JPH10509046A - 導入遺伝子組込みおよび遺伝子治療用アデノ関連性ウイルスレプタンパク質含有脂質小胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 望ましいタンパク質あるいはポリペプチド（治療薬など）をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を細胞に送達する組成物。この組成物はアデノ関連性ウイルスレプタンパク質（あるいはアデノ関連性ウイルスレプタンパク質をコード化する核酸配列）、およびタンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、ならびに少なくとも１個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。遺伝子構築物は更に第１アデノ関連性ウイルスＩＴＲあるいは部分もしくはその誘導体および第２アデノ関連性ウイルスＩＴＲあるいは部分もしくはその誘導体を含む。第１および第２アデノ関連性ウイルスＩＴＲあるいは部分もしくはその誘導体はタンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列、およびタンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターの側面に位置する。このような組成物はヒト染色体の特異的な遺伝子座で遺伝子物質の組込みを提供し、一方宿主の遺伝子の不注意による不活性化の可能性を最小にしまたウイルス汚染の可能性を最小にする。

Description

【発明の詳細な説明】 導入遺伝子組込みおよび遺伝子治療用アデノ 関連性ウイルスレプタンパク質含有脂質小胞 この発明は望ましい遺伝子が遺伝子治療目的のため真核細胞に送達される遺伝 子転移に関する。このような遺伝子送達は生体内で成し遂げられるか、あるいは 試験管内で、次いでその真核細胞を宿主に生体内投与することで成し遂げられる 。より詳細には、この発明はアデノ関連性ウイルスレプタンパク質、アデノ関連 性ウイルスＩＴＲ、および望ましいタンパク質、ポリペプチドあるいは遺伝子転 写物、つまりメッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、あるいはリボザイム などを含むリポソームおよび類似の形質移入ベクター（伝達体）に関する。 発明の背景 アデノ関連性ウイルス（すなわちＡＡＶ）は非無作為で遺伝子座特異的にＤＮ Ａを宿主細胞ゲノムに組込むことを標的とするユニークな能力を有している。こ れは宿主ゲノムで無作為な位置に組込むレトロウイルスなどのような他のウイル スと対照的である。 アデノ関連性ウイルスの左読み取り枠はレプタンパク質をコード化する。地図 位置５および１９（それぞれプロモーターＰ５およびＰ１９）に位置する２個の プロモーターはこのＯＲＶ（読み取り枠）から誘導された４個のタンパク質の発 現 を制御する。レプタンパク質レプ７８およびレプ６８はＰ５促進転写物から生産 され、またレプタンパク質レプ５２およびレプ４０はＰ１９促進転写物から生産 される。Ｐ５促進レプタンパク質（レプ７８およびレプ６８）はＡＡＶプロウイ ルスに対する組込み遺伝子座でヒト染色体の決定領域に結合することが試験管内 で実証された。 従って、外部遺伝子の標的への組込みを達成するための遺伝子送達システムの 部分としてＡＡＶレプタンパク質およびＡＡＶ ＩＴＲを採用することがこの発 明の目的である。このような標的への組込みはより有効かつより安全な遺伝子送 達方法を提供する。他の遺伝子送達方法は組込みの水準が低く、しばしば標的と しての細胞を激しく循環させる必要があり、もし組込みが起こると、それはゲノ ム内で無作為位置で起きる。無作為組込みは有害な遺伝子（癌原遺伝子など）の 故意ではない活性化あるいは必須遺伝子の故意でない不活性化という潜在的な危 険を提供する。 多くの臨床遺伝子治療実験あるいは実験記録もまたウイルスベース遺伝子送達 してシステムを採用する。このような処置は重要な安全性の関心である潜在的病 原性野生型ウイルスの汚染のリスクを提出する。またこれらのシステムはその表 面にウイルスタンパク質を発現する形質移入細胞に対する著しい宿主免疫応答を 引き起こす。図面の簡単な説明 この発明はこれら図面と関連して説明され、ここで、 図１はプラスミドＡＡＶｐ５ｎｅｏの地図であり、 図２はプラスミドｐＳＶ−βガラクトシダーゼの地図であり、 図３はプラスミドＴＲＦ１６９の地図であり、 図４はプラスミドｐＬＺ１１の地図であり、 図５はプラスミドｐＳＰ７２の地図であり、 図６はプラスミドｐＳＰ７２ｎｌａｃＺの地図であり、 図７はプラスミドｐＡｄＲＳＶ４の地図であり、 図８はプラスミドｐＡｄＲＳＶｎｌａｃＺの地図であり、 図９はプラスミドｐＡＡＶｒｎｌａｃＺの地図であり、 図１０はプラスミドｐＰＲ９９７の地図であり、 図１１はプラスミドｐＭＢＰ−レプ６８Δの地図であり、 図１２はプラスミドｐＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰの地図であり、 図１３はプラスミドｐＭＢＰ−レプ７８の地図であり、 図１４はプラスミドｐＡｖ１Ｈ９ＦＲの地図であり、 図１５はプラスミドｐＡＡＶＲＳＶＦ９の地図であり、 図１６はプラスミドｐＣＭＶＭＢＰ−レプ７８の地図であり、 図１７はプラスミドｐＡｖＡＬＡＰＨ８１の地図であり、また、 図１８はプラスミドｐＡＡＶＲＳＶＡｐｏＦ８の地図である。発明の詳細な説明 この発明の一つの見地に従って、一つのタンパク質あるいはポリペプチドもし くは対象となる遺伝子転写物をコード化する ＤＮＡ配列を細胞に送達するための一つの組成物が提供される。この組成物はア デノ関連性ウイルスレプタンパク質、あるいはアデノ関連性ウイルスレプタンパ ク質をコード化する核酸配列（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）よりなる。