【発明の詳細な説明】
MHC- ペプチド複合体の調製法
発明の分野
本発明は、MHC-ペプチド複合体の調製法に関し、ここで該複合体の実質的に全
てがこのペプチドを含む。特に、該方法は、MHC成分を所望の抗原性ペプチドの
大モル過剰と共にインキュベートする工程を包含する。あるいは、該方法は、所
望のペプチドを、最適pH条件下でMHC成分と共にインキュベートする工程を包含
する。
発明の背景
主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）クラスII抗原はヘテロダイマーの細胞表
面糖タンパク質であり、そしてCD4陽性Ｔ細胞に対して抗原性ペプチドを提示す
るのに非常に重要である（YewdellおよびBennick，Cell 62:203-206(1990)）。
いくつかのインビトロ実験により、抗原性ペプチドで占められたMHCクラスII抗
原のパーセントは有意に変化し、そして多くの場合、抗原で占められた部分は全
MHC調製物の非常にわずかな部分を含むに過ぎないことが示されている。これは
、以下の理由：（ｉ）アフィニティー精製されたMHCクラスII抗原における種々
の予め結合した内因性ペプチドの存在（Chiczら、Nature 358:764-768(1993)）
（ii）精製されたMHCクラスII分子と会合した非変異鎖ポリペプチドの存在（Rib
erdyら，Nature 360，474-477(1992)）または（iii）溶液中のこれらの分子の多
重コンフォメーション状態の存在(Dornmairら，Cold Spring Harbor Symp．54:4
09-416(1989))のうちの１つまたは組合せにより説明することができる。
合成ペプチドで占められたMHC抗原の低パーセンテージならびに精製されたMHC
クラスII抗原の限定された収率のため、非複合体化もしくは内因的に結合した複
合体からの良好な回収を伴う、MHCクラスIIと抗原性ペプチドとの均質で純粋な
複合体を調製しようとする種々の試みは、ここ数年間にわたって、困難であるか
役に立たないことが判明した。所定の組成のクラスII-ペプチド複合体を精製す
ることを記載した最初の方法はビオチン-アビジン系を含むもので、そこでは、
抗原性ペプチドは長鎖チオール開裂性(cleavable)ビオチン部分を含有する(Demo
tzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8730-8734(1991))。この方法は、それが
いくつかの工程を含み、そして所定の複合体の回収がかなり低い（通常、出発サ
ンプルの0.4〜４％）という意味で制限を有する。
従って、実行が容易であり、迅速に測定し得、かつ所望のMHC-ペプチド複合体
の回収が比較的高い調製法に対する必要性が存在する。
発明の要旨
本発明は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー反応、および移植片反応のよう
な免疫学的疾患を改善するのに有用なMHC-ペプチド複合体の調製法を提供する。
これらの複合体は、本質的に、（１）MHCがコードする抗原提示糖タンパク質の
有効部分；および（２）処置すべき疾患状態に関連する自己抗原または他の抗原
性配列のフラグメントを表すペプチド（すなわち、抗原性ペプチド）からなる。
本発明は、MHC成分と、約75倍〜約2000倍モル過剰のペプチドとを接触させ、
それによりMHCクラスII-ペプチド複合体を形成する工程を包含する方法を提供す
る。MHC成分は、HLA-DR2のような任意のMHC対立遺伝子に由来し得る。抗原性ペ
プチドは任意の抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）に由来し得る
。好ましいペプチドはMBP（83-102）Ｙ83を含む。この方法は、さらに、複合体
の治療的または診断的投与に適した比率で、MHCクラスII-ペプチド複合体と薬学
的に受容可能な賦形剤とを混合する工程を包含し得る。
本発明はまた、最適pH条件下でMHC成分とペプチドとを接触させ、それにより
、MHCクラスII-ペプチド複合体を形成する工程を包含する方法を提供する。MHC
成分がDR2であり、かつペプチドがMBP（83-102）Ｙ83である場合、最適pH条件は
約pH６である。MHC分子がDR2であり、かつペプチドがMBP（124-143）である場合
、最適pH条件は約pH８である。MHC分子がDR2であり、かつペプチドがMBP（143-1
68）である場合、最適pH条件は約pH７である。
さらに、本発明は、所定のまたは均質な組成の複数のMHC-ペプチド複合体を含
む組成物を提供する。これらの組成物は、MHCによってコードされた糖タンパク
質と共同して特定の抗原を認識するＴヘルパー細胞を標的化するように設計され
る。複合体はＴ細胞レセプターに結合し、そして標的Ｔ-リンパ球および免疫系
の他の細胞において不応答性(non-responsiveness)を引き起こす。
本発明の他の利点、目的、特徴、および実施態様は、以下の詳細な説明から明
らかになる。
図面の簡単な説明
図1A-1Cは、精製されたHLA-DR2に対する種々のMBPペプチドの最大結合のため
の最適pHを示す。アフィニティー精製されたHLA-DR2を、20μg/mlの濃度で、種
々のpHにて、50-倍モル過剰のビオチン化MBP（83-102）ｙ83ペプチド（図1A）、
MBP（124-143）ペプチド（図1B）、およびMBP（143-168）ペプチド（図1C）と共
にインキュベートした。pH5.0および6.0については100mMクエン酸緩衝液を使用
し、pH7.0および8.0については100mMリン酸緩衝液を使用し、そしてpH９および1
0については10mMトリス緩衝液を使用した。白丸はコントロールペプチドMBP（１
-14）を表す。各データ点は２回の測定(determinant)の平均を表す。
図2A-2Bは、酸性pHで作製したDR2.MBP（83-102）複合体の特徴付けを示す。複
合体調製物を、抗-DR2ダイマー特異的ポリクローナル抗体によって捕獲し、そし
てヘテロダイマーの存在をELISAにてL243に結合したペルオキシダーゼによって
検出した（図2B）。中性pHでの天然HLA-DR2をこのアッセイにおいて陽性コント
ロールとして使用した（図2A）。各データ点は、三連の測定の平均を表す。
図3A-3Cは、HLA-DR2に結合する種々のMBPペプチドの時間経過を示す。精製さ
れたHLA-DR2を、20μg/mlの濃度で、37℃にて、上記のように予め最適化したpH
値において、50-倍モル過剰のビオチン化MBP（83-102）ｙ83ペプチド（図3A）、
ビオチン化MBP（124-143）ペプチド（図3B）およびビオチン化MBP（143-168）ペ
プチド（図3C）と共にインキュベートした。示した時点において、アリコートを
取り出し、そして-20℃で保存し、そして抗体捕獲プレートアッセイによって分
析した。白丸はMBP（１-14）ペプチドの結合を表す。パネル中の矢印は最大結合
に要する最適時間を表す。
図4A-4Cは、MBPペプチドのDR2への結合に対するペプチド濃度の増大の効果を
示す。精製されたHLA-DR2を、20μg/mlの濃度で、37℃にて、予め最適化したpH
値において、増大するモル過剰のビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチド（図4A
）、ビオチン化-MBP（124-143）ペプチド（図4B）およびビオチン化-MBP（143-1
68）ペプチド（図4C）と共に72時間インキュベートした。白丸はMBP（１-14）ペ
プチドの結合を表す。
図5A-5Cは、非ビオチン化ペプチドの存在下でのビオチン化MBPペプチドの競合
結合を示す。図5Aは、ビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチドと、漸増濃度の非
ビオチン化MBP（83-102）Ｙ（黒丸）およびMBP（124-143）ペプチド（白丸）と
の結合を示す。図5Bは、非ビオチン化MBP（83-102）Ｙ83（黒丸）およびMBP（12
4-143）（白丸）の存在下でのビオチン化MBP（124-143）の結合を表す。図5Cは
、十分に最適化された条件での、ビオチン化MBP（143-168）と、漸増濃度の非ビ
オチン化MBP（83-102）Ｙ83（黒丸）およびMBP（143-168）（白丸）との結合を
表す。
図6A-6Cは、種々のDR2-ペプチド複合体のSephadex G-75ゲル濾過精製を示す。
DR2と種々のMBPペプチドとの複合体１mgを調製し、そしてSephadex G-75（20ml
ベッド容量）にアプライした。500μlの画分を収集し、そして280nmでの吸光度
を測定した。
図7A-7Cは、種々の温度でのDR2.MBPペプチド複合体の安定性を示す。精製した
複合体を４℃（白丸）、25℃（黒丸）および37℃（白四角）で種々の時間インキ
ュベートし、サンプルアリコートを下記のように取り出した。
図8A-8Bは、アフィニティー精製したHLA-DR2に対するペプチドの結合を示す。
