JPH10512588A

JPH10512588A - 新規ペプチド

Info

Publication number: JPH10512588A
Application number: JP9514360A
Authority: JP
Inventors: デフエオージヨーンズ，デボラ; フオン，トン−メイ; ガルスキイ，ビクター・エム; ジヨーンズ，レイモンド・イー; オリフ，アレン・アイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 1998-12-02
Anticipated expiration: 2016-10-02
Also published as: US6130204A; WO1997012624A1; AU7203496A; JP3481948B2; EP0853483A4; US5866679A; CA2233272A1; EP0853483A1

Abstract

(57)【要約】遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって認識され、蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドについて記載されている。さらに、in vitro および in vivo での遊離ＰＳＡプロテアーゼ活性を測定する上で有用なそのようなオリゴペプチドを含むアッセイについても記載されている。そのようなオリゴペプチドと公知の細胞毒物の接合体を含む治療薬についても記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】新規ペプチド関連出願本特許出願は、１９９５年６月６日出願の同時係属出願である０８／４６８１６１号の一部継続出願であり、該出願はそれ自体が１９９５年３月１５日出願の同時係属出願である０８／４０４８３３号の一部継続出願であり、該出願はそれ自体が１９９４年６月２８日出願の同時係属出願である０８／２６７０９２号の一部継続出願である。発明の背景１９９４年で、米国において２０万人の男性が前立腺癌と診断されていると予想され、３８０００人の米国人男性がその疾患によって死亡する（Garnick，M.B .(1994)，The Dilemmas of Prostate Cancer．Scientific American，April:72- 81）。即ち、前立腺癌は、米国男性で最も高頻度で診断される悪性腫瘍（皮膚の悪性腫瘍以外で）であり、その群における癌関連の死亡の２番目に多い原因である（肺癌の次）。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、３３ｋＤａの一本鎖糖蛋白であり、ほとんど専らヒトの前立腺上皮によって産生され、ヒト精液中０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で生じる（Nadji，M.，Taber，S.Z.，Castro，A.，et a l.(1981)Cancer 48:1229; Papsidero，L.，Kuriyama,M.，Wang，M.，et al.(198 1)．JNCI 66:37; Qui，S.D.，Young，C.Y.F.，Bihartz，D.L.，et al.(1990)，J .Urol.144:1550; Wang，M.C.，Valenzuela，L.A.，Murphy，G.P.，et al.(1979) ．Invest.Urol.17:159）。１個の炭水化物単位がアスパラギン残基の位置４５に結合し、総分子量は２〜３ｋＤａである。ＰＳＡは、キモトリプシン様の特異性を有するプロテアーゼである（Christensson，A.，Laurell，C.B.，Lilja，H.(1 990).Eur.J.Biochem.194:755-763）。ＰＳＡが主として、精子捕捉ゲル中の主要蛋白であるセメノゲリンＩ(SemenogelinI)およびセメノゲリンＩＩ、ならびにフィブロネクチンの蛋白分解によって射精時に生じるゲル構造の溶解の原因であることが明らかになっている（Lilja，H.(1985)．J.Clin．Invest.76:1899; Lilja ，H.，Oldbring，J.，Rannevik，G.，et al.(1987)．J.Clin.Invest.80:281; Mc Gee，R.S.， Herr，J.C.(1988)．Biol.Reprod.39:499）。ゲル形成蛋白のＰＳＡ介在蛋白分解によって、いくつかの可溶性のセメノゲリンＩ断片およびセメノゲリンＩＩ断片、ならびに可溶性のフィブロネクチン断片が生じ、それには射出精液の液状化および徐々に運動性となる精子の放出が伴う（Lilja ，H.，Laurell，C.B.(1984)．Scand.J.Clin.Lab.Invest．44: 447; McGee，R.S. ，Herr，J.C.(1987)．Biol.Reprod.37:431）。さらに、ＰＳＡは蛋白分解的にＩＧＦＢＰ−３（インシュリン様成長因子結合蛋白３）を分解して、ＩＧＦがＰＳＡ分泌細胞の成長を特異的に刺激できるようにすると考えられる（Cohen et al. ，(1992)J.Clin.Ehdo.& Meta.75:1046-1053）。 α−１−抗キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡが血清ＰＳＡの支配的な分子形であり、検出される血清ＰＳＡの Nilsson，O.，et al(1993)．J.Urol.150:100-105; Lilja，H.， 1625; Stenman，U.H.，Leinoven，J.，Alfthan，H.，et al.(1991)．Cancer Res .51:222-226）。前立腺組織は（正常、良性過形成または悪性組織）は主に、成熟した酵素的に活性な形のＰＳＡを放出することが示唆されており、それはその形がα−１−抗キモトリプシンと複合体を形成する上で必要であるからである（Mast，A.E.，Enghild，J.J.，Pizzo，S.V.，et al.(1991)．Biochemistry 30: 1723-1730; Perlmutter，D.H.，Glover，G.I.，Rivetna，M.，et al.(1990)．Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3753-3757）。従って、前立腺ＰＳＡ分泌細胞の微小環境ではＰＳＡは、阻害分子と複合体形成していない、成熟した酵素的に活性な形で処理・分泌されると考えられる。ＰＳＡはさらに、α−２−マクログロブリンとも安定な複合体を形成するが、それによってＰＳＡの封入とＰＳＡエピトープの完全な喪失が生じることから、その複合体形成の in vivo での意義については不明である。遊離の複合体を形成していない形のＰＳＡは、血清 Nilsson，O.，et al(1993)．J.Urol.150:100-105; Lilja，H.， 1625）。この形の血清ＰＳＡの大きさは、精液中のＰＳＡのも U.(1991).Clin.Chem．37:1618-1625）、その遊離形の血清ＰＳＡが酵素原；体内で開裂した不活性形の成熟ＰＳＡ；または酵素活性を発現するＰＳＡであるか否かに関してはまだ不明である。しかしながら、遊離の３３ｋＤａ形ＰＳＡの検出される血清濃度と比較して、血清中の未反応α−１−抗キモトリプシンおよびα−２−マクログロブリンの両方がモル比的にかなり過剰であることから（１００〜１０００倍）、その遊離形の血清ＰＳＡが酵素活性を発現するとは考えにくい（Christenss on， 37:1618-1625）。ＰＳＡの血清測定は、前立腺の腺癌の治療をモニタリングする上で有用である（Duffy，M.S.(1989)．Ann.Clin.Biochem.26:379-387; Brawer，M.K．and Lange ，P.H.(1989)．Urol.Suppl.5:11-16; Hara，M．and Kimura，H.(1989).J.Lab.Cl in.Med.113:541-548）。ただし、良性の前立腺過形成において、ならびに前立腺の手術創後にも、正常血清濃度を超えたＰＳＡが報告されている（Lilja，H.， 1625）。広く見られる転移性前立腺癌を示す前立腺切除患者において血清ＰＳＡが検出可能であることから、前立腺の転移も免疫的に活性なＰＳＡを分泌することが知られている（Ford，T.F.，Butcher，D.N.，Masters，R.W.，et al.(1985) ． Brit.J.Urology，57:50-55）。従って、ＰＳＡの蛋白分解活性によって活性化されると考えられる細胞毒性化合物は、前立腺細胞特異的であるとともに、ＰＳＡ分泌前立腺転移に特異的でもあるはずである。従って本発明の目的は、活性な遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって選択的に酵素的開裂を受ける新規なオリゴペプチドを提供することにある。本発明の別の目的は、それらの新規オリゴペプチドを組み込んだ酵素的に活性なＰＳＡについての定量的アッセイを提供することにある。本発明のさらに別の目的は、細胞毒物と接合したそれら新規オリゴペプチドを含有する、前立腺癌治療に有用な新規な抗癌組成物を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、新規抗癌組成物の投与を含む、前立腺癌の治療方法を提供することにある。発明の概要セメノゲリンＩが遊離ＰＳＡによって選択的に蛋白開裂を起こす開裂箇所がいくつか確認されている。遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって認識され、蛋白分解的に開裂するアミノ酸配列を有するオリゴペプチドについて説明する。そのようなオリゴペプチドは、in vitro および in vivo での遊離ＰＳＡプロテアーゼ活性を測定することができるアッセイで有用である。さらに、そのようなオリゴペプチドを治療薬に組み入れて、治療薬がそのようなオリゴペプチドと公知の細胞毒物との接合体を含有し、前立腺癌治療に有用なものとすることができる。図面の簡単な説明図１：セメノゲリンＩの一次アミノ酸配列セメノゲリンＩの一次アミノ酸配列を示してある（配列番号１）。ＰＳＡ蛋白分解的開裂部位（「ＣＳ」）を示してあり（ＰＳＡ加水分解に対する部位の相対的親和性の順に番号を割り付けてある）、アミノ末端から始めて順番に蛋白断片に番号を付けてある。図２：合成オリゴペプチドの開裂親和性枝分かれ型の合成オリゴペプチド類を得て、そのオリゴヌクレオチドを各種時間で、酵素的に活性な遊離ＰＳＡによって消化させた。結果を表２（図２）に示してある。オリゴペプチドはいずれも、トリフルオロ酢酸塩として調べた。図３、３Ａおよび３Ｂ：合成オリゴペプチドの開裂親和性合成オリゴペプチドを得て、それを４時間にわたって、酵素的に活性な遊離ＰＳＡによって消化させた。