ES2616444T3 - Expresión del receptor Eph en las células madre tumorales - Google Patents

Abstract

Un precursor de EphA2 para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral que comprende una población de células madre cancerosas mediante la inhibición de la proliferación y/o migración de células madre cancerosas, donde dicho precursor de EphA2 es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3.

Description

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invención es un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de efrina para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral.

Las ventajas proporcionadas por la presente invención se deben a la utilización de inhibidores específicos que 5 actúan sobre la diana molecular involucrada en el desarrollo y la progresión de los tumores cerebrales.

En una realización preferente, la presente divulgación proporciona un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de efrina para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral, donde dicho inhibidor de la expresión y/o actividad de un receptor de efrina se selecciona entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 3.

Para fines de la presente divulgación, cada inhibidor de la expresión y de la actividad de los receptores de efrina tiene una SEQ ID NO. Correspondiente, como se ha descrito previamente.

15 La sobreexpresión no regulada de los receptores de efrina se correlaciona con la tumorigénesis, en relación con el crecimiento y la supervivencia tumoral, y se asocia con la angiogénesis y la metástasis en la progresión del cáncer humano. La inhibición de la expresión y actividad de los receptores de efrina resulta, por lo tanto, ventajosa para el bloqueo de la progresión del tumor.

Un aspecto aún adicional de la presente divulgación es el uso de un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de efrina, donde dicho tumor cerebral es un glioblastoma, y en un aspecto aún adicional, donde dicho tumor cerebral es el glioblastoma multiforme.

Un aspecto aún adicional de la presente divulgación es el uso de un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la

25 actividad de un receptor de efrina, donde dicho tratamiento es el tratamiento profiláctico de una recurrencia de un tumor cerebral tras una intervención quirúrgica.

Un aspecto aún adicional de la presente divulgación es el uso de un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de efrina, donde dicho tratamiento es el tratamiento terapéutico de una recurrencia de un tumor cerebral tras una intervención quirúrgica.

El receptor de efrina, expresado en los vasos sanguíneos tumorales, también desempeña un papel importante en la angiogénesis y la neovascularización tumoral a través de la asociación con su ligando endógeno, efrinaA1. Su señalización en los tumores favorece la migración de células endoteliales y su montaje en estructuras capilares

35 mediante la regulación de la plasticidad del citoesqueleto, unión a la matriz, y/o adhesión intercelular.

Los inhibidores de la expresión y los inhibidores de la actividad de un receptor de efrina de acuerdo con la presente divulgación bloquean sorprendentemente la angiogénesis y la neovascularización tumoral, inhibiendo el crecimiento y la recurrencia del tumor tras una intervención quirúrgica.

Un aspecto aún adicional es el uso de un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de efrina, donde dicho tratamiento inhibe el crecimiento de la masa tumoral cerebral.

Un aspecto aún adicional es el uso de un inhibidor de la expresión y/o un inhibidor de la actividad de un receptor de

45 efrina, donde dicho inhibidor de la expresión y/o actividad de un receptor de efrina es un inhibidor de la proliferación de células madre cancerosas.

La ventaja de la presente invención puede ser demostrada por el hecho de que la inhibición del receptor de efrina bloquea la migración y la proliferación de las células madre cancerosas.

Una ventaja adicional de la composición farmacéutica acorde con la presente invención es la de ser capaz de proporcionar terapias selectivas para pacientes, diseñadas efectivamente para orientarse selectivamente a una población de células madre cancerosas específica en un tumor sólido y adaptadas para empobrecer el agregado de células madre cancerosas y la tumorigenicidad.

55

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de células madre cancerosas derivadas a partir de glioblastoma multiforme (CMCs derivadas de GBM) procedentes de muestras tumorales.

Los especímenes tumorales se obtuvieron de la Unidad de Neurocirugía, después de las correspondientes resecciones quirúrgicas realizadas a los pacientes. Las muestras tisulares de glioblastoma (GBM) adulto humano se 65 obtuvieron y se clasificaron de acuerdo con las directrices de la Organización Mundial de la Salud. Cada tejido neoplásico se dividió en dos fragmentos. El primero se utiliza para el análisis histopatológico: con detalle, el tejido se

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alternativamente con 0,5 ml de solución de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) a temperatura ambiente durante 30 min. Las células se lavaron con 2 ml de BD Perm/Wash 1X (BD) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Después de la centrifugación, se volvieron a suspender en 0,2 ml de solución de BD Perm/Wash 1X (BD) que contenía la mezcla de un anticuerpo primario apropiado.

5 Los anticuerpos primarios empleados fueron:

•

anticuerpo policlonal de cabra anti-EphA1 (0,3 µg, R&D)

•

anticuerpo policlonal de cabra anti-EphA2 (0,5 µg, R&D)

•

anticuerpo policlonal de cabra anti-EphA3 (0,3 µg, Gene Tex)

•

anticuerpo policlonal de conejo anti-EphA5 (0,5 µg, Abcam)

•

anticuerpo policlonal de conejo anti-EPHA7 (0,5 µg, Abcam)

•

anticuerpo policlonal de cabra anti-EphA8 (0,5 µg, Santa Cruz)

• anticuerpo policlonal de conejo anti-EphB1 (0,5 µg, Abcam) 15 • anticuerpo policlonal de conejo anti-EphB2 (0,5 µg, Abcam)

•

anticuerpo policlonal de conejo anti-EphB6 (0,5 µg, Santa Cruz)

Tras haber realizado extensos lavados se añadieron 0,3 ml de anticuerpo secundario apropiado:

•

anticuerpo de burro anti-Ig de cabra marcado con PE (0,2 µg, Jackson Immunoresearch)

•

anticuerpo de cabra anti-Ig de conejo marcado con FITC (0,5 µg, Jackson Immunoresearch)

Cada muestra se incubó durante 30 min en la oscuridad a 4 ºC. Después de dos lavados, las células se volvieron a suspender en 0,5 ml de medio completo y se analizaron por citometría de flujo. Los controles de autofluorescencia y

25 de isotipo se llevaron a cabo de forma rutinaria para todos estos ensayos.

Para todos los ensayos anteriores, los análisis se realizaron por citometría de flujo Cyan (Coulter) utilizando el software Summit 4.3. La fluorescencia de fondo se estimó mediante la sustitución de los anticuerpos primarios específicos con controles específicos de isotipo. La medición de la autofluorescencia también se llevó a cabo de forma rutinaria para cada condición ensayada.

Resultados: Los receptores de efrina y la sobreexpresión de sus ligandos análogos se pueden asociar a muchos tipos de progresión de cáncer humano. Como se muestra en la Figura1A, la mayoría de los receptores de efrina (13 analizados) y los ligandos (8 analizados) del transcrito de ARN mensajero pueden recuperarse por PCR

35 convencional. La totalidad del ADNc se normalizó previamente a través de una β-actina. Una estirpe celular de astrocitoma humano (U87) se empleó como referencia para las células tumorales, y las células humanas madre neuronales (CMNhs) como referencia para las células madre neurales normales. Curiosamente, a diferencia de las células madre normales y cancerosas, el ligando de efrinaA1 no puede recuperar ni el transcrito de ARN mensajero ni el nivel proteico en las células U87. De manera notable, la expresión de los receptores de efrina en CMCs derivadas de GBM se confirmó a nivel proteico por análisis citofluorimétrico, como se muestra en la Figura 1 B (a). Además, como se apunta en la Figura 1 B (b), EphA2 aumenta ampliamente las líneas de células madre cancerosas derivadas de GBM (n=6). Los histogramas muestran medias ± EEM de tres ensayos distintos.