この組成物は 更にタンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード 化するＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、タンパク質あるいはポリペプチドもしく は対象となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列を制御するプロモーター、 第１ＡＡＶ ＩＴＲあるいはその部分もしくは誘導体、第２ＡＡＶ ＩＴＲある いはその部分もしくは誘導体よりなる。第１および第２アデノ関連性ウイルスＩ ＴＲ（あるいはその部分もしくは誘導体）はタンパク質あるいはポリペプチドも しくは対象となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列およびタンパク質ある いはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列を 制御するプロモーターの側面に位置する。 一つの実施例において、アデノ関連性ウイルスレプタンパク質は、レプ７８、 レプ６８、レプ５２、レプ４０、および断片あるいはその誘導体よりなるグルー プから選択される。ここで使用される「断片あるいはその誘導体」という用語は 、レプタンパク質がタンパク質構造内でアミノ酸残基を欠失しているタンパク質 であり、およびもしくはＣ末端およびもしくはＮ末端で切形されており、および もしくはタンパク質構造内で通常存在する１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基 が他のアミノ酸残基で置換されるように突然変異されていることを意味する。レ プタンパク質このような断片あるいは誘導体は未修飾レプタンパク質と同じ生物 活性の一部あるいは全体を保有するかあるいは修飾特性を所有する。 一つの実施例において、アデノ関連性ウイルスレプタンパク質はレプ７８タン パク質あるいは断片もしくはその誘導体である。も一つの実施例において、アデ ノ関連性レプタンパク質はレプ６８タンパク質あるいは断片もしくはその誘導体 である。 アデノ関連性ウイルスレプタンパク質は同時出願中である案件Ｎｏ．０８／０ ６７，２３６で開示された方法で生産される。例えばレプタンパク質は自動タン パク質合成機で合成される。選択肢としてはレプタンパク質は遺伝子工学手法で 生産することができる。 レプタンパク質が遺伝子工学手法で生産される際に、レプタンパク質はレプタ ンパク質をコード化する核酸配列を含む発現ベクターで形質移入された細胞から 生産される。一つの実施例において、この発現ベクターはアデノ関連性ウイルス レプタンパク質あるいは断片もしくはその誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列 、およびアデノ関連性ウイルスタンパク質あるいはペプチドでないタンパク質あ るいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列を含み、これにより前記第１ＤＮ Ａ配列および前記第２ＤＮＡ配列は、アデノ関連性ウイルスレプタンパク質ある いは断片もしくはその誘導体、およびアデノ関連性ウイルスタンパク質あるいは ペプチドでないタンパク質あるいはペプチドを含む融合タンパク質の発現に帰着 する。アデノ関連性ウイルスタンパク質あるいはペプチドでないタンパク質ある いはペ プチドは細菌タンパク質あるいはペプチド、もしくは６から１０までのヒスチジ ン残基のヒスチジン「タグ」である。 一つの実施例において、アデノ関連性ウイルスタンパク質あるいはペプチドで ないタンパク質あるいはペプチドは細菌タンパク質である。細菌タンパク質は大 腸菌 マルトース結合タンパク質、あるいは断片もしくはその誘導体である。マル トース結合タンパク質、つまりＭＢＰはマルトースおよびアミロースに対する親 和性が高い。ＭＢＰおよびレプタンパク質を含む融合タンパク質はアミロース親 和力カラムからの吸着および溶離により大腸菌から調製された溶菌液から分離す ることができる。かくして大量のＡＡＶレプタンパク質を分離し精製することが でき、一方このＡＡＶレプタンパク質はその生物活性を保持する。 も一つの選択肢として、レプタンパク質がレプタンパク質をコード化する核酸 配列（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を含む適切な発現ベクターで提供される。この発 現ベクターはレプタンパク質をコード化する核酸配列を含むプラスミドベクター である。 遺伝子構築物はタンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転 写物をコード化するＤＮＡ配列、タンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象 となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列を制御するプロモーター、および ＤＮＡ配列並びにプロモーターの側面に位置するＡＡＶ ＩＴＲあるいはその部 分を含むが、この遺伝子構築物は、他のいずれの宿主遺伝子ではなくタンパク質 あるいはポリペプチドもしくは対象 となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列のみが転写されるようにＡＡＶ ＩＴＲおよびプロモーターの配向が存在する形で構築される。 プロモーターおよびプロモーターにより制御されるＤＮＡ配列の側面に位置す るＡＡＶ ＩＴＲは完全ＩＴＲ配列あるいはＩＴＲ配列の部分であり、それはレ プタンパク質による標的化組込みを促進するのに十分なＡＡＶ ＩＴＲ配列を提 供する。