JPH10510268A - ニューロメジンｂ受容体拮抗薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式（Ｉ） で示される環状オクタペプチドであって、式中、Ａ¹は、Ｄ−Ｎａｌ又はＤ−Ｔｒｐ：Ａ³は、Ｐｈｅ、Ｆ₅−Ｐｈｅ又はＸ−Ｐｈｅ（Ｘは、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＨ₃又はＯＨ）；Ａ⁵は、−ＮＨ−ＣＨ（Ｙ）−ＣＯ−［Ｙは、（ＣＨ₂）_m−Ｒ₄−Ｎ（Ｒ₆）（Ｒ₆）又は（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄−ＮＨ−Ｃ（Ｒ₇）−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆）］；Ａ⁶は、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｍｅ−Ｔｒｐ、Ｂｐａ、Ｆ₅−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ又はＸ−Ｐｈｅ（Ｘは、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＨ₃又はＯＨ）のＤ−又はＬ−異性体；Ａ⁸は、Ｎａｌ又はＴｒｐ：ｍは、１、２又は３；ｎは、１、２、３、４又は５；Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ、独立に、Ｈ、Ｅ、ＣＯＥ又はＣＯＯＥ［Ｅは、（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₁₂）アルケニル、（Ｃ₂〜Ｃ₁₂）アルキニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ₇〜Ｃ₁₂）フェニルアルキルもしくはアルキルフェニル、（Ｃ₈〜Ｃ₁₂）フェニルアルケニルもしくはアルケニルフェニル、（Ｃ₈〜Ｃ₁₂）フェニルアルキニルもしくはアルキニルフェニル、（Ｃ₁₁〜Ｃ₂₀）ナフチルアルキルもしくはアルキルナフチル、（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルケニルもしくはアルケニルナフチル、又は（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルキニルもしくはアルキニルナフチルであるが、Ｒ₁又はＲ₂の一方がＣＯＥもしくはＣＯＯＥであるときは、他方はＨでなければならない］；Ｒ₄は、Ｃ₆Ｈ₄又は不在；Ｒ₇は、＝ＮＲ₈、＝Ｓ又は＝Ｏ；そしてＲ₃、Ｒ₅、Ｒ₆及びＲ₈はそれぞれ、独立に、Ｈ又はＥである。

Description

【発明の詳細な説明】 ニューロメジンＢ受容体拮抗薬 連邦に後援された研究に関する声明 本発明は、米国国立衛生研究所からの資金援助（交付金第ＣＡ45153 号）でな された。従って、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。 関連出願に対する相互参照 本願は、1992年７月27日に出願され、放棄されている米国特許願第07/919,537 号の一部継続出願である、現在係属中の1993年６月17日に出願された米国特許願 第08/078,419号の一部継続出願である。 発明の背景 哺乳動物のボンベシン（Ｂｎ）関連ペプチド、ガストリン放出ペプチド（ＧＲ Ｐ）、ニューロメジンＢ（ＮＭＢ）及びニューロメジンＣ（ＮＭＣ）は、広範囲 の生物学的効果を有する。これらは、化学走性、平滑筋収縮の刺激、及び多数の 胃腸ホルモンの放出を包含する。ＧＲＰ及びＮＭＢは、中枢神経系においても活 性であり、体温調節、行動への効果、飽満、概日リズムの維持、及びＴＳＨ放出 の阻害に影響を及ぼす。Ｂｎ関連ペプチドは、多数の正常細胞（例えば、目、上 皮及び神経内分泌の細胞）や、ヒトの肺小細胞癌細胞、肺非小細胞癌細胞、ラッ ト肝細胞腫瘍細胞、前立腺細胞及び乳腺癌細胞のような新生物細胞で、成長因子 として機能する。 構造及びクローニングの最近の研究は、Ｂｎ関連ペプチドが二つの別個の受容 体群の作用を仲介することを立証している。ＧＲＰ優先性の群又はサブタイプ（ ＧＲＰ受容体又はＧＲＰ−Ｒ）に対して、ＧＲＰは高い親和性を有し、ＮＭＢは 低い親和性を有する。逆に、他方の分類群、すなわちＮＭＢ優先性サブタイプ （ＮＭＢ受容体又はＮＭＢ−Ｒ）に対しては、ＧＲＰは低い親和性を有し、ＮＭ Ｂは高い親和性を有する。両受容体群とも、中枢神経系及び胃腸管の全体にわた って存在する。 天然のソマトスタチン、すなわちソマトスタチン−１４（ＳＳ−１４）は、ボ ンベシン受容体を有することが公知である３Ｔ３細胞やヒトの肺小細胞癌細胞の 、トリトン（商標）抽出物中の１２０ｋＤタンパク質との¹²⁵Ｉ−ＧＲＰの架橋 結合を阻害することが示されている。最近では、Ｏrbuch他,Ｍol.Ｐharmacol.,4 4 : 841(1993)において、ソマトスタチンのオクタペプチド類似体の、ＮＭＢ−Ｒ に対する結合親和性も立証されている。しかし、これらの類似体は、ソマトスタ チン受容体に対する実質的な活性も維持している。 