この期間内に開裂したオリゴペプチドのパーセントを示してある。結果は表４（図３および３Ａ）に示してある。表４ａ（図３Ｂ）には、表記のオリゴペプチドを酵素的に活性な遊離ＰＳＡによって５０％開裂させるのに必要な時間（分）を示してある。オリゴペプチドについて塩が示してない場合は、遊離塩基について調べた。図４：非開裂性オリゴペプチド−ドキソルビジン接合体の細胞毒性データ図のデータは、ドキソルビシンと、遊離ＰＳＡ蛋白分解的開裂部位を持たないオリゴペプチド（化合物１２ｄ）に共有結合的に結合したドキソルビシンの接合体の相対的細胞毒性を示してある。ドキソルビシンのＥＣ₅₀は０．３μＭであるが、アセチル化オリゴペプチドで修飾したドキソルビシンは３００倍以上低下したＥＣ₅₀を持っている。この接合体には、未修飾ドキソルビシンによるＨＰＬＣで検出可能な汚染はなかった。オリゴペプチド単独では、検出可能な殺細胞活性を持たない。図５および５Ａ：ドキソルビシンと接合したオリゴペプチドの in vitro での遊離ＰＳＡによる開裂親和性オリゴペプチド−ドキソルビシン接合体を得て、それを４時間にわたって、酵素的に活性な遊離ＰＳＡによって消化させた。この期間内に酵素的に開裂した接合体のパーセントを示してある。結果は表５（図５）に示してある。表５ａ（図５Ａ）には、表記のオリゴペプチド−細胞毒物接合体を酵素的に活性な遊離ＰＳＡによって５０％開裂させるのに必要な時間（分）を示してある。接合体について塩が示してない場合は、遊離接合体について調べた。図６：細胞ならし培地中でのドキソルビシンと接合したオリゴペプチドの開裂親和性オリゴペプチド−ドキソルビシン接合体を、ＬＮＣａＰ細胞（遊離ＰＳＡを分泌することが知られている細胞）またはＤｕＰＲＯ細胞（遊離ＰＳＡを分泌しない細胞）にさらすことでならした細胞培地と４時間反応させた。この期間中にオリゴペプチド部分で酵素的に開裂する接合体のパーセントを表示してある。結果は表６（図６）に示してある。図７および７ａ：開裂可能なオリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の細胞毒性表７（図７および７Ａ）のデータは、遊離ＰＳＡを分泌することが知られている癌細胞株に対する遊離ＰＳＡ蛋白分解開裂部位を有するオリゴペプチドに共有結合したドキソルビシンの接合体の細胞毒性（ＥＣ₅₀）を示したものである。さらに、選択した接合体について、遊離ＰＳＡを分泌しない細胞系（ＤｕＰＲＯ）に対する接合体の細胞毒性も示してある。接合体について塩が示してない場合は、遊離接合体について調べた。発明の詳細な説明本発明は、遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得る新規オリゴペプチドまたはそれの医薬的に許容される塩に関する。そのようなオリゴペプチドには、下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーなどがある。以上において、ｈＡｒｇはホモアルギニンであり、Ｃｈａはシクロヘキシルアラニンであり、Ｘａａは天然アミノ酸である。本発明の１実施態様においては、オリゴペプチドには、下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーまたはそれらの医薬的に許容される塩などがある。本発明のより好ましい実施態様においては、オリゴペプチドには、下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーまたはそれらの医薬的に許容される塩などがある。本発明のさらに別の実施態様では、オリゴペプチドには下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーなどがある。上記ならびに発明の詳細な説明の他の箇所で使用の「アミノ酸配列を有するオリゴマー」という表記は、アミノ酸配列に記載された特定のアミノ酸配列を含み、従って遊離ＰＳＡによって記載のアミノ酸配列内で蛋白分解的に開裂する約６個〜約１００個のアミノ酸残基のオリゴマーを指す。そこで例えば、GlnLeuAspA snLysIleSerTyrGln|SerSerSerThrHisGlnSerSer（配列番号２０）というオリゴマーは、AsnLysIleSerTyrGln|SerSerSerThr（配列番号１０）を有することから、本発明に含まれるものと考えられる。そのようなオリゴマーは、セメノゲリンＩおよびセメノゲリンＩＩを含まないことがわかる。さらに、本発明は、Ｎ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸あるいは両方の末端のアミノ酸が修飾されているオリゴマーも含むことも明らかである。そのような修飾には、Ｎ末端でのアミノ基のアシル化、およびＣ末端でのアミド形成によるカルボン酸基の置換などがあるが、これらに限定されるものではない。そのような部分の付加は、オリゴマーの固相合成時に行うことができる。即ち、Ｃ末端アミノ酸の固相樹脂への付着をアミン部分を介して行うことができ、その結果、樹脂からのオリゴマーの酸性条件下での開裂時にアミド部分が得られる。即ち以下の化合物が、上記で使用される「アミノ酸配列を有するオリゴマー」であると考えられるが、これらは説明のために列挙されているものであって、本発明を限定するものではない。および医薬的に許容される塩。ペプチド化学の分野の当業者であれば、元のオリゴペプチドの生理活性が修飾オリゴペプチドにおいて保存されるような形で、生理活性ペプチド中のある種のアミノ酸を、他の同族、等立体化学および／または等電子的なアミノ酸によって置換できることは容易に理解できよう。ある種の人工的アミノ酸および修飾された天然アミノ酸を用いて、本発明のオリゴペプチド中の相当する天然アミノ酸に対する置換を行うこともできる。そこで例えば、チロシンを、３−ヨードチロシン、２−メチルチロシン、３−フルオロチロシン、３−メチルチロシンなどで置換することができる。さらに例えば、リジンを、Ｎ’−（２−イミダゾリル）リジンなどで置換することができる。以下のアミノ酸置換リストは、例示を目的としたものであって、本発明を限定するものではない。元のアミノ酸置換アミノ酸 Ala Gly Arg Lys、オルニチン Asn Gln Asp Glu Glu Asp Gln Asn Gly Ala Ile Val，Leu，Met，Nle Leu Tle，Val，Met，Nle Lys Arg、オルニチン Met Leu，Ile，Nle，Val オルニチン Lys，Arg Phe Tyr，Trp Ser Thr Thr Ser Trp Phe，Tyr Tyr Phe，Trp Val Leu，Ile，Met，Nle そこで例えば、当業者には公知の方法によって、以下のオリゴペプチドを合成することができ、それらは遊離ＰＳＡによって蛋白分解的に開裂を受けると予想される。またはこれらの医薬的に許容される塩。同様に、当業者には公知の方法によって、以下のオリゴペプチドを合成することができ、それらは遊離ＰＳＡによって蛋白分解的に開裂を受けると予想される。アミノ酸配列に「｜」の記号が入っているのは、遊離ＰＳＡによってオリゴペプチドが蛋白分解的に開裂するその配列内の箇所を指している。本発明の化合物は不斉中心を持つことができ、ラセミ体、ラセミ混合物、および個々のジアステレオマーとして得られる場合があり、光学異性体を含んだ全ての可能な異性体を有し得るものであって、それらはいずれも本発明に含まれる。別段の断りがない限り、示してあるアミノ酸は、天然の「Ｌ」立体配置を有するものと理解される。本明細書および図においては、以下の略称を用いて、指定のアミノ酸および部分を示す。ｈＲまたはｈＡｒｇ：ホモアルギニンｈＹまたはｈＴｙｒ：ホモチロシンＣｈａ：シクロヘキシルアラニンＡｍｆ：４−アミノメチルフェニルアラニンＤＰＬ：２−（４，６−ジメチルピリミジニル）リジン（イミダゾリル）Ｋ：Ｎ’−（２−イミダゾリル）リジンＭｅ₂ＰＯ₃−Ｙ：Ｏ−ジメチルホスホチロシンＯ−Ｍｅ−Ｙ：Ｏ−メチルチロシンＴＩＣ：テトラヒドロ−３−イソキノリンカルボン酸ＭｅＬ：２−ケト−３−アミノ−５−メチルヘキサンＤＡＰ：１，３−ジアミノプロパンＴＦＡ：トリフルオロ酢酸ＡＡ：酢酸本発明はさらに、組成物中の蛋白分解的遊離ＰＳＡ活性のアッセイ方法に関するものでもある。それは、そのようなアッセイ系が、ある種の体液および組織に存在する遊離ＰＳＡの量を定量的に測定することができる系を提供するという点で、本発明の重要な側面である。そのようなアッセイによってさらに、遊離ＰＳＡの単離・精製を追跡することができるだけでなく、遊離ＰＳＡの蛋白分解活性の阻害剤についてのスクリーニングアッセイの基礎も提供される。そのアッセイ法は通常、酵素的に活性な遊離ＰＳＡを含むと予想される組成物がオリゴペプチドを蛋白分解的に開裂させる能力を簡単に測定することも含む。代表的には、上記のオリゴペプチドの一つを用いてアッセイプロトコールを行う。しかしながら、開裂部位を有するオリゴペプチドに標識することで、未開裂のオリゴペプチドおよび標識部分を有する開裂後に残ったオリゴペプチド部分の両方における放射性同位元素標識などのそのような標識の有無を測定できるアッセイの構築において、特に有用である可能性がある。本発明はさらに、遊離ＰＳＡの蛋白分解活性を阻害する化合物（以下、候補化合物と称する）を確認する方法に関するものでもある。このスクリーニング方法は、候補化合物が構造上蛋白であるかペプチドであるかとは無関係に、阻害などに役立つ候補化合物の確認において有用となることが想到される。そこで本発明は、被験化合物が遊離ＰＳＡの蛋白分解活性を阻害する能力を測定する方法において（ａ）被験物質の存在下に、遊離の前立腺特異的抗原による認識・選択的な蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有する基質と、遊離の前立腺特異的抗原とを反応させる段階；（ｂ）前記基質が開裂したか否かを検出し、被験物質不在下での該基質の開裂減少によって、被験物質が前立腺特異的抗原の蛋白分解活性を阻害する能力を示す段階を有してなる方法に関するものでもある。候補剤スクリーニングアッセイは、準備および実施が非常に簡単であり、蛋白分解活性の測定について前述のアッセイと多くの点で関連がある。そこで、遊離ＰＳＡの比較的精製されたものを得た後、好ましくはＰＳＡが阻害物質がなかったならばその開裂機能を発揮することができるような条件下で、蛋白分解性取得物と被験物質とを単純に混合したくなるであろう。そこで例えば、上記のオリゴペプチドなどのＰＳＡ特異的開裂部位を有する既知のオリゴペプチドをある量で混合物中に含有させたいと考えるのが一般的である。そのようにして、被験物質の存在下に、被験物質がオリゴペプチドの開裂を相対的に低減する能力を測定することができる。従って、加える被験物質存在下での活性と比較した被験物質不在下での遊離ＰＳＡの活性を測定その他の形で求めて、被験物質の相対的阻害能力を評価したくなるであろう。