JPH10509446A - マクロファージ刺激蛋白質を使用する方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はマクロファージ刺激プロテイン（「ＭＳＰ」）を使用して巨核球の成熟および血小板の生産を刺激する方法を提供する。本方法においては、ＭＳＰの有効量を生体内に投与でき、またはＭＳＰの有効量を試験管内で巨核球の成熟を刺激して血小板を生産するためにも使用できる。哺乳類における血小板減少症のＭＳＰを用いる処置法も提供する。さらにＭＳＰを包含するキットおよび製造物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 マクロファージ刺激蛋白質を使用する方法およびキット 発明の分野 本発明は一般的に巨核球の形成および血小板の形成を刺激する方法に関する。 さらに特定的には、本発明はマクロファージ刺激プロテインを使用して巨核球の 成熟および血小板の生産を刺激する方法に関する。本発明はまた、たとえば血小 板減少症のようなある種の造血器疾患の処置法、およびマクロファージ刺激プロ テインを含むキットに関する。 発明の背景 １．肝実質細胞増殖因子 肝実質細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）は、特定の組織および細胞型に対する増殖 因子として機能する。ＨＧＦは最初は肝実質細胞に対する有糸分裂促進剤として 確認された（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓなど、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４４ 巻：４４１４〜４４１９頁（１９８４年）；Ｒｕｓｓｅｌなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１９巻：１８３〜１９２頁（１９８４年）；Ｎａｋａｍｕ ｒａなど、Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１２２巻： １４５０〜１４５９頁（１９８４年）］。前記のＮａｋａｍｕｒａなどは肝臓を 部分的に切除したラットの血清から得たＨＧＦの精製を報告している。それに続 いてＨＧＦはラット血小板から精製され、そのサブユニットの構造が決定された ［Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８ ３巻：６４８９〜６４９３頁（１９８６年）；Ｎａｋａｍｕｒａなど、ＦＥＢＳ ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２４巻：３１１〜３１６頁（１９８７年）］。ヒトの血漿 から得られたヒトＨＧＦ（「ｈｕＨＧＦ」）の精製はＧｏｈｄａなど、Ｊ．Ｃｌ ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１巻：４１４〜４１９頁（１９８８年）によって最初 に記載された。 ラットＨＧＦおよびｈｕＨＧＦはともに分子としてクローニングされており、 「デルタ５−ＨＧＦ」と命名された天然起源アミノ酸５個欠失変異体を含めてク ローニングおよび配列決定がされている［Ｍｉｙａｚａｗａなど、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１６３巻：９６７〜９７３頁（１９ ８９年）；Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：４４０〜４４３頁 （１９８９年）；Ｓｅｋｉなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ ｏｍｍ．、１７２巻：３２１〜３２７頁（１９９０年）；Ｔａｓｈｉｒｏなど、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：３２００〜３２０４ 頁（１９９０年）；Ｏｋａｊｉｍａなど、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９ ３巻：３７５〜３８１頁（１９９０年）］。 ｈｕＨＧＦの成熟型はヒトの血清から精製したものの主たる型に対応するが、 これはヒトのプロホルモンのアミノ酸Ｒ４９４とＶ４９５番との間で蛋白分解的 切断によって誘導されたジスルフィドで結合したヘテロ二量体である。この切断 過程は４４０アミノ酸のα−サブユニット（Ｍ_r６９ｋＤａ）および２３４アミ ノ酸のβ−サブユニット（Ｍ_r３４ｋＤａ）から構成される分子を発生する。ｈ ｕＨＧＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はα−鎖およびβ−鎖の両方がプレプロ 前駆体蛋白質をコードする単一の読取り枠中に含まれていることを示す。予想さ れる成熟ｈｕＨＧＦの一次構造において、鎖間Ｓ−Ｓ橋はα−鎖のＣｙｓ４８７ およびβ−鎖のＣｙｓ６０４の間で形成されている［Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｎ ａｔｕｒｅ、前出、参照］。α−鎖のＮ−末端にはメチオニン基に始まる５４ア ミノ酸が先行する。このセグメントは３１残基の特徴的疎水性リーダー（シグナ ル）配列およびプロ配列を含む。α−鎖はアミノ酸（ａａ）５５から始まり、ク リングルドメイン４個を含む。α−鎖のクリングル１ドメインは約ａａ１２８か ら約ａａ２０６までに伸長し、クリングル２ドメインは約ａａ２１１と約ａａ２ ８８との間にあり、クリングル３ドメインは約ａａ３０３から約ａａ３８３まで に伸長するものと定義され、およびクリングル４ドメインは約ａａ３９１から約 ａａ４６４までに伸長している。 種々のクリングルドメインの定義は他の蛋白質（プロトロンビン、プラスミノ ーゲン）にあるクリングル様ドメインとの相同性に基づくので、それ故に前記の 限定は近似的なものに過ぎない。未だにこれらクリングルの機能は結論付けられ ていない。ｈｕＨＧＦのβ−鎖はセリンプロテアーゼの触媒ドメインと高度な相 同性を示す（プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインに対して３８％の 相同性）。しかしながら、セリンプロテアーゼの触媒三回対称軸を形成する残基 ３個の中で２個はｈｕＨＧＦ中には保存されていない。それ故に、そのセリンプ ロテアーゼ様ドメインにもかかわらず、ｈｕＨＧＦはプロテイン分解的活性を持 たないと思われ、β−鎖の正確な役割は未だ知られていない。ＨＧＦはα−鎖の ２９４位および４０２位およびβ−鎖の５６６位および６５３位に位置する推測 上のグリコシル化部位４個を含有する。 ヒト白血球から分離したｃＤＮＡの一部には１５塩基対のフレーム内欠失が観 察された。ＣＯＳ−１細胞でのそのｃＤＮＡ配列の一過性発現で、コードされて いるクリングル１ドメイン内にアミノ酸５個を欠失したＨＧＦ分子（デルタ５Ｈ ＧＦ）が完全な機能を果たすことが示された［Ｓｅｋｉなど、前出］。 天然起源ｈｕＨＧＦ変異体が確認されており、それはＮ−末端フィンガーに対 するコード配列および成熟ｈｕＨＧＦのクリングルドメインの最初の２個を含む ｈｕＨＧＦ転写の別種スプライシング型に対応する［Ｃｈａｎなど、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２５４巻：１３８２〜１３８５頁（１９９１年）；Ｍｉｙａｚａｗａなど 、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７巻：１５〜２２頁（１９９１年）］。 この変異体はＨＧＦ／ＮＫ２と命名され、成熟ｈｕＨＧＦの競合的拮抗剤である と提唱されている。ラットＨＧＦとｈｕＨＧＦとのアミノ酸配列の比較ではこの 配列２個は高度に保存されて同一の構造的特性を持つことが示されている。ラッ トＨＧＦにあるクリングルドメイン４個の長さはｈｕＨＧＦにあるものと正確に 同一である。さらにその上、全システイン残基は正確に同一の位置に配置されて おり、類似の第三次元構造を示唆する［Ｏｋａｊｉｍａなど、前出；Ｔａｓｈｉ ｒｏなど、前出］。 ＨＧＦ受容体はｃＭｅｔ−プロトオンコジーンの産物と同定されている［Ｂｏ ｔｔａｒｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：８０２〜８０４頁（１９９１年） ；Ｎａｌｄｉｎｉなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６巻：５０１〜５０４頁（１９９１ 年）］。この受容体はｐ１９０^METと命名され、１９０ｋＤａのヘテロ二量体（ ジスルフィド結合した５０ｋＤａのα−鎖および１４５ｋＤａのβ−鎖）である 膜スパンニングしたチロシンキナーゼ蛋白質からなる［Ｐａｒｋなど、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：６３７９〜６３８３頁（１９ ８７年）］。ＨＧＦのその受容体への結合活性はその分子の最初のクリングル２ 個を含むＮ−末端部分の機能ドメインによって伝達される［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８１巻：６９ １〜６９９頁（１９９１年）；Ｈａｒｔｍａｎｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９巻：１１５７４〜１１５７８頁（１９９２年）；Ｌｏｋ ｋｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１１巻：２５０３〜２５１０頁（１９９２年）； ＬｏｋｋｅｒおよびＧｏｄｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻： １７１４５〜１１７１５０頁（１９９１年）］。