図8Aは、HLA-DR2に対するビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチドの速度論を表
す。精製されたHLA-DR2を、２μg/mlの濃度で、37℃、および中性pHにて、50-倍
モル過剰のビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチド（黒丸）またはビオチン化-M
BP（１-14）ペプチド（白丸）のいずれかと共にインキュベートした。種々の時
点でアリコートを取り出し、そして-20℃で凍結させた。実験の最後に、サンプ
ルを下記のように分析した。図8Bは、種々のモル過剰のペプチド濃度においてHL
A-DR2に結合したビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチド（黒丸）およびビオチ
ン化-MBP（１-14）ペプチド（白丸）の定量を表す。
図9A-9Bは、MBP（83-102）Ｙ83またはMBP（124-143）ペプチドのいずれかの存
在下におけるビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチドの競合結合を示す。精製さ
れたHLA-DR2を２μg/mlの濃度で、37℃にて、０〜10,000倍モル過剰のMBP（83-1
02）Ｙ83ペプチド（図9A）またはMBP（124-143）ペプチド（図9B）のいずれかの
存在下で、300-倍モル過剰のビオチン化-MBP（83-102）Ｙ83ペプチドと共に96時
間インキュベートした。次いで、HLA-DR2と会合したビオチン化-MBP（83-102）
Ｙ83ペプチドの量を下記のように定量した。
図10A-10Bは、酸で溶出したペプチドのナロウボア（narrowbore）HPLC分析を
示す。精製されたDR2またはMBP（83-102）Ｙ83-結合DR2複合体１mgを酢酸抽出に
供した。酸溶出したペプチドを、下記のようにナロウボアC-18逆相カラムを用い
てWaters(Millipore)HPLCシステムで分析した。図10Aは、標準MBP（83-102）Ｙ8 3
ペプチドを示し；図10Bは、精製されたHLA-DR2由来の溶出した内因性ペプチド
を示し；図10Cは、ブランク緩衝液のプロフィールを示し；および図10Dは、十分
に占められたHLA-DR2.MBP（83-102）Ｙ83複合体由来の溶出したペプチドを示す
。
発明の詳細な説明および好ましい実施態様
望ましくないＴ細胞活性化は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー反応、およ
び移植片拒絶のような多数の病理学的、免疫学的疾患に関連することが知られて
いる。自己免疫疾患は、有害なまたは望ましくない免疫応答に関与する疾患の特
に重要なクラスである。自己免疫疾患では、自己寛容性が失われ、従って、免疫
系はそれがあたかも外来性標的であるかのように「自己」組織を攻撃する。現在
、30を超える自己免疫疾患が存在することが知られている；例えば、重症筋無力
症（MG）、慢性関節リウマチ（RA）および多発性硬化症（MS）は広範な公然に注
目されている３つの自己免疫疾患である。
さらに、多くのアレルギー性疾患が特定のMHC対立遺伝子と関連することが見
いだされており、あるいは、自己免疫成分を有することが疑われている。さらに
、他の有害なＴ細胞媒介性応答は、同種異系宿主から移植体または移植片として
身体に故意に導入された外来性細胞の破壊を含む。「同種移植片拒絶」として知
られるこのプロセスは、宿主Ｔ細胞と外来性MHC分子との相互作用を含む。極め
て頻繁に、広範囲のMHC対立遺伝子は、同種移植片に対する宿主Ｔ細胞の応答に
関
与する。
本発明は、所定の組成の複数のMHC-ペプチド複合体を含む組成物の調製法を提
供する。一旦形成されると、均質なMHC-ペプチド複合体のこの組成物は、例えば
、自己免疫疾患、アレルギー反応および移植片拒絶のような免疫学的疾患の処置
においてＴ細胞機能を調節するために使用され得る。さらに、本発明の精製され
た複合体は、免疫応答を促進するためのワクチンとして使用され得る。この実施
態様において使用される場合、MHC成分（クラスＩまたはクラスIIのいずれか）
は、典型的には、同時刺激シグナルに関与するリガンドを保持する成分抗原提示
細胞への付着を可能にするように修飾される。あるいは、複合体は、Ｔ細胞増殖
が誘導されるように、単離された同時刺激リガンドに連結され得る。このように
して、Ｔ細胞は複合体によって提示された抗原性ペプチドに応答し、そして免疫
応答が開始される。均質な複合体はまた、MHC-ペプチド相互作用の速度論の理解
、結晶学的解析、および所定の複合体について特異的な抗体の生成においても有
用である。
例えば、自己免疫のような望ましくない免疫応答の原因である免疫系のそれら
の局面を同定し、および阻害するために有用な複合体および方法が、記載されて
いる。米国特許第5,130,297号、第5,194,425号、第5,284,935号、および第5,260
,422号を参照のこと。これらの複合体および方法は、MHCによってコードされる
糖タンパク質と共に特定の抗原を認識するＴヘルパー細胞を標的化するように設
計されている。複合体は効果的にＴ細胞レセプターに結合し、そして標的Ｔ-リ
ンパ球および免疫系の他の細胞において不応答性を引き起こす。
本発明の方法によって作製された複合体は、少なくとも２つの成分を含有する
：（１）処置されるべき疾患状態に関連する自己抗原または他の抗原性配列のフ
ラグメントを表すペプチド；および（２）抗原提示に関与するMHCがコードする
糖タンパク質の有効部分。MHC糖タンパク質の有効部分は、抗原結合部位および
適切なＴ細胞レセプターによるMHC-ペプチド複合体の認識に必要な領域を含む部
分である。MHC成分はクラスＩまたはクラスII分子のいずれかであり得る。ペプ
チド抗原とMHCタンパク質の抗原結合部位との間の会合は、共有結合または非共
有結合によるものであり得る。さらに、MHC-ペプチド複合体は、一般に、トキ
シンまたは標識であるエフェクター成分を含有し得る。エフェクター部分は、MH
Cがコードする糖タンパク質または自己抗原性ペプチドのいずれかに結合され得
る。エフェクター成分を含有する複合体は、米国特許第5,194,425号（前掲）に
開示され特許請求されている。
免疫学的疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー反応、および移植片拒絶）
を改善するのに有用なMHC-ペプチド複合体の精製および特徴付けのための本開示
方法の各局面を、以下にかなり詳細に説明する。
MHC- 由来成分の単離
前記したように、本発明は、所定の組成の複数のMHC-ペプチド複合体を含む組
成物の調製法を提供する。本明細書で使用する用語「所定の組成物の」は、少な
くとも60パーセント、通常70パーセントを超え、好ましくは約75パーセント、そ
してより好ましくは約95パーセント以上の複合体が同一であり、かつ内因性MHC-
ペプチド複合体を含まない複数のMHC-ペプチド複合体をいう。内因性MHC-ペプチ
ド複合体は、MHC分子を発現する細胞からこの分子が単離される時に、MHC分子と
会合しているペプチドを含む複合体である。本方法の最初の工程において、抗原
結合部位（１つまたは複数）を有するMHC成分を、このような成分を生産する細
胞から単離する。MHC成分は、本明細書に記載する方法および手法を用いて容易
に単離され得る。
通常、MHC成分は、天然の抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、または
マクロファージ）、あるいはこのような細胞に由来する固定化細胞株から単離さ
れる。従って、MHC分子は、内因性ペプチドが負荷されている。
主要組織適合性遺伝子複合体によってコードされた糖タンパク質は、ヒトおよ
びマウス系の両方において、広範に研究されてきた。一般に、それらは、クラス
Ｉ糖タンパク質（これは、全ての細胞の表面で見い出され、そして主に細胞傷害
性Ｔ細胞により認識される）；およびクラスII糖タンパク質（これは、マクロフ
ァージのような補助細胞を含む、いくつかの細胞の表面上に見い出され、そして
Ｔヘルパー細胞に対する抗原の提示に関与する）として分類されている。組織適
合性タンパク質のいくつかは、単離され、そして特徴付けられている。MHC糖タ
ンパク質の構造および機能の一般的総説については、例えばFundamental Immuno
logy(第３版、W.E．Paul編、Ravens Press，N.Y.(1993))を参照のこと。本明細
書で使用する用語「単離されたMHC成分」は、その天然状態ではない（すなわち
、通常はMHCを発現する細胞の細胞膜に結合していない）MHC糖タンパク質または
MHC糖タンパク質の有効部分（すなわち、抗原結合部位（１つまたは複数）、お
よび適切なＴ細胞レセプターによる認識に必要な配列を含む部分）をいう。以下
に詳述するように、MHC成分は、好ましくは、適切な細胞供給源から可溶化され
る。ヒトMHC分子については、ヒトリンパ芽球細胞は、MHC成分のための供給源と
して特に好ましい。
次いで、本発明の複合体のMHC糖タンパク質部分は、リンパ球からの単離によ
