KR101719966B1 - 종양 줄기세포에서 eph 수용체의 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중추신경계의 악성 종양 분야에 관한 것으로 뇌 종양의 치료적 및 예방적 치료에 적합하고 종양 종괴의 성장을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

Description

종양 줄기세포에서 EPH 수용체의 발현{EPH receptor expression in tumor stem cells}

본 발명은 중추신경계 악성 종양 분야에 관한 것으로 치료, 뇌 종양의 예방을 위한 치료, 및 종양 덩어리의 성장 억제에 적합한 약제학적 구성요소를 제공한다.

신경아교종(Gliomas)은 가장 일반적인 뇌 종양이며, 특히, 다형성아교모세포종 (glioblastoma multiforme) (GBM)이라고도 불리는 4등급 신경교종은 가장 심각한 형태에 해당한다. 이러한 공격성이 높은 종양은 새롭게 발생하거나(일차 GBM) 낮은 등급의 신경아교종으로부터 악성으로 진행된 결과이다(이차 GBM). 모두의 경우에 이 종양의 내재적인 성질에 기인하여 예후가 좋지 않으며, 방사선치료와 화학치료가 조합될 경우 생존 평균 중앙값은 14.6개월이다(12.).

다형성아교모세포종은 매우 이질성이 높은 종양이며 이는 세포와 조직의 명확한 불일치, 강한 출혈성 구성성분, 및 넓은 부위의 괴사를 보이는데, 이는 현미경 수준에서 다량의 미세혈관성 증식과 가짜울타리 패턴의 존재와 일치한다(9.).

가장 중요하게는, GBM은 완전한 수술적 반응을 방해하는 뇌 속에 있는 종양 세포의 광범위한 파종과 함께 산재하는 조직 분포-패턴에 의해 특징지어진다. 그러므로, 질병의 재발이 대부분의 환자에서 일어난다. 게다가, GBM의 진행은 또한 광범위한 혈관형성을 동반한다.

GBM의 성장 및 확산을 차단하고 이의 치료를 위한 요법을 개발하기 위한 새로운 마커의 개발 및 특정한 분자 표적의 확인에 대한 필요 및 중요성이 점점 더 증가되고 있다.　지난 십 년 동안 여러 세미나 연구가 다른 형태의 종양의 개시, 유지, 및 진행의 주된 원인일 수 있는 암 줄기세포(CSCs)의 확인과 분리를 다루어 왔다. 치료 후 암의 지속적인 성장, 클론의 다양성과 진화, 및 종양 전이와 재발은 줄기세포의 증식 잠재성의 종양세포에 의한 유지의 결과일 수 있으며, 이로부터 종양이 유래했을 수도 있으며, 이를 암 줄기세포라 부른다. 트랜스폼된 줄기세포-유사 세포가 악성 조혈모세포, 유방암에서 발견되었으며, 줄기세포-유사 신경성 전구조상세포가 인간의 뇌 조직에서 발견되었다.

악성 뇌 종양, 또는 적어도 그 중 일부가 암 줄기세포를 포함할 때 발견은 실험적 수준과 임상적 수준 모두에서 새로운 가능성을 제공한다. 사실은, 비록 암 줄기세포 가설은 이러한 세포가 전체 종양 덩어리 내에 작은 세포 풀(pool)을 구성한다는 것을 시사하지만, 이 작은 풀이 종양을 만들고 확장시키며 수술 후 영속화시키는 진정한 장본인일 수 있다.

장기간 증식하는 암 줄기세포(CSCs)는 GBM에서 연구되어 왔으며(GBM-CSCs), GBM-CSCs는 신경 줄기세포의 기능적 특성의 전체(13.)와 인간 GBM 병리학의 주요한 조직학적, 세포학적, 그리고 구조적 특징과 밀접하게 닮아 있는 종양을 만드는 능력을 가지고 있다(5.).

시간이 지남에 따라 인간 질병의 진정한 표현형 모사를 생성하는 암 줄기세포의 능력으로 인하여, 이러한 GBM-CSCs는 GBM 생리학을 시험관 내와 생체 내에서 연구하는 데 가장 적합한 모델 중의 하나에 해당하며, GBM 자체의 침습적이고 혈관을 신생하는 행동의 조절에 직접적으로 관여하는 유전자/경로의 발견을 가능하게 할 수 있다. 분자 마커는 종양세포에서 특정적으로 발견되거나 악성세포에서 높게 과발현되며, 정상세포에서는 거의 없거나 하향조절 되는데, 타겟 약물 전달과 같은 접근에 대해 매력적인 치료적 타겟이다. Eph 수용체는 인간 게놈에 인코딩된 타이로신 키나제(tyrosine kinase)의 가장 큰 패밀리를 포함하며, 발생과 질병에서 중요한 역할을 수행하는 데, 외부 자극을 받아 들이고 신호를 세포 안쪽으로 전달해 줌으로써 반응하고, 개체 기능의 유지에 필수적인 수많은 프로세스를 시작한다. 그들은 그들 모두가 에프린(ephrins)으로 알려진, 나란히 놓여진 세포의 막에 고정되는 리간드를 인식한다는 점에서 다른 RTK와 구별된다. 리간드 결합은 전형적으로 Eph 수용체의 타이로신 인산화를 촉발한다. (4.).

그러므로 본 발명의 목적은 뇌암에 대하여 새롭고 보다 특이적인 치료 전략을 개발하는 것으로, 특히 아교모세포종의 성장과 증식의 억제자를 확인하는 것이다.

본 발명은 적어도 하나의 발현 억제자 및 약제학적으로 허용가능한 생 활성 수단을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명에서 더 설명할 것처럼, 본 발명의 약제학적 구성물은 에프린 수용체의 분자 타겟에 특이적인 이점을 가지고 있으며, 에프린 수용체는 신경계의 발생에서 높게 발현되고, 뇌세포 내의 신호전달과 많은 프로세스의 조절에 중요하다.

본 발명의 추가 양태는 뇌종양 치료에서의 이용을 위한 에프린 수용체의 발현의 억제자 및/또는 에프린 수용체의 활성 억제자이다.

본 발명은 에프린 수용체의 적어도 하나의 발현 억제자 및/또는 활성 억제자 및 약제학적으로 허용할 수 있는 생 활성 수단을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는, 에프린 수용체의 활성 억제자에 의해, 생물학적 반응을 일으키지 않으나, 작용제-중재 반응을 차단하거나 감소시키는 수용체 리간드의 형태가 의도된다.

본 발명에서는, 에프린 수용체 발현의 억제자에 의해, 수용체 발현의 및/또는 활성의 하향조절자를 의도하였다.

본 발명의 약제학적 조성물은 에프린 수용체의 분자 타겟에 특이적인 이점을 가지고 있으며, 이는 신경계의 발생에서 높게 발현되고, 뇌세포 내 신호전달과 많은 프로세스의 조절에서 중요하다.

다형성아교모세포종(GBM)의 분자적 타겟에 작용하는 특이적인 약제학적 조성물은 수술적 절제의 필요를 피할 수 있을 것이며, 그러므로 그러한 수술 후에, 종종 종양의 재발로 이어지는 뇌 내 종양세포의 광범위한 파종을 피할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 구성의 또 다른 이점은 전체 종양 덩어리 보다, 진정한 종양-개시 세포를 타겟팅하는 것에 의해, 독성이 덜하며 더 효과적이고 일반적으로 사용하는 방사선요법과 화학요법의 단독 또는 혼합보다 더 특이적이라는 것이다.

이러한 시도는 세포독성적 방법에 의해 세포를 죽이려고 하는 것보다, 비병원성 표현형을 획득하도록 종양 개시 세포를 "재프로그래밍"하는 시도에 의한 시나리오를 그리게 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 에프린 수용체의 적어도 하나의 발현 억제자 및/또는 활성 억제자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기에서 암 줄기세포는 악성 뇌 암 줄기세포이다.

GBM에서 증식하는 암 줄기세포의 존재를 보여줘 왔기 때문에, 또한 종양에 존재하는 암 줄기세포로 인하여, 암의 증식과 지속적인 성장에 작용하는 특이적인 구성요소에 대한 필요성이 증가해 왔다.

본 발명의 약제학적 조성물은 놀랍게도 줄기세포의 증식하는 잠재성으로 작용할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 에프린 수용체의 적어도 하나의 발현 억제자 및/또는 활성 억제자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기에서 에프린 수용체의 발현 및/또는 활성의 억제자는 서열번호 1과 서열 번호 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 이점을 이주 능력이 차단된 암 줄기세포의 확립 뿐만 아니라 확장의 억제에 의해 더 보여줄 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자를 구성하는 약제학적 구성요소를 제공하며, 여기에는 암 줄기세포가 악성 뇌 암 줄기세포인 것을 말한다.

GBM은 매우 심각한 형태의 뇌 종양에 해당하며, 매우 공격적이고 악성 진행을 가지고 있다.

본 발명의 약제학적 구성요소는 악성 줄기세포 암의 진행을 억제하는 다형성 아교모세포종의 분자적 타겟에 대해 특이적으로 작용하는 이점을 가지고 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자를 구성하는 약제학적 구성요소를 제공하며, 여기에는 에프린 수용체의 발현 및/또는 활성의 억제자가 서열 ID 번호 1과 서열 ID 번호 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되었음을 말한다.

본 발명의 목적을 위해서, 에프린 수용체의 발현과 활성의 각 억제자는 하기와 같은 해당하는 서열번호를 가진다:

서열번호 1은 에프린A1의 아모노산 서열, 아미노산 서열 gi[333596]ref[NP_004419.2] 에프린-A1 아이소폼 전구체 [인간]에 해당한다.

서열번호 2은 에프린A1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 서열 gi[33359681]ref[NM_004428.2] 인간 에프린-A1(EFNA1), 전사체 변이체 1 mRNA에 해당한다;

서열번호 3은 에프린A2의 아미노산 서열, 아미노산 서열 gi[32967311]ref[NP_004422.2] 에프린 형태-A 수용체 2 전구체 [인간]에 해당한다;

서열번호 4는 에프린A2의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 서열 gi[296010835]ref[NM_004431.3] 인간 EPH 수용체 A2 (EPHA2), mRNA에 해당한다.

본 발명의 또다른 측면은 뇌 종양의 치료에서 사용을 위한 에프린 수용체의 발현의 억제자 및/또는 활성의 억제자이다.

본 발명에 의해 제공되는 효과는 뇌 종양의 발생과 진행에 관련된 분자적 타겟에 작용하는 특정한 억제자의 사용에 의한 것이다.

*바람직한 실시형태에서, 본 발명은 뇌 종양의 치료에 사용하기 위하여 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자를 제공하며, 여기에서 에프린 수용체의 발현 및/또는 활성의 억제자는 서열번호 1과 서열번호 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 목적을 위하여, 에프린 수용체 발현과 활성의 각 억제자는 위에서 개시한 대로 상응하는 서열번호를 가진다. 조절되지 않는 에프린 수용체의 과발현은 종양신생과정과 상관관계에 있으며, 종양 성장과 생존에 관계가 있으며, 인간 암 진행에서 혈관신생과 전이에 관련이 있다. 에프린 수용체 발현의 억제와 활성은 그러므로 종양 진행을 차단하는 데 유리하다.

그럼에도 본 발명의 또다른 측면은 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자의 용도이며, 여기에서 뇌 종양은 아교모세포종이고, 또 다른 측면에서, 뇌종양은 다형성 아교모세포종이다.

본 발명의 또다른 측면은 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자의 용도이며, 여기에서 치료는 수술 후 뇌 종양 재발의 요법적 치료이다.

종양 혈관에서 발현된 에프린 수용체는 또한 내인성 리간드인 에프린A1와의 연합을 통해 혈관 신생 및 종양 신혈관화에서 중요한 역할을 한다.

종양에서 그들의 신호전달은 세포골격 가소성, 기질 부착, 및/또는 세포간 부착을 조절함에 의해 내피세포의 이주 및 모세혈관 구조로의 집합을 촉진한다.

본 발명에 따른 에프린 수용체의 발현 억제자 및 활성 억제자는 놀랍게도 혈관신생 및 종양 신혈관화를 차단하고, 수술 후 종양 성장과 재발을 억제한다.

본 발명의 또다른 측면은 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자의 용도이며, 여기에서 치료는 뇌 종양 덩어리의 성장을 저해한다.

본 발명의 또다른 측면은 에프린 수용체 발현 억제자 및/또는 활성 억제자의 이용이며, 여기에서 에프린 수용체의 발현 및/또는 활성의 억제자는 암 줄기세포 증식의 억제자이다.

본 발명의 효과는 에프린 수용체 억제가 암 줄기세포 이주와 증식을 차단한다는 사실에 의해 더 입증될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 추가 효과는 환자-선택적 치료를 제공할 수 있고, 고형 종양 내의 특정 암 줄기세포 집단을 타겟으로 하기 위해 효율적으로 디자인되었으며, 암 줄기세포 풀과 종양신생을 격감시키기 위해 맞춤되었다는 것이다.

