JPH10512277A

JPH10512277A - タンパク質キナーゼ阻害剤を含有する癌細胞における多剤耐性を予防するための化合物

Info

Publication number: JPH10512277A
Application number: JP8522483A
Authority: JP
Inventors: チャウダリー，プリート; シュティル，アレキサンダー・エイ; ローニンソン，イゴール・ビー
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-11-24
Also published as: US5972598A; CA2210320A1; WO1996025949A1; EP0804240A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、癌の化学療法の間に癌細胞における多剤耐性の出現を予防する方法に指向される。特に、本発明は、化学療法薬物によるＰ−糖タンパク質をコードしている多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の発現の誘導を予防するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用に関し、ある種の化学療法薬での引き続いての治療に対して腫瘍細胞耐性を生じるＭＤＲ１発現は、癌細胞からのＰ−糖タンパク質媒介流出のための基質である薬剤および該基質ではない薬剤を含む種々の細胞傷害性剤での治療に応答して誘導されることがここに示される。タンパク質キナーゼ、特に、タンパク質キナーゼＣの阻害剤は、この細胞応答を抑制することがここに示される。さらに、かかるタンパク質キナーゼ阻害剤は、多剤耐性関連タンパク質をコードしている遺伝子（ＭＲＰ遺伝子）の発現を阻害することもここに示される。本発明は、細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１遺伝子発現の阻害を抑制することおよびＭＲＰの発現を阻害することの両方のためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用方法を提供するものである。本発明は、また、ＭＤＲ１およびＭＲＰ発現に対するこれらの効果のいずれかまたは両方を有するタンパク質キナーゼ阻害剤の同定方法を提供するものでもある。かくして、本発明は、化学療法を受けている患者において細胞傷害性薬物治療前または該治療と同時にタンパク質キナーゼ阻害剤を投与した場合、化学療法を受けている癌患者において細胞傷害性薬物および化学療法薬で治療された腫瘍細胞における多剤耐性の出現を予防するために有用な方法および試薬を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質キナーゼ阻害剤を含有する癌細胞における多剤耐性を予防するための化合物発明の背景１．発明の分野本発明は、癌化学療法の間に腫瘍細胞における多剤耐性の出現を予防する方法に指向される。特に、本発明は、化学療法薬による多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の誘発を予防するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用に関する。ある種の化学療法薬での引き続いての治療に対して腫瘍細胞耐性を生じるＭＤＲ１遺伝子発現が種々の細胞傷害剤での治療に応答して誘発されることがここに示される。また、タンパク質キナーゼの阻害剤がこの細胞応答を抑制することもここに示される。したがって、タンパク質キナーゼ阻害剤は、癌患者において細胞傷害性薬物治療前および／または該治療と同時に投与した場合、種々の腫瘍細胞における化学療法薬によるＭＤＲ１誘発を予防するのに有用である。２．関連技術の概要化学療法は、通常の癌治療の主たる形態である。しかしながら、癌化学療法に関連する主たる問題は、治療の間に抗癌薬物の細胞傷害性効果に対する耐性を生じる腫瘍細胞の能力である。腫瘍細胞は、無関係の化学構造および作用機序を有するいくつかの化学療法薬に対して同時に耐性となることが観察されている。この現象は、多剤耐性と称される。腫瘍細胞における多剤耐性についての最良に記載された臨床的に重要なメカニズムは、ＭＤＲ１遺伝子の産物であるＰ−糖タンパク質の発現に関連する。Ｐ−糖タンパク質は、細胞膜に位置する広特異性流出ポンプであり、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤおよびタキソールのごときいくつかの広く使用される抗癌剤を含めた、多くの脂溶性細胞傷害性薬物の細胞内蓄積を減少させ、それにより、細胞をこれらの薬物に対して耐性とすることにより機能する（Pastan および Gottesman，1991，A nnu．Rev．Med．42: 277-286; Roninson(編)，1991，Molecular and Cellular B iology of Multidrug Resistance in Tumor Cells ，Plenum Press，New York; S chinkel および Borst.，1991，Seminars in Cancer Biology 2: 213-226）。ヒトＰ−糖タンパク質は、いくつかのタイプの正常な上皮組織および内皮組織（Cordon-Cardoら，1990，J．Histochem．Cytochem.，38: 1277-1287; Thiebaut ら，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7735-7738）、ならびに造血幹細胞（Chaudhary および Roninson，1991，Cell 66: 85-94）、および成熟リンパ球の亜集団（Neyfakhら，1989，Exp．Cell．Res．185: 496-505）において発現される。より重要なことには、ＭＤＲ１ mＲＮＡまたはＰ−糖タンパク質は、化学療法治療の前後双方においてほとんどのタイプのヒト腫瘍において検出されている（Goldsteinら，1989，J．Natl．Cancer Inst．81: 116-124; Noonanら，1990 , Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 7160-7164）。最も高いレベルのＭＤＲ１発現は、通常、ＭＤＲ１を発現する正常組織に由来する腫瘍、例えば、腎臓癌、副腎皮質癌または結腸直腸癌において見出される。他のタイプの充実性（solid）腫瘍および白血病において、治療前のＭＤＲ１発現は、通常、比較的低いか、または検出不可能であるが、かかる悪性疾患の実質的フラクションは、化学療法への暴露後に高レベルのＭＤＲ１を発現する（Goldsteinら，1989，前掲）。本発明以前には、化学療法後のＭＤＲ１発現の増加は、ＭＤＲ１発現のため化学療法薬に対して既に本来的に耐性であった稀な予め存在する腫瘍細胞についてのイン・ビボ選択に由来すると考えられていた。低レベルのＭＤＲ１発現でさえ、数種類のタイプの癌における化学療法の応答の欠如と関連付けられ（Chanら，1990，J．Clin．Oncol．8: 689-704; Chanら， 1991，N．Engl．J．Med．325: 1608-1614; Mustoら，1991，Brit．J．Haemotol. 77: 50-53）、これは、Ｐ−糖タンパク質媒介多剤耐性が臨床薬物耐性の重要な成分を表すことを示している。多くの臨床的および前臨床実験は、Ｐ−糖タンパク質機能を阻害するための薬理学的戦略を指向しているが（Ford および Hait， 1990，Pharmacol．Rev．42: 155-199）、本発明以前には、癌化学療法に関連する条件下で癌細胞におけるＰ−糖タンパク質発現の誘発または上昇調節の原因たる因子についてほとんど知られていなかった。かかる因子の理解は、ヒト腫瘍におけるＰ−糖タンパク質の出現を予防するための方法の開発についての洞察を与え、かくして、癌における多剤耐性の発生を低下させ、より効果的な癌化学療法に導く。多数の遺伝子導入実験により、ＭＤＲ１遺伝子の上昇した発現が多剤耐性表現型を与えるのに十分であることが示されている（Roninson，1991，前掲）。例えば、ヒトＭＤＲ１ cＤＮＡを担う組換えレトロウイルスで感染されたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞は、それらの表面上のヒトＰ−糖タンパク質の密度に比例して多剤−耐性となった；相関は、細胞傷害性選択の存在または不存在によって影響されなかった（Choiら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 7386-7390）。それにも拘わらず、他の生化学的変化の多剤−耐性細胞との矛盾のない関連は、これらの改変が、恐らくはＰ−糖タンパク質の発現または機能に影響を及ぼすことによって、多剤耐性における役割を演じているらしいことを示唆した。かかる変化の最も顕著なものは、細胞傷害性選択の多重工程後に得られた全てではないが多くの多剤−耐性細胞系で見い出されたタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の増大した活性である（Aquinoら，1990，Cancer Cmmun．2: 243-247: Fineら，19 88, Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:582-586; O'Brianら，1989，FEBS Lett．2 46: 78-82; Posadaら，1989，Cancer Commun．1: 285-292）。ＰＫＣ活性化は、いくつかの薬物−感受性および多剤−耐性細胞系において薬物耐性のレベルを増大させることを示した（Ferguson および Cheng，1987，Cancer Res．47: 433-4 41；Fineら，1988，前掲; Yuら，1991，Cancer Commun，3: 181-189）。ＰＫＣがＰ−糖タンパク質をリン酸化できることが報告されているが（Chambersら，19 90, Biochem．Biophys．Res．Commun．169: 253-259； Chambersら，1990，J．B iol. Chem．265: 7679-7686; Hamadaら，1987，Cancer Res．47: 2860-2865）、かかるリン酸化が観察された薬物耐性の変化の原因であるか否かは知られていない。ある種のＰＫＣ阻害剤がいくつかのＰ−糖タンパク質発現細胞系において多剤耐性を逆行させたことが示されたが（O'Brianら，1989，前掲; Posadaら，198 9， Cancer Commun．1: 285-292; Palayoorら，1987，Biochem．Biophys．Res．Comm un．148: 718-725）、入手できる証拠は、観察された効果のうち少なくともいくつかがＰＫＣ−媒介リン酸化の阻害よりもむしろ試験化合物によるＰ−糖タンパク質機能の直接的阻害のためであったことを示唆する（Fordら，1990，Cancer R es．50:1748-1756; Satoら，1990，Biochem．Biophys．Res．Commun．173: 1252 -1257）。これらの研究は、ＰＫＣ−相互作用剤がＰ−糖タンパク質のリン酸化または機能よりもむしろ発現に対する効果を有し得るという証拠を提供しなかった。いくつかの研究所は、正常細胞および悪性細胞においてＭＤＲ１遺伝子発現を調節する因子を調べた。ＭＤＲ１同族体の正常な生理学的調節の一例がマウス子宮内膜で発見されており、そこでは、マウスmdr遺伝子の発現が妊娠開始時にステロイドホルモンによって誘発された（Arceciら，1990，Molec．Repro．Dev．2 5: 101-109; Batesら，1989，Molec．Cell．Biol．9: 4337-4344）。ラット肝臓において、mdr遺伝子の発現は、いくつかの癌原性または細胞傷害性生体異物によって誘発可能であることが見い出された；また、同様の誘発が肝臓再生の間にも観察された（Fairchildら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7701-770 5; Thorgeirssonら，1987，Science 236: 1120-1122）。さらに、ＭＤＲ１の齧歯類同族体は、ある種の細胞傷害性薬物での処置に応答していくつかの細胞系で誘発された（Chinら，1990，Cell Growth Diff．1: 361-365）。対照的に、細胞傷害性薬物によるヒトＭＤＲ１遺伝子の誘発は、同一実験で試験したヒト細胞系のいずれにおいても検出されなかった。