ｃ−Ｍｅｔ蛋白質はＨＧＦが結 合すると１４５ｋＤａβ−サブユニットのチロジン残基が燐酸化される。ＨＧＦ 遺伝子とＨＧＦ受容体遺伝子は共に染色体７の長アームのｑ１１．２〜ｑ２１． １領域内に配置されている［Ｄｅａｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻：３８５〜 ３８８頁（１９８５年）；Ｗｅｉｄｎｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：７００１〜７００５頁（１９９１年）；Ｓａｃｃｏ ｎｅなど、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３巻：９１２〜９１４頁（１９９２年）］。 肝不全患者の血漿［Ｇｏｈｄａなど、前出］および実験的に肝損傷を導入した 動物の血漿［Ｌｉｎｄｒｏｏｓなど、Ｈｅｐａｔｏｌ．、１３巻：７３４〜７５ ０頁（１９９１年）］または血清［Ａｓａｍｉなど、、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、 １０９巻：８〜１３頁（１９９１年）］ではＨＧＦの濃度が増大することが観察 されている。この応答の機序は迅速であって肝臓再生の間のＤＮＡ合成の第一段 階に先行する。ＨＧＦはまた黒色素胞、尿細管細胞、ケラチノサイト、ある種の 内皮細胞および上皮起源の細胞を含むある種の細胞型に対する有糸分裂促進剤で あることが証明されている［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７６巻：４５〜５１頁（１９９１年）； Ｉｇａｗａなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、 １７４巻：８３１〜８３８頁（１９９１年）；Ｈａｎなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、 ３０巻：９７６８〜９７８０頁（１９９１年）；Ｒｕｂｉｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：４１５〜４１９頁（１９９１年） ］。ＨＧＦはまた試験管内で上皮細胞および血管上皮細胞の剥離を促進する活性 である「散乱因子」としても作用できる［Ｓｔｏｋｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３ ２７巻：２３９〜２４２頁（１９８７年）；Ｗｅｉｄｎｅｒなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ ・Ｂｉｏｌ．、１１１巻：２０９７〜２１０８頁（１９９０年）；Ｎａｌｄｉｎ ｉなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１０巻：２８６７〜２８７８頁（１９９１年）；Ｇｉ ｏｒｄａｎｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻： ６４９〜６５３頁（１９９３年）］。これに加えて最近、ＨＧＦは上皮形態形成 剤として記載された［Ｍｏｎｔｅｓａｎｏなど、Ｃｅｌｌ、６７巻：９０１〜９ ０８頁（１９９１年）］。それ故、ＨＧＦは腫瘍の侵襲においておよび胚の発達 において重要であることが仮定されている。慢性ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体活性 化はある種の悪性腫瘍で観察された［Ｃｏｏｐｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、５巻 ：２６２３頁（１９８６年）；Ｇｉｏｒｄａｎｏなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３９巻 ：１５５頁（１９８９年）］。 ＨＧＦおよびＨＧＦ変異体はさらに米国特許第５２２７１５８号、第５３１６ ９２１号、および第５３２８８３７号にも記載されている。 ２．マクロファージ刺激蛋白質 ＨＧＦに関係する蛋白質が最近確認された。この蛋白質は、ＨＧＦ様［Ｈａｎ など、前出；Ｄｅｇｅｎなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：９７８１頁 （１９９１年）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏなど、ＦＥＢＳ、３３３巻：６１〜６６頁 （１９９３年）］またはマクロファージ刺激蛋白質（「ＭＳＰ」）［Ｌｅｏｎａ ｒｄなど、米国特許第５２１９９９１号；Ｓｋｅｅｌなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．、１７３巻：１２２７〜１２３４頁（１９９１年）；Ｌｅｏｎａｒｄなど、Ｅ ｘｐ．Ｃｅｌｌ・Ｒｅｓ．、１１４巻：１１７〜１２６頁（１９７８年）；Ｙｏ ｓｈｉｍｕｒａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１５４６１〜１５ ４６８頁（１９９３年）］と命名され、ＨＧＦとはクリングル構造全部で４個を 共 有する。 ＭＳＰをコードするｃＤＮＡも確認されている。この蛋白質はクリングルドメ イン４個とそれに続いてセリンプロテアーゼドメインを有しＨＧＦと類似のドメ イン構造を含むと思われる。ＭＳＰは５３ｋＤａのα−鎖および２５ｋＤａのβ −鎖を含むヘテロ二量体である。しかしながら、ＭＳＰは単鎖の前駆体として分 泌される［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出］。ＨＧＦ前駆体［Ｎａｌｄｉｎｉな ど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１１巻：４８２５〜４８３３頁（１９９２年）］と同様に 現在ではＭＳＰの生物学的に活性なα−β−ヘテロ二量体への成熟は血清依存性 の蛋白質分解的切断によって達成されると信じられている［Ｗａｎｇなど、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３４３６〜３４４０頁（１９９４年），Ｗａ ｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１４０２７〜１４０３１頁（ １９９４年）］。Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１３８ ０６〜１３８１０頁（１９９４年）は、たとえば血清カリクレイン、第ＸＩＩａ 因子、γ−神経栄養因子および表皮性増殖因子結合蛋白質のようなある種のプロ テアーゼはプロ−ＭＳＰをα−β−ヘテロ二量体にまで切断し、活性化すること を報告している。 ＭＳＰは「ｐ１８５^RON」または「ＲＯＮ」と命名されたヘテロ二量体膜貫通 グリコプロテインからなる受容体に結合して、活性化することが見出されている ［Ｇａｕｄｉｎｏなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１３巻：３５２４〜３５３２頁（１９ ９４年）；Ｗａｎｇなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻：１１７頁（１９９４年１ ０月７日）］。このグリコプロテインはジスルフィド結合によって結合された鎖 ２本：β（１５０ｋＤａ）およびα（３５ｋＤａ）を持つ。ｐ１８５^RONは単鎖 前駆体（ｐｒ１７０^RON）として合成され、これが続いて蛋白質分解的切断によ り成熟したヘテロ二量体型に変換される。プロセッシングされていない単鎖前駆 蛋白質と異なり、この蛋白質のヘテロ二量体型は細胞表面まで送達される。 ＲＯＮをコードする蛋白質配列はＲｏｎｓｉｎなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８巻 ：１１９５〜１２０２頁（１９９３年）が記載したヒトのケラチノサイトｃＤＮ ＡライブラリーからクローニングされたｃＤＮＡから誘導された。このＲＯＮの ｃＤＮＡは１４００アミノ酸の蛋白質をコードするが、これは構造的にＨＧＦの 受容体と全体的な類似性を共有し、触媒ドメインでは約６３％の配列同一性を持 つ。ＭＳＰの遺伝子およびＲＯＮ受容体の遺伝子は共に染色体３ｐ２．１［Ｈａ ｎなど、前出；Ｒｏｎｓｉｎなど、前出］地図に配置されている。 ＲＯＮ受容体は主として上皮起源の細胞上および単球中に発現される。ｐ１８ ５^RONはまた固有のチロジンキナーゼ活性を有しており、これはＭＳＰおよびＭ ＳＰ融合プロテインであるＭＳＰ−ＮＫ２によって刺激される［Ｇａｕｄｉｎｏ など、前出］。しかしながら、このチロジンキナーゼ活性はＨＧＦ［同］によっ ては刺激を受けない。この交差反応性の不在はさらにＭＳＰは、ＨＧＦ受容体で あるｐ１９０^MET［同］に結合して活性化することができないことによって証明 された。 ＭＳＰをコードするｍＲＮＡは主に肝臓中で発現される。それは肺臓、副腎お よび胎盤中にも低濃度で発現される。現在までに体内でのＭＳＰの生理学的役割 は完全には判明していない。血清ＭＳＰは２４時間以内には静脈内リポポリサッ カライドに反応して増加することはなく、ＭＳＰは急性相蛋白質であるとは思え ないことを示す［Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．、５４巻：２８９〜 ２９５頁（１９９３年）］。