JPH10512143A - ヒトｐａｋ６５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なヒトセリンタンパク質キナーゼ、ｈＰＡＫ６５と呼ぶヒトｐ２１タンパク質活性化セリンキナーゼｐ６５タンパク質、およびその製造方法および使用が提供される。ｈＰＡＫ６５をコードする核酸およびｈＰＡＫ６５の製造、ならびにｈＰＡＫ６５類似体の製造および同定におけるそれらの使用方法が提供される。ｈＰＡＫ６５タンパク質およびそのタンパク質断片、例えば、少なくとも１つのｈＰＡＫ６５活性を保持するものの使用方法が提供され、これらの方法はｈＰＡＫ６５活性を変調する候補について物質のライブラリーをスクリーニングすることを包含する。ｈＰＡＫ６５とｒｈｏ様ｐ２１ＧＴＰアーゼの相互作用、特にｈＰＡＫ６５に対するｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓの結合、および引き続いてｈＰＡＫ６５セリンタンパク質キナーゼ活性の活性化を変調し、ｈＰＡＫ６５セリンタンパク質キナーゼ活性を変調し、そしてｐ２１タンパク質ＧＴＰアーゼ活性に対するｈＰＡＫ６５の作用を変調する物質を同定する方法が提供される。このような変調物質は、ｈＰＡＫ６５およびｐ２１タンパク質のシグナルトランスダクション経路に関係する、新形成、リンパ球増殖性症状、関節炎、炎症、自己免疫疾患、アポプトーシス、およびその他の治療のための化学療法剤を提供するすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＰＡＫ６５ 序論 技術分野 本発明は、ヒトｐ２１活性化キナーゼｐ６５（「ｈＰＡＫ６５」）核酸または タンパク質の配列を含有する組成物の調製および使用する方法に関する。 背景 ｒｈｏ様タンパク質（すなわち、ｐ２１タンパク質）は、ＧＴＰ結合形態と不 活性ＧＤＰ結合状態との間の、他のＧＴＰアーゼのサイクルに似る（Ｎｏｂｅｓ およびＨａｌｌ、１９９４）。これらの形態の調節は、グアニンヌクレオチド交 換因子（「ＧＥＦ」）、例えば、Ｄｂ１およびＧＴＰアーゼ活性化タンパク質を 包含するいくつかのタンパク質により制御されることが示された（Ｈａｒｔ ｅ ｔ ａｌ．、１９９１、ＢｏｇｕｓｋｉおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９９３） 。ＲｈｏＡ、Ｂ、Ｃ、ｒａｃ１、２、ＣＤＣ４２ｈＡ（「ＣＤＣ４２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ」）、およびＴＣ１０を包含する、タンパク質のｒｈｏファミリ ーのメンバーは、互いと少なくとも５０％の配列の同一性、および他のｒａｓ様 タンパク質と３０％の同一性を共有する（ＮｏｂｅｓおよびＨａｌｌ、１９９４ ）。ｒｈｏおよびｒａｃタンパク質の生理学的機能の洞察は、Ｒｉｄｌｅｙおよ びＨａｌｌが記載した最近の報告（ＲｉｄｌｅｙおよびＨａｌｌ、１９９２；Ｒ ｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９９２）から発し、ここにおいて、ｒｈｏおよび ｒａｃタンパク質がＳｗｉ ｓｓ ３Ｔ３繊維芽細胞の中にマイクロインジェクションされたとき、急速な細 胞骨格効果が検出された。活性化されたｒｈｏは応力繊維形成および接着域を誘 発する（ＲｉｄｌｅｙおよびＨａｌｌ１９９２）が、活性化されたｒａｃは膜の 波打ちおよびラメリポジウムの形成を誘発する（Ｒｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、 １９９２）。ｒｈｏタンパク質は、また、細胞骨格の再配列、例えば、細胞の運 動性（Ｔａｋａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３）、細胞質分裂（Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３）およびリンパ球凝集（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａ ｌ．、１９９３）に関連する他の生理学的役割に関係づけられる。 ＣＤＣ４２の生理学的機能は酵母における芽の形成において必須であることが 示された（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｉｎｇｌｅ １９９０）が、同様な生理学 的機能はその哺乳動物の相同体ＣＤＣ４２Ｈｓについて記載されている。しかし ながら、哺乳動物細胞におけるその役割におけるヒントは、プロトオンコジーン Ｄｂ１がｒｈｏおよびＣＤＣ４２Ｈｓに対するＧＥＦ活性を示す研究から来る（ Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。新形成状態への細胞の形質転換における ｒｈｏ様タンパク質の役割が、この観察から示唆される。しかしながら、Ｄｂ１ ドメインを含有するすべてのタンパク質がｒｈｏ様タンパク質に対するヌクレオ チド交換活性を示すわけではない。例えば、ｖａｖ（Ｇｕｌｂｉｎｓ ｅｔ ａ ｌ．、１９９３）、Ｅｃｔ２（Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３）、ｒａｓＧ ＲＦおよびｂｃｒ（ＢｏｇｕｓｋｉおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ １９９３）はｒ ｈｏに対してヌクレオチド交換活性を示さず、そしてｂｃｒおよびｒａｃＧＲＦ のＤｂ１ドメインは細胞を形質転換しない。最近の研究は、ｖａｖおよびＤｂ１ の形質転換がｒｈｏにより仲介されることを証明することによって、生体内にお けるｒｈｏお よびＤｂ１についての直接リンクを示唆している（Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。 ｐ２１タンパク質は、細胞増殖の制御を導くシグナルトランスダクションのメ カニズムの内部成分であることが知られている。多数の病理的状態は、少なくと も一部分、細胞の増殖または分化の異常な制御から生ずる。例えば、新形成は、 正常の細胞増殖制御シグナルに対して応答する能力が減少した、クローン的に誘 導された細胞集団により特徴づけられる。細胞のオンコジーンの形質転換は、細 胞の代謝、生理学的、および形態学の多数の変化に導く。オンコジーン的に形質 転換された細胞の１つ特徴的な変更は、通常、細胞成長調節遺伝子の適当な発現 により付与される、細胞の増殖および分化への拘束に対する応答の喪失である。 ｒｈｏ様タンパク質のエフェクター分子は、現在、わずかしか知られておらず 、ラット脳キナーゼ（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）およびＮＡＤＰ Ｈオキシダーゼのｐ６７−ｐｈｏｘ（Ｄｉｅｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９ ４）を包含する。食細胞の分子の機能の研究から、ｒａｃ１および２はＮＡＤＰ Ｈオキシダーゼによるスーパーオキシドの発生の制御に関係づけられることが証 明された（Ａｂｏ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｋｎａｕｓ ｅｔ ａｌ．、１９ ９１）。活性化されたｒａｃは、２つの他のオキシダーゼ細胞質ゾル成分、ｐ４ ７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘと一緒に、膜結合シトクロムｂ558 と集合 して、活性なオキシダーゼを形成する（ＳｅｇａｌおよびＡｂｏ １９９３）。 この系におけるｒａｃのエフェクター分子はｐ６７−ｐｈｏｘである（Ｄｉｅｋ ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。ｒａｃおよびＣＤＣ４２Ｈｓの追加の分 子のエフェクターは、ラット脳セリン／スレオニンキナーゼであることが示され 、これはｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓ により活性化される（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。他の研究は、 ＣＤＣ４２Ｈｓおよびｒｈｏが、また、Ｐ１３キナーゼを活性化することを示唆 した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９３；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９ ９４）。 生理学的経路および疾患の状態、例えば、細胞構造の完全性におけるｒｈｏ様 ｐ２１タンパク質の潜在的な、様々な役割、細胞の運動性、細胞質分裂、リンパ 球細胞の凝集、腫瘍細胞の形質転換および増殖、転移、細胞の凝集に関連する生 理学的役割、およびこれらの生理学的経路の１または２以上におけるこれらのタ ンパク質の活性を選択的に影響を与えるか、または変調する分子および物質の理 解の不足、にかんがみて、エフェクターおよびモジュレーターの活性を有する化 合物および物質、およびこれらおよび関係する組成物および物質を同定する方法 がこの分野において要求されている。さらに、このような物質は、細胞の増殖、 分化、および他のｐ２１に関係する状態を抑制する、商用研究試薬として働くこ とができる。形質転換された表現型および新形成の基礎となる分子のメカニズム のいっそう明らかにされたモデルの開発の進歩にかかわらず、従来の化学療法を 越えた癌の治療に適用可能な有意な得られた治療法はわずかである。このような ｐ２１タンパク質の変調剤は、新形成、リンパ液増殖の症状、関節炎、炎症、自 己免疫疾患、アポプトーシス、およびその他の治療のための新規な治療剤を提供 するすることができる。これらおよび他の目的は本発明により提供される。 関係する文献 １．Ｎｏｂｅｓ、Ｃ．およびＨａｌｌ、Ａ．（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌ．４、７７−８１。 ２．Ｈａｒｔ、Ｍ．Ｊ．、Ｅｖａ、Ａ．、Ｅｖａｎｓ、Ｔ．、Ａ ａｒｏｎｓｏｎ、Ｓ．Ａ．、Ｃｅｒｉｏｎｅ、Ｒ．Ａ．（１９９１）Ｎａｔｕｒ ｅ ３５４、３１１−３１４。 ３．Ｂｏｇｕｓｋｉ、Ｍ．Ｓ．、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、Ｆ．（１９９３）Ｎａ ｔｕｒｅ ３６６、６４３−３５４。 ４．Ｒｉｄｌｅｙ、Ａ．Ｊ．、Ｈａｌｌ、Ａ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０、 ３８９−３９９。 ５．Ｒｉｄｌｅｙ、Ａ．Ｊ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｈ．Ｆ．、Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎ、Ｃ．Ｌ．、Ｄｉｅｋｍａｎ、Ｄ．、Ｈａｌｌ、Ａ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０、４０１−４１０。 ６．Ｔａｋａｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｋｉｋｕｃｈｉ、Ａ．、Ｋｕｒｏｄａ、Ｓ．、 Ｋｏｔａｎｉ、Ｋ．、Ｓａｓａｋｉ、Ｔ．、Ｔａｋａｉ、Ｙ．（１９９３）、Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、７２−７９。 ７．Ｋｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｓｏｓａｋｉ、Ｔ．、Ｋｕｒｏｄａ、Ｓ．、Ｉｔａｈ 、Ｔ．、Ｔａｋａｉ、Ｙ．（１９９３）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２０、１ １８７−９５。 ８．Ｔｏｍｉｎａｇａ、Ｔ．、Ｓｕｇｉｅ、Ｋ．、Ｈｉｒａｔａ、Ｍ．、Ｆｕ ｋａｔａ、Ｊ．、Ｕｃｈｉｄａ、Ａ．、Ｉｍｕｒａ、Ｈ．，Ｎａｒｕｍｉｙａ、 Ｓ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２０、１５２９−１５３７。 ９．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ．、Ｐｒｉｎｇｌｅ、Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ ．Ｂｉｏｌ．１１１、１４３−１５２。 １０．Ｇｕｌｂｉｎｓ、Ｅ．、Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ、Ｋ．Ｍ．、Ｂａｉｅｒ 、Ｇ．、Ｋａｔｚａｖ、Ｓ．、Ｂｕｒｎ、Ｐ．、Ａｌｔｍａｎ、Ａ．（１９９３ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０、８２２−８２５。 １１．Ｍｉｋｉ、Ｔ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．Ｌ．、Ｌｏｎｇ、Ｊ． Ｅ．、Ｅｖａ、Ａ．、Ｆｌｅｍｍｉｎｇ、Ｔ．Ｐ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２、４６２−４６５。 １２．Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ、Ｒ．、Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋａ−Ｗｏｄｎ ｉｃｋａ、Ｍ．、Ｓｏｌｓｋｉ、Ｐ．Ａ．、Ｅｖａ、Ａ．、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ、 Ｋ．、Ｄｅｒ、Ｃ．Ｊ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、６８ ４８−６８５７。 １３．Ａｂｏ、Ａ．、Ｐｉｃｋ、Ｅ．、Ｈａｌｌ、Ａ．、Ｔｏｔｔｙ、Ｎ．、 Ｔｅａｈａｎ、Ｃ．Ｇ．、Ｓｅｇａｌ、Ａ．Ｗ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３ ５３、６６８−６７０。 １４．Ｋｎａｕｓ、Ｕ．Ｇ．、Ｈｅｙｗｏｒｔｈ、Ｐ．Ｇ．、Ｅｖａｎｓ、Ｔ ．、Ｃｕｒｎｕｔｔｅ、Ｊ．Ｔ．Ｂｏｋｏｃｈ、Ｇ．Ｍ．（１９９１）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５４、１５１２−１５１５。 １５．Ｓｅｇａｌ、Ａ．Ｗ．、Ａｂｏ、Ａ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８、４３−４７。 １６．Ｄｉｅｋｍａｎｎ、Ｄ．、Ａｂｏ、Ａ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｃ．、Ｓ ｅｇａｌ、Ａ．Ｗ．、Ｈａｌｌ、Ａ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５、５ ３１−５３３。 １７．Ｍａｎｓｅｒ、Ｅ．、Ｌｅｕｎｇ、Ｔ．、Ｓａｌｈｕｄｄｉｎ、Ｈ．、 Ｚｈａｏ、Ｚ．、Ｌｉｍ、Ｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６７、４０−４６ 。 １８．Ｚｈｅｎｇ、Ｙ．、Ｂａｇｒｏｄｉａ、Ｓ．、Ｃｅｒｉｏｎｅ、Ｒ．Ａ ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１８７２７−１８７３０。 １９．Ｚｈａｎｇ、Ｊ．、Ｋｉｎｇ、Ｗ．Ｇ．、Ｄｉｌｌｏｎ、Ｓ．、Ｈａｌ ｌ、Ａ．、Ｆｅｉｇ、Ｌ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｓ．Ｅ．（１９９３）、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２２２５１−４。 ２０．Ａｂｏ、Ａ．、Ｗｅｂｂ、Ｍ．Ｒ．、Ｇｒｏｇａｎ、Ａ．、Ｓｅｇａｌ 、，Ａ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９４）２９８、５８５−５９１。 ２１．Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｈ．およびＳｕｚｕｋｉ、Ｋ．（１９９０）Ａｎａ ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６、２６４−２６８。 ２２．Ｔｏｔｔｙ、Ｎ．Ｆ．、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ｍ．Ｄ．、Ｈｓｕａｎ 、Ｊ．Ｊ．（１９９２）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．１、１２１５−１２２４。 ２３．Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ、Ｔ．、Ｓｃｈｅｉｄｔｍａｎｎ、Ｋ．Ｈ． 、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｍ．Ａ．、Ｅｃｋｈａｒｔ、Ｗ．、Ｇｅｒｎｏｔ、Ｗ ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２、７ ９５２−７９５４。 ２４．Ｓｈａｃｔｅｒ、Ｅ．（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８ 、４１６−４２０。 ２５．Ｃｏｏｐｅｒ、Ａ．Ｊ．、Ｓｅｆｔｏｎ、Ｂ．Ｍ．、Ｈｕｎｔｅｒ、Ｔ ．（１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９９、３７。 ２６．Ｍａｎｓｅｒ、Ｅ．、Ｌｅｕｎｇ、Ｔ．、Ｍｏｎｆｒｉｅｓ、Ｃ．、Ｔ ｅｏ、Ｍ．、Ｈａｌｌ、Ｃ．、Ｌｉｍ．Ｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６７、１６０２５−１０６２８。 ２７．Ｂａｍｅｒ、Ｓ．Ｗ．およびＤａｖｉｓ、Ｒ．Ｗ．（１９９３）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０、４５２−４５６。 ２８．Ａｖｒｕｃｈ、Ｊ．、Ｚｈａｎｇ、Ｘ．、Ｋｙｒｉａｋｉｓ、Ｊ．（１ ９９４）Ｔｒｅｎｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９、２７９−２８４。 ２９．Ｌｅｂｅｒｅｒ、Ｅ．、Ｄｉｇｎａｒｄ、Ｄ．、Ｈａｒｃ ｕｓ、Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｄ．Ｙ．、Ｗｈｉｔｅｗａｙ−Ｍ．（１９９２ｂ） ＥＭＢＯ Ｊ．、１１、４８０５−４８１３。 ３０．Ｅｒｒｅｄｅ、Ｂ．、Ｌｅｖｉｎ、Ｄ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏ ｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５、２５４−２６０。 ３１．Ｅｒｒｅｄｅ、Ｂ．、Ｇａｒｔｎｅｒ、Ａ．、Ｚｈｏｕ、Ｚ．、Ｎａｓ ｍｙｔｈ、Ｋ．、Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｇ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２、２ ６１−２６４。 ３２．Ｌｅｂｅｒｅｒ、Ｅ．、Ｄｉｇｎａｒｄ、Ｄ．、Ｈａｒｃｕｓ、Ｄ．、 Ｈｏｕｇａｎ、Ｌ．、Ｗｈｉｔｅｗａｙ、Ｍ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｄ．Ｙ．（１９ ９３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１、２４１−２５４。 ３３．Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ、Ｊ．、Ａｌｂｒｉｇｈｔ、Ｇ．Ｆ．、Ｆｏｓｔｅ ｒ、Ｌ．Ｃ．、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ．Ａ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９ 、１５３−１５４。 発明の要約 本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは新 規なヒトｐ２１タンパク質活性化セリンキナーゼｐ６５タンパク質（「ｈＰＡＫ ６５」）をコードする核酸配列を含んでなる。本発明は、好ましくは第２Ａ図（ 配列番号：１）に記載されているような、ｈＰＡＫ６５をコードする核酸配列と 、前記配列に対して相補的な核酸配列と、その配列のｈＰＡＫ６５コーディング 配列内の縮重コドン置換を含有する核酸配列と、その配列に対して少なくとも９ ５％の相同性を有する密接に関係する変異型と、それらの配列からの少なくとも １０塩基長さを有しかつｈＰＡＫ６５をコードする核酸に選択的にハイブリダイ ゼーションする断片とを有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。核酸配 列は好ましく は天然に見出されるものであるが、本発明にかんがみて、これらの配列を含有す るポリヌクレオチドは、合成方法を包含する、多数のこの分野において知られて いる方法により製造することができる。また、ある種の望ましい性質、例えば、 構成的セリンキナーゼ活性、ｐ２１タンパク質結合活性、および精製および同定 の容易さを有するポリペプチドを提供する、ｈＰＡＫ６５組換え構築物、例えば 、融合物、トランケーション、置換物が提供される。 また、本発明のポリヌクレオチドの中に見出される配列を含有する、単離およ び精製されたｈＰＡＫ６５タンパク質が提供される。天然源からの単離、合成的 製造、および本発明により提供される核酸配列を使用する組換え製造を包含する 、ｈＰＡＫ６５タンパク質を調製するための方法が提供される。本発明は、ヒト ｈＰＡＫ６５蛋白質、および第２Ａ図に描写されているアミノ酸配列を有する、 その断片を提供する。 本発明は、単離されたポリヌクレオチドが用いられる宿主細胞における発現の ために適当な発現ベクターに作用可能に連結された場合に、本発明の単離された ポリヌクレオチドを発現するためのベクターおよび形質転換された宿主細胞を包 含する。 セリンタンパク質キナーゼ活性を有する本発明の単離されたタンパク質は、リ ン酸化されたタンパク質およびアミノ酸を生成するために使用される。本発明の ペプチドは、また、ＰＡＫ−６５に関係するシグナルのトランスダクション経路 および疾患の状態におけるＰＡＫ６５およびＰＡＫ６５複合体の検出アッセイお よび単離方法のための抗体を生成するために使用される。本発明の単離されたポ リヌクレオチドは、ＰＡＫ６５に関係するシグナルのトランスダクション経路お よび疾患の状態の分析、特にアンチセンス処置においてさらに使用することがで きる。 本発明は、また、ｈＰＡＫ６５の性質を変調または阻害する能力について、物 質のライブラリーをスクリーニングする組成物および方法を提供し、ＰＡＫ６５ の性質は、本明細書において開示するように、タンパク質キナーゼ活性、ｐ２１ タンパク質結合活性、ｐ２１タンパク質誘導自己リン酸化活性、およびｐ２１結 合ホスフェート遊離活性を包含する。好ましくは、このような物質はヒトＰＡＫ ６５のｒａｃ１−およびＣＤＣ４２Ｈｓ−相互作用性質を変調する。本発明は、 ヒトおよび動物の被検体における新形成を治療または予防する組成物および方法 、細胞の増殖および／または細胞の分化を調節する薬理学的活性について物質の ライブラリーをスクリーニングする組成物および方法、試験管内における形質転 換された細胞表現型の変調のための組成物および方法を提供し、バイオプロセス 制御における使用および商用実験室試薬として使用を包含する。本発明は、また 、ｈＰＡＫ６５に関連する性質の少なくとも１つを変調することができる物質を 含む、哺乳動物におけるｈＰＡＫ６５依存性疾患を抑制するための医薬組成物、 およびｈＰＡＫ６５に関連する性質の１つを変調することができる物質のｈＰＡ Ｋ６５キナーゼ依存性疾患抑制量を、ｈＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患に罹った 哺乳動物に投与することを包含する、ｈＰＡＫ６５依存性疾患を抑制する方法に 関する。哺乳動物は通常の意味を有し、ヒトを包含する。薬理学的使用は、獣医 学的使用、特に家畜化された動物、例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、 ネコ、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、ラットおよびマウスを包含すること を意図する。 図面の簡単な説明 第１Ａ図および第１Ｂ図は、好中球細胞質ゾルの分画を描写する。第１Ｂ図は モノ−Ｑカラム上の好中球細胞質ゾルの分画を描写し 、このカラム上に１０ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を適用し、３０ｍｌの塩勾配で溶 離した。実施例の節において詳しく記載するように、プローブとして［γ−³²Ｐ ］ＧＴＰ ＣＤＣ４２Ｈｓ（第１Ａ図）を使用するオーバーレイアッセイにより 、集めた画分を分析した。 第２Ａ図、第２Ｂ図、および第２Ｃ図は、ヒトＰＡＫ６５（「ｈＰＡＫ６５」 ）のヌクレオチド（配列番号：１）および推定されたアミノ酸配列（配列番号： ２）を描写する。ｈＰＡＫ６５ｃＤＮＡをヒト胎盤ライブラリーからクローニン グした。第２ａ図は、ヒトＰＡＫ６５ｃＤＮＡの核酸配列およびその推定された アミノ酸配列を表す。第２Ａ図において、下線が引かれているアミノ酸はｐ６５ の精製から得られたペプチド配列に対応する。第２Ｂ図は、ｈＰＡＫ６５の推定 されたアミノ酸配列とラット脳ＰＡＫ６５との間の比較を描写する。第２Ｃ図は 、ｈＰＡＫ６５の推定上のキナーゼドメインと酵母ＳＴＥ２０との間の比較を描 写する。 第３Ａ図、第３Ｂ図および第３Ｃ図は、組織および細胞系におけるｈＰＡＫ６ ５のノーザンブロット分析を表す。ｈＰＡＫ６５ｃＤＮＡのキナーゼドメイン（ ヌクレオチド配列１００９〜１９１２）からＰＣＲにより発生された、放射性標 識化プローブを使用して、ノーザンブロット上に固定化された種々の組織から単 離されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた。オートラジオグラフを３時 間露出した。 第４図は、ｒｈｏ様タンパク質の間のｈＰＡＫ６５結合特異性を描写する。８ ０μｇの好中球細胞質ゾルまたは２〜３μｇの組換えｈＰＡＫ６５をＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上に適用し、ＰＶＤＦフィルター上にブロットし、オーバーレイアッセイ により分析した。［γ−³²Ｐ］ＧＴＰまたは［β³²Ｐ］ＧＤＰを前もって充填し た、示したＧＴＰアーゼで、フィルターをプロービングした。レーンａは組換え ｈＰＡＫ６５を含有し、そしてレーンｂは好中球細胞質ゾルを含有する。 第５Ａ図〜第５Ｃ図は、ｈＰＡＫ６５の自己リン酸化の活性化の結果を表す。 第５Ａ図において、４０μｌのキナーゼ緩衝液中の１〜２μｇのビーズ上に固定 化された組換えｈＰＡＫ６５を、１〜２μｇのＧＴＰまたはＧＤＰを前もって充 填した、示したＧＴＰアーゼとインキュベートした。反応を３０℃において５μ ＭのＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと３０分間インキュベートした 。リン酸化タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分析し、次いでオートラジオグラ フィーにより分析した。第５Ｂ図において、４μｇのＣＤＣ４２Ｈｓ媒介放射性 標識化リン酸化ｈＰＡＫ６５を６Ｎ ＨＣｌ中で１１０℃において２時間インキ ュベートし、ホスホアミノ酸を薄層電気泳動により分離した。³²Ｐｉ標識化残留 をオートラジオグラフィーにより検出した。第５Ｃ図において、［γ−³²Ｐ］Ａ ＴＰを含有するキナーゼ反応混合物中でｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓと前イン キュベートしたｈＰＡＫ６５について、示した酵素（トリプシン、キモトリプシ ン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を使用して、タンパク質分解消化を実施 した。放射性標識化ペプチドを１６％トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）ゲル上で分割 し、オートラジオグラフィーにより可視化した。 第６Ａ図〜第６Ｄ図は、ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性の活性化を描写する。第６ Ａ図において、第５Ａ図について記載したように、３μｇのＭＢＰをキナーゼ反 応においてｈＰＡＫ６５とインキュベートした。第６Ｂ図において、５μｌのキ ナーゼ反応混合物を５分毎に取り出し、ＳＤＳ試料緩衝液の添加により、反応を 停止させた。リン酸化ＭＢＰを１４％ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、バンドを切 除し、取込まれた³²Ｐｉを計数した。第６Ｃ図において、キナーゼ 反応において、ＡＴＰの存在（活性化）または非存在（対照）下に、４μｇのｈ ＰＡＫ６５（３０μｌのビーズ）を３μｇのＣＤＣ４２Ｈｓと２０分間インキュ ベートした。ＣＤＣ４２Ｈｓを除去するために、ｈＰＡＫ６５ビーズを３回洗浄 し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＭＢＰを含有する第２キナーゼ反応にｈＰＡＫ６ ５を付した。第６Ｄ図は、第６Ａ図のブロットから単離されたＭＢＰの中に取込 まれたｈＰＡＫ６５キナーゼ活性（計数／分）を表す。 第７図は、リン酸化ｈＰＡＫ６５および非リン酸化ｈＰＡＫ６５に対するＣＤ Ｃ４２Ｈｓの結合の比較を表す。２μｇの非リン酸化ｈＰＡＫ６５またはリン酸 化ｈＰＡＫ６５（ＣＤＣ４２Ｈｓにより誘発された）をＳＤＳ ＰＡＧＥ上で展 開し、クーマッシーブルーで染色し、また、オーバーレイアッセイによりＣＤＣ ４２Ｈｓの結合について試験した。レーンａは非リン酸化形態を含有し、そして レーンｂはリン酸化形態を含有する。 第８Ａ図および第８Ｂ図は、ＣＤＣ４２Ｈｓの固有のＧＴＰアーゼ活性および ｐ１９０刺激されたＧＴＰアーゼ活性に対するｈＰＡＫ６５の作用を描写する。 １ｎＭの［γ−³²Ｐ］ＧＴＰを前もって充填したＣＤＣ４２Ｈｓを、２０ｎＭの ｐ１９０の触媒ドメインの非存在（第８Ａ図）または存在（第８Ｂ図）において 、示した濃度の非リン酸化またはリン酸化ｈＰＡＫ６５とインキュベートし、次 いでホスフェート解離アッセイを実施した。 第９図は、ｈＰＡＫ６５キナーゼの活性化におけるｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓ の役割のモデルのスキームを表す。