本発明はさらに、前立腺ガンの治療に有用な新規な抗癌組成物に関するものでもある。そのような組成物は、細胞毒物に直接または化学的連結部分を介して共有結合的に結合した本発明のオリゴペプチドを有する。オリゴペプチドと細胞毒物とのそのような組み合わせは、接合体（conjugate）と称することができる。理想的には、ＰＳＡ蛋白分解部位を有するオリゴペプチドが細胞毒物に直接結合しているかまたは化学的連結部分を介して結合しており、完全な形である場合には、細胞毒物の細胞毒性活性は大幅に低減されるか、消失する。さらに理想的には、開裂部位での付着オリゴペプチドの蛋白分解的開裂時に、細胞毒物の細胞毒性活性は大幅に上昇するか、あるいは未修飾の細胞毒物の活性まで回復する。本発明のこの態様を実施する上で必ずしも必要ではないが、本発明のこの態様の好ましい実施態様は、オリゴペプチドと存在する場合はその化学的連結部分とが遊離ＰＳＡおよび組織近位に存在する他の天然の蛋白分解酵素によって細胞毒物から分離することにより、蛋白分解的開裂箇所により、生理的環境中に未修飾の細胞毒物を放出する接合体である。接合体の医薬的に許容される塩も本発明に含まれる。直接の共有結合を介してかまたは化学的連結部分を介してかを問わず、細胞毒物に接合した本発明のオリゴペプチドは、遊離ＰＳＡによって最も強く認識され、遊離ＰＳＡによって最も容易に蛋白分解的開裂を受けるオリゴペプチドである必要はない。そこで、そのような抗癌組成物に組み入れるために選択されるオリゴペプチドは、それの遊離ＰＳＡによる選択的・蛋白分解的開裂とそのような開裂の結果生じる細胞毒物−蛋白分解性残基接合体（または、理想的な状況と考えられる場合では、未修飾の細胞毒物）の両方に関して選択される。本発明の接合体を用いて所定の生物学的応答を変えることができることから、細胞毒物は、従来の化学療法薬に限定されると解釈すべきではない。例えば細胞毒物は、所望の生理活性を有する蛋白またはポリペプチドであることができる。そのような蛋白には例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒などの毒物；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化物質などの蛋白；あるいは例えばリンフォカイン類、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）その他の成長因子などの生理的応答調節剤などがあり得る。好ましい細胞毒物には、アルキル化剤、増殖抑制剤、チューブリン結合剤などがある。好ましい種類の細胞毒物には例えば、アントラサイクリン類の医薬品、ビンカ薬類、マイトマイシン類、ブレオマイシン類、細胞毒性ヌクレオシド類、プテリジン類の医薬品、ジイネン類（diynenes）、ポドフィロトキシン類およびタキサン類などがある。これらの種類のうちの特に有用なものには例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロ−メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはエトポシドもしくはリン酸エトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（leurosidine ）、ビンデシン、ロイロシン、タキソールなどのポドフィロトキシン誘導体などがある。他の有用な細胞毒物には、エストラムスチン、シスプラチンおよびシクロホスファミドなどがある。当業者であれば、所望の細胞毒物に対して化学修飾を施して、その化合物の反応を、本発明の接合体を得る上でより有効なものとすることができる。本発明において非常に好ましい種類の細胞毒物には、下記式の医薬品が含まれる。式（１）のメトトレキセート類式中、Ｒ¹²はアミノ基または水酸基であり；Ｒ⁷は水酸基またはメチル基であり；Ｒ⁸は水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり；Ｒ⁹は水酸基またはカルボン酸の塩を形成する部分である。式（２）のマイトマイシン類式中、Ｒ¹⁰は水素またはメチル基である。式（３）のブレオマイシン類式中、Ｒ¹¹は水酸基、アミノ基、Ｃ₁〜Ｃ₃アルキルアミノ基、ジ（Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル）アミノ基、Ｃ₄〜Ｃ₆ポリメチレンアミノ基、またはである。式（４）のメルファラン式（５）の６−メルカプトプリン式（６）のシトシンアラビノシド式（７）のポドフィロトキシン類またはそれのリン酸塩式中、Ｒ¹³は水素またはメチル基であり；Ｒ¹⁴はメチル基またはチエニル基である。式（８）のビンカアルカロイド類の医薬品式中、Ｒ¹⁵はＨ、ＣＨ₃またはＣＨＯであり；Ｒ¹⁷およびＲ¹⁸が独立している場合、Ｒ¹⁸はＨであり、Ｒ¹⁶とＲ¹⁷のいずれかがエチル基であって他方はＨもしくはＯＨであり；Ｒ¹⁷およびＲ¹⁸がそれらが結合している炭素と一緒になっている場合、それらはＲ¹⁶がエチルであるオキシラン環を形成しており；Ｒ¹⁹は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル）−ＣＯまたは塩素置換された（Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル）−ＣＯである。式（９）のジフルオロヌクレオシド類式中、Ｒ²¹は下記式のいずれかの塩基であり、式中、Ｒ²²は水素、メチル基、臭素、フッ素、塩素またはヨウ素であり；Ｒ²³は−ＯＨまたは−ＮＨ₂であり；Ｒ²⁴は水素、臭素、塩素またはヨウ素である。式（１０）のアントラサイクリン類抗生物質式中、Ｒ¹は−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯ（ＣＨ₂）₃ＣＨ₃または−ＣＨ₂ＯＣＯＣＨ（ＯＣ₂Ｈ₅）₂であり；Ｒ³は−ＯＣＨ₃、−ＯＨまたは−Ｈであり；Ｒ⁴は−ＮＨ₂、−ＮＨＣＯＣＦ₃、４−モルホリニル基、３−シアノ−４−モルホリニル基、１−ピペリジニル基、４−メトキシ−１−ピペリジニル基、ベンジルアミン基、ジベンジルアミン基、シアノメチルアミン基または１−シアノ− ２−メトキシメチルアミン基であり；Ｒ⁵は−ＯＨ、−ＯＴＨＰまたは−Ｈであり；Ｒ⁶は−ＯＨまたはＨであるが、ただしＲ⁵が−ＯＨまたは −ＯＴＨＰである場合はＲ⁶は−ＯＨではない。エストラムスチン（１１）シクロホスファミド（１２）最も好ましい医薬品は、上記の式（１０）のアントラサイクリン抗生剤である。当業者には、この構造式が、当業界において異なった一般名または慣用名を持っている化合物を含むものであることは明らかである。以下の表１には、本発明での使用に特に好ましい多くのアントラサイクリン系医薬品とその一般名または慣用名を示している。表１に示した化合物中、最も好ましい細胞毒物はドキソルビシン、ビンブラスチンおよび脱アセチルビンブラスチンである。ドキソルビシン（本明細書においては「ＤＯＸ」とも称する）は、Ｒ¹が−ＣＨ₂ＯＨであり、Ｒ³が−ＯＣＨ₃であり、Ｒ⁴が−ＮＨ₂であり、Ｒ⁵が−ＯＨであり、Ｒ⁶が−Ｈである式（１０）のアントラサイクリンである。本発明のオリゴペプチド、ペプチドサブユニットおよびペプチド誘導体（「ペプチド」とも称する）は、従来のペプチド合成法、好ましくは固相法によって、その構成アミノ酸から合成することができる。次に、得られたペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。標準的なペプチド合成法については、各種文献に開示されている（例：Schroe der et al.，″The Peptides″，Vol.I，Academic Press 1965; Bodansky et al .，″Peptide Synthesis″，Interscience Publishers，1966; McOmie(ed.)″Pr otective Groups in Organic Chemistry″，Plenum Press，1973; Barany et al .，″The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology″2，Chapter 1，Academic Press，1980; Stewart et al.，″Solid Phase Peptide Synthesis″，Second E dition，Pierce Chemical Company，1984）。これらの研究の記載は、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。本発明の化合物の医薬的に許容される塩には、例えば無毒性の無機酸または有機酸から形成されるような、本発明の化合物の従来からの無毒性塩などがある。例えばそのような従来の無毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモイン（pamoic）酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２ −アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸から得られる塩などがある。ＰＳＡ開裂部位を有するオリゴペプチドおよび細胞毒物を有する本発明の接合体は同様に、医薬化学の分野で公知の方法によって合成することができる。例えば、細胞毒物の遊離アミノ酸部分は、カルボキシル末端でオリゴペプチドに共有結合的に付着して、アミド結合を形成することができる。同様に、オリゴペプチドのアミン部分と細胞毒物のカルボキシル部分の共有結合的カップリングによってアミド結合を形成することができる。その場合、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵとして知られる）および１−ヒドロキシベンオトリアゾール水和物（ＨＯＢＴとして知られる）、ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）などの試薬を、併用でまたは単独で使用することができる。さらに本発明の接合体は、ＰＳＡ開裂部位と細胞毒物との間の非ペプチド結合によって形成することができる。例えば、細胞毒物を、その細胞毒物の水酸基部分を介してオリゴペプチドのカルボキシル末端に共有結合的に付着させることで、エステル結合を形成することができる。その場合、ＨＢＴＵおよびＨＯＢＴの併用、ＢＯＰおよびイミダゾールの併用、ＤＣＣおよびＤＭＡＰの併用などの試薬を利用することができる。そのカルボン酸は、ニトロフェニルエステルを形成することで活性化し、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン）の存在下に反応させることができる。