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、はマクロファージ 中でＭＳＰがＣ５ａに対する化学走性的応答を刺激すると報告している。Ｌｅｏ ｎａｒｄなどは、米国特許第５２１９９９１号に高度に精製したＭＳＰの病原性 感染症の処置のための使用を開示している。 ３．巨核球および血小板の生産 哺乳類の骨髄に一次的に見出される多能幹細胞は末梢血内で循環している様々 な型の血球を生産する潜在能力を有する［Ｄｅｘｔｅｒなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、３巻：４２３〜４４１頁（１９８７年）］。多能幹細胞 は成熟段階を経て種々の血球系統に分化した明確な血球型を生産する。骨髄中で 分化した血球系統の一つは巨核球系統である。 巨核球の形成および血小板生産の制御はＭａｚｕｒ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、 １５巻：２４８頁（１９８７年）およびＨｏｆｆｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４巻： １１９６〜１２１２頁（１９８９年）に綜説がされている。巨核球の始原細胞の 少なくとも３種が確認されている：（１）バースト形成ユニット巨核球（ＢＦＵ −ＭＫ）；（２）コロニー形成ユニット巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）；および低密度 巨核球始原細胞（ＬＤ−ＣＦＵ−ＭＫ）。巨核球の成熟も標準的な形態学的判断 基準に基づいて数段階に分類されている。最先の認識できる細胞は巨核芽球であ る。細胞の中間型はプロ巨核球または好塩基性巨核球と命名されている。細胞の 最後の型は成熟（好酸性、顆粒性または血小板形成）巨核球として呼称される。 成熟巨核球は原形質のフィラメントをシヌソイド空隙に伸長して、そこで、個別 の血小板または「プレートレット」に解離し、断片化する。［Ｗｉｌｌｉａｍｓ など、「血液学（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、第１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ 社、ニューヨーク、ニューヨーク（１９７２年）］。 巨核球の形成は数種の制御因子が関与すると信じられている［Ｗｉｌｌｉａｍ ｓなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５２巻：１７３頁（１９８２年）；Ｗ ｉｌｌｉａｍｓなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｐｈｙｓ．、１１０巻：１０１頁（１９８ ２年）］。巨核球形成の初期は有糸分裂であって、一次的に細胞増殖およびＣＦ Ｕ−ＭＫからのコロニー始動を含むが、しかし血小板のカウントには影響されな いと信じられる［Ｂｕｒｓｔｅｉｎなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｐｈｙｓ．、１０９巻 ：３３３頁（１９８１年）；Ｋｉｍｕｒａなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１ ３巻：１０４８頁（１９８５年）］。成熟の後期は一次的に非有糸分裂であり、 核の倍数体化と原形質の成熟とを含む［Ｏｄｅｌｌなど、Ｂｌｏｏｄ、４８巻： ７６５頁（１９７６年）；Ｅｂｂｅなど、Ｂｌｏｏｄ、３２巻：７８７頁（１９ ６８年）］。 血小板は一般に血液中で循環し、血液凝固および傷害に対する体の反応に重要 な役割を演じている。血小板の循環血中濃度の減少は様々な病理学的状況および 治療に由来できる。血小板減少症は、例えば、骨髄による血小板生産の減損、脾 臓における血小板隔離、および放射線または化学療法による血小板の破壊増進に 由来できる。大量な血液製剤の急速な投与を受けている患者は血液の希釈に基づ く血小板減少症が進行することもある。血小板減少性疾患はさらにＳｃｈａｆｎ ｅｒ、「血小板減少症および血小板機能の疾患（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎ ｉａ・ａｎｄ・Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ・ｏｆ・Ｐｌａｔｅｌｅｔ・Ｆｕｎｃｔｉｏ ｎ）」、Ｉｎｔｅｒｎａｌ・Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社、第３版、Ｈｕｔｔｏｎなど編 （１９９０年）に記載されている。 ある種のサイトカインと増殖因子とは血小板の生産および巨核球の増殖を誘導 することが確認されている。巨核球刺激活性（ＭＫ−ＣＳＡ）を持つと報告され ているサイトカインにはインターロイキン−３（ＩＬ−３）［Ｗｉｌｌｉａｍｓ など、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、９巻：１４８７〜１４９１頁（１９８５年 ）］、インターロイキン−６（ＩＬ−６）［Ｂｒｕｎｏなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａ ｔ．、１７巻：１０３８〜１０４３頁（１９８９年）］、顆粒球−マクロファー ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｉｓｈｉｂａｓｈｉなど、Ｂｌｏｏｄ、 ７５巻：１４３３〜１４３８頁（１９９０年）］、インターロイキン−１１（Ｉ Ｌ−１１）［Ｘｕなど、Ｂｌｏｏｄ、８３巻：２０２３〜２０３０頁（１９９４ 年）］、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）［Ｓａｋａｇｕｃｈｉなど、Ｅｘｐ．Ｈ ｅｍａｔ．、１５巻：１０２３〜１０３４頁（１９８７年）］、およびインター ロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａ ｔ．、２２巻：４９７ａ頁（１９９４年）（補）］を包含する。その他のサイト カインをＭＫ−ＣＳＡを有することが確認された増殖因子と混合した時には血小 板の発達を調整すると報告されている。これらのサイトカインには、ＩＬ−１α ［Ｇｏｒｄｏｎなど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：３０２〜３０７頁（１９９２年）］ および白血病阻止因子（ＬＩＦ）［Ｍｅｔｃａｌｆなど、「巨核球および血小板 の形成に及ぼす白血病阻止因子の作用」、ＣＩＢＡ基金シンポジウム集］を包含 する。ｃＭｐｌリガンドも巨核球の形成および血小板の形成の刺激剤であると報 告されている［ｄｅ・Ｓａｕｖａｇｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５３３〜 ５３８頁（１９９４年）；Ｌｏｋなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５６５〜５６ ８頁（１９９４年）；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５ ６８〜５７１頁（１９９４年）］。さらに、血小板の形成を刺激すると報告され ている合成蛋白質の一つはＰＩＸＹ３２１である［ｖａｎ・ｄｅ・Ｖｅｎなど、 Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻：７４３〜７５１頁（１９９２年）；Ｗｉｌｌｉａｍ ｓなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６６ａ頁（１９９３年）（補）；Ｃｏｌｌｉｎ ｓなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６６ａ頁（１９９３年）（補）］。ＰＩＸＹ３ ２１は合成ペプチド鎖によって結合されたＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３とから構成さ れる融合蛋白質である［Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｃａｎｃｅｒ、６７巻：２７０ ５〜２７０７頁（１９９１年）］。 ＩＬ−３は原理的に血小板形成の過程の分化（最先）相に影響を与えると信じ られる［Ｍｏｏｒｅなど、Ｂｌｏｏｄ、７８巻：１頁（１９９１年）；Ｓｏｎｏ ｄａなど、、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：４３６ ０頁（１９８８年）］。ＩＬ−６はマウスおよび霊長類モデルで巨核球始原細胞 の増殖ならびに成熟を誘導することが証明されているが、一部の研究者はＩＬ− ６は細胞の成熟にのみ影響を与えるとの観察をしている。ＩＬ−３とＩＬ−６と の間の相互作用は現在不明確であるが、いくつかの報告ではマウスのＩＬ−６に 対する抗体がマウスＩＬ−３のＭＫ−ＣＳＡを排除することが発見されたので、 ＩＬ−３のＭＫ−ＣＳＡはＩＬ−６が仲介していると指摘している［Ｌｏｔｅｍ など、Ｂｌｏｏｄ、７４巻：１５４５〜１５５１頁（１９８９年）］。その他の 研究者はＩＬ−６単独の中和抗体は形成不能性患者から調製した血清のＭＫ−Ｃ ＳＡを減少させないことを報告し、巨核球の形成におけるＩＬ−６の重大な役割 を低く評価している。