본 발명의 특성과 효과는 예시적인 그리고 제한없는 목적을 위해 제공되는 실시예로부터 및 첨부된 도면 1-12로부터, 아래에 보고된 상세한 설명에 분명히 드러나 있다:
도 1 : 은 실시예2에 개시한 것과 같이, 인간 GBM - CSC 세포에서 Eph 수용체의 발현과 에프린 리간드의 발현을 보여준다.
도 1(A) : GBM CSC 세포에서 에프린 수용체(Ephs)와 에프린 리간드(에프린 또는 EFNs)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 RT-PCR에 의해 분석하였다.
도 1(B)(a): GBM-CSC에서 Eph 수용체 발현의 세포형광분광계 분석.
도 1(B)(b): 다양한 GBM-CSC 세포주에서 EphA2 수용체의 향상된 발현을 확인하는 FACS 분석.
도 1(C) : 다양한 배율의 대표적인 GBM-CSC 세포주에서 EphA2 수용체와 에프린 A1 리간드의 발현을 확인하는 면역형광 라벨링의 공초점 이미지
도 2: 실시예3에 게시된 것과 같이 GBM 일차 환자의 종양 조직에서 또한 EphA2의 향상된 발현 수준.
도 2 (a) : 종양의 코어에 있는 동결된 일차 GBM에서 EphA2 단백질 수준의 면역 국소화.
도 2 (b) : 종양의 주변부에 있는 동결된 일차 GBM에서 EphA2 단백질 수준의 면역 국소화.
도 2 (c) GBM-CSCs에서 EphA2 수용체 단백질의 세포형광분광 분석.
도 3: 실시예4에 개시한 것과 같이 GBM - CSCs에서 EphA2 수용체 인산화와 하향조절에 대한 에프린 A1- Fc 또는 EphA2 - Fc 처리의 영향.
도 3(A) (a) : 표시된 농도의 GBM-CSCs에서 EphA2 수용체 발현과 인산화에 대한 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 처리의 용량-반응 곡선과 FACS 분석
도 3(A) (b) : 나타낸 기간에 GBM-CSCs에서 EphA2 수용체 발현과 인산화에 대한 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 처리의 시간-과정 곡선과 FACS 분석
도 3(B) (a) 위 패널 : GBM-CSCs에서 수행한 인간 EphA2에 대한 면역-형광염색은 대부분의 세포가 수용체에 대해 양성임을 확인한다.
도 3(B) (b-c) 위 패널 : 각각 에프린 A1-Fc 1.0㎍/㎖과 5.0㎍/㎖ 후에 GBM-CSCs에 대하여 수행한 인간 Eph2에 대한 면역형광염색은 같은 항원에 대하여 단지 몇 개의 세포만이 표지되었다는 것을 확인한다.
도 3(B) 중간 패널 : 에프린 A1-Fc 처리한 GBM-CSCs에서 EphA2 수용체의 전체 세포용해액에 대한 웨스턴 블럿팅. 세포를 에프린A1-Fc의 부재 시 또는 존재 시에 나타낸 기간 동안 성장시켰다.
도 3(B) 아래 패널: 면역침강시킨 EphA2 수준의 포스포타이로신-특이적 (4G10) 항체로 면역블럿한 전체 세포용해액
도 3(C) : EphA2-Fc 처리 후 GBM-CSCs에서 EphA2 수용체 발현을 보여주는 웨스턴 블럿 분석
도 4 : 실시예 5에서 개시한 것과 같이 시험관 내 에프린A1 - Fc와 EphA2 - Fc 처리는 GBM -암 줄기세포 증식을 감소시킨다.
도 4(A) (a-c) 배양에서 GBM-CSC 세포로에 표시된 농도로 에프린A1-Fc 추가 후의 성장역학 곡선.
도 4(A) (d) 인간 신경 줄기세포에 에프린A1-Fc의 추가 후의 성장역학 곡선.
도 4(A) (e) U87 인간 신경아교종 세포에 에프린A1-Fc의 추가 후의 성장역학 곡선.
도 4(A) (f) 배양에서 GBM-CSC 세포에 ephrinA1-Fc나 EphA2-Fc 첨가 후의 성장역학 곡선.
도 4(B) (a) BrdU 세포 증식 분석에 의해 평가된 세포 증식 지수.
도 4(B) (b) KI67-양성 면역반응 세포의 정량에 의해 평가된 세포 증식 지수.
도 4(C) (a,c) EphA2-Fc 부재 하에 2개의 급성으로 분리된 GBM-CSC 세포주로부터의 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경 이미지.
도 4(C) (b,d) EphA2-Fc 존재 하에 자란 2개의 급성으로 분리된 GBM-CSC 세포주로부터의 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경 이미지.
도 5: 실시예 6에 개시한 것과 같이 가용 리간드와 수용체는 시험관 내에서 GBM 뇌종양 개시 세포집단을 고갈시킨다.
도 5(A) GBM-CSC 세포에서 순차적인 클론원성 분석.
도 5(B) (a,d) 2개의 GBM-CSC 세포주 배양으로부터 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경 사진은 휴지기 대조군의 클론 크기에 대한 에프린A1-Fc의 효과를 보여준다.
도 5(B) (b,e) 에프린A1-Fc 0.5 ㎍/㎖과 함께 자란, 2개의 GBM-CSC 세포주로부터 유래한 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경사진은 클론의 크기에 대한 에프린A1-Fc의 효과를 보여줌.
도 5(B) (c,f) 2개의 GBM-CSC 세포주 배양으로부터 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경 사진은 클론 크기에 대한 1.0 ㎍/㎖의 에프린A1-Fc의 효과를 보여줌.
도 5(C) (a) EphA2 발현 수준이 상이한 두 개의 다른 세포 집단의 분류기-기반 정제는 EphA2 단백질 발현이 GBM-CSCs의 클론의 효율과 직접적으로 상관관계에 있음을 나타냈다. 실험적 디자인의 도식도.
도 5(C) (b) EphA2++과 EphA2-- GBM-CSCs의 클론원성 비율
도 6: 실시예 7에 개시한 것과 같이 측면 집단( SP ) 분석을 보여준다.
5.0 ㎍/㎖의 EphA2-Fc 또는 ephrinA1-Fc으로 48시간 동안 처리한 인간의 휴지하고 있는 GBM-CSCs의 혹스트(Hoechst) 33342 염료 프로파일(2 ㎍/㎖).
도 7: 실시예 8에 개시한 것과 같이 에프린A1 - Fc는 GBM - CSCs에 대한 프로-분화(pro-differentiation) 효과를 이끌어 낸다.
Fc 처리된 대조군 대 에프린 A1-Fc-처리된 GBM-CSCs의 뉴런(ME-PE tubIII), 별아교세포 (ME-FITC GFAP), 및 희소돌기아교세포(ME-PE GalC)의 빈도의 세포형광분광 정량.
도 8: 실시예 10에 개시한 것과 같이 시험관 내에서 가용성 에프린A1 - Fc 또는 EphA2 - Fc에 의한 EphA2의 활성화는 세포 골격의 재구성을 유도하며, GBM - CSC 세포 퍼짐과 이주를 억제한다.
도 8(A) (a, b-d 삽도) 무처리한 GBM-CSC 세포에서 F-액틴 단백질(팔로이딘 염색)의 공초점 분포는 매우 높은 이주적 표현형을 가질 수 있다.
도 8(A) (e-f) F-액틴 단백질의 공초점 분포(팔로이딘 염색)는 에피린A1-Fc 처리 또는 EphA2-Fc 처리 후 각 5분에 바뀐다. 남아있는 세포는 동그랗게 남아있고, 퍼지는 데 실패했다.
도 8(B) 위 패널: 웨스턴 블럿팅 분석은 에피린A1-Fc 자극이 FAK의 빠른 불활성화와 탈인산화를 유도한다는 것을 보여줌. 세포를 에피린A1-Fc의 부재(-) 또는 존재 (+) 시에 나타낸 시간 동안 성장시키며, 그리고 나서 용해시켰다.
도 8(B) (a) 아래 패널: 컬트렉스(cultrex) 침습 분석은 인간의 미세혈관 피부 내피세포(HMVECs)가 막의 낮은 표면에 이주하였고, 고정되었으며, 그리고 염색되었음을 보여줌. HMVECs는 대조군으로서 기본 배지에 있는 챔버의 상부에 플레이트 하였다.
도 8(B) (b,c) HMVECs는 기본 배지에 있는 챔버의 상부에 플레이트 하였고, VEGF (20ng/㎖) 또는 GBM-CSCs 조건화 배지에는 낮은 구획에 플레이트 하였다.
도 8(B) (e,f) HMVECs는 EphA2-Fc의 존재 시에 챔버의 상부에 플레이트 하였고(5.0 ㎍/㎖), VEGF (20 ng/㎖) 또는 GBM-CSCs 조건화 배지에는 낮은 구획에 플레이트 하였다.
도 8(B) (d) 상부 측에서의 대조군으로서 대조 인간 IgG는 낮은 구획에서 VEGF에 대한 반응으로 세포 이주에 영향을 미치지 않았다.
도 8(C) (a) 공초점 면역-형광현미경은 인산화된 ERK1/2에 대하여 Fc-처리된 대조군 GBM-CSCs의 양성을 보여줌.
도 8(C) (b) MEK1 활성화의 화학적 억제자(UO126) 처치 후 GBM-CSCs에서 인산화된 ERK1/2의 공초점 면역-분포
도 8(C) (c-d) 공초점 면역-형광은 GBM-CSCs에서 각각 EphA2-Fc 또는 ephrinA1-Fc 추가 6시간 후, 인산화된 ERK1/2의 양성의 빈도를 보여줌.
도 8(C) 아래 패널: 인산화된 ERK1/2를 이용한, 균등화된 세포 용해액의 웨스턴 블럿팅 분석으로 GBM-CSCs에서 증가하는 에프린A1-Fc의 농도가 ERK1/2를 향상시키는 것을 확인하였다.
도 9: 실시예 11에 개시한 것과 같이 rhBMP4로 GBM - CSCs를 처리하면 에프린A1 -Fc의 억제 효과를 향상시킨다.
도 9 (a) mRNA의 분리 전 48시간 동안 표시된 농도에서 대조군-Fc 또는 rhBMP4를 가진 GBM-CSC 세포주에서 EphA2의 평균 수준의 측정을 위한 특정한 프라이머를 이용한 RT-PCR 분석
도 9 (b) rhBMP4의 부재 또는 존재 시에 에프린A1과 함께 성장한 GBM-CSCs의 성장역학곡선. 성장곡선은 GBM-CSC세포주 중의 하나를 나타낸다.
도 10. 실시예 12에 개시한 것과 같이 이종이식 모델에서 에프린A1 - Fc와 EphA2-Fc 처리가 생체 내 종양 성장을 억제한다.
도 10 (a) 세포 주입 후 35일에 다른 처리와 관련된 종양 형태학의 비교
도 10 (b) 상대적인 종양 크기 측정. 그래프는 6마리의 마우스로 구성된 4개 그룹에서의 평균±s.e.m.으로 나타낸다.
도 11: 실시예 13에 개시한 것과 같이 가용성 리간드 또는 수용체에 의한 EphA2의 동원은 인간 GBM의 정위치 모델에서 GBM - CSCs의 종양생성을 억제한다.
도 11(A) luc-GBM-CSCs 종양 이종이식의 생물 발광 모니터는 종양으로부터 해당하는 신호가 증가함을 보여줌.
도 11(B) 휴지기 및 EphA2-Fc 또는 에프린A1-Fc로 미리 처리한 GBM-CSCS의 두개골 내 주입 후 생체 내에서 검출된 종양 성장과 종양크기의 차이.
도 11(C) (a) 정위치 이식 후 6주된, 무처리된 luc-GBM-CSCs로부터 유래한 종양을 보여주는 공초점 이미지.
도 11(C) (b-c) 정위치 이식 후 6주된, 각각 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 처리된 luc-GBM-CSCs로부터 유래한 종양을 보여주는 공초점 이미지.
도 12: 실시예 14에 개시한 것과 같이 인간 GBM의 같은 자리 이식 모델에서 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 투여는 확립된 일차 종양 성장을 억제한다. 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc로 14일 동안 후처리한 luc-GBM-CSCs 종양 이종이식의 생물발광 모니터.

실시예

실시예1.

종양 샘플로부터 다형성 아교모세포종-유래된 암 줄기세포(GBM-CSCs)의 분리

종양 시료는 환자의 수술적 절제 후 신경 수술 유닛으로부터 얻었다.

성인 인간 아교모세포종 조직 샘플을 얻었고, 세계건강기구 지침에 따라 분류하였다. 각 신생물 조직을 2개의 조각으로 나누었다. 첫번째 것은 조직 병리학적 분석에 사용하였다: 자세하게는, 조직을 파라핀 포매와 면역조직화학을 위해 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 담그거나, 공초점 현미경을 위한 부유하는 절편을 얻기 위해 40%로 시작하는 감소하는 농도의 수크로즈 용액에 넣었다.

2번째 부분은 GBM 암 줄기세포 세포주를 얻기 위해 사용하였다. 조직을 1mm³ 부분으로 잘랐고, 그리고 나서 Gritti A, 1996과 Galli R, 2004(6. and 5.)와 같이 기계적으로 및 효소적으로 다음과 같이 갈아 부수었다: 조각을 6웰-플레이트 내의 0.8 mg/㎖의 파파인(20U/㎖, Worthinghton), 0.2 mg/㎖ L-시스테인(시그마), 0.2 mg/㎖ EDTA (시그마)이 들어 있는 EBSS 용액 4㎖로 옮겼고, 37℃로 45분간 인큐베이션하였다. 조직 절편을 불로-다듬은 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 갈아 부수었다. 세포를 원심분리에 의해 모았고 단일 세포를 25 cm² 조직 배양 플라스크(Nunc)에 8,000/cm²의 밀도로 소위 말하는 완전 배지인 DMEM/F12 (1:1 v/v Gibco) 혈청없는 배지에 플레이트하였다. 완전 배지는 20 ng/㎖의 피부성장인자(EGF, Peprotech)와 섬유아세포 성장인자 (FGF2, Peprotech)의 존재 하에 2 mM L-글루타민, 0.6% 글루코스, 9.6 ㎍/㎖ 푸트레신, 6.3 ng/㎖ 프로게스테론, 5.2 ng/㎖ 소듐 셀레니트, 0.025 mg/㎖ 인슐린, 0.1 mg/㎖ 트랜스퍼린(소듐 염, grade II, 시그마)을 포함한다. 새로운 배지를 매 4일마다 첨가하였다.

각 플라스크에서 생성된 일차 스피어의 숫자를 플레이팅 후 10-20일에 계수하였다. 스피어는 그리고 나서 192xg로 10분 동안 원심분리에 의해 15 ㎖ 튜브(BD)에 모았다. 일차 스피어는 그리고 나서 기계적으로 단일-세포 현탁액으로 분리시켜, 배양을 위해 재플레이트 하였다. 며칠이 지남에 따라(2-7) 각 세포주에 전형적인 새로운 스피어가 형성되었으며 더 많은 계대를 수행할 수 있었다.

이러한 세포주를 아교모세포종 유래 암 줄기세포(또는 종양 개시 세포) (GBM-CSCs)의 이름으로 확인하였다.

성공적으로 확립된 세포주로부터의 GBM-CSC의 일부분은 매번 순차적으로 4분의 3 계대 순서에 10% DMSO (시그마)를 추가한 완전 배지에서 침강시켜 얼렸으며 저장하였다. 나머지는 더 확대시켰다.

결과 : 뇌종양, 특히 아교모세포종은, 종양-개시 능력이 부여되고 신경 줄기세포(GBM-CSCs)의 기능적인 특징으로 정의되는 세포를 포함한다. 따라서, 정상 신경신생형성의 조절적 기전의 연구는 GBM-CSCs의 새로운 억제자의 확인으로 이어질 수 있고, 뇌 종양에 대한 더 특이적인 치료적 전략의 발달로 이어질 수 있다.

실시예 2.

GBM - CSC 세포주에서 RT- PCR과 세포형광계측 분석에 의한 Eph 수용체 발현의 결정

조절되지 않은 또는 과발현된 Eph 수용체는 트랜스폼화, 종양 성장과 생존으로 몰아갈 수 있다. 인간 GBM 시료 및 그 안에 함유된 GBM-CSCs에서 에프린의 발현과 조절 및 그들의 짝 수용체를 급성으로 분리하거나 또는 연속적으로 계대배양하여 연구하였다.

RNA 추출과 cDNA 준비:

전체 RNA를 : 아교모세포종으로 진단된 다른 환자들로부터 분리한 GBM-CSC 세포주, 막 채취한 일차 GBM 시료, 비침습성 U87 세포(상업적으로 이용 가능한 인간 별아교세포종 세포주), 및 정상 인간 신경줄기 세포(HNSCs, 실험실에서 이용 가능한, 13.)로부터 RNeasy 미니 키트(Qiagen)에 의해 추출하였다(b).

제조회사에 의해 제공된 지침에 따라서 Superscript RNase H- 역전사효소(Gibco)를 사용하여 cDNA를 얻었다. cDNA 합성을 위해 전체 RNA 1 ㎍을 oligo-dT로 프라임화 하였다.

PCR 증폭

cDNA를 EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6 수용체 및 EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3 리간드 확인을 위해 디자인된 PCR 프라이머로 각각 개별적으로 증폭하였다.