発明の概要 略号 Ｎａｌ＝３−（２−ナフチル）アラニン又は３−（１−ナフチル）アラニン Ｂｐａ＝３−（４−ビフェニル）アラニン Ｘ−Ｐｈｅ＝ｐ−、ｏ−又はｍ−置換基、例えば−ＯＨ、ＣＨ₃、ＮＯ₂及びハ ロゲンをフェニル環に有するフェニルアラニン、例えば３−（４−クロロフェニ ル）アラニン Ｆ₅Ｐｈｅ＝３−（ペンタフルオロフェニル）アラニン Ｎｌｅ＝ノルロイシン Ｍｅ−Ｔｒｐ＝メチル置換されたインドリル窒素を有するＴｒｐ Ｄａｂ＝２，４＝ジアミノ酪酸 Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸 本発明は、ＮＭＢ受容体に対する高い親和性と高い選択性との双方を有し、下 記の式（Ｉ）： に包含される環状オクタペプチドに関する。 Ａ¹は、Ｎａｌ又はＴｒｐのＤ−異性体であり、好ましくはＤ−Ｎａｌである。 Ａ³は、Ｆ₅−Ｐｈｅ、又はｏ−、ｐ−もしくはｍ−置換Ｘ−Ｐｈｅであり、ここ で、Ｘは、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＨ₃又はＯＨである。Ａ³は、好ましくは、Ｐｈ ｅ又はｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅであり、ここでＸは、Ｃｌ、Ｆ又はＯＨである。Ａ⁵ は、−ＮＨ−ＣＨ（Ｙ）−ＣＯ−［Ｙは、（ＣＨ₂）_m−Ｒ₄−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆） 又は（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄−ＮＨ−Ｃ（Ｒ₇）−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆）］である。一態様で は、Ａ⁵は、−ＮＨ−ＣＨ（Ｙ）−ＣＯ−［Ｙは、（ＣＨ₂）_m−Ｒ₄−Ｎ（Ｒ₅） （Ｒ₆）］であり、好ましくはＯｒｎ、Ｄａｂ、７−アミノフェニルアラニン及 び２，３−ジアミノプロピオン酸である。別の態様では、Ａ⁵は、−ＮＨ−ＣＨ （Ｙ）−ＣＯ−［Ｙは、（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄−ＮＨ−Ｃ（Ｒ₇）−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆） ］であり、好ましくはＡｒｇ又は７−グアニジルフェニルアラニンである。Ａ⁶ は、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｍｅ−Ｔｒｐ 、Ａｂｕ、Ｂｐａ、Ｐｈｅ、Ｆ₅−Ｐｈｅ又はＸ−Ｐｈｅ（Ｘは、ハロゲン、Ｎ Ｏ₂、ＣＨ₃又はＯＨ）のＤ−又はＬ−異性体である。Ａ⁶は、好ましくは、Ｔｈ ｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ及びＡｂｕのＤ−又はＬ−異性体 である。Ａ⁸は、Ｎａｌ又はＴｒｐであり、好ましくはＮａｌである。下付き文 字ｍは１、２又は３、好ましくは、２又は３であり；ｎは１、２、３、４又は５ 、好ましくは、２、３又は４である。Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ、独立に、Ｈ、Ｅ、 ＣＯＥ又はＣＯＯＥである。Ｅは、置換又は非置換の；飽和又は不飽和の；直鎖 又は分枝鎖の；環状、非環状又は多環の；１〜２５個の炭素原子を有する炭化水 素である。Ｅの例は、（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₁₂）アルケニル、（Ｃ₂ 〜Ｃ₁₂）アルキニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ₇〜Ｃ₁₂）フェニルアルキルも しくはアルキルフェニル、（Ｃ₈〜Ｃ₁₂）フェニルアルケニルもしくはアルケニ ルフェニル、（Ｃ₈〜Ｃ₁₂）フェ ニルアルキニルもしくはアルキニルフェニル、（Ｃ₁₁〜Ｃ₂₀）ナフチルアルキル もしくはアルキルナフチル、（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルケニルもしくはアルケ ニルナフチル、又は（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルキニルもしくはナフチルアルキ ニルであるが、Ｒ₁又はＲ₂の一方がＣＯＥもしくはＣＯＯＥであるときは、他方 はＨでなければならない。Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈はそれぞれ、独立に、Ｈ又はＥで ある。Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆及びＲ₈はそれぞれ、好ましくはＨ又は（Ｃ₁〜Ｃ₁₀）炭化 水素、例えば、アルキル、アルケニル、アルキルフェニル、フェニル及び（Ｃ₁ 〜Ｃ₅）アルキルを含むフェニルアルキルである。Ｒ₅及びＲ₆はそれぞれ、より 好ましくはＨである。Ｒ₄は、Ｃ₆Ｈ₄又は不在であり、好ましくは不在である。 Ｒ₇は、＝ＮＲ₈、＝Ｓ又は＝Ｏであり、好ましくは＝ＮＲ₈であり、より好まし くは、Ｒ₇は＝ＮＨである。