PT802921E - Pak65 humana - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ DESCRIÇÃO "ΡΑΚ65 humana"

INTRODUÇÃO

Campo Técnico

Este invento refere-se a métodos para a produção e utilização e a composições contendo sequências de ácido nucleico ou proteicas da quinase p65 humana activada pela p21 ("hPAK65").

Antecedentes do Invento

As proteínas semelhantes a rho (i.e., proteínas p21), tal como outras GTPases, alternam entre uma forma activa ligada a GTP e um estado inactivo ligado a GDP (Nobes e Hall, 1994) . Mostrou-se que a regulação destas formas era controlada por várias proteínas incluindo factores de permuta do nucleótido guanina ("GEF") tais como as proteínas Dbl e de activação de GTPase (Hart et ai., 1991; Boguski e McCormicK, 1993). Os membros da família de proteínas rho, incluindo RhoA, B, C, racl, 2, CDC42HS ("CDC42 Homo sapiens"), e TC10, partilham pelo menos 50% de identidade de sequência uns com os outros e 30% de identidade com outras proteínas semelhantes a ras (Nobes e Hall, 1994) . Uma ideia sobre a função fisiológica das proteínas rho e rac surgiu de relatórios recentes descritos por Ridley e Hall (Ridley e Hall, 1992; Ridley et al., 1992), em que foram detectados efeitos rápidos no citoesqueleto quando proteínas rho e rac eram micro-injectadas em fibroblastos Swiss 3T3. A rho activada induz a formação de fibras de stress e contacto focal (Ridley e Hall, 1992) enquanto a rac activada induz a formação de pregas membranares e lamelipodia (Ridley et al., 1992). As proteínas rho estão também implicadas noutros papéis fisiológicos associados a rearranjos do citoesqueleto tais como mobilidade celular (Takaishi et al., 1993), citocinese (Kishi et al., 1993) e agregação de linfócitos (Tominaga et al., 1993).

Embora se tenha mostrado que a função fisiológica de CDC42 é essencial na formação de gemas em levedura (Johnson e Pringle, 1990), não foi descrita nenhuma função fisiológica semelhante para o seu homólogo de mamífero CDC42HS. No 2 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ entanto, uma pista para o seu papel em células de mamífero veio de um estudo que demonstra que o proto-oncogene Dbl exibe actividade de GEF em rho e CDC42Hs (Hart et al., 1991). Esta observação sugere um papel para as proteínas semelhantes a rho na transformação de células para um estado neoplásico. No entanto, nem todas as proteínas contendo o domínio Dbl demonstram uma actividade de permuta nucleotídica em proteínas semelhantes a rho. Por exemplo, vav (Gulbins et al., 1993),

Ect2 (Miki et al., 1993), ras GRF e bcr (Boguski e McCormick, 1993) não exercem actividade de permuta nucleotídica em rho, e o domínio Dbl de bcr e ras GRF não transforma células. Um estudo recente sugere uma ligação directa para rho e Dbl in vivo através da demonstração de que a transformação de vav e Dbl é mediada por rho (Khosravi-Far et al., 1994).

Sabe-se que as proteínas p21 são componentes integrais dos mecanismos de transdução de sinal que conduzem ao controlo da proliferação celular. Muitas condições patológicas resultam, pelo menos em parte, do controlo aberrante da proliferação ou diferenciação celular. Por exemplo, a neoplasia é caracterizada por uma população de células derivadas clonalmente que possuem uma menor capacidade para responder a sinais normais de controlo da proliferação celular. A transformação oncogénica das células conduz a várias alterações no metabolismo, fisiologia e morfologia celulares. Uma alteração característica de células oncogenicamente transformadas é uma perda de capacidade de resposta a constrangimentos na proliferação e diferenciação celulares normalmente impostos pela expressão apropriada de genes reguladores do crescimento celular.

Actualmente são conhecidas apenas algumas moléculas efectoras para proteínas semelhantes a rho incluindo a quinase de cérebro de rato PAK65 (Manser et al., 1994) e a p67-phox de NADPH-oxidase (Diekmann et al., 1994). A partir de estudos da função molecular em fagócitos, foi demonstrado que a rac 1 e 2 estão envolvidas no controlo da geração de superóxido pela NADPH-oxidase (Abo et al., 1991; Knaus et al., 1991). A rac activada juntamente com dois outros componentes citosólicos da oxidase, p47-phox e p67-phox, junta-se ao citocromo b558 ligado à membrana para formarem uma oxidase activa (Segai e Abo 1993). A molécula efectora para rac neste sistema é p67-phox (Diekmann et al., 1994). Mostrou-se que um efector molecular 3 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ adicional para rac e CDC42HS era uma serina/treonina-quinase de cérebro de rato, que é activada por racl e CDC42HS (Manser et al., 1994). Outros estudos sugeriram que CDC42HS e rho podem também activar a Pl3-quinase (Zhang et al., 1993; Zheng et al., 1994).

Tendo em vista os potenciais e variados papéis das proteínas p21 semelhantes a rho em vias fisiológicas e estados de doença, uma tal integridade estrutural celular, papéis fisiológicos associados a rearranjos do citoesqueleto tais como mobilidade celular, citocinese, agregação de linfócitos, transformação e proliferação de células tumorais, metástases, agregação celular e a exiguidade da compreensão das moléculas e agentes que efectuam ou modulam selectivamente as actividades destas proteínas numa ou mais destas vias fisiológicas, existe assim a necessidade na arte de compostos e agentes com actividade efectora e moduladora e métodos para identificação destas e de composições e agentes relacionados. Mais, tais agentes podem servir como reagentes comerciais de investigação para controlo da proliferação e diferenciação celular e outras condições relacionadas com p21. Apesar do progresso no desenvolvimento de um modelo mais definido dos mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo transformado e à neoplasia, resultaram poucos métodos terapêuticos significativos aplicáveis ao tratamento de cancro para além da quimioterapia convencional. Tais agentes moduladores da proteína p21 podem proporcionar novos agentes quimioterapêuticos para tratamento de neoplasia, condições linfoproliferativas, artrite, inflamação, doenças auto-imunes, apoptose e semelhantes. Estes e outros objectos são proporcionados por este invento.

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SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada purificada compreendendo uma sequência 6 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ codificando uma proteína serina-quinase p65 humana activada pela proteína p21 (hPAK65) ou um fragmento desta compreendendo um ou mais domínios estruturais ou funcionais de hPAK65, seleccionada de entre o grupo (a) a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:l; (b) a sequência de ácido nucleico contendo substituições de codões degenerados com a sequência de codificação de hPAK65 de SEQ ID NO:l; (c) variantes possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:l ao longo de toda a extensão desta e resultando em péptidos que retêm a função de uma proteína hPAK65; e (d) uma sequência de ácido nucleico capaz de codificar a sequência de aminoácidos de hPAK65 de SEQ ID NO:2. O presente invento proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência de ácido nucleico do presente invento, em que a referida sequência complementar é homóloga a toda a sequência de referência. As sequências de ácido nucleico são de preferência as verificadas na natureza, embora tendo em vista este invento os polinucleótidos contendo estas sequências possam ser preparados de numerosas maneiras conhecidas na arte, incluindo métodos sintéticos. São aqui descritas construções recombinantes de hPAK65, p. ex., fusões, truncagens, substituições, que proporcionam polipéptidos possuindo certas propriedades desejáveis tais como actividade de serina-quinase constitutiva, actividade de ligação à proteína p21 e facilidade de purificação e identificação. São também proporcionadas proteínas hPAK65 isoladas e purificadas contendo as sequências verificadas nos polinucleótidos do presente invento. Os métodos para a preparação de proteínas hPAK65 estão descritos, incluindo o isolamento de fontes naturais, a produção sintética e a produção recombinante utilizando as sequências de ácido nucleico proporcionadas pelo invento, tal como a cultura de uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucleico proporcionada pelo presente invento num meio de cultura adequado e o isolamento da hPAK65. O presente invento proporciona uma proteína hPAK65 humana e fragmentos desta, possuindo a sequência de aminoácidos representada na Figura 2A. 7 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ Ο presente invento inclui vectores e células hospedeiras transformadas para expressão dos polinucleótidos isolados do presente invento em que os polinucleótidos isolados estão operativamente ligados a um vector de expressão apropriado para expressão na célula hospedeira utilizada.

As proteínas isoladas do presente invento possuindo actividade de proteína serina-quinase são utilizadas para gerar proteínas e aminoácidos fosforilados. Os péptidos do presente invento podem também ser utilizados para gerar anticorpos para ensaios de detecção e métodos de isolamento de PAK65 e complexos de PAK65 em vias de transdução de sinal e condições de doença relacionadas com PAK-65. Os polinucleótidos isolados do presente invento podem ser ainda utilizados na dissecação de vias de transdução de sinal e de condições de doença relacionadas com PAK65 e em tratamentos anti-sentido particulares para estas. São também aqui descritas composições e métodos para pesquisar bibliotecas de agentes quanto à sua capacidade para modular ou inibir as propriedades de hPAK65, que tal como aqui divulgado incluem a sua actividade de proteína-quinase, a sua actividade de ligação à proteína p21, a sua actividade de autofosforilação induzida pela proteína 21 e a sua actividade de libertação de fosfato ligado a p21. De preferência, os agentes modulam as propriedades de interacção da PAK65 humana com racl e CDC42Hs. Mais, são descritas composições e métodos para tratamento de neoplasia em pacientes humanos e veterinários, composições e métodos para pesquisa de uma biblioteca de agentes quanto a actividade farmacológica na regulação da proliferação celular e/ou diferenciação celular, composições e métodos para modulação de um fenótipo de célula transformada in vitro, incluindo a utilização no controlo de bioprocessos e como reagentes laboratoriais comerciais. Adicionalmente, são descritas composições farmacêuticas para o controlo de doenças dependentes de hPAK65 em mamíferos que incluem um agente capaz de modular pelo menos uma das propriedades associadas a hPAK65 e um método de controlo de doenças dependentes de hPAK65 que inclui a administração de uma quantidade de controlo da doença dependente da quinase hPAK65 de um agente capaz de modular uma das propriedades associadas a hPAK65 a um mamífero sofrendo de uma doença 8 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ dependente da quinase hPAK65. Mamífero tem o significado habitual e inclui humanos. Pretende-se que as utilizações farmacêuticas incluam utilizações veterinárias, especialmente a utilização em animais domesticados tais como gado, ovelhas, porcos, cabras, cães, gatos, coelhos, hamsters, gerbilos, ratos e ratinhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA e 1B representam o fraccionamento do citosol de neutrófilos. A Figura 1B representa um cromatograma mostrando o fraccionamento do citosol de neutrófilos numa coluna Mono Q, na qual foram aplicados 10 ml (10 mg/ml) e se eluiu com 30 ml de gradiente salino. As fracções colhidas foram analisadas através de um ensaio de sobreposição com [γ32Ρ]GTP CDC42HS como sonda (Figura IA) tal como descrito em pormenor na secção EXEMPLOS.

As Figuras 2A, 2B e 2C representam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO:l) e de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:2) da PAK65 humana ("hPAK65"). O ADNc de hPAK65 foi clonado a partir de uma biblioteca de placenta humana. A Figura 2a apresenta uma sequência de ácido nucleico do ADNc da PAK65 humana e a sua sequência de aminoácidos deduzida. Na Figura 2A os aminoácidos sublinhados correspondem à sequência peptídica obtida a partir da purificação de ρβ5. A Figura 2B representa uma comparação entre as sequências de aminoácidos deduzidas de hPAK65 e de PAK65 de cérebro de rato. A Figura 2C representa uma comparação entre um putativo domínio quinase de hPAK65 e de STE20 de levedura.

As Figuras 3A, B e C apresentam a análise Northern blot de hPAK65 em tecidos e linhas celulares. A sonda marcada radioactivamente gerada através de PCR a partir do domínio quinase (sequência de nucleótidos 1009-1912) do ADNc de hPAK65 foi utilizada para hibridar com ARNm isolado de vários tecidos imobilizado em Northern blots. A autorradiografia foi exposta 3 h. A Figura 4 representa a especificidade de ligação de hPAK65 entre as proteínas semelhante a rho. Foram aplicados 80 pg de citosol de neutrófilos ou 2-3 pg de hPAK65 9 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ recombinante em SDS-PAGE, transferidos para um filtro de PVDF e analisou-se através de ensaio de sobreposição. O filtro foi sondado com a GTPase indicada previamente carregada com [γ32Ρ] GTP ou [β32Ρ] GDP. As pistas a contêm hPAK65 recombinante e as pistas b contêm citosol de neutrófilos. Marcadores de peso molecular proteicos estão indicados em quilodaltons.

As Figuras 5A-C apresentam resultados da activação da autofosforilação de hPAK65. Na Figura 5A, 1-2 pg de hPAK65 recombinante imobilizados em contas em 40 μΐ de tampão de quinase, foram incubados com 1-2 pg da GTPase indicada que foram previamente carregados com GTP ou GDP. A reacção foi incubada durante 20 min. a 30°C com ATP 50 pM e 5 pCi de [γ32Ρ]ΑΤΡ. As proteínas fosforiladas foram analisadas em SDS-PAGE seguido de uma autorradiografia. Na Figura 5B, 4 pg de hPAK65 fosforilada radiomarcada mediada por CDC42Hs foram hidrolisados em HC1 6 N, 110°C durante 2 h, e os fosfoaminoácidos foram separados numa electroforese de camada fina. Os residuos marcados com 32Pi foram detectados através de autorradiografia. Na Figura 5C foi efectuada digestão proteolítica com as enzimas indicadas (tripsina, quimotripsina, endoproteinase Glu-C) em hPAK65 que foi pré-incubada com racl ou com CDC42Hs numa reacção de quinase contendo [γ32Ρ]ΑΤΡ. Os péptidos radiomarcados foram resolvidos num gel de Tricina a 16% e foram visualizados através de autorradiografia.

As Figuras 6A-D representam a activação da actividade quinase de hPAK65. Na Figura 6A foram incluídos 3 pg de MBP com hPAK65 numa reacção de quinase tal como descrito para a Figura 5A. Na Figura 6B foram removidos 5 pl da mistura reaccional de quinase de 5 em 5 min e a reacção foi parada através da adição de tampão de amostra com SDS. A MBP fosforilada foi separada numa SDS-PAGE a 14%, a banda foi excisada e foi contado o 32Pi incorporado. Na Figura 6C, 4 pg de hPAK65 (30 pl de contas) foram primeiro incubados durante 20 min com 3 pg de CDC42Hs na presença (activada) ou ausência (controlo) de ATP numa reacção de quinase. Para remover CDC42Hs, as contas de hPAK65 foram lavadas três vezes e a hPAK65 foi sujeita a uma segunda reacção de quinase contendo [γ32Ρ]ΑΤΡ e MBP. A Figura 6D apresenta a actividade quinase da 10 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ hPAK65 como contagens por minuto incorporadas em MBP isolada a partir das membranas da Figura 6A. A Figura 7 apresenta uma comparação da ligação de CDC42HS a hPAK65 fosforilada e não fosforilada. Foram corridos 2 pg de hPAK65 não fosforilada ou fosforilada (induzida por CDC42Hs) numa SDS-PAGE, corados com azul de Coomassie e foram também testados quanto à ligação a CDC42Hs através de ensaio de sobreposição. A pista a contém a forma não fosforilada e a pista b contém a forma fosforilada.

As Figuras 8A e 8B representam o efeito de hPAK65 na actividade de GTPase intrínseca e estimulada por pl90 de CDC42Hs. Foi incubado 1 nM de CDC42Hs pré-carregada com [Y32P]GTP com as concentrações indicadas de hPAK65 não fosforilada ou fosforilada na ausência (Figura 8A) ou na presença (Figura 8B) de 20 nM do domínio catalítico de pl90, seguido de um ensaio de libertação de fosfato. A Figura 9 apresenta um esquema de um modelo do papel de racl/CDC42Hs na activação da quinase hPAK65. No passo 1 os factores de permuta racl ou CDC42HS, que são estimulados por factores de crescimento, estimulam a libertação de GDP de racl ou CDC42Hs e subsequentemente a ligação de GTP a racl ou CDC42HS. No passo 2 a racl ou CDC42HS activada liga-se a hPAK65. No passo 3 a racl ou CDC42HS induz a autofosforilação de hPAK65 para activar a actividade de serina-quinase de hPAK65. No passo 4 a actividade de GTPase intrínseca de racl ou CDC42HS hidrolisa o GTP para o estado inactivo GDP. No passo 5 a forma ligada a GDP de racl ou CDC42HS dissocia-se da quinase hPAK65 autofosforilada activa. A Figura 10 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína de fusão de ligação a p21 GST-PAKette.

DESCRIÇÃO DE CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS O presente invento proporciona novas composições compreendendo polinucleótidos e oligonucleotídicos isolados possuindo sequências de ácido nucleico de hPAK65. São também proporcionadas pelo presente invento proteínas isoladas codificadas pelos polinucleótidos de hPAK65. Sequências de 11 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ ácido nucleico e de aminoácidos exemplares são expostas em SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente. Aspectos do presente invento incluem polinucleótidos e oligonucleotidicos isolados possuindo sequências de ácido nucleico homólogas a SEQ ID NO:l ou codificando SEQ ID NO:2; e proteínas isoladas possuindo sequências de aminoácidos homólogas a SEQ ID NO:2. As concretizações do presente invento são alcançadas através da síntese química dos polinucleótidos ou oligonucleotidicos codificando hPAK65, no todo ou em parte, possuindo pelo menos 95% de homologia da sequência de ácido nucleico (com homologias de preferência crescentes até 100%) com uma sequência de ácido nucleico da PAK65 humana; ou através do isolamento de polinucleótidos codificando uma hPAK65 de ocorrência natural possuindo pelo menos 95% de homologia da sequência de ácido nucleico (com homologias de preferência crescentes até 100%) com uma sequência de ácido nucleico codificando a PAK65 humana. Por exemplo, as técnicas para síntese de polinucleótidos e oligonucleótidos são bem conhecidas na arte e podem ser feitas alterações na sequência de SEQ ID NO:l que permitam o desvio dessa sequência ao mesmo tempo que permitam que sejam mantidos pelo menos 95% de homologia da sequência de ácido nucleico com a sequência descrita em SEQ ID NO:l. Numa concretização preferida as sequências têm pelo 95% de homologia com a sequência de codificação de SEQ ID NO:l.

Alternativamente, noutra concretização do presente invento polinucleótidos codificando hPAK65 de ocorrência natural com pelo menos 95% de homologia da sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico da PAK65 humana são isolados utilizando polinucleótidos ou oligonucleótidos isolados possuindo sequências de ácido nucleico derivadas de SEQ ID NO:l. As condições de hibridação e de lavagem são conhecidas na arte e aqui discutidas e podem ser utilizadas para hibridar selectivamente ácidos nucleicos sonda gerados a partir da sequência descrita em SEQ ID N0:1 com ácidos nucleicos com pelo menos 80% de homologia da sequência de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico da PAK humana.

Nos aspectos das proteínas isoladas do presente invento, as proteínas isoladas de hPAK65 têm sequências de aminoácidos 12 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ que correspondem a uma hPAK65 possuindo pelo menos 90% de homologia de aminoácidos (com uma preferência crescente por sequências com pelo menos 95%, 99% até possuindo uma diferença de um aminoácido) com uma sequência de PAK65 humana, SEQ ID NO:2. As proteínas isoladas do presente invento podem ser expressas utilizando os polinucleótidos do presente invento operativamente ligados a uma sequência de controlo apropriada num vector de expressão adequado para expressão numa célula de mamífero, insecto, levedura ou bacteriana.