それにもかかわらず、多数の研究は致死量の放射能を受け た動物に投与した時のＩＬ−６の刺激効果を証明している［Ｂｕｒｓｔｅｉｎな ど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：４２０〜４２８頁（１９９２年）；Ｈｅｒｏｄｉｎな ど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：６８〜７４頁（１９９２年）］。 転移肉腫および肺癌のための化学療法剤を高用量投与されている患者では、I Ｌ−６は血小板数の減少を削減し、ベースライン水準への回復を促進した［Ｄｅ ｍｅｔｒｉなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６７ａ頁（１９９３年）（補）；Ｃｒ ａｗｆｏｒｄなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６７ａ頁（１９９３年）（補）］。 ＩＬ−６で処置した自家骨髄移植のレシピエントはマッチした対照よりも循環血 小板の比較的迅速な回復と短期な血小板注入依存性を経験することが報告されて いる。 生体内および試験管内で血小板の生産を刺激することのできる分子を確認する ことが本発明の目的である。 生体内および試験管内で巨核球の成熟を刺激することのできる分子を確認する ことが本発明の他の目的である。 現存するか、または予想される循環血小板の低下によって特徴付けられる生理 学的な条件の処置における使用のために医薬的に許容される担体中でその分子を 提供することが本発明の他の目的である。 血小板の生産および巨核球の成熟を刺激する目的のために採用できる製造物ま たはキットにおけるその分子を提供することが本発明のさらに別の目的である。 本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書全体を考慮すれば当技術分野に おける通常の熟練者には明確になるものである。 発明の要約 従って、本発明の態様の一つではマクロファージ刺激蛋白質を使用して血小板 の生産を刺激する方法を提供する。 本発明のその他の態様では巨核球の成熟のための方法を提供する。 本発明のさらに別の態様ではマクロファージ刺激プロテインを含有する製造物 およびキットを提供する。このマクロファージ刺激蛋白質は巨核球の成熟および 血小板の生産のための活性成分としてのマクロファージ刺激蛋白質を確認するラ ベルを持つ容器に入れて提供される。 血液中の血小板濃度低下は個体の健康を危険にさらすことがある。発明の背景 の欄で検討したように、危険な程に低下した血液中の血小板濃度は種々の病原的 状況ならびに化学療法および放射線照射の結果かもしれない。本出願人は驚くべ きことにマクロファージ刺激蛋白質が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激す るために有用であることを発見した。本発明のマクロファージ刺激蛋白質は試験 管内および生体内で採用できる。生体内での使用にはマクロファージ刺激蛋白質 は血小板減少症のような造血器官の疾患に悩む個体のための治療的療法剤として 投与できる。このマクロファージ刺激蛋白質は放射線および／または化学療法を 受けているか、またはこれから受けようとしている個体のための予防的な療法剤 としても投与できる。 好適な態様の詳細な記載 １．定義 ここに使用する用語「マクロファージ刺激プロテイン」および「ＭＳＰ」は増 殖因子の一つを示し、この増殖因子は典型的にはクリングルドメイン４個を含む 構造を持つ。この用語「マクロファージ刺激蛋白質」および「ＭＳＰ」は天然起 源から精製されたか、化学的に合成されたか、または組換え的に製造されたか、 のいずれかのこのプロテインの成熟、プレ、プレプロ、およびプロ型を示す。マ クロファージ刺激蛋白質は単鎖型またはヘテロ二量体型をとりうる。本定義は特 にＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１５４６１ 〜１５４６８頁（１９９３年）（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪから受理 番号Ｌ１１９２４の下に入手でき、このヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本明 細書中の配列リストにもおのおの配列番号１および配列番号２として提示する） が記載した配列がコードするマクロファージ刺激蛋白質を包含する。本明細書で 「ＭＳＰ−ＮＫ２」と記載するヒトＩｇＧ−γ１重鎖のＣ末端領域と融合したマ クロファージ刺激プロテインのＮ−末端領域（最初のクリングルドメイン２個） を含む融合蛋白質も特に本定義内に包含する。マクロファージ刺激蛋白質の断片 には本明細書中に記載するマクロファージ刺激蛋白質と同じ活性を持つものがあ り、そのような活性を有する断片の使用は本発明の範囲内にあると考える。 用語「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」は全ての天然起源Ｌ−α−アミノ 酸を示す。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを包含 するものである。これらのアミノ酸は１字表記か３字表記かのいずれかによって 記載される： Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ トレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロジン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リジン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｐ Ｎ アスパラギン 用語「巨核球の成熟」は巨核芽細胞およびプロ巨核球または好塩基性巨核球の 成熟した血小板産生細胞への分化を含む過程を示す。巨核球の成熟は典型的には 、たとえば膜の倍数性および分画のような細胞の変化を伴い、例えば倍数性分析 および顕微鏡的分析によって観察し、定量化できる。 用語「血小板減少症」は典型的には約１５０×１０⁹個／リットル血液以下の 血小板レベルによって特徴付けられる生理学的状況を示す。 用語「処置すること」、「処置」、および「治療」は治療的処置、予防的処置 および防止的処置を示す。 用語「哺乳類」はヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコを含む哺乳類に分類さ れる哺乳類のいずれをも示す。本発明の好適な態様では、この哺乳類はヒトであ る。 ２．本発明の方法および組成物 本発明は以後「ＭＳＰ」として示すマクロファージ刺激プロテインを使用して 巨核球の成熟および血小板の生産を刺激する方法を提供する。本発明の実施に有 用なＭＳＰは多数の方法によって製造できる。例えば、このＭＳＰはＭＳＰの単 離型または精製型を使用して製造できる。天然起源からＭＳＰを単離および精製 する方法は当技術分野では知られており、例えばＳｋｅｅｌなど、Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７３巻：１２２７〜１２３４頁（１９９１年）およびＬｅｏｎａｒ ｄなど、米国特許第５２１９９９１号に記載されている。このような単離法およ び精製法は血清または血漿からＭＳＰを得るために採用できる。これとは別に、 ＭＳＰは化学的に合成でき、および当技術分野で知られており、下記実施例１、 ２および３にさらに詳記する組換えＤＮＡ技術を使用しても製造できる。 このＭＳＰはヒトからまたはいずれかの非ヒト種からのものであってもよい。 例えば、哺乳類に別の哺乳類種からのＭＳＰを投与することもありうる（たとえ ばマウスをヒトＭＳＰで処置できる）。マウスＭＳＰおよびヒトＭＳＰの間には かなりの相同性（アミノ酸同一性約８１％）が存在するので、別種の哺乳類から のＭＳＰを採用できることが期待される。しかしながら、ＭＳＰに対する潜在的 免疫反応を回避するため哺乳類を相同的ＭＳＰで処置するのが好ましい（たとえ ばヒトをヒトＭＳＰで処置する）。 本発明は生体内および試験管内における巨核球の成熟および血小板の生産方法 を包含する。試験管内で巨核球の成熟を刺激するための本発明の方法に従えば、 巨核芽細胞、プロ巨核球および／または塩基性巨核球を含有すると推定される骨 髄細胞または細胞試料を取り、細胞培養培地に入れる。次にこれらの細胞を有効 量のＭＳＰの存在下に培養する。 適当な組織培養培地は当技術分野における熟練者にはよく知られており、これ に限定するものではないが、最小必須培地（「ＭＥＭ」）、ＲＰＭＩ−１６４０ およびダルベッコの修正イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を包含する。これら組織 培養培地はＳｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ＭＯ）およびＧＩ ＢＣＯ社（グランドアイランド、ＮＹ）から商業的に入手できる。次に細胞が生 存し、増殖するために十分な条件下にこれら細胞を細胞培養培地中で培養する。 細胞は、クロット、寒天または液体培地中での培養を包含する種々の方法によっ て培養できる。 これらの細胞は有効量のＭＳＰの存在下に培養される。ＭＳＰの量は変動しう るが、しかし、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましい。 このＭＳＰには勿論当業者が過重な実験なしに実験的に決定する用量を培地に添 加できる。培地中のＭＳＰ濃度は、たとえば細胞およびＭＳＰを培養する条件の ような種々の因子に依存するものである。