JPH10512284A - 骨組織の局所的形成のためのプラスミノーゲンアクティベーターの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示されるプラスミノーゲンアクティベーターは、局所的骨形成を刺激する薬剤の調製のために適している。そのアクティベーターは、好ましくは、治療されるべき体内の場所に、担体に組み込まれて、局所的に適用される。

Description

【発明の詳細な説明】 骨組織の局所的形成のためのプラスミノーゲンアクティベーターの使用 本発明は、骨組織の局所的形成のための薬剤を調製するためのプラスミノーゲ ンアクティベーターの使用、及びこの適用に適した医薬組成物に関する。骨の塊 の局所的形成は、例えば腫瘍による骨の破壊の場合の骨破損の治癒のため、美容 外科のため、歯のプロテーゼのための材料の移植のため又は人工股関節部もしく は膝関節のような骨置換材料のため又は爪及びねじのような補助材料の組込みを 支持するために必要である。 成長因子、例えばトランスホーミング増殖因子−β(TGF−β)、塩基性繊維芽 細胞増殖因子（bFGF）及び血小板由来増殖因子（PDGF）は、骨形成にプラスに影 響を与えることが知られている(Pierceら、J．Cell．Biol．109（1989）429〜44 0)。 本発明の目的は、局所的に適用した時に骨の成長及び骨の治癒（骨形成）を支 持する更なる剤を提供することである。 本発明は、局所的な骨形成のための剤を製造するためのプラスミノーゲンアク ティベーターの使用に関する。プラスミノーゲンアクティベーターは、好ましく は、溶液として（注射又は注入）又は担体結合形態において処理されるべき体の 部分に局所的に投与される。 プラスミノーゲンアクティベーターは、アルギニン 506とバリン 561との間を 開裂してセリンプロテアーゼプラスミンを形成することにより、チモーゲンプラ スミノーゲンを活性化するタンパク質酵素として理解される。プラスミンは、フ ィブリンを含む多数のタン パク質を開裂することができる。プラスミノーゲンアクティベーターは、例えば ウロキナーゼ(uPA)、組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔ−PA）及びス トレプトキナーゼである。ウロキナーゼは、３つのドメイン（表皮成長因子様ド メイン(EGF)、クリングルドメイン及びセリンプロテアーゼドメイン）に分ける ことができる 411アミノ酸から構成される。ウロキナーゼは、1982に既に精製さ れ、キャラクタライズされている。その組換え生産は、Holz，W．E.ら(Biotechn ology 3（1985）923〜929)により記載されている。 ｔ−PAは、527アミノ酸から構成されるタンパク質である。それは、フィンガ ー領域、EGF様ドメイン、２のクリングル領域及びセリンプロテアーゼ領域とし て言及される種々のドメインも含む。ｔ−PAは、Collen，D.ら(Thromb．Haemost as．43（1980）77〜89)により精製され、キャラクタライズされている。その組 換え生産は、Pennica，D.ら(Nature 301（1983）214〜220)に記載されている。 ウロキナーゼ及びｔ−PAの誘導体及び変異体は、Harris T．J．R.(Protein Engi neering 1（1987）449〜458)に記載されている。 特にプラスミノーゲン分解及び免疫学的特性並びにフィブリン結合に関してヒ トｔ−PAに似た特性を有するプラスミノーゲンアクティベーターが好ましくは用 いられる。 低フィブリン結合性を有するプラスミノーゲンアクティベーターが特に好まし く用いられる。このようなプラスミノーゲンアクティベーターは、例えば WO 90 ／09437 に記載され、好ましくはクリングル２及びｔ−PAのプロテアーゼドメイ ンから構成される。 治療されるべき体の部位、好ましくは骨組織へのプラスミノーゲンアクティベ ーターの適用は、溶液において、便利には注射もしくは注入（好ましくは局所的 注射）によって、又は担体と結合してのいずれかで行うことができる。担体結合 プラスミノーゲンアクティ ベーターは、例えばゲル、ペースト又はコーティングとしてインプラントに適用 することができる。 バイオコンパチブルな及び好ましくは生分解性の材料が担体として用いられる 。