Definições A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por um perito na arte à qual este invento pertence. Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais em cultura de células, genética molecular e química e hibridação de ácidos nucleicos descritos abaixo são os bem conhecidos e vulgarmente empregues na arte. Técnicas padrão são utilizadas para métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de polinucleótidos e cultura e transformação microbianas (p. ex., electroporação, lipofecção). Geralmente, as reacções enzimáticas e os passos de purificação são efectuados de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e os procedimentos são geralmente efectuados de acordo com métodos convencionais na arte e várias referências gerais (ver genericamente, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que são proporcionadas ao longo deste documento. A nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais em química analítica, química de síntese orgânica e formulação farmacêutica descritos abaixo são os bem conhecidos e vulgarmente empregues na arte. São utilizadas técnicas padrão para a síntese química, análises químicas, formulação e distribuição farmacêutica, e tratamento de pacientes. Tal como empregues ao longo do fascículo, os seguintes termos, a menos que indicado de outro modo, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: O termo "polinucleótido isolado" aqui referido significa um polinucleótido de origem genómica, em ADNc ou sintética ou 13 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ alguma combinação destas, em que em virtude da sua origem o "polinucleótido isolado" (1) não está associado a todo ou a uma porção de um polinucleótido no qual o "polinucleótido isolado" se verifica na natureza, (2) está operativamente ligado a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. O termo "proteína isolada" aqui referido significa uma proteína de origem em ADNc, ARN recombinante ou sintética ou alguma combinação destas, em que em virtude da sua origem a "proteína isolada" (1) não está associada a proteínas verificadas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, p. ex., livre de proteínas humanas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. O termo "polipéptido" é aqui utilizado como um termo genérico para referir a proteína nativa, fragmentos ou análogos de uma sequência polipéptídica. Deste modo, a proteína nativa, fragmentos e análogos são espécies do género do polipéptido. Os polipéptidos hPAK65 que interagem com p21 preferidos incluem: a proteína humana inteira compreendendo a sequência polipéptídica mostrada na Figura 2A, polipéptidos compreendendo um domínio quinase, tais como consistindo essencialmente numa sequência mostrada na Figura 2C, polipéptidos compreendendo um domínio de ligação a p21 consistindo essencialmente nos aminoácidos 49 a 113 da Figura 2A, polipéptidos hPAK65 sem os aminoácidos 489, 490 e/ou 491, ou polipéptidos hPAK65 possuindo aminoácidos correspondendo a 380, 383 e/ou 384 da Figura 2A substituídos por Glu ou Asp. 0 termo "de ocorrência natural" tal como aqui se utiliza aplicado a um objecto refere-se ao facto de um objecto poder ser verificado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que esteja presente num organismo (incluindo vírus) que possa ser isolada da uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. 14 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ Ο termo "operativamente ligado" aqui referido refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão numa relação que lhes permite funcionarem do modo pretendido. Uma sequência de controlo "operativamente ligada" a uma sequência de codificação está ligada de um modo tal que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo. O termo "sequência de controlo" aqui referido refere-se a sequências polinucleotidicas que são necessárias para efectuar a expressão de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controlo incluem um promotor, um local de ligação ao ribossoma e uma sequência de terminação da transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e uma sequência de terminação da transcrição. O termo "sequências de controlo" pretende incluir, no minimo, todos os componentes cuja presença seja necessária para a expressão e pode incluir também componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências lider e sequências de parceiros de fusão. O termo "polinucleótido" tal como aqui referido significa uma forma polimérica de nucleótidos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleótidos ou desoxinucleótidos ou uma forma modificada de ambos os tipos de nucleótidos. O termo inclui formas de ADN de cadeia simples e dupla. O termo "oligonucleótido" aqui referido inclui nucleótidos de ocorrência natural e modificados ligados uns aos outros através de ligações oligonucleotidicas de ocorrência natural e de ocorrência não natural. Os oligonucleótidos são um subconjunto de polinucleótidos com 200 bases ou menos de comprimento. De preferência, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases de comprimento e de maior preferência 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são habitualmente de cadeia simples, p. ex., para sondas; embora os oligonucleótidos possam ser de cadeia dupla, p. ex., para utilização na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos do presente invento podem ser oligonucleótidos com sentido ou anti- 15 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ sentido. Ο termo "nucleótidos de ocorrência natural" aqui referido inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. O termo "nucleótidos modificados" aqui referido inclui nucleótidos com grupos açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. O termo "ligações oligonucleotídicas" aqui referido inclui ligações oligonucleotídicas tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Um oligonucleótido pode incluir um marcador para detecção, se desejado. O termo "homologia de sequência" aqui referido descreve a proporção de coincidências de bases entre duas sequências de ácido nucleico ou a proporção de coincidências de aminoácidos entre duas sequências de aminoácidos. Quando a homologia de sequência é expressa como percentagem, p. ex., 50%, a percentagem denota a proporção de coincidências ao longo do comprimento da sequência de hPAK65 que é comparada com alguma outra sequência. São permitidos intervalos (numa das duas sequências) para maximizar as coincidências; é habitualmente utilizado um comprimento de intervalo de 15 bases ou menos, é preferido 6 bases ou menos sendo o mais preferido 2 bases ou menos. Quando se utilizam oligonucleótidos como sondas ou tratamentos a homologia de sequência entre o ácido nucleico alvo e a sequência oligonucleotídica é geralmente de não menos de 17 coincidências de bases alvo das 20 coincidências de pares de bases oligonucleotídicas possíveis (85%); de preferência não menos de 9 coincidências das 10 coincidências de pares de bases possíveis (90%) e de maior preferência não menos de 19 de 20 coincidências de pares de bases (95%). O termo "hibrida selectivamente" aqui referido significa que se liga de modo detectável e específico. Os polinucleótidos, oligonucleótidos e fragmentos do presente invento hibridam selectivamente com cadeias de ácido nucleico sob condições de hibridação e lavagem que minimizem quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Podem ser utilizadas condições de elevado rigor para alcançar condições de hibridação selectivas tal como é conhecido na arte e aqui discutido. Geralmente, a homologia de sequência de ácido nucleico entre os polinucleótidos, oligonucleotídicos e fragmentos do presente 16 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ invento e uma sequência de ácido nucleico de interesse serão pelo menos de 80% e mais tipicamente com homologia crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% e 100%.

Duas sequências de aminoácidos são homólogas se houver uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, uma homologia de 85% significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências são alinhadas para um máximo de coincidências. São permitidos intervalos (numa das duas sequências a comparar) para maximizar as coincidências; são preferidos comprimentos de intervalo de 5 ou menos, sendo ainda preferido 2 ou menos. Alternativamente e de preferência, duas sequências proteicas (ou sequências polipeptídicas derivadas destas com pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, tal como este termo aqui se utiliza, se tiverem um registo de alinhamento de mais de 5 (em unidades de desvio padrão) utilizando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutações e uma penalidade de intervalo de 6 ou mais. Ver, Dayhoff, M.O., em "Atlas of Protein Sequence and Structure", 1972, volume 5, National Biomedical Research Foundation, págs. 101-110, e Suplemento 2 a este volume, págs. 1-10. As duas sequências ou partes destas são de preferência homólogas se os seus aminoácidos forem 50% ou mais idênticos quando alinhados de modo óptimo utilizando o programa ALIGN. 0 termo "corresponde a" é aqui utilizado para significar que uma sequência polinucleotídica é homóloga (i.e., é idêntica, não estritamente evolutivamente aparentada) a toda ou a uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência ou que uma sequência polinucleotídica é idêntica a uma sequência polinucleotídica de referência. Em contraste, o termo "complementar a" é aqui utilizado para significar que a sequência complementar é homóloga a toda ou a uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotidica "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar a uma sequência de referência "GTATA".

Os seguintes termos são utilizados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleótidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade 17 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como base para uma comparação de sequências; uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, tal como um segmento de um ADNc inteiro ou uma sequência génica dada numa listagem de sequências tal como SEQ ID NO:l, ou pode compreender um ADNc completo ou sequência génica. Geralmente, uma sequência de referência tem pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, frequentemente pelo menos 25 nucleótidos de comprimento e mais frequentemente pelo menos 50 nucleótidos de comprimento. Uma vez que dois polinucleótidos podem cada um (1) compreender uma sequência (i.e., uma porção da sequência polinucleotidica completa) que seja semelhante entre os dois polinucleótidos, e (2) pode compreender ainda uma sequência que seja divergente entre os dois polinucleótidos, as comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleótidos são tipicamente efectuadas através da comparação das sequências dos dois polinucleótidos ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança das sequências. Uma "janela de comparação", tal como aqui se utiliza, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 20 posições de nucleótidos contíguas em que uma sequência polinucleotidica pode ser comparada com uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleótidos contíguos e em que a porção da sequência polinucleotidica na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., intervalos) de 20 por cento ou menos em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento óptimo das duas sequências. O alinhamento óptimo de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, através do método de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 2444, 1988, através de implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Edição 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou através de inspecção, e é seleccionado o melhor alinhamento (i.e., resultando na percentagem mais elevada de 18 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ homologia ao longo da janela de comparação) gerado através dos vários métodos. O termo “identidade de sequência" significa que duas sequências polinucleotídicas são idênticas (i.e., numa base nucleótido-a-nucleótido) ao longo da janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado através da comparação de duas sequências alinhadas de modo óptimo ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (p. ex., A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências para dar o número de posições coincidentes, dividindo o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação (i.e., o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência. O termo "identidade substancial" tal como aqui se utiliza denota uma caracteristica de uma sequência polinucleotidica, em que o polinucleótido compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência, mais habitualmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleótidos, frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 25-50 nucleótidos, em que a percentagem de identidade de sequência é calculada através de comparação da sequência de referência com a sequência polinucleotídica que pode incluir deleções ou adições que totalizem 20 por cento ou menos da sequência de referência ao longo da janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento da sequência polinucleotídica da PAK65 humana mostrada na Figura 2A.

Tal como aqui se utiliza, os vinte aminoácidos convencionais e a suas abreviaturas seguem a utilização convencional ("Immunology - A Synthesis", 2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 1991). Estereoisómeros (p. ex., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a,a-bissubstituídos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para os polipéptidos do presente invento. Exemplos de aminoácidos não 19 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,N-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, ω-Ν-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes e iminoácidos (p. ex., 4-hidroxiprolina). Na notação dos polipéptidos aqui utilizada, a direcção esquerda é a direcção do terminal amino e a direcção direita é a direcção do terminal carboxilo, de acordo com a utilização padrão e a convenção. De modo semelhante, a menos que especificado de outro modo, a extremidade esquerda das sequências polinucleotidicas de cadeia simples é a extremidade 5'; a direcção esquerda das sequências polinucleotidicas de cadeia dupla é referida como a direcção 5'. A direcção da adição de 5' para 3' dos transcritos de ARN nascentes é referida como a direcção da transcrição; as regiões de sequência na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que o ARN e que estão a 5' da extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como “sequências a montante"; as regiões de sequência na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que o ARN e que estão a 3' da extremidade 3' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a jusante".

Aplicado a polipéptidos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando alinhadas de modo óptimo, tal como através dos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos de intervalo por defeito, partilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, de maior preferência pelo menos 95 por cento de identidade de sequência e ainda de preferência pelo menos 99 por cento de identidade de sequência. De preferência, as posições de resíduos que não são idênticas diferem devido em substituições de aminoácidos conservativas. As substituições de aminoácidos conservativas referem-se à alternância de resíduos possuindo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos 20 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ possuindo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácido possuindo cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Grupos de substituições de aminoácidos conservativas preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutâmico-aspártico e asparagina-glutamina. O termo "fragmento polipeptídico" tal como agui se utiliza refere-se a um polipéptido que possui uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal, mas em gue a restante seguência de aminoácidos é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de ADNc inteira (p. ex., a sequência de ADNc mostrada na Figura 2A). Os fragmentos têm tipicamente pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, ainda de preferência pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, habitualmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e ainda de maior preferência pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo" tal como aqui se utiliza refere-se a polipéptidos que são constituídos por um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que possui uma identidade substancial com uma porção da sequência de aminoácidos deduzida mostrada na Figura 2A e que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica a um polipéptido p21, de preferência racl ou CDC42Hs, sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade para efectuar uma actividade de proteína p21, de preferência actividade de racl ou CDC42HS, quando expresso numa célula de mamífero, (3) actividade de proteína serina-quinase, ou (4) capacidade para modular a actividade da proteína p21, de preferência actividade de GTPase de racl ou CDC42HS. Tipicamente, os polipéptidos análogos compreendem uma substituição de aminoácidos conservativa (ou adição ou deleção) em relação à sequência de ocorrência natural. Os análogos têm tipicamente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais, tendo habitualmente o comprimento do polipéptido hPAK65 de ocorrência natural inteiro tal como mostrado na Figura 2A. Alguns análogos do polipéptido hPAK65 21 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ que interagem com ρ21 podem não ter actividade biológica mas podem ainda ser empregues para várias utilizações, tais como para a criação de anticorpos para epítopos do polipéptido PAK que interagem com p21, como reagentes imunológicos para detectar e/ou purificar anticorpos do polipéptido PAK que interagem com p21, através de cromatografia de afinidade ou como um agonista, antagonista ou agonista parcial competitivo ou não competitivo da função do polipéptido hPAK65 nativo de interacção com p21. O termo "modulação da PAK65 humana" é aqui utilizado para se referir à capacidade de estimular ou inibir uma propriedade funcional da PAK65 humana (p. ex., actividade quinase, ligação a p21); tal estimulação ou inibição pode ser contingente na ocorrência de um acontecimento especifico, tal como a activação de uma via de transdução de sinal e/ou pode manifestar-se apenas em determinados tipos celulares. O termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito a partir de materiais biológicos tais como bactérias, plantas, fungos ou células ou tecidos animais (particularmente de mamífero). Os agentes são avaliados quanto à potencial actividade como agentes moduladores da PAK65 humana (p. ex., agentes antineoplásicos, agentes citotóxicos, inibidores de transformação neoplásica ou proliferação celular, agentes promotores de proliferação celular, tumorigenicidade induzida por Ras e semelhantes) através da inclusão em ensaios de pesquisa aqui descritos. O termo "agente candidato" é aqui utilizado para se referir a um agente que é identificado por um ou mais métodos de pesquisa do presente invento como um putativo agente modulador da PAK65 humana. Alguns agentes moduladores candidatos têm potencial terapêutico como fármacos para utilização humana.

Tal como aqui se utiliza, os termos "marcador" ou "marcado" referem-se à incorporação de um marcador detectável, p. ex., p. ex., através da incorporação de um aminoácido radiomarcado ou de ligação a um polipéptido de porções 22 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ biotinilo que podem ser detectadas através de avidina marcada (p. ex., estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que possa ser detectada através de métodos ópticos ou colorimétricos). São conhecidos na arte e podem ser utilizados vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteinas. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não se limitam aos seguintes: radioisótopos (p. ex., 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanideos), marcadores enzimáticos (p. ex., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, biotinilo, epitopos polipeptidicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p. ex., sequências em pares de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, marcadores epitópicos). Nalgumas concretizações, os marcadores são ligados através de braços espaçadores com vários comprimentos para reduzir um potencial impedimento espacial.

Tal como aqui se utiliza, "substancialmente pura" significa que uma espécie objecto é a espécie predominante presente (i.e., numa base molar é mais abundante que qualquer outras espécie individual na composição) e de preferência uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende pelo menos cerca de 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, de maior preferência mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. De maior preferência, a espécie objecto é purificada essencialmente até à homogeneidade (não podem ser detectadas espécies contaminantes na composição através de métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. O termo "agente farmacêutico ou fármaco" tal como aqui se utiliza refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado correctamente a um paciente. 23 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Outros termos químicos aqui são utilizados de acordo com a utilização convencional na arte, tal como exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco). O termo "agente antineoplásico" é aqui utilizado para se referir a agentes que tenham a propriedade funcional de inibir um desenvolvimento ou proqressão de um neoplasma num humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. A inibição de metástases é frequentemente uma propriedade de agentes antineoplásicos.

Detecção de Ácido Nucleico de hPAK65 Utilizando

Polinucleótidos de hPAK65

Os polinucleótidos isolados do presente invento podem ser utilizados como sondas para detectar, e se desejado clonar, PAK65 numa amostra de um organismo. A amostra é tipicamente de tecido (Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., "Molecular Cloning", segunda edição (1989) (aqui referido como "Sambrook et al."). Os polinucleótidos isolados com sequências de ácido nucleico codificando PAK65 humana (p. ex., SEQ ID NO:l) podem ser utilizados como sondas para detectar a presença de sequências de ácido nucleico alvo com homologia de sequência. As sondas polinucleotídicas são preparadas e marcadas através de métodos conhecidos na arte, p. ex., Sambrook et al., especialmente o Capítulo 10, o texto das secções sobre a preparação e marcação de ácidos nucleicos. Por exemplo, pode ser utilizada a reacção em cadeia da polimerase para amplificar o ADN e pode ser utilizado o sistema de marcação biotina-avidina para marcar e detectar o polinucleotido alvo. As sondas polinucleotídicas são hibridadas com ácidos nucleicos alvo às temperaturas de hibridação apropriadas (p. ex., Sambrook et al.; o texto do Capitulo 9); e lavadas a rigores de lavagem baixo e elevado, dependendo do ensaio de detecção.

De preferência os polinucleótidos são utilizados como sondas sob condições de lavagem de elevado rigor e com as correspondentes condições de hibridação, tal como é conhecido na arte. Podem ser utilizados polinucleótidos isolados para 24 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ produzir sondas que tenham de 50 pares de bases à extensão inteira do ADNc de hPAK65. De preferência, as sondas são produzidas a partir de polinucleótidos isolados com 100-400 nucleótidos de comprimento. Tais condições podem ser utilizadas para detectar alelos do gene de hPAK65 em humanos.

Alternativamente, podem ser empregues oligonucleótidos como sondas. As técnicas para utilização de oligonucleótidos como sondas para detectar as mesmas sequências de ácido nucleico ou aparentadas são bem conhecidas na arte, ver por exemplo, Sambrook et al., especialmente o Capítulo 11. Podem ser produzidas sondas a partir de oligonucleótidos que tenham de 10 a 200 bases de comprimento. De preferência as sondas são produzidas a partir de oligonucleótidos com 10 a 60 nucleótidos de comprimento e de maior preferência 12 a 40 bases de comprimento. Para diminuir o número de falsos positivos, são utilizadas de preferência duas sondas para identificar os clones que se ligam a ambas as sondas sob as condições de hibridação e lavagem. Os oligonucleótidos podem ser sintetizados num sintetizador de oligonucleótidos Applied BioSystems de acordo com as especificações proporcionadas pelo fabricante.

Um método para amplificação de ácidos nucleicos alvo, para posterior análise através de ensaios de hibridação, é conhecido como técnica de reacção em cadeia da polimerase ("PCR") ou PCR. A técnica de PCR pode ser aplicada para detectar sequências do presente invento em amostras suspeitas utilizando iniciadores oligonucleotídicos afastados uns dos outros e baseados na sequência genética aqui exposta. Os iniciadores são complementares a cadeias opostas de uma molécula de ADN de cadeia dupla e são tipicamente separados por cerca de 50 a 450 nucleótidos ou mais (habitualmente não mais de 2000 nucleótidos). Este método implica a preparação dos iniciadores oligonucleotídicos específicos seguida de ciclos repetidos de desnaturação do ADN alvo, ligação do iniciador e extensão com uma ADN-polimerase para obter fragmentos de ADN do comprimento esperado com base no espaçamento do iniciador. Os produtos de extensão gerados a partir de um iniciador servem como sequências alvo adicionais para o outro iniciador. O grau de amplificação de uma sequência alvo é controlado pelo número de ciclos que são 25 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ efectuados e é teoricamente calculado através da fórmula simples 2n onde o n é o número de ciclos. Dado que a eficiência média por ciclo varia de cerca de 65% a 85%, 25 ciclos produzem de 0,3 a 4,8 milhões de cópias da sequência alvo. O método de PCR é descrito em várias publicações, incluindo Saiki et al., Science 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al.r Nature 324: 163-166, 1986; e Scharf et al., Science 233: 1076-1078, 1986. Ver também Patentes U.S. 4683194, 4683195 e 4683202. Métodos adicionais para amplificação por PCR são descritos em: "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification" ed. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", eds. Innis, Gelfland, Snisky and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert, K.A. e Kunkel, T.A., PCR Methods and

Applications 1: 17, 1991; e "PCR", eds. McPherson, Quirkes and Taylor, IRL Press, Oxford.

Vectores adequados para replicação em células de mamifero são conhecidos na arte e podem incluir replicões virais ou sequências que asseguram a integração da sequência codificando PAK65 no genoma do hospedeiro. Vectores adequados podem incluir, por exemplo, os derivados do vírus símio SV40, retrovírus, vírus de papiloma bovino, vírus vacínia e adenovírus.

Um vector adequado, por exemplo, é um derivado de vírus vacínia. Neste caso, o ADN heterólogo é inserido no genoma de vacínia. As técnicas para a inserção de ADN estranho no genoma do vírus vacínia são conhecidas na arte e utilizam, por exemplo, recombinação homóloga. A inserção do ADN heterólogo é feita geralmente num gene que não seja de natureza essencial, por exemplo, o gene da timidina-quinase (tk), que proporciona também um marcador seleccionável. Foram descritos vectores plasmídicos vaivém que facilitam grandemente a construção de vírus recombinantes (ver, por exemplo, Mackett et al., 1984; Chakrabarti et al., 1985; Moss, 1987. A expressão do polipéptido heterólogo ocorre então em células ou indivíduos que são imunizados com o vírus vacínia recombinante vivo.

Tais vectores de expressão de mamífero adequados contêm habitualmente uma ou mais unidades de transcrição eucarióticas 26 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ que são capazes de facilitar a expressão em células de mamífero. A unidade de transcrição é constituída por pelo menos um elemento promotor para mediar a transcrição de sequências de ADN estranhas. Promotores adequados para células de mamífero são conhecidos na arte e incluem promotores virais tais como o do vírus símio SV40 (SV40), de citomegalovírus (CMV) , do vírus do sarcoma de Rous (RSV) , de adenovírus (ADV) e do vírus de papiloma bovino (BPV). A presença opcional de um elemento de estimulação (estimulador), combinado com os elementos promotores aqui descritos, aumentará tipicamente os níveis de expressão. Um estimulador é qualquer sequência de ADN reguladora que pode estimular a transcrição até 1000 vezes quando ligada a promotores endógenos ou heterólogos, com a síntese a começar no local normal de início do ARNm. Os estimuladores são também activos quando são colocados a montante ou a jusante do local de início da transcrição, na orientação normal ou invertida ou a uma distância de mais de 1000 nucleótidos do promotor (Maniatis et al., Science 236: 1237, 1987; Alberts et al., (1989) "Molecular Biology of the Cell", 2a ed.). Os elementos estimuladores derivados de vírus podem ser particularmente úteis, porque possuem tipicamente um amplo espectro de hospedeiros. Exemplos úteis em células de mamífero incluem o estimulador do gene inicial de SV40 (Dijkema et al., EMBO J. 4: 761, 1985) e os estimuladores/promotores derivados da repetição terminal longa (LTR) do vírus do Sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 79 : 6777, 1982b) e de citomegalovírus humano (Boshart et al., Cell 41: 521, 1985).

Adicionalmente, alguns estimuladores são reguláveis e tornam-se activos apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona ou ião metálico (Sassone-Corsi e Borelli, Trends Gene t. 2: 215, 1986; Maniatis et al., Science 236: 1237, 1987) .