本発明の接合本はさらに、連結部単位を介してオリゴペプチドを細胞毒物に付着させることで形成することもできる。そのような連結部単位には例えば、細胞毒物のアミン部分が連結部単位と結合してアミド結合を形成し、オリゴペプチドのアミノ末端が連結部単位の他方の末端と結合してアミド結合を形成するビスカルボニルアルキルジラジカルなどがある。逆に、細胞毒物のカルボニル部分が連結部単位のアミンの一つに共有結合的に付着し、連結部単位の他方のアミンがオリゴペプチドのＣ末端に共有結合的に付着するジアミノアルキルジラジカル連結部単位も有用であると考えられる。遊離ＰＳＡ不在の場合には生理的環境に対して安定であるが、ＰＳＡ蛋白分解的開裂部位の開裂では開裂可能である他のそのような連結部単位も考えられる。さらに、ＰＳＡ蛋白分解的開裂部位の開裂時には細胞毒物に結合した状態で残るが、未修飾の細胞毒物と比較して開裂後の細胞毒物誘導体などの細胞毒性活性がほとんど低下しない連結部単位を利用することができる。当業者であれば、本発明の化合物の合成において、出発化合物および中間体における各種の反応性官能基を保護またはブロックしながら、分子の他の部分に対して所望の反応を行う必要が生じる場合があることは理解できる。所望の反応が終了した後、または所望の時間後に、そのような保護基は加水分解手段または水素化手段などによって除去されるのが普通である。そのような保護および脱保護の段階は、有機化学において従来から行われている技術である。当業者には、本発明の化合物の製造において有用であると考えられる保護基について記載のある文献がある（Protective Groups in Organic Chemistry，McOmie，ed.，Plenum Press，NY，NY(1973)およびProtective Groups inOrganic Synthesis，Greene， ed.，John Wiley & Sons，NY，NY(1981)）。例としてのみであるが、有用なアミノ保護基には、例えばホルミル基、アセチル基、ジクロロアセチル基、プロピオニル基、ヘキサノイル基、３，３−ジエチルヘキサノイル基、γ−クロロブチリル基などのＣ₁〜Ｃ₁₀アルカノイル基；ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびシンナモイルオキシカルボニル基などのＣ₁〜Ｃ₁₀アルコキシカルボニル基およびＣ₅〜Ｃ₁₅アリールオキシカルボニル基；２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基などのハロー（Ｃ₁〜Ｃ₁ ₀ ）−アルコキシカルボニル基；ならびにベンジル基、フェネチル基、アリル基、トリチル基などのＣ₁〜Ｃ₁₅アリールアルキル基およびアルケニル基などがあり得る。他の一般に使用されるアミノ保護基には、アセト酢酸メチルまたはアセト酢酸エチルなどのβ−ケトエステル類を用いて得られたエナミンの形のものである。有用なカルボキシ保護基には例えば、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、デシル基などのＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル基；２，２，２−トリクロロエチル基および２−ヨードエチル基などのハロ−Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル基；ベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基、トリフェニルメチル基、ジフェニルメチル基などのＣ₅〜Ｃ₁₅アリールアルキル基；アセトキシメチル基、プロピンオキシメチル基などのＣ₁〜Ｃ₁₀アルカノイルオキシメチル基；ならびにフェナシル基、４−ハロフェナシル基、アリル基、ジメチルアリル基、トリメチルシリル基などのトリ−（Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル）シリル基、β−ｐ−トルエンスルホニルエチル、β −ｐ−ニトロフェニル−チオエチル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、β −メチルチオエチル基、フタルイミドメチル基、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル基、２−ニトロベンズヒドリル基および関連する基などの基があり得る。同様に、有用な水酸基保護基には例えば、ホルミル基、クロロアセチル基、ベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基、４−ニトロベンジル基、トリメチルシリル基、フェナシル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、テロラヒドロピラニル基などがあり得る。アントラサイクリン系抗生物質であるドキソルビシンとオリゴペプチドとを組み合わせた好ましい実施態様に関して、以下の反応図式に本発明の接合体の合成が示してある。反応図式Ｉ反応図式ＩＩ反応図式ＩＩＩ反応図式ＩＶ反応図式Ｖ反応図式ＶＩには、本発明のオリゴペプチドとビンカアルカロイド系細胞毒物ビンブラスチンの接合体の製造を示してある。オリゴペプチドのＮ末端のビンブラスチンへの付着を示してある（S.P.Kandukuri et al.，J.Med.Chem.28:1079-1 088(1985)）。反応図式ＶＩＩには、本発明のオリゴペプチドとビンカアルカロイド系細胞毒物ビンブラスチンの接合体であって、ビンブラスチンの付着がオリゴペプチドのＣ末端で行われているものの製造を示してある。１，３−ジアミノプロパン連結部の使用は例示のみを目的としてものであり、ビンブラスチンのカルボニル基とオリゴペプチドのＣ末端との間の他のスペーサーも考えられる。さらに、図式ＶＩＩには、Ｃ４位水酸基部分が連結部単位の付加の後に再度アセチル化されている接合体の合成を示してある。本出願人らは、脱アセチルビンブラスチン接合体も有効であって、連結部である１級アミンの保護および無水酢酸と中間体との反応、それに続くアミンの脱保護という反応図式ＶＩＩに示した段階を省略してそれを得ることができることを発見した。他の位置でのオリゴペプチドとビンブラスチンの官能基の接合体は、当業界における通常の技術のいずれかによって容易に得ることができ、やはり前立腺癌の治療で有用な化合物を提供することが予想される。さらに、本発明のオリゴペプチドのＮ末端がビンブラスチンなどのある細胞毒物に共有結合的に付着しているが、同時にＣ末端が同一もしくはドキソルビシンなどの異なる細胞毒物である別の細胞毒物に付着している接合体を得ることができることも明らかである。反応図式ＶＩＩＩには、そのような複数細胞毒物接合体の合成を示してある。そのような複数細胞毒物接合体は、細胞毒物を１個のみ有する接合体より有利になる場合がある。反応図式ＶＩ反応図式ＶＩ（続き）式中、Ｒは−ＮＨ₂、−Ｏ−アルキルなどである。反応図式ＶＩＩ反応図式ＶＩＩ（続き）式中、Ｒ’はアセチル基、アルキル基、水素などである。反応図式ＶＩＩＩ反応図式ＶＩＩＩ（続き）細胞毒物が好ましい細胞毒物ドキソルビシンである本発明のオリゴペプチド− 細胞毒物接合体は下記一般式Ｉで表すことができるか、あるいはそれの医薬的に許容される塩である。式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得るものであり；Ｘ_Lは単なる結合であるか、あるいはａ）フェニルアラニンｂ）ロイシンｃ）バリンｄ）イソロイシンｅ）（２−ナフチル）アラニンｆ）シクロヘキシルアラニンｇ）ジフェニルアラニンｈ）ノルバリンｉ）ノルロイシンｊ）１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸から選択されるアミノ酸であり；Ｒは水素または−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり；Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₆アルキル基またはアリール基である。オリゴペプチド−細胞毒物接合体の好ましい実施態様では、オリゴペプチドは下記から選択されるアミノ酸配列を有してなるオリゴマーであるか、あるいはそれの医薬的に許容される塩である。以上において、Ｘａａは天然アミノ酸である。Ｘ_Lは存在しないかあるいは下記から選択されるアミノ酸であり；ａ）ロイシンｂ）イソロイシンｃ）ノルロイシンｄ）バリンＲはアセチル基、ピバロイル基またはベンゾイル基である。以下の化合物またはそれの医薬的に許容される塩は、本発明のオリゴペプチド −細胞毒物接合体の具体的な例である。式中Ｘは、オリゴペプチドのＮ末端がアシル化され、オリゴペプチドのＣ末端が３’−アミンでドキソルビシンに付着しているオリゴペプチドとドキソルビシンの接合体のさらに別の例としては、以下のものまたはそれの医薬的に許容される塩がある。細胞毒物が好ましい細胞毒物ビンブラスチンまたは脱アセチルビンブラスチンである本発明のオリゴペプチド−細胞毒物接合体は以下の一般式Ｉで示すことができるか、またはそれの医薬的に許容される塩である。式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得るオリゴペプチドまたはそれの医薬的に許容される塩であり；Ｘ_Lは単なる結合であるか、あるいはａ）フェニルアラニンｂ）ロイシンｃ）バリンｄ）イソロイシンｅ）（２−ナフチル）アラニンｆ）シクロヘキシルアラニンｇ）ジフェニルアラニンｈ）ノルバリンｉ）ノルロイシンｊ）１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸から選択されるアミノ酸であるか、またはＸ_Lは−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−であり；Ｒは水素または−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり；Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₆アルキル基またはアリール基であり、Ｒ¹⁹は水素またはアセチル基であり；ｎは１、２、３、４または５である。以下の化合物は、本発明のオリゴペプチド−脱アセチルビンブラスチン接合体またはそれの医薬的に許容される塩の具体例である。以下の化合物は、本発明の複数細胞毒物接合体またはそれの医薬的に許容される塩の具体的な例である。本発明のオリゴペプチド−細胞毒物接合体などのペプチド系治療薬が、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基などの好適な保護基で保護されたオリゴペプチド置換基の末端アミノ部分を有することが好ましいことは、当業界では公知であり、本発明において明らかである。