키고 비드를 풍부화시켜 연장된 주형을 갖는 비드를 분리한다. 선택된 비드 상의 주형을 3' 변형에 적용시켜 유리 슬라이드에 대해 결합되도록 한다. 특이적 형광단에 의해 확인되는 중심 결정 염기 (또는 염기 쌍)를 갖는 부분적 무작위 올리고뉴클레오티드의 순차적 혼성화 및 라이게이션에 의해 서열을 결정할 수 있다. 색을 기록한 후에, 라이게이션된 올리고뉴클레오티드를 절단 및 제거한 다음 과정을 반복한다.

다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하기 위해 SOLiD^TM의 유전자 발현 연속 분석 (SAGE)을 사용한다. 유전자 발현 연속 분석 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개별 혼성화 프로브를 제공할 필요없이 다수의 유전자 전사체의 동시 및 정량적 분석을 허용하는 방법이다. 먼저, 전사체를 고유하게 확인하기에 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그 (약 10-14 bp)를 생성시키되, 단 태그는 각각의 전사체 내의 고유한 위치로부터 수득한다. 이어서, 많은 전사체를 함께 연결하여 긴 연속 분자를 형성하고, 이를 서열분석하여, 다수의 태그의 정체를 동시에 밝힐 수 있다. 개별 태그의 존재비를 결정하고, 각각의 태그에 대응하는 유전자를 확인함으로써 임의의 전사체 집단의 발현 패턴을 정량적으로 평가할 수 있다. 보다 상세한 설명은, 예를 들어 각각의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Velculescu et al., Science 270:484 487 (1995); 및 Velculescu et al., Cell 88:243 51 (1997)]을 참조한다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 또 다른 서열분석 기술은, 예를 들어 헬리코스 진정 단일 분자 서열분석(Helicos True Single Molecule Sequencing) (tSMS) (Harris T. D. et al. (2008) Science 320:106-109)을 포함한다. tSMS 기술에서, DNA 샘플을 대략 100 내지 200개 뉴클레오티드의 가닥으로 절단하고, 폴리A 서열을 각각의 DNA 가닥의 3' 말단에 부가한다. 각각의 가닥을 형광 표지된 아데노신 뉴클레오티드의 부가에 의해 표지한다. 이어서 DNA 가닥을 유동 셀 표면에 고정화되는 수백만개의 올리고-T 포획 부위를 함유하는 유동 셀에 혼성화시킨다. 주형은 밀도가 약 1억개 주형/cm²일 수 있다. 이어서 유동 셀을 기기, 예를 들어 헬리스콥(HeliScope)™ 서열분석기 내로 로딩하고, 레이저로 유동 셀의 표면을 비추어 각각의 주형의 위치를 밝혀낸다. CCD 카메라는 유동 셀 표면 상의 주형의 위치를 맵핑할 수 있다. 이어서 주형 형광 표지를 절단하고 세척 제거한다. DNA 폴리머라제 및 형광 표지된 뉴클레오티드를 도입함으로써 서열분석 반응을 시작한다. 올리고-T 핵산은 프라이머로서 작용한다. 폴리머라제는 주형 지정 방식으로 프라이머에 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 폴리머라제 및 미혼입 뉴클레오티드를 제거한다. 형광 표지된 뉴클레오티드의 지정 혼입을 갖는 주형을 유동 셀 표면의 영상화에 의해 검출한다. 영상화 후에, 절단 단계로 형광 표지를 제거하고, 목적하는 리드 길이가 달성될 때까지 다른 형광 표지된 뉴클레오티드로 상기 과정을 반복한다. 각각의 뉴클레오티드 부가 단계에서 서열 정보를 수집한다. tSMS의 추가의 설명은, 예를 들어 라피두스(Lapidus) 등의 미국 특허 번호 7,169,560, 라피두스 등의 미국 특허 출원 번호 2009/0191565, 퀘이크(Quake) 등의 미국 특허 번호 6,818,395, 해리스(Harris)의 미국 특허 번호 7,282,337, 퀘이크 등의 미국 특허 출원 번호 2002/0164629, 및 문헌 [Braslavsky, et al., PNAS (USA), 100: 3960-3964 (2003)]에 제시되고, 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 DNA 및 RNA 둘 다를 서열분석하는 퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences)의 단일 분자 실시간 (SMRT) 기술을 포함한다. SMRT에서, 4개의 DNA 염기 각각을 4개의 상이한 형광 염료 중 1개에 부착시킨다. 이들 염료는 인-연결된다. 단일 DNA 폴리머라제를 제로-모드 도파관 (ZMW)의 바닥에서 주형 단일 가닥 DNA의 단일 분자로 고정화시킨다. ZMW는 ZMW의 외부에서 (마이크로초 단위로) 급속히 확산되는 형광 뉴클레오티드의 배경에 대하여 DNA 폴리머라제에 의한 단일 뉴클레오티드 혼입의 관찰을 가능하게 하는 구속 구조이다. 뉴클레오티드를 성장 가닥으로 혼입시키는데는 수 밀리초가 소요된다. 이러한 시간 동안에, 형광 표지는 여기되어 형광 신호를 생성시키고, 형광 태그는 절단 제거된다. 염료의 대응하는 형광의 검출은 어느 염기가 혼입되었는지를 나타낸다. 과정을 반복한다. RNA를 서열분석하기 위해, DNA 폴리머라제가 ZMW에서 역전사효소로 대체되고, 그에 따라 과정이 이어진다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 나노포어 서열분석이다 (Soni G V and Meller, AClin Chem 53: 1996-2001) (2007). 나노기공은 직경이 1 나노미터 정도인 작은 구멍이다. 전도성 유체에서의 나노기공의 침지 및 그에 걸친 전위의 적용은 나노기공을 통한 이온의 전도성에 기인하여 경미한 전류를 일으킨다. 흐르는 전류의 양은 나노기공의 크기에 감수성이다. DNA 분자가 나노기공을 통과할 때, DNA 분자 상의 각각의 뉴클레오티드는 상이한 정도로 나노기공을 폐쇄한다. 따라서, DNA 분자가 나노기공을 통과할 때 나노기공을 통과하는 전류의 변화는 DNA 서열의 판독치를 나타낸다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 서열 DNA에 화학물질-감수성 전계 효과 트랜지스터 (chemFET) 어레이를 사용하는 것을 수반한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20090026082에 기재된 바와 같음). 기술의 한 예에서, DNA 분자를 반응 챔버 내에 넣을 수 있고, 주형 분자를 폴리머라제에 결합된 서열분석 프라이머에 혼성화시킬 수 있다. 서열분석 프라이머의 3' 말단에서 새로운 핵산 가닥 내에 1개 이상의 트리포스페이트가 혼입되는 것을 chemFET에 의해 전류의 변화로 검출할 수 있다. 어레이는 다중 chemFET 센서를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 단일 핵산을 비드에 부착시킬 수 있고, 핵산을 비드 상에서 증폭시킬 수 있고, 개별 비드를 각각의 챔버가 chemFET 센서를 갖는 chemFET 어레이 상의 개별 반응 챔버로 전달할 수 있고, 핵산을 서열분석할 수 있다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 전자 현미경을 사용하는 것을 수반한다 (Moudrianakis E. N. and Beer M. Proc Natl Acad Sci USA. 1965 March; 53:564-71). 기술의 한 예에서, 개별 DNA 분자를 전자 현미경을 사용하여 구별가능한 금속성 표지를 사용하여 표지한다. 이어서 이들 분자를 평평한 표면 상에 펼쳐놓고, 전자 현미경을 사용하여 영상화함으로써 서열을 측정한다.