好ましくは、その材料自体も更に創傷治癒又は骨形成を誘導する。 その適用のために、それを固定化し、この調製物を、治療されるべき骨上の部 位に直接適用するために、そのプラスミノーゲンアクティベーターを重合ゲル又 はフィルム内に埋め込むことが好ましい。このようなポリマーベースのゲル又は フィルムは、例えばグリセロール、メチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリエチ レンオキシド及び／又はポリオキサマーから本質的に構成される。コラーゲン、 ゼラチン及びアルギネートも適しており、例えば WO 93／00050 及び WO 93／20 859 に記載される。他のポリマーは、ポリ乳酸(PLA)及び乳酸とグリコール酸と のコポリマー(PLPG)（Hollingerら、J．Biomed．Mater．Res．17（1983）71〜82 ）並びに骨誘導性“脱灰化骨マトリックス”(DBM)(Gutermanら、Collagen Rel． Res．8（1988）419〜431)である。例えば TGF−βを吸着するのに用いられるポ リマーも適しており、EP-A 0 616 814及びEP-A 0 567 391に記載され、WO 91／1 8558 による合成骨マトリックスも適している。 骨置換材料又は他の治療に活性な物質の移植に通常用いられる材料も、プラス ミノーゲンアクティベーターのための担体として適している。このような担体は 、例えば硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト及びポリ 無水物にも基づく。これらの生物分解性担体とは別に、生物分解性ではないがバ イオコンパチブルである担体も適している。このような担体は、例えば、半融ヒ ドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート又は他のセラミック材料（例 えばカルシウムアルミネートホスフェート）である。 これらの材料は、好ましくは、生物分解性材料、例えば特にポリ乳酸、ヒドロキ シアパタイト、コラーゲン又はリン酸三カルシウムと組み合わせて用いられる。 更なる非分解性ポリマーは、例えば米国特許 4,164,560に記載される。 作用の部位に少量で連続的にプラスミノーゲンアクティベーターを放出するこ とが特に好ましい。担体に結合したプラスミノーゲンアクティベーターは、好ま しくはこのために用いられる。Innovative Research of America(Toledo，Ohio ，USA)からの徐放性ペレットがこのために特に適している。好ましくは１日当り １〜10mg／kgの毎日の投与で 100日までの数日間にわたって、プラスミノーゲン アクティベーターを放出するペレットが特に好ましく用いられる。 本発明による適用目的のためのプラスミノーゲンアクティベーターの投与量は 、便利には、溶液における投与のために 0.1μｇ／ml〜 100μｇ／mlの間である 。投与される溶液の量は治療されるべき骨の部位の大きさに主による。しかしな がら、注射当り１mlが通常投与される。投与の数は予後により、当業者によって 決定され得る。 溶液における投与のために、プラスミノーゲンアクティベーターは、水、ポリ エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、天然の油、例えば植 物油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は種々の緩衝液に溶かすこ とができる。当業者に周知である他のアジュバントも用いることができる。 本発明は、以下の実施例及び図面により更に解明される。その実施例は、本発 明の教授の範囲内で種々であり得る本発明を行うための助けとして理解されるべ きである。 図１Ａは、骨密度へのｒ−PA（クリングル２及びプロテアーゼからのｔ−PA誘 導体）の影響を示す(Ｃ＝対照溶液(100％))。 図１Ｂは、骨密度へのプラスミノーゲンの影響を示す(Ｃ＝対照溶液(100％)) 。 図２は、骨密度へのｒ−PA及びｔ−PAの影響を示す(Ｃ＝対照溶液(100％))。 図３は、骨密度へのｔ−PAのプロテアーゼドメインの影響を示す(Ｃ＝対照溶 液(100％))。 