また、他の研究者は、細胞傷害性薬物での処理に際してＭＤＲ１誘発を検出していない(Schinkel および Borst.，1991, Sem．Cancer Biol．2: 213-226)。しかしながら、いくつかの研究は、ヒトＭＤＲ１遺伝子がある条件下でストレス誘発に感受性であり得ることを示した。かくして、いくつかのヒト細胞系におけるＭＤＲ１発現は、熱ショック、亜ヒ酸塩（Chinら，1990，J．Biol．Chem．2 65: 221-226）またはある種の分化剤（Mickleyら，1989，J．Biol．Chem．264: 18031-18040; Batesら，前掲）での処理によって増加した。いくつかの細胞傷害性Ｐ−糖タンパク質基質は、ヒトＭＤＲ１プロモーターからのレポーター遺伝子の転写を刺激すること（Kohnoら，1989，Biochem．Biophys．Res．Commun．165: 1415-1421; Tanimuraら，1992，Biochem．Biophys．Res．Commun．183: 917-92 4）、および長時間の暴露の後に中皮腫細胞系においてＰ−糖タンパク質発現を増加させること（Lightら，1991，Int．J．Cancer 49: 630-637）が報告された。しかしながら、ＭＤＲ１誘発のかかる報告にも拘わらず、癌化学療法で使用されるいずれかの薬剤への短時間暴露がヒト細胞においてＭＤＲ１遺伝子の発現を誘発できるか否か、およびＭＤＲ１誘発が予防できるか否かは判断されていなかった。最近、Kiowaら（1992，FEBS Lett．301:307-309）は、フラボノイド、ケルセチンの添加が、癌治療で使用されていないが、ＭＤＲ１プロモーターにおける熱ショック応答要素によって媒介される転写経路を活性化することが知られている化合物である亜ヒ酸塩によって誘発される肝癌細胞系におけるＭＤＲ１発現の増加を予防できることを報告した。Kiowaらによって開示されていないが、ＰＫＣ活性の阻害は、ケルセチンの生物学的効果のうちの１つである（Gschwendtら，1 984，Biochem．Biophys．Res．Commun．124: 63）。従って、ケルセチンによるＰＫＣ阻害は、部分的には、観察された亜ヒ酸塩によるＭＤＲ１誘発の阻害の原因である可能性がある。しかしながら、熱ショック応答要素によって媒介される転写応答を阻害するケルセチンの能力がＰＫＣ阻害とは無関係であると当業者に信じられていることは注目すべきである（例えば、Kantengwa および Polla，19 91，Biochem．Biophys．Res．Commun．180: 308-314を参照）。さらにまた、Kio waらは、非フラボノイドＰＫＣ阻害剤が亜ヒ酸塩によるＭＤＲ１誘発を阻害できる、あるいは、ケルセチンが、熱ショック応答要素−媒介経路を活性化することが知られていない化学療法薬またはいずれかの他の薬剤と組み合わせて使用した場合に、ＭＤＲ１発現の誘発を阻害できるという示唆を提供していない。ＭＤＲ１に加えて、もう１つの多面発現性薬物輸送が最近発見された（Grant ら，1994，Cancer Res．54: 357-361）。多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）と称されるこのタンパク質は、ＭＤＲ１遺伝子によってコードされているＰ−糖タンパク質輸送体と同様の細胞傷害性の特に化学療法の薬物に対する耐性のパターンを与えることが示された。ＭＲＰ発現の阻害剤は、従前には報告されていない。発明の概要本発明は、癌細胞において多剤耐性の出現を予防するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用、および同一目標に対して有用であろうタンパク質キナーゼ阻害剤を同定するイン・ビトロ方法に関する。本発明は、部分的には、Ｐ−糖タンパク質によって輸送されるか否かには拘わらず、抗癌剤が多様な組織源のヒト腫瘍細胞におけるＭＤＲ１遺伝子の発現を誘発できるという発見に基づくものである。ＭＤＲ１遺伝子発現の増加は、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの双方で観察される。また、ＭＤＲ１誘発は、ＰＫＣアゴニストでの細胞の処理によっても観察される。さらに、細胞傷害性薬物またはＰＫＣアゴニストのいずれかによるこの誘発は、タンパク質キナーゼ阻害剤での細胞の処理によって予防でき、これは、タンパク質キナーゼ―媒介経路がＭＤＲ１遺伝子誘発に関与していること、および、タンパク質キナーゼ阻害剤が化学療法剤に暴露された癌細胞におけるＭＤＲ１遺伝子の発現を予防するのに有用であることを示す。さらに詳しくは、この阻害性効果は、ＰＫＣの阻害と関連している。というのは、ＰＫＣに対して不活性であるタンパク質キナーゼ阻害剤は、ＭＤＲ１誘発を抑制しないが、ＰＫＣに対して優れた効果を有するタンパク質キナーゼ阻害剤は、応答を効果的に阻害するからである。イン・ビトロにおける短時間の暴露によりヒト細胞におけるＭＤＲ１発現を誘発する化学療法薬の能力は、癌化学療法が、予め存在する稀な変異体の選択を通じるよりもむしろ直接的に多剤耐性を誘発することを示す。かかる直接的誘発は、患者の薬物治療単位の間に起こるようであり、少なくとも部分的には、未処理悪性疾患に対する処理悪性疾患におけるＭＤＲ１発現の観察された増大した発生を説明するであろう。したがって、細胞傷害性薬物が関与する化学療法前および／または該化学療法と同時のタンパク質キナーゼ阻害剤の投与は、ＭＤＲ１誘発を予防するにおいて有用であり、かくして、多剤耐性癌細胞の出現を予防し、より好都合な治療結果に導く。本発明は、ＰＫＣアゴニストが正常末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）および腫瘍細胞においてＭＤＲ１発現を誘発することが示される例によって説明される。加えて、種々の細胞傷害性抗癌剤は、ＭＤＲ１遺伝子を活性化する能力を有することも記載される。最も重要には、タンパク質キナーゼ阻害剤は、特に治療前に検出可能なＰ−糖タンパク質をほとんどまたは全く有しない腫瘍細胞において、ＰＫＣアゴニストまたは細胞傷害性薬物によって媒介されるこのＭＤＲ１誘発を予防することが示される。本発明のこの目的では、「Ｐ−糖タンパク質をほとんどまたは全く〜ない」とは、ある種のよく確立された薬物−感受性細胞系、例えば、ＫＢ−３−１（Noonanら，前掲、参照）において見いだされるように、mＲＮＡまたはタンパク質発現の低いレベルを記載することを意図する。限定されるものではないが、癌の化学療法の間に多剤耐性腫瘍細胞の出現を予防することを含めた種々の使用がここに記載の本発明に含まれる。もう１つの具体例において、本発明は、癌細胞において多剤耐性を低下させる方法、およびこの目標に対して有用であろうタンパク質キナーゼ阻害剤をイン・ビトロで同定する方法を提供する。本発明のこの態様は、部分的には、ある種のタンパク質キナーゼ阻害剤が、該阻害剤の不存在下でこのタンパク質を発現する癌細胞において、ＭＲＰ（Grantら，1994，前掲）と称される多剤耐性関連タンパク質の発現を阻害できるという発見に基づいている。本発明のこの態様は、タンパク質キナーゼ阻害剤がこのタンパク質を発現する腫瘍細胞でのＭＲＰ発現を阻害することが示される例によって示される。限定されるものではないが癌化学療法の間の多剤耐性腫瘍細胞におけるこのタンパク質の発現レベルの低下を含めた、種々の使用がここに記載する本発明のこの態様に含まれる。本発明の特別の好ましい具体例は、ある好ましい具体例の以下のより詳細な記載および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な記載図１．Ｈ９細胞系のＰ−糖タンパク質機能および発現に対するホルボールエステル（ＴＰＡ）、ジアシルグリセロール（ＤＯＧ）およびスタウロスポリン（Ｓtau）の効果。Ａ：未処理細胞およびＴＰＡ−またはＤＯＧ−処理細胞による３時間Ｒh１２３蓄積Ｂ：未処理細胞およびスタウロスポリンとのＴＰＡまたはＤＯＧ前処理で処理した細胞による３時間Ｒh１２３蓄積Ｃ：未処理細胞およびＴＰＡ−またはＤＯＧ−処理細胞のＩgＧ２aイソタイプ対照での染色Ｄ：ＵＩＣ２抗体で染色したＣにおけると同一のものＥ：未処理細胞またはスタウロスポリン単独またはスタウロスポリンとのＴＰＡもしくはＤＯＧ前処理で処理した細胞のＵＩＣ２染色図２．様々な細胞系におけるＭＤＲ１ mＲＮＡ発現に対するＴＰＡ、ＤＯＧおよびスタウロスポリンの効果のcＤＮＡ−ＰＣＲ分析。各レーンにおいて、上方のバンド（１６７bp）は、ＭＤＲ１に対応し、下方のバンド（１２０bp）は、 β₂−ミクログロブリン特異的ＰＣＲ産物に対応する。Ａ：Ｈ９細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡ発現に対する、スタウロスポリン処理を伴うかまたは伴わないＴＰＡまたはＤＯＧの効果Ｂ：ＴＰＡによるＨ９細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡの誘発の時間経過。２つの負の対照レーンは、cＤＮＡの代わりのＲＮＡなくして水またはリバースクリプターゼ混合物で行ったＰＣＲに対応する。Ｃ：ＴＰＡまたはＤＯＧによるＫ５６２細胞における、およびＴＰＡによるＭＣＦ-７細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡの誘発図３．薬物−誘発ＭＤＲ１発現のフローサイトメトリー分析Ａ．３０μＭベラパミル（ＶＥＲ）の不在下（左）または存在下（右）におけるＫ５６２細胞からのＰ−糖タンパク質―輸送蛍光色素の流出。上部パネル：未処理細胞（−）からのＲh １２３流出および５０μＭＡra−Ｃ（ＡＲＡ）で１２時間処理した細胞または１０μＭＡra−Ｃで２ないし３日間処理した細胞からのＲh１２３流出。下部パネル：未処理細胞および１μg／mＬビンブラスチン（ＶＢＬ）で３６時間処理した細胞からのＤiＯＣ₂(３)流出。Ｂ．Ａra−Ｃ処理したＫＧ１白血病細胞の増加したＰ−糖タンパク質発現。左:未処理細胞または１０μＭＡra−Ｃで１.５日間処理した細胞におけるＲh１２３蓄積。右：抗−Ｐ−糖タンパク質ＵＩＣ２抗体またはＩgＧ２a イソタイプ対照での同細胞の間接的免疫蛍光標識。Ｃ．種々の薬物への暴露後に無薬物培地に維持し、ＤiＯＣ₂(３) （水平軸）およびフィコエリトリン（ＰＥ）で間接的に標識したＵＩＣ２抗体（左）またはＩgＧ２aイソタイプ対照（右）（垂直軸）を用いた二重標識によって分析したＫ５６２細胞の等高線密度マップ。上部から下部にかけて：未処理細胞、６０ng／mＬアドリアマイシンで３日間処理し、薬物なしで５週間増殖させた細胞、３０μＭクロラムブシル（ＣＨＬ）で５日間処理し、薬物なしで２週間増殖させた細胞、１０μＭＡra−Ｃで３日間処理し、薬物なしで５週間増殖させた細胞（この実験は、他のアッセイで使用した二次抗体の半分量を用いた）；前記したごとくＡra−Ｃで処理し、薬物の除去６週間後に蛍光活性化細胞ソーティングによって単離した細胞のＲh１２３−鈍い（dull）集団。図４．薬物処理細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡ発現のcＤＮＡ−ＰＣＲ分析。各レーンにおいて、上方バンド（１６７bp）は、ＭＤＲ１に対応し、下方バンド（１２０bp）は、別のチューブで増幅させたβ₂−ミクログロブリン特異的ＰＣＲ産物に対応する。Ａ．Ａra−ＣによるＫ５６２細胞におけるＭＤＲ１誘発。細胞を所定濃度のＡra−Ｃに４.５時間暴露した。未処理細胞に対する細胞増殖は、ＲＮＡ抽出と並行したＭＴＴアッセイによって測定した。Ｂ．種々の薬物で処理したＫ５６２細胞におけるＭＤＲ１誘発。薬物暴露の時間を示す。薬物およびそれらの濃度は、以下の通りである：（−）、未処理細胞；ＤＡＵ、２５０ng／mＬダウノルビシン；ＡＤＲ、５００ng／mＬアドリアマイシン；ＶＢＬ、２０ng／mＬビンブラスチン；ＶＰ、１μg／mＬエトポシド；ＭＴＸ、２００ng／mＬメトトレキセート；ＣＤＤＰ、３μg／mＬシスプラチン；ＣＨＬ、５０μＭクロラムブシル；５ＦＵ、２μg／mＬ５−フルオロウラシル；ＨＵ、３０μＭヒドロキシ尿素。Ｃ．未処理または２００ng／mＬアドリアマイシンまたは１０μ ＭＡｒa−Ｃで２日間処理したＫＢ−３−１癌細胞におけるＭＤＲ１誘発Ｄ．未処理（−）または１０μＭＡra−Ｃで４日間処理したＥＪ癌細胞におけるＭＤＲ１誘発Ｅ．Ｋ５６２細胞における薬物誘発ＭＤＲ１発現の維持。細胞を６０ng／mＬアドリアマイシン、１０μＭＡra−Ｃまたは２００ng／mＬメトトレキセートで３日間処理し、所定の期間、無薬物培地中で培養した。図５．Ｈ９細胞における細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１ mＲＮＡ誘発に対するタンパク質キナーゼ阻害剤の効果。