JPH10512673A - 質量分光学によるリガンドの親和力選択 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ライブラリを標的（例えば、レセプター）と接触させ、化合物-標的複合体から非結合化合物を分離し、そして複合体または溶出した化合物を質量分光計により分析することにより、組合せライブラリから化合物が迅速に選択される。SAR情報は、標的に対する化合物の、２つ以上の異なる比でこの選択を行うことにより得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 質量分光学によるリガンドの親和力選択 技術分野 本発明は薬物発見および質量分光学の分野に関する。より詳細には、本発明は 類似のリガンドのプールから選択されたレセプターと結合するリガンドを同定す るための質量分光学の使用に関する。発明の背景 GeysenのEP 198855は、多数の異なるペプチドの同時合成のための方法を開示 した。基本的に、この方法は、固体ポリマー性表面（例えばポリエチレン）上で のペプチドの合成を包含し、これはロッドまたはピンの形状に成形され得る。こ の方法の好適な実施態様においては、これらのロッドまたはピンは12×8のマト リックスを形成するようにホルダー中に位置し、ロッドおよびピンは、間隔がEL ISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）試験に広範に用いられるマイクロタイタープ レートのウェルのそれと対応するように位置している。 Huebnerら、US 5,182,366（本明細書中に参考として援用される）は、固相樹 脂上で等モル比のペプチドの多数の混合物を調製する方法を開示した。これは、 リガンド（例えば、結合したレセプター）をペプチド混合物のセットと接触させ 、そしてセットのどのメンバーが結合するかまたは反応するかを示すことにより 、リガンドに結合するか、またはリガンドと反応する化合物の迅速な探索を可能 にする。代表的には、このセットは、オリゴペプチドの１つまたは２つの位置で 既知のアミノ酸を特定すること、および他の位置でアミノ酸の混合物を提供する ことにより調製される。従って、１つのペプチドの混合物は、式Gly-Gly-X₁-X₂- X₃-X₄のヘキサペプチドのプールからなり得、ここで各Xは全てのアミノ酸がその 位置で見出されることを示す。次のペプチド混合物は、Gly-Ala-X₁-X₂-X₃-X₄、 続いてGly-Cys-X₁-X₂-X₃-X₄などである。これらの混合物の全てからなるセット を「ライブラリ」と言う。ライブラリは、それぞれの個々の混合物を試験し、そ してど の混合物が陽性の応答を生じるかを示すことによりスクリーニングされる。いく つかの形式では、この混合物は同時にスクリーニングされ得る。次いで、陽性の 混合物は特定されたさらなる位置で再合成される。従って、例えば、Phe-Tyr-X₁ -X₂-X₃-X₄を含む混合物が陽性である場合、次に合成された混合物はPhe-Tyr-Gly -X₂-X₃-X₄であり得る。このプロセス（「デコンボリューション」と呼ばれる） は、個々のペプチドが合成され、そして試験されるまで繰り返される。 BartlettらのWO91/19735およびZuckermannらのWO94/06451は、組合せ（combin atorial）ライブラリ合成を、ペプチド以外の化合物に拡張する方法を開示した 。BartlettおよびZuckermannは、N-置換ポリアミド、ポリ-カルバメート、およ び他の骨格に基づくモジュラー化合物（modular compound）を開示し、これは非 ペプチド化合物の探索を可能にする。これらのライブラリもまた、デコンボリュ ーションにより分析される。発明の開示 本発明者らは、ここに化合物のプールをデコンボリュートする必要を排除する 、質量分光学により、結合するリガンドの同一性を直接決定する方法を発明した 。これは、混合物を再合成することなく、組合せライブラリの結果の直接分析を 可能にする。 本発明の別の局面は、２つ以上の異なる化合物：標的比で、化合物を選択し、 そしてスペクトルを比較することにより、混合物中に存在する類似の活性化合物 の相対的な親和力を決定する方法である。発明の実施の形態 A．定義 用語「標的」は、結合または反応する化合物を調べるための任意の化合物、タ ンパク質、レセプターなどを言う。例えば、ライブラリがエンドセリンレセプタ ーに結合する化合物についてスクリーニングされる場合、このエンドセリンレセ プターは標的である。この標的は溶解性であり得るか、または、例えば、固相ま たは細胞表面上に固定され得る。 用語「化合物」は、質量分光学により分析され得、そして生物学的活性を有し 得る化学物質（chemical entity）を言う。本発明の範囲内の化合物は、好まし くは約100〜約1,000AU、より好ましくは約200〜900AUの分子量を有する。用語「 類似の化合物」は、実質的に同じ合成法で作製されるか、または特定の特性を共 有する化合物のセットを言う。例えば、ペプチドの混合物は、この定義の範囲内 に類似の化合物のセットを構成する。