一つの実施例において、遺伝子構築物は、組込み、非共有結合、エンド ヌクレアーゼ作用、共有結合、ヘリカーゼ作用、およびＤＮＡポリメラーゼを含 む宿主細胞酵素の漸増に必要とされると考えられるレプ機能に十分なＡＡＶ Ｉ ＴＲ Ａ／Ａ′およびＤ′／Ｄ領域を含む少なくとも二本鎖オリゴヌクレオチド を含む。非共有結合を促進するＡ／Ａ′領域での基本特性は不完全［ＧＣＴＣ］₄ 反復であり、オリゴヌクレオチドは非共有結合およびもしくはニック切断およ び共有結合に作用するこの不完全反復配列あるいは隣接配列における変更で構築 される。変更はＩＴＲヘアピン配列に対する修正をも含む。 遺伝子構築物は、プラスミドの部分、プラミスドから切除された断片、大型合 成オリゴヌクレオチド、あるいは「無末端」ＡＡＶ ＤＮＡ（すなわち各末端で ＡＡＶ ＩＴＲにより接合され連続二本鎖ＤＮＡ分子を生成したＤＮＡの連続鎖 ）である。 一つの実施例において、タンパク質あるいは対象となるポリペプチドをコード 化するＤＮＡ配列は治療薬をコード化する。「治療（薬）」という用語は一般的 な意味で用いられ、治療 薬、予防薬および置換薬を含む。 遺伝子構築物に導入され治療薬をコード化するＤＮＡ配列は、必ずしもそれに 限定されないが、以下のものを含む：ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ） 遺伝子；インターフェロン−α，インターフェロン−β、およびインターフェロ ン−γなどのインターフェロン；ＩＬ−１，ＩＬ−１−Ｂ、およびインターロイ キン２から１４までのインターロイキンをコード化する遺伝子：ＧＭ−ＣＳＦを コード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼつまりＡＤＡをコード化する遺伝 子；リンパ球の成長因子である上皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因 子（ＫＧＦ）、リンホカインなどの細胞成長因子あるいはサイトカインをコード 化する遺伝子；融解ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子VII；因子IX；Ｔ細胞レ セプター；コレステロール移送および代謝に含まれるＬＤＬレセプター、Ａｐｏ Ｂ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩおよびその他の遺伝子；α−１抗トリプシン（α１Ａ Ｔ）遺伝子、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子、イン スリン遺伝子、負の選択マーカーあるいは「自殺」遺伝子、例えば単純性ヘルペ スウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロンウイルスチミジンキナーゼ 遺伝子、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼなどのようなチミジン キナーゼ遺伝子；Ｃｕ−ＳＯＤ，Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＺｎ−ＳＯＤなどのスー パーオキシドジスムターゼ遺伝子；抗体の抗原結合領域のためのＦｃレセプター 、およびＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセン ス配列などのウイルス複製を阻 害するアンチセンス配列。追加の治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ，アンチセン スＲＮＡ、あるいはリボザイム等の遺伝子転写物を含む。しかしこの発明の範囲 は前記記載の治療薬に限定することを意図していないことは理解されるべきであ る。 治療薬をコード化するＤＮＡ配列は、治療薬あるいは治療薬の断片もしくは誘 導体をコード化する天然核酸配列の断片あるい誘導体をコード化する天然核酸配 列であり、それは未修飾治療薬あるいはその対立突然変異体と同じ生物活性を保 持する。ここで使用される「対立突然変異体」という用語は、対立突然変異体が １個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失、あるいは追加のある天然核 酸配列の代替形態であり、それがコード化された治療薬の機能を事実上変更しな いことを意味する。ＤＮＡ配列は全長治療薬をコード化しあるいは治療薬の断片 もしくは誘導体をコード化し、ＤＮＡ配列はリーダー配列あるいはその部分、治 療薬をコード化する遺伝子の分泌シグナルあるいはその部分を含み、およびもし くは治療薬をコード化する遺伝子のトレーラー配列あるいはその部分を含む。 治療薬をコード化するＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御したにある。使 用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが以下のものを含む ：アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；あ るいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異型プロモーター； ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴＶプロモーター、メタロチ オネインプロモーターなどの誘導体プロモーター；熱ショックプロモーター；ア ルブミンプ ロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーター。選択肢として遺伝子はそれ自身の 天然プロモーターの制御下にある。しかし、この発明の範囲はいずれかの特異的 なプロモーターに限定されるものではない。 