Adicionalmente, a unidade de transcrição pode também ser constituída por uma sequência de terminação e sequências de adição poli(A) que estejam operativamente ligadas à sequência de codificação de PAK65. A unidade de transcrição pode também ser constituída por uma sequência estimuladora que aumente a expressão de PAK65. 27 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Sequências que causem amplificação do gene podem também ser desejáveis, tais como sequências que codifiquem marcadores seleccionáveis. Marcadores seleccionáveis para células de mamífero são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, timidina-quinase, di-hidrofolato-redutase (juntamente com metotrexato como amplificador de DHFR), aminoglicósido-fosfotransferase, higromicina B-fosfotransferase, asparagina-sintetase, adenosina-desaminase, metalotioneína e genes de resistência a antibióticos tais como neomicina. O vector que codifica PAK65 pode ser utilizado para transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. A transformação pode ser através de qualquer método conhecido para introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, o empacotamento do polinucleótido num vírus e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus ou através de procedimentos de transfecção conhecidos na arte, tal como exemplificado pelas Patentes U.S. 4399216, 4912040, 4740461 e 4959455. O procedimento de transformação utilizado depende do hospedeiro a transformar. Métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são conhecidos na arte e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do polinucleótido ou polinucleótidos em lipossomas e micro-injecção directa do ADN nos núcleos.

As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são conhecidas na arte e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não se limitando a células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ex., Hep G2) e várias outras linhas celulares. Tal como discutido abaixo, linhas celulares de particular preferência são as que expressam construções de hPAK65 recombinante possuindo actividade de serina-quinase constitutiva e que de preferência desenvolvem subsequentemente características de uma célula transformada. 28 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

No caso de expressão em células de insecto, geralmente os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, habitualmente um plasmideo bacteriano, que contém um fragmento do genoma de baculovirus e um local de restrição conveniente para inserção do gene ou genes heterólogos a expressar; um baculovirus de tipo selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento especifico de baculovirus no vector de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovirus); e células hospedeiras de insecto e meios de crescimento apropriados. Um vector preferido é pAcC13 (Rubinfeld, B., Cell 65: 1033-1042, 1991). Um plasmideo de expressão preferido é pAcPAK780, que contém uma construção de fusão epitopo Myc:hPAK65. Uma linha celular de insecto preferida é Sf9. A sequência nucleotidica da região de codificação da região de união epitopo Myc:hPAK65 de pAcPAK780 é ATG GAG CAG AAG CTG ATC TCC GAG GAG GAC CTG ATG GAG GAA, que continua até ao final da sequência de codificação de hPAK65 na Figura 2A.

Um dos vectores de transferência mais vulgarmente utilizados para introdução de genes estranhos em AcNPV é pAc373. Muitos outros vectores, conhecidos dos peritos na arte foram também desenhados. Estes incluem, por exemplo, pVL985 (que altera o codão de inicio da poli-hedrina de ATG para ATT, e que introduz uma local de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT; ver Luckow e Summers, Virology 17: 31, 1989. O plasmideo contém também habitualmente o sinal de poliadenilação da poli-hedrina (Mille et al., Ann. Rev. Microbiol. 42 : 177, 1988) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e uma origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.

Os vectores de transferência de baculovirus contêm habitualmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus é qualquer sequência de ADN capaz de se ligar à ARN-polimerase de baculovirus e de iniciar a transcrição para jusante (de 5' para 3') de uma sequência de codificação (p. ex., gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é habitualmente colocada próximo da extremidade 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um local de 29 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ ligação à ARN-polimerase e um local de início da transcrição. Um vector de transferência de baculovírus pode também possuir um segundo domínio designado estimulador, que, se presente, é habitualmente distai ao gene estrutural. A expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Adicionalmente, o polinucleótido PAK65 ou fragmento deste pode ser expresso num sistema bacteriano. Aí, um promotor bacteriano é qualquer sequência de ADN capaz de se ligar à ARN-polimerase bacteriana e iniciar a transcrição para jusante (3') de uma sequência de codificação (p. ex., gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é habitualmente colocada proximal à extremidade 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um local de ligação à ARN-polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano pode também possuir um segundo domínio designado operador, que se pode sobrepor ao local de ligação à ARN-polimerase adjacente no qual se inicia a síntese de ARN. O operador permite a transcrição regulada negativa (indutível), uma vez que uma proteína repressora do gene se pode ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva pode ser alcançada através de uma sequência de ligação à proteína activadora do gene, que, se presente é habitualmente proximal (5') à sequência de ligação à ARN-polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora do gene é a proteína activadora de catabolitos (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) (Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. 18:173, 1984). A expressão regulada pode por essa razão ser positiva ou negativa, deste modo aumentando ou reduzindo a transcrição.

Sequências codificando enzimas da via metabólica proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares, tais como galactose, lactose (lac) (Chang et al., Nature 198: 1056, 1977) e maltose.

Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como de triptofano (trp) (Goeddel 30 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ et al., Nuc. Acids Res. 8: 4057, 1980; Yelverton et al., Nucl. Acids Res. 9: 731, 1981; Patente U.S. 4738921; Pub. EPO 36776 e 121775). Os sistemas promotores da β-lactamase (bla) (Weissmann, (1981), em "Interferon 3" (ed. I. Gresser) , do bacteriófago lambda PL (Shimatake et al., Nature 292: 128, 1981) e T 5 (Patente U.S. 4689406) proporcionam também sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam também como promotores bacterianos. Por exemplo, as sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser unidas com as sequências do operão de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético (Patente U.S. 4551433). Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac constituído por ambas as sequências do promotor trp e do operão lac que é regulada pelo repressor lac (Amann et al., Gene 25: 167, 1983; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 21, 1983). Para além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que tenham a capacidade de se ligarem à ARN-polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de ocorrência natural de origem não bacteriana pode também ser ligado a uma ARN-polimerase compatível para produzir elevados níveis de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema ARN-polimerase/promotor do bacteriófago T7 é um exemplo de um sistema promotor conjugado (Studier et al., J. Mol. Biol. 189: 113, 1986; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sei. 82: 1074, 1985) . Adicionalmente, um promotor híbrido pode também ser constituído por um promotor de bacteriófago e uma região operadora de E. coli (Pub. EPO 267851). a

Para além de uma sequência promotora funcional, um local de ligação ao ribossoma eficiente é também útil para a expressão do gene de PAK65 ou de um fragmento deste em procariotas. Em E. coli, o local de ligação ao ribossoma é designado a sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento situada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine et al., Nature 254: 34, 1975). Pensa-se que a sequência SD promove a ligação do ARNm ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e 31 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ extremidade 3' do ARNr 16S de E. coli (Steitz et ai., (1979). em "Biological Regulation and Development: Gene Expression" (ed. R.F. Goldberger)). Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com um local de ligação ao ribossoma fraco (Sambrook et al., (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli" em "Molecular Cloning: A Laboratory

Manual"). PAK65 pode ser expresso intracelularmente. Uma sequência promotora pode ser directamente ligada ao gene de PAK65 ou a um fragmento deste, caso em que o primeiro aminoácido no terminal N será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina no terminal N pode ser clivada da proteína através de incubação in vitro com brometo de cianogénio ou incubação in vivo ou in vitro com uma metionina N-terminal-peptidase bacteriana (Pub. EPO 219237).

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Tipicamente, uma sequência de ADN codificando a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena ou outra proteína estável, é fundida com a extremidade 5' de sequências de codificação heterólogas de PAK65. Após expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene celular do bacteriófago lambda pode ser ligado no terminal 5' do gene PAK65 ou de um fragmento deste e expresso em bactérias. A proteína de fusão resultante retém de preferência um local para que uma enzima processadora (factor Xa) clive a proteína do bacteriófago do gene de PAK65 ou de um fragmento deste (Nagai et al., Nature 309 : 810, 1984). Proteínas de fusão podem também ser produzidas a partir dos genes lacZ (Jia et al., Gene 60: 197, 1987), trpE (Allen et al., J.

Biotechnol. 5: 93, 1987; Makoff et al., J. Gen. Microbiol. 135: 11, 1989) e Chey (Pub. EPO 324647). A sequência de ADN na junção das duas sequências de aminoácidos pode ou não codificar um local clivável. Outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é feita com a região de ubiquitina que retém de preferência um local para que uma enzima processadora (p. ex., a protease de processamento específica da ubiquitina) clive a ubiquitina do polipéptido PAK65. Através deste método, podem ser isolados polipéptidos maduros de PAK65 (Miller et al., Bio/Technology 32 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 7: 698, 1989). Uma fusão preferida derivada de modo recombinante contém um epítopo Myc (com uma metionina adicionada: MEQKLISEEDL) fundido com o terminal N de um polipéptido PAK ou um fragmento deste. Um anticorpo especifico para este epítopo Myc permite o isolamento e/ou a identificação (tal como num ensaio) da proteína de fusão. Uma tal concretização é a construção verificada no vector de expressão de hPAK65, pAcPAK780. Outro sistema preferido é uma fusão com glutationa-S-transferase ("GST"; disponível em Pharmacia) na extremidade C-terminal de hPAK65 ou do seu fragmento. A proteína de fusão recombinante é facilmente isolada através da sua capacidade para se ligar à glutationa ligada ao suporte sólido seguido de eluição da fusão com glutationa. Uma concretização mais preferida deste tipo é verificada no plasmídeo pGSTPAKette que codifica a proteína de fusão recombinante referida como GST-PAKette, que contém GST fundido com um fragmento da proteína hPAK65 dos aminoácidos 49 a 113 e que retém a capacidade para se ligar especificamente a racl ou CDC42HS. Este domínio de hPAK65 contém o domínio de ligação a racl. A sequência de aminoácidos de GST-PAKette é proporcionada na Figura 10.

Alternativamente, os polipéptidos hPAK65 podem também ser segregados pela célula através da criação de moléculas de ADN quiméricas codificando uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência de péptido sinal que proporciona a secreção dos polipéptidos hPAK65 em bactérias (Patente U.S. 4336336). O fragmento de sequência sinal codifica tipicamente um péptido sinal constituído por aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína pela célula. A proteína é segregada para o meio de cultura (bactérias Gram-positivas) ou para o espaço periplasmático, situado entre a membrana interna e externa da célula (bactéria Gram-negativas). De preferência existem locais de processamento que podem ser clivados in vitro ou in vitro codificados entre o fragmento do péptido sinal e o polipéptido hPAK65. O ADN codificando sequências sinal adequadas pode ser derivado de genes para proteínas bacterianas segregadas, tais como o gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) (Masui et al., 1983, em "Experimental Manipulation of Gene Expression"; Ghrayeb et al., EMBO J. 3: 2 43 7, 1984) e a 33 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ sequência sinal da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) (Oka et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 7212, 1985). Como exemplo adicional, a sequência sinal do gene da alfa-amilase de várias estirpes de Bacillus pode ser utilizada para segregar proteínas heterólogas de B. subtilis (Paiva et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5582, 1982; Pub. EPO 244042).

Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas pelas bactérias são regiões reguladoras situadas a 3' do codão de terminação da tradução e assim, juntamente com o promotor, flanqueiam a sequência de codificação. Estas sequências dirigem a transcrição de um ARNm que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo ADN. Sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de ADN de cerca de 50 nucleótidos capazes de formar estruturas caule-volta que auxiliam na terminação da transcrição. Exemplos incluem sequências de terminação da transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tais como o gene trp em E. coli bem como outros genes biossintéticos.

Tipicamente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, uma sequência sinal (se desejado), a sequência de codificação de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são colocados juntos nas construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extracromossómico (p. ex., plasmídeos) capaz de manutenção estável num hospedeiro, tal como bactérias. O replicão terá um sistema de replicação, permitindo-lhe assim ser mantido num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicão pode estar num plasmídeo de elevado ou baixo n.° de cópias. Um plasmídeo de elevado número de cópias terá geralmente um número de cópias que varia de cerca de 5 a cerca de 200 e tipicamente de cerca de 10 a cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmídeo de elevado número de cópias conterá de preferência pelo menos cerca de 10 e de preferência pelo menos cerca de 20 plasmídeos. Pode ser seleccionado um vector de elevado ou baixo número cópias dependendo do efeito do vector e do polipéptido PAK65 no hospedeiro. 34 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma bacteriano com um vector de integração. Os vectores de integração contêm tipicamente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite que o vector se integre. As integrações parecem resultar de recombinações entre o ADN homólogo no vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, vectores de integração construídos com ADN de várias estirpes de Bacillus integram-se no cromossoma de Bacillus (Pub. EPO 127328). Os vectores de integração podem também ser constituídos por sequências de bacteriófagos ou transposões.

Tipicamente, construções de expressão extracromossómicas e de integração podem conter marcadores seleccionáveis para permitir a selecção de estirpes bacterianas que foram transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem ser expressos no hospedeiro bacteriano e podem incluir genes que tornam as bactérias resistentes a fármacos tais como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina), e tetraciclina (Davies et al., Annu. Rev.

Microbiol. 32: 469, 1978). Os marcadores seleccionáveis podem também incluir genes biossintéticos, tais como aqueles nas vias biossintéticas de histidina, triptofano e leucina.

Alternativamente, alguns dos componentes descritos acima podem ser colocados juntos em vectores de transformação. Os vectores de transformação são tipicamente constituídos por um marcador seleccionável que ou é mantido num replicão ou é desenvolvido num vector de integração, tal como descrito acima.

Foram desenvolvidos vectores de transformação, replicões extracromossómicos ou vectores de integração, para transformação em muitas bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para, inter alia, as seguintes bactérias: Bacillus subtilis (Paiva et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5582, 1982; Pub. EPO 36259 e 63953; PCX WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake et al., Nature 292 : 128, 1981; Amann et al., Gene 40: 183, 1985; Studier et al., J. Mol. Biol. 189: 113, 1986; Pub. EPO 36776, 136829 e 136907; Pedido de Patente UK de Série 8418273), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655, 35 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 1988), Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655, 1988), Streptomyces lividans (Patente U.S. 4745056).

Os métodos para a introdução de ADN exógeno em hospedeiros bacterianos são bem conhecidos na arte e incluem tipicamente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou outros agentes, tais como catiões bivalentes e DMSO. O ADN pode também ser introduzido em células bacterianas através de electroporação. Os procedimentos de transformação variam habitualmente com as espécies bacterianas a transformar. Ver, p. ex. (Masson et al., FEMS Microbiol. Lett. 60: 273, 1989;

Paiva et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5582, 1982; Pub. EPO 36259 e 63953; P.C.T. WO 84/04541, Bacillus), (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 856, 1988; Wang et al., J.

Bacteriol. 172: 949, 1990, Campylobacter), (Cohen et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. 69: 2110, 1973; Dower et al., Nucleic

Acids Res. 16: 6127, 1988; Kushner, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids", em "Genetic Engineering: Proceedings of the

International Symposium on Genetic Engineering" (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia, 1978); Mandei et al., J. Mol. Biol. 53: 159, 1970; Taketo, Biochim. Biophys. Acta 949: 318, 1988;

Escherichia) , (Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett. 44: 173, 1987, Lactobacillus); (Fiedler et al., Anal. Biochem. 170: 38, 1988, Pseudomonas); (Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, 1990, Staphylococcus) , (Barany et al., J. Bacteriol. 144: 698, 1980; Harlander, 1987, "Transformation of

Streptococcus lactis by electroporation," em: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al., Infec. Immun. 32: 1295, 1981; Powell et al., Appl. Environ.

Microbiol. 54: 655, 1988; Somkuti et al., Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, 1987, Streptococcus).

Tal como aqui discutido, estão contempladas pequenas variações na sequência de aminoácidos da proteína hPAK65 ao estarem englobadas pelo termo hPAK65, desde que as pequenas variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 95%, de preferência pelo menos 99% e até pelo menos uma diferença de um aminoácido em homologia com a sequência de codificação da proteína PAK65 humana apresentada na Figura 2A. E provável que tais variações menores ocorram entre variantes 36 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ alélicas de hPAK65. Em particular, estão contempladas substituições conservativas de aminoácidos. As substituições conservativas são as que ocorrem dentro de uma familia de aminoácidos que são aparentados nas suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados estão geralmente divididos em famílias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares sem carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. As famílias preferidas são: serina e treonina são a família de alifáticos-hidroxilo; asparagina e glutamina são uma família contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; e fenilalanina, triptofano e tirosina são uma família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente aparentado não terá um grande efeito na ligação ou nas propriedades quinase da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido num local de ligação a p21 ou num local quinase activo. Pode ser facilmente determinado se uma alteração de aminoácido resulta num péptido funcional através do ensaio da actividade específica do derivado polipeptídico. Os ensaios são aqui descritos em pormenor.

Fragmentos ou análogos de hPAK65 podem ser preparados pelos vulgares peritos na arte. Os terminais amino e carboxilo preferidos dos fragmentos ou análogos ocorrem próximo das fronteiras de domínios funcionais. Por exemplo, tais domínios funcionais incluem domínios conferindo a propriedade de ligação para formar um complexo proteico hPAK65-p21, o domínio proteína-quinase, o domínio de autofosforilação e domínios que conferem a propriedade de modular vias de transdução de sinal relacionadas com hPAK65 das células. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados através da comparação dos dados da sequência nucleotídica e/ou de aminoácidos com bases de dados de sequências públicas ou privadas. De preferência, são utilizados métodos de comparação computorizada para identificar motivos da sequência ou domínios de conformação da proteína previstos que ocorrem noutras proteínas de estrutura 37 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ e/ou função conhecidas, tal como o domínio quinase proporcionado na secção Exemplo. Os métodos para identificar sequências proteicas que se dobram numa estrutura tridimensional conhecida são conhecidos (Bowie et ai., Science 253: 164, 1991). Assim, os exemplos antecedentes demonstram que os peritos na arte podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que podem ser utilizados para definir domínios estruturais e funcionais numa sequência de hPAK65.

Os fragmentos ou análogos compreendendo substancialmente um ou mais domínios funcionais podem ser fundidos com sequências polipeptídicas heterólogas, em que a proteína de fusão resultante exibe as propriedades funcionais conferidas pelo fragmento de hPAK65. Por exemplo, a proteína de fusão GST-PAKette (contendo os aminoácidos 49 a 113) retém a capacidade para se ligar especificamente a racl e CDC42HS. Alternativamente, os polipéptidos em que um ou mais domínios funcionais foram suprimidos exibirão uma perda da propriedade normalmente conferida pelo fragmento em falta. Por exemplo, uma proteína hPAK65 com uma truncagem N-terminal contendo os nucleótidos 1065-2248 não retinha a actividade de serina-quinase.

Embora uma classe de concretizações preferidas sejam fragmentos possuindo terminais amino e/ou carboxilo correspondentes a posições de aminoácidos próximas dos bordos de domínios funcionais, podem ser preparados fragmentos alternativos. A escolha dos terminais amino e carboxilo de tais fragmentos fica à descrição do executante e será feita com base em considerações experimentais tais como a facilidade de construção, a estabilidade à proteólise, a estabilidade térmica, a reactividade imunológica, a modificação do resíduo amino-terminal ou carboxi-terminal ou outras considerações.

Para além dos fragmentos podem ser produzidos análogos de hPAK65. Tais análogos podem incluir uma ou mais deleções ou adições da sequência de aminoácidos, no terminal amino ou no carboxilo, ou internamente, ou ambos; os análogos podem ainda incluir transposições da sequência. Os análogos podem também compreender substituições de aminoácidos, de preferência substituições conservativas. Adicionalmente, os análogos podem incluir sequências heterólogas geralmente ligadas ao terminal 38 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ amino ou carboxilo, em que a sequência ou sequências heterólogas conferem uma propriedade funcional ao análogo resultante que não é inerente a uma proteína hPAK65 nativa. No entanto, os análogos têm de compreender um segmento de 25 aminoácidos que tenha identidade substancial com uma porção da sequência de aminoácidos da proteína nativa. Substituições de aminoácidos preferidas são as que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formação de complexos hPAK65-proteína 21, (4) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos de hPAK65 com substratos proteicos para actividade de serina-quinase, e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência de hPAK65 diferente da sequência peptídica de ocorrência natural. Por exemplo, podem ser feitas substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (de preferência substituições de aminoácidos conservativas) na sequência de ocorrência natural (de preferência na porção do polipéptido fora do domínio ou domínios que formam contactos intramoleculares).

Uma substituição de aminoácidos conservativa não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência original (p. ex., uma substituição de aminoácidos não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na sequência original nem destruir outros tipos de estrutura secundária que caracterizem a sequência original). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptídicas reconhecidas na arte estão descritos em "Proteins, Structures and Molecular Principies", (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York; "Introduction to Protein Structure", (1991), C. Branden and J. Tooze, Garland Publishing, New York, NY; e Thornton et al., Nature 354: 105, 1991.

Pode ser vantajoso empregar um análogo peptídico de hPAK65, ou uma porção deste, como agente farmacêutico ou como reagente de investigação comercial. Por exemplo, pode ser utilizado um análogo peptídico de hPAK65 possuindo elevada afinidade para se ligar a uma proteína p21 como inibidor competitivo da formação de complexos hPAK65-proteína p21 39 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ através da competição com a hPAK65 nativa pela ligaçao a uma proteína p21.

Para além dos polipéptidos que consistem apenas em aminoácidos de ocorrência natural, são também proporcionados peptidomiméticos. Análogos de péptidos são vulgarmente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não peptidicos com propriedades análogas às do péptido molde. Estes tipos de compostos não peptidicos são designados "imitadores de péptidos" ou "peptidomiméticos" (Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber e Freidinger, TINS, pág. 392, 1985; e Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229, 1987) e são habitualmente desenvolvidos com a ajuda de modelação molecular computorizada. Os imitadores de péptidos que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido paradigma (i.e., um polipéptido que tenha uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica) , tal como PAK65 humano, mas tenha uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada de entre o grupo que consiste em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans) , -COCH2-, -CH (OH) CH2- e -CH2SO-, através de métodos conhecidos na arte e melhor descritos nas seguintes referências: Spatola, A.F. em "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", B. Weinstein, eds., Mareei Dekker, New York, pág. 267, 1983; Spatola, A.F., Vega Data (Março de 1983), Vol. 1,

Edição 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisão geral); Morley, J.S., Trends Pharm. Sei., 1980, págs. 463-468 (revisão geral); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185, 1979 (-CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A.F. et al., Life Sei. 38: 1243-1249, 1986 (-CH2-S); Hann, M.M., J. Chem. Soe.