템플레이트로서 사용된 모든 cDNA는 다음의 프라이머 쌍을 사용한 22번의 증폭동안의 β-액틴 RT-PCR을 통해 이전에 정규화하였다: β-ActinF1 (5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' 및 β-ActinR1 (5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3'. 610 bp의 PCR 생성물을 그리고 나서 2% 아가로스 겔에서 러닝시켰고, 인간 뇌 전체 RNA(Ambion)의 1 ㎍으로부터 유래한 cDNA 로부터 얻은 같은 PCR 생성물에 대하여 신호 강도를 비교하였다. 특이적인 프라이머를 디자인하였다:

EphA1 전방: 5'- GCC TGA CAC CAC ATA CAT CG - 3'

역방: 5' ATA TGC GGG TGG CTA AAC TG - 3'

EphA2 전방: 5' AAA GCC GGC TAC ACA GAG AA - 3'

역방: 5' TTG GAC AAC TCC CAG TAG GG - 3'

EphA3 전방: 5' GAG TTT GCC AAG GAA TTG GA - 3'

역방: 5' TTG GGA TCT TCC CTC CTC TT - 3'

EphA4 전방: 5'- ACC AAG CAG TGC GAG AGT TT - 3'

역방: 5'- CTC CCC GTA CGA CAT CAC TT - 3'

EphA5 전방: 5'- CAA GCC TAA TAT GGC GGT GT - 3'

역방: 5'- GTG AAC TGC CCA TCG TTT TT - 3'

EphA7 전방: 5'- ATC ATT GGG AGA AGG CAC TG - 3'

역방: 5'- ATG GAC AAC ATT TGG GTG GT - 3'

EphA8 전방: 5'- GAG AAC GGC TCT CTG GAC AC - 3'

역방 5'- CCT CCA CAG AGC TGA TGA CA - 3'

EphA10 전방: 5'- CGA CTA ATG CTC GAC TGC TG - 3'

역방: 5'- TGA TCA AGC AAC TGC CAC TC - 3'

EphB1 전방: 5'- CAG GGT ACT CGG AGA AGC AG - 3'

역방: 5'- CCA GCA TGA GCT GGT GTA GA - 3'

EphB2 전방: 5'- AGT TCG GCC AAA TTG TCA AC - 3'

역방: 5'- AGG CAG GTG AAT GTC AAA CC - 3'

EphB3 전방: 5'- AGC AAC CTG GTC TGC AAA GT - 3'

역방: 5'- GGA TGA GCT TGT CCA GGG TA - 3'

EphB4 전방: 5'- GAG AGC TGT GTG GCA ATC AA - 3'

역방: 5'- TGT AGG TGG GAT CGG AAG AG - 3'

EphB6 전방: 5'- TCA TTG CAC ATG GAA AGC AT - 3'

역방: 5'- GGG TGA GTC CAG ACA AGG AA - 3'

EFNA1 전방: 5'- GGT GAC TGT CAG TGG CAA AA - 3'

역방: 5'- AGT GGA AGG AGC AGC ACAT - 3'

EFNA2 전방: 5'- ATC TAC TGC CCG CAC TAT GG - 3'

역방: 5'- AGG CGT GGC AGA GAT GTA GT - 3'

EFNA3 전방: 5'- CAT GCG GTG TAC TGG AAC AG - 3'

역방: 5'- GTG GAA CTC GTA GCC CAG AG - 3'

EFNA4 전방: 5'- ACA TTG TCT GCC CCC ACT AC - 3'

역방: 5'- TGG GCT GAC TCA GAC TTC CT - 3'

EFNA5 전방: 5'- AGG ACT CCG TCC CAG AAG AT - 3'

역방: 5'- ATC TGG GAT TGC AGA GGA GA - 3'

EFNB1 전방: 5'- GCC TGG AGT TCA AGA AGC AC - 3'

역방: 5'- GAA CAA TGC CAC CTT GGA GT - 3'

EFNB2 전방: 5'- GTG CCA AAC CAG ACC AAG AT - 3'

역방: 5'- GAT GTT GTT CCC CGA ATG TC - 3'

EFNB3 전방: 5'- AGG CAG AGG GTG GTT ATG TG - 3'

역방: 5'- TCT CTT TCC ATG GGC ATT TC - 3'

세포주를 이용한 유동 세포분석:

다양한 GBM-CSC 세포주에서 Eph 수용체 발현을 결정하기 위하여, 세포 준비물(각 튜브 당 500.000개의 세포)을 원심분리 하였고, 0.2㎖ 완전배지에 현탁하였다. 세포를 암시야 4℃에서 일차항체에 30분 동안 노출시켰다. U87 세포를 종양세포에 대한 참고 대조군으로 및 HNSCs를 신경 줄기세포에 대한 참고 대조군으로 하였다.

세포 내 염색을 위해서, 세포 준비물(각 튜브 당 500,000개의 세포)을 교번적으로 0.5 ㎖의 Cytofix/Cytoperm 용액(BD Biosciences)으로 실온에서 30분 동안 투과시켰다. 세포를 2 ㎖의 BD Perm/Wash 1X (BD)도 세척하였고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 원심 분리 후, 그들을 적절한 일차 항체 혼합물을 포함한 0.2 ㎖의 BD Perm/Wash solution 1X (BD)로 현탁시켰다..

사용된 일차 항체는 다음과 같다 :

항-EphA1 염소 다중클론 항체(0.3㎍, R&D)

항- EphA2 염소 다중클론 항체(0.5㎍, R&D)

항-EphA3 염소 다중클론 항체(0.3㎍, Gene Tex)

항-EphA5 토끼 다중클론 항체(0.5㎍, Abcam)

항-EphA7 토끼 다중클론 항체(0.5㎍, Abcam)

항-EphA8 염소 다중클론 항체(0.5㎍, Santa Cruz)

항-EphB1 토끼 다중클론 항체(0.5㎍, Abcam)

항-EphB2 토끼 다중클론 항체(0.5㎍, Abcam)

항-EphB6 토끼 다중클론 항체(0.5㎍, Santa Cruz)

광범위한 세척 후 0.3 ㎖의 적절한 이차항체를 추가하였다:

당나귀 항-염소 Ig PE-표지된 항체 (0.2㎍, Jackson Immunoresearch)

염소 항-토끼 Ig FITC-표지된 항체 (0.5㎍, Jackson Immunoresearch)

각 샘플을 암시야에서 4℃로 30분 동안 인큐베이션하였다. 2번의 세척 후 세포를 0.5㎖의 완전배지에 재현탁하였고, 유동세포분석에 의해 분석하였다. 자동형광법과 아이소타입 대조군을 모든 이러한 분석에 대하여 일상적으로 작동시켰다. 모든 상기 분석에 대하여, 써밋 4.3 소프트웨어를 이용하여 유동분석기 사이안(쿨터)에 의해 분석을 수행하였다. 배경 형광은 특정 일차 항체를 특이적인 아이소타입 대조군으로 바꿈으로서 평가하였다. 시험한 각 조건에 대한 자동형광의 측정을 또한 일상적으로 수행하였다.

결과: 에프린 수용체와 그들의 짝 리간드 과발현은 인간 암 진행의 많은 형태와 관련이 있을 수 있다. 도1A에 보여 준 바와 같이, 에프린 수용체(13개 분석함)와 리간드(8개 분석함) mRNA 전사체의 대부분은 종래의 PCR에 의해 얻을 수 있다. 모든 cDNA는 이전에 β-액틴을 통하여 정규화 하였다. 인간 별아교세포종 세포주(U87)를 종양세포에 대한 참고로 쓰고, 인간 신경 줄기세포(HNSCs)를 정상적인 신경 줄기세포에 대한 참고로 썼다. 흥미롭게도, 정상과 암 줄기세포와 반대로, 에프린A1 리간드는 U87세포에서 mRNA 전사체와 단백질 수준 모두에서 회수될 수 없다.

놀랍게도, 도 1B(a)에 보여준 것과 같이, GBM-CSCs에서 에프린 수용체의 발현을 형광발광계측 분석에 의해 단백질 수준에서 확인하였다. 게다가, 도1B (b)에 보고한 것과 같이, EphA2는 GBM-유래한 암 줄기세포 세포주(n=6)에서 넓게 상승조절 되었다. 히스토그램은 3번의 별도 분석의 평균 ± s.e.m.을 보여준다. 대표적인 GBM-CSC 세포주에서 EphA2 수용체와 에프린A1 리간드 모두의 넓게 퍼진 발현의 예를 도 1C에서도 보여준다. 면역형광 표지의 공초점 이미지는 종양세포에서 EphA2 수용체(a 및 그의 국소적 고배율 b-c) 및 에프린A1 리간드(d 및 그의 국소적 고배율 e)의 약한 양성 염색의 존재를 확인하고 알아본다. 스케일 바, 40㎛ (a,d); 20㎛ (b,c); 13㎛ (e).

실시예 3.

일차 GBM 조직에서 EphA2 수용체 발현의 결정.

GBM-CSC 세포주에서 EphA2의 향상된 수준을 얻을 수 있다는 것의 입증 후에, 막 채취한 종양조직에서도 면역반응성 EphA2 존재를 확인하였으며, 그러므로 수용체가 단지 시험관 내 장기 배양의 결과물로 발달할 수 있다는 가능성을 제외시켰다.

일차 조직을 이용한 면역조직화학:

면역조직화학 염색을 위해, 일차 GBM 종양 조직을 24시간 동안 파라포름알데하이드로 후고정하였다. 조직을 그리고나서 4℃에서 PBS에 들어 있는 10%-20% 및 30% 수크로스 용액에 넣어 동결보호 하였고, 2:1(v/v) 20% 수크로스/조직-텍 OCT 포매 합성 혼합물에서 밤새 포매 과정을 거쳤다. 동결절편에서 10개의 마이크로미터 두께의 연속 절편을 잘랐고 이중 면역 표지를 위해 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드에 붙였다. 간단히 말하면, 조직을 공기 중에 건조시켰고 0.005% BSA와 0.1% 트리톤을 포함하는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.6)에서 세척하였고, 4℃에서 밤새 일차항체로 인큐베이션하였다(13.).

조직절편을 염소 항-인간 EphA2(1:50, R&D) 또는 단일클론 마우스 IgG1 항-인간 EphA2 클론 D7(1:100, 시그마)으로 염색하였다.

일차 조직을 이용한 유동 세포 분석법

상기한 효소적 및 기계적 소화 후, 일차 종양 시료로부터 분리한 세포 현탁액을 EphA2 수용체 발현에 대한 FACS 분석을 받게 했다. 간단히 말하면, GBM 조직 분리로부터 유래한 세포를 온전한 유핵세포를 확인하기 위하여 LDS 751 (10 ng/㎖, Molecular Probes)로 실온에서 15분간 염색했다. 세포를 유동 세포 분석기(FACSAria, BD Biosciences)로 분석하였고, 도트 플럿 FSC 대 SSC에서 백 게이팅 기술(LDS751 양성 세포)을 사용하여 온전한 유핵세포를 확인하는 부위(P1)를 생성하였다. 온전한 유핵 및 생존 세포를 확인하기 위하여, 7AAD 음성 세포를 포함하는 부위에 부위(P1)을 추가함으로써 결합된 게이트를 생성하였다. 그리고나서, GBM 조직 분리로부터 유래한 CSC를 양성 및 죽은 세포 모두를 확인하기 위하여 염소 항-인간 EphA2(0.5 ㎍, R&D) 및 7AAD(5㎍/㎖, Coulter)로 인큐베이션 하였다.

결과: 아교모세포종 환자로부터의 일차 아교모세포종에서 및 그들에 인접하는 "정상' (말초의) 대응부에서 검사하기 위하여 EphA2 수용체의 분포 및 검사하기 위하여 면역조직화학을 사용하였다. 도2의 위쪽 패널에서 보여준 결과는 덜 악성인 말초(b) (적어도 핵심부에서 2cm 떨어짐)에 비하여 종양의 핵심부(a)에서 더 증가된 EphA2 신호를 분명하게 드러냈다. 스케일 바, 50㎛. 같은 도의 아래 패널에 보여준 바와 같이, EphA2 수용체 단백질을 급성으로 분리한 GBM-SCSs에서도 검출하였고, 세포형광계측 분석에 의해 환자의 종양 내에서 구성적으로 회수할 수 있었다 (n=4) (화살표).

실시예 4.

인간 GBM - CSC에서 EphA2 발현과 인산화에 대한 가용성 에프린A1 - Fc(R&D)과 가용성 EphA2-Fc 수용체(R&D)의 효과.

리간드-유도된 수용체 분해로 인하여, EphA2 발현의 하향조절이 일어날 수 있고, 이는 세포외기질(ECM)에의 증가된 세포 부착, 감소된 세포 이주, 및 악성 성장의 억제로 이어진다. 따라서, GBM-CSC에서 이 수용체의 과발현은 악성 양상에 관여할 수 있고 에프린A1-Fc에 의한 그의 참여는 종양 원성에 반대로 작용할 수 있다. 이 관점에서, GBM-CSC에서 종양원성 특성에 대한 EphA2 발현 또는 활성의 강요된 하향-조절의 효과를 결정하였다. EphA2 수용체를 그 발현을 감소시키기 위하여 관여시켰으며 어떻게 이것이 이러한 세포의 전체 기능적 특성을 조절하는 지를 시험관 내와 생체 내에서 모두 결정하였다. EphA2는 가용성 에프린A1-Fc인 마우스 에프린A1-인간 IgG1 Fc 키메라 단백질을 이용하여 관여시켰다. 게다가, EphA2는 Eph 수용체 중에서 독특한 것으로 보이는데, 그의 키나아제 활성이 전적으로 리간드 결합에 의존적이지 않을 수 있다는 점에서 그렇다. 이러한 EphA2의 리간드-비의존적 효과는 악성 진행에 중요한 프로세스에 영향을 줄 때 중요하다.

내인성 EphA2 인산화를 막는 효과는 이용 가능한 리간드에 경쟁적으로 결합하는 EphA2-Fc 수용체 - 수용체의 세포 외 리간드-결합 도메인이 인간 IgG1의 Fc 부분에 결합하는 키메라 단백질을 이용하여 대안적으로 분석하였다.

세포형광분광계 분석:

투여량-반응 분석을 위하여, 기계적인 분리 후 곧바로 에프린A1-Fc의 존재 하에서 세포를 24시간 동안 파종하였다(0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 ㎍/㎖). 시간-경과 분석을 위하여, 세포를 에프린A1-Fc(1.0 ㎍/㎖)와 6, 24, 48, 72시간 동안 인큐베이션 하였다.

*세포 준비물(500,000세포/샘플)을 원심분리하였고 0.2㎖ 완전배지에서 재현탁하였다. 그리고 나서, 그들을 항-EphA2 염소 다중클론 항체(0.5㎍, R&D)에 암시야에서 4℃로 30분 동안 노출시켰다. 광범위한 세척 후, 당나귀 항-염소 Ig FITC-표지된 항체 (0.56㎍/샘플, Jackson Immunoresearch)를 첨가하였고, 각 튜브를 암시야에서 4℃로 30분 동안 인큐베이션시켰다. 2번 세척 후 세포를 0.5㎖ 완전배지에서 현탁하였고 유동세포분석법에 의해 분석하였다. 자동형광 및 아이소타입 대조군을 모든 이러한 분석에 일반적으로 시행하였다.