各実験において、阻害剤スタウロスポリン（ＳＴ）、Ｈ７、イソ−Ｈ７（ＩＨ７）またはＨＡ１００４（ＨＡ）を２回添加し、１回目は、対応する薬物の添加の直前、および２回目は、明記した期間の後に添加した。Ａ．未処理または５０μＭＡra−Ｃで２２時間処理したＨ９細胞。該阻害剤は、実験の最初および１６時間後に所定濃度で添加した。Ｂ．未処理または２００ng／mＬアドリアマイシンで２２時間処理したＨ９細胞。同量の阻害剤（０.０３μＭスタウロスポリン、１０μＭＨ７、ＨＡ−１００４およびイソ−Ｈ７）を実験の開始時および１６時間後に添加した。Ｃ．未処理または４０ng／mＬビンブラスチンまたは２００ng／m Ｌメトトレキセートで３６時間処理したＨ９細胞。同量の阻害剤（０．１μＭスタウロスポリン、５０μＭＨ７）を実験の開始時および２４時間後に添加した。図６．Ａra−Ｃまたはアドリアマイシン―処理Ｋ５６２細胞におけるビンブラスチン耐性Ａ．未処理およびＡra−Ｃ（ＡＲＡ）−またはアドリアマイシン（ＡＤＲ）−処理細胞におけるビンブラスチンによる増殖阻害。細胞を図３Ｃにおけるごとく処理し、薬物の不在下で６週間増殖させた。ビンブラスチン阻害剤アッセイは、１０日間行った。Ｂ．未処理細胞およびＡra−Ｃ処理細胞のＲh１２３−鈍い集団およびＲh１２３−鮮やかな集団におけるビンブラスチンによる増殖阻害。Ａra −Ｃ処理細胞を薬物から取り出した６週間後にＲh１２３流出方法によって染色し、蛍光−活性化細胞ソーティングによってＲh１２３−鈍い集団およびＲh１２３鮮やかな集団に分けた。Ｒh１２３−鈍い集団は、純度＞６０％であり（図３Ｃ）、Ｒh１２３−鮮やかな集団は、純度９０−９５％であった。ソーティングの１週間後、ビンブラスチン阻害アッセイを７日間行った。図７．Ａra−ＣまたはＴＰＡでの処理によって誘発されたＭＤＲ１ mＲＮＡ発現のタンパク質キナーゼ阻害剤による阻害のcＤＮＡ−ＰＣＲ分析。各レーンにおいて、上方バンド（１６７bp）は、ＭＤＲ１に対応し、下方バンド（１２０bp）は、別のチューブにおいて増幅されたβ₂―ミクログロブリン特異的ＰＣＲ産物に対応する。Ａ．Ａra−ＣによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対するチルホスチン（tyrphostin）の効果。細胞を２５μＭＡra−Ｃ（レーン３および４）と共に、またはＡra−Ｃおよび５０μＭチルホスチンＡ２５（レーン５および６）と共に、またはＡra−Ｃおよび５０μＭチルホスチンＢ４６（レーン７および８）と共に１０時間インキュベートした。チルホスチンの各々は、Ａra−Ｃの添加の１６時間前にそれらの各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、Ａra−Ｃおよびいずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。Ｂ．Ａra−ＣによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対する硫酸ネオマイシンの効果。細胞を２５μＭＡra−Ｃ（レーン３および４）と共に、またはＡra−Ｃおよび４mＭ硫酸ネオマイシン（レーン５および６）または１０mＭ硫酸ネオマイシン（レーン７および８）と共に１０時間インキュベートした。各濃度の硫酸ネオマイシンは、Ａra−Ｃの添加の４５分前に各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、Ａra−Ｃおよび硫酸ネオマイシンの不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。Ｃ．Ａra−ＣによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対するエルブスタチン類似体の効果。細胞を２５μＭＡra−Ｃ（レーン３および４）と共に、またはＡra−Ｃおよび３２μＭ（レーン５および６）または６４μＭ（レーン７および８）のエルブスタチン類似体である２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチルと共に１０時間インキュベートした。各濃度のエルブスタチン類似体は、Ａ ra−Ｃの添加の４５分前に各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、Ａra−Ｃおよびいずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。Ｄ．Ａra−ＣによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対するカルホスチンＣの効果。細胞を２５μＭＡra−Ｃ（レーン３および４）と共に、またはＡra−Ｃおよび０.１μＭカルホスチンＣ（レーン５および６）または１ μＭカルホスチンＣ（レーン７および８）と共に１０時間インキュベートした。各濃度のカルホスチンＣは、Ａra−Ｃの添加の４５分前に各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、Ａra−Ｃおよびいずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。Ｅ．Ａra−ＣによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対するケレリトリンの効果。細胞を２５μＭＡra-Ｃ（レーン３および４）と共に、またはＡra−Ｃおよび１μＭケレリトリン（レーン５および６）または５μＭケレリトリン（レーン７および８）と共に１０時間インキュベートした。各濃度のケレリトリンは、Ａra−Ｃの添加の４５分前に各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、Ａra−Ｃおよびいずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。Ｆ．ＴＰＡによるＨ−９細胞におけるＭＤＲ１誘発に対するスタウロスポリンおよびエルブスタチン類似体の効果。細胞をＴＰＡ（１０ng／mＬ、レーン３および４）と共に、またはＴＰＡおよびエルブスタチン類似体２，５ −ジヒドロキシ桂皮酸メチル（３２μＭ、レーン５および６）またはＴＰＡおよびスタウロスポリン（３０nＭ、レーン７および８）と共に一晩インキュベートした。エルブスタチン類似体またはスタウロスポリンは、各々、ＴＰＡの添加の４５分前に各Ｈ−９細胞培養に添加した。負の対照レーン（レーン１および２）は、ＴＰＡおよびいずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。図８．ＭＲＰ mＲＮＡ発現のタンパク質キナーゼ阻害剤による誘発のcＤＮＡ−ＰＣＲ分析。各レーンにおいて、上部バンド（２９２bp）は、ＭＲＰに対応し、下部バンド（１２０bp）は、別のチューブにおいて増幅されたβ₂−ミクログロブリン特異的ＰＣＲ産物に対応する。Ａ．薬物処理Ｈ−９細胞におけるＭＲＰ mＲＮＡ発現阻害。細胞を３０μＭスタウロスポリン（レーン３および４）、５μＭケレリトリン（レーン５および６）、３２μＭ２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチル（エルブスタチン類似体；レーン７および８）または１０mＭ硫酸ネオマイシン（レーン９および１０）と共に１０時間インキュベートした。負の対照レーン（レーン１および２）は、いずれかの薬物の不在下で一晩インキュベートしたＨ−９細胞培養を表す。発明の詳細な説明本発明は、癌細胞における多剤耐性表現型の出現を予防するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用に関する。細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１誘発およびかかる誘発を予防するタンパク質キナーゼ阻害剤の能力の発見は、以下の実施例において充分に説明され例示される。検討を明確にするために、本発明は、特にヒト腫瘍細胞系のパネルにおけるＰＫＣ活性に対して、有効な効果を有する種々のタンパク質キナーゼ阻害剤に関して記載する。しかしながら、本発明は、同様に、いずれかのタンパク質キナーゼ阻害剤を用いて、他の化学療法薬で処理された種々のイン・ビトロ細胞系およびイン・ビボ腫瘍に適用することもできる。ある種のタンパク質キナーゼ阻害剤の特定の具体例は、以下に記載するごとく例示される。当該技術分野で知られているか、または当該技術分野で知られている方法を用いて製造された、本明細書に記載する特定のタンパク質キナーゼ阻害剤の種々の類似体のいずれもここに記載するごとき本発明によって包含されると解される。１．ＭＤＲ１遺伝子発現の誘発有効なＰＫＣ活性化因子であるＴＰＡ（１２−ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）、およびＰＫＣの生理学的刺激剤であるジアシルグリセロールは、正常ヒトＰＢＬにおいて、および種々のタイプの白血病または充実性腫瘍に由来する細胞系において、ＭＤＲ１遺伝子発現を増加させることが下記実施例１および２において示される。ＴＰＡの効果は、治療前にＰ−糖タンパク質を発現した試験細胞系の全てにおいて、および治療前に検出可能なＰ−糖タンパク質を有しないいくつかであるが全てではない他の細胞系において、観察される。しかしながら、ＭＤＲ１発現は、ここに記載したごとく試験したものよりも高い濃度のＴＰＡにより非応答性細胞系において誘発されることも起こり得る。ＴＰＡおよびジアシルグリセロールの観察された効果は、ヒト細胞におけるＭＤＲ１発現がＰＫＣ媒介シグナル変換経路を介して調節されることを示す。ＰＫＣアゴニストで処理された細胞におけるＭＤＲ１発現の増加は、Ｐ−糖タンパク質およびＭＤＲ１ mＲＮＡの両方のレベルで観察される。ＭＤＲ１ mＲＮＡの増加した定常状態レベルは、増加した転写または減少したmＲＮＡ分解に影響を及ぼす。ヒトＭＤＲ１遺伝子の主な下流プロモーター（Uedaら，1987，J．B iol．Chem.，262: 505-508）は、ＴＰＡによる転写の刺激の原因となるＡＰ−１部位を含有する（Angelら，1987，Cell，49: 729-739; Leeら，1987，Cell 49： 741-752）。ＡＰ−１部位およびその周辺配列は、ヒトＭＤＲ１遺伝子およびその齧歯類相同体との間で保存される（Hsuら，1990，Molec．Cell Biol．10: 359 6-3606; Teeterら，1991，Cell Growth Diff．2: 429-437）。ハムスターpgpl遺伝子のＡＰ−１配列は、そのプロモーターの実質的な正の調節因子であることが示された（Teeterら，1991，Cell Growth Diff．2: 429-437）が、相同性マウス mdrla（mdr3）の対応する要素は、負の調節因子効果を有する（Ikeguchiら，199 1，DNA Cell Biol．10: 639-649）。かくして、ヒトＭＤＲ１プロモーターのＡＰ−１要素は、ＰＫＣアゴニストによるＭＤＲ１発現の刺激の直接的原因である。ＰＫＣ媒介経路によるＭＤＲ１遺伝子発現の誘発は、増加したＰ−糖タンパク質発現のために選択された多剤耐性細胞系がしばしば上昇したレベルのＰＫＣを含有したという以前の発見（Aquinoら，前掲; Fineら，前掲; O'Brianら，前掲; Posadaら，前掲）を説明する。ＰＫＣ活性の増加は、増加したＭＤＲ１遺伝子発現の原因である初期事象を表すことができた。しかしながら、この解釈は、ＰＫＣにより誘発されたＰ−糖タンパク質のリン酸化がさらにＰ−糖タンパク質活性を増加させることができたことを除外しない。後者の仮説についての証拠は、異種プロモーターから転写されたＭＤＲ１ cＤＮＡでのトランスフェクション後に得られたＭＣＦ−７細胞の多剤耐性サブラインにおける薬物耐性のレベルが高レベルのＰＫＣαを発現するベクターの誘導により増大させられることができたことを見いだしたYuら（1991，Cancer Commun．3: 181-189）の研究の結果である。ＰＫＣαトランスフェクタンスにおける増加した耐性は、発現レベルの明らかな変化なしで増加したＰ−糖タンパク質リン酸化により行われた。ＰＫＣは、種々の適応的、増幅的および分化的プロセスに関連した種々のシグナル変換経路における中枢的な役割を演じる。ＰＫＣアゴニストが正常細胞および悪性造血細胞においてＭＤＲ１発現を誘発することが判明したとしても、ＰＫＣ媒介経路を介して作用する造血増殖因子を用いて同一の結果が達成されなかった。さらにまた、ＰＫＣアゴニストは、造血源の細胞系だけではなく上皮源の細胞系においてもＭＤＲ１発現を誘発し、これは、ＭＤＲ１発現のＰＫＣ媒介調節が一般的な生理学的役割を有することを示している。