工程１において、成長因子により刺激される 、ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓの交換因子は、ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ からのＧＤＰの解放を刺激し、引き続いてｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓに対す るＧＴＰの結合を刺激する。工程２において、活性化されたｒａｃ１またはＣＤ Ｃ４２ＨｓはｈＰＡＫ６５に結合する。工程３において、ｒａｃ１またはＣＤＣ ４２ＨｓはｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を誘導して、ｈＰＡＫ６５セリンキナー ゼ活性を活性化する。工程４において、ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓの固有の ＧＴＰアーゼ活性はＧＴＰを加水分解して、ＧＤＰ状態を不活性化する。工程５ において、ｒａｃ１またはＣＤＣ４２ＨｓのＧＤＰ結合形態は、自己リン酸化ｈ ＰＡＫ６５キナーゼから解離する。 第１０図は、ｐ２１結合融合タンパク質ＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅのアミノ酸配 列を表す。 特定の態様の説明 ｈＰＡＫ６５の核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌ クレオチドを含んでなる新規な組成物は、本発明により提供される。ｈＰＡＫ６ ５ポリヌクレオチドによりコードされる単離されたタンパク質も、本発明により 提供される。典型的な核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：１ および２に記載されている。本発明の態様は、配列番号：１に対して相同性の核 酸配列を有するか、または配列番号：２をコードする、単離されたポリヌクレオ チドおよびオリゴヌクレオチド；及び配列番号：２に対して相同性のアミノ酸配 列を有する単離されたタンパク質を包含する。本発明の態様は、ヒトＰＡＫ６５ 核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列の相同性（好ましくは１００％に 増加する相同性）を、全体的または部分的に、有するｈＰＡＫ６５をコードする ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを化学的に合成するか、または、ヒ トＰＡＫ６５をコードする核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列の相同 性（好ましくは１００％に増加する相同性）を有する、天然に存在するｈＰＡＫ ６５をコードするポリヌク レオチドを単離することによって、達成される。例えば、ポリヌクレオチドおよ びオリゴヌクレオチドを合成する技術はこの分野においてよく知られており、そ して配列番号：１から逸脱すると同時に、配列番号：１に記載されている配列と 少なくとも８０％の核酸配列の相同性の維持を可能とする変化を配列番号：１に ついて行うことができる。１つの好ましい態様において、配列は配列番号：１の コーディング配列に対して少なくとも９５％の相同性を有する。 また、本発明の他の態様において、ヒトＰＡＫ６５核酸配列に対して少なくと も８０％の核酸配列の相同性を有する、天然に存在するｈＰＡＫ６５をコードす るポリヌクレオチドは、配列番号：１から誘導される核酸配列を有する、単離さ れたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを使用して単離される。ハイブ リダイゼーションおよび洗浄の条件はこの分野において知られており、そして、 配列番号：１に記載されている配列から作られたプローブの核酸を、ヒトＰＡＫ 核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列の相同性を有する核酸に選択的に ハイブリダイゼーションさせるために使用することができる条件を本明細書にお いて論ずる。 本発明の単離されたタンパク質の態様において、ｈＰＡＫ６５の単離されたタ ンパク質は、ヒトＰＡＫ６５配列、好ましくは配列番号：２の配列、に対して少 なくとも８０％のアミノ酸の相同性（少なくとも８５％、９０％、９５％、９９ ％〜１つアミノ酸の差を有する配列について好ましさは増加する）を有するｈＰ ＡＫ６５に対応するアミノ酸配列を有する。本発明の単離されたタンパク質は、 哺乳動物、昆虫、酵母、または細菌の細胞中の発現に適当な発現ベクター中の適 当な制御配列に作用可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを使用して、 発現させることができる。 定義 特記しない限り、本明細書おいて使用されるすべての技術用語および科学用語 は、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するのと同一の意味を有する。一 般に、本明細書おいて使用される命名法および後述する細胞培養、分子遺伝学、 および核酸の化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室の手法は、この 分野においてよく知られておりかつ普通に使用されているものである。標準的技 術が、組換え核酸法、ポリヌクレオチドの合成、および微生物の培養および形質 転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。一 般に、酵素反応および精製の工程は、製造業者の規格書に従い実施する。技術お よび手法は、一般に、この分野において慣用の方法およびこの明細書を通じて提 供される種々の一般的参考文献（一般に、下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、これは引用することによって本明細書の一部とさ れる）。本明細書おいて使用される命名法および後述する分析化学、有機合成化 学、および医薬処方物における実験室の手法は、この分野においてよく知られて おりかつ普通に使用されているものである。標準的技術が、化学合成、化学分析 、医薬処方物およびデリバリー、および患者の治療に使用される。この開示を通 じて使用されるように、下記の用語は、特記しない限り、下記の意味を有すると 理解すべきである： 用語「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書において、ゲノム、ｃＤＮ Ａ、または合成由来またはそれらのいくつかの組み合 わせのポリヌクレオチドを意味し、その由来により、「単離されたポリヌクレオ チド」は（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレ オチドのすべてまたは一部分に関連しない、（２）天然において連結していない フェニルに作用可能に連鎖されているか、または（３）より大きい配列の一部分 として天然に存在しない。 用語「単離されたタンパク質」は、本明細書において使用するとき、ｃＤＮＡ 、組換えＲＮＡ、または合成由来またはそれらのいくつかの組み合わせのタンパ ク質を意味し、その由来により、「単離されたタンパク質」は（１）天然に見出 されるタンパク質に関連しない、（２）同一源からの、例えば、ヒトのタンパク 質からの他のタンパク質を含有しないか、または（３）異なる種からの細胞によ り発現され、又は（４）天然に存在しない。 用語「ポリペプチド」は、本明細書において一般的用語として、天然のタンパ ク質、断片、またはポリペプチド配列の類似体を意味する。それゆえ、天然のタ ンパク質、断片、および類似体はポリペプチド属の種である。好ましいｐ２１相 互作用性ｈＰＡＫ６５ポリペプチドは、下記のものを包含する：第２Ａ図に示す ポリペプチド配列を含んでなるヒト全長タンパク質、キナーゼドメインを含んで なるポリペプチド、例えば、第２Ｃ図に示す配列から本質的に成るポリペプチド 、第２Ａ図のアミノ酸４９〜１１３から本質的に成るｐ２１結合性ドメインを含 んでなるポリペプチド、アミノ酸４８９、４９０および／または４９１を欠如す るｈＰＡＫ６５のポリペプチド、またはＧｌｕもしくはＡｓｐと置換した第２Ａ 図の３８０、３８３および／または３８４に対応するアミノ酸を有するｈＰＡＫ ６５のポリペプチド。 用語「天然に存在する」は、ある物体に適用されるものとして本 明細書おいて使用するとき、ある物体を天然に見出すことができるという事実を 意味する。例えば、天然源から単離することができる生物（ウイルスを包含する ）の中に存在し、そして実験室において人間により意図的に修飾されてきていな い、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド。 用語「作用可能に連結」は、本明細書において使用するとき、そのように記載 する成分がそれらの意図する方法において機能できる関係にある、並列位置を意 味する。コーディング配列に「作用可能に連結された」制御配列は、コーディン グ配列の発現が制御配列と適合可能な条件下に達成されるような方法において、 結合される。 用語「制御配列」は、本明細書において使用するとき、制御配列が結合される コーディング配列の発現を行うために必要であるポリヌクレオチド配列を意味す る。このような制御配列は、宿主生物に依存して異なる；原核生物において、こ のような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写 停止配列を包含する；真核生物において、一般に、このような制御配列は、プロ モーターおよび転写停止配列を包含する。用語「制御配列」は、最小、それらの 存在が発現に必要であるすべての成分を包含し、そして、また、それらの存在が 有利である成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を包含するこ とができる。 用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用するとき、少なくとも１ ０塩基の長さのヌクレオチドのポリマーの形態、リボヌクレオチドまたはデオキ シヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかの形態の修飾された形態を意味 する。この用語は、核酸の一本鎖および二本鎖の形態を包含する。 用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において使用するとき、天然に存在 するヌクレオチド、および天然に存在する、および天 然に存在しない、オリゴヌクレオチド連結により一緒に連結された、修飾された ヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００塩基またはそれより少 ない塩基の長さのポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌ クレオチドは、１０〜６０塩基の長さであり、最も好ましくは１２、１３、１４ 、１５、１６、１８、１９、または２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレ オチドは、例えば、プローブについて、通常一本鎖であるが、オリゴヌクレオチ ドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用するために、二本鎖であること ができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのオリゴ ヌクレオチドであることができる。用語「天然に存在するヌクレオチド」は、本 明細書において使用するとき、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチ ドを包含する。用語「修飾されたヌクレオチド」は、本明細書において使用する とき、修飾されたまたは置換された糖類基およびその他を有するヌクレオチドを 包含する。用語「オリゴヌクレオチド連結」は、本明細書において使用するとき 、オリゴヌクレオチド連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー ト、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエー ト、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデート、およびその他を包含する。オ リゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出のための標識を含むことができる。 用語「配列の相同性」は、本明細書おいて使用するとき、２つの核酸配列の間 で合致する塩基の比率または２つのアミノ酸配列の間で合致するアミノ酸の比率 を記載する。配列の相同性は百分率、例えば、５０％として表わすとき、百分率 はいくつかの他の配列と比較した、ｈＰＡＫ６５からの配列の長さにわたる合致 の比率を意味する。ギャップ（２つの配列のいずれかにおける）は合致を最大す るために許容される；１５塩基またはそれより小さいギャップ長さが通常され、 ６塩基またはそれより小さいのが好ましく、２塩基またはそれより小さいのがよ り好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブまたは治療剤として使用するとき、 標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列の相同性は、２０の可能なオリ ゴヌクレオチド塩基対の合致のうちの一般に１７以上の標的塩基の合致（８５％ ）、好ましくは１０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の合致のうちの９以下の 合致（９０％）、最も好ましくは２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の合致 のうちの１９以上の合致（９５％）である。 用語「選択的にハイブリダイゼーションする」は、本明細書おいて使用すると き、検出可能にまたは特異的に結合することを意味する。本発明のポリヌクレオ チド、オリゴヌクレオチドおよび断片は、非特異的核酸に対する検出可能な結合 の感知可能な量を最小とする、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下に、 核酸鎖に選択的にハイブリダイゼーションする。この分野において知られている ように、また、本明細書において論ずるように、選択的ハイブリダイゼーション 条件を達成するために、高いストリンジェンシーの条件を使用することができる 。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび断片と問題の 核酸配列との間の核酸配列の相同性は少なくとも８０％であり、そしてより典型 的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の増加す る相同性は好ましい。 ２つのアミノ酸配列は、それらの間に部分的または完全な同一性が存在する場 合、相同性である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を合致が最大となる ように整列させたとき、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャッ プ（合致する２つの配列の いずれかにおける）は合致を最大するとき許容される；５またはそれより小さい ギャップ長さは好ましく、２またはそれより小はより好ましい。また、好ましく は、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸の長さのそれらから 誘導されたポリペプチド配列）は、突然変異のデータマトリックスおよび６また はそれより大きいギャップペナルティを有するプログラムＡＬＩＧＮを使用して 、それらが５より大きい整列スコア（標準偏差の単位において）を有する場合、 この用語を本明細書おいて使用するとき、相同性である。参照、Ｄａｙｈｏｆｆ 、Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９７２、Ｖｏｌ．５、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄ ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．１０１−１１０、 およびこの巻に対するＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２、ｐｐ．１−１０。２つの配列 またはそれらの部分は、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列したとき、 それらのアミノ酸が５０％より大きいか、またはそれに等しい同一性を有する場 合、より好ましくは相同性である。 用語「対応する」は、本明細書おいて使用するとき、ポリヌクレオチド配列が 引用ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分に対して相同性である（すなわ ち、同一である、厳格に進化的に関係づけられない）こと、またはポリヌクレオ チド配列が参照ポリヌクレオチド配列と同一であることを意味する。反対に、用 語「に対して相補的」は、本明細書おいて使用するとき、相補的配列が引用ポリ ヌクレオチド配列のすべてまたは一部分に対して相同性であることを意味する。 例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対 応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。 ２またはそれ以上のポリヌクレオチドの配列の関係を記載するために、下記の 用語を使用する：「引用配列」、「比較ウィンドウ」、「配列の同一性」、「配 列の同一性の百分率」、および「実質的な同一性」。「引用配列」は、配列の比 較のための基準として使用される定められた配列である；引用配列は、例えば、 全長のｃＤＮＡまたは配列のリストの中に与えられた遺伝子配列、例えば、配列 番号：１のセグメントとして、より大きい配列のサブセットであることができる か、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでなることができる。一般に 、引用配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくとも２５ヌク レオチドの長さ、そして頻繁に少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２つ のポリヌクレオチドの各々は（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似する配列 （すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分）を含んでなることができ、 そして（２）２つのポリヌクレオチドの間で分岐する配列をさらに含んでなるこ とができ、典型的には、配列の類似性を有する局所的領域を同定しかつ比較する ために「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較する ことによって、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列の比較は 実施される。「比較ウィンドウ」は、本明細書おいて使用するとき、少なくとも ２０の隣接するヌクレオチド位置の概念上のセグメントを意味し、ここでポリヌ クレオチド配列を少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの引用配列と比較する ことができ、そして比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部分は、 ２つの配列の整列を最適化するために、引用配列（これは付加または欠失を含ま ない）に比較して、２０％またはそれより少ない付加または欠失（すなわち、ギ ャップ）を含んでなることができる。比較ウィンドウを整列させるために配列の 最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔ ｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同 性のアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎお よびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ． Ｓ．Ａ．）８５：２４４４の類似性のサーチ法、これらのアルゴリズムのコンピ ューター化された器具（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳ ＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａ ｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ ｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または検査 により実施することができ、そして種々の方法により発生した最良の整列（すな わち、比較ウィンドウにわたって最高の相同性の百分率を生ずる）が選択される 。用語「配列の同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウに わたって同一である（すなわち、ヌクレオチド／ヌクレオチド基準で）ことを意 味する。用語「配列の同一性の百分率」は、下記のようにして計算される：２つ の最適に整列された配列を比較のウィンドウにわたって比較し、双方の配列にお いて同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置 の数を決定して合致した位置を数を定め、合致した位置の数を比較のウィンドウ における位置の合計の数（すなわち、ウィンドウ数）で割り、そして結果に１０ ０を掛けて配列の同一性の百分率を得る。用語「実質的な同一性」は、本明細書 おいて使用するとき、ポリヌクレオチド配列の特性を意味し、ここでポリヌクレ オチドは、少なくとも２０のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、し ばしば少なくとも２５〜５０のヌクレオチドの比較ウィンドウにわたって、参照 配列に比較して、少なくとも８５％の配 列の同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列の同一性、より通常少な くとも９９％の配列の同一性を有する配列を含んでなり、配列の同一性の百分率 は参照配列をポリヌクレオチド配列と比較することによって計算され、ポリヌク レオチド配列は比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０％またはそれより 少ない欠失または付加を含んでなることができる。参照配列は、例えば、第２Ａ 図に示すヒトＰＡＫ６５ポリヌクレオチド配列のセグメントとして、より大きい 配列のサブセットであることができる。 本明細書おいて使用するとき、２０の慣用のアミノ酸およびそれらの略号は慣 用の使用法に従う（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、 Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ ｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９９１） 、これは引用することによって本明細書の一部とされる）。２０の慣用のアミノ 酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、天然に見出されされないアミノ酸、 例えば、α，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および非慣用 アミノ酸を、また、本発明のポリペプチドのために適当な成分であることがある 。非慣用アミノ酸の例は、下記のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ −カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセ チルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン 、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、 および他の同様なアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン） 。本明細書おいて使用するペプチドの表示法において、標準的使用およびコンベ ンションに従い、左側の方向はアミノ末端方向であり、そして右側の方向はカル ボキシ末端方向である。同様に、特記しない限り、一本鎖ポリヌク レオチド配列の左側の末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左 側の方向は５’方向と呼ばれる。形成されつつあるＲＮＡ転写体の５’→３’付 加の方向は転写方向と呼ばれる；ＲＮＡと同一の配列を有しかつＲＮＡ転写体の ５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流の配列」と呼ばれる ；ＲＮＡと同一の配列を有しかつＲＮＡ転写体の３’末端に対して３’であるＤ ＮＡ鎖上の配列領域は「下流の配列」と呼ばれる。 ポリペプチドに適用するとき、用語「実質的な同一性」は、例えば、欠失ギャ ップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、最適に整列 させたとき、２つのペプチド配列が少なくとも８０％の配列の同一性、好ましく は少なくとも９０％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列の 同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列の同一性を有することを意味す る。好ましくは、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。保 存的アミノ酸置換は、同様に側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂 肪族側鎖を有するアミノ酸の１グループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイ シン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の １グループは、セリンおよびスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ 酸の１グループは、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有する アミノ酸の１グループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン である；塩基性側鎖を有するアミノ酸の１グループは、リジン、アルギニン、お よびヒスチジンである；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の１グループは、 システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は下記の通 りである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リ ジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸 −アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミン。 用語「ポリペプチド断片」は、本明細書おいて使用するとき、アミノ末端およ び／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを意味するが、残りのア ミノ酸配列は、例えば、全長のｃＤＮＡ配列（例えば、第２Ａ図に示すｃＤＮＡ 配列）から、推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一である 。典型的には、断片は少なくとも５、６、８または１０アミノ酸の長さ、好まし くは少なくとも１４アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸の 長さ、通常少なくとも５０アミノ酸の長さ、なおいっそう好ましくは少なくとも ７０アミノ酸の長さである。 用語「類似体」は、本明細書おいて使用するとき、第２Ａ図に示す推定された アミノ酸配列の一部分に対して実質的な同一性を有しかつ下記の性質の少なくと も１つを有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成されたポリペプ チドを意味する：（１）適当な結合条件下に、ｐ２１ポリペプチド、好ましくは ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓに特異的な結合、（２）哺乳動物細胞中で発現さ れるとき、ｐ２１タンパク質活性、好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ活 性を実現する能力、（３）セリンタンパク質キナーゼ活性、または（４）ｐ２１ タンパク質活性、好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４２ＨｓのＧＴＰアーゼ活性 を変調する能力。典型的には、類似体のポリペプチドは、天然に存在する配列に 関して保存的アミノ酸置換（複製起点付加または欠失）を含む。典型的には、類 似体は少なくとも２０アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５０アミノ酸また はこれより大きい長さであり、最も通常第２Ａ図に示すように全長の天然に存在 するｈＰＡＫ６５ポリペプチド程度の長さを有する。