レプタンパク質あるいはＡＡＶレプタンパク質をコード化するＤＮＡおよび遺 伝子構築物は宿主に生体内あるいは真核細胞に試験管内で投与される。一つの実 施例において、レプタンパク質は遺伝子構築物と混合され、レプタンパク質と遺 伝子構築物の混合物は電気穿孔法あるいはリポソームもしくはアデノウイルスカ プシドなどの被包媒体を経て試験管内で真核細胞に導入される。も一つの実施例 において、ＡＡＶレプタンパク質（あるいはＡＡＶレプタンパク質をコード化す る核酸配列を含む発現ベクター）および遺伝子構築物はリポソーム内に被包され 患者に生体内投与され、これによりレプタンパク質は決定された染色体遺伝子座 、染色体１９，１３．４ｑｔｅｒで遺伝子構築物のヒト染色体への組込みを促進 する。レプタンパク質あるいはレプタンパク質をコード化する核酸配列を含む発 現ベクター、および遺伝子構築物は当業者にとって周知の方法によりリポソーム あるいはアデノウイルスカプシド内に被包される。決定された染色体標的の使用 は、いずれかの宿主遺伝子の不注意な不活性化の尤度を最小にする。 一つの実施例において、この組成物はさらに望ましい細胞型、組織あるいは器 官と結合するリガンド、あるいは非組織特異的であるガンドを含む。リガンドの 例は必ずしもそれに限定されないが以下のものを含む：アデノウイルスペントン 、繊維 三量体、あるいは不活性アデノウイルス；センダイウイルス、セムリキ森林熱ウ イルス、およびインフルエンザ融合誘導ペプチドから誘導される融合誘導タンパ ク質；肝細胞のアジアロ糖タンパク質レセプターと結合するアジアロ糖タンパク 質；サイトカインと結合した膜；例えばＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータ などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ’ｓ）；肝細胞のレセプターと結合するトランスフ ェリン；活性化Ｔ細胞、および神経組織細胞のレセプターと結合するインターロ キシン２、肝細胞のＬＤＬレセプターと結合するＡｐｏＢ；肝細胞のＬＲＰレセ プターと結合すね２−マクログロブリン；肝臓のアジアロ糖タンパク質と結合す るアルファ−１酸糖タンパク質；マクロファージのマンノースレセプターと結合 するマンノース含有ペプチド；活性化内皮細胞のＥＬＡＭ−１レセプターと結合 するシアリルルイスＸ（Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｗｉｓ−Ｘ）抗原含有ペプチド；造 血祖先細胞のＣＤ３４レセプターと結合するＣＤ３４リガンド；Ｂリンパ球のＣ Ｄ４０レセプターと結合するＣＤ４０リガンド；リンパ球のＬＦＡ−１（ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８）レセプター、あるいはマクロファージのＭｕｃ−１（ＣＤ１１ ａ／ＣＤ１８）レセプターと結合するＩＣＡＭ−１：脾臓および骨髄マクロファ ージのｃ−ｆｍｓレセプターと結合するＭ−ＣＳＦ；肝細胞の肝臓熱帯熱マラリ ア原虫レセプターと結合するサーカムスポロゾイトタンパク質（circumspo-rozo ite protein）；活性化内皮細胞のＶＣＡＭ−１レセプターと結合するＶＬＡ− ４；神経細胞のＮＧＦレセプターと結合するＮＧＦ：Ｔヘルパー細胞のＣＤ４レ セプターと結合する ＨＩＶ ｇｐ１２０およびクラスＩＩ ＭＨＣ抗原；アポリポタンパク質Ｅ（Ａ ｐｏＥ）分子のＬＤＬレセプター結合領域；ＣＳＦレセプターと結合するコロニ ー刺激因子つまりＣＳＦ；それぞれＩＧＦ−_iおよびＩＧＦ−ＩＩレセプターと 結合するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩなどのインスリン状成長因子；それぞれ インターロイキン１から１４レセプターと結合するインターロイキン１から１４ ；および免疫グロブリンのＦｃ抗原結合領域。このリガンドはレプタンパク質と 接合され、あるいはレプタンパク質および遺伝子構築物の混合物に接合され、も しくはリポソームがレプタンパク質および遺伝子構築物を運ぶために使用される 場合には、リガンドはリポソームのリン脂質二分子層に固定する。 治療薬をコード化するＤＮＡ配列は宿主に治療効果を生み出すのに有効な量で 投与される。宿主は動物宿主であり、とりわけ哺乳類宿主である。哺乳類宿主は ヒトあるいは非ヒト霊長類である。投与される正確な用量は患者の年齢、体重お よび性、使用される遺伝子構築物の型、治療される疾患、使用されるＡＡＶレプ タンパク質の型、ＤＮＡを運ぶのに使用される脂質小胞の製剤形態、およびＤＮ Ａで形質移入される細胞の型の性質を含む各種の因子に依存する。 も一つの実施例において、この発明の組成物は動物モデルで使用され、ここで この発明の組成物は生体内で動物に投与される。動物は次いでヒト患者における 可能な遺伝子治療法の有効性を確認するために生体内で治療薬の発現を評価され る。 選択肢として、タンパク質あるいはポリペプチドもしくは対 象となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列を含むこの発明の組成物は、試 験管内でヒト細胞などの真核細胞に投与され、これにより細胞はタンパク質ある いはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列を 含む遺伝子構築物で形質移入される。このような実施例において、遺伝子構築物 は５×１０⁵細胞当りＤＮＡ約０．７５μｇから約１．５μｇ、望ましくは５× １０⁵細胞当りＤＮＡ約１．２５μｇの量で投与される。真核細胞は次いで遺伝 子治療手順の一部として宿主に投与され、これによりその真核細胞は宿主にある タンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物を発現する。 