Perkin. Trans. I, 307-314, 1982 (-CH-CH-, cis e trans); Almquist, R.G. et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-) ; Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett. 23: 2533, 1982 (-COCH2-) ; Szelke, M. et al., Pedido europeu EP45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2-) ; Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett. 24: 4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2-) ; e Hruby, V.J., Life Sei. 31: 189-199, 1982 (—CH2—S—). Uma ligação não peptídica particularmente preferida é -CH2NH-. Tais imitadores de péptidos podem ter vantagens 40 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ significativas em relação às concretizações polipeptídicas, incluindo, por exemplo: uma produção mais económica, maior estabilidade química, melhores propriedades farmacológicas (semivida, absorção, potência, eficácia, etc.), especificidade alterada (p. ex., um amplo espectro de actividades biológicas), reduzida antigenicidade e outras. A marcação dos peptidomiméticos envolve habitualmente a ligação covalente de um ou mais marcadores, directamente ou através de um espaçador (p. ex., um grupo amida), a uma ou mais posições não interferentes no peptidomimético que se prevejam através de dados quantitativos da estrutura-actividade e/ou modelação molecular. Tais posições não interferentes são geralmente posições que não formam contactos directos com a macromolécula ou macromoléculas (p. ex., não são pontos de contacto em complexos hPAK65-p21) às quais o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. A derivação (p. ex., marcação) de peptidomiméticos não deve interferir substancialmente com a actividade biológica ou farmacológica desejada do peptidomimético. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (p. ex., D-lisina em vez de L-lisina) pode ser utilizada para gerar péptidos mais estáveis. Adicionalmente, podem ser gerados péptidos constrangidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação substancialmente idêntica da sequência de consenso através de métodos conhecidos na arte (Rizo e Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992); por exemplo, através da adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfureto intramoleculares que tornem o péptido cíclico.

Sequências de ADNc de PAK65 humana são identificadas e podem ser isolados clones genómicos através da pesquisa de uma biblioteca de clones genómicos humanos, tal como uma biblioteca genómica humana em cromossomas artificiais de levedura, cosmídeos ou bacteriófago λ (p. ex., λ Charon 35), com uma sonda polinucleotídica compreendendo uma sequência de pelo menos cerca de 30 nucleótidos contíguos (ou o seu complemento) da sequência de ADNc da Figura 2A. Tipicamente, as condições de hibridação e de lavagem são de elevado rigor de acordo com procedimentos de hibridação convencionais. Os 41 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ clones positivos são isolados e sequenciados. Para ilustração e não para limitação, um polinucleótido inteiro correspondendo à sequência da Figura 2A pode ser marcado e utilizado como sonda de hibridação para isolar clones genómicos de uma biblioteca de clones genómicos humanos em ÀEMBL4 ou ÀGEMll (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); as condições de hibridação típicas para pesquisa de membranas de placas fágicas (Benton e Davis, Science 196: 180, 1978) podem ser: formamida a 50%, SSC ou SSPE 5x, solução de Denhardt l-5x, SDS a 0,1-1%, 100-200 pg de ADN heterólogo ou ARNt fragmentado, sulfato de dextrano 0-10%, lxlO5 a lxlO7 cpm/ml de sonda desnaturada com uma actividade específica de cerca de lxlO8 cpm/pg e incubação a 42°C durante cerca de 6-36 horas. As condições de pré-hibridação são essencialmente idênticas excepto que a sonda não está incluída e o tempo de incubação é tipicamente reduzido. As condições de lavagem são tipicamente SSC l-3x, SDS a 0,1-1%, 50-70°C com mudança da solução de lavagem a cerca de 5-30 minutos. Sequências humanas cognatas, incluindo sequências alélicas, podem ser obtidas deste modo. ADNc e clones genómicos não humanos (i.e., genes de PAK65 não humanos cognatos) podem ser vantajosamente isolados de várias bibliotecas de ADNc e de clones genómicos não humanas disponíveis na arte (p. ex., Clontech, Paio Alto, CA) através da utilização de sondas baseadas nas sequências mostradas na Figura 2A, com condições de hibridação e de lavagem tipicamente menos rigorosas que para o isolamento de clones humanos. Uma concretização preferida é um gene de PAK65 de ratinho.

Polinucleótidos compreendendo sequências de aproximadamente 30-50 nucleótidos, de preferência pelo menos 100 nucleótidos, correspondendo ou complementares à sequência nucleotídica mostrada na Figura 2A, podem servir como iniciadores de PCR (pelo menos 10 nucleótidos) e/ou sondas de hibridação para identificação e isolamento de genes da linha germinativa intimamente aparentados com hPAK65. Estes genes da linha germinativa podem ser humanos ou podem ser de outras espécies de mamíferos, de preferência primatas ou ratinhos. Tais genes da linha germinativa podem ser isolados através de vários métodos convencionais na arte, incluindo, mas não se limitando a pesquisa de hibridação de bibliotecas genómicas em 42 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ bacteriófago λ ou bibliotecas de cosmídeos ou através de amplificação por PCR de sequências genómicas utilizando iniciadores derivados das sequências mostradas na Figura 2A. Bibliotecas genómicas humanas estão publicamente disponíveis ou podem ser construídas de novo a partir de ADN humano.

Clones genómicos de PAK65, particularmente do gene PAK65 cognato de murídeo, podem ser utilizados para construir construções homólogas de direccionamento para criação de células e animais transgénicos não humanos possuindo pelo menos um alelo de PAK65 funcionalmente desfeito, de preferência homozigótico para os alelos de PAK65 suprimidos. Orientações para a construção de construções de direccionamento homólogas podem ser encontradas na arte, incluindo: Rahemtulla et ai., Nature 353: 180, 1991; Jasin et al., Genes Devei. 4: 157, 1990; Koh et al. , Science 256: 1210, 1992; Molina et al., Nature 357: 161, 1992; Grusby et al., Science 253: 1417, 1991; Bradley et al., Bio/Technology 10: 534, 1992). O direccionamento homólogo pode ser utilizado para gerar os designados ratinhos knockout, que são heterozigóticos ou homozigóticos para um alelo de PAK65 inactivado. Tais ratinhos podem ser vendidos comercialmente como animais de investigação para pesquisa de condições dependentes de PAK65, tais como integridade estrutural das células, neoplasia, proliferação celular, transdução de sinal, pesquisa de fármacos e outras utilizações.

Os ratinhos alvo quiméricos são derivados de acordo com Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988) e "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987). As células estaminais embrionárias são manipuladas de acordo com procedimentos publicados ("Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987); Zjilstra et al. Nature 342: 435, 1989; e Schwartzberg et al., Science 246: 799, 1989) .

Adicionalmente, pode ser utilizado um ADNc de PAK65 ou uma cópia do gene genómico para construir transgenes para expressar polipéptidos PAK65 a elevados níveis e/ou sob o 43 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ controlo da transcrição de sequências de controlo da transcrição que não ocorram naturalmente adjacentes ao gene de PAK65, tal como discutido acima. Por exemplo, mas não como limitação, um promotor constitutivo (p. ex., um promotor HSV-tk ou pgk) ou uma sequência reguladora da transcrição específica de uma linhagem celular (p. ex., o promotor/estimulador do gene de albumina, elastase ou CD4 ou CD8) pode ser operativamente ligado a uma sequência polinucleotídica codificando PAK65 para formar um transgene (tipicamente em combinação com um marcador seleccionável tal como uma cassete de expressão do gene neo) . Tais transgenes podem ser introduzidos em células (p. ex., células ES, células estaminais hematopoiéticas, hepatócitos primários cultivados) e podem ser obtidas células transgénicas e animais não humanos transgénicos de acordo com métodos convencionais. As células transgénicas e/ou os animais não humanos transgénicos podem ser utilizados para pesquisar agentes antineoplásicos e/ou pesquisar potenciais agentes moduladores da proliferação celular, uma vez que a sobre-expressão de PAK65 ou a expressão inapropriada de PAK65 podem resultar num estado hiperproliferativo ou num estado hipoproliferativo.

Os oligonucleótidos anti-sentido do presente invento podem ser sintetizados através dos métodos conhecidos de síntese química de oligonucleótidos. Tais métodos são geralmente descritos, por exemplo, em Winnacker, "From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology". VCH Verlagsgesellschaft mbH (H., Ibelgaufts trans. 1987). Qualquer um dos métodos de síntese de oligonucleótidos pode ser utilizado na preparação dos presentes oligonucleótidos anti-sentido. Os oligonucleótidos anti-sentido são muito vantajosamente preparados através da utilização de quaisquer sintetizadores de ácidos nucleicos automáticos comercialmente disponíveis. O dispositivo utilizado para preparar os oligonucleótidos aqui descritos, o Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer, utiliza química de β-cianoetil-fosforamidito. Oligonucleótidos anti-sentido hibridáveis com qualquer porção do transcrito de ARNm podem ser preparados através dos métodos de síntese de oligonucleótidos conhecidos dos peritos na arte. Embora possa ser utilizado qualquer comprimento de oligonucleótido na prática do presente invento, sequências menores que 12 bases podem ser menos específicas na hibridação 44 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ com ο ARNm de ΡΑΚ65 alvo e podem ser mais facilmente destruídas por digestão enzimática. Assim, são preferidos oligonucleótidos possuindo 12 ou mais nucleótidos. Sequências maiores que 18 a 21 nucleótidos podem ser de algum modo menos eficazes na inibição da tradução de PAK65 devido à diminuição da tomada pela célula alvo. Assim, na prática do presente invento são preferidos oligómeros de 12-21 nucleótidos, particularmente oligómeros de 12-18 nucleótidos. Oligonucleótidos complementares e hibridáveis com qualquer porção do transcrito de ARNm de PAK65 são, em principio, eficazes para inibição da tradução do transcrito e capazes de indução dos efeitos aqui descritos. A tradução é mais eficazmente inibida através do bloqueio do ARNm num local no codão de iniciação ou próximo. Assim, são preferidos oligonucleótidos complementares à região terminal 5' do transcrito de ARNm de PAK65. A estrutura secundária ou terciária que poderia interferir com a hibridação é mínima nesta região. Para além disso, sequências que estão demasiado distantes na direcção 3' do local de iniciação podem ser menos eficazes na hibridação dos transcritos de ARNm devido a um fenómeno de "leitura contínua" através do qual está postulado que o ribossoma abre o dúplex anti-sentido/com sentido para permitir a tradução da mensagem (ver, p. ex., Shakin, J. Biochemistry 261: 16018, 1986). O oligonucleótido anti-sentido é de preferência dirigido a um local no codão de iniciação ATG ou próximo deste para síntese proteica. Oligonucleótidos complementares a uma porção do ARNm de PAK65 incluindo o codão de iniciação são preferidos. Embora oligómeros anti-sentido complementares à região terminal 5' do transcrito de PAK65 sejam preferidos, particularmente a região incluindo o codão de iniciação, deve apreciar-se que os oligómeros anti-sentido úteis não estão limitados a esses complementares às sequências verificadas na porção traduzida do transcrito de ARNm, mas incluem também oligómeros complementares a sequências nucleotídicas contidas em, ou prolongando-se para as regiões não traduzidas a 5' e 3'. Os nucleótidos anti-sentido ou as construções de expressão anti-sentido podem ser utilizados para pesquisar quanto a agentes antineoplásicos e/ou pesquisar quanto a potenciais agentes moduladores da proliferação celular, uma vez que a expressão inapropriada de PAK65 podem resultar num estado num estado hiperproliferativo ou num estado hipoproliferativo. 45 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Tal como foi aqui determinado, existe uma proteína humana, referida como hPAK65, que é uma proteína de 65 kDa (determinado através de SDS-PAGE sob condições redutoras; o peso molecular baseado na sequência de aminoácidos deduzida é de 56,5 kDa) que interage de um modo dependente de GTP com racl e CDC42Hs mas não com rho A. O ARNm da PAK65 humana é expresso de modo ubíquo em tecidos humanos. A PAK65 recombinante exibe uma especificidade idêntica à da p65 endógena; ambas se podem ligar a racl e CDC42Hs de um modo dependente de GTP. As formas ligadas a GTP de racl e CDC42HS induzem autofosforilação de hPAK65 apenas em resíduos de serina. A hPAK65 activada através de racl ou CDC42Hs é fosforilada nos mesmos locais. A indução de autofosforilação de hPAK65 através de racl ou CDC42Hs estimula a actividade quinase de hPAK65 contra proteínas, p. ex. a proteína básica da mielina ("MBP"), e uma vez activada a hPAK65, racl ou CDC42Hs deixam de ser necessárias para a manter activa. As afinidades de racl e CDC42HS para a hPAK65 não fosforilada ou fosforilada eram semelhantes. A PAK65 humana tinha um efeito marginal na actividade de GTPase intrínseca de CDC42Hs e uma inibição mais significativa da actividade de GTPase estimulada por GAP pl90. Estes dados são consistentes com um modelo em que hPAK65 funciona como molécula efectora para racl e CDC42HS.

Deste modo, os ácidos nucleicos e polipéptidos hPAK65 do presente invento têm particular utilização ao proporcionarem uma nova actividade de proteína-quinase, efectuando ou modulando vias relacionadas com racl e CDC42Hs humanas, na identificação de vias e condições de doença relacionadas com hPAK65 e na identificação de agentes que efectuem ou modulem a actividade de hPAK65 e vias relacionadas. Tais agentes moduladores da proteína p21 podem proporcionar novos agentes quimioterapêuticos para tratamento de neoplasia, condições linfoproliferativas, artrite, angiogénese, inflamação, doenças auto-imunes, apoptose e semelhantes.

Os presentes inventores determinaram que certas proteínas p21 se ligam a hPAK65 para formar um complexo intermolecular de alta afinidade sob condições fisiológicas e que estes complexos são detectados através de numerosos ensaios 46 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ incluindo um "ensaio de sobreposição" modificado e ELISA. Os complexos proteína p21-hPAK65 são alvos para agentes capazes de modular certas vias dependentes da proteína p21 (de preferência racl e CDC42Hs) e dependentes de hPAK65, e particularmente são alvos para novos agentes antineoplásicos e imunomoduladores quimioterapêuticos ou quimiopreventivos. Por exemplo, podem ser desenvolvidos agentes que alterem as interacções racl:hPAK65 em células neoplásicas e/ou pré-neoplásicas como potenciais fármacos terapêuticos humanos. Podem ser identificados agentes antineoplásicos candidatos através da sua capacidade para inibirem a formação do complexo racl:hPAK65 in vitro e/ou in vivo e/ou inibir a função da proteína-quinase hPAK65 in vitro e/ou in vivo (p. ex., bloquear a capacidade de hPAK65 para fosforilar alvos celulares a jusante numa via dependente de hPAK65). Deste modo, são agora proporcionados pelo presente invento métodos de identificação de agentes antineoplásicos e imunomoduladores.

Os agentes antineoplásicos candidatos são então ainda testados quanto à actividade antineoplásica em ensaios que são rotineiramente utilizados para prever de modo adequado a utilização como fármacos antineoplásicos humanos. Exemplos destes ensaios incluem, mas não se limitam a: (1) capacidade do agente candidato para inibir a capacidade das células transformadas independentes de ancoramento para crescerem em ágar mole, (2) capacidade para reduzir a tumorigenicidade de células transformadas transplantadas para ratinhos nu/nu, (3) capacidade para inverter a transformação morfológica das células transformadas, (4) capacidade para reduzir o crescimento de tumores transplantados em ratinhos nu/nu, (5) capacidade para inibir a formação de tumores ou células pré-neoplásicas em modelos animais de carcinogénese espontânea ou induzida quimicamente, e (6) capacidade para induzir um fenótipo mais diferenciado em células transformadas às quais o agente é aplicado.

Uma vez que hPAK65 é abundante em neutrófilos, agentes que estimulem ou inibam a actividade de hPAK65 podem servir como agentes imunomoduladores, por exemplo, para atenuar uma reacção inflamatória, uma reacção de enxerto versus hospedeiro 47 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ ou uma condição auto-imune, doenças neurodegenerativas, neoplasia e semelhantes.

Uma categoria de ensaio onde podem ser identificados agentes moduladores de hPAK65 (p. ex., agentes antineoplásicos candidatos) é um ensaio de inibição da ligação, em que os agentes são avaliados individualmente (ou em bancos) quanto à sua capacidade para inibirem a formação de um complexo de ligação compreendendo um polipéptido da proteína p21 (de preferência racl ou CDC42Hs) ligado a um polipéptido hPAK65 sob condições de ligação aquosas em que a ligação proteína p21:hPAK65 ocorre na ausência do agente (ver Exemplos). Os agentes moduladores de hPAK65 (p. ex., agentes antineoplásicos candidatos) podem ser identificados através da pesquisa de agentes que interfiram com a formação ou a actividade de complexos proteína p21:hPAK65 funcionais. Os agentes que inibam a ligação de polipéptidos racl a polipéptidos hPAK65 são identificados com agentes moduladores de hPAK65 (p. ex., agentes antineoplásicos candidatos).

Os ensaios de pesquisa do presente invento podem utilizar formas isoladas ou purificadas dos componentes do ensaio (polipéptidos hPAK65 e polipéptidos da proteína p21, de preferência racl e CDC42Hs). Isto refere-se a polipéptidos do presente invento que tenham sido separados do seu ambiente natural (p. ex., uma fracção citoplasmática ou nuclear de uma célula) ou através de produção recombinante, até pelo menos cerca de 10-50% de pureza. Uma composição substancialmente pura inclui tal polipéptido ou polipéptidos ou complexos que se aproximam da homogeneidade, i.e., cerca de 80-90% puros, de preferência 95-99% puros e de maior preferência de 99% puros. Concretizações preferidas incluem ensaios de ligação que utilizam racl ou CDC42Hs em combinação com polipéptidos hPAK65 que são produzidos através de métodos recombinantes ou são sintetizados quimicamente.

Concretizações preferidas adicionais compreendem análogos da proteína p21 ou de hPAK65 que tenham estabilidades superiores como reagentes experimentais. Por exemplo, os análogos preferidos podem ser resistentes à degradação por actividades proteolíticas presentes na reacção ou reacções de ligação e/ou podem ser resistentes a inactivação oxidativa. 48 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Tais análogos podem incluir substituições de aminoácidos que removam locais de clivagem proteolítica e/ou substituir resíduos responsáveis por inactivação oxidativa (p. ex., metionina, cisteína). No entanto, os análogos têm de ser funcionais pelo menos no ensaio ou ensaios de ligação de controlo; por essa razão, análogos compreendendo substituições de aminoácidos que destruam ou degradem significativamente a utilidade funcional do análogo no ensaio de ligação não são empregues para tais ensaios. Um polipéptido hPAK65 de ligação à proteína p21 preferido contém os aminoácidos 49 a 113 de hPAK65, com uma forma mais preferida como proteína de fusão GST-PAKette. Um polipéptido preferido para ensaios de inibição de quinase é a hPAK65 constitutivamente activa. Polipéptidos preferidos desta são truncagens sem o domínio regulador que inibe a actividade quinase ou são substituições de serina 380, serina 383 e/ou treonina 384 por ácido glutâmico ou aspártico. Os análogos da proteína p21 preferidos têm ligada uma porção marcadora de identificação, de preferência um marcador epitópico reconhecível por um anticorpo. Os marcadores preferidos são o epítopo Myc e os marcadores peptídicos Glu-Glu tal como proporcionado nos Exemplos. São também preferidas hPAK65 possuindo mutações C-terminais em que os aminoácidos 489-491 (i.e., Ser-Ser-Leu) são substituídos de modo não conservativo ou são removidos. Uma concretização de uma hPAK65 constitutivamente activa deste tipo possui uma deleção dos aminoácidos 482 a 506. Uma concretização preferida possui tanto a rhPAK65 marcada com epítopo myc como a deleção 482-506 anteriormente discutidas.

Estes métodos de pesquisa podem envolver a marcação de uma proteína p21 ou de um polipéptido hPAK65 com qualquer um de uma miríade de marcadores adequados, incluindo radiomarcadores (p. ex., 125I ou 32P) , vários marcadores fluorescentes e enzimas, (p. ex., glutationa-S-transferase, luciferase e β-galactosidase). Se desejado para ensaios de ligação básicos, o polipéptido alvo pode ser imobilizado através de técnicas padrão. Por exemplo, mas não como limitação, tal imobilização pode ser efectuada através de ligação a um suporte sólido, tal como uma matriz cromatográfica, um poço de uma placa de microtítulo ou através de ligação a uma superfície com carga, tal como uma membrana Nylon 66. 49 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Os ensaios de ligação tomam geralmente uma de duas formas: um ou mais polipéptidos hPAK65 imobilizados podem ser utilizados para ligar um ou mais polipéptidos da proteína p21 ou, inversamente, um ou mais polipéptidos da proteína p21 imobilizados podem ser utilizados para ligar polipéptidos hPAK65 marcados. Em cada caso, o polipéptido marcado é posto em contacto com o polipéptido imobilizado sob condições aquosas que permitam a ligação específica do polipéptido ou polipéptidos para formar um complexo na ausência do agente adicionado. Podem ser seleccionadas pelo praticante determinadas condições aquosas de acordo com métodos convencionais. Para orientações gerais, podem ser utilizadas as seguintes condições aquosas tamponadas: NaCl 10-250 mM, Tris HC1 5-50 mM, pH 5-8, com adição opcional de um catião ou mais bivalentes e/ou quelantes metálicos e/ou detergentes não iónicos e/ou fracções de membrana. É apreciado pelos peritos na arte que podem ser feitas adições, deleções, modificações (tais como pH) e substituições (tais como a substituição de NaCl por KC1 ou a substituição do tampão) a estas condições básicas. Podem ser feitas modificações às condições básicas da reacção de ligação desde que ocorra ligação específica do polipéptido ou polipéptidos da proteína p21 aos polipéptidos hPAK65 na reacção ou reacções de controlo. As condições que não permitam ligação específica em reacções de controlo (sem agente incluído) não são adequadas para utilizar em ensaios de ligação. Tal como aqui determinado a rho A humana não se liga nem activa hPAK65.

