JPH10509983A - ヘモグロビンのための多官能性架橋剤および架橋ヘモグロビン複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質を架橋するのに有用な多官能基試薬であって、架橋反応が終了した後も、別の化学反応に使える反応部位をまだ２つ以上有している多官能基試薬を提供する。これらの試薬は広義の芳香族化合物であって、フェニル、ビフェニル、ナフチル、ビナフチルなど（これに制限されるものではない）の芳香核とこの芳香核に直接または間接に結合した４つの独立に選択された電気陰性な置換基とからなっている。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビンのための多官能性架橋剤および 架橋ヘモグロビン複合体 本発明はヘモグロビンのようなタンパク質のための架橋剤に関し、より詳細に はその架橋剤は複数の反応部位を有し、その反応部位のいくつかはヘモグロビン のグロビン鎖と反応してグロビン鎖間の架橋を行い、少なくとも２つの反応部位 は架橋後もフリーのまま残り、それを利用してバイオ分子のような分子を複合化 （conjugation）させることができる化学架橋剤に関する。 われわれは今回ヒトヘモグロビンの特定修飾に役立つ部位特異的架橋剤を開発 した。架橋されたタンパク質は赤血球代替物質としてまたバイオ複合体形成のキ ャリヤーとしても使用できる可能性がある。我々は構造に特徴のある架橋部分と 高度に選択的な複数の反応部位を有する架橋剤がタンパク質中に特定の架橋を生 じさせることができることを見いだした。これによって修飾タンパク質の特性の 変化を明瞭にその構造と関連づけることが可能となる。 普通の架橋剤は２つの反応部位を有しているが、われわれは３つの反応部位を 有する試薬が非常に高い効率と新規な有用性をもってタンパク質を架橋しうるこ とを見いだした。この架橋剤の２つの部位が反応した後は、第３の部位はタンパ ク質の基の１つと反応するか、または外部の反応物質と反応できる状態に留まる 。結果は架橋剤の官能基の種類で決まる。たとえば、トリメソイルトリス（メチ ルホスフェート）はデオキシヘモグロビンの２つのβ−サブユニットのβ−val １のα−アミノ基とIys 82のε−アミノ基と反応するが、トリメソイルトリス（ ３，５−ジブロモサリチレート）（ＴＴＤＳ）は２つのβ−サブユニットのβ− lys 82においてのみ反応し、第３のエステル基は加えた求核物質と反応できる状 態で残る。バイオ複合体化工程を一層効率的にするためにはさらなる反応部位が 利用可能であることが望ましい。したがって、われわれは架橋工程後になお有効 な２つの反応部位を有する試薬を製造する研究を行った。すなわち、ＴＴＤＳの ようにメタ置換ジカルボン酸の３，５−ジブロモサリチル酸エステルを有し、し かも さらに２つの有効な反応部位を有するような物質を探し求めたのである。これら の構造的問題を釣合を保って解決するものが添付図面の図１に示した（３，５， ３’，５’−ビフェニルテトラカルボニルテトラキス（３，５−ジブロモサリチ レート；ＢＴＤＳ）である。われわれはこの新規物質の合成法を開発し、この物 質をヘモグロビンと反応させると２つの反応部位を有する架橋されたタンパク質 が高い効率で生産されることを見いだした。これと類似の試薬でヘモグロビンの 架橋後に複数の有効な反応部位を与えより効率的なバイオ複合体化と薬剤供給を 可能にするものの作成にも成功した。これを図２に示す。これらの化台物におい て図示されている臭素置換基は、全部または部分的に他のハロゲンすなわち塩素 、フッ素、ヨウ素で容易に置換可能である。 さらに別の態様においては、ＴＴＤＳでヘモグロビンを架橋してできた生成物 、すなわち遊離官能基（カルボキシル）を１つ有する物質を、フマル酸のジ（３ ，５−ジブロモサリチレート）と反応させ、ヘモグロビンのグロビン鎖間にさら なる架橋、すなわちα、α’−架橋結合をつくり、遊離官能基はそのままに残し た。その結果ｐ５０が１５．９mmHgでHill係数ｎ＝２．３（２５℃）である興味 ある修飾ヘモグロビンが得られた。 