も一つの選択肢として、この発明の組成物は試験管内で真核細胞を形質移入す るのに使用され、これによりその形質移入真核細胞は望ましいタンパク質あるい は対象となるポリペプチドを試験管内で生産するために培養される。 実施例 この発明はこれから下記の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範 囲はそれにより限定されるものではない。 実施例１ Ａ．ｐＡＡＶＲｎＬａｃＺの構築 プラスミドＡＡＶｐ５ｎｅｏ（フロット、他、呼吸器細胞分子生物学アメリカ ンジャーナル 、７巻、３４９−３５６ページ（１９９２年））（図１）はｎｅｏ^R 遺伝子を除去するためにＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断され、ｐＳＶ −βガラクトシダーゼ（プロメガ）からのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片 （図２）は平滑化されプラスミドＴＲＦ１６９を形成するためにプラスミドの平 滑部位にクローンされた（図３）。 ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターおよびｌａｃＺ遺伝子の核標的化配列を提供した 第２プラスミドが以下のように構築された。プラスミドＬＺ１１からのｎｌａｃ Ｚ 遺伝子を含むＢｇ１ＩＩ／ＸｂａＩ断片（ガリレオ、他、全米科学アカデミー 紀要 、８７巻、４５８−４６２ページ（１９９０年））（図４）がｐＳＰ７２（ プロメガ）の平滑ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位（図５）にクローンされｐＳＰ ７２ｎＬａｃＺを形成した（図６）。ｐＳＰ７２ｎｌａｃＺから、ｎｌａｃＺ遺 伝子を含むＢｇ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片が除去されａｄＲＳＶ４（図７）のＢａ ｍＨＩ部位にクローンされ、後者はミシガン大学のビバリー・ダビッドソン博士 から得られた。生成するプラスミドはｐＡｄＲＳＶｎＬａｃＺ（図８）として引 用される。 ｐＡＡＶｒｎＬａｃＺ（図９、ＡＴＣＣ番号６９４９２）はｌａｃＺ遺伝子に 結合する核標的化シグナルであるＲＳＶ−ＬＴＲプロモータを含むｐＡｄＲＳＶ ｎＬａｃＺからのＳｓｐＩ／ＤｒａＩＩＩ断片をＴＲＦ１６９のＰｍ１Ｉ／Ｄｒ ａＩＩＩ部位に挿入することにより生産された。Ｂ．ＡＡＶレプタンパク質の調製 （ｉ）ＭＢＰ−レプ６８ΔおよびＭＢＰ−レプ７８のクローニング レプタンパク質レプ６８およびレプ７８の読み取り枠がＰＣＲ増幅により生成 された。アデノ関連性ウイルスのヌクレオチド３７７−３４６（レプ６８および レプ７８読み取り枠の コドン３−９）に対応する共通５′プライマーが合成されレプ６８およびレプ７ ８に使用された。最初にレプ６８は、ＡＡＶヌクレオチド２０２９−２０４８（ コドン５７０−２７６）の逆補体に対応する３′プライマーを用いて増幅された 。ＰＣＲ増幅は緩衝液とともにクローンｐｆｕポリメラーゼ（ストラータジェン ）を用いて行われた。ＰＣＲ製品はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、それはヌクレオ チド１８８２でＡＡＶを切断し、プラスミドｐＰＲ９９７に結合し（図１０）（ ニューイングラング・バイオラブス）、それはＸｍｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで 消化された。かくしてレプ６８遺伝子は３′末端での１６コドンが欠失されたｐ ＰＲ９９７に挿入され、かくして以下でレプ６８Δとして時々引用される修飾レ プ６８タンパク質を生成し、ここではＣ末端での最後の１６アミノ酸が欠失して いた。ｐＰＲ９９７は大腸菌ｍａｌＥ遺伝子を含み、ここでｍａｌＥ遺伝子のヌ クレオチド２−２６が欠失され、ｌａｃＩレプレッサーに対するオペレーター部 位を含む大腸菌ｔａｃプロモーターにより制御された。ｐＰＲ９９７は更にポリ リンカーあるいは多重クローニング部位を含む。このクローニング戦略はレプ６ ８ 遺伝子の５′末端でｐＰＲ９９７のｍａｌＥ読み取り枠の枠組みに結合するレ プ６８ 遺伝子の読み取り枠に帰着した。レプ６８遺伝子の３′末端はＡＡＶレプ ６８ 読み取り枠およびｌａｃＺα遺伝子の間でフレームシフト融合となり、カル ボキシ末端で追加５０残基を生じた。生成プラスミドはｐＭＢＰ−レプ６８Δで ある（図１１）。 推定上のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）結合部位での突然 変異を用いる突然変異体ＭＢＰ−レプ６８△は、ｐＨＩＶレプＮＴＰプラスミド からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のコドン３４０（Ｋ３４０Ｈ）における リシン対ヒスチジン突然変異で代替することで生産され（オーエンス、他、ウイ ルス学 、１８４巻、１４−２２ページ（１９９１年）；オーエンス、他、ウイル ス学ジャーナル 、６７巻、９９７−１００５ページ（１９９３年））、ｐＭＢＰ −レプ６８△ＮＴＰを形成した（図１２）。ＭＢＰ−レプ６８△−ＮＴＰはＭＢ Ｐ−レプ６８△のＤＮＡ結合機能を保持する。しかしヘリカーゼ活性などの他の 生化学活性は除去される。 ｐＭＢＰ−レプ７８はＡＡＶヌクレオチド１８７２−２２３９を増幅すること により生成された。この配列はレプ６８およびレプ７８ならびにレプ７８の３′ 末端のオーバーラッピング領域を含む。５′プライマーはＡＡＶヌクレオチド１ ８７２−１８９４に対応しまた３′プライマーはＡＡＶヌクレオチド２２１５− ２２３９の逆補体に対応し、更にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を取り込む 。ＰＣＲ製品はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＭＢＰ−レプ ６８△に結合された。