ＰＫＣ媒介メカニズムは、ＵＶ照射またはアルキル化剤によるＤＮＡ損傷に対する転写応答に関係した（Kainaら，1989，in N．W．Lambert およびJ．Laval( 編)，DNA Repair Mechanisms and Their Biological Implications in Mammalia n Ce1ls ，Plenum Press，New York; Papathanasiou および Fornace，1991，pp ．13-36 in R．F．Ozols（編），Molecular and Clinial Advances in Anticanc er Drug Resistance ，Kluwer Academic Publishers，Boston，MA）。ＰＫＣ活性化は、シトシンアラビノシドなどの他の細胞傷害性薬物に対する細胞応答にも関連していた（Kharbandaら，1991，Biochemistry Cancer Res．49: 6634 -6639）。かくして、ＭＤＲ１発現のＰＫＣ媒介誘発は、細胞傷害性化学療法薬によって生産された損傷を含む種々のタイプの細胞損傷に対する一般的なストレス応答の一部であることができた。本発明は、ヒト白血病および充実性腫瘍誘導細胞系におけるＭＤＲ１発現が癌化学療法において用いられる多くの種々の細胞傷害性薬物への短時間暴露によって誘発されることができることを記載する（下記実施例３を参照）。mＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でのＭＤＲ１誘発は、Ｐ−糖タンパク質輸送薬剤（アドリアマイシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、エトポシド）またはＰ−糖タンパク質により輸送されない化学療法薬（メトトレキセート、５−フルオロウラシル、クロラムブシル、シスプラチナム、ヒドロキシ尿素および１− β−Ｄ−アラビノアラノシルサイトシン（Ａra−Ｃ）、有効な抗白血病薬（Khar bandaら，1991，Biochemistry 30: 7947-7952）など）のいずれかで処理された細胞の亜集団において観察された。ＭＤＲ１発現は、第２グループの薬物に対する耐性を提供しないので、および、ＭＤＲ１誘発は、短時間の薬物暴露後に達成されることができた（多くの場合、１未満の細胞発生）ので、これらの発見は、ＭＤＲ１発現細胞についての細胞傷害性選択が観察されたＭＤＲ１発現の増加の原因ではなかったことを示す。ＭＤＲ１誘発は、明らかな細胞損傷と同時に検出可能になった。このことは、特定の薬剤に対する直接応答よりもむしろかかる損傷の間接的な結果であるらしいということを示す。最も重要には、細胞傷害性薬物での処理により誘発されたＭＤＲ１発現は、薬物の除去後に消滅しなかったが、無薬物培地において培養された細胞において少なくとも数週間維持された。薬物の不在下で増殖するＰ−糖タンパク質陽性細胞は、分化状態の変化を示さなかった。これは、薬物誘発ＭＤＲ１発現が細胞を染色することまたは終末に分化することに限定されない安定な現象である。増加したＭＤＲ１発現に加えて、薬物処理細胞は、ビンブラスチン、Ｐ−糖タンパク質輸送薬物に対する耐性の２〜３倍増加を示した；かかる耐性は、詳細には、ＭＤＲ１発現細胞に関連していた。薬物処理細胞は、Ｐ−糖タンパク質により輸送されない化学療法薬であるクロラムブシルに対する増加した耐性も示した。後者の発見は、薬物耐性のいくつかの他の臨床的に関連したメカニズムが細胞傷害性薬物での処理後にＭＤＲ１発現と一緒に誘発されることを示唆する。ひとまとめにして考えてみると、これらの発見は、癌化学療法において用いた種々の薬物でのヒト腫瘍細胞の処理が、従前に思われていたように予め存在する遺伝的変異体の選択によるよりもむしろ直接的にＭＤＲ１発現を誘発することができることを示唆する。得られた多剤耐性の増加は、安定であり、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方での化学療法薬に対する応答を減少させるのに充分である。ＭＤＲ１発現の薬物媒介誘発は、癌化学療法の間に生じ、少なくとも部分的には、薬物処理ヒト腫瘍におけるＭＤＲ１発現の発生の観察された増加の原因であると思われる。したがって、本発明は、臨床的に関連する条件下でのＭＤＲ１誘発の最初の証拠を提供し、ＰＫＣがかかる誘発においてある種の役割を演じることを示唆する。後者の仮説は、ＰＫＣの誘発を介して癌化学療法の間のＭＤＲ１誘発を予防する化学療法プロトコールの基礎を提供する。２．ＭＤＲ１誘発を予防するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤、特に、ＰＫＣに対して有効な活性を有するタンパク質キナーゼ阻害剤が癌細胞におけるＭＤＲ１遺伝子発現の誘発を予防する能力を有することを示す。例えば、ＰＫＣの有効であるが非選択的な阻害 Sci. 10: 218-220）は、ＴＰＡ、ジアシルグリセロール、ならびにＡra−Ｃ、ビンブラスチン、メトトレキセートおよびアドリアマイシンを含む多くの化学療法細胞傷害性薬物で処理されたＰ−糖タンパク質陰性細胞におけるＭＤＲ１誘発を予防することがここに示される（３０nＭの濃度で用いた場合）。Ｈ７（５０μ Ｍ）、カルホスチンＣ（１μＭの濃度、白色光照明と併せて用いた）およびケレリトリン（５μＭ）を含む種々の他のタンパク質キナーゼ阻害剤は、化学療法薬によるＭＤＲ１誘発を予防することも示す。Ａra−Ｃでの処理により誘発されたＭＤＲ１発現の阻害は、従前にタンパク質キナーゼＣについての特異性を有すると理解されていなかった阻害剤を用いても示された。かかる阻害剤の例としては、エルブスタチンおよびエルブスタチンの類似体ならびに硫酸ネオマイシンが挙げられる。エルブスタチン、および２,５ −ジヒドロキシ桂皮酸メチルなどのその類似体は、表皮増殖因子受容体トロシンキナーゼを阻害する能力を有することが知られている（Umezawa および Imoto， 1991，Meth．Enzymol．201: 379-385）。このエルブスタチン類似体は、３２μ Ｍの濃度でＡra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を完全に阻害することが判明した（下記実施例４を参照）。このエルブスタチン類似体は、抗ＰＫＣ活性と一致する公知のＰＫＣアゴニストであるＴＰＡでの感受性細胞の処理により誘発されたＭＤＲ１発現を阻害することも判明した（下記実施例４および図７Ｆを参照）。エルブスタチン類似体に加えて、タンパク質チロシンキナーゼの阻害剤として知られている２つの他の化合物、チルホスチン（tyrphostin）Ａ２５およびチルホスチンＢ４６は、５０〜１００μＭの濃度で、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を阻害することも判明した。抗菌化合物である硫酸ネオマイシンは、１０mＭの濃度で誘発細胞と接触した場合、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を阻害することが判明した。この濃度のネオマイシンは、ヒトＨ９細胞上で細胞毒性を示さず、臨床的に達成可能な濃度の範囲内であると思われる。この化合物は、化学療法を受けている患者に対する一般的な利益を有するものであるという長所を有し、ヒトにおける細菌性腸感染の治療のために広範囲に用いられてきた。関心のあることには、エルブスタチン（Bishopら，1990，Biochem．Pharmacol . 40: 2129-2135）および硫酸ネオマイシン（Chauhanら，1990，FASEB J．4: A1 779）は、共に、タンパク質キナーゼＣ阻害剤であることが報告されている。これらの発見は、タンパク質キナーゼ阻害剤、特にＰＫＣ阻害剤がＭＤＲ１誘発に関係しているという証拠を提供し、ＭＤＲ１遺伝子活性化を予防するためにタンパク質キナーゼ阻害剤を用いる可能性を示唆する。しかしながら、他のタンパク質キナーゼ阻害剤がＡra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を阻害するのに無効であることが判明した。これらとしては、ＰＫＣ阻害剤Ｄ,Ｌ −threo−スフィンゴシンが挙げられる（５μＭの濃度で用いる場合；より高い濃度は、細胞毒性を誘発した）。これは、ＭＤＲ１誘発を阻害しなかった試験されたＰＫＣ阻害剤だけであり、これは、観察された細胞毒性が有効な阻害濃度のこの化合物の投与を予防したことを示唆する。チロシンキナーゼ阻害剤であるヘルビマイシンＡが０.３５〜３μＭの範囲の濃度でＡra−ＣによるＭＤＲ１誘発を阻害するのに無効であることも判明した。もう１つのチロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステインは、１５０μＭの濃度で、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を非常に弱く阻害した。スタウロスポリンは、Ｐ−糖タンパク質に直接結合するＰ−糖タンパク質阻害剤である（Satoら，1990，Biochem．Biophys．Res．Commun．173: 1252-1257）。しかしながら、いくつかのＰ−糖タンパク質陽性細胞系において、スタウロスポリンは、単独で用いると、Ｐ−糖タンパク質発現を有意に増加させた。さらに、公知のＰＫＣ阻害剤である２つのＰ−糖タンパク質結合化合物であるシクロスポリンＡおよびベラパミルは、Ｐ−糖タンパク質陽性細胞系のいくつかにおいてＰ−糖タンパク質発現を増加させた。これらの薬剤およびスタウロスポリンは、一般的な、現在知られていないメカニズムを介して作用する。これらの結果は、タンパク質キナーゼ阻害剤が、腫瘍細胞の大きなフラクションにおいて既にＰ− 糖タンパク質を発現している腫瘍におけるよりもＰ−糖タンパク質陰性またはほぼ陰性の腫瘍における方がＭＤＲ１の増加を予防するためにより有効に用いられることを示唆する。しかしながら、スタウロスポリンが少数の造血細胞系におけるＰ−糖タンパク質発現を増加させたという発見が、ＰＫＣ阻害剤によるＰ−糖タンパク質発現の増加がＰ−糖タンパク質陽性腫瘍細胞の一般的な性質であること、およびＰ−糖タンパク質陽性腫瘍を有する患者が薬物により誘発される腫瘍細胞における多剤耐性のさらなる増加を予防するためにタンパク質キナーゼ阻害剤の使用により利益を得ることができないことを示さないということに注意すべきである。Ｐ−糖タンパク質陰性充実性腫瘍または白血病は、当該技術分野でよく知られている技術を用いて、患者の腫瘍の生検材料、外科的または血液標本の分析により同定することができる（Roninson，前掲）。これらの技術としては、限定されないが、Ｐ−糖タンパク質特異的抗体での免疫細胞化学アッセイ、免疫組織化学アッセイまたは免疫蛍光アッセイ；Ｐ−特異的タンパク質輸送蛍光色素での生体染色；ＭＤＲ１特異的核酸プローブでのノーザンドットブロットまたはスロットブロットハイブリダイゼーション；またはＭＤＲ１ mＲＮＡのcＤＮＡ−ＰＣＲ分析が挙げられる。前記アッセイのいくつかの研究されている例は、下記実施例１および３に記載する。タンパク質または機能に基づくアッセイによりＰ−糖タンパク質陰性であることが明らかであるいくつかの細胞系が、cＤＮＡ−ＰＣＲによりアッセイされると、ＭＤＲ１ mＲＮＡの検出可能なレベルをなおも示すことに注意すべきである（表Ｉを参照）。これは、タンパクまたは機能に基づくアッセイがタンパク質キナーゼ阻害剤の使用により利益を得ると思われる腫瘍の同定のための主要な規準として好ましいことを示す。別法としては、cＤＮＡ−ＰＣＲまたは他のＭＤＲ１ mＲＮＡ測定のための方法は、Ｋ５６２細胞のレベルまたはわずかに（例えば、２倍）高いレベルでのＭＤＲ１ mＲＮＡ発現がＰ−糖タンパク質陰性腫瘍をなおも示すという理解を伴って用いられる。ここで試験したタンパク質キナーゼ阻害剤は、それらの阻害活性において非選択的であることが知られているが、すなわち、それらの作用がＰＫＣに対して特異的ではないが、ここに記載する研究は、ＰＫＣ活性を阻害するそれらの能力がＭＤＲ１誘発の予防における臨界因子であるという証拠を提供する。例えば、スタウロスポリン、Ｈ７、ケレリトリン、硫酸ネオマイシンおよびカルホスチンＣを含む多くの有効なＰＫＣ阻害剤は、細胞傷害性薬物によりＭＤＲ１誘発を阻害する能力を有する。対照的には、ＰＫＣに対して不活性であるタンパク質キナーゼ阻害剤であるＨＡ１００４は、ＭＤＲ１誘発を予防するのに全体的に無効であることが示されている。したがって、ＰＫＣに対する特異性とは無関係なＰＫＣを阻害する能力を有するいずれのタンパク質キナーゼ阻害剤も、癌細胞におけるＭＤＲ１誘発を予防するのに有用であると思われる。