り得られ、所望のペプチド抗原に結合するその能力についてスクリーニングされ
得る。リンパ球は、個体の種由来であり、一旦形成された複合体で処理される。
それらは、例えば、当業者に公知の技術を利用して、標的自己免疫疾患を患う個
体のヒトＢ細胞（この細胞は複製欠陥エプスタイン-バールウイルスでの形質転
換により不死化されている）から単離され得る。
MHC糖タンパク質は、例えばパパインでの処理による、３M KClでの処理による
、および界面活性剤での処理による可溶化を包含する、種々の技術を用い、多数
の細胞から単離されている。好ましい方法では、リンパ球由来のクラスIIタンパ
ク質の界面活性剤抽出、その後のアフィニティー精製が使用される。界面活性剤
は、続いて、透析により、または選択的結合ビーズ（例えば、Bio Beads）の使
用により除去され得る。
マウスI-A（クラスII）組織適合性タンパク質の精製方法はTurkewitzら，Mole
cular Immunology（1983）20:1139-1147によって開示されている。クラスＩ分子
についてもまた適するこれらの方法は、非イオン性界面活性剤（例えば、NP-40
、
調製する工程を包含する。次いで、所望のMHC分子に対して惹起された抗体を含
有するカラムを用いて、MHC分子をアフィニティークロマトグラフィーによって
精製する。
I-AおよびI-Eサブ領域によりコードされる単離された抗原は、２つの非共有結
合で結合されたペプチド鎖：32〜38kDのα鎖および26〜29kDのβ鎖からなること
が示されている。第３の非変異の31kDペプチドは、これらの２つのペプチドと非
共有結合で会合しているが、これは多形ではなく、そして細胞表面上の抗原の成
分ではないようである（Sekaly，J．Exp．Med.（1986）164:1490-1504）。I-A領
域の７つの対立遺伝子変異体のαおよびβ鎖はクローン化され、そして配列決定
されている。
ヒトクラスＩ織適合性タンパク質もまた、研究されている。染色体６上のヒト
MHC（HLA）は３つの遺伝子座、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cを有し、その最初の２
つは多数のアロ抗原をコードする対立遺伝子を有する。これらは、44kDのサブユ
ニットおよび全ての抗原特異性に共通している12kDのβ2-マイクログロブリンサ
ブユニットからなることが見出されている。これらの界面活性剤可溶性HLA抗原
の単離は、Springerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1976）73:2481-2485; Cl
ementsonら，「Membrane Proteins」(Azzi，A.編); Bjorkman，P.博士 Thesis H
arvard(1984)により記載されている。
抗原性ペプチド
多数の自己免疫疾患についての抗原性タンパク質または組織が知られている。
実験的に誘導された自己免疫疾患においては、例えば、病因に関与する以下の抗
原が特徴付けられている：天然II型コラーゲンは、ラットおよびマウスでのコラ
ーゲン-誘導関節炎において同定されており、およびマイコバクテリアのヒート
ショックタンパク質は、アジュバント関節炎において同定されている(Stuartら
，(1984)，Ann．Rev．Immunol．2:199-218; van Edenら，(1988)，Nature 331:1
71-173); チログロブリンは、マウスでの実験的なアレルギー甲状腺炎（EAT）
において同定されており（Maronら，(1988)，J．Exp．Med．152:1115-1120）；
アセチルコリンレセプター（AChR）は、実験的なアレルギー重症筋無力症（EAMG
）において同定されており（Lindstromら(1988)，Adv．Immunol.42:233-284）；
およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）およびプロテオリピドタンパク質（PLP
）は、マウスおよびラットでの実験的なアレルギー性脳脊髄炎（EAE）において
同定されている（Acha-Orbeaら,前掲を参照のこと）。さらに、標的抗原がヒト
で同定
されている；II型コラーゲンは、ヒト慢性関節リウマチにおいて同定されており
（Holoshitzら，(1986)，Lancet ii:305-309）；およびアセチルコリンレセプタ
ーは、重症筋無力症において同定されている（Lindstromら、(1988)、前掲）。
抗原提示細胞（APC）の表面上のMHC糖タンパク質による抗原の提示は、抗原性
タンパク質のより小さなペプチド単位への加水分解に続いて生じると考えられて
いる。これらの小さなセグメントの抗原性タンパク質内への位置決めは、経験的
に決定され得る。これらのセグメントは、約８〜約18残基の長さであり、アグレ
トープ（MHC分子によって認識される）およびエピトープ（Ｔヘルパー細胞上の
Ｔ細胞レセプターによって認識される）の両方を含有すると考えられている。し
かし、MHC分子に結合し得るペプチドの長さは変化し得る。従って、より大きな
長さ（例えば、100残基まで）のペプチドはまた、複合体に使用され得る。通常
、ペプチドは約50残基未満の長さ、好ましくは約30残基未満の長さである。
標準的な方法を用いて、当業者は、多くの免疫疾患に関連する抗原の関連抗原
性ペプチドを容易に決定し得る。例えば、中枢神経系中のミエリン鞘の破壊を生
じる多発性硬化症（MS）においては、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）（すな
わち、ミエリンの主要タンパク質成分）が主な自己抗原であることが知られてい
る。MBPタンパク質の適切なセグメントはまた、前記手順、およびウシ・ミエリ
ン塩基性タンパク質で免疫する場合、実験的なアレルギー脳炎（EAG）を発症す
るマウスの系統を用いて、経験的に決定し得る。
さらに、全身エリテマトーデス（SLE）は、複雑なシステモロジー(systemolog
y)を有するが、赤血球細胞に対する自己免疫応答に由来することが知られている
。この疾患の抗原性エフェクターであるペプチドは赤血球細胞の表面上のタンパ
ク質において見い出されている。慢性関節リウマチ（RA）、慢性炎症性疾患は、
滑液において見い出されるタンパク質に対する免疫応答の結果である。インスリ
ン依存性糖尿病（IDDM）は、インスリンの分泌を担うランゲルハンス島内のβ細
胞に対する自己免疫的攻撃の結果である。ランゲルハンス細胞表面抗原およびイ
ンスリンに対する循環抗体がIDDMに先行することが知られている。IDDMにおける
免疫応答を惹起する臨床的ペプチドは、インスリン配列およびβ細胞膜表面タン
パク質の一部であると考えられている。
一旦決定されると、ペプチド合成のための標準的な自動化方法を用い、関連抗
原性ペプチドサブユニット（それらは、長さが比較的短い）を容易に合成するこ
とができる。あるいは、それらは、単離されたDNA配列または合成されたDNA配列
を用いて組換え法により作製され得るが、これはこの長さのペプチドについての
最も効果的なアプローチではない。
エフェクター成分：
さらに、本発明の複合体は、問題のペプチドに対する免疫応答を破壊するよう
に設計され得る。この場合においては、MHC-ペプチド複合体は、エフェクター成
分を含有する。MHC-ペプチド分子のエフェクター部分は、例えば、トキシン、化
学療法剤、細胞傷害性Ｔ細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、または「ハード
(hard)」放射（例えば、β放射）を放射する放射性同位体であり得る。多数のタ
ンパク質トキシンが当該分野で知られており、例えば、リシン、ジフテリア、ゲ
ロニン(gelonin)、シュードモナストキシン、およびアブリンが挙げられる。化
学療法剤としては、ドキソルビチン（doxorubicin）、ダウノルビチン（daunoru
bicin）、メトトレキセレート、サイトトキシン、およびアンチセンスRNAが挙げ
られるが、これらに限定されない。さらに、抗生物質もまた、エフェクター成分
として使用され得る。細胞傷害性Ｔ細胞表面分子に対する抗体が単離されており
、従ってこれらはトキシンとして作用し得る。さらに、イットリウム-90、リン-
32、鉛-212、ヨウ素-131、またはパラジウム-109のような放射性同位体が使用さ
れ得る。放射される放射線は、標的Ｔ細胞の破壊を達成する。
いくつかの場合では、エフェクター成分の活性部分はリポソームまたはデキス
トランキャリアのような送達系に捕獲され；これらの場合、活性成分またはキャ
リアのいずれかは、複合体に結合され得る。
エフェクター分子が標識とされるように意図される場合、テクネチウム-99ま
たはインジウム-111のようなγ放射の放射性同位体が使用され得る。さらに、例
えば、フルオレセインによって標識される蛍光のような他のタイプの標識が使用
され得る。
エフェクター成分は、MHC糖タンパク質に付着され得るかあるいは、その性質
が適切である場合、ペプチド部分に付着させ得る。ヨウ素131または他の放射性