生成するプラスミドはｐＭＢＰ−レプ７８である（図１３ ）。 ＭＢＰ−レプ７８タンパク質はｍａｌＥ読み取り枠およびレプ７８遺伝子コド ン３で開始するアデノ関連性ウイルス読み取り枠の間の枠組み内融合タンパク質 である。３′末端はレプ遺伝子の天然発生停止コドンを利用し、従って非ウイル スカルボキシ末端残基は存在しない。 （ii）タンパク質発現 大腸菌生物は標準の方法に従ってｐＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰあるいはｐＭＢ Ｐ−レプ７８で形質移入された。ＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰあるいはＭＢＰ−レ プ７８をコード化するＤＮＡはｌａｃＩレプレッサー遺伝子製品で抑制される大 腸菌ｔａｃ プロモーターの制御下にある。ＩＰＴＧの追加はｌａｃレプレッサー のｔａｃプロモーターへの結合を妨げ、これによりＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰあ るいはＭＢＰ−レプ７８の高水準の発現を可能にする。正確な挿入および配向に 正である組換え体は融合タンパク質の発現をスクリーンされた。予想された分子 量のタンパク質を生産する細菌クローンはより大きな組換えで成長した。 ｐＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰあるいはｐＭＢＰ−レプ７８で形質転換された細 菌１リットルが得られた。細菌ペレットが遠心分離により各培養から得られ、各 細菌ペレットは０．０５量のカラム緩衝液（ＮａＣｌ，２００ｍＭ、トリス−Ｃ ｌ（ｐＨ７．４），２０ｍＭ，ＥＤＴＡ，１ｍＭおよびジチオスレイトール１ｍ Ｍ）で再懸濁された。細菌は４回３０秒パルスの音波処理で溶解された。懸濁液 は９，０００ｘｇで２０分４℃の遠心分離により清澄化された。 上澄みはカラム緩衝液で平衡化されたアミロース−セファロース樹脂を詰めた カラムに容れられた。カラムは次いで１０カラム量のカラム緩衝液で洗浄された 。タンパク質は次いでマルトース１０ｍＭを含む１Ｘカラム緩衝液で溶離された 。約１ｍｌの画分が収集され、２μｌのアリコートがＳＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル８％上でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分 析された。培養物１リットルからのＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰあるいはＭＢＰ− レプ７８の全収穫量はタンパク質４乃至１２ｍｇであった。 Ｃ．ＡＡＶレプタンパク質およびｐＡＡＶＲｎＬａｃＺを含むリポソームの調製 リポソームは脂質３μｌをオプティメム（ジブコ）２５μｌと０．０５μｇ／ μｌの濃度でプラスミドｐＡＡＶＲｎＬａｃＺを含むオプティメム溶液２５μｌ と混和して作られた（ＤＮＡ１．２５μｇを生成した）。プラスミドを含むオプ ティメム溶液は（ｉ）０．９８μｇ，０．４２μｇ，０．２６μｇあるいは０． １９μｇの量のＭＢＰ−レプ７８；（ｉｉ）１．５μｇ，０．１５μｇ、あるい は０．０１５μｇの量のＭＢＰ−ＬａｃＺ；もしくは（ｉｉｉ）１．５μｇ，０ ．１５μｇ、あるいは０．０１５μｇの量のＭＢＰ−レプ６８ΔＮＴＰのいずれ かとともに１／２時間３７℃で予備保温された。Ｄ．ＡＡＶレプタンパク質およびｐＡＡＶＲｎＬａｃＺを含むリポソームを用い る細胞の形質移入 溶液がリポソームを形成するため混和されてから１時間半後に、リポソームを 含む溶液は、ＰＢＳで洗浄され最小量のオプティメムでおおわれたヒト肝臓癌誘 導Ｈｅｐ Ｇ−２細胞に加えられた。リポソームは全プラスミドＤＮＡ１．２５ μｇが５×１０⁵細胞当りで加えられる量で加えられた。細胞をリポソームと接 触させる前に、細胞はウシ胎児血清１０％およびグルタミン２ｍＭを加えたＤＭ ＥＭで成長させられた。細胞は ＣＯ₂５％雰囲気を持つ恒温器で３７℃で成長した。 リポソームが細胞に加えられて１８時間後に血清含有培地が加えられた。リポ ソーム追加３３時間後、細胞はＰＢＳで洗浄され、トリプシンを用いて消化され 血清含有培地がトリプシン作用を停止するために加えられ、細胞は細胞血球計算 のために氷上に移された。 レプタンパク質と５′標識ＡＡＶ ＩＴＲの間の最適比率を決定するために、 共有結合検定を用いて実験が行われた。この検定は３種のレプタンパク質機能（ 非共有結合、エンドヌクレアーゼ活性、および共有結合）に依拠している。（イ ム、他、ウイルス学ジャーナル、６３巻、３０９５−３１１４ページ（１９８９ 年）：キオリーニ、他、ウイルス学ジャーナル、６８巻、７４４８−７４５７ペ ージ（１９９４年））。最大共有結合形成はＭＢＰレプ７８／ＩＴＲモル比が９ ：１の際に生じた。 この情報を用いて、血球計算は形質移入３６時間後に行われた。細胞は計数さ れ生存度はトリパンブルーおよびヨウ化プロピジウム染色で決定された。９５％ 以上の細胞は生存可能であり、これはレプタンパク質を含むリポソームが毒性で はないことを示していた。ＬａｃＺを発現する細胞は蛍光β−ガラクトシダーゼ 基質フルオレセイン・ダイベータ・ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）を用いて検出 され、正（＋）および負（−）母集団に分けられた。非生存可能細胞はすべての ％（＋）同定および分類から除外された。血球計算は更に分類母集団の純度を証 明するために行われた。これは分類母集団が９９％以上の純度 であることを示した。 ＭＢＰ−レプ７８で処置したＨｅｐ Ｇ−２細胞の正の細胞（すなわちｌａｃ Ｚ遺伝子を発現した細胞）の割合は以下の表Ｉで示される。 