そのような末端アミノ基の保護によって、温血動物の血漿中に存在する外因性アミノペプチダーゼの作用によるそのようなペプチド系治療薬の酵素的分解が低減または消失する。本発明のオリゴペプチド−細胞毒物接合体は、式（Ｉ）の接合体およびそれに対する医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物の形で患者に投与される。本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコその他の哺乳動物などの温血動物ならびにトリなどの温血動物の治療または診断で有用な薬剤を指す。好ましい投与形態は非経口的なものであり、特には静脈、筋肉、皮下、腹腔内またはリンパの経路によるものである。そのような製剤は、当業者には公知の担体、希釈剤または賦形剤を用いて調製することができる（それに関しては、例えばRemington' s Pharmaceutical Sciences , 16th ed., 1980, Mack Publishing Company, ed.b y Osol et al.参照）。そのような組成物は、ヒト血清アルブミン等の血清蛋白などの蛋白、リン酸化合物などの緩衝剤または緩衝物質、他の塩、あるいは電解質などを含むことができる。好適な希釈剤には例えば、無菌水、等張生理食塩水、希ブドウ糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコールまたはそのようなアルコールの混合物などがあり得る。組成物は、フェネチルアルコール、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、チメロサールなどの保存剤を含むことができる。所望に応じて、組成物には、メタ重亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤を約０．０５〜約０．２０重量％で含有させることができる。静脈投与用には、組成物の調製は好ましくは、患者に投与される量が接合体約０．０１〜約１ｇとなるように行う。好ましくは、投与量は接合体約０．２ｇ〜約１ｇとなるようにする。本発明の接合体は、治療対象の疾患の状態または変えるべき生理効果、接合体の投与方法、患者の年齢、体重および状態、ならびに担当医師が決定する他の要素などの要素に応じて広い用量範囲で有効である。そこで、ある患者に投与される量は、個々の患者ごとに決定されなければならない。以下の実施例に具体的な試薬および反応条件が説明してあるが、本発明の精神および範囲に含まれると考えられる修正が可能であることは、当業者には明らかである。従って、以下の製造および実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。実施例実施例１セメノゲリンＰＳＡ介在開裂部位の確認精液ゲルの液状化は、セメノゲリンＩの蛋白分解的断片化に伴って起こる（Li lja，H.，Laurell，C.B.，(1984)Scand.J.Clin.Lab．Inves.44，447-452）。セメノゲリンの蛋白分解的断片化は、主として前立腺特異的抗原の蛋白分解活性によるものであると考えられている(Lilja，H.，(1985)J.Clin.Invest.76，1899-1 903)。発表されているセメノゲリンＩの配列(Lilja，H.，Abrahamsson，P.A.，L undwall，A.，(1989)J.of Biol.Chem.264，1894-1900)（図１）を利用して本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーを得て、市販の前立腺ｃＤＮＡライブラリ（Clone-tech，Palo Alto，CA）から、セメノゲリンｃＤＮＡのクローニングを行った。精製セメノゲリンｃＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＴＡＣ（Line meyer, D.L., Kelly, L.J., Minke, J.G., Gimenez-Gallego, G., DeSalvo, J. and Thomas, K.A.，(1987)Bio/Technology 5，960-965）に入れた。チューブリンエピトープがセメノゲリン蛋白のカルボキシル末端に来るように、セメノゲリンｃＤＮＡの設計を行った。抗チューブリン抗体カラムで、細菌発現セメノゲリン蛋白を精製した。精製したセメノゲリンＩ蛋白を、市販の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（York Biologicals International, Stony Brook, NY）と、１２ｍＭトリスｐＨ８．０，２５ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＣａＣｌ₂中、１００：１のモル比（セメノゲリンＩ／ＰＳＡ）で混合し、各種時間でインキュベーションした。消化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分別し、ＣＡＰＳ緩衝液中、電気泳動によってプロブロット（ProBlott）濾紙（Applied Biosyste ms，Inc.，Foster City，CA）に移動させた（Matsudaira，P.,(1987)J.Biol.Che m.252, 10035-10038）。プロブロット濾紙をクマシーブルーで染色して、新規なＰＳＡ発生セメノゲリンＩ蛋白断片複数個を確認した。それらの新規な断片をメスを用いて濾紙から切り取り、その後の配列決定に供した。各種消化時間ごとに蛋白分解断片を確認することで、１０分間の消化反応を行った。セメノゲリンＩにおける５つの考えられる開裂部位に対するＰＳＡの親和性を、部位３４９／３５０＞部位３７５／３７６＞部位２８９／２９０＝部位３１５／３１６＞部位１５９／１６０と決定した。これらの相対的親和性は、各ＰＳＡ発生ペプチド断片のクマシーブルー染色強度によって求めたものである。これらの強度は、約３：１：０．６：０．３の比を持っていた。実施例２ＰＳＡ介在開裂部位を有するオリゴペプチドの製造アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａ型自動ペプチド合成装置でのアミノ酸導入のための二重カップリングプロトコールを用いて、固相合成によってオリゴペプチドを製造した。脱保護および樹脂支持体からのオリゴペプチドの除去を、フッ化水素酸液で処理することで行った。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル勾配を用いた逆相Ｃ１８シリカカラムでの分取高速液体クロマトグラフィーによってオリゴペプチドを精製した。アミノ酸組成分析、高速液体クロマトグラフィーおよび高速原子衝撃質量スペクトル分析によって、オリゴペプチドの同定および純度確認を行った。この方法によって得られたオリゴペプチドを図２に示してある。実施例３遊離ＰＳＡによるオリゴペプチド認識の評価実施例２に記載した方法に従って製造したオリゴペプチドをそれぞれ、ＰＳＡ消化緩衝液（１２ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンｐＨ８．０、０．２５ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂）に溶かし、得られた溶液をＰＳＡにモル比１００：１で加えた。各種反応時間後に、最終濃度１％（容量基準）までトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることで、反応を停止した。停止した反応を、０．１％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによって分析した。評価結果を図２に示してある。実施例２に記載の方法に従って製造した他のオリゴペプチドも、反応を４時間後に停止する同じアッセイで調べた。それらの評価結果を図３に示してある。オリゴペプチドのアミノ末端からアスパラギン残基を除去することで、ＰＳＡ介在ペプチド加水分解の大幅な喪失が生じるが、ペプチドのカルボキシル末端にグルタミン酸残基が存在することは、ＰＳＡによる認識に必須ではないように思われる。実施例４非開裂性オリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の製造表３に示したドキソルビシン誘導体を、以下の一般的反応を用いて製造した。ドキソルビシン（Sigma）および相当するペプチド（固相合成によって製造したもの、または市販品（Sigma））とＤＭＳＯの混合物に、ジイソプロピルアミンとともにＨＢＴＵおよびＨＯＢＴを加え、反応混合物を終夜攪拌した。粗反応混合物を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のアセトニトリル溶液／０．１％ＴＦＡ水溶液の勾配を用いる逆相Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって直接精製した。実施例５ドキソルビシンのペプチド誘導体の細胞毒性の in vitro アッセイ実施例４の方法に従って製造した非開裂性オリゴペピプチド−ドキソルビシン接合体の、未修飾ドキソルビシンによって殺されることがわかっている細胞株に対する細胞毒性を、アラマー・ブルー（Alamar Blue）アッセイによって評価した。具体的には、リンパ節の穿刺生検から摘出したヒト転移前立腺癌であるＬＮＣａＰ前立腺腫瘍細胞(ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ:American Type Culture Collection ，ATCC CRL 1740)またはＤｕＰＲＯ細胞を９６ウェルプレートに入れ、各種濃度の所定の接合体を含む媒体で希釈した（最終のプレートウェル容量は２００ μＬ）。細胞を３７℃で３日間インキュベーションし、次にアラマー・ブルー２０μＬをアッセイウェルに加えた。細胞をさらにインキュベーションし、アラマー・ブルーを加えてから４時間後および７時間後に、５７０ｎｍおよび６００ｎｍで、アッセイプレートをＥＬ−３１０ＥＬＩＳＡ読取装置で読み取った。各種濃度の被験接合体での相対パーセントでの生存率を、対照（接合体なし）培養物に対して計算した。未修飾ドキソルビシンおよび未修飾オリゴペプチドの細胞毒性も評価した。図３には、代表的化合物についての細胞毒性データを示してある（化合物１２ｄ）。実施例６ＬＮＣａＰ細胞からの酵素活性ＰＳＡの評価ＬＮＣａＰ無血清培地（約２００倍濃縮したもの）を組換えセメノゲリンＩ蛋白とともにインキュベーションすることで、酵素活性を示した。濃縮ならし培地中の免疫反応性ＰＳＡ約０．５μｇ（HYBRIDTECH（TandemE）elisaによって測定）を、組換えセメノゲリンＩ約３μｇと混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、消化混合物をウェスタンブロッティング法によって分析した。