いくつかのｐ２１相互作用 性ｈＰＡＫ６５ポリペプチドの類似体は生物学的活性を欠如することがあるが、 種々の用途に なお使用することができ、例えば、ｐ２１相互作用性ＰＡＫポリペプチドのエピ トープに対する抗体を発生させるために、アフィニティークロマトグラフィーに よりｐ２１相互作用性ＰＡＫポリペプチドの抗体を検出しおよび／または精製す るための免疫学的試薬として、または天然のｐ２１相互作用性ｈＰＡＫ６５ポリ ペプチドの機能の競合的または非競合的アゴニスト、アンタゴニスト、または部 分的アンタゴニストとして使用することができる。 用語「ヒトＰＡＫ６５の変調」は、本明細書において、ヒトＰＡＫ６５の機能 的性質（例えば、ｈＰＡＫ６５活性、ｐ２１の結合）を増強または阻害する能力 を意味するために使用する；このような増強または阻害は特定の事象の発生、例 えば、シグナルトランスダクション経路の活性化と随伴性であることができ、お よび／または特定の細胞の型においてのみ発現することがある。 用語「物質」は、本明細書おいて使用するとき、化学化合物、化学化合物の混 合物、生物学的高分子、または生物学的材料、例えば、細菌、植物、真菌、また は動物（特に哺乳動物）細胞または組織から作られた抽出物を意味するために使 用される。物質は、本明細書において記載するスクリーニングアッセイに含める ことによって、ヒトＰＡＫ６５変調物質（例えば、抗新形成剤、細胞障害剤、新 形成の形質転換または細胞増殖のインヒビター、細胞増殖促進剤、Ｒａｓ誘発腫 瘍発生、およびその他）として潜在的活性について評価される。 用語「候補物質」は、本明細書おいて使用するとき、本発明の１または２以上 のスクリーニング法により、推定上のｈＰＡＫ６５変調剤として同定される物質 を意味するために使用される。いくつかの候補の変調剤は、ヒトに使用するため の薬物として治療的可能性を有する。 本明細書おいて使用するとき、用語「標識」または「標識化」は、放射線標識 化されたアミノ酸の組込みによるか、またはマーキングされたアビジン（例えば 、光学的または比色方法により検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有す るストレプチアビジン）により検出できるビオチン成分のポリペプチドへの取付 けによる、検出可能なマーカーの組込みを意味する。ポリペプチドまたは糖タン パク質を標識化する種々の方法はこの分野において知られており、そして使用可 能である。ポリペプチドの標識の例は下記のものを包含するが、これらに限定さ れない：放射性同位元素（例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ）、蛍光標 識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドの蛍りん光体）、酵素標識（例 えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラー ゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次リポーター により認識される前以て決定されたポリペプチドのエピトープ（例えば、ロイシ ンジッパー対の配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトー プの標識）。いくつかの態様において、標識は、潜在的立体障害を減少するため に、種々の長さのスペーサーアームにより取付けられる。 本明細書おいて使用するとき、「実質的に純粋な」は、目的の種が存在する優 勢を占める種である（すなわち、モル基準で、それは組成物中の他の個々の種よ りも豊富である）ことを意味し、そして好ましくは実質的に精製された画分は、 目的の種が存在するすべての高分子の種の少なくとも約５０％（モル基準で）を 構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な種は、組成物の中に存在するす べての高分子の種の約８０％より多く、より好ましくは約８５％、９０％、９５ ％、および９９％より多くを構成するであろう。より好ましくは、目的の種が本 質的に均質に精製され（汚染物質の種は 慣用の検出法により組成物の中に検出することができない）ここで組成物は本質 的に単一の高分子種から成る。 用語「製剤または薬物」は、本明細書おいて使用するとき、患者に適切に投与 されたとき、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を 意味する。 本明細書における他の化学的用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉ ｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ、Ｓ． 編）、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（引用することに よって本明細書の一部とされる）により例示されるように、この分野における使 用に従い使用される。 用語「抗新形成剤」は、本明細書おいて使用するとき、ヒトにおける新形成、 特に悪性（癌性）病変、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病の発生ま たは進行を抑制する機能的性質を有する物質を意味する。転移の抑制は、しばし ば抗新形成剤の１性質である。ｈＰＡＫ６５ポリヌクレオチドを用いるｈＰＡＫ６５核酸の検出 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、生物からの試料中のＰＡＫ６５を検 出し、必要に応じて、クローニングするためのプローブとして使用することがで きる。典型的には、試料は組織からのものである。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、 Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（１９８９）（本明細書において「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．」と呼ぶ）ヒトＰＡＫ６５をコードする核酸配列を有する単離さ れたポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１）は、配列の相同性を有する標的 核酸配列の存在を検出するためのプローブとして使用することができる。ポリヌ クレオチドのプローブは、 この分野、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、特に第１０章、において 知られている方法により製造し、標識化することができ、核酸を製造し、標識化 することについての節のテキストは引用することによって本明細書の一部とされ る。例えば、ポリメラーゼ連結反応を使用してＤＮＡを増幅し、そしてビオチン −アビジン標識系を使用して、標的ポリヌクレオチドを標識化し、検出すること ができる。ポリヌクレオチドのプローブを適当なハイブリダイゼーション温度に おいて標的核酸とハイブリダイゼーションさせ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅ ｔ ａｌ．を参照のこと、第９章のテキストは引用することによって本明細書の 一部とされる）、そして検出アッセイに依存して、低いおよび高い洗浄ストリン ジェンシーにおいて洗浄する。 好ましくは、ポリヌクレオチドは、この分野において知られているように、高 いストリンジェンシー条件下に、対応するハイブリダイゼーション条件を使用し てプローブとして使用される。単離されたポリヌクレオチドは、５０塩基対〜ｈ ＰＡＫ６５ｃＤＮＡの全長であるプローブを作るために使用することができる。 好ましくは、プローブは１００〜４００ヌクレオチド長さの単離されたポリヌク レオチドから作られる。このような条件を使用して、ヒトにおけるｈＰＡＫ６５ 遺伝子のアレレを検出することができる。 また、オリゴヌクレオチドをプローブとして使用することができる。同一また は関係する核酸配列を検出するプローブとしてオリゴヌクレオチドを使用する技 術は、この分野においてよく知られている、参照、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ ｌ．、特に第１１章、そのテキストは引用することによって本明細書の一部とさ れる。プローブは、１０〜２００塩基の長さのオリゴヌクレオチドから作るする ことができる。好ましくは、プローブは１０〜６０ヌクレオチドの 長さ、最も好ましくは１２〜４０塩基の長さのオリゴヌクレオチドから作られる 。誤った陽性物の数を減少するために、好ましくは２つのプローブを使用して、 ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下に双方のプローブに結合するクロー ンを同定する。オリゴヌクレオチドは、製造業者により提供される使用説明書に 従いアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） オリゴヌクレオチド合成装置で合成することができる。 ハイブリダイゼーションアッセイによる後の分析のために、標的核酸を増幅す る１つ方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）またはＰＣＲ技術として知 られている。互いに間隔を置いて位置しかつ本明細書において記載する遺伝学的 配列に基づくオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、推測される試料中の 本発明の配列を検出するために、ＰＣＲ技術を適用することができる。プライマ ーは二本鎖ＤＮＡ分子の対向する鎖に対して相補的であり、そして典型的には約 ５０〜４５０ヌクレオチドまたはそれ以上（通常２０００ヌクレオチド以下）だ け分離されている。この方法は特定のオリゴヌクレオチドのプライマーを調製し 、次いで標的ＤＮＡの変性、プライマーの結合、およびＤＮＡポリメラーゼを使 用するエクステンションのサイクルを反復して、プライマーの間隔に基づいて期 待する長さのＤＮＡ断片を得ることを包含する。１つのプライマーから発生した エクステンション生成物は、他方のプライマーのための追加の標的配列として働 く。標的配列の増幅の程度は実施されるサイクルの数によりコントロールされ、 そして理論的には簡単な式２ｎにより計算され、ここでｎはサイクルの数である 。平均の効率／サイクルが約６５％〜８５％の範囲であることが与えられると、 ２５サイクルは標的配列の０．３〜４．８×１０⁶コピーを生成する。ＰＣＲ法 は、下記の刊行物を包含する多数の刊行物に記載され ている：Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３ ５０−１３５４；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４ ：１６３−１６６；およびＳｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９ ８６）２３３：１０７６−１０７８。また、参照、米国特許第４，６８３，１９ ４号；米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２ 号、各特許のテキストは引用することによって本明細書の一部とされる。ＰＣＲ 増幅の追加の方法は、下記の文献に記載されている：ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄ ＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ、編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ、編、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａ ｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９ ９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７ 、および；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ 、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは引用することによって本明 細書の一部とされる。 哺乳動物細胞における複製に適当なベクターはこの分野において知られており 、そしてウイルスのレプリコン、またはＰＡＫ６５をコードする配列の宿主ゲノ ムの中への組込み保証する配列を包含することができる。適当なベクターは、例 えば、サルウイルスＳＶ４０、レトロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ワクシニ ア（ｖａｃｃ ｉｎｉａ）ウイルス、およびアデノウイルスを包含することができる。 適当なベクターは、例えば、ワクシニアウイルスから誘導されるものである。 この場合において、異種ＤＮＡはワクシニアゲノムの中に挿入される。ワクシニ アウイルスのゲノムの中へ外来ＤＮＡを挿入する技術はこの分野において知られ ており、そして、例えば、相同性組換えを利用する。異種ＤＮＡの挿入は、一般 に、天然において非必須である遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ ）（これは、また、選択可能なマーカーを提供する）の中に行われる。組換えウ イルスの構築を大きく促進するプラスミドシャトルベクターが記載された（参照 、例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ ｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）；Ｍｏｓｓ（１９８７））。次いで、異種ポリペ プチドの発現が、生組換えワクシニアウイルスで免疫化された細胞または個体に おいて起こる。 このような適当な哺乳動物の発現ベクターは通常１または２以上の真核生物転 写ユニットを含有し、これらの転写ユニットは哺乳動物細胞における発現を促進 することができる。転写ユニットは、外来ＤＮＡ配列の転写を仲介するプロモー ター要素から少なくとも構成されている。哺乳動物細胞に適当なプロモーターは この分野において知られており、そしてウイルスのプロモーター、例えば、サル ウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウ イルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシ乳頭腫ウイルス（Ｂ ＰＶ）からのプロモーターを包含する。 本明細書において記載するプロモーター要素と組み合わせられた、エンハンサ ー要素（エンハンサー）の任意の存在は、典型的には発現レベルを増加するであ ろう。エンハンサーは、内因性または異 種のプロモーターに連鎖されるとき、転写を１０００倍まで刺激することができ る、任意の調節ＤＮＡ配列であり、合成は通常のｍＲＮＡ開始部位において開始 する。また、エンハンサーが転写開始部位から上流または下流に、正常またはフ リップした向きにおいて、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドより大 きい距離において、位置するとき、エンハンサーは活性である（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒ ｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔ ｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版）。典型的には、ウイルスから誘導されるエンハンサー 要素は、より広い宿主範囲を有するので、特に有用であることがある。哺乳動物 細胞において有用な例は、ＳＶ４０の初期の遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍ ａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、およびラウス肉腫 ウイルスの長い末端の反復（ＬＴＲ）（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２ ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイ トメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１ ：５２１）から誘導されたエンハンサー／プロモーターを包含する。さらに、い くつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてインデューサー、例えば、ホル モンまたは金属イオンの存在においてのみ活性となる（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒ ｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５ ；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２ ３７）。 さらに、転写ユニットは、また、停止配列、およびＰＡＫ６５コーディング配 列に作用可能に連鎖されたポリ（Ａ）付加配列から構成することができる。転写 ユニットは、また、ＰＡＫ６５の発現を増加するエンハンサーから構成すること ができる。 また、遺伝子の増幅を引き起こす配列、ならびに選択可能なマーカーをコード する配列は望ましいことがある。哺乳動物細胞の選択可能なマーカーはこの分野 において知られており、そして、例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダ クターゼ（ＤＨＦＲアンプリファイアーとしてメトトレキセートと一緒に）、ア ミノグリコシドリン酸転移酵素、ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素、アスパラギ ンシンターゼ、アデノシンジアミナーゼ、メタロチオネイン、および抗生物質耐 性遺伝子、例えば、ネオマイシンを包含する。 ＰＡＫ６５をコードするベクターは、適当な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使 用することができる。形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞の中に導入する任 意の既知の方法、例えば、ウイルス中のポリヌクレオチドのパッケージングおよ びウイルスまたはこの分野において知られているトランスフェクション法による 宿主細胞の形質導入によることができる、例えば、米国特許第４，３９９，２１ ６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号、お よび米国特許第４，９５９，４５５号（これらの特許は引用することによって本 明細書の一部とされる）を参照のこと。使用した形質転換法は、形質転換すべき 宿主に依存する。哺乳動物細胞の中に異種ポリヌクレオチドを導入する方法はこ の分野において知られており、そしてデキストラン仲介トランスフェクション、 リン酸カルシウム沈澱法、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラス ト融合法、エレクトロポレーション、リポソームの中への１または２以上のポリ ヌクレオチドの包膜法、および核の中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクショ ンを包含する。 発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞系はこの分野において知られ ており、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能な多数の永久分裂能化細胞系、例えば、チャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎（ ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多数の他の細胞系を包含する。後述するように、特に好ましい細 胞系は、構成的セリンキナーゼ活性を有する組換えｈＰＡＫ６５構築物を発現し 、より好ましくは引き続いて形質転換された細胞の特性を発生するものである。 昆虫細胞における発現の場合において、一般に発現系の成分は下記のものを包 含する：転移ベクター、通常細菌のプラスミド（これはバキュロウイルスのゲノ ムの断片、および発現すべき１または２以上の異種遺伝子の挿入のための好都合 な制限部位の双方を含有する）；転移ベクター中のバキュロウイルス特異的断片 に対して相同性の配列を有する野生型バキュロウイルス（これはバキュロウイル スゲノムの中への異種遺伝子の相同的組換えを可能とする）；および適当な昆虫 宿主細胞および成長培地。好ましいベクターはｐＡｃＣ１３である（Ｒｕｂｉｎ ｆｅｌｄ、Ｂ．（１９９１）Ｃｅｌｌ６５：１０３３−１０４２）。好ましい発 現プラスミドは、Ｍｙｃ−エピトープ：ｈＰＡＫ６５融合構築物を含有するｐＡ ｃＰＡＫ７８０である。好ましい昆虫細胞系はＳｆ９である。ｐＡｃＰＡＫ７８ ０のＭｙｃ−エピトープ：ｈＰＡＫ６５接合領域は、ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡであり、これは第２Ａ図におけるｈＰＡＫ６５コーディング配列 の末端に続く。 ＡｃＮＰＶの中へ外来遺伝子を導入するために最も普通に使用されている転移 ベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。多数の他のベクターは、当業者に知ら れており、また、設計された。これらは 、例えば、ｐＶＬ９８５を包含し、これはポリヘドリン開始コドンをＡＴＧから ＡＴＴに変更し、そしてＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部 位を導入する；参照、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ １９８９）１７：３１。 プラスミドは、また、通常ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅ ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１ ７７）および原核性アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子およびエシェリキア．コ リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択および増殖のための複製起点を含有する。 バキュロウイルスの転移ベクターは、通常、バキュロウイルスのプロモーター を含有する。バキュロウイルスのプロモーターは、バキュロウイルスのＲＮＡポ リメラーゼと結合し、そしてｍＲＮＡへのコーディング配列（例えば、構造遺伝 子）の下流の（５’→３’）転写を開始することができる、任意のＤＮＡ配列で ある。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に対して近位に位置す る転写開始領域を有するであろう。典型的には、この転写開始領域はＲＮＡポリ メラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルスの転移ベクター は、また、エンハンサーと呼ばれる第２ドメインを有することができ、これは、 存在する場合、通常構造遺伝子に対して遠位に存在する。発現は調節されるか、 または構成的であることができる。 さらに、ＰＡＫ６５ポリヌクレオチドまたはその断片を細菌系中で発現させる ことができる。その中において、細菌のプロモーターは細菌のＲＮＡポリメラー ゼと結合し、そしてｍＲＮＡへのコーディング配列（例えば、構造遺伝子）の下 流の（３”）転写を開始することができる、任意のＤＮＡ配列である。プロモー ターは、通常コーディング配列の５’末端に対して近位に位置する転写開始領域 を有するであろう。典型的には、この転写開始領域はＲＮＡポリメラーゼ結合部 位および転写開始部位を含む。細菌の転移ベクターは、また、エンハンサーと呼 ばれる第２ドメインを有することができ、これは、ＲＮＡの合成が開始する、隣 接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位とオーバーラップすることができる。このオ ペレーターは、負の調節された（誘導可能な）転写を可能とする。なぜなら、遺 伝子のリプレッサーはオペレーターに結合し、これにより特定の遺伝子の転写を 阻害することができるからである。構成的発現は、負の調節要素、例えば、オペ レーターの非存在において起こることができる。さらに、正の調節は遺伝子のア クチベータータンパク質結合配列により達成することができ、この配列は、存在 する場合、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して通常近位（５’）に位置する。 遺伝子のアクチベータータンパク質の例はカタボライトアクチベータータンパク 質（ＣＡＰ）であり、これはエシェリキア．コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を促進する（Ｒａｉｂａｕｄ ｅ ｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。した がって、調節された発現は正または負であり、これにより転写を増強または減少 することができる。 代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する 。例は、糖類代謝酵素、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａ ｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマ ルトースから誘導されたプロモーター配列である。追加の例は、生合成酵素、例 えば、トリプトファン（ｔｒｐ）から誘導されたプロモーター配列である（Ｇｏ ｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０ ５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１ ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１ 号；欧州特許公開（ＥＰＯ）第３６，７７６号および欧州特許公開（ＥＰＯ）第 １２１，７７５号）。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓ ｍａｎｎ（１９８１）、Ｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ 編））、バクテリオファージラムダＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．（ １９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９ ，４０６号）プロモーター系は、また、有用なプロモーター配列を提供する。 さらに、天然に存在しない合成プロモーターは、また、細菌のプロモーターと して機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモーターの 転写活性化配列を、他の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロ ン配列と接合し、合成ハイブリッドプロモーターをつくることができる（米国特 許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモー ターとｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とから構成され た、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ．（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９ ８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌の プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始できる、非細 菌由来の天然に存在するプロモーターを包含することができる。また、非細菌由 来の天然に存在するプロモーターを適合性のＲＮＡポリメラーゼとカップリング させて、原核生物においていくつかの遺伝子を高いレベルで発現させることがで きる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、カップ リングされたプロモーター系の１例である（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１ ９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに 、ハイブリッドプロモーターは、また、バクテリオファージのプロモーターおよ びエシェリキア．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のオペレーター領域から構成することが できる（欧州特許公開（ＥＰＯ）第２６７，８５１号）。 機能化プロモーター配列に加えて、効率よいリボソーム結合部位は、また、原 核生物におけるＰＡＫ６５遺伝子またはその断片の発現のための有用である。エ シェリキア．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、リボソーム結合部位はシャイン− ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開 始コドン（ＡＴＧ）およびその開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置 する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９７ ５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、エシェリキア．コリ（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡのＳＤ配列と３’末端との間の塩基の対合により、リボ ソームに対するｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎ ｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏ ｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位をもつ真核性遺伝子および原 核性遺伝子を発現するために（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）″ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａｃｏｌｉ″Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。 