면역세포화학:

세포를 2.5x10⁴ 세포/cm²의 밀도로 대조군으로서 완전배지에 또는 에프린A1-Fc의 존재 하에(0.5, 1.0 ㎍/㎖) 컬트렉스(Cultrex)-코팅된 12㎜직경의 유리 커버슬립(Trevigen)위에 24시간 동안 파종하였다. 세포를 세척하였고, PBS에 있는 4% 파라포름알데하이드로 pH 7.4로 고정하였고, 면역염색을 수행하였다. 커버슬립을 10% 정상 염소 혈청(NGS) 또는 10% 태아 소 혈청(FBS), 0.3% TritonX-100, 및 적절한 일차 항체 또는 항혈청(토끼 항-인간 에프린A1, 1:50 Abcam, 염소 항-인간 EphA2, 1:50 R&D)을 포함하는 PBS에서 4℃로 밤새도록 인큐베이션하였다. 대안적 방법으로는, 세포를 마우스 단일클론 IgG1 EphA2 클론 D7 (1:100, 시그마)로 면역염색 하였다.

PBS로 완전 세척을 한 후 세포를 적절한 이차 항체에 암시야로 실온에서 45분 동안 반응시켰다.

시아닌 Cy2 또는 알렉사-플로오 488-접합된 염소 항 토끼 (1:200, Jackson Immunoresearch, 1:2000, Invitrogen)

시아닌 Cy3 또는 알렉사-플로오 546-접합된 당나귀 항 염소 (1:500, Jackson Immunoresearch, 1:2000, Invitrogen)

시아닌 Cy3-접합된 염소 항 마우스 (1:800, Jackson Immunoresearch)

세척 이후, 세포핵을 실온에서 10분동안 4,6-다이아미딘-2-인돌-2-페닐인돌 다이하이드로 클로라이드, DPI(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydro-chloride, DAPI, 50 g/㎖ in PBS, 시그마)로 대조염색하였고, PBS에 3번 세척, 증류수에 한 번 세척하였으며 플루오세이브(칼바이오캠)으로 유리 슬라이드를 덮었다.

일차 및 이차 항체에 대한 적절한 대조군은 비특이적인 염색 이거나 항체 교차-반응을 보여준다.

이미지는 Zeiss Axioplan2 Microscope와 Leica DMIRE2 공초점 현미경으로 분석하였다.

웨스턴 블럿:

분리 후 바로 세포를 에프린A1-Fc 5.0㎍/㎖ 또는 EphA2-Fc 5.0㎍/㎖의 존재 하에서 완전배지에 넣어 10, 30, 60분, 24시간 동안 플레이팅 하였다. 세포를 또한 컬트렉스-코팅된(Trevigen) 플라스크에 또한 플레이트하였고, EGF/EGF2를 제거하고 7-10일 동안 백혈병 억제 인자(LIF 10 ng/㎖)를 첨가하여, 그들의 분화를 유도하였다. 세포를 그리고나서 현탁하였고, 원심분리하였으며, 세포용해하였다. 세포용해액 버퍼는 1% 프로테아제 억제제 칵테일(시그마)과 10% 포스파타제 억제제 칵테일(Roche)이 첨가되어, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% TritonX-100로 구성되어 있다. 세포를 모았고 PBS에서 세척하였으며, 14,460xg에서 원심분리하였다. 단백질 정량을 일련의 알부민 표준을 이용해 DC 단백질 분석(Bio-Rad)에 의해 수행하였다. 표준 프로토콜에 따라서, 겔 로딩 버퍼를 70㎍의 각 용해액에 첨가하였고, 단백질을 10% 폴리아크릴라마이드 겔에 녹였으며, 하이본드 ECL 니크로셀룰로오스 막 (GE)에 전달하였다. 막을 트리스-완충된 식염수(TBS)-T (TBS 더하기 0.02% Tween20)와 5% 밀크로 차단하였으며, 다음 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다.

IgG 염소 항-인간 EphA2 (1:750, R&D)

IgG1 마우스 항-인간 EphA2 clone D7 (1:500, 시그마)

이 과정은 홀스레디쉬 페록시다아제(HRP)-접합된 이차 항체로 30분 동안 (1:10.000, Bio-Rad) 인큐베이션하였다.

당나귀 항-염소 IgG(1:5000, Promega)

토끼 항-마우스 IgG (1:10,000, GE)

제조회사의 지시에 따라 향상된 케미-루미너센스(luminescence) 시스템을 사용하여 페록시다제 활성을 검출하였다. 로딩 대조군으로서, 마우스 항-글리세르알데하이드-3-인산 디하이드로제나아제 (GADPH) 항체를 사용하였다 (1:500, Zymed).

면역침강:

세포를 에프린A1 (1.0, 5.0 ㎍/㎖)의 부재 또는 존재 하 또는 마우스 단일항체 IgG1 아이소타입 대조군(R&D)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 자라게 했으며, 그리고 나서 위의 설명과 같이 파쇄하였다. EphA2 인산화의 수준을 결정하기 위하여 100㎍의 전체 단백질을 포함한 세포 용해액을 마우스 항-인간 Eck/EphA2와 +4℃에서 부드럽게 돌리면서 밤새 인큐베이션 하였다 (1:500, Upstate). 제조회사의 지시에 따라, 비드(Dynal Invitrogen bead separation)를 용해액 버퍼로 광범위하게 세척하였고, 면역 복합체를 2X LDS 샘플 버퍼(인비트로젠)로 용출하였으며, 끓였고, 간단하게 원심분리 하였다. 단백질을 녹였고, 마우스 4G10 백금 항-인간 포스포타이로신을 이용해 웨스턴 블럿에 의해 검출하였다. (1:1000, Upstate)

결과: 감소된 리간드-유도된 수용체의 내부화 및 분해는 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있으며, EphA2의 과발현에 기여한다. 에프린A1-Fc에 대한 이중 잠재성의 종양-억제적 역할은 수용체 인산화 뿐만 아니라 이어지는 수용체 하향-조절의 결과로서 발암 신호의 억압에 관여한다.

도 3A에서 세포형광분광 계측 분석은 에프린A1-Fc가 인간 GBM-CSC에서 EphA2 수용체 하향-조절을 통해 발암 신호를 억제한다는 것을 분명하게 보여준다. 에프린A1-Fc의 억제 효과는 용량 또는 시간 의존적이다. 값은 2번 이상의 측정으로부터 평균 ±s.e.m.을 나타낸다.

*게다가, 도 3B의 위쪽 패널에서 보고한 것과 같이, GBM-CSC에서 수행한 인간 EphA2에 대한 면역-형광은 대부분의 세포가 수용체에 대해 양성(a)이며, 반면에 에프린A1-Fc 1.0㎍/㎖ (b) 및 5.0㎍/㎖ (c) 후에는 단지 일부의 세포만이 같은 항원으로 표지 된다는 것을 확인한다. 스케일 바 20㎛. 같은 도의 중간 패널에서는, 전체 세포 용해액에 대한 웨스턴 블럿팅에 의한 단백질 수준에서 에프린A1-F1 처리한 GBM-CSC에서 EphA2 수용체의 감소된 발현을 확인하였다. 놀랍게도, 블럿은 에프린A1-Fc 중개 EphA2 수용체의 동원이 GBM-CSC에서 농도/시간 의존적 양상으로 EphA2의 발현을 현저하게 줄게 하였다는 것을 확인한다. 표시된 시간에서 세포는 에프린A1-Fc의 부재(-) 또는 존재 하(+)에 자랐다. 정량한 면역반응성이 있는 단백질의 수준은 60분 내에 완벽히 제거되었다. 이는 관련성이 있는 리간드에 의한 EphA2의 관여가 수용체의 빠른 배재와 관련이 있는 것을 제안한다. 인간 섬유아세포(HF) 세포주는 EphA2 항체에 대한 음성 대조군. GAPDH를 용해액의 똑같은 로딩에 대한 대조군으로서 포함시켰다. 보여 준 결과는 3개의 다른 GBM-CSC 세포주의 단일의 대표적인 것이다.

에프린A1-Fc는 GBM-CSC에서 EphA2 수용체 인산화와 분해를 촉발한다. 면역침강에 의해 평가 했기 때문에, 에프린A1-Fc로의 처리(도 3B, 아래 패널)에 대하여 타이로신-인산화 EphA2의 수준은 GBM-CSC 세포에서 농도에 대해 극적으로 증가하였으며, 이는 에프린A1-중개 수용체 활성의 표식이다. 분리 후 곧 세포를 증가하는 농도의 에프린A1-Fc 또는 Fc 아이소토프 대조군으로 48시간 동안 처리하였다. 면역침강된 EphA2 수준의 포스포타이로신-특이적 (4G10) 항체를 이용한 전체 세포 용해액 면역 블럿팅은 에프린A1-Fc에 의해 EphA2 활성화와 인산화가 증가하는 것을 확인한다.

결과적으로, 도 3C에 보여준 것과 같이, EphA2-Fc 처리는 GBM-CSC에서 EphA2 단백질 발현을 하향-조절하기보다는 내재적인 EphA2 인산화를 차단할 수 있다. 표시된 기간에 휴지기의 GBM-CSC와 EphA2-Fc로 활성화된 GBM-CSC (5.0㎍/㎖)는 웨스턴 블럿팅 분석을 받았다.

분화된 GBM-CSC에서 어떠한 EphA2 수용체 발현 수준도 검출되지 않았으며, 따라서 이는 일탈적인 증식과 이주와 같은 GBM 암 줄기세포의 발암성 행동의 조절에서의 추정되는 연관을 나타냄을 주목한다. 제시된 면역 블롯은 다른 시간에서 각각 분석된 3번의 블럿 중 대표적인 것이다.

실시예 5.

시험관 내 인간 GBM - CSC 증식에 대한 에프린A1 - Fc 또는 EphA2 - Fc 수용체의 효과.

EphA2 하향-조절/인산화 강요 또는 그의 짝 리간드와의 경쟁적 결합이 GBM-CSC의 종양신생 특성에 영향을 미칠 수 있는 지 여부를 결정하기 위하여, 분열의 전체 대칭과 같은, 첫번째 중요한 줄기세포 파라미터에 대한 에프린A1-Fc와 EphA2-Fc의 세포분열 증식을 억제하는 효과를 분석하였다. 성장의 활성 상태에 있는 GBM-CSC 세포를 가용성 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc에 노출시켰고, 역동성으로부터의 일탈을 평가하였다.

성장곡선:

GBM-CSC 세포 증식 지표를 분석하기 위하여, 뉴로스피어 현탁액을 15㎖ 튜브(BD)에 ?グ弱?, 192xg로 10분간 원심분리하였으며, 기계적으로 단일 세포 현탁액을 분리하였다. 트리판 블루 배제에 의해 세포를 계수하였고, 8x10³ cells/cm² 가시성 세포를 마우스 단일클론 IgG1 아이소타입 대조군(R&D), 에프린A1(0.5, 1.0, 2.0, 3.0 or 5.0 ㎍/㎖), 또는 EphA2-Fc(5.0 ㎍/㎖)의 존재 하에 플레이트 하였다. 다음 계대 단계(0 DIV)에서 얻은 전체 세포 숫자를 플롯팅하였다. 각 배양 계대(각 4-6일)에서 단일-세포 현탁액을 획득하였고 가시성 세포의 전체 숫자를 트리판 블루 배제에 의해 측정하였다. 같은 조건 하에서 8x10³ 볼 수 있는 세포/cm² 를 재플레이트 하였다. 이는 다음의 동적인 파라미터의 정의로 이어지며((Gritti A, 2001)와 같은, 성장곡선의 기울기) (7.), 이는 위에 언급한 CSCs-HNSC 확장율을 결정하는 재조합 단백질 역할의 표시를 제공한다. U87 세포는 종양세포에 대한 참고 대조군으로, HNSCs는 신경 줄기세포에 대한 참고 대조군.

에프린A1-Fc와 EphA2-Fc 처리의 결과가 진짜 줄기세포에 대한 것인지 여부를 평가하기 위하여, EphA2-Fc(5.0 ㎍/㎖)의 존재 하에 일차 종양 시료로부터 분리한 후 (상기 설명한 대로) 곧 GBM-CSC의 계대배양에 의해, 급성으로 분리된 세포로 증식 분석을 수행하였다.

KI67 면역반응성:

KI67 분석을 이용한 증식 지표의 정의에 의해 조사를 보충하였다(1.). 간단히 말하면, EGF/FGF2의 존재 하에 세포를 컬텍스-코팅된(Trevigen) 유리 커버슬립에 파종했으며, 에프린A1-Fc (0.5, 1.0 ㎍/㎖)에 24시간 동안 노출시켰다. 증식세포를 IgG 토끼 다중클론 항-KI67(1:1000, Novocastra)를 이용해 간접적인 면역세포화학에 의해 정량하였다. Cy2 염소 항-토끼 이차 항체를 상기 설명한 대로 사용하였다(1:200, Jackson Immunoresearch). 각 필드에서 세포의 전체 숫자를 4,6-다이아미딘-2-페닐인돌 다이-하이드로-클로라이드(4,6-diamidine-2-phenylindole di-hydro-chloride, DAPI, 시그마; PBS에 50 g/㎖)에 의해 세포핵을 10분간 실온에서 대조 염색해 결정하였다.

비알디유(BrdU) 분석:

증식은 또한 제조회사에서 제공한 지시사항에 따라(Roche) 또한 BrdU 비색 분석 키트에 의해 또한 추적관찰하였다. 간단히 말하면, GBM-CSC를 96-웰 마이크로플레이트에 5000 세포/웰의 밀도로 플레이트 하였다. 세포를 에프린A1(0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0 ㎍/㎖)에 24시간 동안, 그 후 24시간 동안 BrdU(1:10)에 노출시켰다. 세포 증식 지표는 3번 반복해서 평가하였다.

결과: 도4A의 성장 역동성 연구에 의해 명확하게 보여주는 것과 같이, 에프린A1-Fc 리간드에 의해 야기된 EphA2 수용체의 활성화와 빠른 내부화는 GBM-CSC 세포주 증식 지표를 크게 감소시켰다. 아이소타입 대조군(Fc)과 자란 세포에 상대적으로, 배양에서 GBM-CSC 세포로의 에프린 A1-Fc 첨가 후에 성장 역동성의 차이를 검출하였으며(a-c), 이는 인간 신경 줄기세포(d)와 비슷하나 U87 인간 아교모세포종 세포주(e)와는 같지 않았다. 에프린A1-Fc는 GBM-CSC 세포 증식을 농도 의존적 방식으로 약화시킨다. 증식곡선은 3개의 GBM-CSC 세포주를 대표한다. (f) 에프린A1-Fc과 자란 세포에 상대적으로, EphA2-Fc는 GBM-CSC 성장 역동성의 커다란 감소를 유도하는 것을 보여 주었다. 이 결과는 GBM-CSC 풀을 격감시키는 데 있어서 에프린A1-Fc와 EphA2-Fc에 대한 기능적 역할을 한 번 더 시사할 수 있다. 보여준 모든 그래프는 3번의 실험의 대표적인 것이다. f에 있는 성장곡선은 하나의 GBM-CSC 세포주를 대표한다.

도 4B에서 보고한 것과 같이, BrdU 통합세포(a) 또는 KI67 면역반응 세포(b)가 나타낸 농도에서 가용성 리간드의 존재 시 크게 감소하였다. 에프린A1-Fc는 U87 세포 증식에 대하여 어떠한 억제적 효과도 끌어내지 못 한다. a는 하나의 GBM-CSC 세포주를 대표한다. 이 결과는 4개의 독립적인 실험으로부터 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다.