したがって、蛍光色素蓄積、ＭＤＲ１ mＲＮＡについてのcＤＮＡ−ＰＣＲまたはＰ−糖タンパク質特異的抗体での染色法などの下記実施例３に記載される方法によって測定されるような化学療法薬によるＭＤＲ１の誘発を予防する能力を有するタンパク質キナーゼ阻害剤は、本発明のプラクティスで用いられる。かかる阻害剤は、化学療法薬による治療の前および／または該治療と同時に、充実性腫瘍または白血病を有する癌患者において投与される。癌化学療法で一般的に用いられる抗癌剤は、この方針の範囲内に包含され、限定されないが、Ａra−Ｃ、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、クロラムブシル、シスプラチンおよびヒドロキシ尿素が挙げられる。本発明前に、ＰＫＣを阻害する能力を有する多くの化合物が、癌化学療法における有効な使用のためにイン・ビトロおよびイン・ビボで研究された。しかしながら、かかる化合物は、正常な細胞に対して腫瘍についての選択的な増殖阻害を示した（Powis および Kozikowski，1991，Clin．Biochem．24: 385-397; Gruni ckeら，1989，Adv．Enzyme Regul．28: 201-216）が、それらは、癌細胞においてＭＤＲ１発現を予防する能力を有することが示されたり示唆されたりしなかったことに注意すべきである。イン・ビトロでの研究は、ＰＫＣ阻害剤の抗増殖効果がそれらのＰＫＣ阻害活性とほぼ同一の投与量で生じたことを示した（Grunic keら，前掲）。イン・ビボで試験した化合物としては、スタウロスポリンおよびそのベンゾイル誘導体ＣＧＰ４１２５１が挙げられ、これらは、ヌードマウスにおいてこれらの最大許容投与量（ＭＴＤ）（ＭＴＤは、スタウロスポリンについて１mg／kgであり、ＣＧＰ４１２５１について２５０mg／kgであった）の１／１０で抗腫瘍効果を示すことが判明している（Meyerら，1989，Int．J．Cance r 43: 851-856）。イン・ビボでの抗腫瘍活性を有することが示された他のスタウロスポリン類似体としては、ＵＣＮ−０１（Takahashiら，1987，J．Antibot ．40:1782-1784）および８−Ｎ−（ジエチルアミノエチル）レベッカマイシン（ＢＭＹ２７５５７）（Schuringら，1990，Proc．Amer．Assoc．Cancer Res．31 : Abs．2469）が挙げられる。後者の化合物については、腹腔内投与のための至適投与量は、１回の注射につき１２mg／kgで１日に９回の注射で投与される合計１０８mg／kgから単投与６４mg／kgの範囲であった。抗癌剤として活発に研究されたＰＫＣ阻害剤の他のグループは、ヘキサデシルホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ₃、イルモホシン、ＳＲＩ６２−８３４およびＢＭ４１４４０を含むエーテル脂質類似体からなる（Powis および Kozikows ki，1991，Clin．Biochem．24: 385-397; Grunickeら，前掲）。これらの薬剤のいくつかは、臨床試験で用いられた。経口投与のためのこれらの試験において確立されたＭＴＤは、イルモホシンについて２００mg／日（Berdelら，1988，Proc ．Amer．Assoc．Cancer Res．29: Abs．2050）およびＢＭ４１４４０について体重１kg当たり５mg（Hermannら，1987，Lipids 22: 962-966）である。ヘキサデシルホスホコリンは、３〜１２８週間にわたって投与された、患者当たり０.２〜３８.５gの範囲の投与量で、乳癌の皮膚転移の治療のために局所的に用いられた（Ungerら，1990，Cancer Treat．Rev．17: 243-246）。このグループの化合物は、自己骨髄移植のための瀉下剤（purging agent）としても試験された（Vog lerら，1991，Exp．Hematol．99: 557 Abs.）。他のＰＫＣ阻害剤であるスラミンは、寄生虫病の治療において用いられており、抗腫瘍剤として臨床試験において評価されている。１４日目の最後に３００μ g／mＬのピークに達するように設計された速度でのスラミンの連続注入は、ホルモン−難治性前立腺癌において活性を示した（Meyersら，1992，J．Clin．Oncol . 10: 875-877）。ＰＫＣ阻害剤の他のクラスのメンバーであるフラボノイドケルセチンは、２０mg／kgで腹腔内投与されると、ヌードマウスにおいてＰ−糖タンパク質によって輸送されない薬物であるシスプラチンの抗腫瘍効果の効力を増すことが示された（Grunickeら，前掲）。表皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤エルブスタチンは、イン・ビボで抗腫瘍活性を有することが報告された（Imotoら，1987，Japanese J．Cancer Re s．78: 329-332; Toiら，1990，Eur，J．Cancer 26: 722-724）。エルブスタチンが細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１誘発を阻害する能力を有するという証拠は、全く報告されなかった。実施例２および４に記載するスタウロスポリンを除いて、前記化合物のうち、細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１誘発を予防する能力について試験されたものはなかったが、本発明に記載される結果は、それらがかかる効果を有すると思われることを強く示した。というのは、それらの全てがＰＫＣを阻害する能力を有するからである。これらのＰＫＣ阻害剤および他のＰＫＣ阻害剤についてのイン・ビボ動物および臨床試験データの有効性は、当業者が化学療法の間の多剤耐性の出現を予防するために慣用の抗癌剤と合わせてかかる化合物を用いることができるようにする。これらの化合物は、反復注射によって、連続注入によって、または、局所治療として、体重１kg当たり薬物１〜２５０mgの投与量範囲で化学療法薬治療と一緒に投与される。本発明のこれらの態様に加えて、イン・ビトロアッセイは、化学療法薬によるＭＤＲ１遺伝子発言の誘発を予防する能力を有する化合物の迅速な同定について記載される。例えば、Ｈ−９またはＫ５６２白血病細胞系は、標準的な組織培養条件下、１０〜２５μＭＡra−Ｃまたは２００ng／mＬビンブラスチンに暴露する１０〜３６時間前に約３０分間（１時間にわたる培養の時間が充分であるが、図２Ｂを参照）試験化合物で処理し、次いで、対照と比較して、試験化合物で処理した培養物における薬物によるＭＤＲ１誘発を評価する。かかるアッセイによって、化学療法薬によるＭＤＲ１誘発を予防する能力を有すると同定された試験化合物は、ここに記載されタンパク質キナーゼ阻害剤と同様の方法で患者治療のために用いられる。３．ＭＲＰ発現を阻害するためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤が、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ； Grantら，前掲）と称されるタンパク質の発現を阻害する能力も有することを示す。ＭＤＲ１と対照的に、下記実施例５および図８に記載するようなcＤＮＡ− ＰＣＲ実験によって証明されるように、Ｈ９ヒトＴ−細胞白血病細胞などのある種のヒト腫瘍細胞は、ＭＲＰ遺伝子の強い発現を示す。かかる細胞のある種のタンパク質キナーゼ阻害剤での処理の結果、ＭＲＰ発現の劇的な減少を生じる。Ｈ ―９細胞におけるＭＲＰ発現を阻害する能力を有することが示された化合物としては、スタウロスポリン（１００nＭの濃度で）、硫酸ネオマイシン（１０mＭ）、ケレリトリン（１〜５μＭ）およびエルブスタチン類似体である２,５−ジヒドロキシ桂皮酸メチル（３２μＭ）が挙げられる。かくして、本発明は、癌化学療法患者に対する２つの関連する利益活性を有する多くの薬剤を提供するものてある。これらの薬剤は、化学療法薬によるＭＤＲ１遺伝子の活性化を予防し、これにより、ＭＤＲ１陰性腫瘍を有する患者の化学療法の間のＭＤＲ１媒介多剤耐性の出現を抑制する。さらに、これらの薬剤は、ＭＲＰ発現を減少させ、これにより、ＭＲＰ陽性腫瘍におけるＭＲＰによって媒介された多剤耐性を減少させる。これらの薬剤のうちの１つである硫酸ネオマイシンは、一般的に用いられる抗生物質であるというさらなる長所を有しており、これは、臨床的によく特徴付けられており、この使用は、癌化学療法患者における偶発性細菌感染に抗するための利益を付加した。以下の実施例は、本発明の特定の具体例およびその種々の使用を説明するものである。これらの実施例は、説明目的のためだけに挙げられており、本発明を限定しようとするものではない。実施例１タンパク質キナーゼ阻害剤は、正常な細胞および腫瘍細胞におけるタンパク質キナーゼＣアゴニスト媒介ＭＤＲ１誘発を予防する１．物質および方法１.１．細胞系および薬物処理健康なボランティアから、インフォームドコンセント後に静脈穿刺により正常なヒトＰＢＬを採取し、次いで、Ｈistopaque−１０７７（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカルズ・カンパニー（Ｓigma Ｃhemical Co.））中で密度勾配遠心分離により低密度単核細胞の単離を行った。ＫＧ１細胞系は、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２mＭＬ−グルタミン、１００ユニット／mＬペニシリンおよび１００μg／mＬストレプトマイシン（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ・ラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬaboratories））を有するイスコブの修飾ダルベッコ培地中に維持した。ＭＣＦ−７、ＥＪ、ＫＢ−３−１、Ｈe ＬaおよびＨＴ−１０８０細胞系は、１０％ＦＣＳおよび２mＭＬ−グルタミン、１００ユニット／mＬペニシリンおよび１００μg／mＬストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中に維持した。１mＭＡra−Ｃ（シグマ（Ｓigma））の貯蔵溶液を無菌リン酸塩緩衝化生理食塩水（pＨ７.２）中で調製し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。１００〜１０００μg／mＬＴＰＡ（シグマ（Ｓigma））および３０mＭ１,２−ジオクタノイルグリセロール（ＤＯＧまたはＤiＣ₈）（オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブズ（Ｍolecular Probes））の貯蔵溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製し、−３０℃で貯蔵した。ケレリトリン、カルホスチン（calp hostin）Ｃ、２,５−ジヒドロキシ桂皮酸メチル、チルホスチン（tyrphostin）Ａ２５、チルホスチンＢ４６、ヘルビマイシンＡおよびゲニステイン（全て、カリフォルニア州ラジョーラのカルビオケム（Ｃalbiochem）から入手した）ならびにＤ,Ｌ−threo−スフィンゴシン、スタウロスポリン（staurosporine）およびＨ７（全て、シグマ（Ｓigma）から入手した）の貯蔵溶液は、適切な濃度でＤＭＳＯ中で調製した。硫酸ネオマイシン（カルビオケム（Ｃalbiochem））を無菌脱イオン水に溶解させた。ＤＭＳＯ溶液を用いる対照実験は、ＤＭＳＯがＰ− 糖タンパク質機能または発現に対して効果を有しないことを示した。観察される細胞傷害性に依存して、種々の細胞系の処理のために、種々の濃度のＴＰＡを用いた。ＰＢＬは、１ng／mＬＴＰＡで処理し、Ｈ９およびＫ５６２細胞は、１０ ng／mＬＴＰＡで処理し；ＫＧ１ａおよびＫＧ１細胞は、１００ng／mＬＴＰＡで処理し、他の細胞系は、１０ng／mＬＴＰＡで処理した。同様に、種々の細胞系のために種々の濃度のＤＯＧを用いた。かくして、ＰＢＬは、７５μＭＤＯＧで処理し、Ｈ９およびＫ５６２細胞は、７５μＭＤＯＧで２時間おきに２回処理した。フローサイトメトリー分析またはＲＮＡ抽出の前に８〜１２時間、細胞をＴＰＡまたはＤＯＧに暴露した。スタウロスポリン（シグマ（Ｓigma））をＫＧ１ａ細胞について１００nＭの濃度で用い、他の細胞系については３０nＭで用いた：ＴＰＡまたはＤＯＧの添加の３０分前に細胞に添加した。１.２．フローサイトメトリーアッセイローダミン１２３（Ｒh１２３）蓄積アッセイにより、Ｐ−糖タンパク質活性をアッセイした。このアッセイについては、薬物処理細胞または薬物未処理細胞を３回洗浄し、１００ng／mＬＲh１２３（シグマ（Ｓigma））を含有する培地中、３７℃で１.