実施例１ 固定化されたプラスミノーゲンアクティベーターの調製 TCP(リン酸三カルシウム、粒径 150〜250 μｍ、WO 94／15653 に従って調製) を、脱発熱物質化のために0.5mol／ｌ NaOH でプレ処理する。その粒子を、50mm ol／ｌのアルギニン／HCl、pH７〜7.4 中１〜1000mg／ｌプラスミノーゲンアク ティベーターの溶液と共にインキュベートすることにより、プラスミノーゲンア クティベーターでのコーティングを行う。 プラスミノーゲンアクティベーターのセラミック粒子への吸着を、粒子とのイ ンキュベーションの前及び後にその溶液のUV吸光度を測定することにより決定し た。それは約 1.5μｇプラスミノーゲンアクティベーター／mgセラミック粒子で ある。 コートされたセラミックを、各々30分、水及び PBSで洗った。そのコーティン グは、その洗ったセラミックを、0.4mol／ｌリン酸ナトリウム緩衝液、pH６〜８ の溶液と共にインキュベートすることにより検査した。その担体から溶出したプ ラスミノーゲンアクティベーターは、その上清から検出することができる。固定 化されたプラスミノーゲンアクティベーターの酵素／タンパク質分解活性を検出 するのも可能である。 ２．プラスミノーゲンアクティベーターによる生体内骨形成 Mackie及びTrechsel(Bone 11（1990）295〜300)に従う実験モデ ルにおいて骨形成の検出を行う。 2．1．動物の処理 2．1．1. プラスミン及びｒ−PA 雌の７週を経た成熟Balb／ｃマウス（体重約20ｇ）を、各々６の動物のグルー プに任意に分けた。種々の投与量のプラスミン又はプラスミノーゲンアクティベ ーターｒ−PA(WO 90／09437 に従って調製されたＫ２及びＰドメインからのｔ− pA（組織プラスミノーゲンアクティベーター）の組換え誘導体)を４つのグルー プに投与し、ここで１つのグループを対照として供し、中性タンパク質としてウ シ血清アルブミン(BSA)を含み、プラスミノーゲンアクティベーターを含まない 緩衝液を受容させた。50μｌの対応する溶液を、ハミルトン（Hamilton）シリン ジにより、頭皮下に頭蓋冠に直接、各々の動物に１日１回、投与した。投与の期 間は、２回の適用期間の間に２日の休みを入れて２×５日であった。 0.001Ｕ／ml、0.01Ｕ／ml、0.1Ｕ／ml及び１Ｕ／mlの濃度の１mg／mlのウシ血 清アルブミン(BSA)を含む PBS中のプラスミンの溶液、又は 0.1mg／ｌ、１mg／ ｌ、10mg／ｌ及び 100mg／ｌの濃度の PBS／１mg／ml BSA中のｒ−PAの溶液を用 いた。アリコートを−20℃に保存し、各々を投与直前に解凍した。プラスミンの 場合、１日の投与量に動物当り５×10^-5Ｕ、５×10⁴Ｕ、５×10^-3Ｕ及び５×10^{- 2} Ｕであり、ｒ−PAの場合、動物当り 0.005μｇ、0.05μｇ、0.5μｇ及び５μｇ であった。その頭蓋冠を、実験26日目（＝最後の投与後14日目）に収集した。 2．1．2. ｒ−PA及びｔ−PA EP-B 0 093 619に従って、ｔ−pA（ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータ ー）を、CHO細胞中で組換えで調製した。ｔ−PA及びｒ−PAを、2．1．1.に記載 される通り投与した。投与量として各々 の場合に５μｇ／動物(100mg／ｌ)を用いた。対照溶液として150 mmol／ｌリン 酸緩衝液、pH 6.0、10mmol／ｌトラネキサム酸、７mg 投与期間の間に２日の休みを入れて４×５日であった。その頭蓋冠を実験40日目 （＝最後の投与後14日目）に収集した。 2．1．3. ｔ−PAのプロテアーゼドメイン プロテアーゼドメインを WO 96／17928 に従って、大腸菌細胞中で組み換えに より調製した。その投与は2．1．1.に記載される通りに行った。投与量として各 々の場合に、1.15μｇ／動物（23mg／ｌ）又は3.80μｇ／動物（76mg／ｌ）を用 いた。用いた対照溶液は、セクション2．1．2.に記載されるものと同一であった 。投与の期間は、その投与期間の間に２日の休みを入れて４×５日であった。そ の頭蓋冠を、実験40日目に収集した。 2．2．組織調製 頚椎の脱臼により動物を殺し、その頭蓋冠を切り出した。右及び左頭頂骨並び に前頭骨から本質的になる台形断片を各々の頭蓋冠から打ち出した。