本発明の上記の式（Ｉ）が包含する好適なオクタペ プチドは、Ｈ₂−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ−Ｎａｌ−ＮＨ₂（ペプチドＡｒｇ⁵）；Ｈ₂−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙ ｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄａｂ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−ＮＨ₂（ペプチドＤａｂ⁵） ；及びＨ₂−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｃｙ ｓ−Ｎａｌ−ＮＨ₂（ペプチドＯｒｎ⁵）を包含する。 式（Ｉ）では、ポリペプチド鎖の慣用の表示法に従い、Ｎ末端は左方にあり、 Ｃ末端は右方にある。ペプチド配列中の記号Ａ¹、Ａ²などは、アミノ酸残基を意 味する、すなわち、Ｎ末端にあるときは、＝Ｎ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−であり、Ｎ 末端にないときは、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−であり、ここで、Ｒは、そのア ミノ酸残基の側鎖を表す。従って、Ｖａｌについては、Ｒは−ＣＨ（ＣＨ₃）₂で ある。また、アミノ酸残基が光学的に活性であるときは、Ｄ形が明示的に指定さ れなていない限り、意図されるのはＬ形立体配置である。式（Ｉ）中の二つのＣ ｙｓ残基（すなわちＡ²とＡ⁷）は、ジスルフィド結合を介して互いに結合してい ることに留意されたい。しかし、簡便のため、二つのＣｙｓ残基間のジスルフィ ド結合を示すために慣用的に用いられている直線は、本明細書では省略されてい る。ＣＯＥは−（Ｃ＝Ｏ）−Ｅを表し、ＣＯＯＥは−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｅを表す 。 ＮＭＢに仲介される生化学的活性からその障害が生じる患者への、製薬上許容 され得る、式（Ｉ）に網羅されるオクタペプチドの塩の投与も、本発明の範囲内 にある。換言すると、該オクタペプチドは、酸付加塩のような製薬上許容され得 る塩、又は亜鉛もしくは鉄等を含む金属錯体の形態で与えることができる。酸付 加塩の例は、（ｉ）酢酸、乳酸、パモ酸（pamoic acid）、マレイン酸、クエン 酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン 酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸又はトルエンスルホン酸のような有 機酸とで形成される酸付加塩；（ii）タンニン酸又はカルボキシメチルセルロー スのような重合体の酸とで形成される酸付加塩；及び(iii)塩酸、臭化水素酸、 硫酸又はリン酸のような無機酸とで形成される酸付加塩である。 本発明のその他の特徴及び利点は、以下に示す好ましい実施形態の記載及び添 付された請求の範囲からも明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 まず、図面を簡単に説明する。 図１は、本発明の類似体による、ＮＭＢで刺激された食物摂取の抑制を示すグ ラフである。 図２は、本発明の類似体による、ＮＭＣで刺激された食物摂取の抑制を示すグ ラフである。 好ましい実施形態の説明 本発明のオクタペプチドは、メチルベンズヒドリルアミン樹脂上で、標準的な 固相での手順を用いて合成され、フッ化水素／アニソール混合物で切断する。こ のペプチドを、９０％希酢酸溶液中で、Ｉ₂での滴定によって環化し、５０％酢 酸中、セファデックス（商標）Ｇ−２５（Ａldrich,ウィスコンシン州ミルウォ ーキー）でのゲル濾過、及びアセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸緩衝液 を用いたＣ１８シリカでの勾配溶出によって精製する。例えば、Ｓasaki,Ｙ.他, Ｊ.Ｍe d.Ｃhem.,30:1162(1987); Ｓtewart,Ｊ.Ｍ.他,Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthe sis第２版,Ｐierce Ｃhemical Ｃo.,イリノイ州Ｒockford(1984); 及びＣoy,Ｄ. Ｈ.他,Ｔetrahedron,44: 835(1988)を参照されたい。薄層クロマトグラフィー（ ＴＬＣ」）、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及び質量分析によって均質性を評価す る。好ましくは、均質性は、各ペプチドについて＞９６％であると決定されなけ ればならない。下記の実施例１は、ペプチドＤａｂ⁵の合成に関する詳細な説明 である。本発明のその他のペプチドは、本明細書に開示された合成方法に、当業 者の能力の範囲内での適切な変更を加えることによって調製することができる。 本発明のＮＭＢ類似体を結合アッセイでふるい分けして、ＮＭＢ、ＧＲＰ及び ソマトスタチン受容体に対するそれらのそれぞれの親和性を決定する。それぞれ 、実施例２、３及び４を参照されたい。ＮＭＢ受容体の作動薬は、イノシトール リン酸の生成を刺激することが示されている［Ｗang他,Ｊ.Ｂiochem.,286: 641- 648(1992)］。