추가의 검출 방법은 후속 형광 또는 비-형광 검출, 질량 분광측정 방법을 사용하는 바코드 질량 검출, 방출된 라디오파의 검출, 정렬된 바코드로부터의 산란광의 검출, 정량적 PCR 또는 디지털 PCR 방법을 사용하는 형광 검출을 위해 마이크로어레이에 결합하는 것을 이용할 수 있다. 비교 핵산 혼성화 어레이는 환자 샘플 DNA 내에서의 카피수 변이를 검출하기 위한 기술이다. 샘플 DNA 및 참조 DNA는, 예를 들어 구별되는 형광단을 사용하여 상이하게 표지된 다음, 수많은 프로브에 혼성화된다. 이어서, 샘플 및 참조의 형광 강도가 측정된 다음에, 형광 강도 비가 카피수 변이를 계산하는데 사용된다. 비교 게놈 혼성화 어레이의 방법은 문헌 [Shinawi M, Cheung SW The array CGH and its clinical applications, Drug Discovery Today 13 (17-18): 760-70]에 보다 상세히 논의되어 있다. 마이크로어레이 검출이 바로 FASTQ 파일을 생성시키지는 않을 수 있지만, 마이크로어레이 서열분석기에 의해 생성된 데이터를 FASTQ 또는 유사한 포맷으로 전환시키는 프로그램이 이용가능하다.