５〜２時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、分析するまで氷上に維持した。単層で増殖する細胞を、pＨ７.４のリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、２０mＭエチレン−ジアミン四酢酸（シグマ（Ｓigma））で懸濁させ、Ｒh１２３染色前に３回洗浄した。いくつかの実験において、Ｒh１２３蓄積の代わりにＲh１２３流出アッセイ（Chaudhary および Roninson，1991，Cell 66: 85-94）を用いた。Ｐ−糖タンパク質特異的マウスＩgＧ２ａモノクローナル抗体（mＡＢ）ＵＩＣ２（Mechetner および Roninson，1992，Proc Natl ．Acad．Sci．USA 89: 5824ー 5828）を用いて、細胞表面上でのＰ−糖タンパク質発現を分析した。マウスＩg Ｇ２ａイソタイプ対照抗体は、シグマ（Ｓigma）から入手した。ＵＩＣ２ mＡＢまたはイソタイプ対照体によるＰＢＬの染色のために、１０⁶細胞を該抗体１０ μgで４℃で３０分間染色し、２回洗浄した後、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩgＧ２ａ抗体（ニュージャージー州フェアローンのフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆisher Ｓcientific））１０μgで３０分間染色し、ＰＢＳ＋２％ＦＣＳで１：２に希釈した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ＋２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＰＩで染色し、分析するまで氷上に維持した。他の細胞タイプの染色のために、１０⁶細胞当たり二次抗体２μgを用いる以外は、実質的に同一のプロトコールを用いた。いくつかの実験では、二次抗体としてフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩgＧ２ａを用いた；かかる場合、ＰＩは添加しなかった。コールター・エピックス・７５３・フロー・サイトメター（Ｃoult er Ｅpics ７５３Ｆlow Ｃytometer）でフローサイトメトリー分析を行った。１.３．ＲＮＡ抽出およびcＤＮＡ−ＰＣＲ分析小規模ドデシル硫酸ナトリウム抽出法（Peppel および Baglioni，1990，BioT echiques 9: 711-713）により約１０⁶細胞からＲＮＡを抽出した。別法としては、ＴＲＩzol法（ギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）から商業的に入手可能）を用いて細胞からＲＮＡを単離した。ＭＤＲ１およびβ₂−ミクログロブリンcＤＮＡ配列のcＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、実質的に開示に従って行った（Noonanら，1990，Proc．Natl．Acad．US A 87: 7160-7164; Noonan and Roninson，1991，in Roninson(編)，Molecular a nd Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells ，Plenum Press ，New York，pp．319-333）。すなわち、Krug および Berger（1987，Meth. Enz ymol．152: 316-324）の方法を用いて、cＤＮＡを調製した。ランダムヘキサマーをcＤＮＡ合成のためのプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）の代わりに用いた（商業的に入手可能なキット（例えば、メリーランド州ゲイザスバーグのギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）から）は、ランダムヘキサマーを用いてcＤＮＡを作成するために好都合に変形することができる）。次いで、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法を行う： β₂Ｍ（センス） 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'（配列番号１） β₂Ｍ（アンチセンス） 5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'（配列番号２）ＭＤＲ１（センス） 5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'（配列番号３）ＭＤＲ１（アンチセンス） 5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'（配列番号４）（ここで、β₂Ｍは、β₂ミクログロブリンを表す）。９４℃で３分間の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなるサイクル１回、次いで、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなるサイクル１９回、次いで、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で５分間のプライマー伸長からなる最終サイクルからなる方針の下、β₂Ｍ実験についてＰＣＲを行った。増幅を１９サイクルから２５サイクルに延長した以外は、β₂Ｍについてと同一のプロトコールを用いてＭＤＲ１ cＤＮＡ配列を増幅させた。さらに、cＤＮＡ−ＰＣＲ増幅プロトコールは、以下の変形を含んだ：（ｉ）試料を最初に９４℃に加熱した後、ＰＣＲ混合物にＴaq ＤＮＡポリメラーゼを添加した。（ii）種々の処理タイプに付される細胞における差動ＲＮＡ分解について説明するために、種々の調製物におけるcＤＮＡ鋳型の最初の量を補正するためのプライマー規準としてＰＣＲの２２〜２８サイクルの後に得られたβ₂ミクログロブリン特異的結合の収量を用いた。オートラジオグラフィーにより、³²Ｐ標識ＰＣＲ生成物を検出した。実施例２リンパ系細胞分化誘発剤により処理された細胞におけるＰ−糖タンパク質発現の機能的アッセイ機能的アッセイを用いて、Ｐ−糖タンパク質輸送蛍光ミトコンドリア色素であるＲh１２３の細胞蓄積のフローサイトメトリー分析に基づき、リンパ系分化または活性化を誘発する種々の薬剤で処理したヒトＰＢＬにおけるＰ−糖タンパク質活性の変化を検出した。このアッセイでは、Ｐ−糖タンパク質をあまり発現しない細胞は、Ｒh１２３で鮮やかに染色されるが、高レベルのＰ−糖タンパク質活性を有する細胞は、Ｒh１２３−鈍い（dull）を表す。Ｐ−糖タンパク質に対する明らかな効果は、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ＩＬ−１αまたはＩＬ−２で処理した細胞において観察されなかった。対照的に、ＰＢＬのホルボールエステルＴＰＡによる処理は、Ｒh１２３−鈍い細胞の数の有意な増加の原因となる。Ｒh１２３−鈍い集団の増加は、３０μＭベラパミル（Ｐ−糖タンパク質阻害剤）の添加により予防することができた。ＴＰＡの最もよく知られている細胞効果は、ＰＫＣの刺激であるので、細胞透過可能なジアシルグリセロールおよびＰＫＣの生理学的刺激剤であるＤＯＧを試験して、ＰＢＬにおけるＲh１２３蓄積に対する効果を測定した。ＰＢＬのＤＯＧによる処理により、ＰＢＬによるＲh１２３の蓄積が減少することが判明した。Ｐ−糖タンパク質活性に対するＰＫＣ刺激剤の観察された効果がＰ−糖タンパク質発現の増加によるものであるかを決定するために、ヒトＭＤＲ１遺伝子によってコードされているＰ−糖タンパク質の細胞外エピトープを認識したmＡＢＵＩＣ２による間接免疫蛍光標識により、未処理のＰＢＬおよびＴＰＡ処理ＰＢＬを染色した。ＴＰＡ処理は、細胞表面上のＰ−糖タンパク質のレベルを顕著に増加させた。Ｐ−糖タンパク質の増加は、ＭＤＲ１ cＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法により検出されるようなＴＰＡ処理ＰＢＬの全集団におけるＭＤＲ１ mＲＮＡレベルの対応する増加を伴った。かくして、ＴＰＡにより誘発されるＰ−糖タンパク質活性の増加は、少なくとも一部分は、mＲＮＡおよびタンパク質のレベルでのＭＤＲ１遺伝子発現の活性化によるものであった。ＰＢＬは、多くの異なるサブタイプの異種集団からなるので、一連の白血病由来のクローナル細胞系を、ＴＰＡによる処理後のＰ−糖タンパク質発現の変化について試験した。表Ｉにまとめるように、ＴＰＡ処理前にＰ−糖タンパク質について正であった全ての細胞系は、ＴＰＡに暴露した後、Ｐ−糖タンパク質発現の大きな増加を示した。このグループとしては、ヒトＫＧ１およびＫＧ１ａ（幹細胞性白血病細胞系）が挙げられ、その相対的に高いレベルのＰ−糖タンパク質は、正常な造血幹細胞（Chaudhary および Roninson，前掲）ならびにネズミＥ１４胸腺腫およびＬＢＲＭ３３リンパ腫細胞系におけるこのタンパク質の発現を反映すると思われた。検出可能なＰ−糖タンパク質を発現しなかった細胞系のうち、Ｈ９およびＬ５６２白血病細胞系は、ＴＰＡまたはＤＯＧのいずれかによるＭＤＲ１ mＲＮＡおよびＰ−糖タンパク質のクリアーカット（clear−cut）誘発を示した。フローサイトメトリーアッセイは、ＴＰＡまたはＤＯＧによるこれらの細胞系の処理により、Ｐ−糖タンパク質を発現した主な細胞集団の出現が生じたことを示した（図１）。これらの変化は、ＴＰＡ処理細胞またはＤＯＧ処理細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡの定常レベルの増加に匹敵する（図２Ａおよび２Ｂ）。図２Ｂに示すとおり、ＭＤＲ１ mＲＮＡは、ＴＰＡの添加の２時間後にＨ９細胞中で検出可能になり、少なくとも５時間まで増加し続けた。これは、ＴＰＡに対する迅速な応答を示し、これらの細胞におけるＴＰＡによるＭＤＲ１の転写可能な活性化と一致する。ＴＰＡ処理後のＭＤＲ１発現の増加は、造血細胞に限定されないが、低レベルのＰ−糖タンパク質を発現したＥＪ膀胱癌細胞およびＭＤＲ１発現がＴＰＡ処理なしでは検出不可能であったＭＣＦ−７乳癌細胞を含むいくつかの充実性腫瘍誘導細胞系においても観察された（図２Ｃ）。表Ｉにまとめるように、試験したＰ ―糖タンパク質陰性細胞系のほとんどは、ＴＰＡの固定濃度（２０ng／mＬ）で処理されただけであり、高いＴＰＡ濃度に対する応答能について試験されなかった。ＭＤＲ１遺伝子発現は、Ｒh１２３蓄積についての機能的アッセイ（Ｆ）、ＵＩＣ２抗体染色（Ａ）またはＭＤＲ１ mＲＮＡについてのcＤＮＡ−ＰＣＲアッセイ（Ｒ）により評価され、相対的な値として表された。細胞がＲh１２３またはＵＩＣ２染色アッセイにより検出可能なＰ−糖タンパク質を発現せず、ＭＤＲ１ mＲＮＡレベルがＫＢ−３−１細胞のものほど高くない場合、細胞は、陰性であると考えられた。ＰＫＣアゴニストによりＭＤＲ１遺伝子発現の誘発を妨害しようとする試みにおいて、有効なタンパク質キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンを用いて、種々の細胞系を処理した。予想外にも、スタウロスポリン単独で、Ｐ−糖タンパク質に対して既に陽性であった細胞系（ＫＧ１、ＫＧ１ａ、マウスＥＬ４およびＬＢＲＭ３３細胞系）においてＰ−糖タンパク質の有意な増加を生じた。Ｐ−糖タンパク質阻害剤およびＰＫＣの阻害剤であることが知られている２つのさらなる化合物、シクロスポリンＡおよびベラパミルは、ＫＧ１およびＥＬ４細胞におけるＰ−糖タンパク質発現および／または色素流出を増加させることも判明した。Ｐ−糖タンパク質陽性細胞系におけるＰ−糖タンパク質発現に対するＰＫＣ阻害剤の効果により、かかる細胞におけるスタウロスポリンとＰＫＣアゴニストとの間の相互作用を分析することが困難になった。しかしながら、スタウロスポリンは、Ｐ−糖タンパク質陰性Ｈ９細胞においてＭＤＲ１発現を誘発しなかった。ＴＰＡまたはＤＯＧ処理の３０分前のスタウロスポリンのＨ９細胞への添加は、フローサイトメトリー（図１）およびcＤＮＡ−ＰＣＲアッセイ（図２Ａ）により証明されるように、これらの薬剤によりＭＤＲ１誘発を完全に破壊した。スタウロスポリンは、正常なＰＢＬにおけるＴＰＡおよびＤＯＧの効果をも示した。実施例３タンパク質キナーゼ阻害剤は、腫瘍細胞における細胞傷害性薬物媒介ＭＤＲ１誘発を予防する１．物質および方法１.１．