Un ejemplo de la expresión generalizada de tanto el receptor de EphA2 como del ligando de efrinaA1 en una línea

45 representativa de CMCs derivadas de GBM se demostró igualmente en la Figura 1C. Las imágenes confocales de marcaje por inmunofluorescencia confirman la presencia e identifican una tinción positiva débil del receptor de EphA2 (a y su ampliación mayor local b-c) y el ligando de efrinaA1 (d y su ampliación mayor local e) en las células tumorales. Barra de escala, 40 µm (a, d); 20 µm (b, c); 13 µm (e).

Ejemplo 3.

Determinación de la expresión del receptor de EphA2 en tejidos de GBM primario.

Después de la demostración de que los niveles potenciados de EphA2 se recuperaron en las líneas de CMCs

55 derivadas de GBM, la identificación de la presencia de EphA2 inmunorreactiva también en los tejidos tumorales recientes, lo que excluye la posibilidad de que el receptor podría desarrollarse como una mera consecuencia del cultivo in vitro a largo plazo.

Inmunohistoquímica con tejidos primarios:

Para tinciones inmunohistoquímicas, los tejidos tumorales de GBM primario se fijaron posteriormente en paraformaldheído durante 24 h. Los tejidos se crioprotegieron en soluciones de sacarosa al 10 %, 20 % y 30 % en TFS durante la noche a 4 ºC, seguido por una etapa de inclusión durante la noche en una mezcla de compuesto con inclusión de sacarosa al 20 %/Tissue-Tek OCT 2:1 (v/v). Secciones en serie de diez micrómetros de grosor se 65 cortaron en un criostato y se montaron en un portaobjetos de vidrio recubierto de gelatina para un doble inmunomarcaje. Brevemente, las secciones se secaron al aire y se enjuagaron en tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,6)

que contenía SAB al 0,005 % y Triton al 0,1 % y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ºC. (13.).

Las secciones tisulares se tiñeron con cabra anti-EphA2 de humano (1:50, R&D) o clon D7 del monoclonal de ratón 5 IgG1 de anti-EphA2 humano (1:100, Sigma).

Citometría de flujo con tejidos primarios:

Poco después de la digestión enzimática y mecánica descrita anteriormente, las suspensiones celulares aisladas de los especímenes tumorales primarios se sometieron a un análisis por CCAF para la expresión del receptor de EphA2. Brevemente, las células derivadas de la disociación tisular de GBM se tiñeron con LDS 751 (10 ng/ml, Molecular Probes) 15 min a temperatura ambiente para identificar las células nucleadas intactas. Las células se analizaron por citometría de flujo (FACSAria, BD Biosciences), y utilizando una técnica de selección de poblaciones alternativa (células positivas LDS751), se creó una región (P1) que identifica las células nucleadas intactas en el

15 gráfico de puntos FSC frente a SSC. Para identificar las células nucleadas intactas y vivas, una puerta lógica combinada se creó mediante la región de adición (P1) a una región que contenía células negativas 7AAD. Después, las CMCs derivadas de la disociación tisular de GBM se incubaron con un cabra anti-EphA2 humano (0,5 µg, R&D) y 7AAD (5 µg/ml, Coulter), con el fin de identificar las células tanto positivas como muertas.

Resultados: La inmunohistoquímica se empleó para examinar la localización del receptor de EphA2 en los gliomas primarios y sus homólogos "normales" vecinos (periféricos) de pacientes con glioma. Los resultados mostrados en el panel superior de la Figura 2 revelaron con claridad una señal de EphA2 más elevada en el núcleo del tumor (a) en relación a su periferia menos maligna (b) (al menos 2 cm de distancia del núcleo). Barra de escala, 50 µm. Como se muestra en el panel inferior de la misma figura, también se detectó la proteína del receptor de EphA2 en CMCs

25 derivadas de GBM completamente disociadas, constitutivamente recuperables dentro de tumor del paciente, por análisis citofluorimétrico (n=4) (flechas).

Ejemplo 4.

Efecto del receptor de efrinaA1-Fc soluble (R&D) y EphA2-Fc soluble (R&D) en la expresión y la fosforilación de EphA2 en las CMC derivadas de GBM humano.

Debido a la degradación del receptor inducida por el ligando, se puede producir una expresión disminuida de EphA2, que se traduce en un aumento de la adhesión celular a la matriz extracelular (MEC), una disminución de la migración

35 y la inhibición celular del crecimiento maligno. Por tanto, la sobreexpresión de este receptor en las CMC derivadas de GBM podría verse reflejada en el comportamiento maligno y su compromiso mediante la efrinaA1-Fc podría contrarrestar la tumorigenicidad.

Desde este punto de vista, se determinaron los efectos de la disminución de la expresión forzada o de la actividad de EphA2 en las propiedades tumorigénicas de CMCs derivadas de GBM. El receptor de EphA2 se comprometió para disminuir su expresión y determinar cómo esto contribuye a la regulación de las propiedades funcionales generales de estas células, tanto in vitro como in vivo. EphA2 se comprometía utilizando una efrinaA1-Fc soluble, una proteína quimérica Fc de ratón IgG1 de efrinaA1 humana. Además, EphA2 parece ser única entre los receptores Eph en que su actividad quinasa puede no ser totalmente dependiente de la unión del ligando. Estos efectos

45 independientes de ligando de EphA2 son importantes en los procesos influyentes que son críticos en la progresión maligna.

Los efectos de la prevención de la fosforilación de EphA2 endógeno se analizaron alternativamente por medio de una proteína quimérica del receptor de EphA2-Fc con un dominio de unión a ligando extracelular del receptor fusionado a la porción Fc de IgG1 humana que se une competitivamente al ligando disponible.

Análisis citofluorimétrico:

Para el análisis de dosis-respuesta, poco después de la disociación mecánica, las células se sembraron en

55 presencia de efrinaA1-Fc (0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1,0 µg/ml) durante 24 horas. Para el análisis del tiempo-ciclo, las células se incubaron con efrinaA1-Fc (1,0 µg/ml) durante 6, 24, 48, 72 horas.

Las preparaciones celulares (500.000 células/muestra) se centrifugaron y se volvieron a suspender en 0,2 ml de medio completo. A continuación, se expusieron a un anticuerpo policlonal de cabra anti-EphA2 (0,5 µg, R&D) durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ºC. Después de haber realizado extensos lavados, se añadió un anticuerpo de burro anti-Ig de cabra marcado con FITC (0,56 µg/muestra, Jackson Immunoresearch) y cada tubo se incubó durante 30 min en la oscuridad a 4 ºC. Después de dos lavados, las células se volvieron a suspender en 0,5 ml de medio completo y se analizaron por citometría de flujo. Los controles de autofluorescencia y de isotipo se llevaron a cabo de forma rutinaria para todos estos ensayos.

65

Inmunocitoquímica:

Las células se sembraron a una densidad de 2,5 x 104 células/cm 2 en cubreobjetos de vidrio con un diámetro de 12 mm recubiertos de Cultrex (Trevigen) en medio completo como control o en presencia de efrinaA1-Fc (0,5, 1,0

5 µg/ml) durante 24 horas. Las células se lavaron, se fijaron con paraformaldehído al 4 % en TFS, pH 7,4, y se llevó a cabo la inmunotinción. Los cubreobjetos se incubaron durante la noche a 4 ºC en TFS que contenía suero normal de cabra (SNC) al 10 % o suero bovino fetal al 10 % (SBF), Triton X-100 al 0,3 %, y los anticuerpos o antisueros primarios apropiados (conejo anti-efrinaA1 humano, 1:50 Abcam, cabra anti-EphA2 humano, 1:50 R&D). Alternativamente, las células se inmunotiñeron con un clon D7 del monoclonal de ratón IgG1 EphA2 (1:100, Sigma).