特定の温度およびインキュベーション 時間、ならびにその他の培養条件は、たとえばＭＳＰ濃度および細胞および培地 の型のような因子に依存して変化できる。当技術分野の熟練者は操作および最適 培養条件を過大な実験なしに決定できるものである。培地中の巨核球の成熟は、 たとえばＷｉｌｌｉａｍｓなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、９巻：１４８７ 〜１４９１頁（１９８５年）；Ｂｒｕｎｏなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１ ７巻：１０３８〜１０４３頁（１９８９年）；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉなど、Ｂｌｏ ｏｄ、７５巻：１４３３〜１４３８頁（１９９０年）；Ｘｕなど、Ｂｌｏｏｄ、 ８３巻：２０２３〜２０３０頁（１９９４年）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉなど、Ｅｘ ｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５巻：１０２３〜１０３４頁（１９８７年）］のよう な当技術分野で知られる種々の検定によって測定できる。 試験管内で巨核球の成熟を刺激するためにＭＳＰを使用することは種々の目的 において有用であることが企図されている。例えば、試験管内でＭＳＰの存在下 に培養された巨核球を血小板形成細胞レベルが低下した哺乳類に注入できる。 本発明の方法に従えば、哺乳類における巨核球の成熟および血小板の生産を刺 激するためにはその哺乳類に有効量のＭＳＰを投与する。哺乳類に血小板の血中 レベルに悪影響を与えることのある、たとえば高用量の放射線または化学的療法 のような治療を施した時またはその後にＭＳＰを投与することを企図している。 ＭＳＰはまた血中血小板濃度の減少を回避するために予防的にも投与しうる。 このＭＳＰは医薬的に許容される担体の中で哺乳類に投与するのが好ましい。 適当な担体およびその製剤は「レミントンの医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１６版、１９８ ０年、Ｍａｃｋ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｏｓｌｏなど編、に記載がある。こ の発明を実行するため使用するＭＳＰの臨床的投与のために殊によく適合してい る組成物は無菌水溶液または、たとえば凍結乾燥した蛋白質のような無菌の水和 性粉剤を包含する。典型的には、製剤を等張性にするために適切な量の医薬的に 許容される塩も使用する。医薬的に許容される担体の例には食塩水、リンゲル液 およびデキストロース溶液を包含する。たとえば投与経路および投与するＭＳＰ の濃度などに依存して、ある種の担体がより好適になりうることは当分野の熟練 者には明白なこととなろう。このＭＳＰは哺乳類に注射（たとえば、静脈内、腹 腔内、皮下、筋肉内など）または、たとえば活性な型の血流中への送達を確実に する点滴のようなその他の方法によって投与するのが好ましい。 ＭＳＰの有効量および投与計画は実験的に決定しうるが、そのような決定をす ることは当分野の熟練の範囲内にある。用量の異種間スケール変換は当技術分野 で知られている方法、たとえばＭｏｒｄｅｎｔｉなど、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ．、８巻：１３５１頁（１９９１年）に開示されているようにして、実行 できる。投与すべきＭＳＰの用量は、例えばＭＳＰを投与される哺乳類、血小板 水準低下の原因であると信じられる医学的状況または治療の性質、血球生産組織 の損傷の程度、投与経路、およびその哺乳類に投与されている他種薬剤の同一性 などに依存して変化するものであることは当技術分野での熟練者の理解する所で ある。またＭＳＰの用量を１回以上投与する必要がありうることも理解される。 一般にＭＳＰの多回用量が投与のためには必要となろう。ＭＳＰの投与はその哺 乳類における血小板が許容水準に達するまで継続すべきである。 本発明はまた哺乳類において、血小板減少症を処置する方法も提供する。この 方法ではその哺乳類がまず血小板減少症であることを診断する。この診断の実行 は当技術分野の熟練の範囲内にある。当技術分野の熟練者はまた様々な血小板水 準が異なる哺乳類種について血小板減少症の診断を保証しうることも認識するで あろう。この診断はヒトでは通常血小板レベルが約１５０×１０⁹個／Ｌ血液以 下に落ちた時に行われる。血小板減少症は血小板または血小板生産細胞の生産、 分布または破壊にある異常の結果であることがある。血小板減少症を処置するた めには、前記した投与の様式と計画に従ってＭＳＰをその哺乳類に投与する。 前記方法において、ＭＳＰは生物学的または化学的に活性な薬剤１種またはそ れ以上と結合して投与できる。好ましくは、そのような薬剤は巨核球の形成また は血小板の形成作用を持つ。現在では、例えばＭＳＰはｃＭｐｌリガンドまたは トロンボポイエチン［ｄｅ・Ｓａｕｖａｇｅなど、前出；Ｌｏｋなど、前出；Ｋ ａｕｓｈａｎｓｋｙなど、前出］、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＬＩＦと組 合せて投与できると信じられている。熟練した医師は本発明のためにＭＳＰをこ れら薬剤のいずれかと混用する時は、有用な各薬剤の通常の用量を削減した適切 な用量を決定できる。このＭＳＰは他の薬剤と同一の製剤中で投与できるし、ま たはＭＳＰとその他の薬剤とは別に投与することもできる。その他の薬剤もその 特定の薬剤に適当な様式、経路および計画に従って投与される。 巨核球の成熟および血小板の生産は種々の方法で測定し、監視できる。例えば 成熟と血小板の生産は試験管内検定法を使用して測定できる。巨核球始原細胞検 定法は当技術分野では知られており、例えばＴａｎａｋａなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａ ｅｍａｔｏｌ．、７３巻：１８頁（１９８９年）に記載のように細胞をメチルセ ルロース中で培養することによって実行できる。単細胞増殖検定法はＷｉｌｌｉ ａｍｓなど、Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１５巻：４８３頁（ １９８２年）；Ｂａｎｕなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７５巻：３１３ 頁（１９９０年）；Ｏｏｎなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、１０巻：４０３ 頁（１９８６年）；Ｓｐａｒｒｏｗなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、１１巻 ：３１頁（１９８７年）に記載のようにして実行できる。 成熟および血小板の生産は末梢血または骨髄の分析によっても監視できる。循 環血中の血小板水準は細胞計数分析により決定できる。セルカウント分析は生存 細胞をトリパンブルー排除によって計数することによって実行することもある。 細胞は形態学的に検査することもできる。例えば、骨髄試料を哺乳類から採取し 、当技術分野で知られている標準的な組織学的技術を使用して顕微鏡検査のため に準備する。細胞を染色することによって、その骨髄試料中にある巨核球のサイ ズ、細胞の特徴、および数を観察できる。 本発明はさらに巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有用な物質 を含有する製造物およびキットを提供する。製造物にはラベルを有する容器を含 む。適当な容器には、例えばビン、バイアルおよび試験管を包含する。これら容 器は、たとえばガラスまたはプラスチックのような各種の材料から成形しうる。 この容器には巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効な組成物を 入れてある。この組成物中の活性薬剤はＭＳＰである。その容器のラベルには、 その組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために使用されること を指摘し、また前記のような生体内または試験管内のいずれかでの使用に対する 指示を記載してあってもよい。 本発明のキットは前記容器および緩衝液を入れた第二の容器を含む。これには さらに、別の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、注射筒、および使用のため の指示を記載した包装挿入物を含む、商業的視点および使用者の視点から望まし いその他の材料も包含しうる。 本発明は次の実施例を参照することによって、 さらに完全に理解することとなろう。それら実施例がしかしながら本発明の範囲 を限定すると解釈すべきでない。本明細書に記載の引用文献は参考のために記載 したものである。 実施例 実施例１：ＭＳＰの組換え生産 全長ＭＳＰをコードするｃＤＮＡはＭＳＰのアミノ酸１〜３４０をコードする ｃＤＮＡ（クローン５’−ＭＳＰ）と３４１〜７１１（クローン３’ＭＳＰ）を コードするｃＤＮＡとを結合して構築できる（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、 が報告した番号付けを使用）。