DNA 분자, RNA 분자 및 카피수를 검출하는 또 다른 방법은 형광 계내 혼성화 (FISH)이다. 계내 혼성화 프로토콜 (Ian Darby ed., 2000). FISH는 특정 염색체 재배열, 예컨대 DNA 서열 중 돌연변이 및 카피수 변이를 검출하는 분자 세포유전학 기술이다. DNA 분자는 화학적으로 변성된 후, 2개 가닥으로 분리된다. 이어서, 단일 가닥 프로브가 변성된 DNA 가닥과 함께 인큐베이션된다. 신호 가닥 프로브는 표적 서열 부분에 따라 선택되며, 상보적 서열 부분에 대해 고친화도를 갖는다. 프로브는 반복 서열 프로브, 전염색체 프로브 및 유전자좌-특이적 프로브를 포함할 수 있다. 인큐베이션하는 동안, 조합된 프로브 및 DNA 가닥이 혼성화된다. 이어서, 임의의 변이를 평가하기 위해 현미경 하에서 결과가 가시화 및 정량화된다.

또 다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하기 위해 매스어레이(MassARRAY)™-기반 유전자 발현 프로파일링 방법을 사용한다. 시쿼놈, 인크.(Sequenom, Inc.) (캘리포니아주 샌디에고)에서 개발한 매스어레이™-기반 유전자 발현 프로파일링 방법에서, RNA의 단리 및 역전사 후에 수득된 cDNA를, 단일 염기를 제외한 모든 위치에서 표적화된 cDNA 영역과 매치되고 내부 표준물로서 작용하는 합성 DNA 분자 (경쟁자)와 섞는다. cDNA/경쟁자 혼합물을 PCR 증폭시키고, PCR-후 쉬림프 알칼리성 포스파타제 (SAP) 효소 처리에 적용하여, 나머지 뉴클레오티드의 탈인산화를 일으킨다. 알칼리성 포스파타제의 불활성화 후에, 경쟁자 및 cDNA로부터의 PCR 생성물을 프라이머 연장에 적용하여, 경쟁자- 및 cDNA-유래 PCR 생성물에 대한 구별되는 질량 신호를 생성시킨다. 정제 후에, 이들 생성물을 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (MALDI-TOF MS) 분석을 사용하는 분석에 필요한 성분을 예비-로딩한 칩 어레이 상에 분배한다. 이어서, 생성된 질량 스펙트럼 내의 피크 면적의 비를 분석함으로써 반응물 내에 존재하는 cDNA를 정량화한다. 추가의 상세한 설명은, 예를 들어 문헌 [Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059 3064 (2003)]을 참조한다.