下記の実施例５では、イノシトールリン酸代謝回転アッセイによ り、ＮＭＢ類似体の、ＮＭＢ受容体活性化に拮抗できる能力が測定された。下記 の実施例６では、インビボアッセイにより、本発明のＮＭＢ類似体の、ＮＭＢが 生起する食物摂取の抑制を遮断できる能力が立証された。 本発明のＮＭＢ類似体は、ＮＭＢ受容体の強い拮抗薬として働く。ＮＭＢは、 癌細胞系の増殖を刺激することが示されている［Ｍoody他,Ｊ.Ｐharmacol.,2631 (1992)；Ｗang他,Ｂiochem.Ｊ.,286: 641(1992)］。ＮＭＢ拮抗薬として、本発 明の類似体は、肺小細胞腫瘍や膠芽腫のような癌を治療するのに用いることがで きる。加えて、ＮＭＢは、食物摂取を抑制することが示されている（Ｋirkman他 、Ｓociety for the Ｓtudy of Ｉngestive Ｂehavior、カナダ国トロント）。 本発明の類似体は、食欲不振、又は癌もしくはエイズから生じる食欲不振のよう な摂食障害を治療するために、食物摂取を刺激するのに使用され得る。更に、Ｎ ＭＢは、ガストリン放出を低下させることも示されている［Ｋawai他,Ｅndocrin ol.Ｊapan,37(6): 857(1990)］。従って、本発明の類似体は、充分な量のガスト リンを産生していない患者でのガストリン放出を刺激するために用いることがで きる。 本発明の類似体は、ＮＭＢ受容体に対して高度に選択的でもある。従って、本 発明の類似体は、これらの受容体の双方との低下した交差反応性を有すると思わ れる。例えば、ソマトスタチン受容体のその他の作動薬は、この作動薬がインシ ュリン放出を阻害することによって、成長ホルモンの放出を阻害するか、又は炭 水化物代謝を妨げる可能性がある。 上記の疾患を治療するための、本発明の化合物の用量は、投与の方式、被験体 の年齢や体重、及び治療しようとする被験体の状態に応じて変動し、最終的には 、主治医又は獣医が決定することになる。主治医又は獣医が決定するような活性 化合物の量を、本明細書では、「治療有効量」と呼ぶ。 処方物は、単位剤形（unit dosage form）で表され、製薬業界において周知の 方法のいずれかを用いて調製される。該方法のすべては、活性成分を、１種類又 はそれ以上の補助的成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、錠剤又 は散剤の処方物は、活性成分を微細に粉砕した固体担体と均一かつ密に混合し、 次いで、錠剤の場合のように、必要ならば、生成物を所望の形状及びサイズに成 形することによって調製される。 更に詳述しなくても、本明細書の記載に基づいて、当業者は、本発明をその完 全な程度にまで利用できるものと考えられる。従って、以下に記載する特定の実 施形態は、単に例示のみの目的であり、本発明の開示の残りの部分をいかなる方 法によっても限定するものではないと解されなければならない。本明細書に引用 された刊行物はすべて、参考として援用される。 実施例１ Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｓ−メチルベンジル−Ｃｙｓ−Ｏ−ブロモベンジル−オ キシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄａｂ −Ｖａｌ−Ｓ−メチルベンジル−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−ベンズヒドリルアミン樹脂の 合成は、下記のとおり実施された。塩化物イオンの状態であるベンズヒドリルア ミン−ポリスチレン樹脂（Ａdvanced Ｃhem Ｔech,Ｉnc.,ケンタッキー州ルイズ ビル） （０．７ｇ、０．３ミリモル）を、下記の反応周期：すなわち（ａ）塩化メチレ ン；（ｂ）塩化メチレン中の３３％トリフルオロ酢酸（それぞれ１及び２５分間 ずつ２回）；（ｃ）塩化メチレン；（ｄ）エタノール；（ｅ）塩化メチレン；（ ｆ）クロロホルム中の１０％トリエチルアミン、を実施するようにプログラミン グされた Ａdvanced Ｃhem Ｔech（商標）ペプチド合成装置の反応容器に入れた 。 中和した樹脂を、塩化メチレン中のtert−ブチルオキシカルボニル（「Ｂｏｃ 」）−Ｎａｌ及びジイソプロピルカルボジイミド（各１．５ミリモル）とともに １時間攪拌し、次いで、得られたアミノ酸樹脂を上記の洗浄プログラムの段階（ ａ）〜（ｆ）の周期に付した。次いで、同じ手順によって、下記のアミノ酸（０ ．９ミリモル）を逐次結合させた：Ｂｏｃ−Ｓ−メチルベンジル−Ｃｙｓ、Ｖａ ｌ、Ｂｏｃ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄａｂ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ、Ｂ ｏｃ−Ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ、並びにＢｏｃ−Ｓ−メチ ル−ベンジル−Ｃｙｓ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ。洗浄及び乾燥後、完成した樹脂 は１．１３ｇの重量であった。 