これらのｃＤＮＡはヒトの肝臓からのｃＤＮＡの ＰＣＲ増幅によって単離できる（１９８７年７月２８日発行の米国特許第４６８ ３１９５号および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｕｓｂ ｅｌなど編、Ｇｒｅｅｎｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔ ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、１９９１年、２巻：第１５章に記載のようにして）。ラ ンダムヘキサマーおよびオリゴｄＴの混合物を使用する、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（英 国のＢＲＬ社から商業的に購入できる）を用いる逆転写（ＲＴ）のための鋳型と してヒト全肝臓ＲＮＡ（１０μｇ）を使用する。５’−ＭＳＰクローンを得るた めに１０μＬのＲＴ反応混合物を含有する１００μＬ容中でＩＵのＶｅｎｔＤＮ Ａポリメラーゼ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ社から商業的に入手 できる）および各５０ピコモルの正方向プライマー：ＣＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣ ＣＡＧＣＣＡＧＡＡ（配列番号３）および逆方向プライマー：ＣＴＧＴＡＣＡＡ ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号４）を使用するＰＣＲ反応を実行す る。変性（９５℃、１分間）、アニーリング（５５℃、４５秒）および伸長（７ ２℃、２分間）を３０サイクルの後、ＰＣＲ反応物の２μＬをネステド（入れ子 状にした）正方向プライマー：ＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧ ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＴ（配列番号５）およびネ ステド逆方向プライマー：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＡ ＣＣＣＣＧＡＣ（配列番号６）で再増幅する。クローン３’ＭＳＰを得るために は正方向プライマー：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＣ ＣＣＧＡＣ（配列番号７）および逆方向プライマー：ＡＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡ ＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＣＴ（配列番号８）を使用する。ＰＣＲ 生成物をＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ社から 商業的に入手できる）で消化し、精製したのち、ベクターｐＲＫ７（８／１７／ ８８付与の欧州特許第２７８７７６号）にクローニングする。別々のＰＣＲ反応 で増幅した挿入物の配列を次にジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定 する。このｃＤＮＡはＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、に記載の技術を使用して 発現し、精製できる。 実施例２：ＭＳＰ／ＮＫ２融合蛋白質の組換え製造 ＭＳＰのＮ−末端２６８アミノ酸を含む部分的ｃＤＮＡ［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ など、前出、が報告した番号付けを使用］をヒトのＩｇＧガンマ１重鎖の配列に 融合する［Ｂｅｎｎｅｔｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２３０ ６０〜２３０６７頁（１９９１年）］。これはＭＳＰ中の独特なＢａｍＨＩ部位 を介してＭＳＰ配列をヒトのＩｇＧ−ガンマ重鎖ｃＤＮＡ［前記］中のＢｓｔＥ ＩＩ部位に結合するために合成した相補性オリゴヌクレオチド：ＧＡＴＣＣＧＣ ＡＧＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＧ（配列番号９）および：ＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＣＡＣＣＧＣＧＧＣ ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＣＧ（配列番号１０） を使用して達成できる。得られた構築物はＭＳＰのアミノ酸１〜２６８のコード 配列、アミノ酸Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＴｈｒをコードするするリンカ ー配列およびこれに続いてヒトのＩｇＧ−ガンマ１重鎖のアミノ酸２１６〜４４ ３のコード配列を含有する。 このＭＳＰ／ＮＫ２をコードするｃＤＮＡはＥＢＶ−由来の発現プラスミドで あるｐＣＩＳ．ＥＢＯＮ［米国特許第５３２８８３７号］に挿入し、２９３細胞 ［ヒト胎児腎細胞系統、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻 ：５９頁（１９７７年）］中にＣａｃｈｉａｎｅｓなど、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ、１５巻：２５５〜２５９頁（１９９３年）に記載された操作を使用して 挿入できる。ＭＳＰ／ＮＫ２の精製のために、ＭＳＰ／ＮＫ２を発現する２９３ 細胞からの血清不含調整培地を無菌濾過し、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を添加し て最終濃度１００ｍＭ−クエン酸とする。精製操作は全て４℃で実行する。濾過 した培地を次に１００ｍＭ−クエン酸、ｐＨ６と平衡しておいたＨｉＴｒａｐ^TM プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・ＬＫＢ社、ピスカタウエー、ＮＪ） 上に負荷する。結合した蛋白質を１００ｍＭ−クエン酸、ｐＨ６、３．５Ｍ−Ｍ ｇＣｌ₂、２％（ｖ／ｖ）グリセリンで溶離する。各画分をあらかじめ燐酸塩緩 衝食塩水と平衡しておいたＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５）に 直ちに通して緩衝液交換をする。次にこの画分を集めて濃縮する。蛋白質濃度は 抗ヒトＦｃ・ＥＬＩＳＡによって（例えば、米国特許第５３１６９２１号および 第５３２８８３７号参照）およびアミノ酸の全加水分解によって決定できる。精 製したＭＳＰ／ＮＫのＮＨ₂−末端配列は蛋白質配列決定法によって確認できる 。蛋白質の純度および均一性はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により、ならびに ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に対して指向する抗体を使用するウエスタンブロティン グによって、評価できる。 実施例３：ヒトの巨核球細胞系統の成熟に及ぼすＭＳＰの効果 ヒトの巨核球細胞系統を試験管内でおのおの下記のＡ節およびＢ節に記載する ようにして製造したＭＳＰおよび組換えｈｕＨＧＦを含有する種々の濃度の調整 培地に対する反応について分析した。 Ａ．ＭＳＰを含有する調整培地の製造 ＭＳＰをコードするｃＤＮＡを実施例１記載の通りに製造した。このＭＳＰの 配列はＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、に報告されているヒトのＭＳＰの配列と 同一であった。このｃＤＮＡを発現プラスミドｐＣＩＳ．ＥＢＯＮ（実施例２に 記載）中に挿入し、これらのプラスミドを含有する２９３細胞の安定な集団（実 施例２に記載）をＣａｃｈｉａｎｅｓなど、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、前出 に記載のようにして樹立した。２９３対照細胞およびＭＳＰ遺伝子移入体細胞か ら得た培地を使用の前に５％ＦＣＳと３７℃で１時間処理［Ｗａｎｇなど、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３４３６〜３４４０頁（１９９４年）］して プロＭＳＰを成熟２鎖型までプロセッシングした。ベクターのみか、ＭＳＰを含 むベクターかのいずれかを遺伝子移入した細胞からの調整培地を４８時間にわた って集め、下記検定法では１：１０希釈で使用した。 Ｂ．組換えｈｕＨＧＦの製造 組換えｈｕＨＧＦを本質的に米国特許第５２２７１５８号に記載の通りに製造 した。Ｓｅｋｉなど、前出、に記載のヒト白血球ライブラリーから分離したｈｕ ＨＧＦｃＤＮＡクローン（ＨＣＬ３）を発現ベクターｐＳＶＩ６Ｂ５（ＡＴＣＣ 寄託番号６８１５１）中にクローニングした。ヒト白血球ＨＧＦの完全アミノ酸 配列は米国特許第５２２７１５８号、配列番号２に記載されている。ＣＨＯ−ｄ ｈｆｒ細胞［Ｕｒｌａｕｂなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、７７巻：４２１６〜４２２０頁（１９８０年）］に前記ｐＳＶＩ６Ｂ５由来 のｈｕＨＧＦ発現ベクターとｄｈｆｒ選択ベクターｐＦＤ１１［Ｓｉｍｏｎｓｅ ｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：２４９５〜 ２４９９頁（１９８３年）］とをＧｒａｈａｍなど、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻 ：４５６〜４６７頁（１９７３年）の一般法を使用して、共遺伝子移入した。