De preferência, pelo menos uma espécie polipeptídica é marcada com um marcador detectável. Marcação adequada inclui, mas não se limita a, radiomarcação através de incorporação de um aminoácido radiomarcado (p. ex., leucina marcada com 14C, glicina marcada com 3H, metionina marcada com 35S), radiomarcação através de radioiodação pós-tradução com 125I ou 131I (p. ex., reacção de Bolton-Hunter e cloramina T), marcação através de fosforilação pós-tradução com 32P (p. ex., fosforilase e fosfato inorgânico radiomarcado), marcação fluorescente através de incorporação de um marcador fluorescente (p. ex., fluoresceína ou rodamina) ou marcação através de outros métodos convencionais conhecidos na arte. Em concretizações em que uma das espécies polipeptídicas é 50 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ imobilizada através de ligação a um substrato, o outro polipéptido é geralmente marcado com um marcador detectável. Um formato preferido de um ensaio ELISA, no qual um marcador preferido é um epítopo peptídico que é especificamente reconhecido por um anticorpo e que é ligado a uma das proteínas, por exemplo através de conjugação química ou enzimática ou de preferência através de métodos de ADN recombinante que produzam uma proteína de fusão. GTPyS radiomarcado que se liga a, mas não é hidrolisado por, GTPases da proteína p21 pode também ser utilizado para marcar um polipéptido da proteína p21 num ensaio de ligação proteína p21-hPAK65.

Adicionalmente, nalgumas concretizações uma proteína p21 ou um polipéptido hPAK65 pode ser utilizado em combinação com uma proteína acessória (p. ex., uma proteína que forme uma complexo com o polipéptido, de preferência in vivo). E preferível que sejam utilizados diferentes marcadores para cada espécie polipept ídica, de modo a que possa ser distinguida a ligação de complexos individuais e/ou heterodiméricos e/ou multiméricos. Por exemplo, um polipéptido CDC42Hs pode ser marcado com fluoresceína e um polipéptido acessório, p. ex., pl90, pode ser marcado com um marcador fluorescente que fluoresça com um comprimento de onda de excitação ou comprimento de onda de emissão diferente ou ambos. Alternativamente, pode ser utilizada contagem de cintilações de dois marcadores, em que um polipéptido é marcado com um isótopo (p. ex., 3H) e uma segunda espécie polipeptídica é marcada com um isótopo diferente (p. ex., 14C) que pode ser distinguido através de contagem de cintilações utilizando técnicas de discriminação. O polipéptido ou polipéptidos marcados são postos em contacto com o polipéptido ou polipéptidos imobilizados sob condições aquosas tal como aqui descrito. O tempo e a temperatura de incubação de uma reacção de ligação podem ser variados, desde que as condições seleccionadas permitam que ocorra ligação específica numa reacção de controlo em que não está presente qualquer agente. Concretizações preferidas empregam uma temperatura de reacção de cerca de pelo menos 15°C, de preferência 35 a 42°C, e um tempo de incubação de aproximadamente pelo menos 15 segundos, embora sejam 51 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ preferíveis períodos de incubação maiores de modo a que, nalgumas concretizações, seja alcançado um equilíbrio de ligação. A cinética de ligação e a estabilidade termodinâmica dos complexos proteína p21:hPAK65 ligados, de preferência racl:hPAK65 e CDC42Hs:hPAK65 ou onde hPAK65 é substituída por GST-PAKette, determinam a latitude disponível para variar o tempo, a temperatura, o sal, o pH e outras condições reaccionais. No entanto, para qualquer concretização particular, podem ser facilmente calibradas condições da reacção de ligação desejadas pelo executante utilizando método convencionais na arte, que podem incluir análise de ligação utilizando análise de Scatchard, análise de Hill e outros métodos ("Proteins, Structures and Molecular Principies", (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York). A ligação específica da proteína p21 ou do polipéptido hPAK65 marcado (p. ex., marcado com um péptido) ao polipéptido hPAK65 ou à proteína p21 imobilizada, respectivamente, é determinada através da inclusão de uma ou mais proteínas competidoras não marcadas (p. ex., albumina). Após a reacção de ligação ficar completa, é detectado o polipéptido ou polipéptidos marcados que se ligam especificamente ao polipéptido imobilizado. Por exemplo, após um período de incubação adequado para ligação, a fase aquosa contendo proteína não imobilizada é removida e o substrato contendo a espécie polipeptídica imobilizada e qualquer proteína marcada ligada a ela é lavado com um tampão adequado, opcionalmente contendo um ou mais agentes de bloqueio não marcados e é removido o tampão ou tampões de lavagem. Após lavagem, é determinada a quantidade de marcador detectável que permanece especificamente ligado ao polipéptido imobilizado (p. ex., através de métodos ópticos, enzimáticos, imunológicos, autorradiográficos ou outros radioquímicos, ou combinações destes). Num formato preferido, o marcador é um epítopo (etiqueta) detectável por um anticorpo, em que o anticorpo anti-marcador pode então ser detectado através de métodos conhecidos na arte, p. ex., através da medição da actividade enzimática de uma fosfatase alcalina conjugada com o anticorpo.

Nalgumas concretizações, está incluída a adição de agentes de bloqueio não marcados que inibem a ligação não 52 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ específica. Exemplos de tais agentes de bloqueio incluem, mas não se limitam aos seguintes: ADN de timo de vitelo, ADN de esperma de salmão, ARN de levedura, oligonucleótidos de sequência mista (sequência aleatória ou pseudo-aleatória) com vários comprimentos, albumina de soro bovino, detergentes não iónicos (NP-40, Tween, Triton X-100, etc.), proteínas de leite em pó magro, reagente de Denhardt, polivinilpirrolidona, Ficoll e outros agentes de bloqueio. Os executantes podem, à sua discrição, seleccionar agentes de bloqueio a concentrações adequadas para serem incluídos em ensaios de ligação; no entanto, as condições reaccionais são seleccionadas de modo a permitirem ligação específica entre um polipéptido hPAK65 e um polipéptido da proteína p21 numa reacção de ligação de controlo. Os agentes de bloqueio são incluídos para inibirem ligação não específica da proteína marcada à proteína imobilizada e/ou para inibirem ligação não especifica do polipéptido marcado ao substrato de imobilização.

Em concretizações em que um polipéptido é imobilizado, pode ser utilizada ligação covalente ou não covalente a um substrato. As químicas de ligação covalente incluem, mas não se limitam a, métodos bem caracterizados conhecidos na arte (Kadonaga e Tijan, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 83: 5889, 1986). Um exemplo, não para limitação, é a ligação covalente a um substrato derivado de brometo de cianogénio (tal como Sepharose 4B derivada com CNBr). Pode ser desejável utilizar um espaçador para reduzir o potencial impedimento espacial do substrato. A ligação não covalente de proteínas a um substrato inclui, mas não se limita a, ligação da proteína a uma superfície com carga e ligação com anticorpos específicos.

Numa classe de concretizações, são conduzidas reacções de ligação paralelas, em que um conjunto de reacções serve de controlo e pelo menos um outro conjunto de reacções inclui várias quantidades de agentes, misturas de agentes ou extractos biológicos que estão a ser testados quanto à capacidade para inibirem a ligação de um polipéptido da proteína p21 a um polipéptido hPAK65. Os agentes que inibem a ligação relativamente à reacção ou reacções de controlo são desse modo identificados como agentes moduladores de hPAK65 e/ou agentes antineoplásicos candidatos e/ou agentes imunomoduladores candidatos. 53 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Numa variação, a actividade de GTPase e/ou actividade da proteína p21 de ligação a GDP ou GTP, de preferência racl ou CDC42Hs, é medida como o ensaio final. A capacidade do polipéptido hPAK65 para modular uma ou mais destas actividades do nucleótido guanina da proteína p21 serve como base para o ensaio de pesquisa (ver Exemplo 1- ensaio de sobreposição modificado; ver Exemplo 12). Os compostos de teste que modulam a actividade de hPAK65 para modular as actividades do nucleótido guanina da proteína p21 são deste modo identificados como moduladores da proteína hPAK65 e moduladores da proteína p21.

Leveduras compreendendo (1) uma cassete de expressão codificando um domínio de ligação ao ADN de GAL4 (ou domínio activador de GAL4) fundido com um fragmento de ligação de hPAK65 capaz de se ligar a um polipéptido racl, (2) uma cassete de expressão codificando um domínio activador do ADN de GAL4 (ou domínio de ligação a GAL4, respectivamente) fundido com um fragmento de ligação de racl (ou CDC42Hs) capaz de se ligar a um polipéptido hPAK65, e (3) um gene repórter (p. ex., β-galactosidase) compreendendo um elemento de resposta de transcrição GAL4 ligado em cis podem ser utilizadas para pesquisa de agentes num ensaio de pesquisa de dois híbridos. Tais leveduras são incubadas com um agente de teste e é determinada a expressão do gene repórter (p. ex., β-galactosidase) ; a capacidade do agente para inibir a expressão do gene repórter em comparação com uma cultura de controlo identifica o agente como agente de modulação de hPAK65 candidato ou agente de modulação da proteína p21.

Os polipéptidos hPAK65 e racl ou CDC42Hs, especialmente as porções que formam contactos directos em complexos, podem ser utilizados para o desenho racional de fármacos de agentes moduladores candidatos (p. ex., antineoplásicos e imunomoduladores). Os complexos substancialmente purificados e a identificação de racl ou CDC42Hs como parceiro de ligação para hPAK65 tal como aqui proporcionado permite a produção de complexos polipeptídicos substancialmente puros e modelos computacionais que podem ser utilizados para cristalografia de raios X de proteínas ou outros métodos de análise estrutural, tais como o programa DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol. 161: 54 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 269, 1982; Kuntz, I.D., Science 257: 1078, 1992) e variantes destes. Potenciais fármacos terapêuticos podem ser racionalmente desenhados com base na informação estrutural assim proporcionada. Numa concretização, tais fármacos são desenhados para impedir a formação de um complexo proteico.

Assim, o presente invento pode ser utilizado para desenhar fármacos, incluindo fármacos com uma capacidade para inibir a ligação de proteínas p21, de preferência racl ou CDC42Hs, a hPAK65. Utilizando os métodos tal como aqui ensinados outras proteínas p21 são facilmente testadas quanto à sua capacidade para se ligarem e activarem hPAK65. O desenho de compostos que interagem preferencialmente com um polipéptido hPAK65 ou complexo hPAK65rproteína p21 podem ser desenvolvidos utilizando análise de computador de estruturas tridimensionais. Um conjunto de coordenadas moleculares pode ser determinado utilizando: (1) dados de cristalografia, (2) dados obtidos através de outros métodos físicos, (3) dados gerados através de programas de predição de estrutura computorizados operando nos dados da sequência de aminoácidos deduzida, ou, de preferência, uma combinação destes dados. Exemplos de métodos físicos que podem ser utilizados para definir a estrutura são, por exemplo, a espectroscopia correlacionada homonuclear bidimensional (COSY) . Para os peritos na arte de espectroscopia de RMN unidimensional, COSY proporciona o tipo de informação disponível a partir de uma experiência de desacoplamento de frequência simples (p. ex., cujos spins são escalares acoplados um ao outro) . Num gráfico de COSY, o espectro 1D reside ao longo da diagonal e os elementos fora da diagonal estão presentes na intersecção das transições químicas dos grupos que acoplados em J. A região de "impressão digital" contém picos cruzados (1HN, 1H0Í) da estrutura peptídica. O grau de resolução da região de "impressão digital" do mapa de COSY obtido em H20 é um bom preditor do sucesso das atribuições específicas de sequência a obter sem recurso a marcação isotópica. Os espectros do efeito nuclear de Overhauser transferido (TRNOE) (1H RMN) baseiam-se em diferentes espectros 2D NOE, e, na essência, observam a conformação do ligando logo após este se ter dissociado da proteína. A utilização de TRNOE presume, no entanto, que os ligandos 55 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ ligados e livres estão em rápida mudança na escala de tempo da transição química, o que se traduz numa KD do ligando superior ou igual a cerca de lxlCT4 M. Os métodos de TRNOE são úteis para verificar novamente e aumentar a informação da distância obtida através de outras abordagens. Não se pretende que o presente invento seja limitado pelo método particular utilizado para obter informação estrutural. Para além disso, não se pretende que o presente invento seja limitado a uma pesquisa de qualquer um dos tipos de fármacos; uma ou mais moléculas podem ser de ocorrência natural ou podem ser sintéticas ou podem ser uma forma quimicamente modificada de uma molécula de ocorrência natural.

Nalgumas concretizações, é desejável comparar a estrutura da proteína hPAK65 com a estrutura de outras proteínas. Isto ajudará na identificação e selecção de fármacos que afectem selectivamente hPAK65 ou tenham um efeito de amplo espectro em mais de uma espécie de polipéptidos aparentados (p. ex., outras proteínas relacionadas com racl). Numa concretização do presente invento é proporcionado um ensaio para determinação da actividade de proteína-quinase de hPAK65.

Noutra concretização do presente invento é proporcionado um ensaio de inibição da quinase hPAK65, que pode ser utilizado para pesquisa de bibliotecas de fármacos ou agentes quanto à sua capacidade para inibirem uma actividade quinase de hPAK65. Numa concretização deste invento é proporcionado um método para identificação de agentes que inibam a actividade quinase de hPAK65, método esse que compreende a administração de um agente a uma mistura reaccional contendo hPAK65 substancialmente purificada, de preferência hPAK65 activada, um substrato substancialmente purificado, p. ex., MBP, e Y_33P_Atp, e depois a determinação da extensão em que o agente inibe a fosforilação do substrato em comparação com uma reacção de controlo sem o agente.

Deste modo, é também proporcionado um estojo de ensaio para identificação de agentes que inibam a actividade quinase de hPAK65 em que os estojos contêm polipéptido substancialmente purificado contendo hPAK65 ou de maior preferência hPAK65 constitutivamente activado ou um fragmento 56 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ deste com actividade constitutiva. O hPAK65 activado pode ser proporcionado em numerosas formas incluindo como forma autofosforilada, como um análogo possuindo pelo menos uma serina alvo de autofosforilação substituída por um aminoácido que imite fosfosserina, p. ex., Glu ou Asp (Huang e Erikson, Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 8960-8963, 1994), e como uma forma truncada no terminal N em que o domínio regulador de hPAK65 responsável pela inibição da actividade de serina-quinase é suprimido. O estojo de ensaio pode ainda conter um substrato substancialmente purificado, tal como MBP, e pode ainda conter uma solução aquosa tamponada e γ-33Ρ-ΑΤΡ. Formas análogas constitutivamente activadas de hPAK65 com a serina substituída preferidas são aquelas em que uma ou ambas as serinas na posição de aminoácido 381 ou 383 são substituídas por ácido glutâmico ou aspártico. A treonina na posição 384 pode ser opcionalmente substituída por ácido glutâmico ou aspártico. São também preferidos hPAK65 possuindo mutações C-terminais em que os aminoácidos 489-491 (i.e., Ser-Ser-Leu) são modificados ou removidos. Uma concretização deste tipo tem uma deleção dos aminoácidos 482 a 506. Uma concretização preferida tem tanto o marcador epitópico Myc previamente discutido como a deleção 482-506.

Numa concretização do presente invento é proporcionado um método para inibição de uma quinase hPAK65 que inclui os passos de colocação de uma composição contendo uma quinase hPAK65 em contacto com um agente possuindo a capacidade para inibir a actividade quinase de hPAK65 tal como determinado num ensaio de inibição de quinase de hPAK65 aqui descrito. De preferência a composição compreende um fluido corporal de um mamífero, de maior preferência o fluido corporal é sangue ou uma fraeção do sangue. De preferência PAK65 é uma PAK65 humana. O método pode ainda incluir os passos de medição da actividade quinase de hPAK65 no referido fluido corporal na presença e ausência do referido inibidor e relacionamento da referida actividade quinase com a concentração da quinase hPAK65 ou do substrato para a quinase hPAK65 na referida composição. O contacto pode ocorrer in vivo. É aqui descrita uma composição farmacêutica para o controlo de doenças dependentes da quinase PAK65 em mamíferos que inclui um agente possuindo a capacidade para inibir a 57 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ actividade quinase de ΡΑΚ65 tal como determinado um ensaio de actividade quinase de PAK65 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Adicionalmente, é descrito um método de controlo de uma doença dependente da quinase PAK65, que inclui os passos de administração a um mamífero sofrendo de uma doença dependente da quinase PAK65 de uma quantidade que controle a doença dependente da quinase PAK65 de um agente possuindo a capacidade de inibir a actividade quinase de PAK65 tal como determinada num ensaio de actividade de inibição de quinase de PAK65. É também proporcionado um método para identificação de compostos que inibam a actividade de ligação de PAK65 a p21. O método inclui os passos de administração de um composto numa mistura com uma proteína p21 substancialmente purificada a uma mistura reaccional compreendendo PAK65 substancialmente purificada, e determinação da extensão à qual o agente inibe a ligação em comparação com uma reacção de controlo sem o composto.

Noutra concretização do presente invento é proporcionado um método para inibição de uma actividade de ligação de hPAK65 a p21, que inclui os passos de contacto de uma composição contendo uma hPAK65 com um agente possuindo a capacidade para inibir a actividade de ligação de hPAK65 a p21 tal como determinado num ensaio de inibição da ligação de hPAK65 a p21.

Deste modo, é também proporcionado um estojo de ensaio para identificação de agentes que inibam ou modulem a actividade de ligação de hPAK65 a p21 que inclui hPAK65 substancialmente purificada. O estojo de ensaio pode opcionalmente conter uma proteína p21 substancialmente purificada, de preferência racl ou CDC42Hs, uma solução aquosa tamponada, GTPyS, ou um anticorpo para o marcador epitópico Glu-Glu ligado ao terminal N de racl ou CDC42Hs. GTPyS é uma forma de GTP que não pode ser hidrolisada em GDP através de GTPases p21. É proporcionado um método para identificação de agentes que inibam ou modulem a libertação de fosfato a partir de 58 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ proteínas ρ21 ligadas a hPAK65. Ο método inclui os passos de contacto de uma proteína p21 substancialmente purificada com uma mistura reaccional contendo hPAK65 substancialmente purificada para formar um complexo proteína p21-PAK65, pondo depois o complexo em contacto com o agente de teste e determinando depois a extensão à gual o agente inibe a libertação de fosfato em comparação com uma reacção de controlo sem o agente. A hPAK65 pode ser ligada a um suporte sólido ou pode estar livre em solução.

Noutra concretização do presente invento é proporcionado um método para inibição ou modulação da libertação de fosfato a partir da proteína p21 ligada a hPAK65, que inclui os passos de contacto de uma composição contendo uma proteína p21 ligada a hPAK65 com um agente possuindo a capacidade para inibir ou modular a libertação de fosfato a partir da proteína p21 ligada a hPAK65 tal como determinado num ensaio de libertação de fosfato.

Deste modo, é também proporcionado um estojo de ensaio para identificação de agentes que inibam ou modulem tal libertação de fosfato. O estojo inclui hPAK65 substancialmente purificada. O estojo de ensaio pode opcionalmente conter proteína p21 substancialmente purificada, de preferência racl ou CDC42Hs, uma solução aquosa tamponada e ΘΤΡγΡ32. O presente invento proporciona agora pela primeira vez a capacidade de identificar substratos celulares para a actividade quinase de hPAK65 que estejam envolvidos em vias relacionadas com hPAK65. A utilização apropriada das concretizações da proteína e do ácido nucleico de hPAK65 proporcionadas por este invento, de preferência com os tecidos ou linhas celulares fonte aqui indicados como expressando hPAK65 e particularmente hPAK65 constitutivamente activada, permitirão a identificação das macromoléculas celulares que são fosforiladas quando é activada a actividade de serina-quinase de hPAK65.

Os agentes identificados através das várias concretizações deste invento são todos facilmente adaptados à utilização terapêutica como inibidores da quinase hPAK65 (ou como inibidores da ligação hPAK65-racl/CDC42Hs e/ou da 59 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ autofosforilação) para o controlo de doenças dependentes da quinase PAK65 em mamíferos. Doenças dependentes da quinase PAK65 podem incluir distúrbios hiperproliferativos que são iniciados/mantidos por actividade aberrante da enzima serina-quinase PAK65. Exemplos incluem cancro, aterosclerose e anti-angiogénese (p. ex., crescimento tumoral, retinopatia diabética) . É compreendido na arte que os agentes de inibição de quinase terapeuticamente úteis devem ser de preferência selectivos. Os inibidores da quinase PAK65 que inibem muitas outras proteína-quinases em resultado da sua falta de especificidade são altamente citotóxicos. Por essa razão, ensaios de rotina que medem a citotoxidade podem ser utilizados para identificar inibidores de PAK65 que é provável que produzam efeitos secundários indesejados devido a uma falta de selectividade. Como um teste de selectividade mais detalhado, os compostos devem ser testados quanto à sua capacidade para inibirem a actividade enzimática de uma variedade de outras proteína-quinases, p. ex., classes de proteína-quinases identificadas com base no aminoácido ou aminoácidos que servem como seu substrato: quinases que fosforilam tirosina, quinases que fosforilam tirosina e treonina e quinases que fosforilam serina e treonina. Exemplos de quinases que fosforilam serina e treonina incluem RAF, proteína-quinase A, proteína-quinase C e receptor de TGF-beta. A quinase MEK é um exemplo de quinases que fosforilam tirosina e treonina.

Na seguinte discussão de utilizações de inibidores de quinases, a discussão foca-se na proteína-quinase hPAK65, no entanto, deve entender-se que qualquer discussão aqui sobre a utilização de um composto como inibidor da quinase hPAK65 é geralmente aplicável à utilização de um agente que seja específico para uma das outras actividades de hPAK65. Se um agente é ou não específico para a actividade quinase de hPAK65 é facilmente determinado através da utilização dos ensaios de actividade quinase expostos nos exemplos.