同位体標識は、例えば、しばしば、ペプチド抗原決定基配列中に含められ得る。
エフェクター成分を含有する複合体は、米国特許第5,194,425号（前掲）に開示
されそして特許請求されている。
MHC- ペプチド複合体の形成
一旦MHC成分が単離され、そして抗原性ペプチドが合成されると、本発明の方
法を用いて、これらの２つのエレメントを互いに結合させて、MHC-ペプチド複合
体を形成し得る。好ましくは、抗原性ペプチドは、例えば、２つの成分を一緒に
混合することによって、MHCタンパク質のポケット部分と非共有結合的に会合さ
れる。過剰のペプチドは、例えば、限外濾過または透析によるような多数の標準
的手順を用いて除去される。
本発明は、部分的には、非常にモル過剰なペプチドを用いて、所定の組成物の
複合体である、100％負荷された均質なMHC-ペプチド複合体を生成し得るという
発見に基づいている。典型的には、約50〜約100倍モル過剰のペプチドが使用さ
れる。約75倍モル過剰が通常である。しかし、約200倍過剰と約300倍過剰との間
のより高いレベルが使用され得る。約2000倍過剰以下のペプチドを用い、通常、
約1000倍過剰未満、好ましくは約500倍過剰未満である。
あるいは、MHC成分およびペプチドをインキュベートするpH条件を至適化する
ことによって、MHC-ペプチド複合体の均質な組成物が調製され得る。下記に示す
ように、そのようなアプローチは、３つの異なるMHC-ペプチド複合体を用いて、
ペプチド負荷の増加を提供している。
MHC- ペプチド複合体の処方および投与：
本発明の方法により作製された複合体の投与は、通常は全身投与であり、注射
、好ましくは静脈内注射によって達成される。従って、注射の投与経路に適合す
る処方が使用され得る。適切な処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences
（Mack Publishing Company，Philadelphia、PA、第17版(1985)）に見出される
。本発明の複合体および薬学的に有効なキャリアを含む多様な薬学的組成物が調
製
され得る。薬学的組成物は、多様な薬物送達系に適切である。薬物送達の現在の
方法の簡単な総説については、例えば、Langer，Science 249:1527-1533(1990)
を参照のこと。
MHC-ペプチド複合体を含む薬学的組成物の調製において、複合体を修飾してそ
の薬物動態学および体内分布を改変することがしばしば所望される。薬物動態学
の一般的議論については、Remington's Pharmaceutical Sciences，前掲，第37
〜39章を参照のこと。薬物動態学および体内分布を改変する多数の方法が、当業
者に知られている（例えば、Langer，前掲を参照のこと）。
薬学的組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために、非経口、局
所、経口、または局所投与（例えば、エアロゾルまたは経皮）を意図する。薬学
的組成物は投与方法に応じて種々の単位投与形態で投与することができる。例え
ば、経口投与に適切な単位投薬形態としては、粉末、錠剤、丸剤、およびカプセ
ル剤が挙げられる。
好ましくは、薬学的組成物は静脈内投与される。従って、静脈内投与のための
組成物は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中に溶解または懸濁さ
れた複合体の溶液を含むように提供される。多様な水性キャリア、例えば、水、
緩衝化水、0.4％生理食塩水などが使用され得る。例えば、リン酸緩衝化生理食
塩水（PBS）は、本発明の可溶性複合体の投与に特に適している。好ましい処方
は、0.02％TWEEN-80を含有するPBSである。これらの組成物は、従来の周知の滅
菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水性溶液を
、使用のためにパッケージするか、または凍結乾燥し、凍結乾燥調製物は投与の
前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、必要に応じて、pH調整剤および緩
衝剤、等張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、
トリエタノールアミンオレエートなどのような薬学的に受容可能な補助的物質を
含有して生理学的条件に近づけ得る。
複合体の濃度は広く変化し得る。すなわち、約0.05重量％未満から、通常約１
重量％または少なくとも１重量％、10〜30重量％まで変化し得、主として、選択
される特定の投与様式により、流体の容量、粘度などによって選択される。静脈
内投与のための好ましい濃度は、PBS中、約0.02％〜約0.1％またはそれ以上であ
る。
固体組成物については、従来の非毒性固体キャリアを用い得、例えば、製剤用
マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム
などが挙げられる。経口投与について、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、以
前から挙げられているキャリアのような通常使用される任意の賦形剤および一般
に10〜95％の有効成分を組み込むことにより形成される。
エアロゾル投与については、複合体は、好ましくは、界面活性剤および推進剤
とともに微粉砕形態で供される。もちろん、界面活性剤は、非毒性でなければな
らず、好ましくは推進剤に可溶性のものである。そのような薬剤の代表としては
、６〜22個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステアリン
酸、およびオレイン酸）と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物（例えば
、エチレングリコール、グリセロール、エリトリトール、アラビトール、マンニ
トール、ソルビトール、ソルビトールから誘導されるヘキシトール無水物）との
エステルまたは部分エステル、およびこれらのエステルのポリオキシエチレンお
よびポリオキシプロピレン誘導体である。混合されたグリセリドまたは天然のグ
リセリドのような混合エステルが用いられ得る。界面活性剤は組成物の0.1重量
％〜20重量％、好ましくは0.25〜５重量％を構成する。組成物の残りは通常は推
進剤である。液化推進剤は、典型的には雰囲気温度で気体であり、加圧下で凝縮
される。適切な液化推進剤は、ブタンおよびプロパンのような５個までの炭素を
含む低級アルカンであり；好ましくは、フッ素化またはフッ素化塩素化アルカン
を含む。上記の混合物もまた使用され得る。エアロゾルの生成において、適切な
バルブを装備した容器に、微粉砕化合物および界面活性剤を含有する適切な推進
剤を充填する。従って、成分はバルブ作用によって放出されるまで加圧下で維持
される。
複合体を含有する組成物は、治療的、予防的、または診断的適用について投与
され得る。治療的投与において、疾患およびその合併症の徴候を治癒または少な
くとも部分的に阻止するのに十分な量で、上述のように疾患を既に罹う患者に組
成物が投与される。これを達成するのに十分な量を「治療的有効量」と定義する
。これについての効果的な量は、疾患の重篤度、および患者の体重、ならびに患
者の一般的状態に依存する。上記のように、これは典型的には約0.5mg/kgと約25
mg/kgとの間、好ましくは約３mg/kgと約15mg/kgとの間である。
予防的適用において、本発明の複合体を含有する組成物は、特定の疾患の罹患
性または危険性がある患者に投与される。このような量は「予防的有効量」と定
義される。この使用において、正確な量は、さらに、患者の健康状態および体重
に依存する。用量は、一般的に、上記の範囲である。
診断的適用においては、適当な複合体またはそのカクテルを含有する組成物を
、自己免疫疾患状態を有することが疑われる患者に投与して、疾患に関連する自
己反応性Ｔ細胞の存在を決定する。あるいは、特定の処置の効力がモニターされ
得る。これを達成するのに十分な量は、「診断的有効量」と定義される。この使
用では、正確な量は、患者の健康状態などに依存するが、一般には、用量当たり
0.01〜1000mgの範囲、特に患者当たり約10〜約100mgの範囲である。
本発明を特定の実施例により詳細に記載する。以下の実施例は説明の目的のた
めに提供され、本発明を限定および規定することを意図しない。
実施例
実施例１
本実施例では、MBPからの高親和性および低親和性免疫優性ペプチドエピトー
プを選択し、精製されたHLA-DR2に対するpH依存性結合特性を有することを示し
た。材料および方法
細胞株、抗体および化学物質
単形ヒトHLA-DR分子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株L243を、American Type Culture Collection（Bethesda，メリーランド州）
から入手した。HLA-DR2（DRB1*1501およびDRB5*0101）を発現するホモ接合リン