ＰＡＫ６５は細胞内で発現させることができる。プロモーター配列をＰＡＫ６ ５遺伝子またはその断片に直接連鎖することができ、 この場合において、Ｎ−末端における第１アミノ酸は常にメチオニンであり、こ れはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。必要に応じて、臭化シアンとの試験 管内インキュベーションによるか、または細菌のメチオニンＮ−末端ペプチダー ゼとの生体内または試験管内インキュベーションにより、Ｎ−末端におけるメチ オニンをタンパク質から切断することができる（欧州特許公開（ＥＰＯ）第２１ ９，２３７号）。 融合タンパク質は発現を指令する代替物を提供する。典型的には、内因性細菌 タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ−末端部分をコードするＤＮＡ配 列を、異種ＰＡＫ６５コーディング配列の５’末端に融合させる。発現すると、 この構築物は２つのアミノ酸配列の融合物を提供するであろう。例えば、バクテ リオファージラムダの細胞遺伝子をＰＡＫ６５遺伝子またはその断片の５’末端 に連鎖し、そして細菌中で発現させることができる。生ずる融合タンパク質は、 好ましくは、バクテリオファージのタンパク質をＰＡＫ６５遺伝子またはその断 片から切断するためのプロセシング酵素（因子Ｘａ）のための部位を保持する（ Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合 タンパク質は、また、ｌａｃＺ（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ６ ０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｊ．Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｇｅ ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（欧州特許公開（Ｅ ＰＯ）第３２４，６４７号）遺伝子からの配列を使用して作ることができる。２ つのアミノ酸配列の接合部におけるＤＮＡ配列は、切断可能な部位をコードする か、またはコードしなくてもよい。他の例はユビキチン融合タンパク質である。 このような融合タンパク質はユビキチン領域を使用 して作られ、このユビキチン領域はユビキチンをＰＡＫ６５ポリペプチドから切 断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテ アーゼ）のための部位を好ましくは保持する。この方法により、成熟ＰＡＫ６５ ポリペプチドを単離することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９ ）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。好ましい組換え的に誘導され た融合物は、ＰＡＫポリペプチドまたは断片のＮ−末端に融合したＭｙｃ−エピ トープ（付加されたメチオニンを有する：ＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含有する 。このＭｙｃエピトープに対して特異的な抗体は、融合タンパク質の単離および ／または同定（アッセイにおけるような）を可能とする。１つのこのような態様 は、ＰＡＫ６５発現ベクターｐＡｃＰＡＫ７８０の中に見出される構築物である 。他の好ましい系は、ｈＰＡＫ６５またはその断片のＣ−末端にグルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を有 する融合物である。組換え融合タンパク質は、固体の支持体に取付けられたグル タチオンに結合する能力を有するので、融合物をグルタチオンで溶離することに よって、容易に単離される。この型の最も好ましい態様はプラスミドｐＧＳＴＰ ＡＫｅｔｔｅにおいて見出され、このプラスミドはＧＳＴＰＡＫｅｔｔｅと呼ぶ 組換え融合タンパク質をコードし、このＧＳＴＰＡＫｅｔｔｅはｈＰＡＫ６５タ ンパク質断片のアミノ酸４９〜１１３に融合したＧＳＴを含有し、そしてｒａｃ １またはＣＤＣ４２Ｈｓに特異的に結合する能力を保持する。ｈＰＡＫ６５のこ のドメインはｒａｃ１結合ドメインを含有する。ＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅのアミ ノ酸配列は第１０図に示されている。 また、細菌中でｈＰＡＫ６５ポリペプチドの分泌を提供するシグナルペプチド 配列の断片から構成された融合タンパク質をコードす る、キメラＤＮＡ分子をつくることによって、ｈＰＡＫ６５ポリペプチドを細胞 を分泌させることもできる（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列 の断片は、典型的には、細胞のタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸から 構成されたシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は成長培地（グラム 陽性菌）の中に分泌されるか、または細胞の内側膜と外側膜との間に位置する、 周辺質空間（グラム陰性菌）の中に分泌される。好ましくは、シグナルペプチド 断片とｈＰＡＫ６５ポリペプチドとの間において生体内または試験管内でコード された、切断することができるプロセシング部位が存在する。 適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された細菌のタンパク質の遺 伝子、例えば、エシェリキア．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の外側膜タンパク質遺伝子 （ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、ｉｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ；Ｇｈｒａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７） およびエシェリキア．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルカリ性ホスファターゼシグナル 配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）。追加の例として、種々のバシラス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ）株からのアルファ−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を使用して、 バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から異種タンパク 質を分泌させることができる（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：５５８２；欧州特許公開（ＥＰＯ）第２ ４４，０４２号）。 典型的には、細菌により認識される転写停止配列は、翻訳停止コドンに対して ３’に位置する調節領域であり、したがって、プロモ ーターと一緒にコーディング配列に隣接する。これらの配列はｍＲＮＡの転写を 指令し、ｍＲＮＡはＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳することがで きる。転写停止配列は、しばしば、転写の停止を促進するステムループ構造物を 発酵ブロスできる、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例は、強いプロモ ーターを有する遺伝子、例えば、エシェリキア．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｔｒ ｐ遺伝子ならびに他の生合成遺伝子から誘導される転写停止配列を包含する。 典型的には、プロモーター、シグナル配列（必要に応じて）、問題のコーディ ング配列、および転写停止配列を含んでなる、前述の成分を一緒にして発現構築 物にする。発現構築物は、しばしば、レプリコン、例えば、宿主、例えば、細菌 において安定に維持できる染色体外要素（例えば、プラスミド）において維持さ れる。レプリコンは複製系を有し、こうして、発現のために、またはクローニン グおよび増幅のために、原核性宿主においてそれを維持することができる。さら に、レプリコンは高いまたは低いコピー数のプラスミドであることができる。高 いコピー数のプラスミドは、一般に約５〜約２００、典型的には約１０〜約１５ ０の範囲のコピー数を有するであろう。高いコピー数のプラスミドを含有する宿 主は、好ましくは、少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０のプラ スミドを含有するであろう。高いまたは低いコピー数のベクターは、宿主に対す るベクターおよびｈＰＡＫ６５ポリペプチドの作用に依存して、選択することが できる。 また、発現構築物は、組込み体ベクターを使用して細菌のゲノムの中に組込む ことができる。組込みベクターは、典型的には、ベクターの組込みを可能とする 細菌の染色体に対して相同性の少なくとも１つの配列を含有する。組込みは、ベ クター中の相同性ＤＮＡと 細菌の染色体との間の組換えから生ずるように思われる。種々のバシラス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ）株からのＤＮＡを使用して構築された組込みベクターは、バシラ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体の中に組込まれる（欧州特許公開（ＥＰＯ）第 １２７，３２８号）。また、組込みベクターは、また、バクテリオファージまた はトランスポゾンの配列から構成することができる。 典型的には、染色体外および組込み発現の構築物は、形質転換された細菌株の 選択を可能とする、選択可能なマーカーを含有することができる。選択可能なマ ーカーを細菌の宿主の中で発現させることができ、そして選択可能なマーカーは マーカーを薬物、例えば、アンピシリン、クロランフェニコール、エリスロマイ シン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンに対して耐性と する遺伝子を含むことができる（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｎ ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。また、選択可能なマーカ ーは、生合成遺伝子、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの 生合成経路における遺伝子を含むことができる。 また、前述の成分のあるものは形質転換ベクター中で一緒にすることができる 。典型的には、形質転換ベクターは、前述したように、レプリコンにおいて維持 されるか、または組込みベクターに進展させる、選択可能なマーカーから構成さ れる。 染色体外のレプリコンまたは組込みベクターである、発現ベクターおよび形質 転換ベクターは、多数の細菌の中への形質転換のために開発されてきている。例 えば、発現ベクターは、なかでも、下記の細菌のために開発されてきている：バ シラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：５ ５８２；欧州特許公開（ＥＰＯ）第３６，２５９号および欧州特許公開（ＥＰＯ ）第６３，９５３号；ＰＣＴ ＷＯ８４／０４５４１号）、エシェリキア．コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．（ １９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：１２８；Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５ ）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許公開（ＥＰＯ）第３６，７７６号、 欧州特許公開（ＥＰＯ）第１３６，８２９号および欧州特許公開（ＥＰＯ）第１ ３６，９０７号；英国特許出願第８４１８２７３号）、ストレプトコッカス・ク レモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５ ４：６５５）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ ｉｖｉｄａｎｓ）（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、ストレプトミセス・リビダン ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）（米国特許第４，７４５， ０５６号）。 細菌宿主の中に外来ＤＮＡを導入する方法はこの分野においてよく知られてお り、典型的には、ＣａＣｌ2 または他の物質、例えば、２価のカチオンまたはＤ ＭＳＯで処理した細菌の形質転換を包含する。ＤＮＡは、また、エレクトロポレ ーションにより細菌細胞の中に導入することができる。形質転換の手順は、通常 、形質転換すべき細菌の種とともに変化する。参照、例えば、（Ｍａｓｓｏｎｅ ｔ ａｌ．（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７ ３；Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州 特許公開（ＥＰＯ）第３６，２５９号および欧州特許公開（ＥＰＯ）第６３，９ ５３号；Ｐ．Ｃ．Ｔ．ＷＯ８４／０４５４１号、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ）、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ．１７２：９４９、カンピロバクテル（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ） ）、（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）″Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥｌ−ｄｅｒｉ ｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍ ｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．Ｂｏ ｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９７０ ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈ ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ））、（Ｃｈａｓｓｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓ））、（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．１７０：３８、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））；（ Ａｕｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．６６：２０３、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ） ）、（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．（１ ９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９ ８７）″Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｓｓｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，″ｉｎ：Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔ ｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍ ｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐ４ｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ １：４１２、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ） ）。 前述したように、ｈＰＡＫ６５タンパク質のアミノ酸配列における小さい変動 は、用語ｈＰＡＫ６５の中に包含されると考えられるが、ただしアミノ酸配列に おける小さい変動は、第２Ａ図に表されるヒトＰＡＫ６５タンパク質をコードす る配列に対して相同性の少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、 および少なくとも１つのアミノ酸の差までを維持しなくてはならない。このよう な小さい変動はｈＰＡＫ６５のアレレの変異型の間で起こるようである。特に、 保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、アミノ酸側鎖において関係す るアミノ酸の１ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ 酸は、一般に、下記のファミリーに分割される：（１）酸性＝アスパラギン塩、 グルタミン酸塩；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極 性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン 、メチオニン、トリプトファン；および（４）非帯電極性＝グリシン、アスパラ ギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましい ファミリーは下記の通りで ある：セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーである；アスパラ ギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーである；アラニン、バリン、ロイ シンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーである；そしてフェニルアラニン、 トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシン とイソロイシンまたはバリンとの、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩との、ス レオニンとセリンとの単離された置換、またはアミノ酸と構造的に関係するアミ ノ酸との同様な置換は、特に置換がｐ２１結合部位またはキナーゼ活性部位にア ミノ酸を含まない場合、生ずる分子の結合またはキナーゼ性質に主要な作用をも たない。アミノ酸の交換が機能的ペプチドを生ずるかどうかは、ポリペプチド誘 導体の特定の活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。ア ッセイを本明細書において詳細に説明する。 当業者はｈＰＡＫ６５の断片または類似体を製造することができる。断片また は類似体の好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界 付近に存在する。例えば、このような機能的ドメインは、ｈＰＡＫ６５−ｐ２１ タンパク質複合体を形成する結合の性質を付与するドメイン、タンパク質キナー ゼドメイン、自己リン酸化ドメイン、および細胞のｈＰＡＫ６５に関係するトラ ンスダクション経路を変調する性質を付与するドメインを包含する。構造的ドメ インおよび機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列のデー タを公衆または登録の配列データベースと比較することによって同定することが できる。好ましくは、コンピューター化比較法を使用して、既知の構造および／ または機能的の他のタンパク質の中に存在する配列のモチーフまたは予測される タンパク質のコンフォメーションドメイン、例えば、実施例の節において提供さ れているようなキナーゼドメインを同定する。既知の 三次元構造に折りたたまれたタンパク質の配列を同定する方法は、既知である（ Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４）。し たがって、ｈＰＡＫ６５配列中の構造的および機能的ドメインを定めるために使 用できる、配列のモチーフおよび構造的コンフォメーションを当業者が認識でき ることを、前述の例は証明する。 実質的に１または２以上の機能的ドメインを含んでなる断片または類似体を異 種ポリペプチドの配列に融合することができ、ここで生ずる融合タンパク質はｈ ＰＡＫ６５断片により付与された機能的性質を示す。例えば、融合タンパク質Ｇ ＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅ（アミノ酸４９〜１１３を含有する）は、ｒａｃ１および ＣＤＣ４２Ｈｓに特異的に結合する能力を保持する。また、１または２以上の機 能的ドメインが欠失されたポリペプチドは、断片を欠如することによって通常付 与された性質の喪失を示すであろう。例えば、ヌクレオチド１０６５〜２２４８ を含有するｈＰＡＫ６５Ｎ−末端トランケートタンパク質はセリンキナーゼ活性 を保持しなかった。 好ましい態様の１つのクラスは、機能的ドメインの境界付近のアミノ酸位置に 対応するアミノ末端および／またはカルボキシ末端を有する断片であるが、別の 断片を製造することができる。このような断片のアミノ末端およびカルボキシ末 端の選択は実施者の判断に従い、そして実験の考察、例えば、構築の容易さ、タ ンパク質分解に対する安定性、熱安定性、免疫学的反応性、アミノ末端またはカ ルボキシ末端の残基の修飾、または他の考察に基づいてなされるであろう。 断片に加えて、ｈＰＡＫ６５の類似体を作ることができる。このような類似体 は、アミノ末端またはカルボキシ末端における、または内部的、または双方にお ける、アミノ酸配列の１または２以上の 欠失または付加を包含する；類似体はさらに配列の転位を包含することができる 。類似体は、また、アミノ酸の置換、好ましくは保存的置換を含むことができる 。さらに、類似体はアミノ末端またはカルボキシ末端において一般に連鎖された 異種配列を含むことができ、ここで１または２以上の異種配列は、天然のｈＰＡ Ｋ６５タンパク質に対して固有でない機能的性質を、生ずる類似体に付与する。 しかしながら、類似体は天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部分に対して実質 的な同一性を有する２５アミノ酸のセグメントを含んでならなくてはならない。 好ましいアミノ酸置換は下記のものである：（１）タンパク質分解に対する感受 性を減少するもの、（２）酸化に対する感受性を減少するもの、（３）ｈＰＡＫ ６５−ｐ２１タンパク質複合体を形成する結合アフィニティーを変更するもの、 （４）セリンキナーゼ活性のためのタンパク質の基質に対するｈＰＡＫ６５複合 体を形成する結合アフィニティーを変更するもの、および（４）このような類似 体の他の物理化学的または機能的性質を付与または修飾するもの。類似体は、天 然に存在するペプチド配列以外のｈＰＡＫ６５配列の種々の突然変異タンパク質 を含むことができる。例えば、単一または多数のアミノ酸置換（好ましくは保存 的アミノ酸置換）を天然に存在する配列（好ましくは分子間接触を形成する１ま たは２以上のドメインの外側のポリペプチドの一部分）において行うことができ る。 保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特性を実質的に変化させてはならない（ 例えば、置換アミノ酸は親配列中で起こるらせんを破壊する傾向があってはなら ず、または親配列を特性決定する二次構造の他の型を崩壊してはならない）。こ の分野において認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、下記 の文献に記載されている：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、（１９８４）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （編）、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉ ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、（１９ ９１）Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５；これらは引用することによって本 明細書の一部とされる）。 ｈＰＡＫ６５のペプチド類似体、またはその一部分を製剤または商用研究試薬 として使用することは有利であろう。例えば、ｐ２１タンパク質と結合する高い アフィニティーを有するｈＰＡＫ６５のペプチド類似体を、天然のｈＰＡＫ６５ とｐ２１タンパク質に対する結合について競合させることによって、ｈＰＡＫ６ ５−ｐ２１タンパク質複合体の形成の競合的インヒビターとして使用することが できる。 天然に存在するアミノ酸のみから成るポリペプチドに加えて、ペプチド模倣物 がまた提供される。ペプチド類似体は、普通に製剤産業において、鋳型ペプチド の性質に類似する性質を有する非ペプチドの薬物として使用される。非ペプチド の化合物のこれらの型は、「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティックス 」と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ ｐ ．３９２；およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．３０：１２２９、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）、 そして通常コンピューター化された分子モデル化により開発される。治療的に有 用なペプチドに構造的類似するペプチド模倣物は、同等の治療または予防の効果 を生成するために使用することができる。一般に、ペプチド模倣物は、パラダイ ムポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプ チド）、例えば、ヒトＰＡＫ６５に構造的に類似するが、この分野において知ら れており、かつ下記の文献にさらに記載されている方法により、−ＣＨ₂ＮＨ− 、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、 −ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−、および−ＣＨ₂ＳＯ−から成る群より 選択される連結により必要に応じて置換された１または２以上のペプチド連鎖を 有する：Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．ｉｎ″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎ ｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，″Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋ ｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ． 、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３）、Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ ３ 、″Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ″（ｇｅ ｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａ ｒｍ．Ｓｃｉ．（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉ ｅｗ）；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．（１９７９）１４：１７７−１８５（−ＣＨ₂ＮＨ−、ＣＨ₂ＣＨ₂−） ；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９８６）３ ８：１２４３−１２４９（−ＣＨ₂−Ｓ）；Ｈａｎｎ、Ｍ．Ｍ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ ．Ｓｃｉ．Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｉ（１９８２）３０７−３１４（−ＣＨ −ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ、Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． 、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ₂ −）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ− Ｗｈｉｔｅ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８ ２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ2 −）；Ｓｚｅｌｋｅ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、 欧州特許出願ＥＰ第４５６６５号（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８ ２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ、Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３）２４：４４０１−４４０４ （−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；およびＨｒｕｂｙ、Ｖ．