共通の骨格に基づくペプトイドのセットは 、極性、疎水性、pK、または他の特性における違いに関わらず、類似の化合物の セットである。 用語「類似の化合物の混合物」は、少なくとも10の別個の化合物、より好まし くは少なくとも100の異なる化合物、さらにより好ましくは少なくとも1,000の異 なる化合物を有する類似の化合物（上記に定義される）の溶液または懸濁液を言 う。 B． 一般的な方法 親和力選択は、代表的には、組合せライブラリから得られる化合物の混合物を 用いて行われる。この化合物は、固相に結合するよりむしろ、好ましくは溶解性 であり、そして好ましくは約200と約700ダルトンとの間の分子量を有する。この 化合物は、任意の方法、好ましくはBartlettらのWO91/19735またはZuckermannら のWO94/06451（両方とも本明細書中に参考として援用される）に記載の方法によ り調製され得る。 標的は、結合され得るか、または溶解性であり得るかのいずれかであるが、動 力学的理由のため、好ましくは溶解性である。標的は、代表的には、分子生物学 の通常の技術を用いて提供される。固定化標的は、例えば、適切な宿主細胞（例 えば、トランスフェクトされたCHO細胞または組換えバキュロウイルス感染したS f9細胞）の表面でクローン化レセプターを発現させるか、または溶解性形態でレ セプターを発現させ（例えば、トランスメンブレンアンカードメインを排除する ようにレセプターを短縮することにより）、そして適切な表面上にそれを固定す ることにより（例えば、ナイロンまたはポリスチレンアッセイプレートに対する 非特異的親和力によるか、あるいは抗体またはビオチン−アビジンカップリング 系を用いる特異的結合により）提供される。 標的および化合物（またはライブラリ）を、溶液相中かまたは固相に結合した １成分と接触させ、反応させるかまたは結合させ、そして非結合化合物を結合化 合物（または化合物-標的複合体）から分離する。化合物または標的が固相と結 合する場合、この分離は固相支持体を洗浄することにより容易に達成される。こ のアッセイが溶液中で行われる場合、この分離はサイズカラムまたは標的の親和 力捕獲（affinity capture）により達成され得る。サイズカラムは、所定のライ ブラリにおける全ての化合物が類似のサイズのようであり、そして標的または化 合物-標的複合体よりずっと小さいようであるため一般的に有用である。親和力 捕獲は、例えば、抗体または結合パートナー（例えば、アビジン／ビオチン）に 結合する「タグ」またはリガンドを標的に提供することにより行われ得る。ここ では、迅速なサイズ排除クロマトグラフィーHPLC（SEC-HPLC）により、非結合化 合物を化合物-標的複合体から分離することが好ましい。 一旦分離されると、この化合物は標的から溶出されるか、または質量分光学（ MS）分析のために直接供されるかのいずれかである。溶出は、希釈、pH、特異的 リガンドとの競合などにより達成され得る。いくつかのMSイオン化方法（例えば 、エレクトロスプレー（electrospray）、APCI、レーザー脱離、および電子衝撃 ）は、標的から化合物を分離するに十分であり、従って、前溶出（prior elutio n）せずに直接使用され得る。従って、SEC-HPLCカラムは、迅速なスループット 器具の形成のためにES MSのインプットに直接連結され得る。存在する可能性の ある化合物（すなわち、初期の混合物中に存在する化合物）の認識をもって、約 １A.Uの分解能を有するMS検出器を用いて混合物から選択されたほとんどまたは 全ての結合化合物を代表的に同定し得る。 用いられる正確なパラメーター（例えば、溶媒、温度、pHなど）は、本発明の 方法の広く一般的な性質ならびに可能な化合物および標的の多様性により、選択 される化合物および標的に必然的に依存する。しかし、このようなパラメーター は、日常的な実験のみを用い、化合物および標的がインビボで相互作用すると予 想される生理学的条件を出発点として使用して決定され得る。これらの初期条件 から、溶媒またはキャリアを変化させて、疎水性標的および／または化合物の溶 解を補助し得、そしてアッセイをよりストリンジェントにするために、一般的に 温度、pH、およびイオン強度を増加させ得る。約500pmolのレセプター、および5 00pmolのそれぞれの化合物（全体として混合物に対して約１μM）を用い、過剰 の競合リガンドを用いるか、または用いることなく開始し得る。 さらに、化合物の標的に対する比を変化させることにより、構造活性関係（SA R）を誘導し得る。例えば、1:1の化合物：標的比で最も堅い結合化合物のみが選 択される。しかし、この比が0.3:1の化合物：標的に減少すると、より低い親和 力を有する化合物もまた選択される。従って、異なる比で得られたMSスペクトル の比較は、混合物中に存在する化合物の相対的な親和力の示度を提供する。化合 物の標的に対する高い比で得られたスペクトルで表される化合物は高い親和力を 示すが、一方、低い化合物：標的比で得られたスペクトルにおいてのみ表される 化合物は第１の群より低い親和力を示す。選択された化合物の認識を用いると、 この情報は、化合物のどの性質（例えば、親水性または疎水性基、水素結合、芳 香族性の存在）が活性に対して重要であるかの迅速な決定を可能にする。