後 者のプラスミドはＤＨＦＲをコードしており、それによって遺伝子移入された細 胞にメトトレキセート耐性を与えてｈｕＨＧＦ発現形質転換体を選択させる。形 質転換したｄｈｆｒ細胞をグリシン−、ヒポキサンチン−およびチミジン−欠失 培地中で増殖させて選択した。この選択培地に発生したコロニーを綿棒を使用し て分離し、同一培地中で数代にわたって増殖させた。細胞の増殖後、標準技術を 使用してメトトレキセート量を増加させつつ細胞を増幅し、選択した。選択培地 中で増殖でき、それ故、遺伝子移入したＤＨＦＲを含有するプラスミドが導入さ れたクローンを分泌されたＨＧＦの存在について検索した。これらのクローンの 培地中のＨＧＦ活性はＮａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：７２２９〜７２３３頁（１９８３年）に記載の有糸分 裂検定法で検定した。培養培地中のＨＧＦ活性はＮａｋａｍｕｒａなど、Ｎａｔ ｕｒｅ、３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年）に記載のラット肝細胞一次 培養物への¹²⁵Ｉ−標識デオキシウリジンの取込によっても測定しうる。次にｈ ｕＨＧＦを本質的にＮａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、前出、に記載のようにして精製した。 Ｃ．細胞培養検定法 ヒトの巨核球細胞系統「ＤＡＭＩ」（Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｂｒｉｇｈａ ｍ・ａｎｄ・Ｗｏｍｅｎ’ｓ・Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ボストン、ＭＡから入手）お よび「ＣＭＫ」（Ｔ．Ｓａｔｏ、千葉大学、日本から入手）をこの検定法で使用 した。両細胞系統はＧｒｅｅｎｂｅｒｇなど、Ｂｌｏｏｄ、７２巻：１９６８〜 １７４頁（１９８８年）およびＫｏｍａｔｓｕなど、Ｂｌｏｏｄ、７４巻：４２ 頁（１９８９年）に記載の培養物中に維持した。 ５％血小板欠乏血漿（「ＰＰＰ」）（Ａｖｒａｈａｍなど、Ｂｌｏｏｄ、７９ 巻：３６５〜３７１頁（１９９２年）に記載のようにして製造）を含むＲＰＭＩ −１６４０培地中、２×１０⁵細胞／ｍＬの細胞を２４ウェル培養プレート（Ｃ ｏｒｎｉｎｇ社、コーニング、ＮＹ）に入れて５日間５％ＣＯ₂湿潤大気中に維 持した。細胞をＭＳＰ調整培地（前記Ａに記載）中、３濃度の組換えｈｕＨＧＦ （前記Ｂに記載）または２９３細胞条件付き対照培地およびホルボール−１２− ミリステート−１３−アセテート（「ＰＭＡ」）含有または不含条件で培養した 。ＰＭＡはポジティブコントロールとして使用した。ＰＭＡはＰＭＡ（Ｓｉｇｍ ａ社、セントルイス、ＭＯ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して調 製し、−８０℃で貯蔵した。使用直前に、ＰＭＡをＲＰＭＩ−１６４０培地で希 釈した。希釈したＰＭＡを次に１０ｎｇ／ｍＬ濃度で細胞とインキュベーション した。インキュベーションの後、細胞をＨａｎｋ平衡塩溶液（「ＨＢＳＳ」）で ２回洗浄し、核分離培地（「ＮＩＭ」；０．２％ＢＳＡ、０．４％Ｎｏｎｉｄｅ ｔ・ｐ４０、および１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、ＨＢＳＳ中）プラス５ ４Ｗ ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ単位／ｍＬのＲＮａｓｅ・Ａ（Ｂｉｏｌａｂ社、ニューイ ングランド、ＭＡ）中に２×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。 培養した細胞のＤＮＡ含有量または倍数性をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ 社、セントルイス、ＭＯ）２５μｇ／ｍＬを含む等容のＮＩＭ（前記）で細胞を 染色することによって検査した。試料を４℃の暗所に置き、同じ日にフルオレッ セイン活性化細胞分別スキャンニング（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、 マウンテンビュー、ＣＡ）およびＣｅｌｌＦｉｔ^TMソフトウエアを使用して分析 した。結果を次の表１に示す。結果は二重に測定した実験３回のデータの平均値 ±ＳＥＭとして表示する。 実験の結果を倍数性について検定すると、ＭＳＰ処理は一定の濃度範囲にわた ってＣＭＫ細胞の成熟を強化したことを示した。これとは対照的に、ｈｕＨＧＦ はこの濃度範囲にわたってＣＭＫの倍数性には効果を示さなかった。 Ｄ．ＤＡＭＩおよびＣＭＫ細胞のノーザンブロット分析 全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法によってＣＭＫおよびＤＡＭ Ｉ細胞から抽出し、このＲＮＡ２０μｇを２．２モル／Ｌのホルムアルデヒドを 含む１％アガロースゲル中で電気泳動した。ナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ −Ｎ）に移した後、フィルターを放射能標識相補性ＤＮＡ挿入物とハイブリッド 形成させた。このハイブリッド形成は３７℃で５０％ホルムアミド、３×塩化ナ トリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）、１０％硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍＬの変性鮭精子 ＤＮＡの存在下に行った。フィルターを０．２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中 で６０℃で２時間洗浄した。膜を次にＫｏｄａｋ・Ｘｏｍａｔフィルム（Ｅａｓ ｔｍａｎ・Ｋｏｄａｋ社、ロチェスター、ＮＹ）に４８時間感光させた。特定の メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を、キナーゼドメインから構成される ＲＯＮに対するヒトの部分的ｃＤＮＡプローブで検出した。ブロット分析の結果 からＲＯＮ遺伝子の５．０ｋｂおよび２．０ｋｂの特異的な転写物が構成的にＣ ＭＫおよびＤＡＭＩ細胞中に発現されていることが示された（データ不掲載）。 実施例４：ヒトの骨髄巨核球によるサイトカイン分泌に及ぼすＭＳＰの効果 Ａ．試験管内検定法 特異的サイトカイン検定法を使用して、ＭＳＰ調整培地または組換えｈｕＨＧ Ｆで処理して培養したヒトの巨核球およびＤＡＭＩ細胞からの上清液をＩＬ−６ 、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの合成および分泌について検定した。 骨髄を健康な提供者から標準的技術を使用して無菌条件下に保存剤不含のヘパ リン中に吸引、採取した。一次骨髄巨核球をＴａｎａｋａなど、Ｂｒｉｔ．Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７３巻：１８〜２４頁（１９８９年）に記載のように表面 ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体のカクテルで被覆した免疫磁 気ビーズ（Ｍ７５３、Ｄａｋｏ社、カーペンテリア、ＣＡ）によって分離した。 次に分離した骨髄巨核球の純度をフローサイトメトリー（Ｔａｎａｋａなど、前 出、の方法を使用）によって測定し、９５〜９８％の値を得た。 分離した一次骨髄巨核球（１０⁵細胞／ｍＬ）およびＤＡＭＩ細胞（１０⁶細胞 ／ｍＬ）（Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｂｒｉｇｈａｍ・＆・Ｗｏｍｅｎ’ｓ・Ｈ ｏｓｐｉｔａｌ、ボストン、ＭＡから入手）をＭＳＰ調整培地（実施例３のＡに 記載のようにして製造）、組換えｈｕＨＧＦ（実施例３のＢに記載のようにして 製造）または２９３細胞対照調整培地の存在または不在下に１％ＰＰＰ含有ＲＰ ＭＩ−１６４０培地（実施例３のＣに記載）中でＡｖｒａｈａｍなど、前出、に 記載の条件下に２４時間培養した。各被験培養について二重に培養を行った。こ の検定には血小板欠乏血漿を採用して血清中に比較的高濃度で存在することがあ るＴＧＦ−βおよびその他の血小板由来媒介物質の存在を回避した。 これら細胞培養物からの上清液を得て免疫反応性サイトカインについて検定し た。ヒトのインターロイキン−１β、ヒトのＧＭ−ＣＳＦ、およびヒトのインタ ーロイキン−６の免疫検定はＲ・＆・Ｄ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、Ｍ Ｎから購入して製造社の指示に従って使用した。各検定ではサイトカインのポジ ティブコントロールによる標準曲線を作成した。検出の最低限界はＩＬ−６につ いて０．３５ｐｇ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦについて１．５ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−１β について０．３ｐｇ／ｍＬであると測定された。 次の表２に報告する検定結果は二重に行った検定３回から得たデータの平均値 ±ＳＥＭとして表示する。統計的有意性はスチューデントのＴ−検定を使用して 決定した。 表２に示す通り、ＭＳＰの添加は検査した培地の全てにおいて他の全処置を超 えるＩＬ−６の分泌増加を示した。