도 4C는 일차 종양 시료로부터 분리된 후 곧 GBM-CSC 세포의 EphA2-Fc(5.0㎍/㎖)로의 노출이 배양에서 그들의 확장을 막는다는 것을 보여 주었다. EphA2-Fc의 부재(a,c) 또는 존재(b,d) 하에 2개의 급성으로 분리된 GBM-CSC 세포주로부터의 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경 이미지는 클론 형태에서 분명한 차이를 보여준다. 무처리 GBM-CSC-유래된 클론은 전형적으로 동그란 형태를 보이는 반면에, EphA2-Fc 처리 후에 얻은 뉴로스피어는 불규칙하게 생겼으며, 많이 돌출된 신장된 세포의 존재를 특징으로 하며, 이는 증가된 세포부착과 아마도 분화를 시사한다. (n=4). 바, 50㎛.

실시예 6.

인간 GBM - CSC 클론원성 및 자가-재생 능력에 대한 가용성 에프린A1 - Fc 또는 가용성 EphA2-Fc 수용체의 효과.

주어진 시간 동안 자체의 다수의 자가 재생을 위한 GBM CSC의 능력은, 의 복사체를 생산하는 암 줄기세포의 능력으로 정의할 수 있는, 그들의 행동이 얼마나 공격적일지를 전망하는 지표이다. 여기에서는 관련된 자가-재생 활동과 같은 분열의 전체적인 대칭에 관련된 중요한 줄기세포 파라미터를 분석하였다.

에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 노출 후 자가 재생 지표는 클론원성 분석와 GBM-CSC 세포 분석에 의해 평가하였다.

클론원성 분석:

단일 클론의 분리로부터 유래한 GBM-CSC 세포주를 계수하였고, 웰 당 1000개의 가시성 세포를 L-poly-Lisin-코팅된(0.1 mg/㎖, 시그마) 24-웰 플레이트에 파종하였다. 생성된 이차 스피어의 숫자를 7-10일 후에 평가하였다 (7.). 세포를 마우스 단일클론 IgG1 아이소타입 대조군(R&D), 에프린A1-Fc ((0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 ㎍/㎖) 또는 EphA2-Fc (5.0 ㎍/㎖)의 존재 하에 플레이트 하였고, HNSC를 줄기세포 대조군으로 사용하였다.

세포 분류:

2x10⁶개의 GBM-CSC세포를 원심분리하고 DNase (1:1000, 최종농도 1㎍/㎖, 시그마)를 가진 0.5㎖의 완전배지에서 재현탁하였다. GBM-EphA2 수용체 양성 또는 음성 세포를 단일 세포 분류 모드와 ACDU (Automated Cell Deposition Unit)를 사용하여 그리고 나서 분류하여 96 다중 웰 플레이트의 각 웰에서 단일세포를 분류하였다(FACSAria, BD Biosciences). FACS Aria는 488, 633 및 보라색 레이저를 갖추고 있다. 세포를 확인하였고 전방 및 직교 광 산란 신호에서 전자적으로 게이트 하였다. 항-EphA2에 결합하는 세포를 대표하는 이벤트를 그들의 광 산란(FSC 및 SSC)과 형광 사인(FITC)에 의해 확인하였다. 동시에 세 개의 세포 집단이 분류되었다. 기구의 원래 데이터는 기록 보관과 데이터 프로세싱을 위해 전자적으로 저장하였다.

각 웰에서 생성된 일차 스피어의 숫자(클론 효율)은 플레이팅 후 10-14일에 평가하였다(DAP).

결과: 도 5A에 보여준 것과 같이, 에피린A1-Fc는 시험관 내 인간 GBM-CSC에서 전체적인 분열의 대칭성 및 관련된 자가-재생 활성에 영향을 주었다. 방법에 개시한대로 순차적인 클론원성 분석에 의해, 대조군-Fc와 성장한 세포에 비하여, 에프린A1-Fc의 지시된 농도로 자극한 GBM-CSC는 낮은 클론 효율을 보여주었으며, HNSC와 비슷하지만, U87 세포와는 같지 않았다. EphA2의 리간드-중재 활성화는 용량-의존적 방법으로 신경 전구체 클론-형성의 백분율(클론 효율)을 감소시켰다. 컬럼, 3개의 독립적인 분석의 평균, 바, s.e.m. 게다가, 에프린A1-Fc는 시험관 내 GBM 세포에서 형태학적 변화를 유도한다. 도 5B에 보고한 대로, 2개의 GBM-CSC 세포주 배양으로부터의 뉴로스피어의 위상차-명시야 현미경사진은 클론 크기에 대한 에프린A1-Fc의 영향을 명확하게 보여준다. (a,d) 휴지 대조군, (b,e) 에프린A1-Fc 0.5 ㎍/㎖, (c,f) 에프린A1-Fc 1.0 ㎍/㎖. 이는 GBM-CSC 풀의 격감에서 에프린A1-Fc의 추정되는 연관을 확인해 준다. 주목할만 하게, 에프린A1-Fc의 포화 농도(5㎍/㎖)가 완전히 HNSCs의 뉴로스피어 형성을 완전히 없앤다(자료는 보여주지 않았다). 스케일 바 100㎛(a-c); 50㎛(d-f). 마지막으로, 도 5C에 보고한 것과 같이, EphA2/세포 분류를 수행하였고 EphA2 양성 세부 구성집단은 시험관 내 EphA2 음성 세포에 관하여 현저하게 더 클론원성 이었다. 컬럼, 5개의 독립적인 분석의 평균, 바, s.e.m.

실시예 7.

가용성 에프린A1 - Fc 리간드 또는 가용성 EphA2 - Fc 수용체는 종양신생 GBM -CSC의 풀에 대해 영향을 준다.

에프린A1-Fc와 EphA2-Fc 처리의 결과가 웨이브 커밋티드(wave committed) 전구세ㅗ가 아닌 진짜 줄기세포에 영향을 미치는 지 여부를 평가하기 위하여, 에프린A1-Fc와 EphA2-Fc의 GBM CSC 측면 집단에 대한 영향을 조사하였다. 게다가, FACS에 의해 EphA2-Fc 자극된 GBM-CSC(24시간 동안 5.0 ㎍/㎖)를 추정되는 신경 줄기세포, 뇌 종양 줄기세포, 및 암 줄기세포/종양-개시 세포 집단 마커의 발현에 대한 성질을 규명하였다.

측면 집단:

SP 세포는 듀얼 파장 분석의 도트 플롯의 특징적인 낮은-형광 꼬리로 확인하고 우리의 GBM-CSC에서 검출하였다 (1.41% 생존-게이트된 세포, 대 0.03%의 골수). 혹스트 33342(Hoechst 33342)의 배출을 중재하는 베라파밀의 처리는 특정한 ABC 트랜스포터를 억제하는 것으로 알려져 있는 이 집단을 없앴다. 350nm의 UV 선으로 여기 후, 세포를 이중 파장 분석을 사용한 모플러(Coulter)에서 분석하였다(파란색, 450-465 nm, 빨간색, 630-730nm). 세포를 5.0μg/㎖의 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc의 존재 하에서 24시간 동안 자라게 했고, 그리고 나서 2x10⁶/㎖의 최종 농도로 DMEM/F12과 DNase(1μg/㎖, 시그마), BSA(2 μg/㎖, 시그마), 헤파린(heparin)(4μg/㎖, 시그마), EDTA(200 μg/㎖, 시그마) 내에 재 현탁시켰다. GBM-CSC를 그리고 나서 2μg/㎖의 Hoechst 33342 염료(Invitrogen)로 37℃에서 간헐적으로 흔들어 주면서 2시간 동안 표지하였다. 억제적 대조군으로서, 혹스트 33342로 표지하기 전에 10분 동안 실온에서 칼슘 채널 차단제인 베라파밀(verapamil) (시그마)을 첨가해 마지막 농도가 50 μM이 되게 하였다. 인큐베이션의 끝에, 세포를 냉장에서 스핀 다운시켰고 얼음이 있는 빙냉 PBS에서 재현탁하였다. 프로피디움 아이오다이드(PI) (2 μg/㎖, 마지막 농도, 시그마)를 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석 전에 실온에서 5분 동안 첨가하였으며, 이는 사멸세포 대 생존세포의 차이를 나타낸다. ABC 트랜스포터 유전자인, ABCG2 (또한 Bcrp1으로 알려진)은 마우스 골수 및 다른 조직에서 SP 표현형의 일차 중재자의 하나이다. 우리는 상기 개시한 대로 마우스 단일클론 IgG2b 항체(1:50, eBioscience)와 알렉사 플루오르(alexa Fluor) 488-접합 이차 염소 항-마우스 항체(1:2000, Invitrogen)를 이용한 면역형광염색을 수행하여 GBM-CSC 세포에서 ABCG2 단백질을 검출하였다.

유동 세포분석 면역 표현형 프로파일링:

상기 개시한대로 유동 세포분석을 수행하였다. 다음의 일차 접합 항체를 사용하였다:

마우스 항 CD133-PE 접합 (0.25 ㎍, MACS)

마우스 항 CD44-PE 접합 (20 ㎕ / 1x10⁶ 세포, BD)

마우스 항 CD184-CXCR4-APC 접합 (20 ㎕ / 1x10⁶ 세포, BD)

마우스 항 CD81-TAPA1-FITC 접합 (20 ㎕ / 1x10⁶ 세포, BD)

마우스 항 CD15 SSEA1-FITC 접합 (20 ㎕ / 1x10⁶ 세포, BD)

마우스 항 CD117-cKit-PE 접합 (0.2 ㎍, BD)

세포를 암시야 실온에서 30분 동안 인큐베이션 하였고, 세척하고 0.5 ㎖ 완전배지에 재현탁 하였으며, 유동세포분석기에 의해 분석하였다. 자동형광과 아이소타입 대조군은 모든 이러한 분석에 대하여 일상적으로 실시하였다.

결과: 도 6에 명확하게 보고된 것과 같이, GBM-CSC SP는 에프린A1-Fc 및 EphA2-Fc 처리에 의해 완벽하게 사라졌거나 크게 감소되었다. 세포를 혹스트 33342(Hoechst 33342) 단독 표지하거나 100 μmol/L의 베라파밀(verapamil)과 혼합으로 표지하였고 유동세포계수를 실시하였다. 가용성 리간드 또는 수용체로 처리한 GBM-CSC는 베라파밀의 존재 하에서 뿐만 아니라 검출되지 않는 측면집단세포를 보여 주었다. 결과는 적어도 2번의 독립적인 실험의 대표적인 도트 플럿이다. EphA2-Fc는 종양 줄기세포 또는 종양-개시세포 소집단 농축 관련될 수 있다. EphA2-Fc 자극 후 일부 마커의 발현 양 또는 패턴이 감소하였다.(자료는 보여주지 않았다).

실시예 8.

가용성 에프린A1 - Fc 리간드 또는 가용성 EphA2 - Fc 수용체의 인간 GBM - CSC 다분화능에 대한 효과.

줄기세포로서 효과를 갖기 위해서는, GBM-CSC는 다능성 이어야 한다. 여기에서는 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 처리 후에 GBM-CSC에서 보다 더 분화된 표현형의 후보 습득을 결정하는 분화 연구를 수행하였다. 에프린A1 또는 EphA2-Fc의 부재 시 또는 존재 시에 성장한 클론성 스피어를 형광 신호 강도의 세포형광 계측성 측정을 실시하였다.

세포유동분석(Flow cytometry):

자가-재생 분석로부터 클론성 스피어는 FACS 분석을 받았고, 계통-특이적 마커를 사용하여 신경 마커 발현을 평가하였다.

별아교세포(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 뉴런(βIII-튜블린) 및 희소돌기아교세포(galactocerebrossidC, GalC) 정량을 위해서, 레인보우 칼리브레이션 파티클(Rainbow calibration particle) 혼합물 (8 peaks), 3.0-3.4 μm (BD Bioscience)를 칼리브레이션을 위해 사용하였고, 세포 표지의 강도를 동등한 파이코에리뜨린(phycoerythrin) 분자로서 표현하거나(MEPE) 동등한 플루오르세인 분자로 표현하였다. 간단히 말하면, 세포 내 염색을 위해 세포를 24시간 동안 1.0 μg 또는 5.0 μg/㎖의 에프린A1의 존재 하에 플레이트 해놓고 나서, 재현탁하고 실온에서 30분간 0.5㎖의 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 용액에 의해 퍼미어빌라이즈(permeabilize) 하였다. 세포를 2㎖의 BD Perm/세척 1X (BD)로 세척하고 실온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 원심분리 후, 그들을 0.2㎖ BD Perm/Wash 용액 1X(BD)에 재현탁 하였으며, 여기에는 적절한 일차 항체 혼합물이 포함되어 있다. 막 항원을 위해서, 세포를 0.2㎖의 성장배지에 재현탁하였고, 그리고 나서 다음의 일차 항체와 4℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. : 토끼 다중클론 항-GFAP (1:400, dako), 마우스 모노클론 항-베타III 튜블린(1:400, Babco), 및 마우스 단일클론 항-GalC((1:400, Chemicon). 세포를 세척하고 30분 동안 +4℃에서 2차 항체에 노출하였다. 세포 내 항원의 경우에는 이들은 1:800 염소 항-토끼 Ig FITC-표지되거나 염소 항-마우스 IgG R-PE-표지된 항체 (BD)였으며, 반면에 막 항원에 대해서는 1:1000 FITC-접합된 F(ab') 2 염소 항-마우스 IgM 또는 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgM (Jackson ImmunoResearch)를 사용하였다. 광범위한 세척 후, 세포를 재현탁시켰고, 유동세포 분석법에 의하여 분석하였다.

결과: 도 7에 나타난 것과 같이, 대조군-Fc에 상대적으로, 가용성 리간드와 수용체 모두 GBM-CSCs에서 명시적인 형태학적 변화를 유도하였다. 세포형광분광 측정법에 의한 형광 신호 강도의 측정을 이용함에 의해, 에프린A1-Fc로 자극한 세포가 아교세포(GFAP) 면역반응을 위한 동등한 플루오르세인의 분자에서 (MEFL) 용량 의존적 증가를 보였다.

에프린A1-Fc와 EphA2-Fc는 시험관 내에서, 더 성숙한 표현형의 획득을 촉발하며, 이는 주로 별아교세포-와 유사 운명을 얻으며, 종양원성 GBM-CSC의 풀을 고갈시킨다. 히스토그램은 3번 반복된 측정으로부터 평균 ± s.e.m.을 보여 준다.

실시예 9.

가용성 에프린A1 - Fc 리간드 또는 가용성 EphA2 - Fc 수용체의 인간 GBM - CSC 아폽토시스 또는 세포주기에 대한 효과.