Para que compostos que inibam (ou modulem) a actividade quinase de hPAK65 ou uma das suas outras actividades sejam terapeuticamente úteis, devem ser activos em células intactas. Estão prontamente disponíveis vários métodos para determinação da actividade de inibidores (ou moduladores) de hPAK65 60 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ candidatos contra hPAK65 em células intactas. A fosforilação dos substratos celulares de hPAK65 pode ser medida utilizando anticorpos anti-fosfosserina ou impressões digitais de fosfopéptidos. Podem também ser medidos acontecimentos de sinalização intracelulares adicionais incluindo fluxo de cálcio, metabolismo do inositol-fosfato, proliferação celular e síntese de ADN celular, ou qualquer outro processo fisiológico relacionado com vias dependentes de hPAK65. De preferência, uma linha celular geneticamente modificada para expressar hPAK65 constitutivamente activa pode conduzir a uma linha celular transformada sobre a qual podem ser testados inibidores da actividade quinase de hPAK65 candidatos quanto à capacidade para diminuir a actividade quinase de hPAK65, diminuir a fosforilação global numa célula ou reverter a célula para um estado menos transformado.

Os agentes candidatos que inibam ou modulem a ligação da proteína p21 a hPAK65 podem ainda ser testados contra uma linha celular transformada por uma racl recombinante que tenha sido alterada numa forma constitutivamente activa. As células transformadas com racl têm as características de células neoplásicas, p. ex., de formação de loci e tumores em ratinhos, e podem ser analisadas quanto a reversão para um estado mais normal na presença de agentes candidatos que inibam a activação de racl de hPAK65. É provável que a solubilidade dos agentes do presente invento tanto em água como em solventes suavemente hidrófobos aumente a probabilidade de atravessarem a membrana celular.

Os compostos deste invento podem ser úteis na forma do ácido livre, na forma de um sal e como um hidrato. Todas as formas estão dentro do âmbito do presente invento. Podem ser formados sais básicos e são simplesmente uma forma mais conveniente para utilização; na prática, a utilização da forma de sal contribui inerentemente para a utilização da forma ácida. As bases que podem ser utilizadas para preparar os sais incluem, de preferência, as que produzem, quando combinadas com o ácido livre, sais farmaceuticamente aceitáveis, isto é, sais cujos aniões sejam não tóxicos para o organismo do animal em doses farmacêuticas dos sais, de modo a que as propriedades benéficas inerentes no ácido livre não sejam corrompidas por 61 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ efeitos secundários imputáveis aos catiões. Embora sejam preferidos sais farmaceuticamente aceitáveis do composto ácido, todos os sais são úteis como fontes da forma de ácido livre mesmo que seja desejado o sal particular per se apenas como produto intermediário tal como, por exemplo, quando o sal é formado apenas para fins de purificação e identificação ou quando é utilizado como intermediário na preparação de um sal farmaceuticamente aceitável através de procedimentos de permuta iónica.

Agentes dentro do âmbito deste invento que tenham actividade como inibidores ou moduladores específicos de hPAK65 possuem valor terapêutico como agentes anti-proliferativos celulares para o tratamento de certas condições incluindo, por exemplo, neoplasia, inflamação, condições linfoproliferativas, artrite, doenças auto-imunes, apoptose e semelhantes.

Os compostos do presente invento podem ser administrados a um hospedeiro mamífero numa variedade de formas, i.e., podem ser combinados com vários transportadores inertes farmaceuticamente aceitáveis na forma de comprimidos, cápsulas, pastilhas, trociscos, rebuçados, pós, sprays, elixires, xaropes, soluções injectáveis ou em gotas nos olhos e semelhantes dependendo da via de administração escolhida, p. ex., oralmente ou parentericamente. A administração parentérica inclui neste respeito a administração através das seguintes vias: intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-ocular, intra-sinovial, trans-epitelial (incluindo transdérmica, oftálmica, sublingual e bucal), tópica (incluindo oftálmica, dérmica, ocular, rectal, inalação nasal através de insuflação e aerossol) e sistémica rectal. xaropes O composto activo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um transportador edível assimilável, ou pode ser encerrado em cápsulas de gelatina duras ou moles, ou pode ser comprimido em comprimidos, ou pode ser incorporado directamente com o alimento da dieta. Para administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipiente e utilizado na forma de comprimidos, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e semelhantes 62 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ comestíveis. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% de composto activo. A percentagem das composições e preparações pode, como é claro, ser variada e pode estar convenientemente entre cerca de 2 a cerca de 6% do peso da unidade. A quantidade de composto activo em tais composições terapeut icamente úteis é tal de modo a que seja obtida uma dosagem adequada. As composições ou preparações preferidas de acordo com o presente invento são preparadas de modo a que uma forma de dosagem oral unitária contenha entre cerca de 1 e 1000 mg de composto activo.

Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes podem também conter o seguinte: um ligante tal como polivinilpirrolidona, goma adragante, goma-arábica, sacarose, amido de milho ou gelatina; um excipiente tal como fosfato de cálcio, citrato de sódio e carbonato de cálcio; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, amido de tapioca, certos silicatos complexos, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como laurilsulfato de sódio, talco e estearato de magnésio; um agente adoçante tal como sacarose, lactose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, óleo de Gaultheria ou aroma de cereja. Composições sólidas de um tipo semelhante são também empregues como enchimentos em cápsulas de gelatina moles e duras; materiais preferidos para isto incluem também lactose ou açúcar do leite bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, para além dos materiais do tipo de cima, um transportador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar de outro modo a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto activo, sacarose como agente adoçante, metilo e propilparabenos como conservantes, um corante, aromatizantes tais como aroma de cereja ou laranja, agentes de emulsão e/ou agentes de suspensão bem como diluentes tais como água, etanol, propilenoglicol, glicerina e várias combinações destes. Claro que qualquer material utilizado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. 63 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Adicionalmente, ο composto activo pode ser incorporado em preparações e formulações de libertação sustida. O composto activo pode também ser administrado parentericamente ou intraperitonealmente. Para fins de administração parentérica, podem ser empregues soluções em óleo de sésamo ou de amendoim ou em propilenoglicol aquoso, bem como soluções aquosas estéreis dos correspondentes sais solúveis em água, de metais álcali ou de metais de terra alcalina anteriormente enumerados. Tais soluções aquosas deverão ser adequadamente tamponadas, se necessário, e o diluente líquido tornado primeiro isotónico com suficiente solução salina ou glicose. As soluções do composto activo como base livre ou sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água misturadas de modo adequado com um tensioactivo tal como hidroxipropilcelulose. Uma dispersão pode também ser preparada em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas destes e em óleos. Sob condições vulgares de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para fins de injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, os meios aquosos estéreis empregues são todos facilmente obteníveis através de técnicas padrão bem conhecidas dos peritos na arte.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Em todos os casos a forma tem de ser estéril e tem de ser fluida até ao ponto em que exista capacidade de passar numa seringa. Tem de ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e tem de ser conservada contra a acção contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e semelhantes), misturas adequadas destes e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de uma dispersão e através da utilização de ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 6 4 tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser alcançada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo: açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser alcançada através da utilização de agentes que atrasem a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Soluções injectáveis estéreis são preparadas através da incorporação do composto activo na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do ingrediente activo esterilizado num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem por vácuo e a técnica de secagem por congelação que produz um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da solução previamente esterilizada por filtração destes.

Para fins de administração tópica, são preparadas soluções aquosas estéreis diluídas (habitualmente numa concentração de cerca de 0,1% a 5%), de outro modo semelhantes às soluções parentéricas de cima, em recipientes adequados para administração gota-a-gota no olho. Os compostos terapêuticos deste invento podem ser administrados a um mamífero sozinhos ou em combinação com transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Tal como observado acima, as proporções relativas de ingrediente activo e de transportador são determinadas através da solubilidade e natureza química do composto, da via de administração escolhida e da prática farmacêutica padrão. A dosagem dos agentes terapêuticos presentes que será mais adequada para profilaxia ou tratamento dependerá da forma de administração, do composto particular escolhido e das características fisiológicas do paciente particular em tratamento. Geralmente, serão utilizadas inicialmente pequenas dosagens e, se necessário, serão 65 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ aumentadas em pequenos aumentos até ser alcançado um efeito óptimo sob as circunstâncias. A administração oral requer dosagens maiores. Os compostos são administrados oralmente ou parentericamente ou topicamente como gotas nos olhos. As dosagens podem ser facilmente determinadas pelos médicos utilizando métodos conhecidos na arte, utilizando dosagens tipicamente determinadas a partir de estudos animais como pontos de partida.

Estando o presente invento agora descrito geralmente, o mesmo será melhor compreendido em referência aos seguintes exemplos detalhados, que são proporcionados apenas para fins de ilustração e não devem ser considerados limitantes do presente invento a menos que especificado em contrário.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Identificação de proteínas efectoras em neutrófilos para racl e CDC42HS

Para detectar se existem alvos para rac/CDC42Hs em humanos, foi utilizado um ensaio de sobreposição para detectar qualquer um desses alvos no citosol de neutrófilos. O ensaio de sobreposição para GTPase foi inicialmente descrito como um método para detectar proteínas activadoras de GTPase ("GAP") (Manser et ai., 1992) para proteínas semelhantes a rho; sondando um filtro de nitrocelulose contendo lisado com proteínas semelhantes a rho ligadas a (y32P)GTP foi possível detectar proteínas no filtro que podem afectar a velocidade de hidrólise de GTP, uma vez que as GAP catalisam a libertação do γΡί de GTP, a perda de Pi radiomarcado da sonda de GTPase foi visualizada como bandas claras sobre um fundo escuro. No entanto, através da modificação das condições de sondagem foi descoberto pelos presentes inventores que se pode detectar proteínas efectoras que inibem a libertação de Pi como bandas escuras na membrana. Tal como aqui divulgado as três bandas principais agrupando-se próximo do marcador de 68 kDa foram detectadas utilizando citosol de neutrófilos humanos. Foram aplicados 40 μΐ de fracção de citosol de neutrófilos bruta ou parcialmente purificada contendo p65 (-80 pg de proteína) numa SDS-PAGE a 14% e transferidos para uma membrana de PVDF. A membrana foi corada durante 30 s com corante Azul de Coomassie ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 6 6 para detectar proteínas transferidas, descorada durante 2 min. e incubada durante 30 min com PBS contendo BSA a 1% BSA, MgCl2 0,5 mM, Triton x-100 a 0,1% e DTT 5 mM. 30-50 μΐ (3-5 yg de proteína) de CDC42HS, racl humana, ou rho A humana, preparadas como proteínas recombinantes em células de insecto Sf9, foram diluídos em 200 μΐ de tampão de permuta: MES 25 mM, pH 6,5, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,05% e 1 μΐ de [Y32P]GTP (5 yCi, ICN) ou [p32P]GDP (5 yCi, ICN) . As proteínas foram incubadas com o tampão de permuta durante 15 min à temperatura ambiente e depois misturadas com 10 ml de tampão de ligação contendo tampão MES 25 mM, pH 6,5, GTP 0,5 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 50 mM e DTT 5 mM. Imediatamente, a partir daí a proteína carregada com os nucleótidos foi utilizada para sondar o filtro. A mistura foi incubada durante 5-8 min e lavada durante cinco min com tampão MES 25 mM, pH 6,5, MgCl2 5 mM, Triton X-100 a 0,05%. A membrana foi seca e exposta a uma película durante 2-3 horas. Foram detectadas três proteínas principais como alvos de racl/CDC42Hs. Foi ainda determinado que estas proteínas eram abundantes em fracções citosólicas de neutrófilos e células HL-60. Deste modo, foram utilizados neutrófilos como fonte para purificação da proteína. O fraccionamento do citosol de neutrófilos numa coluna Mono Q resolveu as bandas que se agrupavam próximo do marcador de 68 kDa em três bandas distintas de tamanho molecular 62, 65 e 68 kDa, as quais foram todas detectadas apenas quando o filtro foi sondado com a forma ligada a GTP de racl e CDC42Hs e não com a rho A ligada a GTP. Ver Figuras 1 e 3.

Exemplo 2. Isolamento da proteína hPAK65 A banda p65, que era a mais abundante das três proteínas identificadas no Exemplo 1, foi subsequentemente isolada e purificada. Foi preparado citosol a partir de neutrófilos humanos tal como anteriormente descrito (Abo et al., 1994).

Todos os passos de purificação foram efectuados em colunas ligadas a um sistema de FPLC, a 40°C, caudal de 1 ml/min, e foram colhidas fracções de 1 ml. Foram aplicados 10 ml (10 mg/ml) de citosol de neutrófilos numa coluna Mono Q (HR5/5 Pharmacia LKB) equilibrada com tampão A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, PMSF 1 mM, 1 yg/ml de pepstatina. As proteínas foram eluídas com 30 ml de um 67 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ gradiente de NaCl Ο a 0,5 Me as fracções colhidas foram ensaiadas quanto a ligação de racl ou CDC42Hs através do ensaio de sobreposição. As fracções contendo a proteína p65 foram reunidas e sujeitas a precipitação em sulfato de amónio. Foram adicionados à mistura grãos de sulfato de amónio ao longo de um período de 15 min para se alcançar uma saturação de 40%. A solução foi agitada em gelo durante mais 30 min. e subsequentemente centrifugada a 100 000 g durante 15 min numa ultracentrífuga TLX Beckman. O sedimento foi ressuspenso em tampão A até o seu volume original e as fracções foram analisadas através do ensaio de sobreposição. O sobrenadante obtido através de 40% de sedimentação em sulfato de amónio que continha a proteína p65 desejada foi ainda purificado numa coluna Phenyl Superose (HR 5/5 Pharmacia LKB) equilibrada com tampão Pi 100 mM, pH 7,2, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, PMSF 1 mM, 1 pg/ml de pepstatina e sulfato de amónio 1,2 M. As proteínas ligadas foram eluídas através de 30 ml de gradiente de sulfato de amónio 1,2 M a 0. No caso da purificação de uma grande quantidade de material de partida (300-500 mg de proteína), os passos de sulfato de amónio e de Phenyl Superose foram os primeiros procedimentos de purificação seguidos de fraccionamento Mono Q. Para este fim foi utilizada uma coluna HiLoad de Phenyl Sepharose 16/10 (Pharmacia, LKB). As fracções colhidas foram analisadas através do ensaio de sobreposição e as fracções contendo a proteína p65 foram reunidas e dessalinizadas em tampão A numa coluna PD 10 (Pharmacia, LKB). A p65 parcialmente purificada foi ainda purificada numa coluna Mono S HR5/5 (Pharmacia LKB) equilibrada com o tampão A. As proteínas foram eluídas através de 30 ml de gradiente de NaCl 0 a 0,5 M e as fracções foram analisadas através do ensaio de sobreposição. Neste estádio o polipéptido p65 pôde ser facilmente identificado através de coloração de Azul de Coomassie e a banda foi excisada e utilizada para análise de aminoácidos. A sequência de aminoácidos foi determinada como se segue. A preparação de p65 foi purificada através de SDS-PAGE, seguindo-se coloração de Azul de Coomassie G-250, e a proteína foi excisada. Após lavagem, as peças de gel foram maceradas e digeridas com endoproteinase Ly-C de Achromobacter lyticus. Os péptidos foram recuperados através de lavagens sequenciais e separados através de HPLC em série utilizando colunas de 68 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ permuta aniónica e de fase inversa com um diâmetro interno de 2,1 mm em série, seguindo os procedimentos anteriormente descritos (Kawasaki et ai., 1990). As fracções foram colhidas e aplicadas directamente num sequenciador automático de liquido pulsado Applied Biosystem 477A modificado para química de ciclo rápido tal como descrito (Totty et ai., 1992). A digestão de p65 e a subsequente análise de aminoácidos produziu a seguinte sequência de aminoácidos: STMVGTPYWMAPEVVTR, que está intimamente relacionada com uma sequência dentro do domínio serina/treonina-quinase de levedura STE20 (Ramer e Davis 1993), e é 100% idêntica à serina/treonina-quinase de cérebro de rato, PAK65 (Manser et ai., 1994).

Exemplo 3. Isolamento do clone de ADNc de hPAK65

Com base na sequência proteica da PAK65 de cérebro de rato (Manser et ai., 1994) e na sequência de aminoácidos derivada da p65 purificada determinada no Exemplo 2, os oligómeros GM749 5'-GGGGCCATCCAATAGGGGGTACCNACCATNG-3' e GM752: 5'-ACCGGAGAATTCACCGGCATGCCTGAACAGTGG-3' foram desenhados e utilizados para amplificar ADNc humanos codificando proteínas PAK. Estes oligómeros foram utilizados para amplificar ADNc de PAK específicos de várias bibliotecas de ADNc humanas comercialmente disponíveis. Embora o produto esperado tenha sido detectado em várias bibliotecas específicas de tecido, foram detectadas quantidades relativamente grandes numa biblioteca de placenta humana. Foi seleccionada uma biblioteca de placenta humana de Stratagene (1994 número de catálogo 936203) como fonte para um clone de ADNc. O produto de PCR de 962 pares de bases purificado em gel foi amplificado na presença de 32P dCTP e 32P dGTP resultando num produto radioactivo. Este produto de PCR foi utilizado para pesquisar aproximadamente 100 000 placas fágicas recombinantes utilizando condições de hibridação rigorosas (tampão de hibridação: formamida a 50%, SSC 5x, solução de Denhardt 5x, NaP04 50 mM, pH 7 e SDS a 0,1% a 42°C; lavagem: SSC 5x, SDS a 0,1%) para isolar um ADNc inteiro. Um clone positivo foi purificado em placas fágicas e auto-excisado ("excisão in vivo") a partir de lambda Zap II de acordo com os protocolos do fabricante para produzir o clone plasmídico contendo o ADNc da PAK65 humana inteiro com a sequência 69 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ apresentada na Figura 2Α (SEQ ID N0:1), que foi designado pBSPAK. A sequência da inserção de ADNc contida dentro do plasmideo Bluescript resultante foi determinada utilizando o método de terminação da cadeia com didesoxinucleótidos.

Exemplo 4. Homologia de aminoácidos A sequência nucleotidica e de aminoácidos deduzida do ADNc da PAK65 humana, que será aqui referida como hPAK65, são mostradas na Figura 2. Um clone inteiro de ADNc da hPAK65 obtido a partir de uma biblioteca de placenta humana apresentou uma semelhança de sequência com o domínio quinase da PAK65 de cérebro de rato e da STE20 de levedura. Embora a PAK65 de cérebro de rato e a hPAK65 exibam uma especificidade semelhante para racl/CDC42Hs, as sequências apresentam apenas 70% de identidade de sequência ao nível dos aminoácidos nos domínios de ligação a racl/CDC42Hs. A sequência de aminoácidos completa de hPAK65 partilha *73% de identidade com a PAK65 anteriormente isolada de cérebro de rato (Manser et al., 1994) (Figura 2A) e partilha mais de 95% de identidade com o domínio quinase (aminoácidos: 230-506) (Figura 2B) . Adicionalmente, hPAK65 exibe *63% de identidade com o domínio quinase de STE20 (posição: 620-880) (Ramer e Davis, 1993) (Figura 2C). Tal como relatado para a PAK65 de rato (Manser et al., 1994), o domínio de ligação a racl e CDC42Hs (aminoácidos 47-113) de hPAK65 partilha também algumas semelhanças com o domínio regulador de STE20 (dados não mostrados).

Exemplo 5. Distribuição tecidual de hPAK65

Para determinar a distribuição tecidual de ARNm codificando hPAK65, foi utilizado um produto de PCR radioactivo contendo o domínio quinase altamente conservado (pares de bases 1009 a 1912) do ADNc da PAK humana para hibridar com ARNm derivado de 16 tecidos humanos e 8 linhas celulares de cancro imobilizados em Northern blots (o ARNm ligado à membrana está disponível em Clontech). Uma vez que a sonda era derivada do domínio quinase, a região mais conservada entre hPAK65, PAK65 de cérebro de rato e STE20, esperava-se que a expressão de mensagens infimamente relacionadas fosse analisada. As condições de hibridação utilizadas foram tal como sugerido pelo fabricante utilizando 70 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

ExpressHyb (Clontech) excepto que a temperatura foi 72°C e o tempo de hibridação foi de um dia para o outro. A análise Northern blot indica que o ARNm relacionado com hPAK65 está distribuído de modo ubíquo por vários tecidos com níveis maiores em células de origem mielóide, designadamente no músculo-esquelético, ovário, timo e baço e 2-3 vezes mais na linha celular HL-60 (Figura 3). Foram detectadas quatro espécies de ARN na maioria dos tecidos com tamanhos de aproximadamente 7,5 kb, 5 kb, 4,4 kb e 3 kb. A mensagem com 7,5 kb era a espécie predominante em todos os tecidos excepto no músculo-esquelético em que o ARNm de 7,5 kb e de 3 kb era quase o mesmo. Em contraste, as linhas celulares HL-60, Molt-4, Raji e SW480 têm quantidades iguais de todas as quatro espécies enquanto no cérebro foi detectado um ARNm de tamanho diferente em torno de 3,3 kb. Com base nos resultados de Southern blotting genómico sob condições rigorosas (resultados não mostrados; ADN genómico humano ligado à membrana disponível em Clontech; as condições foram as sugeridas pelo fabricante excepto que a temperatura de hibridação foi de 64°C em vez de 60°C e a hibridação decorreu de um dia para o outro), estes múltiplos ARNm são muito provavelmente formas de processamento alternativo a partir de um único gene (Figura 3).

Em contraste, através da utilização do ensaio de sobreposição, foi detectado um elevado nível de proteína PAK de rato principalmente em células cerebrais (Manser et al., 1994), enquanto através de análise Northern foi verificada uma expressão mais elevada de hPAK65 em neutrófilos e células HL-60 tal como aqui descrito. É muito provável que o ensaio de sobreposição não seja suficientemente sensível para detectar PAK em tecidos com uma expressão de proteína relativamente mais baixa e assim não é um método preferido para a determinação da distribuição tecidual de PAK.