その打ち出 した断片を50％エタノール＋１％ CaCl₂中で４℃で24時間、固定し、次に保存の ため70％エタノールに移した。 2．3．Ｘ線分析 その頭蓋冠断片を、エタノール溶液から除去し、30分、空気中で乾燥させた。 全ての頭蓋冠断片から共通のＸ線写真をとった（Ｘ線プレート：Structurix D 4pDW，13×18cm／100、AGFA−GAEVERT Co．Ｘ線装置：Torrex 120，EG & E Co． Astrophysics Research Corporation，35KV、５mA、40sec.）。次に、Ｘ線強度 （真の色の分析機：CBA800，Wild-Leitz Co.による頭蓋冠のグレーレベル）を、 常に一定であ る特定の測定窓内で定量した。その測定窓は頭蓋冠の半分（規則どおり右半分） の主要部分を含み、その縫合線は測定領域内ではなかった。各々の投与グループ について測定した値を平均化して、対照に関連させた。 2．4．結果 図１Ａ＋１Ｂは、2．1．1．からのＸ線分析の結果を示している。これは、プ ラスミンは骨密度に実際に影響を及ぼさないが、プラスミノーゲンアクティベー ターｒ−PAは骨密度をかなり増加させることを示す。図２は、実施例2．1．2.か らの結果を示す。これは、ｒ−PA及びｔ−PAが骨密度をかなり増加させることを 示す。図３は、実施例2．1．3.からの結果を示す。これは、ｔ−PAのプロテアー ゼドメインも骨密度をかなり増加させることを示す。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年１月２７日 【補正内容】 請求の範囲 １．プラスミノーゲンアクティベーターを含む局所的骨形成のための医薬組成 物。 ２．治療されるべき体内の部位への注射又は注入により、溶液として適用され ることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。 ３．治療されるべき体内の部分に、担体に結合した形態で局所的に適用される ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。 ４．前記プラスミノーゲンアクティベーターが、ポリマーゲルと混合すること により固定化されていることを特徴とする請求項１又は３に記載の医薬組成物。 ５．固定化された形態でポリマーゲルとの混合物においてプラスミノーゲンア クティベーターでコートされ、又はプラスミノーゲンアクティベーターを連続的 に放出するバイオコンパチブルな水不溶性担体マトリックスにおいてプラスミノ ーゲンアクティベーターでコートされることを特徴とする骨組織インプラント。 ６．プラスミノーゲンアクティベーターを連続的に放出するバイオコンパチブ ルな水不溶性の担体マトリックス中にプラスミノーゲンアクティベーターを含む ことを特徴とする骨組織置換材料。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラング，カート ドイツ連邦共和国，デー−82377 ペンツ バーグ，ランゴナー シュトラーセ 10 (72)発明者 レザー，ウルリケ ドイツ連邦共和国，デー−80796 ミュン ヘン エリザベスシュトラーセ 26

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．局所的骨形成のための薬剤を生産するためのプラスミノーゲンアクティベ ーターの使用。 ２．前記プラスミノーゲンアクティベーターが、治療されるべき体内の部位へ の注射又は注入により、溶液として適用されることを特徴とする請求項１に記載 の使用。 ３．前記プラスミノーゲンアクティベーターが、治療されるべき体内の部分に 、担体に結合した形態で局所的に適用されることを特徴とする請求項１に記載の 方法。 ４．前記プラスミノーゲンアクティベーターが、ポリマーゲルと混合すること により固定化されていることを特徴とする請求項１又は３に記載の使用。 ５．ポリマーゲルと混合することにより、固定化された形態においてプラスミ ノーゲンアクティベーターを含むプラスミノーゲンアクティベーターの医薬調製 物。 ６．プラスミノーゲンアクティベーターを連続的に放出するバイオコンパチブ ルな水不溶性担体マトリックス内に前記プラスミノーゲンアクティベーターを含 むプラスミノーゲンアクティベーターの医薬調製物。