この技術をさらに進展させて、その試薬とヘモグロビンと反応させた時に、付 加部分が任意の数の反応基を有するように誘導体化されたヘモグロビンを与える 架橋剤を製造することもできる。 架橋剤を適当に換えることにより、２つまたはそれ以上のグロビン鎖のそれぞ れで１つまたはそれ以上の反応部位が架橋されている修飾ヘモグロビンを作るこ とができる。これらの架橋剤は他の架橋剤と組み合わせて使用することができ、 これにより２つ以上の部位で、反応基を提示しているひとつまたはそれ以上の架 橋部分により架橋されているようなヘモグロビンを得ることができる。実験 材料と方法 有機試薬はAldrich Chemical Companyから購入した。溶媒はAldrich Chemical Company とBDH Canada Ltd.,から、重水素を含む溶媒はCambridge Isotope Labo ratoriesから購入した。市販の試薬は精製せずにそのまま使用した。溶媒は使用 前に乾燥した。生化学材料 HPLCグレードのアセトニトリルと水はMallinckrodtから入手し、トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）はPierce Chemical Company から入手した。グロビン鎖の酵素消 化のためにはWothington Biochemical Company (Freehold，NJ) から入手したト リプシンとBoehringer Mannheim Biochemical(Indianapolis，IN)から入手したS taphylococcus aureus V8 エンドプロテイナーゼ Glu-Cを使用した。SephadexG -25はPharmacia Fine Chemicals AB(Uppsala，Sweden)から入手した。ヘモグロ ビン修飾やクロマトグラフィー用の緩衝液ならびに展開液を調製するための試薬 はすべて分析グレードまたはそれ以上であった。スペクトル ＮＭＲスペクトルはVarian Gemini(200MHz)分光計を使用して記録した。実施例１ ３，５，３’，５’−ビフェニルテトラカルボニルテトラキス（３、 ５−ジブロモサリチレート）の合成 ｔ−ブチリル３，５−ジブロモサリチレート１．４１ｇ（４．０ｍｍｏｌ）と ｔ−ブトキシドカリウム０．４５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ３０ml中で ２０分間撹拌した。無水ＴＨＦ１５ml中３，５，３’，５’−ビフェニルテトラ カルボニルテトラクロライド０．４０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）の溶液を添加して撹 拌を一晩続けた。この混合物に水を添加し生成物をエーテルで抽出した。その溶 液をMgSO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発させた。白色固体を２０mlの無水トリ フルオロ酢酸に溶解して１時間放置した。このあと、エーテル２０mlを溶液に加 えた。生じた白色沈殿をフィルターに集めて乾燥した。この生成物をエタノール −水から再結晶した。実施例２ デオキシ−ヘモグロビンと３，５，３’，５’−ビフェニルテトラカ ルボニルテトラキス（３，５−ジブロモサリチレート）との反応 ５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（pH６．５）中１．４０ｍＭＣＯＨｂ溶液２． ０mlを、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）で平衡化したSephadex G ー 25 カラムに通した。ＣＯＨｂは酸素気流下０℃で２時間さらしてそのオキシ型 に変換した。オキシ−Ｈｂは窒素雰囲気下３８℃で２時間デオキシ化された。架 橋剤８．１mg（０．００５６ｍｍｏｌ）をジオキサン１．０mlに溶解し、５０ｍ Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）２．