フローサイトメトリーアッセイＫ５６２細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ５mＬ中、３７℃で１０分間、１００ng／mＬＲh１２３または１０ng／mＬのＤiＯＣ₂(３)、別のＰ −糖タンパク質輸送色素（Chaudhary および Roninson，前掲）で染色した。２回洗浄した後、該細胞を、前記に従って（Chaudhary および Roninson，前掲）、無色素培地５mＬ中、３７℃で３時間（Ｒh１２３について）または２時間（Ｄ iＯＣ₂(３)について）、色素を流出させた。二重標識実験において、染色のために培地５mＬ中ＤiＯＣ₂(３)３ng／mＬを用いた。３μＭベラパミルの存在下および不在下で各流出アッセイを行った。ＫＧ１細胞を、３７℃で３時間、培地５mＬ中、１００ng／mＬＲh１２３で染色し、流出なしで分析した。ＫＧ１細胞２×１０⁵個当たり、一次抗体（シグマ（Ｓigma）からのＵＩＣ２またはマウスＩgＧ２ａイソタイプ対照）２μgおよびヒツジ抗マウスＩgＧのＰＥコンジュゲートＦ(ａｂ')₂フラグメント（シグマ（Ｓigma））である二次抗体１０μg を用いて間接免疫蛍光標識（前掲のChaudhary および Roninsonの開示に従って）を行った。開示されているとおり（Chaudhary および Roninson，前掲）、フローサイトメトリー分析およびフローソーティングを行った：生存不可能な細胞は、異常なサイズもしくは粒度に基づいて、または、フィコエリトリンを用いない実験において、ヨウ化プロピジウムの蓄積により、分析から排除された。１.２．増殖阻害アッセイウエル当たり細胞３,０００個で９６ウエルのマイクロタイタープレート中で二重に細胞を平板培養し、種々の薬物の増加する濃度において増殖させた。７〜１０日後の細胞増殖をＭＴＴアッセイにより分析した（Pauwelsら，1988，J．Vi rol．Meth．20: 309-321）。１.３．ＭＤＲ１誘発阻害アッセイウエル当たり細胞３,３００個で６ウエルのファルコン組織培養プレート中で細胞を平板培養した。Ａra−ＣまたはＴＰＡの１２時間前に添加したヘルビマイシンＡ、ならびにＡra−ＣまたはＴＰＡの添加によるＭＤＲ１誘発の１６時間前に添加したチルホスチンＡ２５およびＢ４６を除いては、試験しようとするタンパク質キナーゼ阻害剤の各々をＡra−ＣまたはＴＰＡの添加によるＭＤＲ１誘発の４５分前に適切な最終濃度で添加した。cＤＮＡ−ＰＣＲ分析のために収穫する前にＭＤＲ１誘発剤を添加した後、３７℃／５％ＣＯ₂で、細胞を一晩（ＴＰＡ）または１０時間（Ａra−Ｃ）インキュベートした。さらに、ある薬物の分析は、付加された要求を強要した。カルホスチンＣを用いる実験のために、直接白色光照明下、細胞をインキュベートした。Ｄ,Ｌ―thr eo−スフィンゴシンを用いる実験のために、該細胞培養培地を、３７℃で１時間、ゆっくりと連続的に混合しつつ、適切な濃度の薬物で前処理した。この前処理後、薬物で補足した培地中、細胞を再懸濁させ、前記に従って４５分間インキュベートした。インキュベーション期間の終了後、各培養物を２５μＭＡra−Ｃで処理し、さらに１０時間インキュベートした。別法としては、各培養物を１６nＭ（１０n g／mＬ）ＴＰＡで処理し、１２時間または一晩インキュベートした。前記実施例１の記載に従って、薬物で処理した各培養物について、または、Ａ ra−ＣまたはＴＰＡ単独の不在下または存在下でインキュベートした対照培養におけるcＤＮＡ−ＰＣＲ分析を行った。実施例４タンパク質キナーゼ活性化因子および阻害剤で処理した細胞におけるＰ−糖タンパク質発現の機能的アッセイ前記実施例１および２に記載の研究は、腫瘍細胞における多剤耐性応答の活性化におけるＰＫＣの重要な役割を示す、ＰＫＣアゴニストがＭＤＲ１発現を誘発することができることを示した。ＰＫＣは、種々のタイプの細胞傷害性ストレスに対する細胞応答にも関係しなかった（Papathanasiou および Fornace，1991， in R．F．Ozols(編)，Molecular and Clinical Advances in Anticancer Drug R esistance ，Kluwer Academic Publishers，Boston，MA，pp．13-36）。特に、ＰＫＣは、Ａra−Ｃでの処理により活性化される。したがって、Ｐ−糖タンパク質により輸送されないＡra−ＣがＫ５６２白血病細胞におけるＰ−糖タンパク質機能に対する効果を有するかを試験するために実験を行った。図３Ａにおいて説明したとおり、Ｋ５６２細胞のＡra−Ｃへの１２〜７２時間の暴露により、Ｒh１２３を流出した３〜１７％細胞の亜集団が出現した。Ｒh１２３流出は、Ｐ−糖タンパク質阻害剤ベラパミルに対して感度が高かった。Ｒh１２３−鈍い細胞の出現を、cＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅により検出されたように、Ａr a−Ｃ処理Ｋ５６２細胞におけるβ₂−糖タンパク質に対してＭＤＲ１ mＲＮＡ発現の投与依存性増加により比較した（図４）。Ｋ５６２細胞においてＭＤＲ１発現を誘発させる能力について、多くの他の化学療法薬を試験した。アドリアマイシン、ダイウロルビシン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびヒドロキシ尿素は、全て、ＭＤＲ１ mＲＮＡ発現（図４Ｂ）および処理細胞の３〜１０％までのＲh１２３またはＤiＯＣ₂(３)流出（図３Ａ）を誘発することが判明した。これらの薬物の最初の４つだけは、Ｐ−糖タンパク質によって輸送される（Roninson，前掲）。ＭＤＲ１誘発に必要な短時間の薬物暴露と一緒にこの結果は、ＭＤＲ１発現細胞についての細胞傷害性薬物選択がＰ−糖タンパク質陽性亜集団の出現の原因ではなかったことを示す。細胞傷害性薬物のＭＤＲ１発現を誘発する能力は、Ｋ５６２細胞に限定されなかった。Ａra−Ｃは、Ｒh１２３蓄積またはモノクローナル抗体ＵＩＣ２との免疫反応性により検出されるように、薬物処理前にＰ−糖タンパク質の有意な量を含有するＫＧ１白血病細胞においてＰ−糖タンパク質を増加させた（図３Ａ）。Ａra−Ｃは、また、Ｈ９Ｔ細胞白血病（図５）、ＫＢ−３−１類表皮癌（図４Ｃ）およびＥＪ膀胱癌（図４Ｄ）におけるＭＤＲ１ mＲＮＡ発現をも活性化させたが、誘発の大きさは、癌細胞系において多少低下させられた。さらに、ＭＤＲ１ mＲＮＡ発現は、アドリアマイシン、ビンブラスチンおよびメトトレキシエートでの処理によりＨ９細胞において（図５）、および、アドリアマイシンでの処理によりＫＢ−３−１細胞において（図４Ｃ）誘発された。しかしながら、Ｐ− 糖タンパク質誘発は、これらの薬物で処理したＨＬ６０白血病細胞において検出されなかった。全ての場合、ＭＤＲ１誘発は、明らかな細胞損傷と同時に検出可能になり、これは、細胞腫脹、増加した量、変形した細胞の形状、および増殖阻害により証明された（図４Ａ）。さらに、いくつかの方法のための薬物の不在下でのいくつかの細胞系の連続通過により、ＭＤＲ１発現を少し増加させ、これは、未処理細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡの基本レベルにおける変異性の原因となる。また、薬物誘発ＭＤＲ１発現が細胞傷害性薬物処理後に維持されるかをアッセイした。この目的のために、Ｋ５６２細胞を、Ａra−Ｃ、アドリアマイシン、クロラムブシルまたはメトトレキセートの細胞傷害性濃度で３〜５日間処理し、次いで、薬物の不在下で増殖させた。種々の時点で、生存している細胞におけるＭＤＲ１発現を、ＵＩＣ２による色素流出および免疫蛍光標識により（図３Ｃ）、または、cＤＮＡ−ＰＣＲにより（図４Ｅ）分析した。処理細胞の亜集団におけるＭＤＲ１発現は、薬物の除去後、少なくとも数週間（Ａra−Ｃ処理集団において１１週間まで）維持された。Ｐ−糖タンパク質陽性Ｋ５６２細胞は、それらのサイズ、粒度および分化関連抗原性マーカーの発現の有意な変化を示さなかった。Ａra−Ｃまたはアドリアマイシンの除去の６週間後の多剤耐性細胞の存在もまた、ビンブラスチン、Ｐ−糖タンパク質基質での増殖阻害アッセイによって示された。ＩＤ₁₀値の約２〜３倍の増加により特徴付けられるビンブラスチン耐性は、特に、細胞のＲh１２３−鈍い亜集団と関連した（図６）。かくして、薬物処理は、処理細胞の亜集団におけるＭＤＲ１発現の保持された誘発およびその関連薬物耐性を導く。Ａra−Ｃおよびアドリアマイシン処理Ｋ５６２細胞は、Ｐ−糖タンパク質により輸送されない化学療法的アルキル化剤であるクロラムブシルの細胞傷害性効果に対して未処理細胞よりも耐性があることも判明した。この結果は、臨床的に関連した薬物耐性の他の経路またはメカニズムが化学療法薬での処理後にＭＤＲ１発現と一緒に誘発されることを示す。ＰＫＣが細胞傷害性薬物によるＭＤＲ１誘発に関係したことを示すために、種々のＰＫＣ阻害剤を用いて、Ｈ９細胞におけるＭＤＲ１ mＲＮＡ誘発を遮断した。これらの化合物の添加は、cＤＮＡ−ＰＣＲにより検出されるようなＡra−Ｃ、アドリアマイシン、メトトレキセートおよびビンブラスチンによるＭＤＲ１誘発ならびにＡra−Ｃ処理細胞による色素流出アッセイを有効に遮断した。ＰＫＣについて観察された阻害の特異性を研究するために、Ｈ７（ＰＫＣについてＩＣ₅₀ ＝６.０μＭ、タンパク質キナーゼＡについてＩＣ₅₀＝３.０ｐＭ）およびＨＡ１００４、非ＰＫＣ特異的タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＣについてＩＣ₅₀＝４０μＭ、タンパク質キナーゼＡについてＩＣ₅₀＝２.３μＭ）（Hidakaら，198 4, Biochemistry 23: 5036-5041）の増加する投与量の効果を比較した。図５Ａに示すとおり、Ｈ７は、１０μＭ以上の濃度でＡra−ＣによるＭＤＲ１誘発を阻害したが、ＨＡＩ００４は、６０μＭでさえ有意な阻害を示さなかった。これらの結果は、細胞傷害性によるＭＤＲ１誘発におけるＰＫＣについての役割と一致した。タンパク質キナーゼ阻害剤の、細胞傷害性薬物およびＰＫＣアゴニストによるＭＤＲ１誘発を抑制する能力をさらに評価するために、Ｈ−９ヒトＴ細胞白血病細胞をcＤＮＡ−ＰＣＲアッセイにおいて用いて、タンパク質キナーゼ阻害剤の存在下、誘発されたＭＤＲ１ mＲＮＡ発現レベルを試験した。これらのアッセイの結果を図７に示し、表IIにまとめる。ＭＤＲ１は、１０ng／mＬＴＰＡにおける一晩のインキュベーションにより図７に示される細胞において誘発された；２５μＭＡra−Ｃとの１０時間のインキュベーションを用いて、図７Ａ〜７Ｅにおけるように分析した全ての他の細胞培養物においてＭＤＲ１発現を誘発した。２つのエルブスタチン類似体（チルホスチンＡ２５およびＢ４６）を、図７Ａに示すように、Ａ２５誘発ＭＤＲ１ mＲＮＡ発現を阻害する能力について試験した。これらの化合物（チルホスチンＡ２５、レーン５および６；チルホスチンＢ４６、レーン７および８）は、共に、５０〜１００μＭの濃度でＨ−９細胞と一緒にインキュベートした場合、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を強く阻害する能力を示した。抗菌剤硫酸ネオマイシンを、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現に対する阻害能力について試験した。この化合物は、１０mＭの濃度で２５μＭＡra−Ｃで誘発された細胞におけるＭＤＲ１発現を阻害することが判明した。これらの結果は、硫酸ネオマイシンが、臨床的に関連しており、達成可能な濃度で、ＭＤＲ１阻害能を有することを示す。エルブスタチン類似体２,５−ジヒドロキシ桂皮酸メチルの、Ｈ−９細胞の２５μＭＡra−Ｃによる処理により誘発されたＭＤＲ１発現を阻害する能力を図７Ｃに示す。これらの結果は、このエルブスタチン類似体が、３２μＭおよび６４μＭで，ＭＤＲ１発現を実質的に同一の程度までに阻害することを示す。Ａra−Ｃの阻害は、図７Ｄに示されるカルホスチンＣと白色光での直接照明との組合せによりＭＤＲ１発現を誘発した。この化合物は、１μＭの濃度で存在する場合、ＭＤＲ１発現を阻害する能力を有することが判明した（レーン７および８）；この化合物の阻害能は、用いた濃度が０.１μＭに減少した場合に非常に低下した（レーン５および６）。Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現の漸進的投与量依存性阻害は、ＰＫＣ阻害性ケレリトリンについて示され、図７Ｅに示される。この化合物を用いる阻害の投与量依存性は、レーン５および６（１μＭケレリトリン）ならびにレーン７および８（５μＭケレリトリン）におけるＭＤＲ１特異的結合の強度の比較によって見られる。図７Ｆは、公知のＰＫＣアゴニストであるＴＰＡによるＭＤＲ１の発現の誘発について、３０nＭスタウロスポリン（レーン７および８）または３２μＭ２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチル（エルブスタチン類似体）の存在下、Ｈ−９細胞のインキュベーションの結果を示す。