結果から、精液からの精製ＰＳＡおよびＬＮＣａＰならし培地からのＰＳＡが与える組み換えセメノゲリンＩ蛋白の蛋白分解マップが同一であることがわかる。そこで、ＬＮＣａＰ細胞は、酵素的に活性なＰＳＡを産生する。ＬＮＣａＰはヌードマウスにおいて腫瘍形成性であり、検出可能な濃度の循環ＰＳＡを生成する。実施例７開裂性オリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の製造以下の一般的反応を用いて、遊離ＰＳＡによって蛋白分解的に開裂するオリゴペプチドがドキソルビシンの糖部分のアミンに共有結合により付着しているドキソルビシン誘導体を製造した。ドキソルビシン（Sigma）と相当するペプチド（実施例２に記載の方法に従って、固相合成によって製造したもの）のＤＭＳＯとの混合物に、ジイソプロピルエチルアミンとともにＨＢＴＵおよびＨＯＢＴを加え、反応混合物を終夜攪拌した。粗反応混合物を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のアセトニトリル溶液／０．１％ＴＦＡ水溶液の勾配を用いる逆相Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって直接精製した。反応性アミン部分がペプチドにある場合、そのような官能基はフルオレニルメチルオキシカルボニル付加物として保護されるのが普通であり、それはピペリジンなどの２級アミンで処理することで脱離させ、次にドキソルビシンと接合させた。その接合体は下記式の構造を有し、「Ａｃ−ペプチド−ＤＯＸ（３’）」という表現で表すことができる。市販品で容易に入手できるかまたは当業界で公知の合成法によって得られる適切な出発のアミノ酸残基を用いる以外、上記の一般的方法によって、または実施例８に記載の合成経路によって製造した接合体を、図５、５Ａおよび７の表５、５ａおよび７に挙げてある。実施例８ Ac-Lys-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Dox ・酢酸段階Ａ：Ac-Lys(Fmoc)-Gln-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Leu-PAM樹脂（１） Boc-Leu-PAM 樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６７ｇ）を原料として、４３０ＡＡＢＩペプチド合成装置で保護されたペプチドを合成した。そのプロトコールでは、Boc-Ser(OBzl)、Boc-Gln、Boc-Tyr(BrZ)、Boc-Lys(Fmoc)という保護されたアミノ酸それぞれを４倍過剰（２ｍｍｏｌ）で使用した。メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣおよびＨＯＢＴ活性化を用いて、カップリングを行った。Ｎ末端アセチル基の導入には、酢酸を用いた。５０％ＴＦＡの塩化メチレン溶液を用いてＢｏｃ基の脱離を行い、得られたＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中和した。合成完了後、ペプチド樹脂を乾燥して、（１）を１．３ｇ得た。段階Ｂ：Ac-Lys(Fmoc)-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-OH（２）保護されたペプチド樹脂（１）１．３ｇを、アニソール（２ｍＬ）の存在下に、０℃で２時間にわたり、ＨＦ（２０ｍＬ）で処理した。ＨＦを留去後、残留物をエーテルで洗浄し、濾過し、ＤＭＦで抽出した。ＤＭＦ抽出液（７５ｍＬ）を濃縮乾固し、Ｈ₂Ｏで磨砕した。得られた不溶生成物（２）を濾過し、乾燥した（０．４６ｇ）。段階Ｃ：Ac-Lys(Fmoc)-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Dox（３）上記で製造した中間体（２）０．４６ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶かし、ドキソルビシン塩酸塩１２５ｍｇ（０．２１５ｍｍｏｌ）を加え、次にトリエチルアミン６０μＬ（０．４３０ｍｍｏｌ）を加えた。攪拌溶液を冷却し（０℃）、ジフェニルホルホリルアジド９２μＬ（０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、追加のＤＰＰＡ９２μＬを加え、ＴＥＡでｐＨを約７．５（ｐＨ試験紙）に調節した。１時間後、追加のＤＰＰＡ９２μＬを加え、ｐＨを約７．５に調節し、反応液を０〜５℃で終夜攪拌した。１８時間後、反応液（ＨＰＬＣ分析で反応は完結しているのが認められた）を濃縮して、油状物を得た（３）。段階Ｄ：Ac-Lys-Gln-Tyr-Ser-Ser-Ser-Leu-Dox（４）上記生成物（３）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かし、冷却し（０℃）、ピペリジン１０ｍＬを加えた。溶液を濃縮乾固し、分取ＨＰＬＣで精製した。緩衝液Ａ＝１５％酢酸−Ｈ₂Ｏ；Ｂ＝１５％酢酸ーメタノール。粗生成物を１０％Ｂ／９０％Ａ緩衝液３００ｍＬに溶かし、濾過し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Waters，DeltaPak 15μm，300Å ）で精製した。１０％Ｂから６０％Ｂへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で使用した（ｕｖ＝２６０ｎｍ）。純粋な生成物分画を集め、濃縮し、Ｈ₂Ｏからの凍結乾燥を行って、精製生成物（４）１２５ｍｇを得た。実施例９脱アセチルビンブラスチン-Leu-Asn-Lys-Ala-Ser-TSer-Ser-Ser-Leu-NH₂・酢酸（配列番号１８４）段階Ａ：NH₂-Leu-Asn-Lys(Fmoc)-Ala-Ser-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-アミド（６）ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ）０．５ｍｍｏｌを原料として、保護されたペプチドNH₂-Leu-Asn-Lys(Fmoc)-Ala-Ser(OBzl)-Tyr(BrZ)-Gln-S er(OBzl)-Ser(OBzl)-Ser(OBzl)-Leu-MBHA中間体を、４３０ＡＡＢＩペプチド合成装置で合成した。そのプロトコールでは、Boc-Leu、Boc-Asn、Boc-Lys(Fmoc) 、Boc-Ala、Boc-Ser(OBzl)、Boc-Tyr(BrZ)、Boc-Glnという保護されたアミノ酸それぞれを４倍過剰（２ｍｍｏｌ）で用いた。Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中でのＤＣＣおよびＨＯＢＴ活性化を用いて、カップリングを行った。５０％ＴＦＡの塩化メチレン溶液を用いてＢｏｃ基の脱離を行い、得られたＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中和した。乾燥した保護ペプチド樹脂（１．８０ｇ）を、アニソール（２ｍＬ）の存在下に、０℃で２時間にわたり、ＨＦ（２０ｍＬ）で処理した。留去後、残留物をＤＭＦで抽出した。ＤＭＦ抽出液（７５ｍＬ）を濃縮乾固し、アセトニトリル：Ｈ₂Ｏ＝１：１混合物に溶かし、凍結乾燥して、粗生成物７５０ｍｇを得た。一部分（２００ｍｇ）を、Ｃ１８逆相担体（Waters，μ-Bondapak）での分取ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａ＝１５％酢酸−Ｈ₂Ｏ；Ｂ＝１５％酢酸−メタノール。精製のため、粗生成物を１０％Ｂ／９０％Ａ緩衝液４００ｍＬに懸濁させ、濾過し、濾液をカラムに負荷した。１０％Ｂから５５％Ｂへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で使用した。純粋な生成物分画を集め、濃縮し、Ｈ₂Ｏからの凍結乾燥を行って、（６）を得た。段階Ｂ：脱アセチルビンブラスチン・モノヒドラジド（７）硫酸ビンブラスチン１ｇを、塩化メチレンおよび飽和重炭酸ナトリウムでの抽出によってアミン型に変換した。塩化メチレン層をＨ₂Ｏで洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で脱水し、濃縮乾固した。次に、得られたビンブラスチンを無水エタノール（２０ｍＬ）に溶かし、無水ヒドラジンを加えた（２０ｍＬ）。溶液をＮ₂雰囲気下に１７時間加熱した（６０℃）。反応液を濃縮して油状物を得て、それを塩化メチレンに溶かし、Ｈ₂Ｏで抽出し、ＭｇＳＯ₄で脱水した。溶媒留去後、化合物（７）を単離した（参考：K.S.P.Bhushana Rao et al.,J.Med.Chem．(1985)， 28:1079）。段階Ｃ：脱アセチルビンブラスチン酸アジド（８）脱アセチルビンブラスチン・モノヒドラジド（７）（４８ｍｇ、０．０６２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶かし、冷却し（−１５℃）、ＨＣｌ／ジオキサンでｐＨ約２．５（ｐＨ試験紙）の酸性とした。硝酸イソアミル（１０μＬ）を加え、次に１０分後に追加の１０μＬを加えた。ＨＰＬＣ分析で、５分後にヒドラジドが完全にアジドに変換されていることが示された。用時まで、アジドを −１５℃で溶液のまま保管した。段階Ｄ：脱アセチルビンブラスチン-Leu-Asn-Lys-Ala-Ser-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser -Leu-NH₂・酢酸（５）段階Ａからのオリゴペプチド生成物（６）３２ｍｇ（０．０２２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、冷却した（−１５℃）。この溶液に、脱アセチルビンブラスチン酸アジド（８）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液（０．０３１ｍｍｏｌ）を加えた。トリエチルアミンでｐＨを約７．５（ｐＨ試験紙）に調節し、反応液を−５℃（２時間）および０℃で１８時間攪拌した。反応液にＨ₂Ｏ（２ｍＬ）を加え、溶液の溶媒留去を行って乾固させた。得られた中間体をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かし、冷却し（０℃）、ピペリジン２ｍＬを加えた。溶液を濃縮乾固し、段階Ａに記載の方法に従って分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な分画を集め、濃縮し、Ｈ₂Ｏから凍結乾燥して、（５）を得た。