Ｊ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． （１９８２）３１：１８９−１９９（−ＣＨ₂−Ｓ−）；それらの各々は引用す ることによって本明細書の一部とされる。特に好ましい非ペプチドの連結は−Ｃ Ｈ₂ＮＨ−である。このようなペプチド模倣物はポリペプチドの態様を越えた有 意な利点を有し、これらの利点には下記のものが包含される：例えば、より経済 的な製造、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、 効力、効能、およびその他）、変更された特異性（例えば、生物学的活性の広い スペクトル）、抗原性の減少、およびその他。ペプチド模倣物の標識化は、通常 、定量的構造−活性のデータおよび／または分子のモデル化により予測されるペ プチド模倣物上の１または２以上の非妨害位置に、直接またはスペーサー（例え ば、アミド基）を介して、１または２以上の標識を共有結合で取付けることを包 含する。このような非妨害位置は、一般に、ペプチド模倣物が治療的効果を生成 するために結合する１または２以上の高分子と直接接触を形成しない（例えば、 ｈＰＡＫ６５−ｐ２１複合体中の接触点ではない）位置である。ペプチド模倣物 の誘導化（例えば、標識化）は、ペプチド模倣物の所望の生物学的または薬理学 的活性を実質的に妨害してはならない。 コンセンサス配列の１または２以上のアミノ酸と同一型のＤ−アミノ酸との系 統的置換（例えば、Ｌ−リジンのＤ−リジンによる置 換）を使用して、より安定なペプチドを発生させることができる。さらに、コン センサスペプチドまたは実質的に同一のコンセンサス配列の変異型を含んでなる 拘束されたペプチドは、この分野において知られている方法（ＲｉｚｏおよびＧ ｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７、 引用することによって本明細書の一部とされる）により、例えば、ペプチドを環 化する分子内ジスルフィド架橋を形成できる内部のシステイン残基を付加するこ とによって、発生させることができる。 ヒトＰＡＫ６５ｃＤＮＡ配列が同定され、そしてヒトゲノムのクローンのライ ブラリー、例えば、酵母の人工的染色体、コスミド、またはバクテリオファージ λ（例えば、λＣｈａｒｏｎ３５）中のヒトゲノムのライブラリーを、第２Ａ図 に示すｃＤＮＡ配列の少なくとも３０の隣接ヌクレオチドの配列（またはそれら の補体）を含んでなるポリヌクレオチドのプローブでスクリーニングすることに よって、ゲノムのクローンを単離することができる。典型的には、ハイブリダイ ゼーションおよび洗浄の条件は慣用のハイブリダイゼーション手順に従い高いス トリンジェンシーにおいて実施される。陽性のクローンを単離し、配列決定する 。例示を目的とし、限定を意図せず、第２Ａ図の配列に対応する全長のポリヌク レオチドを単離し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用してλＥＭＢＬ ４またはλＧＥＭ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓ ｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中のヒトゲノムのクローンのライブラリーからゲノ ムのクローンを単離することができる；プラークのリフトをスクリーニングする ために典型的なハイブリダイゼーション条件（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（ １９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０）は下記の通りであることができる ：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣまたはＳＳＰＥ、１〜５×デン ハルト溶液、０．１〜１％ＳＤＳ、１００〜２００μｇ剪断異種ＤＮＡまたはｔ ＲＮＡ、０〜１０％デキストラン硫酸、１×１０⁵〜１×１０⁷ｃｐｍ／ｍｌの変 性プローブ（約１×１０⁸ｃｐｍ／μｇの比活性を有する）、および４２℃にお いて約６〜３６時間のインキュベーション。プレハイブリダイゼーションの条件 は本質的に同定であるが、ただしプローブを含めず、そしてインキュベーション を典型的には減少する。洗浄条件は典型的には１〜３×ＳＳＣ、０．１〜１％Ｓ ＤＳ、５０〜７０℃、約５〜３０分における洗浄溶液の交換。アレレ配列を包含 する、同種のヒト配列がこの方法において得ることができる。 非ヒトｃＤＮＡおよびゲノムのクローン（すなわち、同種の非ヒトＰＡＫ６５ 遺伝子）は、この分野において入手可能な種々の非ヒトｃＤＮＡおよびゲノムの クローンのライブラリー（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロア ルト）から、第２Ａ図に示す配列に基づくプローブを使用することによって、同 様に単離することができ、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は典型的に はヒトクローンの単離よりも低いストリンジェンシーである。最も好ましい態様 は、マウスからのＰＡＫ６５遺伝子である。 第２Ａ図に示すヌクレオチド配列に対応するか、またはそれに対して相補的で ある、ほぼ３０〜５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド の配列を含んでなるポリヌクレオチドは、ｈＰＡＫ６５に密接に関係する生殖細 胞系遺伝子を同定および単離するためのＰＣＲプライマー（少なくとも１０ヌク レオチド）および／またはハイブリダイゼーションプローブとして働くことがで きる。これらの生殖細胞系遺伝子はヒトであるか、または他の哺乳動物の種、好 ましくは霊長類またはマウスからのものであることができる。このような生殖細 胞系遺伝子は、この分野において慣用の 種々の方法により単離することができ、このような方法は下記のものを包含する が、これらに限定されない：バクテリオファージλにおけるゲノムのライブラリ ーまたはコスミドライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、また は第２Ａ図に示す配列から誘導されたプライマーを使用するゲノムの配列のＰＣ Ｒ増幅。ヒトゲノムライブラリーは一般に入手可能であるか、またはヒトＤＮＡ からあらたに構築することができる。 特にネズミ同種ＰＡＫ６５遺伝子の、ＰＡＫ６５のゲノムのクローンを使用し て、好ましくは切除されたＰＡＫ６５アレレに対してホモ接合性である、少なく とも１つの機能的に崩壊されたＰＡＫ６５アレレを有する細胞およびトランスジ ェニック非ヒト動物を発生させるための、相同性標的構築物を構築することがで きる。相同性標的構築物の構築の手引きは、この分野において見出すすることが でき、例えば、下記の文献に記載されている：Ｔａｈｅｒｎｔｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：１８０；Ｊａｓｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．４：１５７；Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．（１ ９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２１０；Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９ ９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：１６１；Ｇｒｕｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１４１７；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９ ２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５４３、引用することによって本明 細書の一部とされる）。相同性ターゲティングを使用して、不活性化ＰＡＫ６５ アレレに対してヘテロ接合性またはホモ接合性である、いわゆる「ノックアウト 」マウスを発生させることができる。このようなマウスは、ＰＡＫ６５依存性症 状、例えば、細胞の構造的完全性、新形成、細胞の増殖、シグナルのトランスダ クション、薬物のスクリーニング、および他の用途 の研究のための研究用動物として商業的に販売することができる。 キメラの標的マウスは、下記の文献に従い誘導される：Ｈｏｇａｎ、ｅｔ ａ ｌ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）およびＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８７）、これらは引用することによって 本明細書の一部とされる。胚幹細胞は発表された手法に従い操作される（Ｔｅｒ ａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ ｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏ ｎ、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８７）； Ｚｊｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５； およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：７９９；これら各々は引用することによって本明細書の一部とされる） 。 さらに、ＰＡＫ６５ｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子のコピーを使用して、前述し たように、高いレベルにおいて、および／またはＰＡＫ６５遺伝子に対して隣接 して天然に存在しない転写制御配列の転写制御下に、ＰＡＫ６５ポリペプチドを 発現するトランスジーンを構築することができる。例として、限定を意図しない で、構成的プロモーター（例えば、ＨＳＶ−ｔｋまたはｐｇｋプロモーター）ま たは細胞系列特異的転写調節配列（例えば、アルブミン、エラスターゼ、または ＣＤ４またはＣＤ８遺伝子プロモーター／エンハンサー）を、ＰＡＫ６５をコー ドするポリヌクレオチド配列に作用可能 に連鎖して、トランスジーン（典型的には選択可能なマーカー、例えば、ｎｅｏ 遺伝子発現カセットと組み合わせて）を形成することができる。このようなトラ ンスジーンは細胞（例えば、ＥＳ細胞、造血幹細胞、培養された一次肝細胞）の 中に導入することができ、そしてトランスジェニック細胞およびトランスジェニ ック非ヒト動物を慣用法に従い得ることができる。トランスジェニック細胞およ びトランスジェニック非ヒト動物を使用して、抗新形成剤についてスクリーニン グし、および／または潜在的細胞増殖変調剤についてスクリーニングすることが できる。なぜなら、ＰＡＫ６５の過度の発現またはＰＡＫ６５の不適切な発現は 過度に高いか、または低い増殖状態を生ずるからである。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の既知の化学的オリゴヌク レオチド合成法により合成することができる。このような方法は、一般に、例え ば、下記の文献に記載されている：Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｏｒｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ。ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ（Ｈ ．、Ｉｂｅｌｇａｕｆｓｔｓ ｔｒａｎｓ．１９８７）。任意の既知のオリゴヌ クレオチド合成法を、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造において 利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最も有利には、商 業的に入手可能な自動化核酸合成装置を使用して製造される。本明細書において 記載するオリゴヌクレオチドの製造に利用される装置であるアプライド・バイオ システムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ ＤＮＡ合成装 置は、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学を利用する。ｍＲＮＡ転写物の 任意の部分とハイブリダイゼーション可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドは 、この分野において知られ いるオリゴヌクレオチド合成法により製造することができる。任意の長さのオリ ゴヌクレオチドを本発明の実施において利用することができるが、１２塩基より 短い配列は標的ＰＡＫ６５ｍＲＮＡに対してハイブリダイゼーションの特異性が 低いことがあり、そして酵素の消化によりいっそう容易に破壊されやすい。それ ゆえ、１２またはそれ多いヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは好ましい 。１８〜２１ヌクレオチドより長い配列は、標的細胞による吸収が減少するので 、ＰＡＫ６５の翻訳の阻害において多少有効さに劣ることがある。したがって、 １２〜２１ヌクレオチドのオリゴマー、特に１２〜１８ヌクレオチドのオリゴマ ーは本発明の実施において最も好ましい。ＰＡＫ６５ｍＲＮＡ転写物の任意の部 分に対して相補的でありかつそれとハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレ オチドは、原理的には、転写物の翻訳の阻害において有効であり、そして本明細 書に記載する効果を誘導することができる。開始コドンにおけるまたはその付近 の部位においてｍＲＮＡをブロックすることによって、翻訳は最も有効に阻害さ れる。したがって、ＰＡＫ６５ｍＲＮＡ転写物の５’末端領域に対して相補的な オリゴヌクレオチドは好ましい。ハイブリダイゼーションを妨害することがある 二次または三次構造物は、この領域において最小である。そのうえ、リボソーム がアンチセンス／センス二重らせんをほどいてメッセージの翻訳を可能とすると 仮定される「リードスルー」現象のために、開始部位から３’方向において遠す ぎる配列はｍＲＮＡ転写物のハイブリダイゼーションにおいて有効さが低いこと がある。（参照、例えば、Ｓｈａｋｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ ２６１ ：１６０１８（１９８６））。タンパク質の合成のために、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンにおけるか、またはその付近の部位に向いてい ることが好ましい。開始コドンを含むＰ ＡＫ６５ｍＲＮＡの一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドは好ましい。Ｐ ＡＫ６５転写物の５’末端領域、特に開始コドンを含む領域に対して相補的なア ンチセンスオリゴマーは好ましいが、有用なアンチセンスオリゴマーはｍＲＮＡ 転写物の翻訳された部分において見出される配列に対して相補的なものに限定さ れず、また、５’−および３’−非翻訳領域の中に含有されるか、またはその中 に延びるヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴマーを包含することを理解す べきである。アンチセンスヌクレオチドまたはアンチセンス発現構築物を使用し て、抗新形成剤についてスクリーニングし、および／または潜在的細胞増殖変調 剤についてスクリーニングすることができる。なぜなら、ＰＡＫ６５の不適切な 発現は過度に高いか、または低い増殖状態を生ずることがあるからである。 本明細書において決定したように、ｈＰＡＫ６５と呼ぶヒトタンパク質が存在 し、これはＧＴＰ依存的方法においてｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓと相互作用 するが、ｒｈｏＡと相互作用しない６５ｋＤａのタンパク質である（還元性条件 下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した；推定されたアミノ酸配列に基づく分子量 は５６．５ｋＤａである）。ヒトＰＡＫ６５ｍＲＮＡはヒト組織において偏在的 に発現される。組換えｈＰＡＫ６５は内因性ｐ６５と同一の特異性を示す；双方 はＧＴＰ依存的方法においてｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓに結合することがで きる。ｒａｃ１およびＣＤＣ４２ＨｓのＧＴＰ結合形態は、セリン残基上におい てのみｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を誘発する。ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ により活性化されたｈＰＡＫ６５は、同一部位においてリン酸化される。ｒａｃ １またはＣＤＣ４２ＨｓによるｈＰＡＫ６５の自己リン酸化の誘発は、タンパク 質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）に向かうｈＰＡＫ６５の ｈＰＡＫ６５活性を刺激し、いったんｈ ＰＡＫ６５が活性化されると、その活性を保持するために、ｒａｃ１またはＣＤ Ｃ４２Ｈｓはもはや要求されない。非リン酸化およびリン酸化ｈＰＡＫ６５に対 するｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓのアフィニティーは類似した。ヒトＰＡＫ６ ５はＣＤＣ４２Ｈｓの固有のＧＴＰアーゼ活性に対して限界の作用、およびＧＡ Ｐｐ１９０刺激されたＧＴＰアーゼ活性のいっそう有意な阻害を有した。これら のデータは、ｈＰＡＫ６５がｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓのエフェクター分子 として機能するモデルと一致する。 したがって、本発明のｈＰＡＫ６５核酸およびポリペプチドは、新しいタンパ ク質キナーゼ活性を提供することによって、ヒトｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓ が関係する経路に影響を与えか、またはそれを変調するとき、ｈＰＡＫ６５が関 係する経路および疾患を同定するとき、そしてｈＰＡＫ６５の活性およびそれが 関係する経路に影響を与えか、またはそれを変調する物質を同定するとき、特定 の用途を見出す。このようなｐ２１タンパク質を変調する物質は、新形成、リン パ増殖性症状、関節炎、血管形成、炎症、自己免疫疾患、アポプトーシス、およ びその他の治療用の新規な化学療法剤を提供することができる。 本発明者らは、ある種のｐ２１タンパク質が生理学的条件下にｈＰＡＫ６５と 結合して、高いアフィニティーの分子間複合体を形成すること、そしてこれらの 複合体が変更された「オーバーレイアッセイ」およびＥＬＩＳＡを包含する多数 のアッセイにより検出されることを証明した。ｐ２１タンパク質−ｈＰＡＫ６５ 複合体は、ある種のｐ２１タンパク質依存性（好ましくはｒａｃ１およびＣＤＣ ４２Ｈｓ）およびｈＰＡＫ６５依存性経路を変調することができる物質のための 標的であり、特に新規な化学療法的または化学予防的抗新形成および免疫調節剤 のための標的である。例えば、新形成お よび／または前新形成細胞におけるｒａｃ１：ｈＰＡＫ６５の相互作用を変更す る物質を、有効なヒト治療薬物として開発することができる。候補の抗新形成剤 は、試験管内および／または生体内においてｒａｃ１：ｈＰＡＫ６５複合体を形 成する能力、および／または生体内においてｈＰＡＫ６５タンパク質キナーゼ機 能を阻害する（例えば、ｈＰＡＫ６５依存的経路において下流の細胞標的をリン 酸化するｈＰＡＫ６５の能力をブロックする）能力により同定することができる 。したがって、抗新形成剤および免疫調節剤を同定する方法は本発明により今回 提供される。 次いで、ヒト抗新形成薬物として使用するための適当性を予測するために日常 的に使用されるアッセイにおいて、候補の抗新形成剤を抗新形成活性についてさ らに試験する。これらのアッセイの例は下記のものを包含するが、これらに限定 されない：（１）定着独立の形質転換された細胞が柔寒天中で増殖する能力を候 補の物質が阻害する能力、（２）ｎｕ／ｎｕマウスの中に移植された形質転換さ れた細胞の腫瘍発生性を減少する能力、（３）形質転換された細胞の形態学的形 質転換を逆転する能力、（４）ｎｕ／ｎｕマウスにおいて移植された腫瘍の増殖 を減少する能力、（５）自発的または化学的に誘発された発癌性の動物モデルに おける腫瘍または腫瘍発生前の細胞の形成を阻害する能力、および（６）物質を 適用した形質転換された細胞におけるいっそう分化した表現型を誘発する能力。 ｈＰＡＫ６５は好中球の中に豊富に存在するので、ｈＰＡＫ６５活性を増強ま たは阻害する物質は免疫調節剤として、例えば、炎症反応、移植片／宿主の反応 、または自己免疫症状、神経変性疾患、新形成、およびその他を減衰する働きを することができる。 ｈＰＡＫ６５変調剤（例えば、候補の抗新形成剤）を同定できるアッセイの１ つのカテゴリーは結合阻害アッセイであり、ここにお いて、ｐ２１タンパク質：ｈＰＡＫ６５の結合が物質の非存在において起こる水 性結合条件下に、ｈＰＡＫ６５ポリペプチドに結合したｐ２１タンパク質ポリペ プチド（好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ）を含んでなる結合複合体の 形成を阻害する能力について、物質を個々に（またはプールで）評価する（実施 例を参照のこと）。機能的ｐ２１タンパク質：ｈＰＡＫ６５複合体の形成または 活性を妨害する物質についてスクリーニングすることによって、ｈＰＡＫ６５変 調剤（例えば、候補の抗新形成剤）を同定することができる。ｈＰＡＫ６５ポリ ペプチドに対するｒａｃ１ポリペプチドの結合を阻害する物質は、ｈＰＡＫ６５ 変調剤（例えば、候補の抗新形成剤）として同定される。 本発明のスクリーニングアッセイは、アッセイ成分の単離されたまたは精製さ れた形態を利用することができる（ｈＰＡＫ６５ポリペプチドまたはｐ２１タン パク質ポリペプチド、好ましくはｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓ）。これは天然 の環境（例えば、細胞の細胞質または核画分）から、または組換え製造により、 少なくとも約１０〜５０％の純度に分離された、本発明のポリペプチドを意味す る。実質的に純粋な組成物は、均質性に近づく、すなわち、約８０〜９０％の純 度、好ましくは９５〜９９％の純度、最も好ましくは９９％より大きい純度であ る、このようなポリペプチドまたは複合体を包含する。好ましい態様は結合アッ セイを包含し、このアッセイにおいて、組換え法により製造されるか、または化 学的に合成されたｈＰＡＫ６５ポリペプチドと組み合わせたｒａｃ１またはＣＤ Ｃ４２Ｈｓを使用する。 追加の好ましい態様は、実験用試薬としてよりすぐれた安定性を有するｐ２１ タンパク質またはｈＰＡＫ６５類似体を含む。例えば、好ましい類似体は、１ま たは２以上の結合反応において存在する タンパク質分解活性による分解に対して耐性であることができ、および／または 酸化的不活性化に対して耐性であることができる。このような類似体は、タンパ ク質分解性切断部位を除去し、および／または酸化的不活性化に対して応答性の 残基（例えば、メチオニン、システイン）を置換する、アミノ酸置換を含むこと ができる。しかしながら、類似体は少なくとも１または２以上の制御結合アッセ イにおいて機能的でなくてはならない；したがって、結合アッセイにおける類似 体の機能的実用性を破壊するか、または有意に分解するアミノ酸置換を包含する 類似体は、このようなアッセイにおいて使用されない。好ましいｈＰＡＫ６５ｐ ２１タンパク質結合ポリペプチドは、ｈＰＡＫ６５のアミノ酸４９〜１１３を含 有し、より好ましい形態は融合タンパク質ＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅである。キナ ーゼ阻害アッセイのために好ましいポリペプチドは、構成的に活性なｈＰＡＫ６ ５である。この好ましいポリペプチドは、キナーゼ活性を阻害する調節ドメイン を欠如するトランケーションであるか、またはセリン３８０、セリン３８３およ び／またはスレオニン３８４のグルタミン酸またはアスパラギン酸置換である。 好ましいｐ２１タンパク質類似体は、取付けられた同定標識部分、好ましくは抗 体により認識可能なペプチドエピトープ標識を有する。好ましい標識は、実施例 において提供されたような、Ｍｙｃ−エピトープおよびＧｌｕ−Ｇｌｕペプチド の標識である。また、アミノ酸４８９〜４９１（すなわち、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌ ｅｕ）が非構成的に置換されているか、または除去されている、Ｃ−末端の突然 変異を有するｈＰＡＫ６５は好ましい。この型の１つの構成的に活性なｈＰＡＫ ６５態様は、アミノ酸４８２〜５０６の欠失である。好ましい態様は、前述のｍ ｙｃ−エピトープ標識化ｒｈＰＡＫ６５および４８２〜５０６欠失の双方を有す る。 これらのスクリーニング方法は、ｐ２１タンパク質またはｈＰＡＫ６５ポリペ プチドを多数の適当なマーカー、例えば、放射性標識（例えば、¹²⁵Ｉまたは³² Ｐ）、種々の蛍光標識および酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ ーゼ、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ）の任意のもので標識化す ることを包含することができる。必要に応じて塩基性結合アッセイについて、標 的ポリペプチドを標準的技術により固定化することができる。例示として、限定 を意図しないが、このような固定化は固体の支持体、例えば、クロマトグラフの マトリックス、マイクロタイタープレートのウェルへの結合によるか、または帯 電した表面、例えば、ナイロン６６膜への結合により実施することができる。 結合アッセイは、一般に、２つの形態の１つを取る：固定化されたｈＰＡＫ６ ５ポリペプチドを使用して１または２以上の標識化ｐ２１タンパク質ポリペプチ ドを結合するか、または逆に、１または２以上の固定化されたｐ２１タンパク質 ポリペプチドを使用して標識化ｈＰＡＫ６５ポリペプチドを結合することができ る。各場合において、添加した物質の非存在において１または２以上のポリペプ チドの特異的結合を可能として複合体を形成する水性条件下に、標識化ポリペプ チドを固定化ポリペプチドと接触させる。慣用法に従い実施者が特定の水性条件 を選択することができる。一般的手引きのために、下記の緩衝化水性条件を使用 することができる：１０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのＴｒｉｓ Ｈ Ｃｌ、ｐＨ５〜８、必要に応じて１種または２種以上の２価のカチオンおよび／ または金属キレート剤および／または非イオン洗浄剤および／または膜画分を添 加する。当業者は理解するように、これらの基本的条件について、添加、希釈、 変更（例えば、ｐＨ）および置換（例えば、ＮａＣｌの代わりにＫＣｌの使用ま たは緩衝液の置換）を行う ことができる。ｈＰＡＫ６５ポリペプチドに対する１または２以上のｐ２１タン パク質ポリペプチドの特異的結合が１または２以上の対照反応において起こるか ぎり、基本的結合反応条件に対する変更を行うことができる。対照反応において 特異的結合を可能としない条件（物質を含めない）は、結合アッセイにおいて使 用するために不適当である。本明細書において決定したように、ヒトｒｈｏＡは ｈＰＡＫ６５に結合せず、またはそれを活性化しない。 好ましくは、少なくとも１つのポリペプチド種を検出可能なマーカーを標識化 する。適当な標識化は下記のものを包含するが、これらに限定されない：放射性 標識化アミノ酸の組込みによる放射性標識化（例えば、¹⁴Ｃ標識化ロイシン、³ Ｈ標識化グリシン、³⁵Ｓ標識化メチオニン）、¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを使用する翻訳 後の放射性標識化により放射性標識化（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ反 応およびクロロアミンＴ）、³²Ｐを使用する翻訳後のリン酸化による標識化（例 えば、ホスホリラーゼおよび無機放射性標識化ホスフェート）、蛍光標識の組込 みによる蛍光標識化（例えば、フルオレセインまたはローダミン）、または他の 慣用のこの分野において知られている方法による標識化。ポリペプチド種の１つ を基質への結合により固定化する態様において、他のポリペプチドは一般に検出 可能なマーカーで標識化される。好ましいフォーマットはＥＬＩＳＡアッセイで あり、ここで標識はペプチドのエピトープであり、このエピトープは抗体により 特異的に認識され、そして、例えば、化学的または酵素的接合によるか、または 好ましくは融合タンパク質を生ずる組換えＤＮＡ法により、タンパク質の１つに 取付けられる。また、ｐ２１タンパク質−ｈＰＡＫ６５結合アッセイにおいて、 ｐ２１タンパク質ＧＴＰアーゼに結合するが、それにより加水分解されない放射 性標識化ＧＴＰγＳを使用して、ｐ２１タンパク質 ポリペプチドを標識化することができる。 さらに、いくつかの態様において、ｐ２１タンパク質またはｈＰＡＫ６５ポリ ペプチドをアクセサリータンパク質（例えば、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏにおい て、ポリペプチドと複合体を形成するタンパク質）と組み合わせて使用すること ができる。各ポリペプチド種について異なる標識を使用し、これにより個々のお よび／またはヘテロ二量体および／またはマルチマーの複合体の結合を区別でき るようにすることが好ましい。例えば、ＣＤＣ４２Ｈｓポリペプチドをフルオレ セインで標識化し、そして異なる励起波長または放射波長、または双方で蛍光を 発する蛍光マーカーで、アクセサリーポリペプチド、例えば、ｐ１９０を標識化 することができる。