パ芽球様細胞株GM03107は、National Institute of General Medical Sciences
(NIGMS)ヒト遺伝子変異体細胞寄託所（Coriell Institute of Medical Research
，ニュージャジー州）から入手した。HLA-DR2ヘテロダイマーに対するウサギポ
リクローナル抗体は、Zymogenetics（ワイオミング州）から入手した。ｐ-ニト
ロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物はSigma Chemicals（ミズーリー州）か
ら購入した。既知量のビオチン分子を含有する免疫的に純粋なビオチン化ウシ血
清アルブミンは、Pierce Chemicalsから購入した。ストレプトアビジン結合精製
アルカリ性ホスファターゼはTropix，Inc．（マサチューセッツ州）から入手し
た。
リンパ芽球様細胞からのヒトHLA-DR2の精製
EBV形質転換リンパ芽球様細胞からのHLA-DR2の精製を、重要でないいくらかの
改変を施して、以前に記載されているように行った(Nag B.ら，Proc．Natl．Aca
d．Sci．U.S.A．90:1604-1608(1993))。Triton X-100細胞溶解物を、L243結合Se
pharose-4Bカラムにかけ、そして結合したDR2を、pH11.3の0.05％n-ドデシルβ-
D-マルトシド（DM）界面活性剤を含有するリン酸系緩衝液で溶出させた。画分を
１Ｍ酢酸で直ちに中和し、DR2プールを、0.5Ｍ NaClおよび0.05％DM（pH6.0）を
含有するリン酸緩衝液中で、DEAEイオン交換カラムを通して回収した。次いで、
精製したタンパク質を180kD膜を通して濾過し、13.5％SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、続いて銀染色（LabLogix 銀染色キット（silver stain kit），Bel
mont,カリフォルニア州）によって特徴付けした。
種々のMBPペプチドの合成
Applied Biosystems 431A自動ペプチド合成機上で側鎖保護Fmocアミノ酸を用
い、標準的な固相法によって、種々のN-アセチル化ミエリン塩基性タンパク質ペ
プチドアナログ：配列Ac-YDENPVVHFFKNIVTPRTPPを有するMBP（83-102）Ｙ83ペプ
チド；配列Ac-GFGYGGRASDYKSAHKGFKGを有するMBP（124-143）ペプチド；配列Ac-
FKGVDAQGTLSKIFKLGGRDを有するMBP（143-168）および配列Ac-ASQKRPSQRHGSKYを
有するMBP（１-14）を合成した。脱保護した粗製ペプチドを逆相HPLCによって精
製し、精製ペプチドの均質性および同一性を質量分析によって確認した。
ビオチン-MBPペプチド結合体の調製
ペプチド樹脂（0.25mmole）を、122mgのD-ビオチン、79.6mgの1-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール水和物（HOBT）および81μlの6.4Mジイソプロピルカルボジイ
ミド（DIPCDI）溶液を含有する15mlのN-メチルピロリジノン（NMP）に懸濁した
。懸濁液を室温で一晩穏やかに混合した。樹脂の小サンプルをNMPで洗浄し、ニ
ンヒドリンテストに付して、反応の完了を確認した。次いで、樹脂を濾過し、50
mlのNMPおよびメタノールで交互に２回洗浄し、次いで、メタノールおよびジク
ロロメタン（DCM）で交互に２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した。スカベン
ジャーを含有するトリフルオロ酢酸（TFA）を用い、ペプチドを樹脂から切断し
た。エーテルでの沈殿によって粗製ビオチン化ペプチドを単離し、減圧下で乾燥
させた。次いで、逆相HPLCによってビオチン化ペプチドを精製し、精製ペプチド
の同一性を質量分析によって確認した。
複合体の調製およびペプチド結合アッセイ
結合ペプチドの定量には、濃度２μg/mlのアフィニティー精製したHLA-DR2を3
7℃、pH7.0にて、増大したモル過剰のビオチン化MBPペプチドと共に96時間イン
キュベートした。いくらか改変を施して、以前に記載されているように(Jensen
，J．Exp．Med．171:1779-1784(1991); Reayら，Eur．Molec．Biol．Org．J．11
:2829-2839(1992))、酵素結合アビジン系を用いる抗体捕獲プレートアッセイに
よって、得られた複合体調製物を分析した。0.014〜1.80pmoleの間の範囲のBSA-
ビオチン結合体を用い、標準曲線を作成した。MHCクラスII抗原の非存在下で当
量のビオチン化ペプチドを、このアッセイで１％未満の非特異的結合を示すコン
トロールとして用い、ペプチド占有率の計算のために差し引いた。
プレートアッセイによる解離速度論測定
HLA-DR2とビオチン化MBPペプチドとの複合体を調製し、G-75サイズ排除ゲル濾
過クロマトグラフィーによって非結合ペプチドから精製した。次いで、得られた
複合体を３つの異なる温度（４℃、25℃および37℃）でインキュベートした。種
々の時点で、複合体サンプルを取り出し、−20℃で凍結した。各実験の最後に、
サンプルを、前記した抗体捕獲プレートアッセイによって分析した。結果
pH、ペプチド濃度およびペプチドインキュベーションの持続時間のような種々
の会合パラメーターを、アフィニティー精製したHLA-DR2（DRB1*1501/DRB5*0101
を含む）および４種の異なるMBPペプチドを用いてテストした。これらのペプチ
ドを、HLA-DR2に対する親和性と共にその免疫優性特性に基づいて選択した(Vall
iら，J．Clin．Invest．91:616-628(1993))。実施例２に示すように、MBP（１-1
4）ペプチドは精製HLA-DR2に対してほとんど親和性を有さず、すべての結合アッ
セイにおいてコントロールペプチドとして使用された。
最大ペプチド占有についての最適pHを決定するために、HLA-DR2を、５〜10のp
H範囲の結合緩衝液中で、50倍モル過剰の種々のMBPペプチドと共にインキュベー
トした。図1Aに示すように、MBP（83-102）ペプチドのみが酸性pHで増大した結
合を示した。対照的に、MBP（124-143）ペプチドは塩基性pHで最大結合を示した
（図1B）。第３のMBPペプチドMBP（143-168）の最大ペプチド結合は中性pHで観
察された（図1C）。酸性条件（pH４またはそれ以下）はMHCクラスIIヘテロダイ
マーをモノマーαおよびβ鎖に解離させることが知られている(Passmoreら，J．
Immunol．Meth．155:193-200(1992))ので、本発明者らは、非還元SDS-PAGE分析
によって、pH５および６で調製したDR2.MBP（83-102）複合体の分子特性を評価
しようとした。ゲル電気泳動の結果は、pH５および６で調製した複合体がヘテロ
ダイマーのモノマーへの顕著な解離を有することを示す。このような解離の１つ
の可能性は、電気泳動条件の効果によるものであろう。SDSの存在下での電気泳
動条件のゲル中でpH５またはpH６で観察された解離を区別するために、種々のpH
値で作製した複合体調製物をヘテロダイマー特異的ELISAによって分析した。96
ウェルプレートに、ヘテロダイマーDR2のみを認識することが特徴付けられてい
る抗DR2ポリクローナル抗体をコートした。次いで、DR2ヘテロダイマーに特異的
なペルオキシダーゼ結合L243モノクローナル抗体によって結合複合体を検出した
。pH5.0および6.0で調製された複合体はダイマー特異的抗体によって十分認識さ
れることが判明し、これはpH5.0および6.0で調製されたDR2.MBP複合体ヘテロダ
イマーが存在することを示唆する。この結果は、SDS-PAGE分析で観察された解離
が電気泳動条件によるものであることを明瞭に確認するものであるが、MHCクラ
スIIは以前に記載されているように構造がよりオープンであるようである（Jens
on，J．Exp．Med．171:1779-1784(1990)）。当量の非結合性MBP（１-14）ペプチ
ドを、すべての場合において何らかの顕著な結合を示さなかったHLA-DR2と共に
インキュベートすることによって、種々のpH値でのペプチド結合の特異性を証明
し
た。これらの結果に基づき、最適pH６、７および８が、各々、MBP（83-102）、M
BP（143-168）およびMBP（124-143）ペプチドについて選択された。
各最適pHの結合緩衝液にて、種々のビオチン化MBPペプチドをHLA-DR2に対して
インキュベートすることによって、最大ペプチド結合の経時変化を調べた。サン
プルを37℃でインキュベートし、種々の時点でアリコートを取り出し、−20℃で
保存した。図３に示したオンレート速度論的結果(on rate kinetic result)は、
３種すべてのMBPペプチドの結合が72時間までに完了したことを示す。インキュ
ベーション期間のさらなる増加は、ペプチドでのDR2の占有を増加させなかった
。すべてのMBPペプチドの場合で、ペプチド結合の増加は最初に時間と共に観察