Exemplo 6. Produção de proteínas recombinantes em células Sf9

Um marcador epitópico Glu-Glu modificado (Grussenmeyer et al., 1985; modificado para Met-Glu-Tyr-Met-Pro-Thr-Asp) foi clonado no terminal N de racl, CDC42HS e rho utilizando uma reacção em cadeia pela polimerase (Grussenmeyer et al., 1985). hPAK65 foi marcado com o epítopo myc (MEQKLISEEDL) através da 71 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ ligação de oligómeros fundidos no local Xfoal (417 pb) imediatamente a montante da Met de iniciação de hPAK65. Os ADNc marcados foram clonados no vector de expressão de baculovírus pAcC13. pAcPAK780 contém a hPAK65 marcada com myc. 1 g de sedimentos de Sf9 congelados rapidamente, expressando as proteínas desejadas, foram homogeneizados em Dounce em 10 ml de Tampão B: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCÍ2 5 mM, GDP 200 μΜ, Pefabloc 1 mM, 10 yg/ml de leupeptina, 10 pg/ml de aprotinina. Para remover a fracção particulada, o homogenato foi centrifugado a 100 000 g durante 15 min. A fracção solúvel foi aplicada numa coluna de 2 ml de proteína G-Sepharose conjugada com anticorpos monoclonais anti-Glu-Glu ou anti-Myc. A coluna foi lavada com 10 ml de tampão B sem GDP, e a proteína foi eluída com o mesmo tampão contendo o marcador peptídico Myc ou 50 yg/ml do marcador peptídico ED (EYMPTD). As fracções foram analisadas num SDS-PAGE, quantificadas através do método de Bradford, concentradas através de um Centricon 10 (Amicon) até 1 mg/ml, divididas em alíquotas, rapidamente congeladas e armazenadas a -70°C. Foi utilizada uma alíquota fresca da proteína para cada ensaio. A expressão da hPAK65 em células Sf9 permitiu a preparação de hPAK65 recombinante essencialmente homogénea marcada com o epítopo myc ("rhPAK65") , que foi utilizada para caracterização das propriedades bioquímicas de hPAK65.

Exemplo 7. A especificidade de ligação de hPAK65 a proteínas p21 hPAK65 recombinante ou hPAK65 endógena no citosol de neutrófilos, foi detectada apenas quando o filtro foi sondado com [γ32Ρ] GTP-CDC42Hs e [ γ32Ρ] GTP-racl mas não com [γ32Ρ] GTP-rho A (Figura 4). Não foram detectadas proteínas quando a GTPase foi previamente carregada com [p32P]GDP, indicando que a proteína hPAK65 se comporta como uma molécula efectora para racl e CDC42HS. A afinidade relativa tal como avaliada através do ensaio de sobreposição é *3-4 vezes superior para CDC42Hs que para racl (Figura 4).

Exemplo 8. CDC42Hs e racl induzem autofosforilação de hPAK65

Para determinar se CDC42Hs e racl induzem autofosforilação de hPAK65, a hPAK65 foi incubada com a forma activada de racl ou de CDC42HS numa reacção de quinase 72 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ contendo [γ32Ρ]ΑΤΡ. A estimulação de autofosforilação da hPAK65 foi observada em ambos os casos (Figura 5A) . Não foi observada fosforilação com rho A nem através da omissão da GTPase e adicionando simplesmente GTP (Figura 5A). A fosforilação ocorreu de um modo dependente da dose apenas com a GTP ou a forma GTPyS de CDC42Hs ou racl. A fosforilação máxima foi obtida após 15 min a 30°C (dados não mostrados).

Para determinar o padrão de fosforilação em hPAK65 induzido por racl e CDC42Hs, a hPAK foi sujeita a reacção de quinase contendo racl ou CDC42Hs activada. Para remover racl e CDC42Hs, a hPAK65 imobilizada em contas foi lavada três vezes com PBS contendo Triton X-100 a 1% e as contas foram ressuspensas em Tris HC1 100 mM, pH 6,8, SDS a 0,5%, DTT 10 mM, glicerol a 10%. As amostras foram fervidas durante 3 min e foram adicionados 10 pg da protease indicada (todos de Boehringer). As proteínas foram digeridas de um dia para o outro à temperatura ambiente e as amostras foram analisadas em géis de Tricina a 16%. O gel foi corado com Azul de Coomassie, descorado, seco e exposto a película de um dia para o outro. A análise dos fosfoaminoácidos foi efectuada para determinar a localização da autofosforilação. 4 pg (em 50 pl de contas) de hPAK65 recombinante foram sujeitos a reacção de quinase tal como descrito acima. A hPAK65 fosforilada imobilizada em contas de Sepharose G foi lavada três vezes em PBS contendo Triton X-100 a 1% e depois hidrolisada em 50 pl de HC1 6 N a 100°C durante 2 h. As contas foram removidas através de centrifugação e o sobrenadante foi seco e dissolvido em 10 pl de tampão de electroforese pH 3,5 (10:100:1890, piridina:ácido acético:água). Os fosfoaminoácidos foram resolvidos numa placa de celulose de camada fina utilizando o tampão de electroforese essencialmente tal como descrito antes (Cooper et ai., 1983). Os padrões foram visualizados através de coloração com Ni-hidrina a 0,2% em acetona e os resíduos marcados com 32Pi foram detectados através de autorradiografia de um dia para o outro. A análise dos fosfoaminoácidos indicou que hPAK65 era fosforilada nos resíduos de serina quando activada através de CDC42Hs e não nos resíduos de treonina ou de tirosina (Figura 5B).

Uma vez que racl e CDC42Hs partilham *72% de identidade de sequência e têm aparentemente papéis fisiológicos 73 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ diferentes, é concebível que racl e CDC42HS possam activar a autofosforilação de hPAK65 em locais distintos. Para testar esta hipótese a hPAK65 foi incubada com racl ou CDC42Hs numa reacção de quinase com [γ32Ρ]ΑΤΡ e a proteína fosforilada foi digerida com três enzimas diferentes: tripsina, quimotripsina e Glu-C. Este tratamento resultou na geração de fosfopéptidos radiomarcados que foram resolvidos num gel de Tricina a 16%. Perfis fosfopeptídicos idênticos foram gerados a partir de digestão de hPAK65 activada através de rac ou CDC42HS (Figura 5C). Este resultado sugere que rac e CDC42Hs estimulam hPAK65 a fosforilar-se nos mesmos locais de serina.

Tal como a p65 de neutrófilos humanos e a PAK65 de cérebro de rato, a hPAK65 recombinante interagiu especificamente com a forma activada de racl ou CDC42, e subsequentemente, se proporcionada com ATP, tornou-se autofosforilada. Os dados sugerem que rac/CDC42Hs medeia a autofosforilação de hPAK65 gerando deste modo uma quinase activa. O estrito requisito de ligação e activação de hPAK65 apenas pela forma ligada a GTP de rac e CDC42Hs indica que hPAK65 serve como proteína efectora para rac/CDC42Hs. Adicionalmente, é muito provável que a afinidade de ligação relativa de rac/CDC42Hs para hPAK65 seja regulada através do estado nucleotídico e não pelo estado fosforilado de hPAK65. Em contraste com o modelo sugerido (Manser et al., 1994), os dados divulgados pelos presentes inventores indicam que o estado de fosforilação de hPAK65 não está envolvido na regulação da ligação de rac/CDC42Hs. A hPAK65 fosforilada e não fosforilada exibiu afinidades comparáveis para racl e CDC42HS.

Exemplo 9. A hPAK65 fosforilada é uma quinase activa

Foi efectuado um ensaio de quinase para determinar se a hPAK65 tinha actividade quinase contra outras proteínas e se essa actividade era afectada por proteínas p21. 1-2 pg de rhPAK65 (ligada a proteína G-Sepharose conjugada com anticorpo de Myc monoclonal) foram lavados uma vez e incubados em 40 μΐ de tampão de quinase (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, MnCl2 1 mM) com 1-2 pg de racl, rho ou CDC42Hs, que foram todos previamente carregados com GTP ou GDP. A reacção foi iniciada através da adição de 10 pl de tampão de quinase contendo ATP 50 pM e 5 pCi de [γ32Ρ]ΑΤΡ e incubou-se 74 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ durante 20 min a 30°C. A reacção foi parada através da adição de 10 μΐ de tampão de amostra de SDS-PAGE 5x e fervendo durante 5 min. As amostras foram aplicadas a um SDS-PAGE a 14%, o gel foi corado com Azul de Coomassie, descorado, seco e exposto a uma película durante 1-2 horas. As bandas fosforiladas foram excisadas e foram contados os 32fosfatos incorporados. No caso de fosforilação da proteína básica da mielina ("MBP") , foram incluídos 3 yg de MBP (Sigma) na reacção de quinase. A fosforilação da hPAK65 induzida por racl ou CDC42Hs estimula a sua actividade quinase contra o substrato MBP (Figura 6a). Tanto rac como CDC42HS foram capazes de estimular uma quinase hPAK65 activa de um modo dependente do tempo. A fosforilação máxima da MBP foi obtida dentro de 10 min a 30°C (Figura 6B) .

Exemplo 10. A hPAK activada não requer racl nem CDC42HS para manter a sua actividade quinase

As experiências de cima demonstram claramente o requisito de racl/CDC42Hs na activação da autofosforilação de hPAK65. Foi investigado se racl/CDC42Hs são necessárias para a actividade quinase de hPAK65 através da seguinte experiência: a autofosforilação de hPAK65 foi primeiro induzida através de CDC42Hs na presença de ATP frio, depois o complexo de hPAK65 e CDC42Hs foi rompido através de lavagens exaustivas. A hPAK65 autofosforilada livre de CDC42Hs (confirmado através de Western blot) foi sujeita a uma segunda reacção de quinase contendo [γ32Ρ]ΑΤΡ e MBP. A hPAK65 autofosforilada livre de CDC42Hs foi suficiente para activar a fosforilação de MBP (Figura 6C) . A hPAK65 de controlo foi tratada exactamente do mesmo modo excepto que o ATP não foi incluído na primeira reacção de quinase. Foram detectados níveis mais baixos de autofosforilação de hPAK65 na hPAK65 de controlo, que muito provavelmente são devidos a níveis residuais de complexos CDC42Hs/PAK não lavados. Estes dados sugerem que rac e CDC42Hs têm um papel importante na activação de hPAK65 através da estimulação da sua autofosforilação mas não na manutenção e regulação da actividade quinase. 75 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Exemplo 11. Comparaçao da ligaçao de CDC42Hs à hPAK65 fosforilada vs. não fosforilada

Tanto a hPAK65 completamente fosforilada como a não fosforilada, tal como avaliado através da mudança de mobilidade e da reacção de quinase, ligaram-se igualmente bem a CDC42Hs activada (Figura 7). A fosforilação de hPAK65 serve muito provavelmente para activar a quinase de hPAK65 mas não altera a sua afinidade para rac/CDC42Hs. Este resultado está em contraste com o sistema de rato, em que se mostrou que a CDC42 tem uma afinidade reduzida para a forma activada de PAK65 de cérebro de rato e foi sugerido que a fosforilação de PAK é um mecanismo através do qual rac/CDC42 pode ser libertada de PAK uma vez activada (Manser et ai., 1994).

Exemplo 12. O efeito de hPAK65 na actividade de GTPase intrínseca e estimulada

Uma vez que a proteína p65 foi inicialmente detectada através do ensaio de sobreposição como potencial efector e inibição de GTPase para racl/CDC42Hs, foi examinado o efeito de hPAK65 na actividade de GTPase em solução. CDC42Hs purificada (800 nM) foi previamente ligada a 80 nM de g-32P-GTP (6000 Ci/mmol) na presença de EDTA 1 mM durante 5 min a 25°C, seguido da adição de 19 volumes de Tampão de Ensaio GAP (MES 50 mM, pH 6, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) para produzir γ-32Ρ-GTP-CDC42HS 4 nM. Incubou-se [γ-32Ρ]-GTP-CDC42HS 1 nM com as concentrações indicadas de hPAK65, que tinha sido pré-incubada na presença ou ausência de ATP. As reacções foram realizadas em Tampão de Ensaio de GAP contendo BSA (0,2 mg/ml de BSA, MES 50 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) na presença ou ausência do fragmento catalítico da pl90 humana 20 nM durante 5-10 min a 25°C, seguido de ensaio da libertação de fosfato (Shacter, 1984). Para as reacções estimuladas por pl90, foram realizadas reacções correspondentes na ausência de pl90 e foi subtraída a hidrólise resultante para produzir apenas actividade dependente de pl90. pl90 é um estimulador da actividade de GTPase. hPAK65 exibe um efeito marginal na actividade de GTPase intrínseca de CDC42Hs (Figura 8A) . 0 aumento da quantidade de hPAK65 até 1000 vezes a de CDC42Hs inibiu a actividade de 76 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ GTPase intrínseca mas apenas em 10-15% (Figura 8A) .

Interessantemente, a hPAK65 activada teve um efeito idêntico, sugerindo que a fosforilação não teve efeito regulador na actividade de GTPase intrínseca de rac/CDC42Hs (Figura 8A).

Em contraste, quando o domínio catalítico da GAP pl90 humana (Settleman et al., 1992 divulgaram a pl90 de rato) foi incluído no ensaio, hPAK65 exerceu uma inibição significativa da hidrólise de GTP estimulada por pl90. O aumento da concentração de hPAK65 para 5 vezes mais que a de CDC42Hs resultou no bloqueio de até 40% da hidrólise de GTP estimulada por GAP (Figura 8B) . Não se observaram diferenças na GTPase estimulada por GAP quando a hPAK65 fosforilada foi comparada com a não fosforilada (Figura 8B).

Racl e CDC42Hs partilham «72% de identidade de sequência e têm papéis fisiológicos distintos. Por exemplo, racl induz enrugamento da membrana (Ridley et al., 1992) e interage com p67-phox para activar a NADPH-oxidase (Diekmann et al., 1994), enquanto CDC42Hs não tinha qualquer efeito na actividade da NADPH-oxidase nem na indução de pregas na membrana. Em levedura, CDC42 está envolvida na formação de gemas (Johnson e Pringle, 1990). A afinidade relativamente inferior de hPAK65 para racl em comparação com CDC42HS pode sugerir que CDC42Hs é o activador fisiológico de hPAK65. No entanto, é improvável que a activação de hPAK65 por racl seja um artefacto in vltro, uma vez que a activação In vltro da NADPH-oxidase requer especificamente rac e não CDC42Hs. É muito provável que proteínas semelhantes a rho tenham numerosos domínios efectores, alguns dos quais podem ser partilhados entre os vários membros da família, enquanto outros podem ser únicos de cada membro. Uma vez que o mapa parcial dos f osf opéptidos gerado a partir da hPAK65 activada através de rac ou de CDC42Hs era idêntico, isto indica que rac e CDC42Hs activam hPAK65 do mesmo modo, nomeadamente, através da estimulação de autofosforilação nos mesmos locais. Será muito importante determinar que agonista ligará a estimulação de racl ou CDC42Hs com a activação de hPAK65 in vivo. Tais estudos determinarão que factor de permuta de nucleótidos para proteínas semelhantes a rho está implicado nesta via. Por exemplo, foi mostrado que Dbl tem uma actividade de permuta de nucleótidos em rho, CDC42Hs mas não em racl (Hart et al., 77 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 1991). Assim é possível que a activação de Dbl possa conduzir a estimulação de hPAK65 dependente de CDC42Hs. A homologia de hPAK65 e de PAK65 de cérebro de rato com o domínio quinase da STE20 de levedura sugere um papel de rac/CDC42Hs e das proteínas PAK na cascata de quinases da proteína activada por mitogénio ("MAP") em células de mamífero (Avruch et al., 1994) que está envolvida na proliferação e transformação celular. Mostrou-se que a STE20 era um alvo para as subunidades βγ da proteína G heterotrimérica em S. cerevisiae que liga a resposta a feromonas a uma cascata de quinases conduzindo a actividade de transcrição (Leberer et al., 1992; Errede e Levin, 1993) . Cinco proteínas quinase (STE20, STE11, STE7, FUS3 e KSS1) foram implicadas entre as proteínas G e o factor de transcrição STE12 (Errede e Levine, 1993) . STE7 tem alguma homologia com MAP-quinase e FUS3 e KSS1 são homólogos de levedura da MAP-quinase (Errede et al., 1993). Adicionalmente, evidências genéticas demonstram uma associação funcional entre um novo gene STE5 e STE20 (Leberer et al. , 1993) . Para além de uma homologia limitada com FAR1, STE5 não tem nenhum motivo estrutural específico conhecido no entanto opera dentro desta cascata de quinases e é muito provável que funcione como uma proteína adaptadora (Leberer et al., 1993; Errede e Levine, 1993). A divergência relativamente elevada entre a PAK65 de cérebro da rato e a hPAK65 nos seus domínios reguladores sugere que estas proteínas possam ser controladas por moléculas diferentes. Assim, diferentes homólogos de STE5 de mamífero podem servir como proteínas adaptadoras para montar quinases distintas semelhantes a PAK com quinases a jusante tais como STE7 e STE11. Crê-se que rac esteja envolvida na activação de vias de quinases de stress que podem conduzir, entre outras coisas, a apoptose. A MEK-quinase (MEKK) , implicada em vias de quinases de stress, pode actuar a jusante de hPAK65 uma vez que MEKK tem homologia com STE11 de levedura que actua a jusante de STE20, uma proteína que se mostra aqui possuir homologia com hPAK65.

Em resumo os dados aqui apresentados são consistentes com o modelo apresentado na Figura 9. Após permuta do nucleótido de GDP para a forma activa GTP, racl/CDC42Hs interagem com hPAK65 e subsequentemente induzem autofosforilação de hPAK65. O GTP é hidrolisado em GDP através da actividade de GTPase 78 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ intrínseca de racl/CDC42Hs. As formas inactivas ligadas a GDP de racl/CDC42Hs são libertadas da quinase hPAK65 activa que subsequentemente fosforila um substrato fisiologicamente ainda não identificado.

Exemplo 13. Anticorpos para hPAK65

Um anticorpo gerado contra um péptido derivado do domínio quinase de hPAK65 foi utilizado para determinar se as outras duas proteínas efectoras, p62 e p68, identificadas no citosol de neutrófilos eram aparentadas com a proteína hPAK65. Não se observou reactividade cruzada utilizando soros policlonais.

Exemplo 14. Um ELISA de ligação de hPAK65 a rac/CDC42 O seguinte ensaio em formato de ELISA proporciona uma concretização de um meio para detectar ou medir a ligação de proteínas p21 a hPAK65 ou fragmentos desta e proporciona assim um meio para pesquisar agentes que modulem esta ligação. Uma superfície, p. ex., um poço de microtítulo, foi revestida com solução de proteína hPAK65 preparada primeiro através da adição de DTT 0,5 mM a solução salina de Denhardt tamponada com fosfato (contendo Ca2+ e Mg2+) seguida da adição da proteína de fusão GST-pakette substancialmente purificada a uma concentração final de 10 pg/ml (para 0,5 pg/poço) . Após mistura suave de preferência através de inversão, foram colocados 50 μΐ desta solução de GST-PAKette em cada poço de uma placa de microtítulo, p. ex., de uma placa Immulon, que foi depois coberta com um vedante de placas e incubada de um dia para o outro, de preferência a 4°C e de preferência com agitação para distribuir uniformemente a solução ao longo da superfície. As placas revestidas foram tipicamente utilizáveis durante 4-5 dias. Antes da utilização a placa foi lavada uma vez com 200 μΐ de tampão de lavagem: PBS contendo Ca2+ e Mg2+ mais Tween-20 a 0,1%. Os locais de ligação inespecífica foram bloqueados através da adição a cada poço de 200 μΐ de PBS contendo Ca2+, Mg2+ e BSA a 1%, com incubação a 4°C durante pelo menos 2 horas, de preferência com agitação, seguido de duas lavagens com 200 μΐ de tampão de lavagem de cada vez.

A racl ou a CDC42HS humanas recombinantes e marcadas foram misturadas nas concentrações desejadas com GDP/GTPyS 79 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 1 mM e EDTA (a duas vezes a concentração molar de MgCl2 para quelar Mg2+) até um total de ~3χ o volume de racl/CDC42Hs adicionado. O volume foi ajustado com tampão de pré-ligação (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM) . A solução de proteína p21 foi então incubada a 30°C durante 30 minutos. Foi adicionado MgCl2 a duas vezes a concentração molar de EDTA. O ião de magnésio estimula a ligação dos nucleótidos a proteínas p21. O EDTA efectua a quelação de Mg2+ para auxiliar na remoção de nucleótidos.

Para a ligação, a solução de proteína p21 de cima foi ajustada no volume com tampão de ligação (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM, MgCl2 50 mM, NP-40 a 1%, BSA a 0,1%). A ligação foi iniciada através da adição de 50 μΐ de solução de racl/CDC42Hs a cada poço. Para testar um agente quanto à sua capacidade para inibir ou modular a ligação, foi adicionado um agente de teste a 10 μΜ aos 50 μΐ de solução (p. ex., 5 μΐ de agente + 45 μΐ de solução racl/CDC42 GTPyS). Deixou-se prosseguir a ligação durante 1 hora a 35°C. Os poços foram então lavados três vezes com 200 μΐ de tampão de lavagem de cada vez.

Para detectar racl/CDC42Hs ligada a hPAK65, foi adicionado a cada poço um conjugado de anticorpo-fosfatase alcalina ("Ab-AP") que reconhece o marcador apropriado. Tipicamente, o conjugado anticorpo-AP foi diluído 1:4000 em tampão de diluição de Ab (PBS contendo Ca2+ e Mg2+, Tween-20 a 0,1%, BSA a 0,1 %) e depois foram adicionados a cada poço 50 μΐ de solução de Ab-AP. Após incubação durante 1 h à TA, cada poço foi lavado três vezes com 200 μΐ de tampão de lavagem. Foram adicionados a cada poço 100 μΐ de substrato para AP (reserva: 1 pastilha de PNPP (Boeringher-Mannheim) em 100 ml de H20) seguido de incubação de 10-20 minutos a 35°C para revelar a cor. A cor foi lida a 405 nm quando a DO era cerca de 1,0.