実施例１０脱アセチルビンブラスチン-Leu-Asn-Lys-Ala-Ser-TSer-Ser-Ser-Leu-Dox・酢酸（１０）段階Ａ：脱アセチルビンブラスチン-Leu-Asn-Lys(Fmoc)-Ala-Ser-Tyr-Gln-Ser-S er-Ser-Leu-Dox・酢酸（９）実施例９の段階Ａに記載の方法に従って製造したオリゴペプチド生成物（６）（１６６ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（３ｍＬ）に溶かし、冷却して−１５℃とした。この溶液に、実施例９の段階Ｃに記載の方法で製造した脱アセチルビンブラスチン酸アジド（８）のＤＭＦ溶液（０．１２５ｍｍｏｌ）を加えた。トリエチルアミンでｐＨを約７．５（ｐＨ試験紙）に調節し、反応液を−１５℃で９０分間攪拌した。０〜５℃で１８時間攪拌後、反応液を濃縮乾固し、粗残留物をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かし、濾過した。ドキソルビシン塩酸塩６２ｍｇ（０．１０６ｍｍｏｌ）を濾液に加え、次にトリエチルアミン３０μＬを加えた。溶液を攪拌しながら冷却し（０℃）、ジフェニルホルホリルアジド２７μＬ（ＤＰＰＡ、０．１３４ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、追加のＤＰＰＡ２７μＬを加え、ＴＥＡでｐＨを約７．５に調節した（ｐＨ試験紙）。１時間後、追加のＤＰＰＡ２７μＬを加え、ｐＨを約７．５に調節し、反応液を０〜５℃で終夜攪拌した。１８時間後、反応液（ＨＰＬＣ分析で反応が完結していることが認められた）を濃縮して、油状物（９）を得た。段階Ｂ：脱アセチルビンブラスチン-Leu-Asn-Lys-Ala-Ser-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser -Leu-Dox・酢酸（１０）上記の中間体生成物（９）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かし、冷却し（０℃）、ピペリジン１０ｍＬを加えた。溶液を濃縮乾固し、分取ＨＰＬＣで精製した。緩衝液Ａ＝１５％酢酸−Ｈ₂Ｏ；Ｂ＝１５％酢酸−メタノール。粗生成物を１０％Ｂ／９０％Ａ緩衝液３００ｍＬに溶かし、濾過し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Waters，μ-Bondapak）で精製した。１０％Ｂから６０％Ｂへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で使用した（ｕｖ＝２６０ｎｍ）。半精製生成物を、緩衝液Ａ＝０．１３ＭｐＨ３．０リン酸トリエチルアンモニウムおよび緩衝液Ｂ＝アセトニトリルを用いるＣ１８（Waters，PrepPak）でさらに精製した。１０％Ｂから４０％Ｂへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で使用した（ｕｖ＝２１４ｎｍ）。純粋な生成物分画を集め、Ｈ₂Ｏで希釈し、生成物を同じカラムに負荷し、酢酸塩としての生成物を９０％アセトニトリル／１０％Ｈ₂Ｏ(１％酢酸)で溶離することで脱塩を行った。生成物分画を濃縮し、Ｈ₂Ｏからの凍結乾燥を行って、精製生成物（１０）を得た。実施例１１ Ac-Lys-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Nle-NH-(CH₂)₃NH- 脱アセチルビンブラスチンアミド（１４）段階Ａ：脱アセチルビンブラスチン−３−アミノプロピルアミド（１１）冷却した（−１５℃）脱アセチルビンブラスチン酸アジド（実施例９の段階Ｃに記載の合成）のＤＭＦ溶液（３ｍＬ、０．０６２４ｍｍｏｌ）に、１，３−ジアミノプロパン（１２０μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を加えた。反応液を−１０℃で１時間攪拌し、濾過し、濃縮乾固して、（１１）を得た。段階Ｂ：脱アセチルビンブラスチン−３−アミノプロピルアミド−ノルロイシンアミド（１２）Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（２２ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＨＯＢＴの１Ｍ溶液（ＮＭＰ溶液）３１８μＬと次にＤＣＣの１Ｍ溶液（ＮＭＰ溶液）２８０μＬを加えた。３０分後、中間体（１１）（０．０６２４ｍｍｏｌ）を３．５ｍＬＤＭＦ溶液で加えた。ジイソプロピルエチルアミンで反応液のｐＨを約７．５に調節した。１８時間攪拌後、反応液を濃縮して油状物を得て、ＴＦＡ：ＣＨ₂Ｃｌ₂の１：１溶液（２０ｍＬ）で油状物を処理することで、Ｂｏｃ保護基を脱離させた。５分後、反応液を濃縮して乾固させた。Ｃ１８逆相担体（Waters，DeltaPak）での分取ＨＰＬＣによって精製を行った。緩衝液Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ₂Ｏ；Ｂ＝０．０１％ＴＦＡ−ＣＨ₃ＣＮ。粗生成物を１００％Ａ緩衝液（１００ｍＬ）に溶かして負荷し、１００％Ａから３０％Ａへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で用いた。純粋な生成物分画を厚め、凍結乾燥して、（１２）を得た。段階Ｃ：Ac-Lys(Fmoc)-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Nle-OH（１３）実施例９、段階Ａに記載の方法に従って上記の中間体を製造して、Ac-Lys(Fmo c)-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-OHの製造を行った。段階Ｄ：Ac-Lys-Tyr-Gln-Ser-Ser-Ser-Nle-NH-(CH₂)₃NH-脱アセチルビンブラスチンアミド（１４）オリゴペプチド生成物（１３）（７０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を、（１２）（４１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と混合した。その溶液を冷却し（０℃）、ジフェニルホスホリルアジド１７ μＬ（０．０８ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、ＤＰＰＡ１７μＬを加え、トリエチルアミンでｐＨを約７．５（ｐＨ試験紙）に調節した。２時間後、追加の（１３）３５ｍｇをＤＭＦ溶液（０．５ｍＬ）で加え、ＤＰＰＡ１７μＬを加えた。ＴＥＡによってｐＨを約７．５に維持し、３時間後、追加の（１３）３５ｍｇをＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液で加えた。反応液を０〜５℃で攪拌した。１８時間後、反応液を濃縮乾固し、ＤＭＦ（９ｍＬ）に再度溶解させ、冷却し（０℃）、ピペリジン３ｍＬを加えた。溶液を濃縮乾固し、分取ＨＰＬＣで精製した。緩衝液Ａ＝０．１％ＴＦＡ− Ｈ₂Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ₃ＣＮ。粗生成物を３０％酢酸−Ｈ₂Ｏ（１００ｍＬ）に溶かし、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Waters, DeltaPak ）で精製した。１００％Ａから７０％Ａへの段階的勾配を、流量７５ｍＬ／分で用いた。半精製分画を集め、凍結乾燥した。前述のようにＣ４担体（Waters，De laPak）での再精製を行って、純粋になるまで精製した。生成物分画を集め、凍結乾燥して純粋な（１４）を得た。実施例１２オリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の遊離ＰＳＡによる認識の評価実施例７〜９に記載の方法に従って製造した接合体をそれぞれ、ＰＳＡ消化緩衝液（１２ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンｐＨ８．０、２５ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂）に溶かし、その溶液をＰＳＡにモル比１００：１で加えた。各種反応時間後に、トリフルオロ酢酸を最終濃度１％（容量基準）となるまで加えることで反応を停止した。停止した反応を、０．１％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによって分析した。評価結果を図５の表５および５ａに示してある。実施例１３細胞ならし培地でのオリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の開裂の評価血清を含まない細胞ならしα−ＭＥＭ培地（フェノールレッドを含まない）を、ＬＮＣａＰ細胞系またはＤｕｐｒｏ細胞株（J.Urology，146:915-919(1991)に記載の方法に従って得たもの）に加えてから３日後に、培地を回収した。分子量１００００置）を用いて、培地を２０倍に濃縮した。ＬＮＣａＰならし培濃度で遊離ＰＳＡ蛋白を含有していた。Ｄｕｐｒｏ細胞ならし培地では、検出可能な遊離ＰＳＡはなかった。濃縮ならし培地１００μＬずつを、実施例７に記載の方法に従って製造したオリゴペプチド−ドキソルビシン接合体３５μｇと混合し、混合物を３７℃で０時間、４時間、２４時間でインキュベーションした。ＺｎＣｌ₂を加えることで（最終濃度０．０１Ｍまで）反応を停止し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ１８カラムでのＨＰＣＬによって分析することで、消化されたペプチド−細胞毒物接合体のパーセントを求めた。評価結果を図６の表６に示してある。実施例１４ドキソルビシンのペプチド誘導体の細胞毒性の in vitro でのアッセイ未修飾ドキソルビシンによって殺されることがわかっている細胞株に対する、実施例７に記載の方法に従って製造した開裂可能なオリゴペプチド−ドキソルビシン接合体の細胞毒性を、実施例５に記載の方法に従ってアラマー・ブルーアッセイで評価した。具体的には、９６ウェルプレート中のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍細胞またはＤｕＰＲＯ細胞の細胞培地を、各種濃度の所定の接合体を含む培地で希釈した（最終プレートウェル容量２００μＬ）。細胞を３７℃で３日間インキュベーションし、アラマー・ブルー２０μＬをアッセイウェルに加える。細胞をさらにインキュベーションし、アラマー・ブルーを加えてから４時間後および７時間後に、２つの波長５７０ｎｍおよび６００ｎｍでＥＬ−３１０ＥＬＩＳＡ読取装置でアッセイプレートを読み取った。