ＴＰＡ単独（レーン３および４）は、前記の結果と一致する、ＭＤＲ１発現の容易に検出可能なレベルを有効に誘発した。ＰＫＣ阻害剤であるスタウロスポリンおよび２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチルは、共に、ＴＰＡ誘発ＭＤＲ１発現を完全に阻害した。これらの結果は、表皮細胞増殖因子チロシンキナーゼを阻害することが知られているエルブスタチン類似体がＰＫＣ阻害活性を有するという従前の観察と一致する（Bishopら，前掲）。多くの他のタンパク質キナーゼ阻害剤は、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を阻害する能力をあまり有しないことが判明した。これらの化合物は、これらの化合物としては、Ｄ,Ｌ−threo−スフィンゴシン（５μＭで試験した；高濃度は、細胞傷害性を誘発した）およびヘルビマイシンＡ（０.３５〜３μＭの濃度で試験した）が挙げられる。タンパク質キナーゼに対して１０倍弱い効果を有するpＨ７の構造類似体であるＩso−Ｈ７で、有意な阻害が観察されなかった（Pelosinら，1 990，Biochem．Biophys．Res．Commun．169: 1040-1048）。Ａra−Ｃ処理Ｋ５６２細胞で類似の結果が観察された。別のタンパク質キナーゼ阻害剤であるゲニステイン（１５０μＭ）は、Ａra−Ｃ誘発ＭＤＲ１発現を非常に弱く阻害することが判明した（表II）。これらの結果は、多くのタンパク質キナーゼ阻害剤のうちある種のものおよび特にタンパク質キナーゼＣ阻害剤が細胞傷害性薬物またはタンパク質キナーゼＣアゴニストによる癌細胞の処理によって誘発されたＭＤＲ１発現を阻害する能力を有することを示した。本明細書に示したデータは、Ｐ−糖タンパク質によって輸送されないものを含む種々の化学療法薬が、予め存在する遺伝的変異体の選択によるよりもむしろ直接ＭＤＲ１発現を阻害したことを示した。薬物誘発ＭＤＲ１発現は、処理細胞の亜集団に限定され、Ｐ−糖タンパク質輸送薬物の耐性の適度な増加（Ｋ５６２細胞の場合、約２〜３倍）に関連した。この増加は、イン・ビボでの化学療法への応答を低下させるのに、および、高レベルの薬物耐性を有する遺伝的突然変異体の選択を増強させるのに充分である。ＭＤＲ１発現の薬物媒介誘発は、癌化学療法の間に生じ、処理した腫瘍におけるＭＤＲ１発現の増加した事件の大きな原因となる。したがって、ＰＫＣ阻害剤がＭＤＲ１誘発を予防することができるというデモンストレーションは、癌細胞の高度な根絶を達成するために、癌化学療法において細胞傷害性薬物との組み合わせでかかる薬剤を用いて示唆された。実施例５タンパク質キナーゼ阻害剤は、腫瘍細胞においてＭＲＰ発現を予防する１．物質および方法１.１．ＭＲＰ発現阻害アッセイウエル当たり細胞３,３００個で６ウエルのファルコン組織培養プレート中で細胞を平板培養し、適切な濃度の薬物中でインキュベートした。試験しようとするタンパク質キナーゼ阻害剤の各々を適切な最終濃度で添加し、次いで、該細胞を、５％ＣＯ₂の雰囲気下、３７℃で１０時間インキュベートした。前記実施例１に記載に従って、薬物で処理した各培養物について、または、薬物なしでインキュベートした対照培養物中でのcＤＮＡ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲ法は、以下のプライマーを用いて行った。 β₂Ｍ（センス） 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3' （配列番号１） β₂Ｍ（アンチセンス） 5−ATCTTCAAACCTCCATGATG-3' （配列番号２）ＭＲＰ（センス） 5'-GGACCTGGACTTCGTTCTCA-3' （配列番号５）ＭＤＲ１（アンチセンス） 5'-CGTCCAGACTTCCTTCATCCG-3'（配列番号６）（ここで、β₂Ｍは、β₂ミクログロブリンを表す）。９４℃で３分間の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなるサイクル１回、次いで、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなるサイクル１９回、次いで、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で５分間のプライマー伸長からなる最終サイクルからなる方針の下、β₂Ｍ実験についてＰＣＲを行った。ＭＲＰ cＤＮＡ配列は、９４℃ で３分間の変性からなるサイクル１回、９４℃で３０秒の変性、６２℃で３０秒のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなるサイクル２６回、次いで、７２℃で５分間のプライマー伸長からなるサイクル１回からなるプロトコールを用いて増幅させて、２９２bpのＭＲＰ特異的増幅フラグメントを得た。³²Ｐ標識ＰＣＲ生成物は、オードラジオグラフィーによって検出した。実施例６タンパク質キナーゼ活性化因子および阻害剤で処理した細胞におけるＭＲＰ発現の機能的アッセイＨ−９細胞を用いて、多剤耐性関連タンパク質ＭＲＰの発現について種々のタンパク質キナーゼ阻害剤の効果を分析した（Grantら，前掲）。これらの実験の結果を図８に示す。ＭＲＰ mＲＮＡ発現を薬物の不在下でＨ−９細胞において評価した場合、これらの細胞は、ＭＲＰ遺伝子を強く発現することが判明した（図８、レーン１および２）。ＭＤＲ１とは対照的に、２５μＭＡra−ＣにおけるＨ−９細胞のインキュベーションは、ＭＲＰ発現のわずかな減少を生じた（データは、示さない）。スタウロスポリン（１００nＭ；レーン３および４）、ケレリトリン（１〜５μＭ；レーン５および６）、２，５−ジヒドロキシ桂皮酸メチル（３２μＭ；レーン７および８）または硫酸ネオマイシン（１０mＭ；レーン９および１０）とのインキュベーションの後、ＭＲＰ発現を強く阻害した。これらの結果は、種々のタンパク質キナーゼ阻害性化合物が細胞傷害性薬物誘発ＭＤＲ１発現および多剤耐性表現型関連ＭＲＰ遺伝子の発現の両方を阻害する能力を有することを示す。これらの結果は、かかるタンパク質キナーゼ阻害剤が、化学療法を受けている癌患者における多剤耐性の出現を予防するのにおいて大きな有用性を有することを強く示す。本発明は、例示した具体例によっては範囲を限定されず、該具体例は、本発明の個々の態様を説明しようとするものである。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の種々の変形例は、前記説明および添付した図面から当業者に明らかになるであろう。かかる変形例は、以下の請求の範囲の範囲内になる。本明細書に挙げられた全ての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シュティル，アレキサンダー・エイアメリカ合衆国60607イリノイ州シカゴ、サウス・ルーミス717番 (72)発明者ローニンソン，イゴール・ビーアメリカ合衆国60091イリノイ州ウィルメット、リンカーン・レイン2731番

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞傷害性薬物での処理と同時に癌細胞をタンパク質キナーゼ阻害剤と接触させることからなる、細胞傷害性薬物での処理による癌細胞におけるＭＤＲ１誘発の阻害方法。２．タンパク質キナーゼ阻害剤がエルブスタチン、チルホスチンＡ２５、チルホスチンＢ４６、スタウロスポリン、Ｈ７、硫酸ネオマイシン、ケレリトリンもしくはカルホスチンＣまたはその誘導体である請求項１記載の方法。３．細胞傷害性薬物が化学療法薬である請求項１記載の方法。４．癌細胞が、抗Ｐ−糖タンパク質抗体との免疫反応性、Ｐ−糖タンパク質輸送色素の蓄積もしくは流出、またはＭＤＲ１ mＲＮＡ発現アッセイにより測定される場合に検出可能なＭＤＲ１コード化Ｐ−糖タンパク質をあまりまたは全く含有しない請求項１記載の方法。５．癌細胞が造血性腫瘍から誘導される請求項１記載の方法。６．癌細胞が充実性腫瘍から誘導される請求項１記載の方法。７．癌細胞をタンパク質キナーゼ阻害剤と接触させることからなる、癌細胞におけるＭＲＰ発現の阻害方法。８．タンパク質キナーゼ阻害剤がエルブスタチン、スタウロスポリン、硫酸ネオマイシン、もしくはケレリトリン、またはその誘導体である請求項７記載の方法。９．細胞傷害性薬物が化学療法薬である請求項７記載の方法。１０．癌細胞が造血性腫瘍から誘導される請求項７記載の方法。１１．癌細胞が充実性腫瘍から誘導される請求項７記載の方法。１２．細胞傷害性薬物での処理による癌細胞におけるＭＤＲ１誘発を阻害する能力を有する化合物を判定するための複数の化合物のスクリーニング方法であって、ａ．癌細胞の最初の試料を複数の化合物の各々と、ＭＤＲ１発現に対する阻害効果を有するのに充分な時間、充分な濃度で接触させ、該癌細胞を、ＭＤＲ１遺伝子発現を誘発する能力を有する細胞傷害性薬物で、ＭＤＲ１発現誘発効果を有するのに充分な時間、充分な濃度で処理し、ｂ．試験しようとする化合物の不在下、癌細胞の第２の試料をＭＤＲ１遺伝子発現を誘発する能力を有する細胞傷害性薬物て、ＭＤＲ１発現誘発効果を有するのに充分な時間、充分な濃度で処理し、ｃ．工程ａの癌細胞のＭＤＲ１遺伝子発現を工程ｂの癌細胞のＭＤＲ１遺伝子発現と比較し、ｄ．試験した複数の化合物のうち、工程ａの癌細胞におけるＭＤＲ１遺伝子発現の誘発されたレベルが工程ｂの癌細胞におけるＭＤＲ１遺伝子発現のレベルよりも低い化合物を同定することからなるスクリーニング方法。１３．細胞傷害性薬物が化学療法薬である請求項１２記載の方法。１４．化学療法薬がシチジンアラビノシド、ビンブラスチン、アドリアマイシンまたはメトトレキセートである請求項１３記載の方法。１５．癌細胞が癌細胞系Ｈ−９白血病からなる請求項１２記載の方法。１６．癌細胞が癌細胞系Ｋ５６２白血病からなる請求項１２記載の方法。１７．スクリーニングしようとする複数の化合物の各々の存在下または不在下でのＭＲＰ発現を比較することによる、癌細胞におけるＭＲＰ発現を阻害する能力を有する化合物を判定するための複数の化合物のスクリーニング方法。１８．癌細胞が癌細胞系Ｈ−９白血病からなる請求項１７記載の方法。１９．悪性腫瘍を有しており、癌化学療法を受けている動物におけるＭＤＲ１発現の誘発を抑制するための薬物の製造のためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用であって、該薬物がタンパク質キナーゼ阻害剤の治療有効量を含有してなることを特徴とする使用。２０．タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＣ阻害剤である請求項１９記載の使用。２１．タンパク質キナーゼ阻害剤が硫酸ネオマイシンである請求項２０記載の使用。２２．タンパク質キナーゼ阻害剤がエルブスタチンまたはその類似体である請求項２０記載の使用。２３．悪性腫瘍を有しており、癌化学療法を受けている動物におけるＭＤＲ１発現の誘発を抑制するための薬物の製造のためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用であって、該薬物が請求項１２記載の方法に従って同定されたタンパク質キナーゼ阻害剤の治療有効量を含有してなることを特徴とする使用。２４．タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＣ阻害剤である請求項２３記載の使用。２５．薬物が化学療法薬も含有する請求項２３記載の使用。２６．悪性腫瘍を有しており、癌化学療法を受けている動物におけるＭＲＰ発現の誘発を抑制するための薬物の製造のためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用であって、該薬物がタンパク質キナーゼ阻害剤の治療有効量を含有してなることを特徴とする使用。２７．タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＣ阻害剤である請求項２６記載の使用。２８．タンパク質キナーゼ阻害剤が硫酸ネオマイシンである請求項２６記載の使用。２９．タンパク質キナーゼ阻害剤がエルブスタチンまたはその類似体である請求項２６記載の使用。３０．薬物が化学療法薬も含有する請求項２６記載の使用。３１．悪性腫瘍を有しており、癌化学療法を受けている動物におけるＭＲＰ発現の誘発を抑制するための薬物の製造のためのタンパク質キナーゼ阻害剤の使用であって、該薬物が請求項１７記載の方法に従って同定されたタンパク質キナーゼ阻害剤の治療有効量を含有してなることを特徴とする使用。３２．タンパク質キナーゼ阻害剤がタンパク質キナーゼＣ阻害剤である請求項３１記載の使用。