この決 定は、好ましくは、化合物の標的に対する、３つ以上の異なる比で（例えば、3: 1、1:1、0.3:1、0.01:1、および0.03:1（化合物：標的）の比で）行われる。 C． 実施例 以下に示す実施例は、当業者の実施者にさらなる指針として与えられ、本発明 をいかなる方法においても限定するものとして解釈されるべきではない。 実施例１ （sUPAR結合化合物の選択） ヒトウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーターレセプター（UPAR）を、 本明細書中に参考として援用されるRosenbergら、WO94/28145に記載のように溶 解性の、短縮形態で発現させた。ペプトイド化合物を、本明細書中に参考として 援用されるBartlettら、WO91/19735に記載されるように調製した。第１（N-末端 ）位にチラミン、第２位に5-アミノインダン、そして第３（最後）位に以下の側 鎖：ジフェニル、フェニルフェニルエーテル、インダン、および1,4-ベンゾジ オキサンを有する４つのN置換グリシンペプトイドを調製した。ジフェニルまた はフェニルフェニルエーテルを第３位に有する化合物を、uPAR（＞10μM）に対 する親和力を説明するために示し、一方、他の２つの化合物は有為な活性を示さ なかった。リガンドuPA_1-48を、Rosenberg（前出）に記載されるように調製した 。 上記に明細に述べられた４つの化合物を含む576N-置換グリシンペプトイドの 混合物を調製した。この混合物（化合物当たり１μM）を、uPAR_1-48（２μM）の 存在下および非存在下でsUPAR（１μM）と接触させ、30分間インキュベートし、 そしてSEC HPLCカラム（Pharmacia HSIO/IO）に展開した。カラムの排除体積で 溶出する化合物-標的複合体を回収し、そしてES MS（PE-Sciex）で分析した。結 果は、（ジフェニルまたはフェニルフェニルエーテルを第３位に有する）同じ２ つのペプトイドが、uPA_1-48の非存在下で接触する場合、選択されたことを示し ：特異性をuPA_1-48の存在下における競合により確認した。化合物の同一性を、C CID質量分光学（衝突誘導解離（collision induced dissociation））における フラグメンテーションにより確認した。 結果は、標的に対して相対的に低い親和力を有する化合物でさえも、デコンボ リューションを必要とせずに迅速かつ正確に選択され得ることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択された標的を結合し得る化合物を選択する方法であって、該化合物が類 似の化合物の混合物中に存在し、該方法が以下の工程を包含する、方法： a) 化合物の混合物および標的部分を提供する工程； b) 該標的を該化合物の混合物と接触させ、化合物-標的複合体を形成する工 程； c) 該化合物-標的複合体から該標的に結合しない化合物を分離する工程；お よび d) 該化合物-標的複合体を質量分光光度計に通過させる工程。 ２．前記化合物の混合物および前記標的が溶解性である、請求項１に記載の方法 。 ３．前記工程c)が前記化合物および複合体をクロマトグラフィーカラムに展開さ せる工程を包含する、請求項２に記載の方法。 ４．前記クロマトグラフィーカラムがサイズカラムを含む、請求項３に記載の方 法。 ５．前記クロマトグラフィーカラムが、逆相高性能液体クロマトグラフィーカラ ムを含む、請求項３に記載の方法。 ６．前記質量分光器がエレクトロスプレーMSである、請求項１に記載の方法。 ７．請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程を包含する、方法： e) 化合物-標的複合体に関与した化合物を同定する工程。 ８．前記化合物の混合物が少なくとも10の類似の化合物の混合物を含有する、 請求項１に記載の方法。 ９．前記化合物の混合物が少なくとも100の類似の化合物の混合物を含有する、 請求項８に記載の方法。 １０．前記化合物の混合物が少なくとも1,000の類似の化合物の混合物を含有す る、請求項９に記載の方法。 １１．標的化合物に対して２つの化合物の相対的な親和力を決定する方法であっ て、該方法が以下の工程を包含する、方法： a) 化合物の混合物および標的部分を提供する工程； b) 該標的を該化合物の混合物と第１の化合物：標的比で接触させ、化合物- 標的複合体を形成する工程； c) 該化合物-標的複合体から該標的に結合しない化合物を分離する工程； d) 該化合物-標的複合体を質量分光光度計に通過させ、第１のスペクトルを 得る工程；および e) 該第１の化合物：標的比とは異なる第２の化合物：標的比で工程a)からd) を繰り返し、第２のスペクトルを得る工程。 １２．前記化合物の混合物が少なくとも10の類似の化合物の混合物を含有する、 請求項１１に記載の方法。 １３．前記化合物の混合物が少なくとも100の類似の化合物の混合物を含有する 、請求項１２に記載の方法。 １４．前記化合物の混合物が少なくとも1,000の類似の化合物の混合物を含有す る、請求項１３に記載の方法。