され、続いてMHC-ペプチド複合体の安定化の前に少し低下した。精製MHCクラスI
I分子に対するペプチド結合のこの特徴的速度論は、本発明者らの研究室におい
て、いくつかのネズミ、ラットおよびヒトのクラスII-ペプチド複合体形成につ
いて一貫して観察された。そのような速度論の説明は現時点では明瞭に十分に理
解されない。１つの解釈は、精製されたMHCクラスII分子の２つのコンフォメー
ション状態、いわゆる「フロッピー(floppy)」および「コンパクト(compact)」(
Dornmairら，Cold Spring Harbor Symp．54:409-416(1989))の存在によるもので
あろう。フロッピー形態はSDS-PAGE分析に基づくオープンな構造分子と考えられ
、弱いペプチド結合親和性を有し得る。
MHCクラスIIの占有率に対するペプチド濃度の効果を調べるために、HLA-DR2を
、その最適pHにて72時間、漸増量の３種のMBPペプチドと共にインキュベートし
た。ペプチド濃度の増加は、テストした３種すべてのMBPペプチドの場合におい
て結合の増加を示した。図４に示す結果は、DR2濃度に対して約50〜100倍モル過
剰の各MBPペプチドがDR2の完全な飽和に十分であったことを示す。両高親和性MB
Pペプチド［MBP（83-102）およびMBP（124-143）］の場合には、50倍モル過剰の
ペプチド濃度が、それらの最適pHでDR2のほぼ100％の占有に導く（図４Ａおよび
４Ｂ）。しかしながら、低親和性MBP（143-168）ペプチドの場合には、ペプチド
濃度のそのような増加は、DR2の100％占有を示さなかった。この場合、結合は、
100倍モル過剰のペプチド濃度でDR2の35％占有にて飽和した（図４Ｃ）。別の実
験で、MBP（124-143）ペプチドのDR2への結合を、最適pH８の代わりにpH６で調
べ
た場合、ペプチド占有率は、1000倍モル過剰ペプチドであっても100％に達しな
かった。これは、最適pHの予備選択がインビトロのペプチド負荷のための重要な
工程であることを示唆する。増大したペプチド濃度におけるペプチド結合の特異
性は、図４の各パネルに示したように、当量のMBP（１-14）ペプチドをインキュ
ベートすることによって証明した。
最適結合条件でのHLA-DR2に対する３種すべてのMBPペプチドの結合のさらなる
特異性を競合結合アッセイによって証明した（図５）。精製したHLA-DR2を、最
適結合条件下にて、漸増濃度の非ビオチン化同一ペプチドまたは次の高親和性MB
Pペプチドのいずれかの存在下で、ビオチン化ペプチドと共にインキュベートし
た。図５Ａに示すように、ビオチン化MBP（83-102）の結合は、10倍過剰濃度の
非ビオチン化MBP（83-102）ペプチドによって完全に阻害された。同様に、ビオ
チン化MBP（83-102）ペプチドの結合の約40％阻害がMBP（124-143）で観察され
た。MBP（124-143）によるDR2へのビオチン化MBP（83-102）ペプチド結合の部分
的阻害は、MBP（83-102）ペプチドに対する異なる親和性を持つ２つの異なるコ
ンフォメーション状態の精製DR2の存在によると説明できる。ビオチン化MBP（12
4-143）ペプチドの結合は、MBP（83-102）およびMBP（124-143）の非ビオチン化
ペプチド両方によって完全に阻害された（図５Ｂ）。予測されるように、DR2に
対するそれらの親和性に基づき、MBP（83-102）はMBP（124-143）より効果的で
ある。同様に、ビオチン化MBP（143-168）ペプチドのDR2への結合は、等モル濃
度のMBP（83-102）およびMBP（124-143）ペプチドの両方によって劇的に阻害さ
れた。従って、競合結合結果は、DR2に対する３種のMBPペプチドの親和性とよく
相関する。
最後に、十分に最適化された結合条件で調製されたDR2とMBPペプチドとの種々
の複合体の安定性を、45日間、３つの異なる温度（４℃、25℃および37℃）で調
べた。安定性研究に先立ち、Sephadex G-75ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフ
ィーによって、複合体を遊離非結合ペプチドから精製した（図６）。図７に示す
解離速度論データは、DR2とMBPペプチドとの３種すべての複合体が４℃で安定で
あることを示す。25℃では、DR2とMBP（83-102）ペプチドとの複合体のみが長期
間安定な会合を示し、そして37℃では、３種すべての複合体が時間と共に結合ペ
プチドの増大した解離を示す。37℃で他の２種の複合体と比較して、オフレート
(off-rate)速度論はDR2.MBP（83-102）ペプチド複合体について明瞭に異なった
。解離速度論データは、精製DR2に対する３種のMBPペプチドの結合親和性とよく
相関する。
結果として、ここに示す結果は、インビトロ結合条件の最適化が、精製MHCク
ラスII分子への抗原性ペプチドの負荷を最大にし得ることを示す。本研究でテス
トした種々の結合パラメーターの中で、結合緩衝液のpHがペプチド負荷において
最も重要であるようである。最大ペプチド結合のための最適pHは、ペプチドの正
味の電荷およびMHCクラスII分子の結合溝に基づいて、各ペプチドおよびMHCクラ
スII分子について異なる。高親和性ペプチドの場合、結合緩衝液のpHの変化は、
MHCクラスII分子の100％占有を生じ得る。変化したpHにおけるペプチドのそのよ
うな結合は、この報告における両競合アッセイによって証明されるように、特異
的であるようである。高親和性ペプチドと免疫優性エピトープとの良好な相関は
、抗原性エピトープのpHスペクトルにおける結合を、抗原の高親和性免疫優性エ
ピトープのスクリーニングで利用できることを示唆する。MHCクラスIIと抗原性
ペプチドとの精製複合体は自己免疫疾患の抗原特異的療法において利用できるの
で、所定の組成のMHCクラスII-ペプチド複合体のpH依存的調製は顕著な臨床的関
連性を有する。
実施例２
本実施例は、MHCクラスIIと抗原性ペプチドとをより高いペプチド濃度にて中
性pHで同時インキュベートすることによって、100％回収で、精製MHCクラスII抗
原に合成ペプチドを負荷する別の方法を記載する。材料および方法
細胞株、抗体および化学物質
単形ヒトHLA-DR分子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株L243を、American Type Culture Collection（Bethesda，メリーランド州）
から入手した。HLA-DR2（DRB1*1501およびDRB5*0101）を発現するホモ接合リン
パ芽球様細胞株GM03107は、National Institute of General Medical Sciences
(NIGMS)ヒト遺伝子変異体細胞寄託所（Coriell Institute of Medical Research
，ニュージャジー州）から入手した。二次元電気泳動のためのアンフォリン(amp
holine)および種々の等電点マーカーはBio-Rad Laboratories，Inc.から購入し
た。
リンパ芽球様細胞からのヒトHLA-DR2の精製
EBV形質転換リンパ芽球様細胞を、２mM L-グルタミンおよび10％熱不活化FBS
を含有するRPMI1640培地中で培養し、１×106細胞／mlの密度で回収した。モノ
クローナル抗体の精製およびCNBr活性化Sepharose 4Bへの結合を、以前に記載さ
れているように行った（Nagら，J．Immun．148:3483-3491(1992)）。HLA-DR2分
子を、いくらかの改変を施して、以前に記載されているように（Nagら，J．Immu
nol．150:1358-1364(1993)）、L243モノクローナル抗体結合Sepharose 4Bカラム
上の培養したGM03107リンパ芽球様細胞のTriton X-100膜抽出物から精製した。
界面活性剤抽出細胞溶解物を抗体アフィニティーカラムにかけ、0.5％Triton X-
100を含有する10カラム容量のPBS、続いて0.01％Tween-80を含有する５カラム容
量のPBSで洗浄した。0.01％Tween-80を含有する20mMリン酸緩衝液（pH11.3）中
で結合DR2を溶出させた。画分を酢酸で直ちに中和し、DR2プールを、0.5Ｍ NaCl
および0.01％Tween-80を含有するリン酸緩衝液(pH6.0)中、DEAEイオン交換カラ
ムを通して回収した。次いで、精製したタンパク質を180kD膜を通して濾過した
。13.5％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて銀染色（LabLogix 銀染色
キット（Belmont,カリフォルニア州）によってアフィニティー精製DR2を特徴付
けした。
ペプチドの合成
Applied Biosystems 431A自動ペプチド合成機上で側鎖保護Fmocアミノ酸を用
い、標準的な固相法によって、種々のN-アセチル化ミエリン塩基性タンパク質ペ
プチドアナログ：配列Ac-YDENPVVHFFKNIVTPRTPPを有するMBP（83-102）Ｙ83ペプ