８mlを添加した。この溶液を真空下 、３回窒素を添加して脱酸素化した。このあとその溶液をデオキシ−Ｈｂの溶液 に嫌気的に添加した。この反応混合物を２時間３８℃に保持し水で飽和させた窒 素を回転フラスコに連続的に流した。２時間経過後、フラスコを一酸化炭素で満 たした。未反応試薬を分離するためこの修飾されたＨｂの溶液を０．１ＭのＭＯ ＰＳ緩衝液（pH７．２）で平衡化したSephadex G-25 カラムに通した。 この結果得られた生成物、（３，５−ジブロモサリチル−ビフェニルテトラカ ルボニル−（(Lys-β- 82)-(Lys-β'-82)-ヘモグロビンを以下ＤＢＳＢ−Ｈｂと 呼ぶ。 架橋されたβ−サブユニットに対応するピークをＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムを 使用して分離した。この物質はそのイオンスプレイ質量スペクトルによって同定 した。Ｍ⁺：32,585（実測値）、32,586（計算値）。実施例３ ＤＢＳＢ−Ｈｂとエチレンジアミンとの反応 架橋操作は上記と同様に実施した。出発物質として５ｍＭトリス緩衝液（pH７ ．６）中の１．１７ｍＭＣＯＨｂ１．０mlを使用した。反応はpH８．０で行った 。反応が終わってから反応容器を一酸化炭素で満たした。このあと未反応試薬を 分離するため、修飾されたヘモグロビンの溶液を５０ｍＭpH８．０ホウ酸ナトリ ウム緩衝液で平衡化したSephadex G-25 カラムに通した。 上記の溶液に、０．２Ｍのエチレンジアミン溶液２３０μl を添加した（反応 物質溶液のpHは濃ＨＣl で８．０に調整した）。反応バイアルをシールして３７ ℃の温度に２時間保持した。このあと過剰のエチレンジアミンを分離するために 、５０ｍＭpH８．０ホウ酸ナトリウム緩衝液で平衡化したSephadex G-25 カラム に通した。 生成物をＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムを使用して分離し、イオンスプレイ質量分 析によって同定した。Ｍ⁺：32,109（実測値）、32,114（計算値）。 タンパク質、タンパク質鎖およびペプチドのクロマトグラフィー ヘモグロビンの分離はAX300 陰イオン交換ＨＰＬＣカラムで行った。ヘムとグ ロビン鎖はＣ−４逆相ＨＰＬＣによって分離した。ペプチド断片はＣ−18逆相Ｈ ＰＬＣによって分離された。すべての方法はすでに記載されているものである³ 。 グロビン鎖の酵素加水分解 すでに記載されているものである³。結果と検討 ＢＴＤＳの合成 ３，５，３’，５’−ビフェニルテトラカルボン酸は文献¹で公知の化合物で ある。これは市販されている５−ブロモ−ｍ−キシレンから合成された。テトラ カルボニルテトラクロライドは塩化チオニルと触媒量のＤＭＦを使用して製造さ れた。 目的分子はテトラカルボニルテトラクロライドからKlotz 等の方法²によって 製造された。すなわち、４当量のｔ−ブチル３，５−ジブロモサリチリレートと 無水ＴＨＦ中で化合させた。無水トリフルオロ酢酸を使用した脱保護により好収 率で所望生成物が得られた。この反応図式は添付の図３に示されている。 ＢＴＤＳによるヘモグロビンの架橋 ヘモグロビンの一酸化炭素型とデオキシ型の両者とＢＴＤＳとの反応はいくつ かのpH (7.2、8.0、9.0) で実施された。ＢＴＤＳはジオキサンとそれそれの緩 衝液に溶解し、得られた溶液を脱酸素化した。デオキシ−Ｈｂとの反応は回転フ ラスコの中で実施され、そのフラスコに水飽和窒素を流し、架橋剤を嫌気的に添 加した。ＣＯＨｂの場合にはヘモグロビン溶液を一酸化炭素で飽和させてから、 架橋剤の添加後反応容器をシールした。 ＣＯＨｂの場合には、いずれのpHにおいても有意味量の修飾タンパク質の生成 は見られなかった。しかしデオキシ−ＨｂはＢＴＤＳと容易に反応する。架橋剤 を２当量使用した場合には上記pHのいずれにおいても反応混合物中には未変性Ｈ ｂはまったく残らなっかった。最良の結果はpH８．０において得られた。