Tras lavar a fondo con TFS, las células se hicieron reaccionar durante 45 min en la oscuridad a temperatura ambiente (TA) con el anticuerpo secundario apropiado:

• Cabra anti-conejo conjugado con cianina Cy2 o Alexa-Fluor 488 (1:200, Jackson Immunoresearch, 1:2000, 15 Invitrogen)

•

Cabra anti-burro conjugado con cianina Cy3 o Alexa-Fluor 546 (1:500, Jackson Immunoresearch, 1:2000 Invitrogen)

•

Cabra anti-ratón conjugado con cianina Cy3 (1:800, Jackson Immunoresearch)

Tras haber realizado el lavado, los núcleos celulares se contratiñeron 10 min a temperatura ambiente con 4,6diamidina-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI, 50 g/ml en TFS, Sigma), se enjuagaron tres veces en TFS y una vez en agua destilada y se montaron en un portaobjetos de vidrio con Fluorsave (Calbiochem).

Los controles apropiados para los anticuerpos primarios y secundarios no revelaron ni la tinción no específica ni la 25 reactividad cruzada de los anticuerpos.

El diagnóstico por imágenes se analizó por un microscopio de Zeiss Axioplan2 y un microscopio confocal Leica DMIRE2.

Membrana de Western:

Poco después de la disociación, las células se sembraron en medio completo en presencia de 5,0 µg/ml de efrinaA1-Fc o 5,0 µg/ml de EphA2-Fc durante 10, 30, 60 min y 24 horas. Las células también se sembraron en matraces recubiertos de Cultrex (Trevigen) y su diferenciación se indujo mediante la eliminación de EGF/FGF2 y la adición del

35 factor inhibidor de la leucemia (FIL 10 ng/ml) durante 7-10 días. Las células se volvieron a suspender, se centrifugaron y se lisaron. El tampón de lisis estaba compuesto por 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM de EDTA y Triton X-100 al 1 % suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa al 1 % (Sigma) y cóctel inhibidor de la fosfatasa al 10 % (Roche). Las células se recogieron, se lavaron en TFS y se centrifugaron a 14.460 xg. La cuantificación proteica se realizó por el ensayo proteico DC (Bio-Rad), utilizando una serie de estándares de albúmina. El tampón de carga de gel se añadió a 70 µg de cada lisado, y las proteínas se resolvieron con geles de poliacrilamida al 10 % y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (GE), de acuerdo con los protocolos convencionales. Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris (SST)-T (SST más Tween 20 al 0,02 %) y leche al 5 %, y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4 ºC:

45 • IgG de cabra anti-EphA2 humano (1:750, R&D)

•

clon D7 de IgG1 de ratón anti-EphA2 humano (1:500, Sigma)

Esta etapa fue seguida de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (PRP) (1:10.000; Bio-Rad) durante 30 min:

•

IgG de burro anti-cabra (1:5000, Promega)

•

IgG de conejo anti-ratón (1:10.000, GE)

La actividad de la peroxidasa se detectó utilizando el sistema potenciado de quimioluminiscencia (GE) siguiendo las

55 instrucciones de los fabricantes. Como control de carga, se utilizó el anticuerpo de ratón anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1:500, Zymed).

Inmunoprecipitación:

Las células se cultivaron en ausencia o presencia de efrinaA1 (1,0, 5,0 µg/ml) o del control de isotipo monoclonal de ratón IgG1 (R&D) durante 24 horas y luego se lisaron como se ha descrito previamente. Para determinar los niveles de fosforilación de EphA2, los lisados celulares que contenían 100 µg de proteína total se incubaron con ratón antiEck/EphA2 humano, (1:500, Upstate) durante la noche a 4 ºC con rotación suave. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las microesferas (separación de microesferas Dynal Invitrogen) se lavaron ampliamente con tampón de 65 lisis, y los complejos inmunes se eluyeron con 2x tampón de muestra LDS (Invitrogen), se hirvieron y se centrifugaron brevemente. Las proteínas se determinaron y se detectaron por inmunoelectrotransferencia utilizando

ratón, 4G10 platinum, anti-fosfotirosina humano (1:1000, Upstate).

Resultados: La disminución de la internalización y de la degradación del receptor inducido por el ligando podrían aumentar la estabilidad de la proteína y contribuir a la sobreexpresión de EphA2. Se muestra un papel supresor 5 tumoral potencial doble para efrinaA1-Fc que consiste en la represión de la señalización oncogénica como resultado de la fosforilación del receptor, así como la disminución del receptor posterior.

El análisis citofluorométrico de la Figura 3A muestra con claridad que efrinaA1-Fc reprime la señalización oncogénica a través de la disminución del receptor de EphA2 en CMCs derivadas de GBM humano. El efecto inhibidor de efrinaA1-Fc es cualquiera dependiente de la dosis o del tiempo. Los valores representan las medias ± EEM de la medición por duplicado.

Además, como se indica en el panel superior de la Figura 3B, la inmunofluorescencia para EphA2 humano realizada en CMCs derivadas de GBM confirma que la mayor parte de las células fueron positivas para el receptor (a), 15 mientras que después de 1,0 µg/ml de efrinaA1-Fc (b) y 5,0 µg/ml de efrinaA1-Fc (c) solo se marcaron unas cuantas células para el mismo antígeno. Barra de escala, 20 µm. En el panel central de la misma Figura, la disminución en la expresión del receptor de EphA2 en CMCs derivadas de GBM tratadas con efrinaA1-Fc se confirmó a nivel proteico por inmunoelectrotransferencia en lisados celulares totales. Especialmente, la membrana confirma que el reclutamiento mediado por efrinaA1-Fc del receptor de EphA2 disminuye notablemente la expresión de EphA2 en CMCs derivadas de GBM de una manera dependiente de la concentración/tiempo. Las células se cultivaron en ausencia (-) o presencia (+) de efrinaA1-Fc en los periodos de tiempo indicados. El nivel de proteína inmunorreactiva cuantificado se abolió completamente en 60 minutos. Esto sugiere que el compromiso de EphA2 por su ligando análogo corresponde con una rápida internalización del receptor. Estirpe celular de fibroblastos humanos (FH) como control negativo para el anticuerpo EphA2. GAPDH se incluye como control para la carga idéntica de lisados. Los

25 datos presentados son un único representante de tres líneas diferentes de CMCs derivadas de GBM.

EfrinaA1-Fc desencadena la fosforilación y la degradación del receptor de EphA2 en CMCs derivadas de GBM. Según la evaluación por inmunoprecipitación, en el tratamiento con efrinaA1-Fc (Figura 3B, panel inferior), los niveles de EphA2 fosforilada con tirosina aumentaron drásticamente durante la concentración en las CMCs derivadas de GBM, una indicación de la activación del receptor mediada por efrinaA1. Poco después de la disociación, las células se trataron con concentraciones crecientes de efrinaA1-Fc o control de isotipo Fc durante 48 horas. La inmunoelectrotransferencia de lisados celulares totales con un anticuerpo (4G10) específico de fosfotirosina de los niveles de EphA2 inmunoprecipitada confirman un aumento en la activación y la fosforilación de EphA2 por efrinaA1-Fc.

35 Por último, como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento con EphA2-Fc puede prevenir la fosforilación de EphA2 endógena en lugar de la disminución de la expresión proteica de EphA2 en CMCs derivadas de GBM. Las CMC derivadas de GBM en estado de reposo y las CMC derivadas de GBM activadas con EphA2-Fc (5,0 µg/ml) en los periodos indicados se sometieron a un análisis de membrana Western.