完成した樹脂を用い、Ｈ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ −Ｄａｂ−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−ＮＨ₂を調製した。上記で得られたペプチド樹脂（ １．１３ｇ、０．５ミリモル）を、アニソール（５ml）、ジチオトレイトール（ １００mg）及び無水フッ化水素（３５ml）と０℃で混合し、４５分間攪拌した。 過剰なフッ化水素を、乾燥窒素の気流下で急速に蒸発させた。遊離ペプチドをエ ーテルで沈澱させ、かつ洗浄した。次いで、未精製ペプチドを９０％酢酸２５０ ml に溶解し、それにＩ₂／ＭｅＯＨの濃縮溶液を、永続的な褐色が認められるま で加えた。アスコルビン酸の添加によって、過剰なＩ₂を除去し、蒸発によって 、溶液を少量にまで減量した。この未精製ペプチド溶液を、セファデックス（商 標）Ｇ−２５のカラム（２．５×９０cm）にかけ、５０％酢酸で溶出させた。次 いで、ＵＶ吸収及びＴＬＣによって主成分を含有していることが判明したフラク ションを集め、蒸発によって少量にまで減量し、ＶＹＤＡＣ（商標）オクタデシ ルシランシリカ（１０〜１５μ）（Ｖydac,カリフォルニア州Ｈesperia）のカラ ム （１．５×７０cm）にかけ、次いで、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液へのアセ トニトリルを一定割合で増量しながら溶出した。フラクションはＴＬＣと分析高 性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とによって分析され、最高純度を与え るように集められた。 水からの溶液の反復的な凍結乾燥によって、白色の綿毛状粉末の生成物９７ｍ ｇが得られた。ＨＰＬＣ及びＴＬＣによって、生成物は均質であると判明した。 酸水解物のアミノ酸分析、及びＦＡＢ−ＭＳによって、オクタペプチドの組成が 確認された。 実施例２ ＮＭＢ受容体の結合アッセイ ラットＮＭＢ受容体をＢＡＬＢ−３Ｔ３線維芽細胞にトランスフェクションす る手法が、Ｗada他,Ｎeuron.,6: 4221-430(1991)及びＢenya他,Ｍol.Ｐharmacol .,42; 1058(1992)に考察されている。ＮＭＢ受容体結合アッセイに使用される膜 は、ラットＮＭＢ受容体でトランスフェクションしたＢＡＬＢ−３Ｔ３線維芽細 胞を、氷冷した５０mＭトリス−塩酸（緩衝液Ａ）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズー リ州セントルイス）中でＰＯＬＹＴＲＯＮ（商標）組織ホモジナイザー（Ｂrink man,ニューヨーク州Ｗestbury）を用いて均質化し（６に設定して１５秒）、新 鮮な緩衝液Ａへの再懸濁を中間に挟んで、39,000×ｇ（１０分）で２回遠心分離 することによって得られた。最終的なペレットを、０．１mg/ml のバシトラシン （Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントルイス）及び０．１％ウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）を含有する５０mＭトリス−塩酸（緩衝液Ｂ）（Ｓigma Ｃhemicals ,ミズーリ州セントルイス）に再懸濁させ、氷上に保って受容体結合アッセイに 供した。アリコート（０．４ml）を、非標識ＮＭＢ類似体０．０５mlを加えた、 及び加えない緩衝液Ｂへの［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ボンベシン（〜2200Ｃi/ミリモル ）（Ｎew Ｅngland Ｎuclear,マサチューセッツ州ボストン）０．０５mlととも にインキュベ ートした。３０分間インキュベーション（４℃）した後、結合した［¹²⁵Ｉ−Ｔ ｙｒ⁴］ボンベシンを、Ｂrandel濾過マニホールド（Ｂrandel,メリーランド州Ｇ aithersberg）を用いて、予め０．３％ポリエチレンイミンに浸漬しておいたワ ットマン（商標）ＧＦ／Ｂフィルターを通す高速濾過によって、遊離状態のもの と分離した。次いで、氷冷緩衝液Ａのアリコート５mlでフィルターを３回洗浄し た。特異的結合は、結合した［¹²⁵Ｉ］ボンベシンの総量から、１μＭの非標識 ＮＭＢの存在下で結合したそれの量を減じたものとして定義した。本発明の類似 体は、ＮＭＢ受容体に対する高い結合親和性を有した。本発明の３種類の類似体 についてのＮＭＢ受容体結合アッセイの結果の例は、（nＭでのＫ_i値で）４７． ４±１０．３（ペプチドＡｒｇ⁵）、８５．１±２．７（ペプチドＤａｂ⁵）及び ６９．９±７．１（ペプチドＯｒｎ⁵）であった。 実施例３ ＧＲＰ受容体の結合アッセイ ＧＲＰ受容体結合アッセイに使用される膜は、培養ＡＲ４２Ｊ細胞を、氷冷し た５０mＭトリス−塩酸（緩衝液Ａ）中でＰolytron（商標）組織ホモジナイザー を用いて均質化し（６に設定して１５秒）、新鮮な緩衝液Ａへの再懸濁を中間に 挟んで、39,000×ｇ（１０分）で２回遠心分離することによって得られた。最終 的なペレットを、０．１mg/mlのバシトラシン及び０．１％ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）を含有する５０mＭトリス−ＨＣｌ（緩衝液Ｂ）に再懸濁させ、氷上 に保ってＧＲＰ受容体結合アッセイに供した。