세포주기 분석: BrdU/DNA 분석과 검출

세포주기 분석을 위하여, 에프린A1-Fc(5 μg/㎖) 또는 EphA2(5 μg/㎖)의 존재 하에서 6, 24, 48시간 동안 1x10⁶ 세포/샘플 을 배양하였다. 세포를 그리고 나서 20μM의 5-브로모-2-디옥시유리딘(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU, 1:500, 시그마)에 37℃에서 20분간 노출시켰으며, PBS에 들어 있는 70% 에탄올에 고정하였고 염색 전에 4℃를 유지하였다(3.). DNA를 1㎖의 3N HCl로 20분간 실온에서 변성시켰으며, 그리고 나서 펠렛을 1%의 BSA(시그마)를 포함한 1㎖의 0.5% Tween-20(시그마)이 있는 용액에서 15분간 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 그리고나서 항-BrdU 당일클론 항체(1:10, BD)와 60분간 실온에서, 암시야에서 인큐베이션하였다. 이용한 2차 항체는 알렉사(Alexa) 488 염소 항-마우스 IgG (1:500, Invitrogen) 였다. 그리고 나서 세포를 PBS 내의 2.5 ㎍/㎖의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)에 및 물 내의 7μL RNAse (3 mg/㎖)에 재현탁하였으며, 암시야, 4℃에서 밤새 염색하였다. FACSCalibur (BD Biosciences)에 의해 각 샘플에 적어도 30000개의 세포를 가지고 이중 파라미터성(Bi-parametic) BrdU/DNA 분석을 수행하였고 써밋 4.3 소프트웨어(Summit 4.3 software)를 사용하여 결과를 분석하였다.

터미널 디옥시뉴클레오티딜 트렌스퍼라제 - 중개된 dUTP - FITC 닉-엔드(Nick-End) 표지 분석 (튜넬(TUNEL))

아폽토시스를 튜넬(TUNEL) 분석키트(Roche Diagnostics)를 이용하여 측정하였으며 이중파라미터 유동성 세포측정기에 대해서는 제조회사의 지침에 따랐다. FACSCalibur (BD Biosciences)에서 분석을 수행하였고, 써밋 4.3 소프트웨어(Summit 4.3 software)를 사용하여 결과를 분석하였다 (Coulter).

결과: FACS-튜넬 및 BrdU에 의해 측정한 것과 같이, 대조군 세포에 상대적으로, 가용성 리간드 또는 가용성 수용체 어떤 것도 세포사멸/아폽토시스를 유도하지 못했으며, GBM-CSC 및 HNSC 세포주기단계를 변화시키지 못 했다 (자료는 보여주지 않았다).

실시예 10.

가용성 에프린A1 - Fc 또는 가용성 EphA2 - Fc 수용체의 GBM - CSC 확산과 이주에 대한 및 관련된 세포 내 관련 경로에 대한 효과

EphA2의 과발현 또는 활성의 부족은 GBM-CSC 세포 침입에서도 통합적인 작용자이며, 세포 골격의 변경 또는 FAK의 지속적인 인산화 및 FAK의 키나아제 활성 지속 및 다른 세포 내 경로의 지속을 일으킨다. 세포 운동성은 세포골격의 변경에 의존하기 때문에, GBM-CSC 세포골격 재배치 및 형태학적 변화를 차단함에 있어서 에프린A1-Fc와 EphA2-Fc의 발암성-억제 역할을 팔로이딘에 의한 F-액틴 링 번들을 보여주는 세포의 빈도를 측정함으로써 평가하였다. 혈관세포의 운동성 및 침습 능력을 조절하는 데 있어서 가용성 리간드 또는 수용체의 효율을 또한 결정하였다.

세포골격 마커에 대한 면역염색:

에프린A1-Fc(5.0 ㎍/㎖) 또는 EphA2-Fc (5.0 ㎍/㎖)의 부재 시 또는 존재 시에 GBM-CSC를 2.5x10⁴ cells/cm²의 밀도로 컬트랙스(Cultrex) 코팅된 유리 커버슬립(12 mm 직경)에 5분 30초 동안 플레이트 하였다. F-액틴 염색을 위하여, 세포를 4% 파라포름알데하이드에서 20분간 고정하였고, 0.1 % (v/v) Triton-X 100으로 투과성을 증진시켜서 알렉사(Alexa)555-표지된 팔로이딘(phalloidin, 1:40, Invitrogen)으로 실온에서 30분간 인큐베이션 하였다.

이주 분석:

Pennacchietti 2003 (10.)에서 같이 24-웰 트랜스웰 챔버에(24-well Transwell chambers) (8-um pore크기, 6.5 mm, 0.33 cm², Corning Costar)서 침습 분석을 수행하였다. 필터의 윗부분을 Cultrex로 코팅하였고, 1x10⁵ 인간 피부 미세혈관 내피세포(Human Dermal Microvascular Endothelial cells, HMVECs)를 EphA2-Fc (5.0 ㎍/㎖)의 부재 또는 존재 하에 1.5 ㎖ DMEM/F12에서 파종하였다. 아래 구획에는, 이주의 양성 자극으로서, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF, 20 ng/㎖) 또는 GBM-CSC 세포 조건화 배지(플레이팅 1일 후 1x10⁶ 세포로부터 1㎖). 필터의 윗부분에는 EphA2-Fc의 부재 또는 존재 하에 2.6 ㎖의 DMEM/F12 기본배지에서 자극을 추가하였다.

플레이팅 후 7-14일에, 필터의 윗부분에 있는 세포를 기계적으로 제거하였고, 아래쪽으로 이주한 세포를 고정하였으며, DiffQuick (Dade Behring)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 덴시토미터(densitometer) 스캐너에 의해 얻은 부피 밀도 값에 의해 세포의 이주를 평가하였다.

웨스턴 블럿:

GBM-CSCs의 악성 행동에 대한 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 처리의 결과를 결정하기 위하여, 적절한 시간 동안 세포를 에프린A1-Fc(1.0 또는 5.0 ㎍/㎖) 및 EphA2-Fc(5.0 ㎍/㎖)의 존재 하에 파종하였고 용해하여 용해액(lysate)을 만들었다. 모든 과정은 상기에 개시한 대로 수행하였다.

다음의 일차 항체를 사용하였다:

토끼 항-포스포 FAK (Tyr576/577, Tyr 925) (1:1000, Cell Signaling)

토끼 항-인간 총 p42/p44 MAPK (ERK1/2) (1:1000, Cell Signaling)

토끼 항-인간 포스포 ERK1/2 Thr202/Tyr204) (1:1000, Cell Signaling)

토끼 항-포스포 Akt (Ser473) (1:1000; Cell Signaling)

토끼 항-포스포 mTOR (Ser2481) (1:1000, Cell Signaling)

토끼 항-포스포 PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (1:1000, Cell Signaling)

토끼 항-인간 E-카드헤린 (1:1000, Cell Signaling)

마우스 항-인간 젤소린 (1:1000, 시그마)

이 과정 후 당나귀 항 토끼 HRP(1:10.000, GE) 및 토끼 항 마우스 HRP로 인큐베이션 하였다. 인간 뇌 단백질 메들리(70㎍, Clonetech) 또는 인간 뇌 종양 전체 단백질 용해액 LYS054(70㎍, Abserotec)을 조직 대조군으로 사용하였다. ERK1/2의 인산화 형태를 또한 면역조직화학에 의해 검출하였다. 에프린A1-Fc(5.0 ㎍/㎖) 또는 EphA2-Fc(5.0 ㎍/㎖)의 부재 시 또는 존재 시에 세포를 컬트렉스(Cultrex)-코팅된 (Trevigen) 유리 커버슬립에 1, 6, 24시간 동안 파종하였다. 대조군으로는 휴지 세포 또는 MEK1/2 억제제인 UO126으로 미리 처리한 세포(2시간 동안 10 μM에 2시간, Cell Signaling). 상기에서 설명한대로 토끼 다중클론 항 phospho-MAPK (t202/y204) (1:1000, Cell Signaling) 및 Alexa Fluor 488 IgG (1:2000, Invitrogen)로 면역조직화학을 수행하였다.

결과: 가용성 수용체 또는 가용성 리간드는 세포 퍼짐을 막는다. 부착과 퍼짐은 액틴과 마이크로튜블 세포골격 모두에서 변화를 수반하여 진행된다. 세포골격 재배치 분석은 도 8A에서 보고하였으며, 높은 이주성 표현형을 가져서 컬트렉스(Cultrex) 위에 잘 퍼지는, 무처리 GBM-CSC 세포(a)가 납작하고 다각형의 형태를 특징으로 하며, 잘-구성된 액틴 세포골격을 가지며, 더 많은 F-액틴 필라멘트가 밀집하여 스트레스 섬유(stress fiber)를 조직화되며 섬유아세포(fibroblast)와 유사한 형태를 가짐을 잘 보여준다(b-d 삽도). 링과 같은 액틴 번들(섬유묶음)은 GBM-CSCs 행동의 특징이다. 정반대로, 에프린A1-Fc(e)와 EphA2-Fc(f) 처리된 세포는 동그랗고, 극성의 형태(bipolar) 및 긴 세포로 특징지워 지고, 퍼지지 못 하며, 세포-세포 접촉면에 국소적인 F-액틴 양성반응을 가진 덜 조직화된 마이크로튜블을 보여준다. 큰 패널의 바, 5 ㎛; 작은 패널의 바, 10 ㎛.

도 8B의 위쪽 패널에 나타난 데이터는, EphA2 활성화가 시험관 내 세포 부착, 퍼짐과 이주를 억제할 수 있음을 확인하였고, FAK의 빠른 비활성화와 탈인산화를 유도한다는 것을 확인하였다. 세포를 정해진 시간 동안에 에프린A1-Fc의 부재 시 및 존재 하에 성장시키고 용해시켰다. 처리된 세포의 타이로신 잔기(tyrosine residues) 576/577 또는 925에서 인산화된 FAK의 감소된 발현을 웨스턴 블럿에 의해 단백질 수준으로 평가하였다. 가장 현저한 수준은 처리 후 60분과 24시간 후에서 관찰되었으며, FAK는 다시 타이로신 인산화 되었다. 로딩 대조군: GAPDH.

주목할만하게, 도 8B(아래 패널)에 보고된 컬트렉스(cultrex) 침입 분석에 의해 나타난 대로, 재조합 EphA2-Fc 투여에 의해, EphA2-발현되는 내피세포 이주가 시험관 내에서 또한 심각하게 억제되었다. 혈청을 넣지 않은(Serum starved) HMVEC 챔버의 위쪽 끝에 플레이트 하였고, 6시간 동안 필터의 아래쪽 면으로 이주하게 하였다. (a) 대조군으로서 기본배지에 있는 HMVEC. 아래쪽 구획에서 VEGF (20ng/㎖) 또는 GBM-CSC 조건화 배지는 각각 챔버의 위쪽 면에서 에프린A2-Fc (5.0 ?g/㎖)의 부재 시(b, c) 및 존재 시(e, f) 챔버의 위쪽 면에 있는. 위쪽 면에 있는 대조군 인간 IgG는 VEGF에 대한 반응인 세포 이주에 영향을 미치지 않았다(d). 막의 아래쪽 표면으로 이주한 세포를 고정하였고, 방법에 기술한 대로 염색하였다. 스케일 바, 200㎛.

마지막으로, 에프린A1-Fc 및 EphA2-Fc는 GBM-CSC에서 ERK1/2의 인산화에 의한 MAP 키나아제-의존성 경로의 활성화를 유발하는 것을 입증하여 왔다. 도 8C의 공초점 면역-형광에서 보고한 바와 같이, Fc-처리된 대조군(a)에 상대적으로, 인산화된 ERK1/2 양성의 빈도에서 특정한 즉각적인 증가를 성장배지에서 EphA2-Fc(c) 또는 에프린A1-Fc(d) 추가 후 6시간에 검출할 수 있었다. 관찰된 양성의 평균 수준은 24시간 동안 안정적으로 남아 있었다. (b) ERK 기질 부위에서의 가용성 리간드 및 수용체 매개된 인산화는 MEK1 활성화의 화학적 억제자인 UO126으로 세포를 미리 처리해 제거하였다. 스케일 바, 20 ㎛. 같은 도의 아래쪽 패널에 있는 웨스턴 블럿 분석은 GBM-CSC에서 에프린A1-Fc의 증가된 농도가 ERK1/2 활성을 향상시킨다는 것을 확인하였다. GAPDH는 샘플 로딩에 대한 대조군을 제공하였다. Akt와 mTOR의 강렬한 활성이 검출되었기 때문에 에프린A1-Fc는 심지어는 MAPK 다운스트림 신호를 향상시킬 수도 있다(결과를 보이지는 않았다).

*실시예 11.

BMP4는 이벤트의 프로-분화(pro-differentiation) 캐스케이드를 몰아가며, 이는 시험관 내와 생체 내 모두에서 GBM에서 암 줄기세포 풀의 격감으로 이어진다(11.). 아래는 결합된 BMP4와 에프린A1-Fc 처리의 결합된 효과이다.

실시간 PCR:

GBM-CSC 세포를 재조합 인간 BMP4에 48시간 동안 노출하였다(100 ng/㎖, R&D). 전체RNA와 cDNA를 이전에 개시한 대로 얻었으며, EphA2 발현에 대한 정량 분석을 수행하였다. Brilliant SYBT Green QPCR 핵심 시약 키트(Stratagene)를 이용하여 정량 RT-PCR 반응을 3번 반복하였다. SYBR Green 염료는 어떠한 PCR 생성물에도 결합하며, 따라서 서열-특이적인 프로브의 사용을 필요로 하지 않는다. 형광 배출은 실시간으로 기록된다(Chromo 4 Four-Color Real-Time PCR 검출기, MJ). 상대적 정량의 비교 Ct 방법을 이용하여 유전자발현 프로파일링을 마쳤다. 상대적인 RNA 양을 2개의 내재적인 대조군, GAPDH, 및 18S 리보솜 RNA(18S rRNA)에 대하여 정규화하였다.

성장곡선:

에프린A1-Fc(1.0 ㎍/㎖ 또는 5.0 ㎍/㎖), 및 각각 BMP4의(100 ng/㎖, R&D) 또는 인간 중추신경계 줄기세포 자손의 신경 분화의 강력한 조절자인 백혈병치료제 억제인자(LIF, 10 ng/㎖, Chemicon) 존재 하에서 GBM-CSC를 파종하였다. 상기 개시한 것과 같이 세포 증식 지수를 성장 곡선 분석으로 평가하였다.

결과 :

도 9에 보여주는 것처럼, rhBMP4 노출은 GMB-CSC 풀의 분화와 격감을 통해 GBM-CSCs에서 EphA2 단백질의 하향조절을 증진한다. (a) 특이적 프라이머를 사용한 QRT-PCR 분석으로, 매치되는 대조군과 비교했을 때 rhBMP4-처리된 세포에서 GAPDH를 이용하여 정규화된 감소된 EphA2 전사체 표준화를 밝혀 냈다. 히스토그램은 표준화된 평균±s.e.m.을 보여주며 대표적인 2개의 GBM-CSC 세포주를 대표하는 3개의 다른 실험으로부터 정량하여 얻은 정규화된 평균 ± s.e.m.을 보여준다. 게다가, 도 9(b)에 보고한 것처럼, rhBMP4는 GBM-CSCs 및 HNSCs 증식에 대한 에프린A1-Fc의 억제적 효과를 이끌어 낸다. rhBMP4의 부재 또는 존재 시에 에프린A1-Fc와 성장한 GBM-CSCs 사이에 성장 동력학에서 차이를 발견하였으며, 전자는 빠른 성장 비율에 의해 특징지워 지고, 후자는 천천히 분열하는 GBM-CSC를 포함한다. b에서 성장곡선은 하나의 6BM-CSC 세포주를 나타낸다. 똑같은 결과를 LIF 자극 후 수집하였다 (결과를 보여주지는 않았다).

실시예 12.