Obsérvese que no se detectó un nivel de expresión del receptor de EphA2 en CMCs derivadas de GBM diferenciadas, lo que indica su implicación putativa en la regulación del comportamiento oncogénico de las células madre de cancerosas en GBM, tal como la proliferación y la migración aberrantes. La inmunoelectrotransferencia presentada es un representante de tres membranas analizadas en diferentes momentos.

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Ejemplo 5.

Efectos del receptor de efrinaA1-Fc o EphA2-Fc en la proliferación de CMCs derivadas de GBM in vitro.

Para determinar si la aplicación de la disminución/fosforilación de EphA2 o la unión competitiva con su ligando análogo puede afectar a las propiedades tumorigénicas de CMCs derivadas de GBM, en este caso, se analizaron los efectos citostáticos de efrinaA1-Fc y EphA2-Fc en el primer parámetro crítico de células madre, tales como la simetría general de división.

55 Las CMCs derivadas de GBM en su estado activo de crecimiento se expusieron a efrinaA1-Fc soluble o a EphA2-Fc y luego se evaluó la desviación de la cinética.

Curvas de crecimiento:

Para analizar el índice de proliferación de las CMCs derivadas de GBM, las suspensiones de neuroesferas se transfirieron a tubos de 15 ml (BD), se centrifugaron a 192 xg durante 10 minutos y se disociaron mecánicamente a una suspensión de una célula individual. Las células se contaron por el método de exclusión con azul de tripano y 8 x 103 células/cm2 de células viables se sembraron en presencia de control de isotipo monoclonal de ratón IgG1 (R&D), efrinaA1 (0,5, 1,0, 2,0, 3,0 o 5,0 µg/ml) o EphA2-Fc (5,0 µg/ml). Se representó el número total de células 65 obtenido en la siguiente etapa de subcultivo (0 DIV). En cada pase de subcultivo (cada 4-6 días) se obtuvo una suspensión de una única célula y el número total de células viables se contó por exclusión con azul de tripano. Se

volvieron a sembrar 8 x 103 células viables/cm2 en las mismas condiciones. Esto condujo a la definición de los parámetros cinéticos (pendiente de la curva de crecimiento, como en Gritti A, 2001) (7.) que proporciona indicaciones de la función de las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente en la determinación de la tasa de expansión de CMCs-CMNhs. Células U87 como control de referencia para las células tumorales y CMNhs

5 para las células madre neurales.

Para evaluar si el resultado de los tratamientos con efrinaA1-Fc y EphA2-Fc se basaba en criterios de buena fe de las células madre, el análisis de la proliferación de células disociadas completamente se realizó por un subcultivo de CMCs derivadas de GBM poco después del aislamiento a partir de los especímenes de tumores primarios (como se ha descrito previamente) en presencia de EphA2-Fc (5,0 µg/ml).

Inmunorreactividad ante KI67:

La investigación se complementó por medio de la definición del índice de proliferación con el análisis con KI67 (1.).

15 Brevemente, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos de Cultrex (Trevigen) en presencia de EGF/FGF2 y se expusieron a efrinaA1-Fc (0,5, 1,0 µg/ml) durante 24 horas. Las células en crecimiento se cuantificaron mediante inmunocitoquímica indirecta utilizando un policlonal de conejo anti-IgG Ki67 (1:1000, Novocastra). Se utilizó un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo con Cy2, como se ha descrito previamente (1:200, Jackson Immunoresearch). El número total de células en cada campo se determina por la contratinción de núcleos celulares con 4,6-diamidina-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI; Sigma; 50 g/ml en TFS) durante 10 min a temperatura ambiente.

Ensayos BrdU:

25 La proliferación también se controló mediante el kit de ensayo colorimétrico mediante BrdU de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por los fabricantes (Roche). En resumen, las CMCs derivadas de GBM se sembraron en microplacas de 96 pocillos, a una densidad de 5000 células/pocillo. Las células se expusieron a efrinaA1 (0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1,0 µg/ml) durante 24 horas y después 24 horas a BrdU (1:10). El índice de proliferación celular se evaluó por triplicado.

Resultados: Como se mostró con claridad por los estudios de cinética de crecimiento en la Figura 4A, la activación y la rápida internalización del receptor de EphA2 causadas por el ligando de efrinaA1-Fc redujeron en gran medida el índice de proliferación de líneas de CMCs derivadas de GBM. En relación con las células cultivadas con un control de isotipo (Fc), se detectaron diferencias en la cinética de crecimiento después de la adición de efrinaA1-Fc a las

35 CMCs derivadas de GBM en cultivo (a-c), similares a las células madre neuronales humanas (d), pero diferentes a las líneas de glioma humano U87 (e). La efrinaA1-Fc atenúa la proliferación de CMCs derivadas de GBM de manera dependiente de la concentración. Las curvas de crecimiento son representativas de tres líneas de CMCs derivadas de GBM. (f) En relación con las células cultivadas con efrinaA1-Fc, EphA2-Fc mostró inducir una gran reducción de la cinética de crecimiento de las CMCs derivadas de GBM. Estos datos podrían sugerir una vez más un papel funcional para efrinaA1-Fc y EphA2-Fc en el empobrecimiento del agregado de CMCs derivadas de GBM. Todas las gráficas mostradas son representativas de tres experimentos. Las curvas de crecimiento en f son representativas de una línea de CMCs derivadas de GBM.

Como se apunta en la Figura 4B, la incorporación de BrdU (a) o las células inmunorreactivas ante Kl67 (b) se redujo

45 en gran medida en presencia del ligando soluble en las concentraciones indicadas. La efrinaA1-Fc no provoca ningún efecto inhibidor sobre la proliferación de las células U87. a es representante de una línea de CMCs derivadas de GBM. Los datos representados son la media ± EEM de cuatro experimentos independientes.

La Figura 4C muestra con claridad que la exposición de las CMCs derivadas de GBM a EphA2-Fc (5,0 µg/ml) poco después del aislamiento del espécimen del tumor primario previno su expansión en cultivo. Las imágenes de microscopía de fase brillante de neuroesferas a partir de dos líneas de CMCs derivadas de GBM disociadas completamente en ausencia (a, c) o presencia (b, d) de EphA2-Fc muestran claras diferencias en la morfología del clon. Los clones derivados de CMCs derivadas de GBM sin tratar exhiben la morfología típica redondeada, mientras que las neuroesferas obtenidas después del tratamiento con EphA2-Fc se formaron de forma irregular y se

55 caracterizaron por la presencia de muchas células alargadas que sobresalen, lo que sugiere probablemente el aumento y la diferenciación de la adhesión celular (n=4). Bar, 50 µm.

Ejemplo 6.

Efectos del receptor de efrinaA1-Fc soluble o EphA2-Fc soluble en la clonogenicidad y la capacidad de autorrenovación de CMCs derivadas de GBM.

La capacidad de las CMC derivadas de GBM para autorrenovarse, que puede definirse como la capacidad de una célula madre cancerosa para producir múltiples copias de sí misma en un tiempo dado, es un índice prospectivo de 65 lo agresivo que puede ser su comportamiento. En este caso, se analizó un parámetro de células madre crítico relacionado con la simetría global de la división, tal como la actividad de autorrenovación relacionada. El índice de

imagen8

conocido por inhibir transportadores específicos ABC que median la expulsión de Hoechst 33342, abolió esta población. Las células se analizaron en MoFlo (Coulter) utilizando el análisis de doble longitud de onda (azul, 450465 nm; rojo, 630-730 nm) después de la excitación con luz UV de 350 nm.