ＭＢＰ−ｌａｃＺで処置されたＨｅｐ Ｇ−２細胞で形質移入３６時間後の正 の細胞（すなわちｌａｃＺ遺伝子を発現した細胞）の割合は以下の表IIで示され る。 ＭＢＰ−レプ６８−デルタＮＴＰで処置されたＨｅｐ Ｇ−２細胞で形質移入 ３６時間後のｌａｃＺ遺伝子を発現した正の 細胞の割合は以下の表IIIで示される。 これらの結果にもとづき、ＭＢＰ−レプ７８は用量関連様式ではｌａｃＺ遺伝 子の早期の発現を生じさせるように見えた。これは特異的なレプタンパク質作用 であった。というのは、レプタンパク質機能を持たないタンパク質であるＭＢＰ −ｌａｃＺが反対の作用を有し、タンパク質の量を増加させながら正の細胞数を より少なく示す傾向にあったためであった。ＭＢＰ−レプ７８の作用はＤＮＡ結 合以外のレプタンパク質活性を必要とするかに見えた。何故なら非共有結合でき るがＡＡＶ ＩＴＲを切断しない突然変異体レプタンパク質であるＭＢＰ−レプ ６８デルタＮＴＰがＭＢＰ−ｌａｃＺと同じ作用を持っていたためであった。 細胞は培養で約２ケ月維持され、次いで反復血球計算分析に送られた。細胞生 存度は高水準を維持した。細胞は次いで何らかの背景明白性を減少するためにク ロロキンで予備保温され、次いで前記記載のフルオレセイン・ダイベータ・ガラ クトピラノシド（ＦＤＧ）で染色された。非生存可能細胞はヨウ化プロピジウム および血球計算により除去され、正のパーセント細胞 は生存可能細胞として決定された。 形質移入３６時間後正であり、ＭＢＰ−レプ７８で処置された細胞の中で形質 移入２ケ月後正の細胞（すなわちｌａｃＺ遺伝子を発現した細胞）の割合は以下 の表IVで示される。 形質移入３６時間後負であり、ＭＢＰ−レプ７８で処置された細胞の中で形質 移入２ケ月後正の細胞の割合は以下の表Ｖで示される。 表IVおよびＶの結果は、もともと負であった細胞で最大であった用量依存型Ｍ ＢＰ−レプ７８作用を示していた。これらの細胞はＦＤＧ正の細胞の割合が高く 、またこの割合は使用されるレプ７８の用量が増加するにつれて増加した。形質 移入３６時間後で正であった細胞は安定した正の細胞の割合がずっと低く、また レプ７８が長期にわたって正の細胞を増加させているように見えた間に、用量作 用は存在しなかった。 これらの結果は、ＭＢＰ−レプ７８がＩＴＲ側面位置遺伝子を持つリポソーム 経由で運ばれると、それは用量依存型様式で細胞培養内に長期にわたり遺伝子導 入発現を増加させるように見える。このような発現の増加は、連続的な正の選択 圧力なしで２か月間それが培養で染色体外因子を持続することがあり得ないよう に、組込みを増加させることから生じることはあり得ないことである。前記の結 果から、リポソームで運ばれるレプタンパク質は細胞内で二つの作用、すなわち （ｉ）組込みへの作用を減少させる遺伝子導入の当初の発現の強化（持続的に正 の細胞を引続いて低い水準で持つもともと正である細胞）：あるいは（ii）一方 では組込みを促進する当初の遺伝子導入発現の抑制（長期にわたり正の細胞を引 続いて高い水準で持つもともと負である細胞）を持つように見える。 実施例２ ヒト因子IXに対するＡＡＶベクターを用いる血友病Ｂの生体外処置 ｐＡｖ１Ｈ９ＦＲ（図１４．アデノウイルス５′ＩＴＲ、ＲＳＶプロモーター 、三部分リーダー配列、ヒト因子IX遺伝子 の５′未翻訳領域、中心切形第１イントロン、ヒト因子IXコード化領域、ヒト因 子IX遺伝子の３′未翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、およびアデノウイルス 相同的組換え領域を含む）は、ヒト因子IX遺伝子および前記ゲノム要素ならびに ポリアデニル化シグナルを含む断片を得るためにＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで消 化される。この断片はクレノウで平滑末端化され、ｐＡＡＶＲＳＶＦ９を得るた めにｐＡＡＶｒｎｌａｃＺのＮｏｔＩ−ＢｓｍＩ消化のＩＴＲ含有断片にクロー ンされる（図１５）。 プラスミドｐＡＡＶＲＳＶＦ９はＲＳＶプロモーターの制御の下でヒト因子IX の遺伝子を含む。そこには５′および３′フランキングＡＡＶ ＩＴＲが存在す る。 ５′−ＡＡＶ ＩＴＲ−ＲＳＶプロモーター−ヒト因子IX遺伝子−ポリＡ−Ａ ＡＶ ＩＴＲ−３′ 血友病Ｂを持つ患者は適切な凝固因子支援を利用して部分肝切除を受ける。除 去細胞は３７℃で培養される。１日後細胞はＩＸ ＰＢＳでゆっくり洗浄され、 次いでオプティメム（ジブコ）でゆっくり再洗浄される。細胞はオプティメムの 薄層でおおわれる。ＤＮＡ含有リポソームが５×１０⁵細胞当りに加えられるＤ ＮＡが１．２５マイクログラムの比率になるように加えられる。 脂質３マイクロリットルをオプティメム（ジブコ）２５マイクロリットルと０ ．０５マイクログラム／マイクロリットルの濃度でプラスミドｐＡＡＶＲＳＶＦ ９を含むオプティメム２５マイクロリットルで混和して形成される（ＤＮＡ、 １．２５μｇを形成する）。プラスミドを含有するオプティメム溶液はＭＢＰ− レプ７８の１μｇとともに１／２時間３７℃で予備保温された。 リポソーム迫加の１８時間後、血清含有培地が細胞に加えられる。翌日細胞は 標準のトリプシン消化方法を用いて溶液にされ、当初の部分肝切除の時点で置か れた留置門静脈カテーテルを用いて患者に自家輸血される。カテーテルは細胞の 自家輸血後除去される。肝細胞は再移植されヒト因子IXを生産し、これにより患 者の因子IX欠損を改善する。 実施例３ リポソームの門静脈注入を用いる血友病Ｂの生体内処置 血清の存在下で安定している脂質がリポソーム形成に使用される。リポソーム はまず脂質５マイクロリットルを生体内リポソームの形成に適した溶液２５マイ クロリットルに混和して作られる。この脂質溶液は次いでプラスミドｐＡＡＶＲ ＳＶＦ９、１．２５マイクログラムおよびＭＢＰ−レプ７８あるいはレプ７８の 遺伝子を含むプラスミドのいずれか１マイクログラムを含む溶液２５マイクロリ ットルと混和される。