また、二重標識のシンチレーションカウンティングを使用す ることができ、ここでポリペプチドを１つのアイソトープ（例えば、³Ｈ）で標 識化し、そして識別技術を使用するシンチレーションカウンティングにより区別 できる異なるアイソトープ（例えば、¹⁴Ｃ）で第２ポリペプチド種を標識化する 。 本明細書において記載するように水性条件下に、１または２以上の標識化ポリ ペプチドを１または２以上の固定化ポリペプチドと接触させる。物質が存在しな い対照反応において、選択した条件が特異的結合反応を起こさせるかぎり、結合 反応のインキュベーションの時間および温度を変化させることができる。好まし い態様において、少なくとも約１５℃、より好ましくは３５〜４２℃の反応温度 、および少なくともほぼ１５秒のインキュベーション時間を使用するが、ある態 様において、結合の平衡が達成されるようにするために、より長い期間が好まし い。結合したｐ２１タンパク質：ｈＰＡＫ６５複合体、好ましくはｒａｃ１：ｈ ＰＡＫ６５およびＣＤＣ４２Ｈｓ：ｈＰＡＫ６５またはｈＰＡＫ６５をＧＳＴ− ＰＡＫｅｔｔ ｅで置換した場合の結合の反応速度論および熱力学的安定性は、時間、温度、塩 、ｐＨ、および他の反応条件を変化させる程度を決定する。しかしながら、特定 の態様について、所望の結合反応条件はこの分野における慣用法を使用して容易 に較正することができ、これはスキャッチャード分析、ヒル分析、および他の方 法を使用する結合分析を包含する（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、（１９８４）Ｃｒｅｉｇ ｈｔｏｎ（編）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。 標識化（例えば、ペプチド標識化）ｐ２１タンパク質またはｈＰＡＫ６５ポリ ペプチドの、それぞれ、固定化ｈＰＡＫ６５またはｐ２１タンパク質ポリペプチ ドに対する特異的結合は、１または２以上の非標識化競合物のタンパク質（例え ば、アルブミン）を含めることによって決定される。結合反応が完結した後、固 定化ポリペプチドに特異的に結合した１または２以上の標識化ポリペプチドを検 出する。例えば、結合のために適当なインキュベーション期間後、非固定化タン パク質を含有する水性相を取り出し、そして固定化ポリペプチド種およびそれに 結合した標識化タンパク質を含有する基質を、必要に応じて１または２以上の非 標識化ブロッキング剤を含有する、適当な緩衝液で洗浄し、１または２以上の洗 浄緩衝液を除去する。洗浄後、固定化ポリペプチドに特異的に結合したままであ る検出可能な標識の量を決定する（例えば、光学的、酵素的、免疫学的、オート ラジオグラフィーまたは他の放射線化学的方法、またはそれらの組み合わせによ り）。好ましいフォーマットにおいて、標識は抗体の検出可能なエピトープ（標 識）であり、ここで次いでこの分野において知られている方法により、例えば、 抗体に接合したアルカリ性ホスファターゼの酵素活性を測定することによって、 抗標識抗体を検出することができる。 ある態様において、非特異的結合を阻害する非標識化ブロッキング剤の添加を 含める。このようなブロッキング剤の例は、下記のものを包含するが、これらに 限定されない：仔ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、酵母ＲＮＡ、種々の長さの 混合配列（ランダムまたは偽ランダム配列）オリゴヌクレオチド、ウシ血清アル ブミン、非イオン洗浄剤（ＮＰ−４０、ツイーン、トリトンＸ−１００、および その他）、脱脂ドライミルクのタンパク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリ ドン、フィコール、および他のブロッキング剤。実施者は、彼らの判断において 、結合アッセイにおいて含めるべきブロッキング剤を適当な濃度において選択す ることができる；しかしながら、制御結合反応においてｈＰＡＫ６５ポリペプチ ドとｐ２１タンパク質ポリペプチドとの間の特異的結合を可能とするように、反 応条件を選択する。固定化タンパク質への標識化タンパク質の非特異的結合を阻 害するために、および／または固定化基質への標識化ポリペプチドの非特異的結 合を阻害するために、べきブロッキング剤を含める。 ポリペプチドを固定化する態様において、基質に対する共有結合または非共有 結合を使用することができる。共有結合の化学は、よく特徴づけられたこの分野 において知られている方法を包含するが、これらに限定されない（Ｋａｄｏｎａ ｇａおよびＴｉｊａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ Ｕ．Ｓ．Ａ．）８３：５８８９、これは引用することによって本明細書の一部と される）。１つの例は臭化シアンで誘導化された基質（例えば、ＣＮＢｒ誘導化 セファローズ４Ｂ）であるが、これに限定されない。基質からの潜在的立体障害 性を減少するために、スペーサーを使用することが望ましいことがある。基質に 対する製造の非共有結合は 、帯電した使用の製造の結合および特異的抗体との結合を包含するが、これらに 限定されない。 態様の１つのクラスにおいて、平行結合反応を実施し、ここで１組の反応は対 照として働き、そして反応の少なくとも１つの他の組は種々の量の物質、物質の 混合物、または生物学的抽出物を包含し、これらはｈＰＡＫ６５ポリペプチドに 対するｐ２１タンパク質ポリペプチドの結合を阻害する能力について試験される 。これにより、１または２以上の対照反応に関して結合を阻害する物質は、ｈＰ ＡＫ６５変調剤および／または候補の抗新形成剤および／または候補の免疫調節 剤として同定される。 １つの変法において、ｐ２１タンパク質、好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４ ２ＨｓのＧＴＰアーゼ活性および／またはＧＤＰ−またはＧＴＰ−結合活性をア ッセイの終点として測定する。ｐ２１タンパク質のこれらのグアニンヌクレオチ ド活性の１または２以上を変調するｈＰＡＫ６５ポリペプチドの能力は、スクリ ーニングアッセイのための基準として働く（参照、実施例１−変更されたオーバ ーレイアッセイ；参照、実施例１２）。これにより、ｈＰＡＫ６５の活性を変調 してｐ２１タンパク質グアニンヌクレオチド活性を変調する被検化合物は、ｈＰ ＡＫ６５タンパク質のモジュレーターおよびｐ２１タンパク質のモジュレーター として同定される。 （１）ｒａｃ１ポリペプチドに結合できるｈＰＡＫ６５の結合断片に融合した ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（またはＧＡＬ４アクチベータードメイン）をコー ドする発現カセット、（２）ｈＰＡＫ６５ポリペプチドに結合できるｒａｃ１（ またはＣＤＣ４２Ｈｓ）の結合断片に融合したＧＡＬ４ＤＮＡアクチベータード メイン（またはＧＡＬ４結合ドメイン、それぞれ）をコードする発現カセット、 および（３）シス−連鎖したＧＡＬ４転写応答要素を含んでなるリ ポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を含んでなる酵母は、２つの ハイブリッドスクリーニングアッセイにおいて物質のスクリーニングのために使 用可能である。このような酵母を被験物質とともにインキュベートし、リポータ ー遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の発現を決定する；対照培養物に比 較してリポーター遺伝子の発現を阻害する物質の能力は、その物質を候補のｈＰ ＡＫ６５変調剤またはｐ２１タンパク質変調剤として同定する。 ｈＰＡＫ６５およびｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓポリペプチド、特に複合体 において直接接触を形成する部分は、候補の変調剤（例えば、抗新形成剤および 免疫調節剤）の合理的薬物設計について使用することができる。実質的に精製さ れた複合体および本明細書において提供されたｈＰＡＫ６５の結合相手としての ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓの同定は、タンパク質Ｘ線結晶学または他の構造 分析法、例えば、ＤＯＣＫプログラム（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９；Ｋｕｎｔｚ ＩＤ（１９９２）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５７：１０７８）およびそれらの変法に使用できる、実質的に純粋 なポリペプチド複合体の製造および計算法を可能とする。こうして提供された構 造の情報に基づいて、有効な治療用薬物を合理的に設計することができる。１つ の態様において、タンパク質複合体の形成を防止するように、このような薬物は 設計される。 したがって、本発明は、ｈＰＡＫ６５に対するｐ２１タンパク質、好ましくは ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓの結合を阻害する能力を有する薬物を包含する、 薬物を設計するために使用することができる。本明細書において教示される方法 を使用して、ｈＰＡＫ６５に結合しかつそれを活性化する能力について、他のｐ ２１タンパク質は容易に試験される。 ｈＰＡＫ６５ポリペプチドまたはｈＰＡＫ６５：ｐ２１タンパク質複合体と優 先的に相互作用する化合物の設計は、３次元構造のコンピューター分析を使用し て、開発可能である。１組の分子の候補は、下記のものを使用して決定すること ができる：（１）結晶学のデータ、（２）他の物理的方法により得られたデータ 、（３）推定されたアミノ酸配列のデータ、または、好ましくは、これらのデー タの組み合わせに基づいて操作される、コンピューター化された構造予測プログ ラムにより発生されたデータ。構造を定めるために使用できる物理的方法の例は 、例えば、２次元の等核相関分光学（ＣＯＳＹ）である。外径のＮＭＲ分光学を 使用する当業者について、ＣＯＳＹは単一の周波数の減結合実験（例えば、その スピンは互いにスカラ結合される）から入手可能な種類の情報を提供する。ＣＯ ＳＹプロットにおいて、ＩＤスペクトルは対角線に沿って横たわり、そして対角 線をはずれる要素はＪ結合したグループの化学シフトの交差に存在する。「フィ ンガープリント」領域は、ペプチドの主鎖からの（¹Ｈ^N、¹Ｈ^α）クロス−ピー クを含有する。Ｈ₂Ｏ中で得られたＣＯＳＹ地図の「フィンガープリント」領域 の分解能は、アイソトープの標識化に頼らないで得られるべき配列特異的帰属が 成功したことを予測するすぐれた因子である。トランスファード・ニュークリア ー・オーバーハウザー効果（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ Ｏｖｅ ｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）（ＴＲＮＯＥ）スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）は 、異なる２Ｄ ＮＯＥスペクトルに頼り、そして、本質的に、リガンドがタンパ ク質から解離した直後における、リガンドのコンフォメーションを見る。しかし ながら、ＴＲＮＯＥの使用は、結合したリガンドおよび遊離のリガンドが化学シ フトの時間目盛りで速い交換状態にあることを仮定し、これは約１０^-4Ｍより大 きいか、またはそれに等しいリガンド のＫ_Dに換算される。ＴＲＮＯＥ法は、他のアプローチにより得られた距離の情 報をクロスチェックし、強化するために有用である。 本発明は構造の情報を得るために使用した特定の方法により限定されることを 意図しない。さらに、本発明はいかなる１つの検出器についてのサーチに限定さ れることを意図しない；分子の１または２以上は天然に存在することができるか 、または合成であるか、または天然に存在する分子の化学的変更された形態であ ることができる。 いくつかの態様において、ｈＰＡＫ６５タンパク質の構造を他のタンパク質の 構造と比較することが望ましい。これは選択的にｈＰＡＫ６５に影響を与えるか 、または関係するポリペプチド（例えば、他のｒａｃ１に関係するタンパク質） の１つより多い種に対して広いスペクトルの作用を有する薬物の同定および選択 を促進する。本発明の１つの態様において、ｈＰＡＫ６５タンパク質キナーゼ活 性を決定するアッセイが提供される。 本発明の他の態様において、ｈＰＡＫ６５キナーゼの阻害アッセイが提供され 、このアッセイは薬物のライブラリーまたは物質をｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を 阻害する能力についてスクリーニングするために使用できる。本発明の１つの態 様において、ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する物質を同定する方法が提供さ れ、この方法は実質的に精製されたｈＰＡＫ６５、好ましくは活性化されたｈＰ ＡＫ６５、実質的に精製された基質、例えば、ＭＢＰ、およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰ を含有する反応混合物に物質を投与し、次いで前記物質を欠如する対照反応に比 較して、前記物質が基質のリン酸化を阻害する程度を決定することを含んでなる 。 したがって、また、ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する物質を同定するアッ セイキットが提供され、ここでキットは実質的に精製 されたポリペプチドを含有し、このポリペプチドはｈＰＡＫ６５またはより好ま しくは構成的に活性化されたｈＰＡＫ６５または構成的活性を有するその断片を 含有する。活性化されたｈＰＡＫ６５は多数の形態で提供することができ、この ような形態は自己リン酸化された形態、ホスホセリンを模擬するアミノ酸、例え ば、ＧｌｕまたはＡｓｐにより置換された少なくとも１つの自己リン酸化−標的 セリンを有する類似体（ＨｕａｎｇおよびＥｒｉｋｓｏｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：８９６０−８９６３）、およびセリンキ ナーゼ活性を阻害するｈＰＡＫ６５の調節ドメインが欠失されているＮ−末端の トランケートされた形態を包含する。このアッセイキットは、さらに、実質的に 精製された基質、例えば、ＭＢＰを含有し、そしてさらに緩衝化水溶液およびγ −³²Ｐ−ＡＴＰを含有することができる。ｈＰＡＫ６５の好ましい選択置換され 、構成的に活性化された形態は、アミノ酸位置３８１または３８３のいずれかま たは双方がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換された形態である。位置３ ８４におけるスレオニンはグルタミン酸またはアスパラギン酸で必要に応じて置 換することができる。また、アミノ酸４８９〜４９１（すなわち、Ｓｅｒ−Ｓｅ ｒ−Ｌｅｕ）が修飾または除去されているＣ−末端の突然変異を有するｈＰＡＫ ６５は好ましい。この型の１つの態様はアミノ酸４８２〜５０６の欠失を有する 。好ましい態様は前述のｍｙｃエピトープの標識および４８２〜５０６の欠失の 双方を有する。 本発明の１つの態様において、ｈＰＡＫ６５キナーゼを阻害する方法が提供さ れ、この方法は本明細書において記載するｈＰＡＫ６５キナーゼ阻害アッセイに おいて決定してｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する能力を有する物質と、ｈＰ ＡＫ６５キナーゼを含有する組成物を接触させる工程を含む。好ましくは、組成 物は哺乳動物 の体液を含んでなり、より好ましくは体液は血液または血液の画分である。好ま しくは、ＰＡＫ６５はヒトＰＡＫ６５である。この方法は、さらに、前記インヒ ビターの存在または非存在において前記体液中のｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を測 定し、そして前記ｈＰＡＫ６５活性を前記組成物中のｈＰＡＫ６５キナーゼまた はｈＰＡＫ６５キナーゼの基質の濃度に関係づける工程を含む。接触は生体内に おいて行うことができる。 本発明の他の態様において、哺乳動物におけるＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患 を抑制する医薬組成物が提供され、この医薬組成物はｈＰＡＫ６５キナーゼ活性 アッセイにおいて決定してｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する能力を有する物 質と、薬学上許容される担体とを含んでなる。 本発明のなお他の態様において、ＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患を抑制する方 法が提供され、この方法はｈＰＡＫ６５キナーゼ阻害活性アッセイにおいて決定 してｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する能力を有する物質を、ＰＡＫ６５キナ ーゼ依存性疾患を抑制する量において、ＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患に罹った 哺乳動物に投与する工程を含む。 また、ＰＡＫ６５ｐ２１−結合活性を阻害する化合物を同定する方法が提供さ れる。この方法は、実質的に精製されたＰＡＫ６５を含んでなる反応混合物に、 実質的に精製されたｐ２１タンパク質と混合した化合物を投与し、そして前記化 合物を欠如する対照反応に比較して、前記物質が結合を阻害する程度を決定する 工程を含む。 本発明の他の態様において、ｈＰＡＫ６５ｐ２１−結合活性を阻害する方法が 提供され、この方法は、ｈＰＡＫ６５ｐ２１−結合阻害アッセイにおいて決定し て、ｈＰＡＫ６５ｐ２１−結合活性を阻害する能力を有する物質とｈＰＡＫ６５ を含有する組成物を接触さ せる工程を含む。 したがって、また、ｈＰＡＫ６５ｐ２１−結合活性を阻害または変調する物質 を同定するアッセイキットが提供され、このキットは実質的に精製されたｈＰＡ Ｋ６５を含む。このアッセイキットは、必要に応じて、実質的に精製されたｐ２ １タンパク質、好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ、緩衝化水溶液、ＧＴ ＰγＳ、またはｒａｃ１またはＣＤＣ４２ＨｓのＮ−末端に取付けられたＧｌｕ −Ｇｌｕエピトープ標識に対する抗体を含有することができる。ＧＴＰγＳは、 ｐ２１ＧＴＰアーゼによりＧＤＰに加水分解されることができないＧＴＰの１形 態である。 ｈＰＡＫ６５結合したｐ２１タンパク質からのホスフェートの遊離を阻害また は変調する物質を同定する方法が提供される。この方法は、実質的に精製された ｐ２１タンパク質を、実質的に精製されたｈＰＡＫ６５を含有する反応混合物と 接触させて、ｐ２１タンパク質−ＰＡＫ６５複合体を形成し、次いで複合体を被 験物質と接触させ、次いで前記物質を欠如する対照反応に比較して前記物質がホ スフェートの遊離を阻害する程度を決定する工程を含む。ｈＰＡＫ６５は固体の 支持体に結合するか、または溶液中で遊離であることができる。 本発明の他の態様において、ｈＰＡＫ６５結合したｐ２１タンパク質からのホ スフェートの遊離を阻害または変調する物質を同定する方法が提供され、この方 法は、ホスフェート遊離アッセイにおいて決定して、ｈＰＡＫ６５−結合ｐ２１ タンパク質からのホスフェートの遊離を阻害または変調する能力を有する物質と 、ｈＰＡＫ６５−結合ｐ２１タンパク質を含有する組成物を接触させる工程を包 含する。 したがって、また、このようなホスフェートの遊離を阻害または 変調する物質を同定するキットが提供される。このキットは実質的に精製された ｈＰＡＫ６５を含む。このアッセイキットは、必要に応じて、実質的に精製され たｐ２１タンパク質、好ましくはｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ、緩衝化水溶液 、およびＧＴＰγＰ³²を含有することができる。 今回、本発明は、ｈＰＡＫ６５が関係する経路に関係づけられるｈＰＡＫ６５ キナーゼ活性の細胞の基質を同定する能力を最初に提供する。本発明により提供 されるタンパク質および核酸ｈＰＡＫ６５の態様を、好ましくはｈＰＡＫ６５を 発現するとして本明細書において示す組織源または細胞系とともに、特に構成的 に活性化されたｈＰＡＫ６５を適当に使用すると、ｈＰＡＫ６５セリンｈＰＡＫ ６５活性が活性化されるとき、リン酸化される細胞の高分子を同定することがで きる。 本発明の種々の態様により同定される物質のすべては、哺乳動物におけるＰＡ Ｋ６５キナーゼ依存性疾患を抑制するためにｈＰＡＫ６５キナーゼインヒビター として（またはｈＰＡＫ６５−ｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓ結合および／または自 己リン酸化のインヒビターとして）治療において容易に使用することができる。 ＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患は、異常なＰＡＫ６５セリンキナーゼ酵素活性に より開始／維持される過度の増殖性疾患を包含することができる。例は、癌、ア テローム性動脈硬化症、および抗血管形成（例えば、腫瘍の増殖、糖尿病性網膜 症）を包含する。この分野において、治療的に有用なキナーゼ阻害剤は好ましく は選択的であるべきであることが理解される。特異性が欠如するために多数の他 のタンパク質キナーゼを阻害するｈＰＡＫ６５キナーゼインヒビターは、高度に 細胞障害性である。したがって、細胞障害性を測定する日常のアッセイを使用し て、選択的を欠如するために望ましくない副作用を生 成すると思われるＰＡＫ６５インヒビターを同定することができる。選択的のい っそう詳細な試験として、ある範囲の他のタンパク質キナーゼ、例えば、それら の基質として働くアミノ酸に基づいて同定されたタンパク質キナーゼのクラス： チロシンをリン酸化するキナーゼ、チロシンおよびスレオニンをリン酸化するキ ナーゼ、およびセリンおよびスレオニンをリン酸化するキナーゼ、の酵素活性を 阻害する能力について、化合物を試験すべきである。セリンおよびスレオニンを リン酸化するキナーゼの例は、ＲＡＦ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナ ーゼＣ、およびＴＧＦベータレセプターを包含する。キナーゼＭＥＫは、チロシ ンおよびスレオニンをリン酸化するキナーゼの１例である。 キナーゼインヒビターの使用についての下記の説明において、説明はｈＰＡＫ ６５タンパク質キナーゼに集中するが、ｈＰＡＫ６５キナーゼインヒビターとし て化合物の使用についての本明細書における説明は一般にｈＰＡＫ６５の他の活 性の１つに対して特異的である物質の使用に適用可能であることを理解すべきで ある。ある物質がｈＰＡＫ６５キナーゼ活性に対して特異的であるかどうかは、 実施例に記載されているｈＰＡＫ６５活性のアッセイを使用して容易に決定され る。 ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性またはその他の活性の１つを阻害（または変調）す る化合物が治療的に有用であるためには、化合物は完全な細胞に対して活性であ るべきである。ｈＰＡＫ６５に対する候補のｈＰＡＫ６５インヒビター（または モジュレーター）の完全な細胞に対する活性を決定する、いくつかの方法を容易 に利用することができる。抗ホスホセリン抗体またはホスホペプチドフィンガー プリントを使用して、ｈＰＡＫ６５細胞基質のリン酸化を測定することができる 。また、細胞内のシグナリング事象、例えば、カルシ ウムフラックス、リン酸イノシトールの代謝、細胞の増殖、および細胞のＤＮＡ 合成、またはｈＰＡＫ６５依存的経路に関係する他の生理学的プロセスのいずれ をも測定することができる。好ましくは、ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を減少させ 、細胞における全体のリン酸化を減少させ、または細胞を低い形質転換の状態に 復帰させる能力について、候補のｈＰＡＫ６５キナーゼ活性のインヒビターを試 験することができる、形質転換された細胞系に、構成的に活性なｈＰＡＫ６５を 発現するように遺伝子操作された細胞系を導くことができる。 ｈＰＡＫ６５に対するｐ２１タンパク質の結合を阻害または変調する候補の物 質を、構成的に活性な形態に変更された組換えｒａｃ１により形質転換された細 胞系に対して、さらに試験することができる。ｒａｃ１で形質転換された細胞は 、新形成性細胞の特性、例えば、マウスにおいて遺伝子座および腫瘍を形成する 特性を有し、そしてｈＰＡＫ６５のｒａｃ１活性化を阻害する候補の物質の存在 においていっそう正常な状態に復帰することについて分析することができる。 水および温和に疎水性の溶媒の双方の中に本発明の物質は溶解するので、本発 明の物質が細胞膜を横切る可能性は増大されるようである。 本発明の化合物は、遊離酸の形態で、塩の形態で、または水和物として有用で あろう。すべての形態は本発明の範囲内に入る。塩基性塩を形成することができ 、そしてこれらは使用のために単にいっそう好都合な形態である；実際に、塩の 形態の使用は固有的に酸の形態の使用に等しい。塩の調製に使用できる塩基は、 好ましくは、遊離酸と組み合わせたとき、薬学上許容される塩、すなわち、遊離 酸において固有の有益な性質がカチオンに帰属される副作用により 損なわれないように、アニオンが塩の製剤学的投与量において動物の生体に無毒 である塩、を生成するものを包含する。酸性化合物の薬学上許容される塩は好ま しいが、特定の塩それ自体が中間生成物としてのみ望まれる場合においてさえ、 例えば、塩を精製および同定の目的でのみ形成するとき、または塩をイオン交換 体手法により薬学上許容される塩を製造するとき中間体として使用するとき、す べての塩は遊離酸の形態の源として有用である。 ｈＰＡＫ６５望まれる特定のインヒビターまたはモジュレーターとして活性を 有する本発明の範囲内の物質は、ある種の症状、例えば、新形成、炎症、リンパ 増殖性症状、関節炎、自己免疫疾患、アポプトーシス、およびその他の治療のた めの細胞の抗増殖剤として治療上の価値を有する。 本発明の化合物は哺乳動物の宿主に種々の形態で投与することができる、すな わち、それらは、選択した投与のルート、例えば、経口的または非経口的ルート に依存して、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ剤、硬質キャンディー、粉 剤、噴霧剤、エリキシル剤、シロップ剤、注入用溶液または眼点滴溶液、および その他の形態で、種々の薬学上許容される不活性担体と組み合わせることができ る。これに関して非経口投与は、下記のルートにより投与を包含する：静脈内、 筋肉内、皮下、眼内、滑膜内、経上皮（経皮、眼、舌下および頬を包含する）、 局所（眼、皮膚、眼球、経直腸、注入器およびエーロゾルを介する鼻の吸入を包 含する）。 活性化合物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口 的に投与するか、または硬質または軟質ゼラチンカプセルの中に取り囲むか、ま たは錠剤に圧縮するか、または食事の食物の中に直接混入することができる。経 口的治療投与のために、活性化合物は賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、頬錠剤 、トローチ剤 、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、オブラート、およびその他 の形態で使用することができる。このような組成物および調製物は少なくとも０ ．１％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物の百分率は、もち ろん、変化させることができ、好都合には単位の約２〜約６重量％であることが できる。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な投与量 が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または調製物は、経 口投与単位形態が約１〜１０００ｍｇの活性化合物を含有するように、調製され る。 錠剤、トローチ剤、丸剤およびその他は、また、下記の成分を含有することが できる：結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシア ゴム、スクロース、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸カ ルシウム、クエン酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム；崩壊剤、例えば、コーン スターチ、ジャガイモ澱粉、タピオカ澱粉、ある種の錯体ケイ酸塩、アルギン酸 およびその他；滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクおよびステアリ ン酸マグネシウム；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン ；または香味剤、例えば、ペパーミント、ヒメコウジ油またはサクランボの香味 剤。同様な種類の固体状組成物は、また、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセ ル中の充填剤として使用される；この組成物の好ましい物質は、また、ラクトー スまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールを包含する。投与単位形 態がカプセル剤であるとき、それは、前述の種類の物質に加えて、液体担体を含 有することができる。種々の他の物質はコーティングとして、またはそうでなけ れば投与単位の物理的形態を改変するために存在することができる。例えば、錠 剤、丸剤、またはカプセル剤はシェラック、糖または双方でコーティングするこ とができる。シロップ剤またはエリキシル剤は活性化合物、甘味剤としてスクロ ース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素、香味剤、例えば、サ クランボまたはオレンジの香味剤、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに希釈 剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび種々の 同様なそれらの組合わせを含有することができる。もちろん、投与単位形態を製 造するとき使用する物質は製剤学的純粋であり、かつ使用する量において実質的 に無毒であるべきである。さらに、活性化合物は持続放出性調製物および処方物 の中に混入することができる。 活性化合物は、また、非経口または腹腔内に投与することができる。非経口投 与のために、ゴマ油または落花生油または水性プロピレングリコール中の溶液、 ならびに前述の対応する水溶性アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩の水溶 液を使用することができる。