Um agente candidato é um que inibe significativamente a ligação de racl ou CDC42HS a GST-PAKette e tem de preferência uma CI5o (concentração à qual ocorre 50% da inibição máxima) no intervalo de menos de 1 μΜ e de maior preferência menos de 1 nM. De maior preferência, um agente exibirá selectividade na inibição da ligação não inibindo substancialmente outros pares 80 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ proteína ρ21:proteína-quinase, de preferência com uma selectividade de pelo menos duas vezes, de maior preferência pelo menos três vezes e ainda de preferência pelo menos dez vezes.

Exemplo 15. Pesquisa de compostos que inibem a actividade quinase de hPAK65

Os compostos podem ser avaliados num formato de ensaio in vitro quanto à capacidade para inibirem a actividade quinase da PAK65 humana para o substrato MBP. Os formatos gerais de ensaio são tal como proporcionados nos Exemplos de cima. Pode ser adaptado outro ensaio (MacDonald et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6615, 1993) como se segue: a proteína PAK65 humana purificada e a MBP purificada são combinadas num vaso de reacção (p. ex., um poço de uma placa de microtítulo) sob condições aquosas tamponadas na presença de γ-33Ρ-ΑΤΡ e incubadas a 32°C; a incorporação catalisada por quinase de 33P na proteína é detectada como contagens radioactivas retidas em papel de fosfocelulose após lavagem para remover os componentes não ligados (i.e., não proteicos), incluindo γ-33Ρ-ΑΤΡ. Os agentes de teste são incluídos em reacções paralelas e avaliados quanto à sua capacidade para inibirem a incorporação dependente de hPAK65 de 33P na proteína retida em fosfocelulose. Numa concretização alternativa, pode ser utilizado γ-32Ρ-ΑΤΡ em vez de γ-33Ρ-ΑΤΡ. Numa segunda concretização alternativa, pode ser utilizado um péptido, tal como CQQFGFGRRASDDG em vez de MBP (Kolch et ai., Nature 364: 249, 1993) .

Um agente candidato é um que iniba significativamente a actividade quinase de hPAK65, e tem de preferência uma CI5o (concentração à qual ocorre 50% da inibição máxima) no intervalo de aproximadamente 3χ10~8 M. De maior preferência um agente exibirá selectividade na inibição de hPAK65 ao não inibir substancialmente a actividade da proteína-quinase C (PKC) a concentrações até ΙχΙΟ-5 M. De maior preferência, um agente não deve inibir significativamente a actividade de rasGAP nem de rapGAP em ΙχΙΟ-5 M de agente sob condições de ensaio padrão para essas actividades. 81 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Exemplo 16. Inibição do crescimento de tumores humanos em ratinhos SCID

Para avaliar a capacidade de um agente candidato para inibir o crescimento de tumores humanos, foram injectadas células tumorais humanas em ratinhos SCID (imunodeficiência grave combinada) para formar massas tumorais palpáveis. Os efeitos de um agente candidato na inibição do crescimento de tumores podem ser determinados como se segue. Aproximadamente lxlO7 células da linha celular CCL 221 (ATCC, Rockville, MD) , uma linha celular de adenocarcinoma do cólon humano dependente de ras, é suspensa em 100 μΐ de DMEM e injectada subcutaneamente em ratinhos SCID, de modo a que se formem dois tumores por ratinho. Os ratinhos SCID recebem células CCL 221 e os tumores são criados durante 7 dias sem tratamento; no 7o dia (Dia 0) são registados os diâmetros máximos dos tumores e os pesos dos animais. No Dia 0, é determinado o tamanho médio do tumor para os ratinhos. No Dia 1 (oito dias após a injecção de células tumorais), começou o tratamento dos ratinhos com agente candidato ou apenas veiculo. Um grupo dos ratinhos (controlos) foi injectado intraperitonealmente com 0,2 ml de veiculo e um segundo grupo de ratinhos recebeu agente através de injecção intraperitoneal. Podem ser testadas várias doses do agente em grupos separados de ratinhos. No Dia 7 e no Dia 14, é medido o peso dos animais e o diâmetro máximo dos tumores. O tamanho máximo médio dos tumores para cada grupo no Dia 0, Dia 7 e Dia 14 é comparado com o do Dia 14, seguiu-se um animal com uma dose elevada adicional para determinar se o agente produz uma inibição do crescimento tumoral dependente da dose. Os efeitos de toxicidade podem ser examinados acompanhando o peso dos ratinhos e através de colheita dos pulmões, fígados e baços dos animais para coloração histológica.

Estando o presente invento agora completamente descrito será aparente aos vulgares peritos na arte que lhe podem ser feitas muitas alterações e modificações sem se sair do âmbito das reivindicações anexas. 82 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Abo, Arie Martin, George (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PAK65 Humana (iii ) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Cooley Godward et al. (B) RUA: Five Paio Alto Square (C) CIDADE: Paio Alto

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 94306 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível COM IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DE PEDIDO: US (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 06-JAN-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Mendlein, John D., Ph.D. (B) NÚMERO DE REGISTO: 38,770 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: ONYX-006/00US (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2248 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: hPAK65 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 391..1908 83 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NQ;1 ;_

AGGGGAGGAC ACACTTCTGG CAAACGTTTC TCAAATCTGC TTCATCCAAT GTGAAGTTCA 60 TCTTGCAGCA TTTACTATGC ACAACAGAGT AACTATCGGG TCCTGTGGAC AGCTCACCTA 120

GTGGCAATGG CTCCAGGCTC CCGGACATCC CGTCTCCTGG CTTTTGCCTG CTCTGCCTGC 180

CCTGGCTTCA AGAGGCTGGT GCGTCCAAAC CGTTCCGTTA TCCAGGCTTT TTGACCACGC 240

TATGCTCCAA GCCCATGCGC GCACCAGCTG GCCATTGACA CCTACCAGGA GTTTGAAGAA 300

ACCTATATCC CAAAGGACCA GAAGTATTCA TTCCTGCATG ACTCCCAGAC CTCCTTCTGC 360

TTCTCAGACT CTATTCCGAC ACCCTCCAAC ATG GAG GAA ACG CAA CAG AAA TCC 414

Met Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser 1 5

AAT CTA GAG CTG CTG TCA GCC AAT CAC AGT TTG AAA CCT TTG CCC TCT 462

Asn Leu Glu Leu Leu Ser Ala Asn Hls Ser Leu Ly9 Pro Leu Pro ser 10 15 20

GTT CCA CAA GAG AAA AAG CCC AGG CAT AAA ATC ATC TCC ATA TTC TCA 510 84 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ val Pro Clu Glu Lys Lys Pro Arg His Lys Ile Ile Ser Ile Phe Ser 25 30 35 40 CCC ACA GAG AAA GGA AGT AAA AAG AAA GAA AAG GAA CGG CCA GAA ATT 558 Gly Thr Glu Lys Gly Ser Lys Lys Lys Glu Lys Glu Arg pro Glu Ile 45 50 55 TCT CCT CCA TCT GAT TTT GAG CAC ACC ATC CAT GTT GGC TTT GAT ACT 606 ser Pro Pro Ser Asp Phe Glu His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Thr 60 65 70 GTT ACT GGA GAA TTC ACT GGC ATG CCA GAA CAG TGG GCT CGA TTA CTA 654 Val Thr Gly -Glu Phe Thr Gly Met Pro Glu Gin Trp Ala Arg Leu Leu 75 80 85 CAG ACC TCC AAT ATC ACC AAA CTA GAG CAA AAG AAG AAT CCT CAG GCT 702 Gin Thr Ser Asn Ile Thr Lys Leu Glu Gin Lys Lys Asn Pro Gin Ala 90 95 100 GTG CTG GAT GTC CTA AAG TTC TAC GAC TCC AAC ACA GTG AAG CAG AAA 750 Val Leu Asp Val Leu Lys Phe Tyr Asp Ser Asn Thr Val Lys Gin Lys 105 110 115 120 TAT CTG AGC TTT ACT CCT CCT CAG AAA GAT CCC TTT CCT TCT CCA ACA 798 Tyr Leu Ser Phe Thr Pro Pro Glu Lys Asp Gly Phe Pro Ser Gly Thr 12S 130 135 CCA GCA CTG AAT GCC AAG GGA ACA GAA GCA CCC GCA GTA GTC ACA GAG 846 Pro Ala Leu. Asn Ala LyS Gly Thr Glu Ala Pro Ala Val Val Thr Glu 140 14b 150 GAG GAG GAT GAT GAT GAA GAG ACT GCT CCT CCC GTT ATT GCC CCG CGA 894 Glu Glu Asp Asp Asp Glu Glu Thr Ala Pro Pro Val Ile Ala Pro Arg 155 160 165 CCG CAT CAT ACA AAA TCA ATT TAC ACA CCG TCT GTA ATT GAC CCT GTT 942 85 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Pro Asp His Thr Lys Ser Ile Tyr Thr Arg Ser Val Ile Asp Pro val 170 175 180 CCT CCA CCA GTT CGT GAT TCA CAT GTT GAT GGT GCT GCC AAG TCT TTA 990 Pro Ala Pro Vai Gly Asp Ser His Val Asp Gly Ala Ala Lys Ser Leu 18S 190 195 200 ΑΤΓ? ATT -ATG GAG 1038 Asp Lya Gin Lys Lys Lys Thr Lys Met Thr Αβρ Glu. Glu Ile Met Glu 205 210 215 AAA TTA AGA ACT ATC GTG AGC ATA CGT GAC CCT AAG AAA AAA TAT ACA 1086 Lys Leu Arg Thr Ile val Ser Ile Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr 220 225 230 AGA TAT GAA AAA ATT GGA CAA GGG CCT TCT GGT ACA GTT TTC ACT GCT 1134 Arg Tyr Glu Lys Ile Gly Gin Gly Ala Ser Gly Thr Val Phe Thr Ala 235 240 245 ACT GAC GTT GCA CTG GGA CAG GAG GTT CCT ATC AAA CAA ATT AAT TTA 1182 Thr Asp Vai Ala Leu Gly Gin Glu Val Ala Ile Lys Gin Ile Asn Leu 250 255 260 CAG AAA CAG CCA AAG AAG GAA CTG ATC ATT AAC GAG ATT CTG GTG ATG 1230 Gin Lys Gin Pro Lys Ly3 Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met 265 270 27S 280 AAA 6ΆΑ TTG AAA AAT CCC AAC ATC GTT AAC TTT TTG GAC AGT TAC CTG 1278 Lys Glu Leu Lys Asn Pro Asn Ile Val Asn Phe Leu Asp ser Tyr Leu 285 290 295 GTA GGA GAT GAA TTG TTT GTG CTC ATG GAA TAC CTT GCT GGG AGG TCA 1326 Vai Gly Asp Glu Leu Phe Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Arg Ser 300 305 310 CTC ACT GAT GTG GTA ACA GAA ACG TGC ATG GAT GAA GCA CAG ATT GCT 1374 86 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Leu Thr Asp vai Val Thr Glu Thr Cys Met Asp Glu Ala Gin Ile Ala 315 320 325 GCT GTA TGC AGA GAG TGT TTA CAG GCA TTG GAG TTT TTA CAT GCT AAT 1422 , Ala Vai Cya Arg Glu Cys Leu Gin Ala Leu Glu Phe Leu His Ala Asn 330 335 340 CAA GTG ATC CAC AGA GAC ATC AAA AGT GAC AAT GTA CTT TTG GGA ATG 1470 Gin Vai Ile Hia Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Val Leu Leu Gly Met 345 350 355 360 GAA GGA TCT GTT AAG CTC ACT GAC TTT GGT TTC TGT GCC CAG ATC ACC 1518 Glu Gly Ser Vai Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gin Ile Thr 36S 370 375

CCT OAG CAG AOC AAA CGC AGT ACC ATG GTC GGA ACG CCA TAC TOO ATG

1566 Pro Glu GCA CCA 1614 Ala Pro Gin GAG Glu 395 Ser 380 GTG Val Lys GTT Val Arg ACA Thr Ser CGG Arg Thr AAA Lys 400 Met 385 GCT Ala Val TAT Tyr Gly GGC Gly Thr CCT Pro Pro AAA Lya 405 Tyr Trp Met 390 CTC GAC ATA Val Asp Ile TGG TCT CTO GGT ATC ATG GCT ATT GAG ATG GTA GAA GGA GAG CCT CCA 1662 Trp Ser Leu Gly Ile Met Ala Ile Glu Met val Glu Gly Glu Pro Pro 410 415 420 TAC CTC AAT GAA AAT CCC CTT AGG GCC TTG TAC CTA ATA CCA ACT AAT 1710 Tyr Leu Asn Glu Asn Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn 425 430 435 440 GGA ACC CCA GAA CTT CAG AAT CCA GAG AAA CTT TCC CCA ATA TTT CGG 1758 Gly Thr Pro Glu Leu Gin Asn Pro Glu Lys Leu Ser Pro Ile Phe Arg 445 450 455 GAT TTC TTA AAT CGA TGT TTG GAA ATG GAT GTG GAA AAA AGG CCT TCA 1806 87 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ Αβρ Phe Leu Αβη Arg Cya Leu Glu Met Aap vai Glu Lye Arg Cly Ser 460 465 470 GCC AAA GAA TTA TTA CAG CAT CCT TTC CTG AAA CTG GCC AAA CCG TTA 1854

Ala Lye Glu Leu Leu Gin His Pro Phe Leu Lye Leu Ala Ly9 Pro Leu 475 480 48S TCT AGC TTG ACA CCA CTG ATC ATG GCA GCT AAA GAA GCA ATG AAG AGT 1902

Ser Ser Leu Thr Pro Leu Ile Met Ala Ala Lye Glu Ala Met Lye Ser 490 495 500 AAC CGT TAACATCACT CCTGTGGCCT CATACTCTTT TTTCCATTTT CTACAAGAAG 1958

Asn Arg__

SOS CCTTTTAGTA TATGAAAATT ATTACTCTTT TTGGGGTTTA AAGAAATGGT CTGCATAACC 2018 TGAATGAAAG AAGCAAATGA CTATTCTCTG AAGACAACCA AGAGAAAATT GCAAAAAGAC 2078 AAGTATGACT TTTATATGAA CCCCTTCTTT AGGGTCCACA AGGAATTGTG GACTGAATÇA 2138 CTAGCCTTAG GTCTTTCAGC AAACAGCCTA TCAGGGCCAT TTATCATGTG TGAGATTTGC 2198 ATTTTACTTT GCTGACTTTG TTGTAATAGA TCCCATTCAT TGTCCCCTTT 2248 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 506 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 88 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NO;2;

Met Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Ser Ala Α9Π 1 5 10 15 His Ser Leu Lys Pro Leu Pro Ser Val Pro Glu Glu Lys Lys Pro Arg 20 25 30 HÍ8 Lys ile Ile Ser Ile Phe ser Gly Thr Glu Lys Gly ser Lys Lys 35 40 45 Lys Glu Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Pro Pro Ser Asp Phe Glu His 50 S5 60 Thr Ile His Vai Gly Phe Asp Thr Val Thr Gly Glu Phe Thr Gly Met 65 70 75 80 Pro Glu Gin Trp Ala Arg Leu Leu Gin Thr Ser Asn Ile Thr Lys Leu SS 90 95 Glu Gin Lys Lys Asn- Pro Gin Ala Val Leu Asp Val Leu Lys Phe Tyr 100 105 110 Asp Ser Asn Thr Val Lys Gin Lys Tyr Leu Ser Phe Thr Pro Pro Glu 115 120 125 Lys Asp Gly Phe Pro Ser Gly Thr Pro Ala Leu Asn Ala Lys Gly Thr 130 135 140 Glu Ala Pro Ala Val Val Thr Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Glu Thr 145 150 155 160 Ala Pro Pro Val Ile Ala Pro Arg Pro Asp HiS Thr Lys Ser Ile Tyr 165 170 175 Thr Arg Ser Vai Ile Asp Pro Val Pro Ala Pro Val Gly Asp Ser His 180 ias 190 Vai Asp Gly Ala Ala Lys Ser Leu Asp Lys Gin Lys Lys Lys Thr Lys 195 200 20S Met Thr Asp Glu Glu Ile Met Glu Lys Leu Arg Thr Ile Val Ser Ile 210 215 220 Gly Αβρ Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg Tyr Glu Lys Ile Gly Gin Gly 225 230 235 240 89 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ

Ala Ser Gly Thr val Phe Thr Ala Thr Aep Val Ala Leu Gly Gin Glu 245 250 2SS Vai Ala Ile Lys Gin Ile Asn Leu Gin Lys Gin Pro Lys Lys Glu Leu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Ile Leu val Met Lys Glu Leu Lys Asn Pro Asn Ile 275 280 28S Vai Asn Phe Leu Asp Ser Tyr Leu Val Cly Asp Glu Leu Phe Val Val 290 295 300 Met Glu Tyr Leu Ala Gly Arg Ser Leu Thr Asp val val Thr Clu Thr 30S 310 315 320 Cya Met Asp Glu Ala Gin Ile Ala Ala Val Cys Arg Glu Cys Leu Gin 325 330 335 Ala Leu Glu Phe Leu His Ala Asn Gin Val Ile His Arg Asp Ile Lys 340 345 350 Ser Asp Asn Vai Leu Leu Cly Met Glu Gly Ser val Lys Leu Thr Asp 355 360 36S Phe Gly Phe Cys Ala Gin Ile Thr Pro Glu Gin Ser Lys Arg Ser Thr 370 375 380 Met Vai Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu Val Val Thr Arg Lys 185 390 395 400 Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Met Ala Ile 405 410 415 Glu Met Vai Glu Gly Glu Pro Pro Tyr Leu Asn Glu Asn Pro Leu Arg 420 425 430 Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly Thr Pro Glu Leu Gin Asn Pro 435 440 445 Glu Lys Leu Sar Pro Ile Phe Arg Asp Phe Leu Asn Arg Cye Leu Glu 450 455 460 Met Asp Vai Glu Lys Arg Gly Ser Ala Lys Glu Leu Leu Gin His Pro 465 470 475 480 Phe Leu Lys Leu Ala Lys Pro Leu Ser Ser Leu Thr Pro Leu Ile Met 485 490 495 Ala Ala Lys Glu Ala Met Lys Ser Asn Arg 500 505 ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 90

Lisboa, 2009-02-17

Claims (15)

1. ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada purificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína serina-quinase p65 activada pela proteína p21 humana (hPAK65) ou um seu fragmento compreendendo um ou mais domínios estruturais ou funcionais da proteína hPAK65, seleccionada de entre o grupo: a) a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:l; b) a sequência de ácido nucleico contendo substituições de codões degenerados dentro da sequência de codificação da proteína PAK65 de SEQ ID NO:l; c) sequências de ácido nucleico variantes possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:l ao longo de todo o seu comprimento e resultando em polipéptidos hPAK65 que retêm a função de uma proteína hPAK65; e d) uma sequência de ácido nucleico capaz de codificar a sequência de aminoácidos da proteína hPAK65 de SEQ ID NO: 2 .
2. 2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1 em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ADNc codificando a proteína hPAK65 tal como mostrada em SEQ ID NO:l.
3. 3. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a referida sequência complementar é homóloga a toda a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2.
4. 4. Fragmento de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 codificando um polipéptido compreendendo pelo menos 70 aminoácidos, em que o referido polipéptido é capaz de se ligar de modo específico a um polipéptido p21 ou retém a actividade de quinase de hPAK65. ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 2/3
5. 5. Fragmento de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 codificando a sequência de aminoácidos da proteína hPAK65 de 49-113 de SEQ ID NO: 2 ou codificando a sequência de aminoácidos da proteína hPAK65 de SEQ ID NO:10 ou codificando a sequência de aminoácidos da proteína hPAK65 de 1 a 481 de SEQ ID NO:2.
6. 6. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
7. 7. Célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um vector de acordo com a reivindicação 6.
8. 8. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7 em que a molécula de ácido nucleico está (a) em associação operativa com uma sequência de controlo da expressão capaz de dirigir a expressão da referida molécula ou está (b) opcionalmente interrompida, codifica hPAK65 e é flanqueada por pelo menos uma sequência de ADN de tipo não selvagem 5' a 3' da sequência de codificação de hPAK65.
9. 9. Polipéptido hPAK65 compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
10. 10. Polipéptido hPAK65 possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência tal como mostrada em SEQ ID NO:2 ao longo de todo o seu comprimento.
11. 11. Polipéptido hPAK65 possuindo uma sequência de aminoácidos tal como mostrada em SEQ ID NO:2.
12. 12. Polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos do aminoácido 49 ao 113 de SEQ ID NO:2.
13. 13. Processo para produção de polipéptido hPAK65, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7 ou a reivindicação 8 num meio de cultura adequado e o isolamento do polipéptido hPAK65. ΕΡ Ο 802 921/ΡΤ 3/3
14. 14. Método para identificação de um composto que iniba a actividade de quinase da proteína hPAK65, compreendendo o referido método a administração de um composto a uma mistura reaccional compreendendo um polipéptido hPAK65 de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12 possuindo actividade de serina-quinase; um substrato da quinase hPAK65 substancialmente purificado; e ATP marcado; e a determinação da extensão em que o composto inibe a fosforilação do substrato de hPAK65 em comparação com uma reacção de controlo sem o composto.
15. 15. Método para identificação de agentes que inibam a actividade de ligação a p21 da proteína hPAK65, compreendendo o referido método a administração de um agente misturado com uma proteína p21 substancialmente purificada a uma mistura reaccional compreendendo um polipéptido hPAK65 de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12 possuindo actividade de ligação a racl, e a determinação da extensão em que o agente inibe a ligação da proteína p21 ao polipéptido hPAK65 em comparação com uma reacção de controlo sem o agente. Lisboa, 2009-02-17