5 Las células se cultivaron en presencia de 5,0 µg/ml de efrinaA1-Fc o EphA2-Fc durante 24 horas y después se volvieron a suspender en una concentración final de 2 x 106/ml en DMEM/F12 más DNasa (1 µg/ml, Sigma), SAB (2 mg/ml, Sigma), heparina (4 µg/ml, Sigma) y EDTA (200 µg/ml, Sigma). Las CMC derivadas de GBM se marcaron con 2 µg/ml de colorante Hoechst 33342 (Invitrogen) a 37 ºC durante 2 horas con mezcla intermitente. Como control inhibidor, se añadió verapamilo, bloqueador del canal de calcio, (Sigma) a una concentración final de 50 µM durante 10 min a temperatura ambiente antes de su marcaje con Hoechst 33342.

Al final de la incubación, las células se centrifugaron en frío y se volvieron a suspender en TFS enfriado con hielo. El yoduro de propidio (YP) (2 µg/ml de concentración final, Sigma) se añadió 5 min a temperatura ambiente antes del análisis de clasificación celular activado con fluorescencia (CCAF), que permite la discriminación de las células

15 muertas frente a las vivas.

El gen transportador ABC, ABCG2 (también conocido como Bcrp1), es uno de los mediadores principales del fenotipo de PL en médula ósea de ratón y otros tejidos. Se detectó la proteína ABCG2 en CMCs derivadas de GBM que realizan la tinción de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo monoclonal IgG2b de ratón (1:50, eBioscience) y un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen), como se ha descrito previamente.

Perfil del inmunofenotipo por citometría de flujo:

25 Se realizó un análisis de citometría de flujo como se ha descrito previamente. Se emplearon los siguientes anticuerpos primarios conjugados:

 ratón anti-CD133 conjugado con PE (0,25 µg, MACS)  ratón anti-CD44 conjugado con PE (20 µl/1 x 106 células, BD)  ratón anti-CD184, CXCR4, conjugado con APC (20 µl/1 x 106 células, BD)  ratón anti-CD81, TAPA1, conjugado con FITC (20 µl/1 x 106 células, BD)  ratón anti-CD15, SSEA1, conjugado con FITC (20 µl/1 x 106 células, BD)  ratón anti-CD117, cKit, conjugado con PE (0,2 µg, BD)

35 Las células se incubaron durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavaron y se volvieron a suspender en 0,5 ml de medio completo y se analizaron por citometría de flujo. Los controles de autofluorescencia y de isotipo se llevaron a cabo de forma rutinaria para todos estos ensayos.

Resultados: Como se apunta con claridad en la Figura 6, la PL de CMCs derivadas de GBM desapareció completamente o se redujo en gran medida por el tratamiento con efrinaA1-Fc y EphA2-Fc.

Las células se marcaron con Hoechst 33342 solo o en combinación con 100 µmol/L de verapamilo y después se analizaron por citometría de flujo. Las CMC derivadas de GBM tratadas con ligando o receptor soluble mostraron una población lateral de células de que no eran detectables, al igual que en presencia de verapamilo. Los datos

45 mostrados son gráficos de puntos representativos de al menos 2 experimentos independientes.

EphA2-Fc podría tener una implicación en las células madre tumorales o un enriquecimiento de la subpoblación de células iniciadoras del tumor. La cantidad o el patrón de la expresión de algunos marcadores disminuyó después de la estimulación de EphA2-Fc (datos no mostrados).

Ejemplo 8.

Efectos del receptor de efrinaA1-Fc soluble o EphA2-Fc soluble en la multipotencialidad de CMCs derivadas de GBM.

55 Para poder calificarse como células madre, las CMCs derivadas de GBM han de ser multipotentes. En este caso, se realizaron estudios de diferenciación para determinar la adquisición de un candidato de un fenotipo más diferenciado de CMCs derivadas de GBM tras el tratamiento con efrinaA1-Fc o EphA2-Fc. Las esferas clonales cultivadas en ausencia o presencia de efrinaA1 o EphA2-Fc se sometieron a una medición citofluorimétrica de la intensidad de la señal de fluorescencia.

Citometría de flujo:

Las esferas clonales del ensayo de autorrenovación se sometieron a análisis de CCAF y la expresión de los 65 marcadores neuronales se evaluó mediante marcadores específicos de linaje.

Para la cuantificación de los astrocitos (proteína ácida glial fibrilar, GFAP), las neuronas (βIII-tubulina) y los oligodendrocitos (galactocerebrosidaC, GalC), una mezcla de partículas de calibración rainbow (8 picos), 3,0-3,4 µm (BD Bioscience) se utilizó para la calibración y la intensidad del marcaje celular se expresó como moléculas de ficoeritrina equivalente (MEPE) o moléculas de fluoresceína equivalente (MEFL). En resumen, para la tinción 5 intracelular, las células se sembraron en presencia de 1,0 o 5,0 µg/ml de efrinaA1 durante 24 horas, después se volvieron a suspender y se permeabilizaron por medio de 0,5 ml de solución de Cytofix/Cytoperm (BD) a temperatura ambiente durante 30 min. Las células se lavaron con 2 ml de BD Perm/Wash 1X (BD) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Después de la centrifugación, se volvieron a suspender en 0,2 ml de solución de BD Perm/Wash 1X (BD) que contenía la mezcla de anticuerpo primario apropiado. Para antígenos de membrana, las células se volvieron a suspender en 0,2 ml de medio de crecimiento y después se incubaron durante 30 min a 4 ºC con los siguientes anticuerpos primarios: policlonal de conejo anti-GFAP (1:400, Dako Corporation), monoclonal de ratón anti-tubulina bill (1:400, Babco) y monoclonal de ratón anti-GalC (1:400, Chemicon). Las células se lavaron y se expusieron durante 30 min a + 4 ºC al anticuerpo secundario. En el caso de antígenos intracelulares, estos fueron anticuerpo de cabra anti-Ig de conejo marcado con FITC o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con PE

15 (BD) 1:800, mientras que para antígenos de membrana se utilizó F(ab')2 de IgM de cabra anti-ratón conjugada con FITC o IgM de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Jackson ImmunoResearch) 1:1000. Después de un extenso lavado, las células se volvieron a suspender y se analizaron por citometría de flujo.

Resultados: Como se muestra en la Figura 7, con relación a Fc de control, el ligando y el receptor solubles se indujeron por los cambios morfológicos evidentes de CMCs derivadas de GBM. Mediante el uso de la medición por citofluorimetría de la intensidad de la señal de fluorescencia, las células estimuladas con efrinaA1-Fc revelaron un aumento dependiente de la dosis en las moléculas de fluoresceína equivalente (MEFL) para la inmunorreactividad de glial (GFAP). La efrinaA1-Fc y EphA2-Fc desencadenan la adquisición de un fenotipo más maduro in vitro, que adquiere predominantemente un alcance similar astroglial y empobrece el agregado de CMCs derivadas de GBM

25 tumorigénicas. El histograma muestra la media ± EEM de la medición por triplicado.

Ejemplo 9.

Efectos del receptor de efrinaA1-Fc soluble o EphA2-Fc soluble en la apoptosis o ciclo celular de CMCs derivadas de GBM humano.