チド；配列Ac-GFGYGGRASDYKSAHKGFKGを有するMBP（124-143）ペプチド；および
配列Ac-ASQKRPSQRHGSKYを有するMBP（１-14）を合成した。脱保護した粗製ペプ
チドを逆相HPLCによって精製し、精製ペプチドの均質性および同一性を質量分析
によって確認した。
ビオチン-MBPペプチド結合体の調製
ペプチド樹脂（0.25mmole）を、122mgのD-ビオチン、79.6mgの1-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール水和物（HOBT）および81μlの6.4Ｍジイソプロピルカルボジイ
ミド（DIPCDI）溶液を含有する15mlのN-メチルピロリジノン（NMP）に懸濁した
。懸濁液を室温で一晩穏やかに混合した。樹脂の小サンプルをNMPで洗浄し、ニ
ンヒドリンテストに付して、反応の完了を確認した。次いで、樹脂を濾過し、50
mlのNMPおよびメタノールで交互に２回洗浄し、次いで、メタノールおよびジク
ロロメタン（DCM）で交互に２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した。スカベン
ジャーを含有するトリフルオロ酢酸（TFA）を用い、ペプチドを樹脂から切断し
た。エーテルでの沈殿によって粗製ビオチン化ペプチドを単離し、減圧下で乾燥
させた。次いで、逆相HPLCによってビオチン化ペプチドを精製し、精製ペプチド
の同一性を質量分析によって確認した。
複合体の調製およびペプチド結合アッセイ
結合ペプチドの定量には、濃度２μg/mlのアフィニティー精製したHLA-DR2を3
7℃、pH7.0にて、増大したモル過剰のビオチン化MBPペプチドと共に96時間イン
キュベートした。いくらか改変を施して、以前に記載されているように（Reayら
、EMBO J．11:2829-2839(1992)）、酵素結合アビジン系を用いるプレートアッセ
イによって、得られた複合体調製物を分析した。50μgのアフィニティー精製L24
3モノクローナル抗体当たり１μgを、PBS中、96ウェルプレートのウェルごとに
コートした。プレートを４℃で18時間インキュベートし、25℃にて、１％魚類ゼ
ラチンで30分間ウェルをブロックした。15.6ng/ml〜2.0μg/ml（0.013〜1.66pmo
le）の濃度の予め形成された複合体（0.78〜100ng）を、0.1％魚類ゼラチン、0.
01％Tween-80および0.02％アジドを含有するPBS緩衝液中、各ウェルにアプライ
した。プレートを25℃で２時間インキュベートし、0.1％Tween-20を含有するPBS
で洗浄した。結合したビオチン化ペプチドを、0.1％魚類ゼラチンを含有するPBS
に5000倍希釈したストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼ結合体（Tropi
x,マサチューセッツ州）の存在下でプレートを25℃にて30分間インキュベートす
ることによって検出した。ウェルを、0.1％Tween-20を含有する50mMトリスHCl（
pH7.0）で洗浄し、200μl／ウェルの、0.1ＭジエタノールアミンpH10に溶解させ
た１mg／mlのp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム(Sigma Chemicals)で発色
させた。次いで、結合したペプチドを伴うDR2抗原の割合を標準曲線から計算し
た。0.014〜1.80pmoleの間の範囲のBSA-ビオチン結合体を用い、標準曲線を作成
した。MHCクラスII抗原の非存在下で当量のビオチン化ペプチドを、１％未満の
非特異的結合を示すコントロールとして用い、ペプチド占有率の計算のために差
し引いた。
結合ペプチドの酸抽出およびナロウボアHPLC分析
逆相HPLCの分析では、0.1mg／mlの濃度のミリグラム量のDR2を、非ビオチン化
MBP（83-102）ｙ83ペプチドと共にインキュベートし、複合体混合物をL243結合S
epharose 4Bカラムに通すことによって非結合ペプチドを除去した。次いで、内
因的に結合したペプチドの酸抽出に先立ち、エタノール：クロロホルム（１：４
）相分離によってTween-80界面活性剤を除去した。HLA-DR2とMBPペプチドとの複
合体からの結合ペプチドの抽出は、重要でないいくらかの改変を施して、以前に
記載されているように(Chiczら，Nature 358:764-768(1992))行った。沈殿した
複合体調製物を、10％酢酸の存在下で70℃にて15分間インキュベートした。反応
混合物を遠心分離し、ペプチドプール上清を回収し、−80℃まで凍結させ、そし
て凍結乾燥した。0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中の10〜60％の漸増アセトニト
リルの線形グラジエントにて、C-18（0.21×15cm）Vydac 218TP5215ナロウボア
カラムを用い、Waters(Millipore)590モデルで、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）を行った。精製複合体からの酸溶出HPLCペプチドピークを回収し、凍
結乾燥し、質量分析によって同一性を確認した。
二次元ゲル電気泳動
O'Farrell(O'FarrellおよびGoodman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8797-8
801(1976))によって以前に記載されている方法をいくらか改変して用いて、第一
の次元（IEF）にてそれらの電荷に従ってポリペプチドを分離し、次いで、第二
の次元にて、それらのサイズに従って分離した。簡単に述べると、第一の次元の
ゲルをガラスチューブ（１mm内径×7.5cm長）中、6.5cm，の高さに注いだ。ゲル
溶液は、9.2Ｍ尿素、5.5％アクリルアミド／ビス、２％Triton X-100、および1.
5％アンフォリンpH５〜７と0.5％pH３〜10との混合物を含有した。これを脱気し
、そして10mlのゲル混合物当たり、50μlの10％過硫酸アンモニウムおよび18
μlのN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）を添加することによっ
て重合させた。精製したHLA-DR2およびDR2とMBP（83-102）Ｙ83ペプチドとの複
合体をアセトン沈殿によって濃縮し、サンプル緩衝液（9.5Ｍ尿素、2.0％Triton
X-100、150mM DTTおよび1.5％アンフォリンpH５〜７および0.5％pH３〜10の混
合物）中に再懸濁し、37℃で18時間インキュベートした。５μgの各サンプルを
チューブ中にロードし、そしてゲルに８μlの2D標準物(Bio-Rad Laboratories，
Inc.)を重層(overlay)した。30μlのサンプル重層溶液（９Ｍ尿素、１％アンフ
ォリンpH５〜７、0.5％アンフォリンpH３〜10および0.05％ブロモフェノールブ
ルー）を用いて、サンプル溶液に重層した。IEF電気泳動を900Ｖで3.5時間行っ
た。下部チャンバー緩衝液は10mMリン酸を含み、上部チャンバーは20mM水酸化ナ
トリウムを含有した。第一の次元の泳動の完了後、ゲルを取り出し、Bio-Radミ
ニゲルアセンブリー中の4.5％層積(stacking)ゲルを含有する13.5％ポリアクリ
ルアミド-SDSゲルの頂部に置いた。IEFチューブゲルを、還元サンプル緩衝液（6
2.5mMトリスHCl（pH6.8）、10％グリセロール、２％SDSおよび25mM DTTおよび0
.05％ブロモフェノールブルー）と共に、５分間インキュベートし、95℃まで５
分間予備加熱し、次いで電気泳動を、２分間の50mAの一定電流、続いて45分間の
25mAの一定電流にて行った。LabLogix銀染色キットを用いてゲルを分析用に染色
した。結果
DRB1*1501およびDRB5*0101クラスII分子を共に含有するHLA-DR2を、抗体結合
アフィニティーカラムで、続いてイオン交換クロマトグラフィーによってリンパ
芽球様細胞から精製した。精製タンパク質の銀染色は98％を超える純度を示した
。ペプチド結合を、ビオチン化MBPペプチドを用いるプレートアッセイによって
測定し、アルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジンを用いる比色法によ
って定量した。HLA-DR2の非存在下であること以外は同一の条件下でインキュベ
ートした当量のビオチン化ペプチドをコントロールとして使用した。中性pHにお
けるMBP（83-102）Ｙ83ペプチドでのHLA-DR2の最大ペプチド占有の経時変化を、
50倍モル過剰のペプチド濃度の存在下で最適化し、37℃にて72〜96時間であるこ
とが判明した（図7A）。HLA-DR2に対して顕著な結合を示さない同一条件下で、M
BP
（１-14）ペプチドをインキュベートすることによって、MBP（83-102）Ｙ83ペプ
チド結合の特異性を証明した。これらの結果は、MBP（１-14）ペプチドが異なる