인간 GBM - CSCs 피하(s.c.) 종양 이종이식 성장에 대한 에프린A1 - Fc 및 EphA2-Fc 투여의 효과

EphA2 과발현은 종양발생을 야기하는 것으로 알려져 있다. 나아가, 분열의 총체적 대칭 및 관련된 자가-재생 활성과 같이, 상기에서 분석된 GBM-CSCs의 결정적인 줄기세포 매개변수들은 이들 세포의 종양-개시 능력과 선형적으로 연관되어 있다. 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc의 발현 또는 활성의 EphA2 하향-조절의 효과를 생체 내에서(in vivo) 시험하였다.

본 실시예에서는 발암성 GBM-CSCs 풀의 시험관 내(in vitro) 감소가 피하(s.c) 이종이식편에서 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc-처리 세포의 생체 내 종양 형성 능력의 유사한 감소와 관련이 있는지 여부를 평가하였다.

s.c. 주사를 위해, 면역약화(immunocompromised) 무흉선(athymic) nu / nu 마우스(암컷 3-4주령, Charles River)를 사용하였다. 동일 부피의 컬트렉스(Cultrex, Trevigen)와 혼합된 100 uL의 PBS로 3x10⁶ hGBM-CSC 세포를 23 게이지 바늘을 사용하여 수용자인 마우스의 우측 옆구리에 주사하여 인간 GBM 피하 종양 이종이식편을 확립하였다.

마우스를 7-35일간 모니터링하였고, 시약을 GBM-CSCs 주사 부위 근처(종양주위 주사)에 35일간 1일 1회(1x/day) 투여하였다.

GBM-CSCs의 종양-개시 능력을 감소시키고 종양 확립 및 성장을 방지하는 가용성 리간드/수용체의 능력을 시험하기 위하여, 동물을 하기와 같이 무작위화하였다:

대조군-비히클: 세포 이식 후 100 ㎕의 식염수를 종양주위 주사로 동물에게 투여함;

에프린A1-Fc(동시-처리군): 식염수 내 100 ㎕의 에프린A1-Fc(10 ㎍/용량)의 종양주위 투여와 동시에 세포 이식을 수행함;

EphA2-Fc(동시-처리군): 식염수 내 100 ㎕의 EphA2-Fc(10 ㎍/용량)의 종양주위 투여와 함께 세포 이식을 수행함;

EphA2-Fc(후-처리군): 세포 이식 후 7-10일간 종양을 성장시킨 후, 100 ㎕의 EphA2-Fc(후-종양 형성)(10 ㎍/용량)를 종양주위 주사로 마우스에 투여함.

주 1회 버니아 캘리퍼스(vernier calipers)를 이용해 종양을 측정하였고, 처리군 대비 종양 성장 비율에 있어서의 변화를 평가하기 위하여, 절대 부피로 나타내었을 뿐만 아니라, 투여 개시 1일째의 개별적인 종양 부피에 대해 표준화하였다(상대적 종양 부피).

V(mm³)= π/6 x a x b x c

동물의 체중을 유사한 시간의 경과에 따라서 측정하고 분석하였다.

대조군, 에프린A1-Fc 및 EphA2-Fc-처리 동물로부터 GBM-CSCs 종양 이종이식편을 절제한 후 상기에 기술된 바와 같이 후-고정 및 동결방지시켰다.

10 ㎛ 두께의 연속 절편을 하기의 항체/항혈청으로 면역표지하였다: 종양의 인간성을 확인하기 위한 마우스 IgG1 항-인간 핵(1:100, Chemicon), 마우스 IgG1 항-인간 미토콘드리아(1:50, Chemicon) 및 마우스 IgG2a 항-인간 HLA-abc(1:100, Dako). 증식 지수 검출을 위한 토끼 IgG 항-Ki67(1:1000, NovoCastra). 완전히 세정 후, 절편을 적합한 이차 항체: 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 알렉사 플루오르 488-546(1:1000, Invitrogen)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 절편을 세척하고 플루오르세이브(Fluorsave)로 덮어주었다.

헤마톡실린 및 에오신 염색과 면역조직화학분석을 수행하였다.

시료를 시각화하고 자이스 악시오포트-2(Zeiss Axiophot-2) 형광현미경 및 레이카(Leica) 공초점 현미경으로 사진을 찍었다. 일차 항체 또는 항혈청이 생략되었거나, 대안적으로 정상의 비-면역 혈청이 사용된 대조군 실험에서는 어떠한 표지도 관찰되지 않았다.

결과 :

도 10에 명백히 나타난 바와 같이, 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc의 투여는 피하 생쥐 모델에서 인간 GBM-CSCs의 발암성 및 종양 진행을 강력하게 억제하였다. 에프린A1-Fc/EphA2-Fc의 생체 내 전달은 피하 종양 확립 및 성장을 방지한다. 이미-확립된 종양을 가용성 수용체로 처리하는 것은 생체 내에서 이들 성장의 상당한 저하를 나타내었다. GBM-CSCs를 nu / nu 마우스의 우측 옆구리에 주사하였다. 식염수(대조군-비히클) 또는 시약(에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc 동시-처리)을 세포 주사 시로부터 시작하여 플러그(plug) 주위에 매일 투여하였다(100 ㎕/용량). 후-처리 분석을 위하여 부피를 획득할 시(7일째)에 종양 보유 누드 마우스에 매일 100 uL/용량을 투여하였다. 그래프는 6마리 마우스의 4개 그룹에서의 평균±s.e.m.을 나타낸다.

실시예 13.

시험관 내에서 에프린A1 - Fc 및 EphA2 - Fc에 대한 GBM - CSCs 노출이 동소(orthotopical) 종양 이종이식을 개시하는 이들의 능력에 미치는 효과.

종양 성장에 대한 (발현 또는 활성의 EphA2 하향-조절에 의한) 가용성 수용체 및 리간드 분자의 항종양 효과를 평가하기 위하여, 더욱 임상적으로 관련된 동소 종양 모델을 사용하였다.

s.c. 모델에서 수득된 결과를 확인하고 확대 해석하기 위하여, 전-처리 실험을 수행하였다. 가용성 리간드 또는 수용체(5.0 ㎍/㎖)에 48시간 노출 후, GBM-CSCs(루시퍼라제의 수용체 유전자로 감염됨, luc-GBM-CSCs)를 scid / bg 마우스의 선조체 내로 주사하였다. 이는 에프린 리간드에의 일시적 노출이 GBM-CSCs에서 종양형성성(tumorigenicity)을 감소/파괴할 수 있는지 여부의 결정을 가능케 한다.

GBM-CSCs 렌티바이러스 감염.

GBM-CSCs를 초라피 루시퍼라제 리포터 유전자로 감염시켰다.

합성 양방향 프로모터가 2개 mRNA의 동조(coordinate) 전사를 매개하고 효율적인 이중-유전자 전달을 가능케 하는 새로 생성된 렌티바이러스 벡터를 사용하였다.(2.).

이 프로바이러스 벡터는 상류에 연결된 인간 사이토메갈로바이러스(mCMV) 유래 최소 핵심 프로모터 요소, 및 반대 방향으로, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 유래의, 유효 프로모터로 이루어진다. 이 벡터 도안은 프로모터 유전자로서 초파리 루시퍼라제(f-luc) 및 녹색 형광 단백질(GFP)의 이용을 가능하게 하고, 이는 i) 시험관 내에서, FACS에 의해, 제한 희석에 의해, 또는 생체 내 IVIS 영상화 제노젠(Ivis Imaging Xenogen) 분석에 의해, 형질전환유전자-발현 세포를 증균시키고; ii) 생체 내에서, 뇌 내에서 종양 세포 분포를 손쉽게 모닝터링하는데 사용될 것이다. 293T 세포 내로의 일시적 4-플라스미드 동시-형질감염에 의해 VSV-슈도타입화(pseudotyped) 3세대 LV가 생산되고 초원심분리에 의해 농축될 것이다.

벡터의 발현 역가를 제한 희석에 의해 HeLa 세포 상에서 평가하였다. HIV-1 gag p24 항원 면역포획에 의해 벡터 입자를 측정하였다. 각 벡터에 대한 역가와 입자 사이의 비율로 벡터 감염성을 계산하였다. GBM-CSC 세포를 상청액에 노출시키고, 형질감염된 293T 세포로 밤새, 16시간 동안 조건화하였다. 그 후에 바이러스 함유 배지를 제거하고 신선한 배지(luc-GBM-CSCs)로 교체해주었다.

GFP-발현 세포의 개수를 세거나 생체 내 루미나(Lumina) 분석에 의해 감염 효율을 평가하였다.

생발광(bioluminescent) 세포를 검정색의, 투명 바닥, 96-웰 플레이트(Nunc) 내에서 완전 배지를 이용해 5000 내지 100 세포로 연속 희석하였다. D-루시페린(ONE-Glo, 루시퍼라제 분석 시스템, Promega)을 영상화 3분 전에 각 웰(100 ㎕ 완전 배지에 재현탁된 단일 세포 함유)에 1:1(v/v)로 첨가하였다. 영상화 시간은 플레이트당 1 분이었다.

scid/bg 마우스의 선초체 내로 GBM CSCs 이식.

Luc-GBM-CSC 세포를 동소 주사 48시간 전에 에프린A1-Fc(5 ug/㎖) 또는 EphA2-Fc(5 ㎍/㎖)의 부재 또는 존재 하에서 접종하였다.

DNAse(1:1000, 시그마) 함유 DMEM 중의 1x10⁵ 세포/uL 현탁액 3 uL를 헤밀톤(Hamilton) 주사기에 연결된 유리 전극을 통한 정위(stereotactic) 주사에 의해 우측 선조체(0.2 ㎕/min) 내로 전달하였다. 모든 주사는 최적의 실질 순응도를 보증하기 위하여 6분의 간격에 걸쳐서 이루어졌다.

식염수 내에 염산케타민(ketamine hydrochloride, 8 mg/㎖), 자일라진(0.8 mg/㎖), 및 14.25% 에틸 알코올을 함유하는 0.2 ㎖/kg의 원액(stock solution)을 복강 내로 주사하여 동물을 마취시켰다.

마취된 마우스의 두부(head)를 70% 에틸 알코올 및 포비돈-요오드 용액으로 소독하였다. 두부의 등쪽 방향으로 중간선 절개를 만들고 정수리점(bregma)을 노출시키기 위해 두개골막을 가쪽으로(laterally) 소거하였다(swept).

2 mm 드릴 구멍을 만들었다. 경막을 파괴하지 않도록 주의하였다.

하기 좌표(정수리점으로부터의 mm)를 사용하였다: 두개골 표면으로부터 전복측(anterior-ventral, AV) = 0; 내외측(medio-lateral, ㎖)= +2.5 mm; 등배측(dorso-ventral, DV)= -3.0 mm.

미세-주사기 바늘을 제거하고 피부를 4-0 비크릴(Vicryl)로 덮었다. 신경학적 기능이상의 임의의 징후에 대하여 매일 동물을 모니터링하였다.

제노젠 IVIS 루미나 시스템에 의한 종양 성장의 평가.

종양 형성, 확장 및 부피를 생체 내 루미나 시스템(Xenogen)을 이용해 취해진 연속 영상을 이용해 주 1회 간접적으로 계산하고 처리 없이 GBM 세포가 투여된 대조군 동물의 결과와 비교하였다.

제조사의 지침에 따라서, 생체 내 영상화를 위하여, 동물에게 영상화 15분 전에 PBS 중의 150 mg/Kg으로 복강 내 주사에 의해 기질 D-루시페린(Caliper)을 투여한 후 마취시켰다(2,5% 이소플루란)(8.).

그 후에 마우스를 2% 이소플루란에 계속 노출시키면서 빛-차단 카메라 박스 내부의 가온된 단(stage) 위에 위치시켰다. 종양 성장 및 시점에 따라서, 자동화 방식으로 영상화 시간을 20초 내지 1분의 범위로 하였다.

세포 접종 후 처음 1주일의 마지막에서 시작하여 6주째까지 주 1회 발광 측정을 수행하였다.

생발광 종양으로부터 발산되는 낮은 수준의 빛을 IVIS™ 카메라 시스템에 의해 검출하고, 통합하고, 디지털화하고, 표시하였다. 표시된 영상으로부터 관심 영역(regions of interest, ROI)을 종양 부위 주변에서 확인하고 리빙 이미지 소프트웨어(Living Image software, Xenogen)를 사용하여 총 유량(flux)(광자/s)으로 정량하였다.

조직 절편에 대한 면역조직화학분석:

6주 후 마우스를 희생시켰다. 희생된 동물에게 왓슨-말로우(Watson-Marlow) 연동 펌프를 사용하여, 120 mmHg의 압력으로 주입되는 100 ㎖의 0.15 M NaCl에 이어 4% PFA 함유 250 ㎖의 0.1M 인산칼륨 완충액(KBS)을 이용한 경심(transcardiac) 관류/고정을 수행하였다. 상기에 기술된 바와 같이, 뇌를 후-고정하고 동결방지시켰다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색과 면역조직화학분석을 수행하였다. 10 ㎛-두께 연속 절편을 상기에 기술된 바와 같이 처리하였다. 조직 절편 내에서 인간 종양 세포를 회수하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 IgG1 항-인간 미토콘드리아(1:50, Chemicon), 마우스 IgG1 항-인간 핵(1:100, Chemicon), 마우스 IgG2a 항-인간 HLA-abc(1:100, Dako)와 같은 인간 특이적 항체를 사용하거나, 벡터 내에 존재하는, 루시퍼라제(마우스 IgG1 1:25, Invitrogen) 또는 리포터 유전자 녹색 형광 단백질(GFP, 1:500, Mol Probes)을 이용하였다.

종양 세포 증식, 분화, 및 혈관신생을 하기의 항체/항혈청을 사용한 면역조직화학분석에 의해 평가하였다: 토끼 항-GFAP(1:500, Dako), 항-KI67(1:200, Novocastra), 마우스 항-인간 PCNA(1:1500, Sigma), 토끼 항-CD147(1:600, serotech), 토끼 항-NG2(1:300, Chemicon). 종양 부피 및 확장을 연속 재구성에 의해 계산하였다.

조적 절편을 또한 하기 일차 항체로 염색하였다:

염소 항-인간 EphA2(1:50, R&D), 단클론성 마우스 IgG 1 항-인간 EphA2 clone D7(1:100, Sigma), 토끼 다클론성 항-인간 에프린A1(1:50, Abcam), 토끼 항-인간 포스포-에프린B(Tyr324/329)(1:100, Cell Signaling), 염소 항-에프린B2(1:10, R&D), 염소 항-인간 에프린B3(1:10, R&D), 토끼 항-포스포(S339) CXCR4(1:100, Abcam), 염소 항-인간 Wnt5a(1:10, R&D), 토끼 항-인간 E-캐드헤린(1:100, Cell Signaling).