次に、対照（接合体なし）培地との比較で、各種濃度の被験接合体での相対的生存率（パーセント）を計算した。同じアッセイで評価した未修飾ドキソルビシンおよび未修飾オリゴペプチドの細胞毒性と、接合体の細胞毒性との比較も行った。このアッセイの結果を図７の表７に示してある。実施例１５ペプチド−細胞毒物接合体の in vivo での効力ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ細胞またはＤｕＰＲＯ細胞をトリプシン処理し、成長培地に再懸濁し、２００×ｇで６分間遠心する。細胞を血清を含まないα−ＭＥＭに再懸濁し、計数する。所望数の細胞を含む適切な容量のこの溶液を円錐形遠心管に移し入れ、前述のように遠心し、適切な容量のα−ＭＥＭ−マトリゲル（Matr igel）の冷１：１混合物に再懸濁させる。この懸濁液を氷上で保管して、動物への接種に供する。ハーラン（Harlan）スプレーグ・ドーリー雄ヌードマウス（１０〜１２週齢）を麻酔を施さずに拘束し、２２Ｇ針を用いる皮下注射によって左脇腹に細胞懸濁液０．５ｍＬを接種する。マウスには、約５×１０⁵個のＤｕＰＲＯ細胞または１．５×１０⁷個のＬＮＣａＰ．ＦＧＣ細胞のいずれかを接種する。腫瘍細胞を接種した後、マウスを下記の２つのプロトコールのいずれかで処置する。プロトコールＡ：細胞接種の１日後、動物に０．１〜０．５ｍＬの容量の被験接合体、ドキソルビシンまたは媒体対照（無菌水）を投与する。接合体およびドキソルビシンの用量は、最初に最大非致死量とするが、その後はそれより低い力価とすることができる。同じ用量を５日間にわたって２４時間間隔で投与する。１０日後、マウスから採血を行い、ＰＳＡの血清濃度を測定する。同様の血清ＰＳＡ濃度を、５〜１０日間隔で測定する。５．５週間経過後、マウスを屠殺し、存在する腫瘍の重量を測定し、血清ＰＳＡを再度測定する。アッセイの開始時および終了後に、動物の体重を測定する。プロトコールＢ細胞接種から１０日後、動物から採血を行い、ＰＳＡの血清濃度を求める。次に、動物をそのＰＳＡ血清濃度に従って群分けする。細胞接種から１４〜１５日後に、動物に容量０．１〜０．５ｍＬの被験接合体、ドキソルビシンまたは媒体対照（無菌水）を投与する。接合体およびドキソルビシンの用量は、最初に最大非致死量とするが、その後はそれより低い力価とすることができる。同じ用量を５日間にわたって２４時間間隔で投与する。５〜１０日間隔で、血清ＰＳＡ濃度を測定する。５．５週間経過後、マウスを屠殺し、存在する腫瘍の重量を測定し、血清ＰＳＡを再度測定する。アッセイの開始時および終了後に、動物の体重を測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 5/107 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/06 7/08 ＺＮＡ 7/08 ＺＮＡ 14/47 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フオン，トン−メイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ガルスキイ，ビクター・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ジヨーンズ，レイモンド・イーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者オリフ，アレン・アイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．遊離前立腺特異的抗原によって認識され、選択的に蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有してなるオリゴペプチドの医薬的に許容される塩。２．アミノ酸配列が下記のものである請求項１に記載の医薬的に許容される塩；（hArgはホモアルギニンであり、Xaaは天然アミノ酸である）。３．アミノ酸配列が下記のものである請求項２に記載の医薬的に許容される塩；４．アミノ酸配列が下記のものである請求項２に記載の医薬的に許容される塩；５．アミノ酸配列が下記のものである請求項２に記載の医薬的に許容される塩；６．下記から選択される請求項１に記載の医薬的に許容される塩；７．下記のものである請求項１に記載の医薬的に許容される塩；８．遊離前立腺特異的抗原によって認識され、選択的に蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有してなるオリゴペプチドにおいて、アミノ酸配列が下記のものであるオリゴペプチド、またはそれの医薬的に許容される塩；（hArgはホモアルギニンであり、Chaはシクロヘキシルアラニンである）９．遊離前立腺特異的抗原によって認識され、選択的に蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有してなるオリゴペプチドにおいて、アミノ酸配列が下記のものであるオリゴペプチド、またはそれの医薬的に許容される塩；１０．オリゴペプチドに付着した細胞毒物を有する前立腺癌治療に有用な接合体の医薬的に許容される塩であって、オリゴペプチドが遊離前立腺特異的抗原によって認識され、選択的に蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有し、付着手段が共有結合または化学的連結部である塩。１１．細胞毒物が、下記の種類のものから選択される細胞毒物類のものである請求項１０に記載の医薬的に許容される塩；ａ）アントラサイクリン類の医薬品ｂ）ビンカアルカロイド薬類ｃ）マイトマイシン類ｄ）ブレオマイシン類ｅ）細胞毒性ヌクレオシド類ｆ）プテリジン類の医薬品ｇ）ジイネン類ｈ）エストラムスチンｉ）シクロホスファミドｊ）ポドフィロトキシン類およびｋ）タキサン類１２．細胞毒物が、下記の細胞毒物から選択される請求項１０に記載の医薬的に許容される塩；ａ）ドキソルビシンｂ）カルミノマイシンｃ）ダウノルビシンｄ）アミノプテリンｅ）メトトレキセートｆ）メトプテリンｇ）ジクロロ−メトトレキセートｈ）マイトマイシンＣｉ）ポルフィロマイシンｊ）５−フルオロウラシルｋ）６−メルカプトプリンｌ）シトシンアラビノシドｍ）ポドフィロトキシンｎ）エトポシドｏ）リン酸エトポシドｐ）メルファランｑ）ビンブラスチンｒ）ビンクリスチンｓ）ロイロシジンｔ）ビンデシンｕ）エストラムスチンｖ）シスプラチンｗ）シクロホスファミドｘ）ロイロシン、およびｙ）タキソール１３．細胞毒物が、ドキソルビシンおよびビンブラスチンあるいはそれらの細胞毒性誘導体から選択される請求項１０に記載の医薬的に許容される塩。１４．細胞毒物がドキソルビシンまたはそれの細胞毒性誘導体である請求項１０に記載の医薬的に許容される塩。１５．下記式Ｉの構造を有する請求項１４に記載の医薬的に許容される塩。［式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得るものであり；Ｘ_Lは存在しないか、あるいはａ）フェニルアラニンｂ）ロイシンｃ）バリンｄ）イソロイシンｅ）（２−ナフチル）アラニンｆ）シクロヘキシルアラニンｇ）ジフェニルアラニンｈ）ノルバリンｉ）ノルロイシン、およびｊ）１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸から選択されるアミノ酸であり；Ｒは水素または−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり；Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₆アルキル基またはアリール基である。１６．オリゴペプチドが、下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーである請求項１５に記載の医薬的に許容される塩、またはそれの医薬的に許容される塩；［上記において、hArgはホモアルギニンであり、Xaaは天然アミノ酸であり；Ｘ_Lは存在しないかあるいは下記から選択されるアミノ酸であり；ａ）ロイシンｂ）イソロイシンｃ）ノルロイシンｄ）バリンＲはアセチル基、ピバロイル基またはベンゾイル基である。］１７．下記から選択される請求項１４に記載の医薬的に許容される塩。［式中Ｘは、１８．下記式Ｉの構造を有する前立腺癌治療に有用な接合体またはそれの医薬的に許容される塩。［式中、オリゴペプチドは、下記から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴマーであり hArgはホモアルギニンであり、Chaはシクロヘキシルアラニンであり；Ｘ_Lは存在しないかあるいは下記から選択されるアミノ酸であり；ａ）ロイシンｂ）イソロイシンｃ）ノルロイシンおよびｄ）バリンＲはアセチル基、ピバロイル基またはベンゾイル基である。］１８．下記から選択される前立腺癌治療に有用な接合体またはそれの医薬的に許容される塩；２０．下記式ＩＩの構造を有する前立腺癌の治療に有用な接合体またはそれの医薬的に許容される塩。［式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得るオリゴペプチドであり；Ｘ_Lは存在しないか、あるいはａ）フェニルアラニンｂ）ロイシンｃ）バリンｄ）イソロイシンｅ）（２−ナフチル）アラニンｆ）シクロヘキシルアラニンｇ）ジフェニルアラニンｈ）ノルバリンｉ）ノルロイシンｊ）１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸から選択されるアミノ酸であるか、またはＸ_Lは−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−であり；Ｒは水素または−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり；Ｒ¹はＣ₁〜Ｃ₆アルキル基またはアリール基であり、Ｒ₁₉は水素またはアセチル基であり；ｎは１、２、３、４または５である。２１．下記式ＩＩの構造を有する請求項２０に記載の接合体の医薬的に許容される塩またはそれの医薬的に許容される塩。［式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異的抗原の酵素活性によって蛋白分解的に開裂し得るオリゴペプチドである。］２２．下記から選択される請求項２０に記載の接合体またはそれの医薬的に許容される塩。および２３．オリゴペプチドに付着した２個の細胞毒物を有する前立腺癌治療に有用な接合体であって、オリゴペプチドが遊離前立腺特異的抗原によって認識され、選択的に蛋白分解的開裂を受けるアミノ酸配列を有し、付着手段が共有結合または化学的連結部である接合体またはそれの医薬的に許容される塩。２４．下記式の構造を有する請求項２３に記載の接合体またはそれの医薬的に許容される塩。