Análisis del ciclo celular: análisis y detección de BrdU/ADN

Para el análisis del ciclo celular, 1 x 106 células/muestra se cultivaron en presencia de efrinaA1-Fc (5 µg/ml) o EphA2

35 (5 µg/ml) durante 6, 24, 48 horas. Las células se expusieron a 20 µM de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU, 1:500, Sigma) durante 20 min a 37 ºC., se fijaron en etanol al 70 % en TFS y se mantuvieron a 4 ºC antes de la tinción (3.). El ADN se desnaturalizó con 1 ml de HCl 3N durante 20 min a TA y después el sedimento se incubó con 1 ml de Tween-20 al 0,5 % (Sigma) que contenía SAB al 1 % (Sigma) durante 15 min a TA. Las células se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-BrdU (1:10, BD) durante 60 minutos a TA en la oscuridad. El anticuerpo secundario empleado fue IgG de cabra anti-ratón conjugada con Alexa 488 (1:500, Invitrogen). Las células se volvieron a suspender en 2,5 µg/ml de yoduro de propidio (YP) en TFS y 7 µl de ARNasa (3 mg/ml) en agua, y se tiñeron durante la noche a 4 ºC en la oscuridad. Se realizó un análisis de BrdU/ADN biparamétrico con al menos 30.000 células para cada muestra por FACS-Calibur (BD Biosciences) y se analizaron los datos utilizando el software Summit 4.3.

45 Ensayo del marcado del extremo libre FITC por desoxi-transferasa terminal dUTP (TUNEL)

La apoptosis se midió utilizando el kit de ensayo TUNEL (Roche Diagnostics) siguiendo las instrucciones del fabricante para el parámetro de doble citometría de flujo. El análisis se realizó en un equipo FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron utilizando el software Summit 4.3 (Coulter).

Resultados: Como se ha medido por CCAF-Tunel y BrdU, en relación con las células control, ni el ligando soluble ni el receptor soluble indujeron la muerte/apoptosis celular o cambiaron las fases del ciclo de CMCs derivadas de GBM y CMNhs (datos no mostrados).

55

Ejemplo 10.

Efectos del receptor de efrinaA1-Fc soluble o EphA2-Fc soluble en la propagación, migración y en las vías intracelulares relacionadas implicadas de CMCs derivadas de GBM.

La sobreexpresión de EphA2 o la falta de activación es un jugador esencial también en la invasión de CMCs derivadas de GBM, provocando modificaciones del citoesqueleto o el mantenimiento de la fosforilación y la actividad de la quinasa FAK y de otras vías intracelulares.

65 Desde que la motilidad celular depende de las modificaciones del citoesqueleto, el papel de supresión oncogénico de efrinaA1-Fc y EphA2-Fc en el bloqueo de los reordenamientos del citoesqueleto y los cambios morfológicos de

CMCs derivadas de GBM se evaluó midiendo la frecuencia de las células que muestran los fascículos de anillos de actina F por faloidina.

También se determinó la eficacia del ligando o receptor soluble en la regulación de la motilidad y la capacidad de 5 invasión de las células vasculares.

Inmunotinción para marcadores del citoesqueleto:

CMCs derivadas de GBM se sembraron a una densidad de 2,5 x 104 células/cm2 en un cubreobjetos de vidrio recubierto con Cultrex (12 mm de diámetro) en ausencia o presencia de efrinaA1-Fc (5,0 µg/ml) o EphA2-Fc (5,0 µg/ml) durante 5 y 30 min. Para la tinción con F-actina, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos, se permeabilizaron con Triton-X 100 al 0,1 % (v/v) y se incubaron con faloidina marcada con Alexa555 (1:40, Invitrogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

15 Ensayos de migración:

Los ensayos de invasión se realizaron en cámaras Transwell de 24 pocillos (tamaño de poro de 8 um, 6,5 mm, 0,33 cm2, Corning Costar) como en Pennacchetti 2003 (10.). El lado superior de los filtros se recubrió con Cultrex y 1 x 105 células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (CEMDHs) se sembraron en 1,5 ml de DMEM/F12 en ausencia o presencia de EphA2-Fc (5,0 µg/ml). En el compartimento inferior, como estímulos positivos de migración, se añadió el factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV, 20 ng/ml) o las CMC derivadas de GBM en medio condicionado (1 ml de 1 x 106 células 1 día después de la siembra). Se añadieron estímulos en 2,6 ml de medio basal DMEM/F12 en ausencia o presencia de EphA2-Fc en el lado superior del filtro.

25 7-14 días después de la siembra, las células en el lado superior de los filtros se eliminaron mecánicamente, y las que migraron hacia el lado inferior se fijaron y tiñeron utilizando DiffQuick (Dade Behring) siguiendo las instrucciones del fabricante. La migración de las células se evaluó por valores de densidad de volumen adquiridos por un escáner densitómetro.

Membrana de Western:

Para determinar el resultado del tratamiento con efrinaA1-Fc o EphA2-Fc en el comportamiento maligno de las CMC derivadas de GBM, las células se sembraron en presencia de efrinaA1-Fc (1,0 o 5,0 µg/ml) o EphA2-Fc (5,0 µg/ml) durante el tiempo apropiado y después se lisaron. Se realizaron todos los procedimientos como se ha descrito

35 previamente.

Se emplearon los siguientes anticuerpos primarios:

 conejo anti-fosfo FAK (Tyr576/577, Tyr925) (1:1000, Cell Signaling)  conejo anti-p42/p44 MAPK total humano (ERK1/2) (1:1000, Cell Signaling)  conejo anti-fosfo-ERK1/2 humano (Thr202/Tyr204) (1:1000, Cell Signaling)  conejo anti-fosfo-Akt (Ser473) (1:1000; Cell Signaling)  conejo anti-fosfo-mTOR (Ser2481) (1:1000, Cell Signaling)  conejo anti-fosfo-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (1:1000, Cell Signaling)

45  conejo anti-E-cadherina humano (1:1000, Cell Signaling)  ratón anti-gelsolina humano (1:1000, Sigma)

Esta etapa fue seguida de la incubación con burro anti-conejo-HRP (1:10.000, GE) y conejo anti-ratón-HRP (1:10.000, GE).

La mezcla proteica cerebral humana (70 µg, Clontech) o el lisado proteico total de tumores cerebrales LYS054 humanos (70 µg, Abserotec) se utilizaron como controles tisulares.

Se detectaron asimismo las formas fosforiladas de ERK1/2 por inmunocitoquímica. Las células se sembraron en

55 cubreobjetos de vidrio recubiertos de Cultrex (Trevigen) en ausencia o presencia de efrinaA1-Fc (5,0 µg/ml) o EphA2-Fc (5,0 µg/ml) durante 1, 6 y 24 horas. Células en estado de reposo o células pre-tratadas con el inhibidor MEK1/2 UO126 (10 µm durante 2 horas, Cell Signaling) como control. La inmunocitoquímica se realizó con un policlonal de conejo anti-fosfo MAPK (t202/y204) (1:1000, Cell Signaling) e IgG con Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen) como se ha descrito previamente.

Resultados: Ni el receptor soluble ni el ligando soluble evitan la propagación celular. La adhesión y la propagación continúan de forma simultánea con cambios tanto en la actina como en el citoesqueleto de microtúbulos. El análisis de los reordenamientos del citoesqueleto expuestos en la Figura 8A, muestran con claridad que las CMCs derivadas de GBM no tratadas (a), que tienen un fenotipo altamente migratorio y se propagan bien en Cultrex, se caracterizan 65 por una morfología plana y poligonal, con un citoesqueleto de actina bien organizado, más filamentos de actina F

organizados densamente en las fibras de estrés y una morfología similar a fibroblastos. (Inserciones b-d) Los fascículos de actina similares a un anillo reúnen las características del comportamiento de las CMC derivadas de GBM. Por el contrario, las células tratadas con efrinaA1-Fc (e) y EphA2-Fc (f) se mantuvieron redondeadas, caracterizadas por células bipolares y alargadas y que no pueden propagarse, revelando microtúbulos menos

5 organizados con la positividad a actina F focal en los contactos célula-célula. Barra en paneles más grandes, 5 µm; Barra en paneles más pequeños, 10 µm.