Ｃ−４ 逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（グロビン鎖分離）によると、主生成物は架橋反応 中に生成された修飾ヘモグロビン混合物の約９５％に相当した。 修飾タンパク質の構造決定 グロビン鎖をＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムで分離した。Ｃ−４クロマトグラムの 主ピークに相当する物質のイオンスプレイＭＳはこの物質がＢＴＤＳによって架 橋された２本のβ−鎖であり、ＢＴＤＳの他の２つの３，５−ジブロモサリチレ ート基は未反応であったことを示している。 グロビン鎖は最初トリプシンで、続いてエンドプロテイナーゼ Glu-C で消化 された。生じたペプチドはＣ−18逆相ＨＰＬＣカラムで分離された。修飾の部位 を確定するため、修飾されたβ−鎖と未変性β−鎖のそれぞれのペプチドパター ンを比較した。その結果によると、架橋は２つのβサブユニットのLys-82残基の 間で起こっている。生成物ＤＢＳＢ−Ｈｂは添付の図４に示されている。 上記の結果が示すように、ＢＴＤＳはＨｂの２つのβ−鎖のLys-82残基のε− アミノ基に対して高度の特異性をもつアシル化剤である。デオキシ型と反応する と２つのβサブユニットの間が架橋され、優れた収率でＤＢＳＢ−Ｈｂを与える 。この物質の酸素結合特性によっては、ヘモグロビンをベースとした酸素キャリ ヤーの適当な候補物質となりうる。 ＢＴＤＳによる２つのβサブユニットのLys-82残基の間の架橋には２つの可能 なやりかたがあるので、この生成物の正確な構造はＸ線結晶学によってのみ確定 可能である。しかしながら、イソフタリル架橋剤⁶とトリメシル架橋剤^3、5を使用 してすでに得られた結果に基づくと、ＢＴＤＳは同じベンゼン環に存在する複数 の活性エステル基のうちの２つが架橋反応に関与していると思われる。別の可能 性も排除できないが、ＤＢＳＢ−Ｈｂは上記の構造を有しているものと推定され る。 上述したように、ＢＴＤＳの活性エステル基のうちの２つはヘモグロビンとの 架橋操作において未反応のまま残る。これらは求核基を有する分子に特異的な複 合部位を提供する。３，５−ジブロモサリチルトリメシルー（(Lys-β- 82)-(1y s-β'-82)−ヘモグロビン（ＤＢＳＴ−Ｈｂ）が各種の生化学的に興味ある求核 試薬のための特異性単官能基アシル化剤であることはすでに報告されている⁴。 しかしながら、ＤＢＳＢ−Ｈｂはヘモグロビン１分子当り２つの活性エステル基 を含有し、２当量の求核試薬の導入を許容する。以下に記す実験において、ＤＢ ＳＢ−Ｈｂが２官能基アシル化剤として使用しうることを示す。 エチレンジアミンとＤＢＳＢ−Ｈｂとの反応 この反応は架橋の直後に実施された。２００倍過剰のジアミンを使用し反応は pH８．０、温度３７℃で実施された。大過剰の試薬は３，５−ジブロモサリチレ ート基の競合的加水分解を最低限におさえるために必要である。反応はヘムとグ ロビン鎖を分離する条件下でのＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムで追跡された。 生成物の分離と同定 反応の間に生じた新しい主ピークをＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムで分離した。こ の物質のイオンスプレイ質量スペクトルはそれがＢＴＤＳで架橋結合された２つ のβサブユニットであり、架橋剤にエチレンジアミン２分子が結合していること を示した。この生成物の図式的構造を添付の図３に示す。 架橋されたヘモグロビン内のＢＴＤＳの残る２つの反応部位に求核試薬２分子 が結合できることがはっきりと示されている。このことは将来ＤＢＳＢ−Ｈｂが 前記したＤＢＳＴ−Ｈｂ⁴よりも２倍も効果的な半天然薬物キャリヤーとして使 用できることを請け合うものであろう。実施例４ １，２−ビス｛２−［３，５ビス（３，５−ジブロモサリチルオキシ カルボニル）フェノキシ］エトキシ｝エタンの合成 結果 テトラカルボニルテトラクロライドの合成はCollman の方法⁷を変更すること によって達成された。