アリコート（０．４ml）を、非標 識ＮＭＢ類似体０．０５mlを加えた、及び加えない緩衝液Ｂへの［¹²⁵Ｉ−Ｔｙ ｒ⁴］ボンベシン（〜2200Ｃi/ミリモル）０．０５mlとともにインキュベートし た。３０分間インキュベーション（４℃）した後、結合した［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ ボンベシンを、Ｂrandel（商標）濾過マニホールドを用いて、予め０．３％ポリ エチレンイミンに浸漬しておいたワットマン（商標）ＧＦ／Ｂフィルター を通す高速濾過によって、遊離状態のものと分離した。次いで、氷冷緩衝液Ａの アリコート５mlでフィルターを３回洗浄した。特異的結合は、結合した［¹²⁵Ｉ −Ｔｙｒ⁴］ボンベシンの総量から、１μＭの非標識ＧＲＰの存在下で結合した それの量を減じたものとして定義した。本発明の類似体は、ＧＲＰ受容体に対す る弱い結合親和性を有した。本発明の類似体についてのＧＲＰ受容体結合アッセ イの結果の例は、（nＭでのＫ_i値で）2921±250（ペプチドＡｒｇ⁵）及び2632± 216（ペプチドＤａｂ⁵）であった。Ｏｒｎは、Ｋ_i値＞10,000で、特に弱い親和 性を有した。 実施例４ ソマトスタチン受容体の結合アッセイ ソマトスタチン受容体結合アッセイに使用される膜は、培養ＡＲ４２Ｊ膵腺房 細胞を、氷冷した５０mＭトリス−塩酸（緩衝液Ａ）中でＰolytron（商標）組織 ホモジナイザーを用いて均質化し（６に設定して１５秒）、新鮮な緩衝液Ａへの 再懸濁を中間に挟んで、39,000×ｇ（１０分）で２回遠心分離することによって 得られた。最終的なペレットを１０mＭトリス−塩酸に再懸濁させて、受容体結 合アッセイに供した。Ｋ_i値の決定のために、様々な濃度のＮＭＢ類似体を、Ｂ ＳＡ（フラクションＶ）（１０mg/ml）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セント ルイス）、ＭgＣｌ₂（５mＭ）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントルイス） 、アプロチニン（２００ＫＩＵ/ml）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントル イス）、バシトラシン（０．０２mg/ml）及びフッ化フェニルメチルスルホニル （０．０２mg/ml）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントルイス）を含有する ５０mＭのＨＥＰＥＳ（pＨ７．４）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントルイ ス）への約０．０５nＭの［¹²⁵Ｉ］ＭＫ−６７８（アリゾナ大学医学部、アリゾ ナ州Ｔucson）とともに、２５℃で９０分間インキュベートした。最終的なアッ セイ体積は、０．３mlであった。ＢＲＡＮＤＥＬ（商標）濾過マニホールドを用 いた、Ｇ Ｆ／Ｃフィルター（０．３％ポリエチレンイミンに予め浸漬）を通す高速濾過に よって、インキュベーションを終了させた。次いで、氷冷緩衝液のアリコート５ mlで各管とフィルターを３回洗浄した。特異的結合は、結合した［¹²⁵Ｉ］ＭＫ −６７８の総量から、２００nＭのＭＫ−６７８の存在下で結合したそれの量を 減じたものとして定義した。公知の環状オクタペプチドであるＤ−Ｎａｌ−Ｃｙ ｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−ＮＨ₂（Ｌｙｓ⁵） は、Ｏrbuch他，Ｍol.Ｐharmacol.,44: 841(1993)に開示され、ソマトスタチン 受容体に対する極めて高い親和性を有した（Ｋ_i＝０．８４±０．５３）。逆に 、本発明の類似体は、Ｌｙｓ⁵のＫ_i値の約１００分の１又は約１０００分の１の 範囲である、はるかに低い親和性を有した。例えば、本発明の類似体についての Ｋ_i値（nＭ）は、５４．２±９．６（ペプチドＯｒｎ⁵）、４０７±８２（ペプ チドＤａｂ⁵）及び、特に、1032±113（ペプチドＡｒｇ⁵）であった。 実施例５ イノシトールリン酸の代謝回転アッセイ イノシトールリン酸の代謝回転の測定のために、ラットＮＭＢ受容体でトラン スフェクションしたＢＡＬＢ−３Ｔ３線維芽細胞を採集し、２５mＭグルコース （Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州セントルイス）及び７５mＭショ糖を含有する リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ＋ＧＳ）に再懸濁させ、２５μＣi/mlのミオ ［³Ｈ］イノシトール（Ｎew Ｅngland Ｎuclear，マサチューセッツ州ボストン ）とともに３７℃で６０分間、プレインキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ ＋ＧＳに再懸濁させ、ＬｉＣｌ（１００mＭ）（Ｓigma Ｃhemicals,ミズーリ州 セントルイス）及びＮＭＢ類似体とともに、０．３０mlの最終体積としてインキ ュベートした。