Los datos que se muestran en el panel superior de la Figura 8B, confirman que la activación de EphA2 podría inhibir la adhesión celular, la propagación y la migración in vitro, induciendo la inactivación rápida y desfosforilación de FAK. Las células se cultivaron en ausencia (-) o presencia (+) de efrinaA1-Fc durante los periodos de tiempo indicados, y luego se lisaron. La disminución de la expresión de FAK fosforilada en los residuos de tirosina 576/577

o 925 en las células tratadas se evaluó a nivel proteico por membrana de Western. El nivel más marcado se observó 60 minutos después del tratamiento y tras 24 horas, FAK es una tirosina fosforilada de nuevo. Control de carga: GAPDH.

15 En particular, como se indica por ensayos de invasión de cultrex expuestos en la Figura 8B (panel inferior), también la migración in vitro de las células endoteliales que expresan EphA2 se inhibió de forma severa por la administración de EphA2-Fc recombinante. Las CEMDHs privadas de suero se sembraron en la parte superior de la cámara y se les permitió migrar al lado inferior de los filtros durante 6 horas. (a) CEMDHs en medio basal como control. En el compartimento inferior se añadió FCEV (20 ng/ml) o CMCs derivadas de GBM en medio condicionado, respectivamente, en ausencia (b, c) o presencia (e, f) de EphA2-Fc (5,0 µg/ml) en el lado superior de la cámara. IgG humana de control en el lado superior no afectó a la migración celular en respuesta a FCEV (d). Las células que migraron a la superficie inferior de la membrana se fijaron y se tiñeron como se describe en los métodos. Barra de escala, 200 µm.

25 Por último, se ha demostrado que la efrinaA1-Fc y EphA2-Fc pueden provocar la activación de las vías dependientes de MAP quinasa por la fosforilación de ERK1/2 en CMCs derivadas de GBM. Según se expone por inmunofluorescencia confocal en la Figura 8C, con relación al control tratado con Fc (a), se pudo detectar un aumento inmediato específico en la frecuencia de la positividad a ERK1/2 fosforilada 6 horas después de la adición de EphA2-Fc (c) o efrinaA1-Fc (d) en el medio de crecimiento. El nivel promedio de positividad observada se mantuvo estable durante 24 horas. (b) La fosforilación mediada por el receptor y el ligando solubles en los sitios de sustrato de ERK es abolida por el pre-tratamiento de las células con UO126, un inhibidor químico de la activación de MEK1. Barra de escala, 20 µm. El análisis por membrana de Western expuesto en el panel inferior de la misma Figura confirma que las concentraciones crecientes de efrinaA1-Fc potencian la activación de ERK1/2 en CMCs

35 derivadas de GBM. GAPDH proporcionó un control para la carga de la muestra. La efrinaA1-Fc podría incluso potenciar la señalización aguas abajo de MAPK, como una intensa activación de Akt y se detectó mTOR (datos no mostrados).

Ejemplo 11.

BMP4 impulsa una cascada pro-diferenciación de acontecimientos que conducen a el empobrecimiento de agregados de células madre cancerosas en GBM, tanto in vitro como in vivo (11.). A continuación, se muestra el efecto de los tratamientos con BMP4 y efrinaA1-Fc combinados.

45 PCR en tiempo real:

Las CMC derivadas de GBM se expusieron cuarenta y ocho horas a BMP4 humano recombinante (100 ng/ml, R&D). El ARN ADNc total y se obtuvieron como se ha descrito previamente y, posteriormente se realizó un análisis cuantitativo para la expresión de EphA2. Las reacciones de RT-PCR cuantitativa se realizaron por triplicado utilizando un SYBR Verde Green QPCR Core Reagent Kit (Stratagene). El colorante SYBR Green se une a cualquier producto de PCR, y, por lo tanto, no requiere el uso de sondas específicas para la secuencia. La emisión fluorescente se registró en tiempo real (Chromo 4 Four-Color Real-Time PCR Detector, MJ). El perfil de expresión génica se completó utilizando el método comparativo Ct de cuantificación relativa. Las cantidades relativas de ARN se normalizaron con dos controles endógenos, GAPDH y ARN ribosomal 18S (ARNr 18S).

55 Curvas de crecimiento:

CMCs derivadas de GBM se sembraron en presencia de efrinaA1-Fc (1,0 µg/ml o 5,0 µg/ml) y en presencia de respectivamente BMP4 (100 ng/ml, R&D) o factor inhibidor de leucemia (FIL, 10 ng/ml, Chemicon), un fuerte regulador de la diferenciación neuronal en la progenie de células madre del SNC humano. El índice de proliferación celular se evaluó con el análisis de las curvas de crecimiento, como se ha descrito previamente.

Resultados: Como se muestra en la Figura 9, la exposición de rhBMP4 incita a la disminución proteica de EphA2 en CMCs derivadas de GBM a través de la diferenciación y el empobrecimiento del agregado de CMCs derivadas de

65 GBM. (a) Análisis de QRT-PCR con cebadores específicos reveló la disminución del transcrito de EphA2, normalizado con GAPDH, en las células tratadas con rhBMP4 en comparación con los controles emparejados. El

histograma muestra medias normalizadas ± EEM cuantificadas a partir de 3 experimentos diferentes representativos de dos líneas de CMCs derivadas de GBM. Además, como se apunta en la Figura 9(b), rhBMP4 provoca efectos inhibidores en efrinaA1-Fc en CMCs derivadas de GBM y la proliferación de CMNhs. No se detectaron diferencias en la cinética de crecimiento entre CMCs derivadas de GBM cultivadas con efrinaA1-Fc en ausencia o presencia de

5 rhBMP4, siendo la primera caracterizada por una tasa de crecimiento más rápido y el último comprende CMCs derivadas de GBM que se dividen gradualmente. Las curvas de crecimiento en b son representativas de una línea de CMCs derivadas de GBM.

Los mismos resultados se recogieron después de la estimulación con FIL (datos no mostrados).

Ejemplo 12.

Efectos de la administración de efrinaA1-Fc y EphA2-Fc en el crecimiento de xenoinjertos tumorales subcutáneos (SC) de CMCs derivadas de GBM humano.

15 Se sabe que la sobreexpresión de EphA2 causa tumorigénesis. Además, los parámetros críticos de células madre de CMCs derivadas de GBM analizados previamente, tales como la simetría general de división y la actividad relacionada con la autorrenovación, están linealmente correlacionados con la capacidad iniciadora del tumor de estas células. Los efectos de la disminución de EphA2 de la expresión o de la actividad por medio de efrinaA1-Fc o EphA2-Fc se ensayaron in vivo.

En este caso, se ha evaluado si la reducción in vitro del agregado de CMCs derivadas de GBM tumorigénicas se relaciona con un descenso similar en la capacidad de las células tratadas con efrinaA1-Fc o EphA2-Fc para formar tumores in vivo en xenoinjertos subcutáneos (SC).

25 Para las inyecciones SC, se emplearon ratones nu/nu atímicos inmunocomprometidos (hembra con 3-4 semanas de vida, Charles River). Los xenoinjertos tumorales subcutáneos de GBM humano se establecieron mediante la inyección de 3 x 106 de CMCs derivadas de GBMh en el flanco derecho de los ratones como receptores, utilizando una aguja de calibre 23, en 100 µl de TFS mezclado con un volumen equitativo de Cultrex (Trevigen).

Los ratones se vigilaron 7-35 días, los reactivos se administraron 1x/día durante 35 días cerca del sitio de la inyección de CMCs derivadas de GBM (inyección peritumoral).