無水ＴＨＦ中ジエチル５−ヒドロキシイソフタレートで１ ，２ビス（２−ヨードエトキシ）エタンのヨウ素を求核置換してテトラエステル を得、これを次にシリカカラムで精製した。エタノール中過剰の水酸化ナトリウ ムで加水分解してテトラカルボン酸を得た。テトラカルボニルテトラクロライド は塩化チオニルと触媒量のＤＭＦを使用して製造された。 目的分子はKlotz 等の方法²によりテトラカルボニルテトラクロライドから製 造された。テトラキス（ｔ−ブチル３，５−ジブロモサリチレート）はこのテト ラクロライドをｔ−ブチル３，５−ジブロモサリチレートと反応させて生成され た。トリフルオロ酢酸で脱保護して所望の生成物が得られた。実験 テトラエステルの合成 ジエチル５−ヒドロキシイソフタレート９５２mg（４ｍｍｏｌ）とカリウムｔ −ブトキシド４７５mg（４．２５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ２０ml中で３０分間撹 拌した。ついで、無水ＴＨＦ２０ml中１、２ビス（２−ヨードエトキシ）エタン ７４０mg（２ｍｍｏｌ）の溶液を添加しこの反応混合物を窒素雰囲気下で４８時 間還流させた。水を添加し生成物をエーテルで抽出した。得られた溶液をMgSO₄ で乾燥し、濾過し、溶媒を真空蒸発させた。シリカゲルカラム（ヘキサン−EtOA ｃ１：１）で精製して白色粉末（０．６０ｇ，５１％）を得た。 テトラ酸の合成 上記テトラエステル０．６０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）をエタノール３０mlに溶 解してこの溶液を６５℃まで加熱した。ついで、水１mlに溶解した水酸化ナトリ ウム０．２５ｇ（６ｍｍｏｌ）を添加しこの反応混合物を６５℃に２２時間保持 した。生じた白色沈殿を濾過分離して水１０mlに溶解した。テトラ酸を濃塩酸で 沈殿析出させこれを濾過分離した。この生成物を真空乾燥した（０．４６ｇ，９ ５％）。 テトラカルボニルテトラクロライドの合成 上記テトラ酸２２５mg（０．４７ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１５mlに溶解して ＤＭＨ３滴を添加した。この溶液を５時間窒素雰囲気下で還流させた。溶媒を真 空蒸発させた。生成物（黄色味を帯びた油）を真空乾燥して一晩固化させた（２ ６０mg、１００％）。これをさらに精製することなく使用した。 テトラキス（ｔ−ブチル−３，５−ジブロモサリチレート）の合成 ｔ−ブチル−３，５−ジブロモサリチレート６６３mg（１．８８ｍｍｏｌ）と カリウムｔ−ブトキシド２１１mg（１．８８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ１５ml中で ３０分間撹拌した。ついで、無水ＴＨＦ１５ml中テトラカルボニルテトラクロラ イド２６０mg（０．４７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、この反応混合物を室温で一 晩撹拌した。溶液をMgSO₄で乾燥し濾過し、溶媒を真空蒸発させた。（白い泡状 、７５０mg、８８％）。 テトラキス（３，５−ジブロモサリチレート）の合成 上記ｔ−ブチル保護化合物７４５mg（０．４１ｍｍｏｌ）を無水ＴＦＡ１５ml に溶解し室温に２．５時間放置した。このあと乾燥エーテル１５mlを添加した。 この時沈殿が生じた。４℃に一晩保持した後、生成物を濾過分離して真空乾燥し た。（白色粉末、５５０mg、８４％）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パール，クリスズチーナ ドイツ国，エキング デー − 85386 バートル − マイエル − ヴェク ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．