결과:

도 11에 나타난 바와 같이, scid / bg 마우스의 선조체 내로의 이식 전에, 시험관 내에서 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc(5.0 ㎍/㎖)에 luc-GBM-CSC 세포를 48시간 동안 노출시키는 것은 종양-개시 능력을 현저하게 감소시킨다. 도 11A에 보고된 생발광 모니터링은 종양 유래의 대응하는 신호 증가를 명백히 나타낸다. GBM 종양 성장은 EphA2-Fc 또는 에프린A1-Fc으로 처리된 luc-GBM-CSC 생발광 계(lines)에서 강력히 억제된다. 생체 내 영상화를 이용하여 세포 주사 7일 후부터 주 1회 종양을 모니터링하였다. 그래프는 6마리 마우스의 3개 그룹에서의 평균±s.e.m.을 나타낸다. 또한, 도 11B는 휴지(resting) 및 EphA2-Fc 또는 에프린A1-Fc로 전-처리된 GBM-CSCs의 두개 내 주사 후에 생체 내에서 검출된 종양 성장 및 종양 크기에 있어서의 차이를 나타낸다. 주사된 3개의 대표적인 scid / bg 마우스로부터 시간의 경과에 따라 취해진 등쪽 영상을 나타낸다. 시간의 경과에 따른 종양 부위에서의 상대적 변화를 나타내기 위하여 등쪽상의 모든 영상에 대해 위색(pseudocolor) 눈금 막대를 일관되게 적용하였다.

도 11C에 보고된, 공초점 영상에 의하여, 루시퍼라아제-특이적 면역염색에 의해 나타난 바와 같이, 동소 이식하고 6주 후에, 비처리 luc-GBM-CSCs(a) 유래의 종양이 에프린A1-Fc(b) 및 EphA2-Fc(c) 처리 세포에 의해 생성된 종양에 비해 더욱 효과적으로 뇌 실질 내로 확장하고 침투하였다. 상관관계의 정도를 결정하기 위하여 연속적으로-등록된 절편의 면역조직화학적 영상 유래의 종양 크기를 대응하는 BLI 측정값과 비교하였다(결과 비제시). 눈금 막대, 1 mm.

실시예 14.

미리-확립된 동소 종양에 대한 에프린A1 - Fc 및 EphA2 - Fc의 국소화 및 직접 미세주입의 효과.

생체 내에서 EphA2 조정 시 종양 성장을 연구하기 위하여 유사한 접근법을 사용하였다. 이는 EphA2 수용체의 활성화 또는 발현 상태와 GBM-CSCs의 발암성 특성 사이의 명확한 관계, 및 구체적으로 이들 두 매개변수 사이의 역 상관관계를 정의할 수 있었다. 이는 또한 환자의 종양 내에서 hGBM-TCSC 풀을 다루기(tackle) 위한 후보 치료적 수단으로서 생체 내에서 EphA2 조정을 이용하는 가능성을 결정할 수 있었다.

scid / bg 마우스의 선조체 내로 에프린A1 - Fc 또는 EphA2 - Fc를 주입하는 미니-알제트(mini-alzet) 펌프의 이식.

luc-GBM-CSCs 동소 주사 10일 후, 임의의 운동 또는 행동 장애를 유발하지 않으면서 종양이 충분한 크기일 때, 미니-삼투압 펌프(Alzet)의 뇌내 카테터를 마우스 선조체 내로 동일한 천공기(burr) 구멍을 통해 장착하였다.

염 슬리브(salt sleeve)라고 불리는, 펌프 내의 구획과 펌프가 이식된 조직 환경 사이의 삼투압 차이에 의해 알제트 펌프는 작동한다. 염 슬리브의 높은 삼투압농도는, 펌프의 외부 표면을 덮고 있는, 반투과성 막을 통해 물이 펌프 내로 유입되게 한다. 물이 염 슬리브 내로 유입됨에 따라서, 이는 가용성 저장소를 압박하고, 제어되는, 미리 지정된 속도로 펌프로부터 검사 용액을 변위시킨다.

제조사(뇌 주입 키트)의 지침에 따라서, PBS 중의 EphA2-Fc(30 ㎍) 또는 에프린A1-Fc(30 ㎍) 용액 100 ㎕를 저장소에 위치시키고 14일간 주입시켰다(0.25 ㎕/시간). 전달된 용량은 1.8 ㎍/일이었다.

독성의 징후에 대해서 동물을 면밀하게 모니터링하였다. 종양 형성, 확장 및 부피를 상기에 기술된 바와 같이 생체 내 루미나 분석(Xenogen)을 이용해 취해진 연속 영상에 의해 주 1회 간접적으로 계산하였다. 주입된 마우스를 처리 없이 GBM 세포가 투여된 대조군 동물(100 uL의 PBS 용액)의 것들과 비교하였다.

카테터 장착하고 2주 후(GBM-CSCs 주입하고 4주 후) 마우스를 희생시켰다. 경심 관류/고정, 조직 후-고정과 봉입, 및 면역조직화학분석은 후-처리 두개 내 실험에 기술되어 있다.

결과:

도 12는 GBM CSCs 이식하고 7-10일 후 세포 주입 부위에서 scid / bg 마우스의 선조체 내로 이식된, 미니-알제트 펌프를 이용한 에프린A1-Fc 또는 EphA2-Fc의 연속 투여(후-처리)가 종양 성장을 억제함을 나타낸다. Luc-GBM-CSCs를 scid / bg 마우스의 우측 선조체 내에 주사하고 그로부터 14일 후에, 종양 부피를 측정할 때, 미니-삼투압 펌프의 두개 내 카테터를 마우스 선조체 내로 동일한 천공 구멍을 통해 장착하였다(화살표: 삼투압 펌프 이식). 종양 보유 마우스에 1.8 ㎍/일의 전달 일일 용량으로 14일간 EphA2-Fc, 에프린A1-Fc 또는 대조군 비히클을 주입하였다. 종양 세포를 이식하고 7일 후부터 시작하여 주 1회 생발광 모니터링을 수행하였다. EphA2-Fc 또는 에프린A1-Fc 처리군은, 대조군의 증가하는 발광 값과는 달리, 21일에 걸쳐서 감소된 표준화 발광 값을 나타낸다. 각 마우스에 대한 생발광 측정값을 요법의 개시점에서 수득한 대응하는 판독값에 대해 표준화하였다. 그래프는 6마리 마우스의 3개 그룹에서의 평균±s.e.m.을 나타낸다.

상기 기재 및 상기에 언급된 실시예로부터, 본 발명에 따라 기술되고 수득된 제품에 의해 달성되는 이점은 명백하다.

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tacgagaagg 960 tggaggatgc ctgccaggcc tgctcgcctg gattttttaa gtttgaggca tctgagagcc 1020 cctgcttgga gtgccctgag cacacgctgc catcccctga gggtgccacc tcctgcgagt 1080 gtgaggaagg cttcttccgg gcacctcagg acccagcgtc gatgccttgc acacgacccc 1140 cctccgcccc acactacctc acagccgtgg gcatgggtgc caaggtggag ctgcgctgga 1200 cgccccctca ggacagcggg ggccgcgagg acattgtcta cagcgtcacc tgcgaacagt 1260 gctggcccga gtctggggaa tgcgggccgt gtgaggccag tgtgcgctac tcggagcctc 1320 ctcacggact gacccgcacc agtgtgacag tgagcgacct ggagccccac atgaactaca 1380 ccttcaccgt ggaggcccgc aatggcgtct caggcctggt aaccagccgc agcttccgta 1440 ctgccagtgt cagcatcaac cagacagagc cccccaaggt gaggctggag ggccgcagca 1500 ccacctcgct tagcgtctcc tggagcatcc ccccgccgca gcagagccga gtgtggaagt 1560 acgaggtcac ttaccgcaag aagggagact ccaacagcta caatgtgcgc cgcaccgagg 1620 gtttctccgt gaccctggac gacctggccc cagacaccac ctacctggtc caggtgcagg 1680 cactgacgca ggagggccag ggggccggca gcaaggtgca cgaattccag acgctgtccc 1740 cggagggatc tggcaacttg gcggtgattg gcggcgtggc tgtcggtgtg 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gtgatgaaag 2640 ccatcaatga tggcttccgg ctccccacac ccatggactg cccctccgcc atctaccagc 2700 tcatgatgca gtgctggcag caggagcgtg cccgccgccc caagttcgct gacatcgtca 2760 gcatcctgga caagctcatt cgtgcccctg actccctcaa gaccctggct gactttgacc 2820 cccgcgtgtc tatccggctc cccagcacga gcggctcgga gggggtgccc ttccgcacgg 2880 tgtccgagtg gctggagtcc atcaagatgc agcagtatac ggagcacttc atggcggccg 2940 gctacactgc catcgagaag gtggtgcaga tgaccaacga cgacatcaag aggattgggg 3000 tgcggctgcc cggccaccag aagcgcatcg cctacagcct gctgggactc aaggaccagg 3060 tgaacactgt ggggatcccc atctgagcct cgacagggcc tggagcccca tcggccaaga 3120 atacttgaag aaacagagtg gcctccctgc tgtgccatgc tgggccactg gggactttat 3180 ttatttctag ttctttcctc cccctgcaac ttccgctgag gggtctcgga tgacaccctg 3240 gcctgaactg aggagatgac cagggatgct gggctgggcc ctctttccct gcgagacgca 3300 cacagctgag cacttagcag gcaccgccac gtcccagcat ccctggagca ggagccccgc 3360 cacagccttc ggacagacat atgggatatt cccaagccga ccttccctcc gccttctccc 3420 acatgaggcc atctcaggag atggagggct tggcccagcg ccaagtaaac agggtacctc 3480 aagccccatt tcctcacact aagagggcag actgtgaact tgactgggtg agacccaaag 3540 cggtccctgt ccctctagtg ccttctttag accctcgggc cccatcctca tccctgactg 3600 gccaaaccct tgctttcctg ggcctttgca agatgcttgg ttgtgttgag gtttttaaat 3660 atatattttg tactttgtgg agagaatgtg tgtgtgtggc agggggcccc gccagggctg 3720 gggacagagg gtgtcaaaca ttcgtgagct ggggactcag ggaccggtgc tgcaggagtg 3780 tcctgcccat gccccagtcg gccccatctc tcatcctttt ggataagttt ctattctgtc 3840 agtgttaaag attttgtttt gttggacatt tttttcgaat cttaatttat tatttttttt 3900 atatttattg ttagaaaatg acttatttct gctctggaat aaagttgcag atgattcaaa 3960 ccgaaaaaaa 3970 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA1 forward <400> 5 gcctgacacc acatacatcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA1 reverse <400> 6 atatgcgggt ggctaaactg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA2 forward <400> 7 aaagccggct acacagagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA2 reverse <400> 8 ttggacaact cccagtaggg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA3 forward <400> 9 gagtttgcca aggaattgga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA3 reverse <400> 10 ttgggatctt ccctcctctt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA4 forward <400> 11 accaagcagt gcgagagttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA4 reverse <400> 12 ctccccgtac gacatcactt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA5 forward <400> 13 caagcctaat atggcggtgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA5 reverse <400> 14 gtgaactgcc catcgttttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA7 forward <400> 15 atcattggga gaaggcactg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA7 reverse <400> 16 atggacaaca tttgggtggt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA8 forward <400> 17 gagaacggct ctctggacac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA8 reverse <400> 18 cctccacaga gctgatgaca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA10 forward <400> 19 cgactaatgc tcgactgctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphA10 reverse <400> 20 tgatcaagca actgccactc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB1 forward <400> 21 cagggtactc ggagaagcag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB1 reverse <400> 22 ccagcatgag ctggtgtaga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB2 forward <400> 23 agttcggcca aattgtcaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB2 reverse <400> 24 aggcaggtga atgtcaaacc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB3 forward <400> 25 agcaacctgg tctgcaaagt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB3 reverse <400> 26 ggatgagctt gtccagggta 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB4 forward <400> 27 gagagctgtg tggcaatcaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB4 reverse <400> 28 tgtaggtggg atcggaagag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB6 forward <400> 29 tcattgcaca tggaaagcat 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EphB6 reverse <400> 30 gggtgagtcc agacaaggaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA1 forward <400> 31 ggtgactgtc agtggcaaaa 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <223> EFNA1 reverse <400> 32 agtggaagga gcagcacat 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA2 forward <400> 33 atctactgcc cgcactatgg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA2 reverse <400> 34 aggcgtggca gagatgtagt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA3 forward <400> 35 catgcggtgt actggaacag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA3 reverse <400> 36 gtggaactcg tagcccagag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA4 forward <400> 37 acattgtctg cccccactac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA4 reverse <400> 38 tgggctgact cagacttcct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA5 forward <400> 39 aggactccgt cccagaagat 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNA5 reverse <400> 40 atctgggatt gcagaggaga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB1 forward <400> 41 gcctggagtt caagaagcac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB1 reverse <400> 42 gaacaatgcc accttggagt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB2 forward <400> 43 gtgccaaacc agaccaagat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB2 reverse <400> 44 gatgttgttc cccgaatgtc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB3 forward <400> 45 aggcagaggg tggttatgtg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> EFNB3 reverse <400> 46 tctctttcca tgggcatttc 20

Claims (22)

1. 악성 뇌 종양으로부터 유래된 암 줄기세포의 집단에 의해 발현된 에프린 수용체를 저해하는데 효과적인 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
   수술 후 뇌 종양 재발의 치료적 치료 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
   여기서 상기 조성물은 상기 에프린 수용체의 발현, 에프린 수용체의 활성, 또는 이들 모두를 억제하는데 효과적이며, 상기 EphA2 전구체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는, 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 암 줄기세포는 아교모세포종(glioblastoma) 세포인, 약제학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 아교모세포종 세포는 다형성 아교모세포종(glioblastoma multiforme)인, 약제학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 뇌 종양 종괴(mass)의 성장을 억제하는 데 효과적인, 약제학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포의 증식을 억제하는데 효과적인, 약제학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포의 이동을 억제하는데 효과적인, 약제학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 종양-향상 세포 집단 (tumor-enhancing cell population)의 고갈에 효과적인, 약제학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포 클론 효율의 억제에 효과적인, 약제학적 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 0.001 내지 0.5μg/mL의 세포 내 농도를 제공하는, 약제학적 조성물.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 악성 뇌 종양은 다형성 아교모세포종인, 약제학적 조성물.
    
12. 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    악성 뇌 종양의 수술적 절제 후 암 줄기세포를 포함하는 악성 뇌 종양의 재발의 치료적 치료 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    여기서 상기 조성물은 악성 뇌 종양 유래의 암 줄기세포의 집단에 의한 에프린 수용체의 발현, 상기 에프린 수용체의 활성, 또는 이들 모두를 억제하는데 효과적이며, 상기 EphA2 전구체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는, 약제학적 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 암 줄기세포는 아교모세포종(glioblastoma) 세포인, 약제학적 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 아교모세포종 세포는 다형성 아교모세포종(glioblastoma multiforme)인, 약제학적 조성물.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 뇌 종양 종괴(mass)의 성장을 억제하는 데 효과적인, 약제학적 조성물.
    
16. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포의 증식을 억제하는데 효과적인, 약제학적 조성물.
    
17. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포의 이동을 억제하는데 효과적인, 약제학적 조성물.
    
18. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 종양-향상 세포 집단 (tumor-enhancing cell population)의 고갈에 효과적인, 약제학적 조성물.
    
19. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 암 줄기세포 클론 효율의 억제에 효과적인, 약제학적 조성물.
    
20. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 양의 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 0.001 내지 0.5μg/mL의 세포 내 농도를 제공하는, 약제학적 조성물.
    
21. 제12항에 있어서, 상기 EphA2 전구체의 가용성 세포 외 도메인은 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는, 약제학적 조성물.
    
22. 제12항에 있어서, 상기 악성 뇌 종양은 다형성 아교모세포종인, 약제학적 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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