同様な増加はＤＡＭＩ細胞でも観察されて、 ＭＳＰ処理培養物に約９０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６が検出されたのに比較して非処 理培地の培養物中では約３４ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６が検出された。それ程でもな いが、ＭＳＰ処理は一次骨髄巨核球に対するその他の処理のすべてを超え、また ＤＡＭＩ細胞についての対照を超えて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１βの分泌を 増加させた。 ヒトの巨核球によるＩＬ−１βの分泌はまた特異的なＩＬ−１βＥＬＩＳＡを 使用して評価した。ＩＬ−１β蛋白質は未刺激巨核球の上清液中に検出された。 ＭＳＰはＩＬ−１βの分泌をわずかに刺激したが、有意ではなかった。ＭＳＰま たはｈｕＨＧＦがＧＭ−ＣＳＦの分泌に及ぼす影響は観察されなかった。 Ｂ．巨核球のＲＮＡ分析 分離した一次骨髄巨核球から全細胞ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをグアニジ ンイソチオシアネート操作法によって抽出し、続いてＣｓＣｌクッションを通す 超遠心分離を行った。全ＲＮＡを次に１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲル 上を移動させ、無傷のＲＮＡをエチジウムブロミド染色によって可視化させた。 ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を各試料から得た全ＲＮＡ２μｇを使用して実行した。 ＲＯＮプライマーを使用するＰＣＲ検定を正方向プライマーと逆方向プライマー とを使用して実行した。 このＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル（ＢＲＬ社、ベセスダ、ＭＯ）で分析 した。増幅されたＤＮＡバンドはＵＶトランスイルミネーターで目視した。増幅 されたＤＮＡはゲルのエチジウムブロミド染色によって期待したサイズで検出で きた。ＰＣＲ対照についての内部反応標準も実行した。これらの標準にはプライ マー含有または不含のＲＮＡ、ＲＮＡ不含プライマーおよびアクチンプライマー 含有ＲＮＡを含めた。プライマーストックの全ておよび全ＲＮＡ調製物は細胞の ＤＮＡによる夾雑を除外するために分析したものである。ＲＮＡ分析のこの結果 は分離された骨髄巨核球がＲＯＮに対する特異的なｍＲＮＡを発現したことを示 す（データは表示せず）。 実施例５：マウス巨核球減少症に及ぼすＭＳＰの効果 マウスの巨核球分化に及ぼすＭＳＰの効果を検査するために、Ｏｏｎなど、Ｌ ｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０巻：４０３〜４１２頁（１９８６年） およびＳｐａｒｒｏｗなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１巻：３ １〜３６頁（１９８７年）に記載の方法に従って単細胞巨核球の増殖検定を実行 した。 骨髄からの単細胞集団は正常Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ・Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入）の大腿骨に１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを流すこ とによって調製した。未成熟巨核球集団をＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社）勾配によって分離した単細胞骨髄細胞の懸濁物から１．０７〜１．０８５ｇ ／ｃｍ³画分として得た。分画した細胞を１０⁵細胞／ｍＬでＤＭＥＭ−１０％Ｆ ＣＳ中で５日間３７℃で湿潤インキュベーター中で１０％ＣＯ₂下に、滴定量の ＭＳＰ含有調整培地（実施例３のＡに記載のとおりに調製）およびＩＬ−６（Ｒ ・＆・Ｄ・Ｓystems社、ミネアポリス、ＭＮから購入）の存在下に培養した。 培養物を乾燥し、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅ ｔｉｃｓ、１５巻：４８３〜４９４頁（１９８２年）；Ｂａｎｕなど、Ｂｒ．Ｊ ．Ｈａｅｍａｔ．、７５巻：３１３〜３１８頁（１９９０年）；Ｏｏｎなど、前 出；Ｓｐａｒｒｏｗなど、前出、に記載のようにアセチルコリンエステラーゼに ついて染色した。単細胞のマウス巨核球は画分した骨髄細胞培養物５×１０⁴個 当りアセチルコリンエステラーゼ陽性細胞の数として記録した。未成熟巨核球の 増殖は光学顕微鏡によって検出された単球大型巨核球の数によって定量した。 その結果を表３に示す。この結果は３重の培養を行った実験３回からの平均値 ±ＳＥＭを示す。 マウスの未成熟巨核球集団の培養液にＭＳＰを添加すると検出可能なアセチル コリンエステラーゼ陽性巨核球数の増加を伴う増殖強化の反応を示す。 間接的な免疫複合体欠乏法［Ｓｐａｒｒｏｗなど、前出］を使用する中和検定 も実施した。ＩＬ−６に対する中和モノクローナル抗体はＧｅｎｅｔｉｃ・Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ、ボストン、ＭＡから入手した。増殖因子（ＭＳＰおよびｈｕＨ ＧＦ）の最適下限濃度および抗体の至適濃度（１：１０希釈）を選択して抗体の 過剰状態を作成した。種々の増殖因子および抗体を混合して、４℃で２時間イン キュベーションした。対照には正常ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、 ＭＯから購入）を使用した。免疫複合体はＰｒｏｔｅｉｎ・Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ・ＣＬ−４Ｂ^TM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・ＬＫＢ社、ピスカタウエー、ＮＪ） を５０μＬ添加して沈降させた。培養物の上清液を集めて前記未成熟マウス巨核 球増殖検定における残留巨核球刺激活性について検定した。 中和検定の結果はＭＳＰ（ならびにＩＬ−６）に応答する未成熟マウス巨核球 の増殖はＩＬ−６に指向するモノクローナル抗体によって中和されることを示し た。表３参照。表３はまたＩＬ−６またはＭＳＰに添加した非免疫血清はＩＬ− ６またはＭＳＰ単独を超える有意な効果を示さないことを示す。完全な理解はな されておらず、いずれの一理論に限定されるものでもないが、この結果は巨核球 からのサイトカイン分泌を誘導することまたは補助細胞によるＩＬ−６の誘導に よってＭＳＰが巨核球の成熟を制御する機能を果たしているであろうことを示唆 している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ゴドウスキー，ポール・ジェイ アメリカ合衆国94010カリフォルニア州 バーリンゲイム、イーストン・ドライブ 2627番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．医薬的に許容される担体中の有効量のマクロファージ刺激プロテインを哺 乳類に投与することを含む哺乳類中の血小板の生産を刺激する方法。 ２．マクロファージ刺激プロテインがヒトのマクロファージ刺激プロテインで ある請求項１の方法。 ３．その哺乳類に化学療法剤を投与した後にマクロファージ刺激プロテインを 投与する請求項１の方法。 ４．その哺乳類に化学療法剤を投与する前にマクロファージ刺激プロテインを 投与する請求項１の方法。 ５．医薬的に許容される担体が無菌食塩水である請求項１の方法。 ６．血小板減少症に罹患していると診断された哺乳類に医薬的に許容される担 体中のマクロファージ刺激プロテインの有効量を投与することを含む哺乳類にお ける血小板減少症の処置方法。 ７．有効量のマクロファージ刺激プロテインの存在下に巨核芽細胞、プロ巨核 球および／または好塩基性巨核球を含むと推測される細胞試料を培養することを 含む試験管内で巨核球の成熟を刺激する方法。 ８．マクロファージ刺激プロテインの量が約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ ／ｍＬまでである請求項７の方法。 ９．容器、 その容器のラベル、および その容器内に含まれる組成物 を含む製造物 ［ここに、その組成物は巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効 であり、その容器上ラベルにはその組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を 刺激するために使用できることが記載され、さらにその組成物中の活性薬剤はマ クロファージ刺激プロテインを含む］。 １０．さらに哺乳類にそのマクロファージ刺激プロテインを投与するための指 示を含む請求項９の製造物。 １１．さらに試験管内細胞培養においてマクロファージ刺激プロテインを使用 するための指示を含む請求項９の製造物。 １２．第一の容器、その容器のラベル、およびその容器内に含まれる組成物； ［ここに、その組成物は巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効 であり、その容器のラベルにはその組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を 刺激するために使用できることが記載され、さらにその組成物中の活性薬剤はマ クロファージ刺激プロテインを含む］；および 緩衝液を入れた第二の容器； を含むキット。