官能基のうちの２つはタンパク質と反応してそれを架橋することができ、官 能基の他の２つは架橋されたタンパク質がさらに反応するのに利用可能な部位を 提供することができる少なくとも４つの官能基を有する多官能基架橋剤であって 、下記一般式Ｉ （式中、 ｍは４−１２の整数； ｎは１−５の整数； Ｒはフェニル、ナフチル、ビフェニル、ビナフチル、フェニル−アルキレン− フェニル、ナフチル−アルキレン−ナフチル、フェニル−ポリエーテル−フェニ ルおよびナフチレン−ポリエーテル−ナフチルからなる群から選択される芳香族 基、ここでアルキレン鎖とポリエーテル鎖は線形にのびる２乃至２０個の原子を 含む； Ｘは直接結合、エチレン基または−ＮＨ−基を意味する、 Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−または直接結合を意味する、 Ｚは１つまたはそれ以上の互いに独立に選択された、正のHammett シグマ値を 示す電気陰性基を意味する） に対応する多官能基架橋剤。 ２．一般式Ｉの中のＹが−Ｏ−である請求項１記載の架槁剤。 ３．一般式Ｉの中のＺがアセトアミド、アセトキシ、アセチル、カルボメトキシ 、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、エトキシ、ヒドロキシ、メタンスルホニル、 メトキシ、ニトロ、フェニル、トリフルオロメチル、トリメチルアン モニオ、ホスフェート、スルホネート、サルフェート、ジホスフィネートからな る群から選択される請求項２記載の架橋剤。 ４．一般式Ｉの中の整数ｎが２または３である請求項３記載の架橋剤。 ５．一般式Ｉの中のＺがカルボキシル、ホスホネート、スルホネート、サルフェ ート、ホスフィネート、ハロゲンからなる群から選択される請求項４記載の架橋 剤。 ６．一般式Ｉの中の基 が３，５−ジブロモサリチルである請求項５記載の架橋剤。 ７．３，５，３’，５’−ビフェニルテトラカルボニルテトラキス（３，５−ジ ブロモサリチレート）である請求項６記載の架橋剤。 ８．１，２−ビス｛２−［３，５−ビス（３，５−ジブロモサリチルオキシカル ボニル）−フェノキシ］エトキシ｝エタンである請求項６記載の架橋剤。 ９．１，３，５−トリス｛［３，５−ビス（３，５−ジブロモサリチルオキシカ ルボニル）フェノキシ］メチル｝ベンゼンである請求項６記載の架橋剤。 10．ヘモグロビンを架橋剤と反応させることによって架橋されたヘモグロビンを 製造する方法において、さらに別の化学反応のために利用可能な、架橋剤の残基 から誘導された複数の自由官能性を有する架橋されたヘモグロビンを製造するた め、ヘモグロビンを請求項１に定義した架橋剤と反応させることを特徴とする製 造方法。 11．ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである請求項１０記載の方法。 12．ヘモグロビンをデオキシの形でかつ酸素の不存在で架橋剤と反応させる請求 項１１記載の方法。 13．架橋剤が３，５，３’，５’−ビフェニルテトラカルボニルテトラキス（３ ，５−ジブロモサリチレート）である請求項１１記載の方法。 14．架橋剤が１，２−ビス｛２−［３，５−ビス（３，５−サリチルオキシカ ルボニル）フェノキシ］エトキシ｝エタンである請求項１１記載の方法。 15．ヘモグロビンに共有結合した架橋剤残基を有する架橋ヘモグロビンからなる ヘモグロビン−バイオ分子複合体であって、該架橋剤残基は少なくとも２つの反 応部位を提供し、少なくとも１つのバイオ分子が架橋剤残基の反応部位に共有結 合している、ヘモグロビン−バイオ分子複合体。 16．ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである請求項１５記載のヘモグロビン−バ イオ分子複合体。 17．バイオ分子が該架橋剤残基に該バイオ分子の第１または第２アミン基を使用 して結合されている請求項１５記載のヘモグロビン−バイオ分子複合体。 18．バイオ分子がアミノ酸、ポリヒドロキシルアミン、ペプチド、酵素補因子類 似体、ホルモン、ハプテン、補酵素、求核基含有薬剤、糖、脂質、核酸からなる 群から選択される請求項１５記載のヘモグロビン−バイオ分子複合体。