このような溶液は、必要に応じて、緩衝化すべきで あり、そして液状希釈剤をまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張とする 。遊離塩基または薬学上許容される塩として活性化合物の溶液を、界面活性剤、 例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合した水中で調製することが できる。また、分散液をグリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれ らの混合中で、そして油中で調製することができる。通常の貯蔵および使用の条 件下に、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。こ れらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射の目的に 適当である。これに関して、使用する無菌の水性媒質のすべては、当業者によく 知られている標準的技術により容易に得ることができる。 注射用に適当な製剤学的形態は、無菌の水性溶液または分散液、および無菌の 注射可能な溶液または分散の即時調合用の無菌の粉末 を包含する。すべての場合において、形態は無菌でなくてはならず、そして注射 容易である程度に流動性でなくてはならない。それは製造および貯蔵の条件下に 安定であり、そして微生物、例えば、細菌および真菌類の汚染に対して保存され なくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グ リセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールおよびその他 ）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒質である ことができる。例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液 の場合において要求される粒度の維持により、そして界面活性剤の使用により、 適切な流動性を維持することができる。種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば 、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルおよびそ の他により、微生物の作用を防止することができる。多くの場合において、等張 剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。吸収を 遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用 により、注射用組成物の吸収を延長することができる。 無菌の注射用溶液は、活性化合物を要求される量において適当な溶媒の中に、 必要に応じて、種々の前述の成分とともに混入し、次いで濾過滅菌することによ って調製される。一般に、分散液は、基本的分散媒質および要求される前述の他 の成分を含有する無菌のビヒクルの中に、滅菌された活性成分を混入することに よって調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合におい て、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらの技術は前 もって濾過滅菌した溶液から活性成分＋任意の追加の成分の粉末を生成する。 局所投与の目的のために、眼への点滴投与に適当な容器の中で、 希薄の無菌の水溶液（通常約０．１％〜５％の濃度）、それ以外は前述の非経口 的溶液に類似する、を調製する。本発明の治療用化合物は、単独で、または薬学 上許容される担体と組み合わせて、哺乳動物に投与することができる。前述した ように、活性成分および担体の相対的比率は、化合物の溶解度および化学的特質 、選択した投与のルートおよび標準の製剤学的実施により決定される。予防また は治療に最も適当な本発明の治療剤の投与量は、投与の形態、選択した特定の化 合物、および治療する特定の患者の生理学的特性とともに変化するであろう。一 般に、少ない投与量を初期に使用し、そして、投与量は、必要に応じて、環境下 に最適な効果に到達するまで、小さい増分で増加されるであろう。経口投与はよ り高い投与量を必要とする。化合物は経口的または非経口的に、または眼点滴剤 として局所的に投与される。医師により薬学分野において知られている方法を使 用して、出発点として動物の研究から典型的には決定される投与量を使用して、 投与量は容易に決定することができる。 本発明を一般的に説明したが、下記の詳細な実施例を参照すると、本発明はさ らによく理解されるであろう。これらの実施例は例示のみを目的とし、特記しな い限り、本発明を限定するとして考慮すべきではない。 実施例実施例１．ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓについての好中性細胞質ゾル中のエフ ェクタータンパク質の同定 ｒａｃ／ＣＤＣ４２Ｈｓについての標的がヒトにおいて存在するかどうかを検 出するために、オーバーレイアッセイを使用して好中性細胞質ゾル中のこのよう な標的を検出した。ＧＴＰアーゼについてのオーバーレイアッセイは、ｒｈｏ様 タンパク質についてＧＴＰ アーゼ活性化タンパク質（「ＧＡＰ」）を検出する方法として最初に記載された （Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９２、これは引用することによって本明細 書の一部とされる）；ライゼイトを含有するニトロセルロースのフィルターを（ γ³²Ｐ）ＧＴＰ結合ｒｈｏ様タンパク質でプロービングすることによって、ＧＴ Ｐの加水分解速度に影響を与えることができるフィルター上のタンパク質を検出 することができ、ＧＡＰｓはＧＴＰからのγＰｉの解放を触媒するので、ＧＴＰ アーゼから放射性標識化Ｐｉの損失を暗いバックグラウンドにわたって明瞭なバ ンドとして可視化された。しかしながら、プロービング条件を変更することによ って、Ｐｉの解放を阻害するエフェクタータンパク質をブロット上の暗いバンド として検出できることが本発明者らにより発見された。本明細書において記載す るように、６５Ｋｄａのマーカー付近においてクラスターする３つの主要なバン ドがヒト好中性細胞質ゾルを使用して検出された。４０μｌのｐ６５（約８０μ ｇのタンパク質）を含有する粗製または部分的に精製された好中性細胞質ゾル画 分を１４％ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に適用し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。この膜を クーマッシーブルー染色により３０秒間染色して、転移されたタンパク質を検出 し、２分間脱染し、１％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のトリト ンｘ−１００および５０ｍＭのＤＴＴを含有するＰＢＳと３０分間インキュベー トした。３０〜５０μｌ（３〜５μｇのタンパク質）のＣＤＣ４２Ｈｓ、ヒトｒ ａｃ１、またはヒトｒｈｏＡ（昆虫Ｓｆ９細胞中で組換えタンパク質として調製 した）を２００μｌの交換緩衝液の中に希釈した：２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６． ５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンｘ−１００ および１μｌの［γ³²Ｐ］ＧＴＰ（５μＣｉ、ＩＣＮ）または［β³²Ｐ］ＧＤＰ （５μＣｉ、ＩＣＮ）。タンパク質を交 換緩衝液と室温において１５分間インキュベートし、次いで１０ｍｌの２５ｍＭ のＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５、０．５ｍＭのＧＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍ ＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのＤＴＴを含有する結合緩衝液と混合した。直ちに 、その後、ヌクレオチドを負荷したタンパク質を使用してフィルタープロービン グした。この混合物を５〜８分間インキュベートし、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐ Ｈ６．５、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０５％のトリトンＸ−１００で５分間洗浄 した。膜を乾燥し、フィルムに２〜３時間露出した。３つの主要な製造がｒａｃ １／ＣＤＣ４２Ｈｓの標的として検出された。さらに、これらのタンパク質は好 中性物質およびＨＬ−６０細胞の細胞質ゾル画分において豊富であることが証明 された。したがって、好中性物質をタンパク質を精製する源として使用した。モ ノ−Ｑカラム上の好中性細胞質ゾルの分画は６８ｋＤａｍｋｆ付近において群化 するバンドを分子大きさ６２、６５および６８ｋＤａの３つの明確なバンドに分 割し、それらのすべてはフィルターをｒａｃ１およびＣＤＣ４２ＨｓのＧＴＰ結 合の形態でプロービングしたときにのみ検出されたが、ＧＴＰ結合ｒｈｏＡでは 検出されなかった。参照、第１図および第３図。実施例２．ｈＰＡＫ６５タンパク質の単離 実施例１において同定された３つのタンパク質のうちで最も豊富であったｐ６ ５バンドを引き続いて単離し、精製した。細胞質ゾルを以前に記載されたように ヒト好中性物質から調製した（Ａｂｏｅｔ ａｌ．、１９９４、これは引用する ことによって本明細書の一部とされる）。すべての精製工程は、ＦＰＬＣシステ ムに接続されたカラム上において、４℃において、１ｍｌ／分の流速で実施し、 １ｍｌの画分を集めた。１０ｍｌ「１０ｍｇ／ｍｌ）の好中性細胞質ゾルを下記 の緩衝液Ａと平衡化したモノ−Ｑカラム（ＨＲ５／ ５ファーマシアＬＫＢ）；緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４ 、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのペ プスタチン。タンパク質を３０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌの勾配で溶離し、 集めた画分をオーバーレイアッセイによりｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓについ てアッセイした。６５タンパク質を含有する画分をプールし、硫酸アンモニウム 沈降させた。硫酸アンモニウム粒子を混合物に１５分かけて添加して、４０％の 飽和を達成した。この溶液を氷上でさらに３０分間撹拌し、引き続いて１００， ０００ｇにおいて１５分間ＴＬＸベックマン超遠心機で遠心した。ペレットを緩 衝液Ａの中にそのもとの体積に懸濁させ、画分をオーバーレイアッセイにより分 析した。上清が４０％の硫酸アンモニウム沈降により得られ、これは所望のｐ６ ５タンパク質を含有し、これをさらに１００ｍＭのＰｉ緩衝液ｐＨ７．２、１ｍ ＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのペプスタ チンおよび１．２Ｍの硫酸アンモニウムと平衡化したフェニルスペロースカラム （ＨＲ５／５ファーマシアＬＫＢ）上で精製した。結合したタンパク質を３０ｍ ｌの１．２Ｍ〜０の硫酸アンモニウムの勾配で溶離した。大量の出発物質（３０ ０〜５００ｍｇのタンパク質）の精製の場合において、硫酸アンモニウムおよび フェニルスペロース工程は最初の精製手順であり、次いでモノＱ分画を実施した 。この目的で、ハイロード（Ｈｉｌｏａｄ）フェニルセファローズ１６／１０カ ラム（ファーマシア、ＬＫＢ）を使用した。集めた画分をオーバーレイアッセイ により分析し、ｐ６５タンパク質を含有する画分をプールし、ＰＤカラム（ファ ーマシア、ＬＫＢ）上で緩衝液Ａの中に脱塩した。さらに、部分的に精製された ｐ６５を緩衝液Ａで平衡化したモノＳカラムＨＲ５／５（ファーマシアＬＫＢ） 上で精製した。タンパク質を３０ｍｌの 勾配０〜０．５ＭのＮａＣｌで溶離し、画分をオーバーレイアッセイにより分析 した。この段階において、ｐ６５ポリペプチドはクーマッシーブルー染色により 容易に同定することができ、バンドを切除し、アミノ酸分析のために使用した。 アミノ酸配列は下記のようにして決定された。ｐ６５調製物をＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅで精製し、次いでクーマッシーブルーＧ−２５０で染色し、タンパク質を切除 した。洗浄後、ゲル片を細断し、アルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂ ａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｕｓ）エンドプロテイナーゼＬｙ−Ｃで消化した。以前に 記載されたように（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、ペプチドを 順次の洗浄により回収し、直列のｈｐｌｃにより直列の２．１ｍｍの内径のアニ オン交換カラムおよび逆相カラムを使用して分離した。画分を集め、記載された ように（Ｔｏｔｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９９２）、速いサイクルの化学のために 変更されたアプライド・バイオシステムス４４７Ａパルス液体自動化配列決定装 置に直接適用した。ｐ６５を消化し、引き続いてアミノ酸配列を行うと、下記の アミノ酸配列が得られた：ＳＴＭＶＧＴＰＷＭＡＰＥＶＶＴＲ、これは酵母ＳＴ Ｅ２０のセリン／スレオニンキナーゼドメイン内の配列（ＲａｍｅｒおよびＤａ ｖｉｓ、１９９３）に密接に関係づけられ、そしてラット脳セリン／スレオニン キナーゼ、ＰＡＫ６５（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）と１００％同 一である。実施例３．ｈＰＡＫ６５ｃＤＮＡクローンの単離 ラット脳ＰＡＫ６５（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）のタンパク質 配列および実施例２において決定された精製されたｐ６５から誘導されたアミノ 酸配列に基づいて、オリゴマーＧＭ７４９ ５’ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＡＴＡ ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＮＡＣＣＡＴＮＧ３’およびＧＭ７５２：５’ＡＣＣＧＧＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧ３’を消化し、ＰＡＫタンパク質 をコードするいくつかのヒトｃＤＮＡを増幅するために使用した。これらのオリ ゴマーを使用して、いくつかの商業的に入手可能なヒトｃＤＮＡライブラリーか らいくつかの特定のＰＡＫｃＤＮＡを増幅した。期待される生成物はいくつかの 組織ライブラリーにおいて検出されたが、ヒト胎盤ライブラリーにおいて、比較 的大量が検出された。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（１９９４カタ ログＮｏ．９３６２０３）からのヒト胎盤ライブラリーをｃＤＮＡクローン源硫 酸アンモニウム選択した。ゲル精製された９６２塩基対ＰＣＲ生成物を³²ＰｄＣ ＴＰおよび³²ＰｄＧＴＰの存在において増幅して、放射性生成物を得た。このＰ ＣＲ生成物を使用して、ほぼ１００，０００の組換えプラークをストリンジェン トのハイブリダイゼーション条件（ハイブリダイゼーション緩衝液：５０％のホ ルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト、５０ｍＭのＮａＰＯ4 ｐＨ７、およ び０．１％のＳＤＳ、４２℃；洗浄：５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）下にスク リーニングして、全長のｃＤＮＡを単離した。１つの陽性のクローンをプラーク 精製し、製造業者のプロトコールに従いラムダＺａｐＩＩＩから自己切除（「ｉ ｎ ｖｉｖｏ切除」）して、第２Ａ図に表す配列（配列識別Ｎｏ．１）を有する 全長のヒトＰＡＫ６５ｃＤＮＡを含有するプラスミドクローンを生産し、これを ｐＢＳＰＡＫと表示した。生ずるブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プ ラスミド内に含有されるｃＤＮＡインサートの配列を、ジデオキシヌクレオチド 連鎖停止法により決定した。実施例４．アミノ酸の相同性 ヒトＰＡＫ６５ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列（これ を本明細書においてｈＰＡＫ６５と呼ぶ）は第２図に 示されている。ヒト胎盤ライブラリーから得られた全長のｈＰＡＫ６５ｃＤＮＡ クローンは、ラット脳ＰＡＫ６５および酵母ＳＴＥ２０のキナーゼドメインに類 似する配列を表した。ラット脳ＰＡＫ６５およびｈＰＡＫ６５の双方はｒａｃ１ ／ＣＤＣ４２Ｈｓに対して同様な特異性を示したが、配列はｒａｃ１／ＣＤＣ４ ２Ｈｓ結合ドメインにおいてアミノ酸レベルでわずかに７０％の配列の同一性を 表す。ｈＰＡＫ６５の完全なアミノ酸配列はラット脳から前に単離されたＰＡＫ ６５に対して約７３％の同一性を共有し（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９ ４）（第２Ａ図）そしてキナーゼドメイン内で９５％より大きい同一性を共有す る（アミノ酸：２３０〜５０６）（第２Ｂ図）。さらに、ｈＰＡＫ６５はＳＴＥ ２０のキナーゼドメインに対して約６３％の同一性を示す（位置：６２０〜８８ ０）（ＲａｍｅｒおよびＤａｖｉｓ １９９３）（第２Ｃ図）。ラットＰＡＫ６ ５について報告されているように（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、 ｈＰＡＫ６５のｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓ結合ドメイン（アミノ酸４７〜１ １３）は、また、ＳＴＥ２０調節ドメインに対して多少の類似性を共有する（デ ータは示されていない）。実施例５．ｈＰＡＫ６５の組織の分布 ｈＰＡＫ６５をコードする複数のｍＲＮＡの組織分布を決定するために、ヒト ＰＡＫｃＤＮＡの高度に保存されたキナーゼドメイン（塩基対１００９〜１９１ ２）を含有する放射性ＰＣＲ生成物を使用して、ノザンブロット上に固定化され た１６のヒト組織および８の癌細胞系から誘導されたｍＲＮＡをハイブリダイゼ ーションさせた（膜結合ｍＲＮＡはクロンテクから入手可能である）。プローブ はｈＰＡＫ６５、ラット脳ＰＡＫ６５、およびＳＴＥ２０の間のキナーゼドメイ ン、すなわち、最も保存された領域からから誘導され たので、密接に関係するメッセージの発現が分析されるであろうことが期待され た。使用したハイブリダイゼーション条件はエキスプレスＨｙｂ（Ｅｘｐｒｅｓ ｓＨｙｂ）（クロンテク）を使用して製造業者により示唆されたような条件であ ったが、ただし温度は７２℃であり、そしてハイブリダイゼーション時間は一夜 であった。ノザンブロット分析において、ｈＰＡＫ６５に関係するｍＲＮＡは種 々の組織の間に偏在的に分布していることが示され、骨髄性由来の細胞、すなわ ち、骨格筋、卵巣、胸腺、および脾臓においてレベルはより高く、そしてＨＬ− ６０細胞系において２〜３倍より高い（第３図）。４つのＲＮＡ種が大部分の組 織においてほぼ７．５ｋｂ、５ｋｂ、４．４ｋｂおよび３ｋｂの大きさで検出さ れた。７．５ｋｂのメッセージは骨格筋を除外したすべての組織において優勢を 占める種であり、骨格筋において７．５ｋｂおよび３２ｋｂのｍＲＮＡはおおよ そ同一であった。対照的に、細胞系ＨＬ−６０、Ｍｏｌｔ−４、Ｒａｊｉおよび ＳＷ４８０は等しい量のすべての４つの種を有するが、脳において、異なるｍＲ ＮＡが３．３ｋｂ付近において検出された。ストリンジェント条件下のゲノムの サザンブロッティングの結果（結果は示されていない：クロンテクから入手可能 な膜結合ヒトゲノムＤＮＡ；条件は製造業者が示唆したものであったが、ただし ハイブリダイゼーション温度は６０℃ではなく６４℃であり、ハイブリダイゼー ションは一夜行った）に基づいて、これらの多数のｍＲＮＡは単一の遺伝子から 交互してスプライスされるように思われる（第３図）。 対照的に、オーバーレイアッセイの使用により、高いレベルのラットＰＡＫタ ンパク質が主として脳細胞において検出された（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９４）が、本明細書において記載するように、ノザン分析により、好中性物 質およびＨＬ−６０におけ るｈＰＡＫ６５のより高い発現が見出された。オーバーレイアッセイはタンパク 質の発現が比較的低い組織においてＰＡＫを検出するために十分に感受性ではな く、それゆえ、ＰＡＫの組織分布を決定する好ましい方法ではないと思われる。実施例６．Ｓｆ９細胞における組換えタンパク質の生産 修飾されたＧｌｕ−Ｇｌｕエピトープ標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）を、 ｒａｃ１、ＣＤＣ４２Ｈｓ、およびｒｈｏのＮ−末端上に，ポリメラーゼ連鎖反 応（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８５）によりクローニング した。アニールしたオリゴマーをｈ６ので開始Ｍｅｔの直ぐ上流のＸｂａＩ部位 （４１７ｂｐ）の中にクローニングすることによって、ｈＰＡＫ６５をｍｙｃ− エピトープ標識化した（ＭＥＱＫＬＳＥＥＤＬ）。標識化された複数のｃＤＮＡ をバキュロウイルスの発現ベクターｐＡｃＣ１３の中にクローニングした。ｐＡ ｃＰＡＫ７８０はｍｙｃ標識化ｈＰＡＫ６５を含有する。１ｇのスナップ凍結し たＳｆ９ペレット（所望のタンパク質を発現する）を１０ｍｌの緩衝液Ｂ：５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣ ｌ₂、２００μＭのＧＤＰ、１ｍＭのペファブロク（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）、１０ μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン中でダウンス（Ｄｏ ｕｎｃｅ）均質化した。粒状画分を除去するために、ホモジネートを１００，０ ００ｇにおいて１５分間遠心した。可溶性画分を２ｍｌの抗Ｇｌｕ−Ｇｌｕまた は抗Ｍｙモノクローナル抗体と接合したプロテインＧセファローズカラムに適用 した。このカラムを１０ｍｌのＧＤＰを欠如する緩衝液Ｂで洗浄し、タンパク質 をＭｙｃペプチド標識または５０μｇ／ｍｌのＥＤペプチド標識（ＥＹＭＰＴＤ ）を含有する同一緩衝液で 溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、ブラッドフォード方法により定 量し、セントリコン１０（アミコン）により１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、アリコート を取り、スナップ凍結し、−７０℃において貯蔵した。タンパク質の新鮮なアリ コートを各アッセイのために使用した。Ｓｆ９細胞中のｈＰＡＫ６５の発現は本 質的に均質なｍｙｃエピトープ標識化ｈＰＡＫ６５（「ｒｈＰＡＫ６５」）の製 造を可能とし、これをｈＰＡＫ６５の生化学的製造の特性決定に使用した。実施例７．ｐ２１タンパク質に対するｈＰＡＫ６５の結合の特異性 組換えｈＰＡＫ６５または好中性細胞質ゾル中の内因性ｈＰＡＫ６５は、フィ ルターを［γ³²Ｐ］ＧＴＰ−ＣＤＣ４２Ｈｓおよび［γ³²Ｐ］ＧＴＰ−ｒａｃ１ でプローブしたときにのみ検出されたが、［γ³²Ｐ］ＧＴＰ−ｒｈｏＡでプロー ビングしたとき、検出されなかった（第４図）。ＧＴＰアーゼを［β³²Ｐ］ＧＤ Ｐで前もって負荷したとき、タンパク質は検出されず、ｈＰＡＫ６５タンパク質 がｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓのためのエフェクター分子として挙動すること が示された。オーバーレイアッセイにより判定された相対アフィニティーは、ｒ ａｃ１よりＣＤＣ４２Ｈｓについて約３〜４倍高い（第４図）。実施例８．ＣＤＣ４２Ｈｓおよびｒａｃ１はｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を誘発 する ＣＤＣ４２Ｈｓおよびｒａｃ１がｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を誘発するかど うかを決定するために、ｈＰＡＫ６５を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを含有するキナーゼ 反応においてｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓの活性化された形態とインキュベー トした。ｈＰＡＫ６５の自己リン酸化の刺激は双方の場合において観察された（ 第５Ａ図）。ｒｈｏＡを使用するか、またはＧＴＰアーゼを省略しかつＧＴＰを 単に添加することによって、リン酸化は観察されなかった（第５Ａ図）。ＣＤＣ ４２Ｈｓまたはｒａｃ１のＧＴＰまたはＧＴＰγＳ形態のみを使用して、リン酸 化は投与量依存的方法で起こった。最大のリン酸化は３０℃において１５分後に 得られた（データは示されていない）。 ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓにより誘発されたｈＰＡＫ６５に対するリン酸 化のパターンを決定するために、ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓを含有するキナ ーゼ反応にｈＰＡＫを付した。ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓを除去するために 、ビーズ上に固定化されたｈＰＡＫ６５を１％のトリトンＸ−１００を含有する ＰＢＳで３回洗浄し、ビーズを１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０ ．５％のＳＤＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロールの中に再懸濁させた 。試料を３分間沸騰させ、１０μｇの示したプロテアーゼ（すべてベーリンガー から）を添加した。タンパク質を室温において一夜消化し、試料を１６％のトリ シン（Ｔｉｃｉｎｅ）ゲル上で分析した。ゲルをクーマッシーブルーで染色し、 脱染し、乾燥し、フィルムに一夜露出した。ホスホアミノ酸分析を実施して、自 己リン酸化の位置を決定した。４μｇ（５０μｌのビーズに基づく）の組換えｈ ＰＡＫ６５を前述したようにキナーゼ反応に付した。セファローズＧビーズ上に 固定化されたリン酸化ｈＰＡＫ６５を１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢ Ｓで３回洗浄し、次いで５０μｌの６Ｎ ＨＣｌ中で１００℃において２時間加 水分解した。ビーズを遠心により除去し、上清を乾燥し、１０μｌのｐＨ３．５ 電気泳動緩衝液（１０：１００：１８９０ピリジン：酢酸：抽出）中に溶解した 。ホスホアミノ酸を薄層セルロースプレート上で電気泳動緩衝液を使用して本質 的に前に記載されたようにして分割した（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８ ３）。標準をアセトン中の ０．２％のニンヒドリンの染色により可視化し、³²Ｐｉ標識化残基をオートラジ オグラフィーにより一夜検出した。ホスホアミノ酸分析は、ＣＤＣ４２Ｈｓによ り活性化したとき、ｈＰＡＫ６５がセリン残基上でリン酸化され、そしてスレオ ニンまたはチロシン残基上でリン酸化されないことを示した（第５Ｂ図）。 ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓは約７２％の配列の同一性を共有しそして明ら かに異なる生理学的役割を演ずるので、ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓは明確な 部位におけるｈＰＡＫ６５のリン酸化を活性化することができると考えられる。 この仮説を試験するために、ｈＰＡＫ６５を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとのキナーゼ反 応においてｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓとインキュベートし、リン酸化された タンパク質を３つの異なる酵素で消化した：トリプシン、キモトリプシンおよび Ｇｌｕ−Ｃ。この処理は放射性標識化されたホスホペプチドを生じ、これらを１ ６％のトリシンゲル上で分割した。ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓにより活性化 されたｈＰＡＫ６５の消化から、同一のホスホペプチドのプロフィルが発生した （第５Ｃ図）。この結果が示唆するように、ｒａｃおよびＣＤＣ４２ＨｓはｈＰ ＡＫ６５のそれ自体のリン酸化を同一セリン部位において刺激する。 ヒト好中性物質のｐ６５およびラット脳ＰＡＫ６５と同様に、ｈＰＡＫ６５は 他のｒａｃ１またはＣＤＣ４２の活性化された形態と特異的に相互作用し、引き 続いて、ＡＴＰが準備されると、自己リン酸化するようになる。データが示唆す るように、ｒａｃ／ＣＤＣ４２ＨｓはｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を仲介し、こ れにより活性なキナーゼを発生させる。ｒａｃおよびＣＤＣ４２ＨｓのＧＴＰ結 合形態のみによるｈＰＡＫ６５の結合および活性化のための厳格な要件は、ｈＰ ＡＫ６５がｒａｃ／ＣＤＣ４２Ｈｓのためのエフェク タータンパク質として働くことを示す。さらに、ｈＰＡＫ６５に対するｒａｃ／ ＣＤＣ４２Ｈｓの相対的結合アフィニティーはそれらのヌクレオチドの状態によ り調節されるが、ｈＰＡＫ６５のリン酸化された状態により調節されないように 思われる。示唆されたモデル（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）と対照 的に、本発明者らが開示したデータが示すように、ｈＰＡＫ６５のリン酸化状態 はｒａｃ／ＣＤＣ４２Ｈｓの結合の調節に関係づけられない。リン酸化および非 リン酸化ｈＰＡＫ６５は、ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓに対して匹敵するアフ ィニティーを示した。