추가의 PCR-기반 기술은, 예를 들어 차등 디스플레이 (Liang and Pardee, Science 257:967 971 (1992)); 증폭된 단편 길이 다형성 (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305 1312 (1999)); 비드어레이(BeadArray)™ 기술 (일루미나, 캘리포니아주 샌디에고; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); 유전자 발현에 대한 신속한 검정에서 상업적으로 입수가능한 루미넥스100(Luminex100) LabMAP 시스템 및 다색-코딩 마이크로구체 (루미넥스 코포레이션(Luminex Corp.), 텍사스주 오스틴)를 사용하는, 유전자 발현의 검출을 위한 비즈 어레이 (BADGE) (Yang et al., Genome Res. 11:1888 1898 (2001)); 및 고 포괄적 발현 프로파일링 (HiCEP) 분석 (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003))을 포함한다. 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특정 실시양태에서, 나일론 멤브레인 어레이, 마이크로칩 어레이 및 유리 슬라이드 어레이, 예를 들어 아피메트릭스(Affymetrix) (캘리포니아주 산타 클라라)로부터 상업적으로 입수가능한 것을 비롯한 마이크로어레이 기술을 사용하여 유전자 발현의 변이가 또한 확인 또는 확증될 수 있다. 일반적으로, RNA 샘플이 단리되고, 역전사를 통해 표지된 cDNA로 전환된다. 이어서, 표지된 cDNA는 관심 세포 또는 조직으로부터의 특정 DNA 프로브를 갖는 나일론 멤브레인, 마이크로칩 또는 유리 슬라이드 상에 혼성화된다. 이어서, 혼성화된 cDNA가 검출 및 정량화되고, 생성된 유전자 발현 데이터는 분석용 대조군과 비교될 수 있다. 표지, 혼성화 및 검출 방법은 마이크로어레이 지지체가 나일론 멤브레인인지, 마이크로칩인지 또는 유리 슬라이드인지에 따라 달라진다. 나일론 멤브레인 어레이는 전형적으로 P-dNTP 표지된 프로브와 혼성화된다. 유리 슬라이드 어레이는 전형적으로 2개의 구별되는 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 표지하는 것을 수반한다. 마이크로어레이를 제조하고 유전자 산물 발현 (예를 들어, RNA 또는 단백질)을 결정하는 방법은 이트만(Yeatman) 등의 미국 특허 출원 번호 2006/0195269에 제시되며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에서 본원에 개시된 1종 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양을 결정하기 위해 질량 분광측정법 (MS) 분석을 단독으로 또는 다른 방법 (예를 들어, 면역검정 또는 RNA 측정 검정)과 조합하여 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, MS 분석은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 비행 시간 (TOF) MS 분석, 예컨대 예를 들어 직접-점 MALDI-TOF 또는 액체 크로마토그래피 MALDI-TOF 질량 분광측정법 분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, MS 분석은 전기분무 이온화 (ESI) MS, 예컨대 예를 들어 액체 크로마토그래피 (LC) ESI-MS를 포함한다. 질량 분석은 상업적으로 입수가능한 분광계를 사용하여 달성할 수 있다. 생물학적 샘플 내에서 바이오마커 펩티드의 존재 및 양을 검출하기 위해 MALDI-TOF MS 및 ESI-MS를 비롯한 MS 분석을 이용하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다. 추가의 지침에 대해서는, 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,925,389; 6,989,100; 및 6,890,763을 참조한다.

본 발명의 방법, 서열 구축물 및 시스템에서 사용하기 위한 단백질 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 수많은 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 및 아미노산 서열 리드는 질량 분광측정법 또는 에드만(Edman) 분해를 사용하여 단백질 또는 단백질의 일부분을 분석하는 것에 의해 생성될 수 있다. 질량 분광측정법은, 예를 들어 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 비행 시간 (TOF) MS 분석, 예컨대 예를 들어 직접-점 MALDI-TOF 또는 액체 크로마토그래피 MALDI-TOF 질량 분광측정법 분석, 전기분무 이온화 (ESI) MS, 예컨대 예를 들어 액체 크로마토그래피 (LC) ESI-MS, 또는 다른 기술, 예컨대 MS-MS를 포함할 수 있다. 에드만 분해 분석은 모델 49X 프로사이스(Procise) 단백질/펩티드 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈/라이프 테크놀로지스)와 같은 상업용 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 서열분석된 아미노산 서열, 즉 폴리펩티드, 즉 단백질은 적어도 10개 아미노산의 길이, 예를 들어 적어도 20개 아미노산의 길이, 예를 들어 적어도 50개 아미노산의 길이일 수 있다.

참조로 포함

본 개시내용 전반에 걸쳐 특허, 특허 출원, 특허 공개, 학술지, 서적, 논문, 웹 콘텐츠와 같은 다른 문헌을 참조 및 인용하였다. 모든 이러한 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

등가물

본원에 제시되고 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형 및 그의 다수의 추가의 실시양태는, 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌에 대한 참조를 비롯한 본 문헌의 전체 내용으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본원의 대상은 그의 다양한 실시양태 및 그의 등가물에서 본 발명의 실시에 적합화될 수 있는 중요한 정보, 예시 및 지침을 함유하고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Seven Bridges Genomics Inc. Kural, Deniz <120> METHODS AND SYSTEMS FOR DETECTING SEQUENCE VARIANTS <130> SBG-002/01WO 31079/22 <140> PCT/US14/58328 <141> 2014-09-30 <150> US 61/884,380 <151> 2013-09-30 <150> US 14/041,850 <151> 2013-09-30 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 catagtacct aggtcttgga gctagtc 27 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 2 catagtacct aggtcttggc tagtc 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 3 catagtacct aggggtcttg gctagtc 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 4 catagtacct aggggtcttg gagctagtc 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 5 cataggacct aggtcttggc tagtc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 6 cataggacct aggtcttgga gctagtc 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 7 cataggacct aggggtcttg gctagtc 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 8 cataggacct aggggtcttg gagctagtc 29 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 9 ggatcgaaat gg 12 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 10 ttggatcgaa ttatggg 17 <210> 11 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 11 ttggatatgg g 11 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 12 agctacgtac actacc 16 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 13 agctatcgta ctagc 15 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 14 ggggcttatc ctgcgtccca gggcgaggac cgcttgggtt cgaatctggg 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 15 ggggcttatc ctgcgtccca gggcgcttat gatgaatgtc gacaatgcaa 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 16 ggggcttatc ctgcgtccca ggtcgcttat gatgaatgtc gacaatgcaa 50 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 17 aggtcgctta tgatg 15