DR2対立遺伝子およびイソタイプに対する結合を示さない最近の観察(Valliら，(
1993)，前掲)と一致した。最適化条件に続き、精製HLA-DR2を漸増濃度のビオチ
ン化MBP（83-102）ｙ83ペプチドと共にインキュベートした。図7Bに示すように
、結合ペプチドで占められたDR2の割合は、漸増ペプチド濃度に従って増加した
。MBP（83-102）Ｙ83ペプチドでのHLA-DR2の完全な飽和は、300〜500倍モル過剰
のペプチド濃度で観察された。2000倍モル過剰までのペプチド濃度のさらなる増
加は、さらなる結合を示さなかった。これは、MBP（83-102）Ｙ83ペプチドでのH
LA-DR2の飽和が、高濃度でのペプチド凝集によるものではないことを示唆する。
ペプチド結合の特異性は、精製DR2を当量のビオチン化MBP（１-14）ペプチドと
共にインキュベートすることによって証明された。ビオチン化MBP（83-102）Ｙ8 3
ペプチド単独は、本発明者らのプレートアッセイでは顕著な結合を示さなかっ
た。このことは、当量のビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチド単独をHLA-DR2の
非存在下でインキュベートすることによって確認された。これは、１％未満の結
合を示し、ペプチド占有率を計算するのに差し引いた。100％を超える、MBP（83
-102）Ｙ83ペプチドのわずかに増加した結合が、いくつかの実験で一貫して観察
された。本発明者らの研究室の以前の結果は、MHCクラスII抗原の精製された単
離αおよびβポリペプチド鎖が、インタクトなヘテロダイマーと同様に、抗原性
ペプチドに等しく結合できることを示した(Passmoreら，J．Immunol．Meth．155
:193-200(1992); Nagら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8797-8801(1993))。
また、MHCクラスII抗原が「フロッピー」および「コンパクト」として知られる
２つのコンフォメーション状態で存在し(Dornmairら，(1990)，前掲)、フロッピ
ー形態は分子当たり２個のペプチドに結合できることが報告されている(Tampeら
，Science 255:87-89(1991)); KroonおよびMcConnell，Proc．Natl．Acad．Sci
．USA 90:8797-8801(1993))。100％を超える、HLA-DR2に対するMBP（83-102）Ｙ83
ペプチドの観察された増大した結合は、精製DR2調製物における少量(small fr
action)の解離αおよびβ鎖の存在またはヘテロダイマーのコンフォメーション
状態のいずれかのためと説明できる。
より高いペプチド濃度におけるビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチドのDR2と
のさらなる特異性は、競合アッセイで証明された。この実験において、漸増濃度
の非ビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチドの存在下、精製HLA-DR2を300倍モル
過剰のビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチドと共に同時インキュベートした。
図8Aに示すように、ビオチン化MBP（83-102）Ｙ83結合を、漸増濃度の非ビオチ
ン化MBP（83-102）Ｙ83ペプチドと競合させ、33倍を超えるビオチン化MBP（83-1
02）Ｙ83ペプチドの濃度で完全に阻害した。同様に、HLA-DR2に対してより高い
結合親和性を有する(Valliら，(1993)，前掲)同じヒトミエリン塩基性タンパク
質MBP（124-143）由来の別のエピトープは、ビオチン化MBP（83-102）Ｙ83ペプ
チドの結合について競合することができた(図8B)。
HLA-DR2とMBP（83-102）Ｙ83との精製複合体が１つのMBP（83-102）Ｙ83ペプ
チドを含有することを証明するために、ミリグラム量の非ビオチン化MBP（83-10
2）Ｙ83ペプチドとの複合体を調製し、結合したペプチドを特徴付けるのに使用
した。これは、予め負荷されたDR2分子からの結合ペプチドの酸溶出プロフィー
ルと後に負荷されたDR2分子からの結合ペプチドの酸溶出プロフィールとを比較
することによって達成された。酸抽出に先立ち、DR2.MBP（83-102）Ｙ83複合体
を、L243結合Sepharose 4Bカラムに結合させ、続いて十分洗浄することによって
、非結合遊離ペプチドの複合体調製物からの完全除去を達成した。次いで、精製
複合体を樹脂から溶出させ、酢酸抽出に付した。溶出したペプチドをナロウボア
HPLC分析によって特徴付けした（図９）。100％負荷された複合体から抽出した
ペプチドの逆相HPLC分析は、純粋なMBP（83-102）Ｙ83ペプチドの保持時間と同
一の保持時間を持つ１つのピークを示した（図9D）。対照的に、精製HLA-DR2か
らの酸溶出ペプチドのHPLC分析は、顕著な量の内因性ペプチドを示した（図9B）
。100％負荷された複合体から溶出したペプチドピークの同一性を、質量分析に
よって確認した。
内因的に結合したペプチド以外に、精製MHCクラスII分子のかなりの部分がし
ばしば、非変異鎖ポリペプチドと会合することが知られている。小胞体における
非変異鎖の会合は２つの重要な機能を供する。まず、それはクラスII分子が、輸
送の初期段階でペプチドに結合するのを妨げる（RocheおよびCresswell，Proc．
Natl．Acad．Sci．USA 88:8730-8734(1991); Lotteauら，Nature 348:600-605(1
990); RocheおよびCresswell，Nature 345:615-618(1990)）。第二に、それは、
酸性エンドソーム区画に対してクラスII-非変異鎖複合体を標的づける細胞質シ
グナル(BakkeおよびDobberstein，Cell 63:707-716(1990); Lotteau ら，Nature
348:600-605(1990))を含有する。酸性エンドソーム区画では、非変異鎖のタン
パク質分解および続いて解離が起こり、細胞表面への輸送に先立って、抗原性ペ
プチドの結合が可能となる。精製MHC II-非変異体複合体はインビトロで抗原性
ペプチドに結合できないこと(RocheおよびCresswell．(1990)，前掲; Newcombお
よびCresswell，J．Immunol．150:1358-1364(1993))、ならびに可溶性および膜
結合性の非変異鎖は共にMHCクラスIIヘテロダイマーへのペプチドの結合をブロ
ックできる(Lotteauら、(1990)，前掲; Rocheら，EMBO J．11:2829-2839(1992))
ことが示されている。100％負荷されたHLA-DR2とMBP（83-102）Ｙ83との複合体
において非変異鎖ポリペプチドが全く存在しないことを証明するために、二次元
ゲル電気泳動を行った。このゲル系において、IEF（pH５〜７）を第一の次元で
行い、続いて第二の次元にて13.5％ポリアクリルアミド-SDSによって行った。ゲ
ルの結果から、精製複合体において非変異鎖ポリペプチドは検出されなかった。
対照的に、精製HLA-DR2は、種々の分子サイズを持つ、非変異鎖ポリペプチドの
複数のバンドを示した。
これらの結果は、高濃度のMBP（83-102）Ｙ83ペプチドがHLA-DR2抗原の完全な
負荷に使用できることを証明する。本明細書に記載したプレート結合アッセイは
、この現象の研究を容易にする。ストレプトアビジンの感度および親和性が異常
に高いビオチン化ペプチドを用い、本発明者らは、10,000〜20,000倍モル過剰の
ペプチド濃度がわずか400-800μgのビオチン化ペプチドを表すにすぎない0.025p
mole程度の低い複合体を用いてこれらの実験を行うことができた。加えて、ビオ
チン化ペプチドを用いるプレートアッセイは、多くのサンプルが一度に分析でき
、非結合ペプチドの除去が必要ないという利点を有する。
前記実施例は発明を説明するために提供され、その範囲を限定するものではな
い。本発明の他の変形は当業者に容易に明らかであり、添付の請求の範囲に含ま
れる。本明細書で引用したすべての出版物、特許、および特許出願は、本明細書
中に参考として援用される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 51/00 ＡＢＧ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ
Ｃ０７Ｋ 1/36 43/00 ＡＢＧ
19/00 37/02 ＡＡＢ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｋ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ムック， プラブハ ブイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94555,
フレモント，シワード ドライブ
34212