Para ensayar la capacidad del ligando/receptor soluble para reducir CMCs derivadas de GBM con capacidad de 35 iniciación tumoral y prevenir el establecimiento y crecimiento de tumores, los animales se asignaron al azar en:

 Control del vehículo: tras el trasplante de células, estas recibieron una inyección peritumoral de 100 µl de solución salina;  EfrinaA1-Fc (grupo co-tratado): el trasplante de células se acompañó al mismo tiempo por una inyección peritumoral de 100 µl de efrinaA1-Fc en solución salina (10 ug/dosis);  EphA2-Fc (grupo co-tratado): el trasplante de células se acompañó por una inyección peritumoral de 100 µl de EphA2-Fc en solución salina (10 µg/dosis);  EphA2-Fc (grupo post-tratado): el tumor se dejó crecer 7-10 días después del trasplante de células, a continuación, los ratones recibieron una inyección peritumoral con 100 µl de EphA2-Fc (formación post-tumoral) 45 (10 µg/dosis).

Las mediciones tumorales se determinaron con un calibrador pie de rey una vez por semana y se expresaron como volúmenes absolutos, así como volúmenes tumorales normalizados a individuales en el día 1, el inicio de la dosificación (volúmenes tumorales relativos) para evaluar los cambios en la tasa de crecimiento tumoral en relación con el tratamiento.

imagen9

Los pesos corporales de los animales se determinaron y se analizaron sobre un curso temporal similar. Los

55 xenoinjertos tumorales de CMCs derivadas de GBM de los animales tratados con efrinaA1-Fc y EphA2-Fc del control se extirparon, se post-fijaron y se crioprotegieron como se ha descrito posteriormente. Las secciones en serie de diez micrómetros de grosor se inmunomarcaron con los siguientes anticuerpos/antisueros: IgG1 de ratón antinúcleos humano (1:100, Chemicon), IgG1 de ratón anti-mitocondria humano (1:50, Chemicon) e IgG2a de ratón antiHLA-abc humano (1:100, Dako) para confirmar la naturaleza del tumor en humanos. IgG de conejo anti-Ki67 (1:1000, Novocastra) para la detección del índice de proliferación. Después de un enjuague minucioso, las secciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario apropiado: IgG de cabra anti-ratón o anti-conejo con Alexa Fluor 488-546 (1:1000, Invitrogen). Las secciones se lavaron y se cubrieron con Fluorsave.

Se realizaron tinción de hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica. Las muestras se vieron y fotografiaron con un 65 microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot-2 y microscopio confocal Leica DMIRE2. No se observó marcado

alguno en los experimentos de control cuando se omitieron los anticuerpos o antisueros primarios o, alternativamente, cuando se utilizó suero normal no inmune.

Resultados: Como se muestra con claridad en la Figura 10, La administración de efrinaA1-Fc o EphA2-Fc inhibió

5 fuertemente la capacidad tumorigénica de CMCs derivadas de GBM humano y la progresión tumoral en el modelo murino subcutáneo. La administración de efrinaA1-Fc/EphA2-Fc in vivo impide el establecimiento y el crecimiento de tumores subcutáneos. El tratamiento de tumores preestablecidos con un receptor soluble produjo una caída importante de su crecimiento in vivo. Las CMC derivadas de GBM se inyectaron en el flanco derecho de ratones nu/nu. La solución salina (vehículo de control) o reactivos (co-tratamiento con efrinaA1-Fc o EphA2-Fc) se administraron diariamente alrededor del tapón (100 µl/dosis) desde la inyección de las células. Para el análisis del post-tratamiento hasta conseguir los volúmenes (7 días), los ratones desnudos portadores de un tumor recibieron 100 µl/dosis diaria. La gráfica muestra la media ± EEM en los cuatro grupos de seis ratones.

Ejemplo 13.

15 Efectos de la exposición de CMCs derivadas de GBM a efrinaA1-Fc y EphA2-Fc in vitro sobre su capacidad para iniciar xenoinjertos de tumores ortotópicos.

Para evaluar la eficacia antitumoral de las moléculas del receptor y del ligando solubles (por disminución de la expresión o actividad de EphA2) en el crecimiento tumoral, se empleó un modelo tumoral ortotópico clínicamente más relevante.

Con el fin de confirmar y ampliar los resultados obtenidos en el modelo SC, se realizaron experimentos de pretratamiento. Después de cuarenta y ocho horas de exposición al ligando o receptor soluble (5,0 µg/ml), CMCs

25 derivadas de GBM (infectadas con el gen indicador de la luciferasa, CMCs derivadas de GBM infectadas con el gen indicador de luc) se inyectaron en el cuerpo estriado de los ratones idcs/bg. Esto permitió determinar si la exposición transitoria al ligando de efrina podría reducir/suprimir la tumorigenicidad en CMCs derivadas de GBM.

Infección lentiviral de CMCs derivadas de GBM.

Las CMC derivadas de GBM se infectaron con un gen indicador de luciferasa de luciérnaga.

Se emplearon recientemente vectores lentivirales generados en los que los promotores bidireccionales sintéticos median la transcripción coordenada de dos ARNm y permiten una transferencia eficaz del gen doble. (2.).

35 Este vector proviral consiste en un promotor bidireccional realizado por elementos del promotor del núcleo mínimo de citomegalovirus humano (CMVm) unido aguas arriba, y en orientación opuesta, de un promotor eficiente, de la fosfoglicerato quinasa humana (PGK). El diseño del vector pone a disposición la luciferasa de luciérnaga (luc f) y la proteína fluorescente verde (PFV) como genes promotores, que se explotarán i) in vitro, para enriquecer las células que expresan transgenes por CCAF, por dilución limitante o por análisis Ivis Imaging Xenogen In vivo; ii) in vivo, para controlar con facilidad la distribución de las células tumorales en el cerebro. LV de tercera generación pseudotipado con VEV se producirá por una co-transfección transitoria con 4 plásmidos en células 293T y se concentró por ultracentrifugación.

45 El título de la expresión de los vectores se estimó en células HeLa mediante dilución limitante. Las partículas del vector se midieron por inmunocaptura del antígeno gag p24 del VIH-1. La infectividad del vector se calculó como la relación entre el título y las partículas de cada vector. Las CMC derivadas de GBM se expusieron al sobrenadante, condicionado de las células 293T transfectadas durante la noche, durante 16 horas. A continuación, el virus que contenía el medio se eliminó y se reemplazó por medio fresco (CMCs derivadas de GBM infectadas con el gen indicador de luc).

La eficacia de la infección se evaluó mediante el recuento del número de células que expresan PVF o por análisis de Lumina in vivo.

55 Las células bioluminiscentes se diluyeron en serie a partir de 5.000 a 100 células en medio completo en placas de 96 pocillos con fondo transparente, negro (Nunc). Se añadió D-luciferina (ONE-Glo, sistema de ensayo de luciferasa, Promega) 1:1 (v/v) a cada pocillo (que contenía las células individuales suspendidas de nuevo en 100 µl de medio completo) 3 minutos antes del diagnóstico por imágenes. El tiempo del diagnóstico por imágenes fue de 1 min/placa.

Trasplante de CMCs derivadas de GBM en el cuerpo estriado de ratones idcs/bg.

Las CMCs derivadas de GBM infectadas con el gen indicador de luc se sembraron en ausencia o presencia de efrinaA1-Fc (5 µg/ml) o EphA2-Fc (5 µg/ml) 48 horas antes de la inyección ortotópica. 3 µl de una suspensión de 1 x 105 células/ul en DMEM con DNasa (1:1000, Sigma) se administraron al cuerpo estriado derecho (0,2 µl/min)

65 mediante una inyección estereotáctica a través de un electrodo de vidrio conectado a una jeringa Hamilton. Todas las inyecciones se realizaron durante un periodo de 6 minutos para asegurar el cumplimiento del parénquima óptimo.

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Claims (1)

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