実施例９．リン酸化されたｈＰＡＫは活性キナーゼである ｈＰＡＫ６５が他のタンパク質に対するｈＰＡＫ６５活性を有するかどうか、 そしてその活性がｐ２１タンパク質により影響を受けるかどうかを決定するため に、キナーゼアッセイを実施した。１〜２μｇのｒｈＰＡＫ６５（モノクローナ ルＭｙｃ抗体と接合したプロテインＧセファローズに結合した）を１回洗浄し、 ４０μｌのキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＭｎＣｌ₂）中で１〜２μｇの ｒａｃ１、ｒｈｏ、またはＣＤＣ４２Ｈｓ（これらはＧＴＰまたはＧＤＰが前も って負荷されている）とインキュベートした。５０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉ の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを含有する１０μｌのキナーゼ緩衝液の添加により、反応 を開始し、３０℃において２０分間インキュベートした。１０μｌの５×ＳＤＳ ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し、５分間沸騰させることによって、反応を停止さ せた。試料を１４％のＳＤＳ ＰＡＧＥに適用し、ゲルをクーマッシーブルーで 洗浄し、脱染し、乾燥し、フィルムに１〜２時間露出した。リン酸化されたバン ドを切除し、組込まれた32ホスフェートを計数した。ミエリン塩基性タンパク質 （「ＭＢＰ 」）のリン酸化の場合において、３μｇのＭＢＰ（シグマ）をキナーゼ反応にお いて含めた。 ｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓにより誘発されたｈＰＡＫ６５のリン酸化は、 ＭＢＰ基質に向かうそのｈＰＡＫ６５活性を刺激する（第６ａ）。ｒａｃおよび ＣＤＣ４２Ｈｓの双方は、時間依存的方法において活性ｈＰＡＫ６５キナーゼを 刺激することができた。最大のＭＢＰリン酸化は３０℃において１０分以内に得 られた（第６Ｂ図）。実施例１０．活性化ｈＰＡＫはそのｈＰＡＫ６５活性を持続するためにｒａｃ１ またはＣＤＣ４２Ｈｓを必要としない 前述の実験が明瞭に証明するように、ｈＰＡＫ６５の自己リン酸化の活性化に おいてｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓを必要とする。ｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓがｈ ＰＡＫ６５ｈＰＡＫ６５活性のために要求されるかどうかを、下記の実験により 研究した：ｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を最初に冷いＡＴＰの存在において誘発 し、次いでｈＰＡＫ６５およびＣＤＣ４２Ｈｓの複合体を激しい洗浄により崩壊 させた。ＣＤＣ４２Ｈｓを含有しない（ウェスタンブロットにより確証された） 自己リン酸化されたｈＰＡＫ６５を、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＭＢＰを含有す る第２のキナーゼ反応に付した。ＣＤＣ４２Ｈｓを含有しない自己リン酸化され たｈＰＡＫ６５は、ＭＢＰのリン酸化を活性化するために十分であった（第６Ｃ 図）。対照ｈＰＡＫ６５を正確に同じように処理したが、ただしＡＴＰを第１キ ナーゼ反応において含めた。対照ｈＰＡＫ６５について、ｈＰＡＫ６５の自己リ ン酸化のより低いレベルが検出され、これは未洗浄のＣＤＣ４２Ｈｓ／ＰＡＫ複 合体の残留レベルのためであると思われる。これらのデータが示唆するように、 ｒａｃおよびＣＤＣ４２Ｈｓは、ｈＰＡＫ６５の自己リン酸化を刺激すすること によって、ｈ ＰＡＫ６５の活性化において重要な役割を演ずるが、ｈＰＡＫ６５活性の維持お よび調節において関係しない。実施例１１．リン酸化／非リン酸化ｈＰＡＫ６５に対するＣＤＣ４２Ｈｓの結合 の比較 完全にリン酸化されたｈＰＡＫ６５および非リン酸化ｈＰＡＫ６５は、運動性 のシフトおよびキナーゼ反応により判定して、活性化ＣＤＣ４２Ｈｓに対して等 しくよく結合した（第７図）。ｈＰＡＫ６５のリン酸化はｈＰＡＫ６５のキナー ゼを活性化する働きをするように思われるが、ｒａｃ／ＣＤＣ４２Ｈｓに対する そのアフィニティーを変更しない。この結果はラット系に対して対照的であり、 ラット系において、ＣＤＣ４２はラット脳ＰＡＫ６５の活性化形態に対して減少 したアフィニティーを有することが示され、そしてＰＡＫのリン酸化はいったん 活性化されたＰＡＫからｒａｃ／ＣＤＣ４２を解放することができるメカニズム であることが示唆された（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。実施例１２．固有のおよび刺激されたＧＴＰアーゼ活性に対するｈＰＡＫ６５の 作用 ｐ６５タンパク質は最初にオーバーレイアッセイによりｒａｃ１／ＣＤＣ４２ Ｈｓに対する潜在的なエフェクターおよびＧＴＰアーゼインヒビターとして検出 されたので、溶液中のＧＴＰアーゼ活性に対するｈＰＡＫ６５の作用を検査した 。精製されたＣＤＣ４２Ｈｓ（８００ｎＭ）を１ｍＭのＥＤＴＡの存在において ８０ｎＭのｇ−３２−ＧＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に対して２５℃におい て５分間前もって結合させ、次いで１９体積のＧＡＰアッセイ緩衝液（５０ｍＭ のＭＥＳ、ｐＨ６、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂）を添加して、 ４ｎＭのβ−３２Ｐ−ＧＴＰ−ＣＤＣ４２Ｈｓを生成させた。１ｎＭの［γ³²Ｐ ］−ＧＴＰ−ＣＤＣ４２Ｈ ｓを示した濃度のｈＰＡＫ６５（これはＡＴＰの存在またはの非存在において前 インキュベートした）とインキュベートした。ＢＳＡを含有するＧＡＰアッセイ 緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、１００ｍ ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂）中で２０ｎＭのヒトｐ１９０−触媒断片の 存在またはの非存在において２５℃において５〜１０分間反応を実施し、次いで ホスフェートの解放についてアッセイした（Ｓｈａｃｔｅｒ １９８４）。ｐ１ ９０刺激反応のために、ｐ１９０の非存在における対応する反応を実施し、生ず る加水分解を減じてｐ１９０依存性活性のみを得た。ｐ１９０はＧＴＰアーゼ活 性の刺激因子である。 ｈＰＡＫ６５はＣＤＣ４２Ｈｓ固有のＧＴＰアーゼ活性に対する限界の作用を 事実示す（第８Ａ図）。ｈＰＡＫ６５の量をＣＤＣ４２Ｈｓを越えて１０００倍 まで増加すると、固有のＧＴＰアーゼ活性は阻害されたが、わずかに１０〜１５ ％だけであった（第８Ａ図）。興味あることには、活性化されたｈＰＡＫ６５は 同一の作用を有し、リン酸化がｒａｃ／ＣＤＣ４２Ｈｓ固有のＧＴＰアーゼ活性 に対して調節作用をもたないことが示唆された（第８Ａ図）。 対照的に、ヒトｐ１９０ＧＡＰの触媒ドメイン（Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９２はラットｐ１９０を開示した）をアッセイにおいて含めたとき、 ｈＰＡＫ６５はｐ１９０により刺激されたＧＴＰ加水分解を有意に阻害した。ｈ ＰＡＫ６５の濃度をＣＤＣ４２Ｈｓのそれより５倍大きく増加すると、ＧＡＰ刺 激されたＧＴＰの加水分解が４０％までにブロックされた（第８Ｂ図）。リン酸 化されたｈＰＡＫ６５を非リン酸化ｈＰＡＫ６５と比較したとき、ＧＴＰアーゼ を刺激するＧＡＰにおいて差は観察されなかった（第８Ｂ図）。 ｒａｃ１およびＣＤＣ４２Ｈｓは約７２％の配列の同一性を共有 し、そして明確な生理学的役割を有する。例えば、ｒａｃ１は膜の波打ちを誘発 し（Ｒｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９２）そして６７−ｐｈｏｘと相互作用し てＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化する（Ｄｉｅｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９ ９４）が、ＣＤＣ４２ＨｓはＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性または膜の波打ちに対 して作用をもたなかった。酵母において、ＣＤＣ４２は芽の形成に関係する（Ｊ ｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｉｎｇｌｅ １９９０）。ＣＤＣ４２Ｈｓに比較してｒ ａｃ１に対するｈＰＡＫ６５のアフィニティーが比較的低いことは、ＣＤＣ４２ ＨｓがｈＰＡＫ６５の生理学的アクチベーターであること示唆する。しかしなが ら、ｒａｃ１によるｈＰＡＫ６５の活性化がｉｎ ｖｉｔｒｏの人工的事象であ るとは思われない。なぜなら、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性 化は特異的に再活性化を必要とするが、ＣＤＣ４２Ｈｓを必要としないからであ る。ｒｈｏ様製造は多数のエフェクタードメインを有し、それらのいくつかは種 々のファミリーのメンバーの間で共有されることができるが、他のものは各メン バーに対してユニークであることがある可能性が最も強い。ｒａｃまたはＣＤＣ ４２Ｈｓにより活性化されたｈＰＡＫ６５から発生した部分的リン酸化物質は同 一であったので、これにより、ｒａｃおよびＣＤＣ４２Ｈｓは同一方式において 、すなわち、同一部位における自己リン酸化を刺激することによって、ｈＰＡＫ ６５を活性化することが示される。如何なるアゴニストがｒａｃ１またはＣＤＣ ４２Ｈｓの刺激をｉｎ ｖｉｖｏにおいてｈＰＡＫ６５の活性化と結合させるか を決定することは、非常に重要であろう。このような研究は、ｒｈｏ様タンパク 質の如何なるヌクレオチド交換因子がこの経路において関係するかを決定するで あろう。例えば、Ｄｂ１はｒａｃ１に対してではなく、ｒｈｏ、ＣＤＣ４２Ｈｓ に対してヌクレオチド交換活性を有する ことが示された（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）。したがって、Ｄｂ１の活 性化がＣＤＣ４２Ｈｓ依存的ｈＰＡＫ６５の刺激に導くことがある可能性が存在 する。 酵母ＳＴＥ２０のキナーゼドメインに対するｈＰＡＫ６５およびラット脳ＰＡ Ｋ６５の相同性は、哺乳動物細胞中のマイトジェン活性化タンパク質（「ＭＡＰ 」）キナーゼのカスケードにおけるｒａｃ／ＣＤＣ４２ＨｓおよびＰＡＫタンパ ク質の役割を示唆し（Ａｖｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４）、これは細胞の増 殖および形質転換に関係する。ＳＴＥ２０はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるヘテロトリマーのＧタンパク質のβγサブユニ ットの標的であることが示され、これらのサブユニットはフェロモンの応答をキ ナーゼのカスケードに結合して転写の活性化に導く（Ｌｅｂｅｒｅｒ ｅｔ ａ ｌ．１９９２、ＥｒｒｅｄｅおよびＬｅｖｉｎ １９９３）。５つのタンパク質 キナーゼ（ＳＴＥ２０、ＳＴＥ１１、ＳＴＥ７、ＦＵＳ３およびＫＳＳ１）はＧ タンパク質と転写因子ＳＴＥ１２との間において関係づけられた（Ｅｒｒｅｄｅ およびＬｅｖｉｎｅ １９９３）。ＳＴＥ７はＭＡＰキナーゼに対して多少の相 同性を有し、そしてＦＵＳ３およびＫＳＳ１はＭＡＰキナーゼの酵母相同体であ る（Ｅｒｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．１９９３）。さらに、遺伝学の証拠は新規な遺 伝子ＳＴＥ５とＳＴＥ２０との間の機能的アソシエーションを証明する（Ｌｅｂ ｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３）。ＦＡＲ１に対する制限された相同性の外に 、ＳＴＥ５は特定の既知の構造的モチーフをもたないが、このキナーゼのカスケ ード内で操作し、アダプタータンパク質として機能すると思われる（Ｌｅｂｅｒ ｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３、ＥｒｒｅｄｅおよびＬｅｖｉｎｅ １９９３）。 調節ドメインにおける脳ラットＰＡＫ６５とｈＰＡＫ６５との間の比較的高いダ イバージェンスは、これらのタンパク質が異なる分子によりコントロールされる ことを示唆する。したがって、異なる哺乳動物のＳＴＥ５相同体は、明確なＰＡ Ｋ様キナーゼを下流キナーゼ、例えば、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１と集合させる アダプター製造として働くことができる。ｒａｃは、なかでも、アポプトーシス に導くことがある、ストレスキナーゼ経路を活性化することに関係すると考えら れる。ＭＥＫキナーゼ（ＭＥＫＫ）は、ストレスキナーゼ経路に関係し、ｈＰＡ Ｋ６５から下流において作用することができる。なぜなら、ＭＥＫＫは酵母ＳＴ Ｅ２０、すなわち、本明細書においてｈＰＡＫ６５に対する相同性を有すること が示されたタンパク質、から下流において作用する酵母ＳＴＥ１１に対する相同 性を有するからである。 要約すると、本明細書において提示するデータは、第９図に表す温和なと一致 する。ヌクレオチドをＧＤＰから活性形態ＧＴＰに交換すると、ｒａｃ１／ＣＤ Ｃ４２ＨｓはｈＰＡＫ６５と相互作用し、引き続いてｈＰＡＫ６５の自己リン酸 化を誘発する。ｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓの固有のＧＴＰアーゼ活性により、Ｇ ＴＰはＧＤＰに加水分解される。ｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓの不活性なＧＤＰ結 合形態は活性なｈＰＡＫ６５キナーゼから解放され、これは引き続いてまだ未同 定の生理学的基質としてリン酸化する。実施例１３．ｈＰＡＫ６５に対する抗体 ｈＰＡＫ６５のキナーゼドメインから誘導されたペプチドに対して発生した抗 体を使用して、他の２つのエフェクタータンパク質、すなわち、ｐ６２およびｐ ６８（好中性細胞質ゾルにおいて同定された）がｈＰＡＫ６５タンパク質に関係 するかどうかを決定した。ポリクローナル血清を使用して、交差反応は観察され なかった。実施例１４．ｒａｃ／ＣＤＣ４２ｈＰＡＫ６５結合ＥＬＩＳＡ 下記のＥＬＩＳＡフォーマットのアッセイは、ｈＰＡＫ６５またはその断片に 対するｐ２１タンパク質の結合を検出または測定する手段の１つの態様を提供し 、こうして、この結合を変調する物質についてスクリーニングする手段を提供す る。まず０．５ｍＭのＤＴＴをダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｃａ²⁺およ びＭｇ²⁺を含有する）に添加し、次いで実質的に精製されたＧＳＴ−ｐａｋｅｔ ｔｅ融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌ（０．５μｇ／ウェルについて）の最終濃 度に添加することによって調製されたｈＰＡＫ６５タンパク質溶液で、例えば、 マイクロタイターウェル、の表面をコーティングした。好ましくは逆転によりお だやかに混合した後、このＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅ溶液の５０μｌをマイクロタ イタープレート、例えば、イムロンプレートの各ウェルの中に入れ、次いでこの プレートをプレートスケーラーでカバーし、好ましくは４℃においてかつ好まし くは揺動して表面を横切って溶液を均一に分布させるながら、一夜インキュベー トした。コーティングされたプレートは典型的には４〜５日間使用可能であった 。使用する前に、プレートを２００μｌの洗浄緩衝液：Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺＋０ ．１％のツイーン２０を含有するＰＢＳで１回洗浄した。各ウェルに２００μｌ のＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺＋１％のＢＳＡを含有するＰＢＳを添加することによって、非 特異的結合部位をブロックし、４℃において、好ましくは揺動しながら、少なく とも２時間インキュベートし、次いで各回２００μｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し た。 組換え標識化ヒトｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓを所望の濃度において１ｍＭ のＧＤＰ／ＧＴＰγＳおよびＥＤＴＡ（Ｍｇ²⁺をキレート化するためにＭｇＣｌ₂ のモル濃度の２倍）と混合して、添加したｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓの体積の 合計約３×にした。体積を前もって結合した緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８、５０ｍＭ のＮａＣｌ）で調節した。次いでｐ２１タンパク質溶液を３０℃において３０分 間インキュベートした。ＭｇＣｌ₂をＥＤＴＡのモル濃度の２倍に添加した。マ グネシウムイオンはｐ２１タンパク質に対するヌクレオチドの結合を刺激する。 ＥＤＴＡはＭｇ²⁺とキレート化して、ヌクレオチドの除去を促進する。 結合のために、前述のｐ２１タンパク質溶液を結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉ ｓ ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１％のＮＰ−４０、 ０．１％のＢＳＡ）で体積を調節した。５０μｌのｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓ溶 液を各ウェルに添加することによって、結合を開始した。結合を阻害または変調 する能力について、物質を試験するために、被験物質を１０μＭにおいて５０μ ｌの溶液（例えば、５μｌの物質＋４５μｌのｒａｃ１／ＣＤＣ４２ＧＴＰγＳ 溶液）に添加した。結合を３５℃において１時間進行させた。次いでウェルを各 回２００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。 ｈＰＡＫ６５−結合ｒａｃ１／ＣＤＣ４２Ｈｓを検出するために、適当な標識 を認識する抗体−アルカリ性ホスファターゼ複合体（「Ａｂ−ＡＰ」）を各ウェ ルに添加した。典型的には、抗体−ＡＰ複合体をＡｂ希釈緩衝液（Ｃａ²⁺および Ｍｇ²⁺、０．１％のツイーン２０、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）の中に １：４０００に希釈し、次いで５０μｌのＡｂ−ＡＰ溶液を各ウェルに添加した 。室温において１時間インキュベートした後、各ウェルを２００μｌの洗浄緩衝 液で３回洗浄した。１００μｌのＡＰの基質（ストック：１００ｍｌのＨ2 Ｏ中 の１錠剤ＰＮＰＰ（ベーリンガー・マンヘイム））を各ウェルに添加し、次いで ３５℃において１０〜２０分間インキュベートして発色させた。ＯＤが約１．０ であるとき、色を４０５ｎｍにおいて読んだ。 候補の物質はＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅに対するｒａｃ１またはＣＤＣ４２Ｈｓ の結合を有意に阻害する物質であり、好ましくは１μＭより低い、好ましくは１ ｎＭより低い範囲のＩＣ₅₀（最大阻害の５０％が起こる濃度）を有する。より好 ましくは、ある物質は他のｐ２１タンパク質：タンパク質キナーゼ対を実質的に 阻害しないことによって、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくと も３倍、なおより好ましくは少なくとも１０倍の選択性において、結合の阻害の 選択性を示すであろう。実施例１５．ｈＰＡＫ６５ｈＰＡＫ６５活性を阻害する化合物についてのスクリ ーニング 化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのフォーマットにおいて基質ＭＢＰに対す るヒトＰＡＫ６５ｈＰＡＫ６５活性を阻害する能力について評価することができ る。一般的アッセイのフォーマットは、前述の実施例において提供された通りで ある。他のアッセイを下記のようにして採用することができる（ＭａｃＤｏｎａ ｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：６６１５ ）：精製されたヒトＰＡＫ６５タンパク質および精製されたＭＢＰを反応器（例 えば、マイクロタイタープレートのウェル）中で緩衝化水性条件下にγ−³³Ｐ− ＡＴＰの存在において一緒にし、３２℃においてインキュベートした；すすいで 未結合（すなわち、非タンパク質）成分、例えば、γ−³³Ｐ−ＡＴＰを除去した 後、ホスホセルロース紙上に保持された放射能の計数として、タンパク質の中へ の³³Ｐのキナーゼ触媒の組込みを検出する。被験物質を平行反応において含め、 ホスホセルロース上に保持されたタンパク質の中への³³ＰのｈＰＡＫ６５依存的 組込みを阻害する能力について評価する。別の実験において、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ をγ−³³Ｐ−ＡＴＰの代わりに使用することができる。第２の別の態様において 、ペプチド、 例えば、ＣＱＱＦＧＦＧＲＲＡＳＤＤＧをＭＢＰの代わりに使用することができ る（Ｋｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９３３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：２４９）。 候補の物質はｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を有意に阻害し、好ましくはほぼ２× １０⁸Ｍの範囲におけるＩＣ₅₀（最大阻害の５０％が起こる濃度）を有した物質 である。最も好ましくは、ある物質は１×１０⁵Ｍまでの濃度においてタンパク 質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性を実質的に阻害しないことによって、ｈＰＡＫ６５ の阻害において選択性を示すであろう。より好ましくは、ある物質はｒａｓＧＡ ＰおよびｒａｐＧＡＰ活性を１×１０^-5Ｍの物質だけそれらの活性について標準 的アッセイ条件下に有意に阻害してはならない。実施例１６．ＳＣＤＩマウスにおけるヒト腫瘍の増殖の阻害 ヒト腫瘍の増殖を阻害する候補の物質の能力を評価するために、ヒト腫瘍細胞 をＳＣＤＩマウス（苛酷な組み合わされた免疫不全症）に注射して、接知可能な 腫瘍の塊を形成した。腫瘍の増殖を阻害する候補の物質の作用を下記のようにし て決定することができる。ほぼ１×１０⁷細胞のＣＣＬ２２１細胞系（ＡＴＣＣ 、マリイランド州ロックビレ）、ヒトｒａｓ依存性結腸腺癌細胞系を１００μｌ のＤＭＥＭの中に懸濁させ、ＳＣＤＩマウスに皮下注射し、２つの腫瘍が各マウ スについて形成するようにする。ＳＣＤＩマウスにＣＣＬ２２１細胞を与え、腫 瘍を治療なしに７日間増殖させる；第７日（第０日）に腫瘍の最大直径および動 物の体重を記録する。第０日に、マウスについて平均の腫瘍大きさを決定する。 １日に（腫瘍細胞注射後８日）、候補の物質またはビヒクル単独でマウスを治療 を開始した。マウスの１群（対照）に０．２ｍｌのビヒクルを腹腔内注射し、マ ウスの第２群に候補の物質を腹腔内注射した。種々の投与量の物質をマウスの別 々の群において試験することができる。 第７日および第１４日に、動物の体重および最大の腫瘍直径を測定する。第０日 、第７日、および第１４日における各群についての平均の最大腫瘍大きさを第１ ４日と比較し、１つの高い投与量の動物をさらに追跡して物質が腫瘍の成長の投 与量ジペプチダーゼ阻害を生成するかどうかを決定した。マウスの体重を追跡し 、組織学的染色のために動物の肺、肝臓、および脾臓を収獲した。 この明細書中に述べたすべての刊行物および特許出願は、各刊行物および特許 出願が特別にかつ個々に引用すべき場合、引用することによって本明細書の一部 とされる。 本発明を詳しく記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の 変化および変更が可能であることが当業者にとって明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9/12 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ Ｇ０１Ｎ 33/15 ＡＢＡ 33/566 ＡＡＡ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｈＰＡＫ６５タンパク質またはそれから誘導された少なくとも２５アミノ 酸の断片をコードする配列を含んでなる、精製、単離された核酸。 ２．核酸がｈＰＡＫ６５のｃＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸 。 ３．核酸がｈＰＡＫ６５をコードする配列に対して相補的な配列である、請求 項１に記載の核酸。 ４．核酸がｈＰＡＫ６５をコードする核酸配列またはその相補的配列から本質 的に成る、請求項１に記載の核酸。 ５．ｈＰＡＫ６５をコードする核酸配列が第２Ａ図におけるそれに対応する、 請求項１に記載の核酸。 ６．ｈＰＡＫ６５が第２Ａ図におけるアミノ酸配列（配列番号：２）を有する 、請求項１に記載の核酸。 ７．ｃＤＮＡが第２Ａ図における核酸配列（配列番号：１）を有する、請求項 ２に記載の核酸。 ８．ｈＰＡＫ６５をコードする核酸配列が天然に存在する、請求項１に記載の 核酸。 ９．核酸配列が高いストリンジェンシイの条件下にｈＰＡＫ６５核酸配列に対 してハイブリダイゼーション可能である、請求項１に記載の核酸。 １０．核酸配列が第２Ａ図の核酸配列をコードするｈＰＡＫ６５に対して少な くとも９５％相同である、請求項１に記載の核酸。 １１．第２Ａ図のｈＰＡＫ６５アミノ酸配列４９〜１１３から本質的に成るア ミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸。 １２．ｈＰＡＫ６５が少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、請求項 １に記載の核酸。 １３．請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。 １４．請求項１に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。 １５．ｈＰＡＫ６５核酸配列が（ａ）請求項１に記載のｈＰＡＫ６５配列の発 現を指令することができる発現制御配列に作用的に関連しているか、または（ｂ ）必要に応じて中断されており、ｈＰＡＫ６５をコードし、そしてｈＰＡＫ６５ をコードする配列に対して５’または３’の少なくとも１つの非野生型ＤＮＡ配 列により隣接されている、請求項１４に記載の宿主細胞。 １６．構成的セリンキナーゼ活性を有するｈＰＡＫ６５ポリペプチドを含んで なる、請求項１４に記載の宿主細胞。 １７．請求項１に記載の核酸によりコードされるペプチドを含んでなるポリペ プチド。 １８．ｈＰＡＫ６５からの少なくとも５アミノ酸配列を含んでなり、そしてｈ ＰＡＫ６５に対するｐ２１タンパク質の結合を阻害する能力を有するペプチドま たはペプチド模倣物。 １９．配列番号：２のアミノ酸４９〜１１３からのアミノ酸配列を含んでなる ポリペプチド。 ２０．適当な培地中で請求項１４に記載の宿主細胞を培養し、そしてｈＰＡＫ ６５を単離することを含んでなる、ｈＰＡＫ６５を生産する方法。 ２１．請求項２０に記載の方法により生産されたポリペプチド。 ２２．ｈＰＡＫ６５またはセリンキナーゼ活性を有するその断片を含んでなる 、実質的に精製されたペプチド、実質的に精製されたｈＰＡＫ６５キナーゼ基質 、およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含んでなる反応混合物に化合物を投与し、そして 前記化合物がそれを欠如する対照反応に比較してｈＰＡＫ６５基質のリン酸化 を阻害する程度を決定する、 ことを含んでなる、ｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する化合物を同定する方法 。 ２３．ｈＰＡＫ６５キナーゼ阻害アッセイにおいて決定して、ｈＰＡＫ６５キ ナーゼ活性を阻害する能力を有する化合物と、ｈＰＡＫ６５キナーゼを含有する 組成物とを接触させる、ことを含んでなる、ｈＰＡＫ６５キナーゼを阻害する方 法。 ２４．前記組成物が哺乳動物の体液を含んでなる、請求項２３に記載の方法。 ２５．ｈＰＡＫ６５キナーゼ阻害アッセイにおいて決定して、ｈＰＡＫ６５キ ナーゼ活性を阻害する能力を有する化合物と、薬学上許容される担体とを含んで なる、哺乳動物におけるｈＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患を抑制する医薬組成物 。 ２６．ｈＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患に罹った哺乳動物に、ｈＰＡＫ６５キ ナーゼ阻害アッセイにおいて決定してｈＰＡＫ６５キナーゼ活性を阻害する能力 を有する化合物を、ｈＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患抑制量において、投与する ことを含んでなる、ｈＰＡＫ６５キナーゼ依存性疾患を抑制する方法。 ２７．ある物質を実質的に精製されたｐ２１タンパク質と混合して、ｈＰＡＫ ６５ｒａｃ１結合活性を有するｈＰＡＫ６５またはその断片を含んでなる実質的 に精製されたペプチドを含む反応混合物に投与し、そして 前記物質が、前記物質を欠如する対照反応に比較して、前記結合を阻害する程 度を決定する、 ｈＰＡＫ６５ｐ２１タンパク質の結合活性を阻害する物質を同定する方法。 ２８．ｈＰＡＫ６５断片がＧＳＴ−ＰＡＫｅｔｔｅ融合タンパク質である、請 求項２７に記載の方法。 ２９．ｈＰＡＫ６５ｐ２１タンパク質結合阻害アッセイにおいて決定して、ｈ ＰＡＫ６５ｐ２１タンパク質の結合活性を阻害する能力を有する化合物と、ｈＰ ＡＫ６５ポリペプチドを含有する組成物とを接触させることを含んでなる、ｈＰ ＡＫ６５ｐ２１タンパク質の結合活性を阻害する方法。 ３０．ｐ２１タンパク質結合活性を有するｈＰＡＫ６５ポリペプチドと、ｐ２ １タンパク質ポリペプチドと、ある物質とを含む、異種二量体化アッセイを行い 、そして 前記物質が異種二量体化を変調するかどうかを決定する、 ｈＰＡＫ６５調節物質を同定する方法。 ３１．異種二量体化アッセイが試験管内結合反応を含んでなる、請求項３０に 記載の方法。