クロロホルム／メタノール（１：２）（Ｂurdick & Ｊohnson,ミ シガン州Ｍuskegeon；Ｍallinckrodt,ケンタッキー州Ｐaris）の添加によって、 反応を終了させ、Ｓnider他,Ｊ.Ｎeurochem.,47: 1214(1986)に記載のとおり、 総［³Ｈ］イノ シトールリン酸を単離した。ペプチドＤａｂ⁵は、ＮＭＢ受容体の強い作動薬で あって、イノシトールリン酸代謝回転アッセイでは、Ｋ_i（μＭ）が７８．１± ２５．９であった。 実施例６ 食物摂取のインビボ抑制 個別に収容した、体重４５０〜５００ｇの雄性Ｓprague-Ｄawaley系ラット（ Ｃharles Ｒiver、ｎ＝８）を、温度制御された室内で１２時間：１２時間の明 ：暗周期に保った。ラットを、５時間の食物剥奪スケジュールに続く、０．５kc al/mlのグルコース溶液の６０分間の入手に適応させた。０．９％食塩水（１． ０ml/kg）又は１００ナノモル/kgのペプチドＯｒｎ⁵のいずれか一方をラットに 腹腔内注射した。１分後に、食塩水、３２．０ナノモル/kgのＮＭＢ、又はＧＲ Ｐの生物学的活性部分である３．２ナノモル/kgのＮＭＣ（ＧＲＰ１８〜２７） のいずれかをラットに腹腔内注射した。これらの作動薬の用量は、この実験のパ ラダイムで摂取を確実に抑制することが既に示されている［Ｌadenheim他,Ａmer . Ｐhysiol.Ｓoc.,Ｒ263-Ｒ266(1991)］。第二の注射の５分後にグルコース溶液 を与え、摂取を１５、３０、４５及び６０分後にモニタリングした。各ラットに は、ＮＭＢとＮＭＣの双方について、４種類の条件をすべて与えた。作動薬又は 拮抗薬のいずれかの投与は、少なくとも４８時間引き離した。４（注射）×４（ 時間）通りの分散分析、次いで、各作動薬についての計画的ｔ検定による比較を 用いて、データを統計的に解析した。双方の組の実験について、基線条件（食塩 水＋食塩水）後の摂取が有意に相違しなかったため（ｐ＞０．５）、これらを平 均し、作動薬及びペプチドＯｒｎ⁵の効果と比較するのに用いた。 結果は、ＮＭＢ（図１）とＮＭＣ（図２）はともに、すべての時点で基線摂取 と比較して、食物摂取を有意に抑制する（ｐ＜０．０１）ことを示した。１００ ナノモル/kgのペプチドＯｒｎ⁵の事前投与は、ＮＭＢが生起するグルコース摂 取の抑制を完全に遮断した。ペプチドＯｒｎ⁵＋ＮＭＢ、及びペプチドＯｒｎ⁵＋ 食塩水という条件に対する摂取は、食塩水＋食塩水という条件より大であった（ ｐ＜０．０１）。ＮＭＢとは逆に、ペプチドＯｒｎ⁵の事前投与は、食塩水＋Ｎ ＭＣという条件での摂取の抑制が、ペプチドＯｒｎ⁵＋ＮＭＣという条件での摂 取とは有意に相違しなかった（ｐ＞０．５）という点で、ＮＭＣが生起する摂取 の抑制に対する効果が皆無であった。 その他の実施形態 上記の説明から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確認することができ 、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件にそれを適 応させるよう、本発明の様々な変更及び改変をなすことができる。従って、その 他の実施形態も、本発明の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コイ、デビッド エイチ. アメリカ合衆国 70130 ルイジアナ州 ニューオーリンズ フォース ストリート 1529 (72)発明者 テイラー、ジョン イー. アメリカ合衆国 01568 マサチューセッ ツ州 アプトン フィスク ミル ロード 74

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： ［式中、Ａ¹は、Ｄ−Ｎａｌ又はＤ−Ｔｒｐであり； Ａ³は、Ｐｈｅ、Ｆ₅−Ｐｈｅ又はＸ−Ｐｈｅ（Ｘは、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＨ₃ 又はＯＨ）であり； Ａ⁵は、−ＮＨ−ＣＨ（Ｙ）−ＣＯ−［Ｙは、（ＣＨ₂）_m−Ｒ₄−Ｎ（Ｒ₅）（ Ｒ₆）又は（ＣＨ₂）n−Ｒ₄−ＮＨ−Ｃ（Ｒ₇）−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆）］であり； Ａ⁶は、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｎａｌ、Ｔｒｐ、 Ｍｅ−Ｔｒｐ、Ｂｐａ、Ｆ₅−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ及びＸ−Ｐｈｅ（Ｘは、ハロゲン 、ＮＯ₂、ＣＨ₃又はＯＨ）よりなる群から選択されたアミノ酸のＤ−又はＬ−異 性体であり； Ａ⁸は、Ｎａｌ又はＴｒｐであり； ｍは、１、２又は３であり； ｎは、１、２、３、４又は５であり； Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ、独立に、Ｈ、Ｅ、ＣＯＥ又はＣＯＯＥ［Ｅは、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₁₂）アルケニル、（Ｃ₂〜Ｃ₁₂）アルキニル、フェ ニル、ナフチル、（Ｃ₇〜Ｃ₁₂）フェニルアルキルもしくはアルキルフェニル、 （Ｃ₈〜Ｃ₁₂）フェニルアルケニルもしくはアルケニルフェニル、（Ｃ₈〜Ｃ₁₂） フェニルアルキニルもしくはアルキニルフェニル、（Ｃ₁₁〜Ｃ₂₀）ナフチルアル キルもしくはアルキルナフチル、（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルケニルもしくはア ルケニルナフチル、又は（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）ナフチルアルキニルもしくはアルキニル ナフチルであるが、Ｒ₁又はＲ₂の一方がＣＯＥもしくはＣＯＯＥであるときは、 他方はＨでなければならない］であり； Ｒ₄は、Ｃ₆Ｈ₄又は不在であり； Ｒ₇は、＝ＮＲ₈、＝Ｓ又は＝Ｏであり；そして Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆及びＲ₈はそれぞれ、独立に、Ｈ又はＥである］ で示される環状オクタペプチド。 ２．Ｙが（ＣＨ₂）_m−Ｒ₄−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆）である請求項１に記載の環状オク タペプチド。 ３．Ｒ₄が不在である請求項２に記載の環状オクタペプチド。 ４．ｍが２又は３であり、Ｒ₅及びＲ₆がそれぞれ、独立に、Ｈ又は（Ｃ₁〜Ｃ₅） アルキルである請求項３に記載の環状オクタペプチド。 ５．Ａ⁶が、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ及びＡｂｕより なる群から選択されるアミノ酸のＤ−又はＬ−異性体である請求項４に記載の環 状オクタペプチド。 ６．Ａ³が、Ｐｈｅ又はｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（Ｘは、Ｃｌ、Ｆ又はＯＨ）である 請求項５に記載の環状オクタペプチド。 ７．Ａ¹がＤ−Ｎａｌであり、Ａ⁸がＮａｌである請求項６に記載の環状オクタペ プチド。 ８．Ａ³がＴｙｒであり、Ａ⁶がＶａｌである請求項７に記載の環状オクタペプチ ド。 ９．Ａ⁵が、Ｄａｂ又はＯｒｎであろ請求項４に記載の環状オクタペプチド。 １０．Ａ⁶が、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ及びＡｂｕよ りなる群から選択されるアミノ酸のＤ−又はＬ−異性体である請求項９に記載の 環状オクタペプチド。 １１．Ａ³が、Ｐｈｅ又はｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（Ｘは、Ｃｌ、Ｆ又はＯＨ）であ る請求項９に記載の環状オクタペプチド。 １２．Ａ¹がＤ−Ｎａｌであり、Ａ⁸がＮａｌである請求項９に記載の環状オクタ ペプチド。 １３．Ａ³がＴｙｒであり、Ａ⁶がＶａｌである請求項９に記載の環状オクタペプ チド。 １４．式： Ｈ₂-Ｄ-Ｎal-Ｃys-Ｔyr-Ｄ-Ｔrp-Ｄab-Ｖal-Ｃys-Ｎal-ＮＨ₂ を有する請求項１３に記載の環状オクタペプチド。 １５．式： Ｈ₂-Ｄ-Ｎal-Ｃys-Ｔyr-Ｄ-Ｔrp-Ｏrn-Ｖal-Ｃys-Ｎal-ＮＨ₂ を有する請求項１３に記載の環状オクタペプチド。 １６．Ｙが（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄−ＮＨ−Ｃ（Ｒ₇）−Ｎ（Ｒ₅）（Ｒ₆）である請求項 １に記載の環状オクタペプチド。 １７．Ｒ₄が不在であり、Ｒ₇が＝ＮＲ₈である請求項１６に記載の環状オクタペ プチド。 １８．ｎが２、３又は４であり、Ｒ₅、Ｒ₆及びＲ₈がそれぞれ、独立に、Ｈ又は （Ｃ₁〜Ｃ₅）アルキルである請求項１７に記載の環状オクタペプチド。 １９．Ａ⁶が、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ及びＡｂｕよ りなる群から選択されるアミノ酸のＤ−又はＬ−異性体である請求項１８に記載 の環状オクタペプチド。 ２０．Ａ³が、Ｐｈｅ又はｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（Ｘは、Ｃｌ、Ｆ又はＯＨ）であ る請求項１９に記載の環状オクタペプチド。 ２１．Ａ¹がＤ−Ｎａｌであり、Ａ⁸がＮａｌである請求項２０に記載の環状オク タペプチド。 ２２．Ａ³がＴｙｒであり、Ａ⁶がＶａｌである請求項２１に記載の環状オクタペ プチド。 ２３．Ａ⁵がＡｒｇである請求項１８に記載の環状オクタペプチド。 ２４．Ａ⁶が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ及びＡｂｕよりなる群 から選択されるアミノ酸のＤ−又はＬ−異性体である請求項２３に記載の環状オ クタペプチド。 ２５．Ａ³が、Ｐｈｅ又はｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（Ｘは、Ｃｌ、Ｆ又はＯＨ）であ る請求項２４に記載の環状オクタペプチド。 ２６．Ａ¹がＤ−Ｎａｌであり、Ａ⁸がＮａｌである請求項２５に記載の環状オク タペプチド。 ２７．Ａ³がＴｙｒであり、Ａ⁶がＶａｌである請求項２５に記載の環状オクタペ プチド。 ２８．該オクタペプチドが式； Ｈ₂-Ｄ-Ｎal-Ｃys-Ｔyr-Ｄ-Ｔrp-Ａrg-Ｖal-Ｃys-Ｎal-ＮＨ₂ で示される請求項２７に記載の環状オクタペプチド。