Claims (55)

1. 서열에서 구조적 변이에 근접한 희귀 변이체를 확인하는 방법이며, 방법은 시스템 상에서 실행되고,
   복수의 핵산 서열 리드(read)를 수득하는 단계이며, 여기서 적어도 1개의 핵산 리드는 희귀 변이체 및 구조적 변이를 포함하며, 상기 구조적 변이는 1 킬로염기(Kb) 내지 3 메가염기(Mb) 크기를 갖는 것인 단계;
   상기 리드를 참조 비순환 방향 그래프 (DAG)와 비교하는 단계이며, 여기서 상기 참조 DAG는 컴퓨터 메모리에 저장되며 참조 DAG 내 제1 위치에 적어도 2개의 대안적 서열을 나타내는 노드를 포함하고, 상기 대안적 서열 중 1개는 구조적 변이이며, 여기서 적어도 하나의 노드는 하나 이상의 모 노드를 갖고 다수의 핵산의 서열을 나타내는 복수 개의 기호의 스트링과 연관되며, 여기서 노드의 모 노드(들)는 참조 DAG 내 다른 노드에 대해 노드의 위치를 정의하는 것인 단계;
   참조 DAG에 대한 복수 개의 핵산 서열 리드의 각각의 핵산 서열 리드의 서열 중첩을 점수화하는 단계이며, 상기 점수화는 핵산 서열 리드를 나타내는 스트링과 위치에 선행하는 참조 DAG의 부분 사이의 정렬을 점수화하는 것을 추가로 포함하고, 상기 참조 DAG의 부분에서 노드의 스트링의 각각의 기호 (d)의 선행자는, (i) 기호 (d)가 노드에 의해 나타내어지는 서열의 제1 기호가 아닌 경우에, 기호 (d)에 선행하는 기호이고; (ii) 기호 (d)가 노드에 의해 나타내어지는 서열의 제1 기호인 경우에, 기호 (d)의 노드의 모체인 임의의 노드 서열의 최종 기호인 단계;
   각각의 리드에 대한 점수가 최대화되도록 참조 DAG 상의 위치에 대해 각각의 리드를 정렬하는 단계; 및
   구조적 변이의 100 bp 이하 이내에 정렬되는 것으로 희귀 변이체를 확인하는 단계
   를 포함하는 것인, 서열에서 구조적 변이에 근접한 희귀 변이체를 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 참조 DAG에 대한 핵산 리드의 정렬에 기초하여 핵산 리드를 서로 조립하는 것을 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 구조적 변이가 1 킬로염기(Kb) 내지 3 메가염기(Mb) 크기를 갖고, 상기 방법은 참조 DAG 내 희귀 변이체가 존재하지 않는 경우, 상기 희귀 변이체를 나타내도록 참조 DAG를 업데이트하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 참조 DAG가 참조 DAG 내 제2 위치에 적어도 2개의 추가의 대안적 서열을 추가로 포함하고, 추가의 대안적 서열 중 1개가 희귀 변이체에 매치되는 서열을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 참조 DAG가 참조 DAG 내 제2 위치에 적어도 2개의 추가의 대안적 서열을 추가로 포함하고, 추가의 대안적 서열 중 어느 것도 희귀 변이체를 나타내지 않는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 제1 및 제2 위치가 100 bp 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 희귀 변이체가 이전에 변이체 지명 포맷(variant call format (VCF)) 파일에서 확인되지 않은 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 구조적 변이가 결실, 중복, 카피수 변이, 삽입, 역위 및 전위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 희귀 변이체가 결실, 중복, 역위, 삽입 및 단일 뉴클레오티드 다형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 희귀 변이체가 참조 DAG에 매치되는 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 참조 DAG가 유기체의 게놈을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 참조 DAG가 유기체의 염색체를 포함하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 희귀 변이체가 이전에 변이체 지명 포맷 (VCF) 파일에서 확인된 것인 방법.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
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