使用されるこの溶液は生体内で使用できるリポソームの形 成に適切なものである。ｐＣＭＶＭＢＰレプ７８（図１６）はレプ７８の遺伝子 を含むプラスミドの例である。ｐＣＭＶＭＢＰレプ７８は以下のように構築され た。 ＰＣＲを用いて、ｐＭＢＰレプ７８の５′未翻訳領域にあるＥｃｏＲＶ部位に 隣接して位置するＡＴＧ配列はＡＧＴに変化された。このＰＣＲで使用されたオ リゴヌクレオチドは の配列を有していた。生成するプラスミドｐＭＢＰＡＧＴレプ７８は、次いでＥ ｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化された。ＭＢＰレプ７８断片は次いでプラスミド ｐＣＤＮＡにクローンされ、このプラスミドはＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで開か れていた。生成するプラスミドｐＣＭＶＭＢＰレプ７８（図１６）はＣＭＶプロ モーターの制御下にあるＭＢＰ−レプ７８の遺伝子である。 ＭＢＰ−レプ７８タンパク質がリポソームを形成するために使用される場合に は、次いでこのＤＮＡおよびタンパク質は脂質−オプティメム混合物で混和する １／２時間前にオプティメム溶液で３７℃で予備保温される。リポソームは次い で門静脈カテーテルを使用して血友病Ｂを持つ患者の肝臓に運ばれる。カテーテ ルは適切な凝固因子支援を用いて注入の日に設置される。患者の持つ肝細胞数の 概算見積は彼もしくは彼女の体質量指数で与えられ、無菌水で希釈されたリポソ ームはＤＮＡの約１．２５マイクログラムが５×１０⁵肝細胞当りで投与される ように注入される。門静脈カテーテルが除去され患者は適切な術後ケアをとられ る。摂取に続き、安定的に形質導入されたこれらの細胞はヒト因子IXの生産を開 始し、これにより患者の凝固因子欠損を改善する。 実施例４ リポソームおよび肝臓選択的リガンドを用いる血友病Ｂの生体内処置 アジアロ糖タンパク質などの肝臓選択的リガンドがリポソームの膜相に固定さ れることを除き、リポソームは実施例３で説明された通りに形成される。リガン ドはリガンドに連結される適切な脂質尾部を用いてリポソーム形成の時点で取り 込むことができ、あるいはリガンドはリポソームの形成に続いて取り込むことが できる。後者の場合、リガンドと膜結合タンパク質の間の共有化学結合形成を含 む各種の標準方法のいずれかを用いてリガンドは膜に付加することができる。リ ポソームは血友病Ｂを持つ患者に静脈内投与される。リポソームは全身循環を通 じて移動するので、それは肝細胞により選択的に取り込まれる。というのはリガ ンドが肝細胞表面にあるレセプターと結合するからである。これは肝臓特異的摂 取、従ってヒト因子IX遺伝子の発現に導き、これにより患者の凝固欠損を改善す る。 実施例５ ヒト因子VIIIのＡＡＶベクターおよび浸透圧ポンプを用いて再移植されるヒト 内皮細胞を使用する血友病Ａの生体外処置 ｐＡｖＡＬＡＰＨ８１（図１７。アデノウイルス５′ＩＴＲ、アルブミンプロ モーター、およびＡｐｏＡｌ転写開始部位、ヒト因子VIIIコード化領域、および アデノウイルス相同性組換え断片を含む）はＡｐｏＡＩ−因子VIII断片を得るた めにＳａｌＩおよびＣｌａＩで消化された。断片はクレノウで平滑末端化され、 次いでこの平滑断片はｐＡＡＶＲＳＶＦ９にクローンされる。ｐＡＡＶＲＳＶＦ ９プラスミドはプラスミドの因子IX−ポリＡ部分を除去するためにＥｃｏＲＶお よびＣｌａＩでの消化によって開かれる。残存する断片はＡＡＶ ＩＴＲおよび ＲＳＶプロモーターを含む。ｐＡｖＡＬＡＰＨ８１のｐＡＡＶＲＳＶＦ９へのク ローニングの結果はｐＡＡＶＲＳＶＡｐｏＦ８である（図１８）。 内皮細胞が血友病Ａ（因子VIII欠損）を持つ患者の静脈から分離され、３７℃ の培養で維持される。リポソームは以下のように形成される：プラスミドｐＡＡ ＶＲＳＶＡｐｏＦ８、１．５μｇおよびＭＢＰ−レプ７８、１．２μｇが全量で ２５マイクロリットルを生産するためにオプティメム溶液（ジブコ）に加えられ る。この混合物はゆるやかに粉末にされ３７℃で１／２時間保温される。保温に 引き続きＤＮＡ−レプ溶液はオプティメム２５マイクロリットル内で脂質３マイ クロリットルよりなる溶液と混和される。生成する混合物はゆっくりと粉末化さ れ１／２時間室温で放置される。 内皮細胞は１Ｘ ＰＢＳでゆっくりと洗浄され、次いでオプティメムを用いて ２回ゆっくりと再洗浄される。１０⁵細胞当りすべてリポソーム２５マイクロリ ットルが追加される。細胞は１２時間３７℃の恒温器に戻され、次いで血清含有 培地が付加される。この処置に引き続いて４週間後に細胞による因子VIIIの生産 が確認される。細胞は標準のトリプシン消化、それに続く血清含有培地とともに トリプシンの不活性化により溶液に投入される。細胞は浸透圧ポンプ装置管材料 の内表面に接種され、ポンプは患者の前腕部皮下に挿入される。ポンプにある細 胞はヒト因子VIIIを生産し、このタンパク質は浸透圧ポンプから周辺組織に放散 される。それは次いで患者の血流に取り入れられ、因子VIII欠損を治療する。 この明細書で引用されるすべての特許、公開された特許出願を含む公開情報、 およびデータベースエントリーの開示は、この個別の特許、公開情報およびデー タベースエントリーがあたかも特異的かつ個別的に引用例として組み込まれるも のと指示されたかのように同じ範囲でその全体を引用例として特異的に組み込ま れている。 しかしこの発明の範囲は前記記載の特異的な実施例に限定されるべきものでな いことは理解されるべきである。この発明は特に説明されるもの以外に実施する ことができ、しかも以下の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キオリーニ，ジョン，エイ. アメリカ合衆国，20902 メリーランド, シルバー スプリング，ローマ ストリー ト 2604 (72)発明者 セイファー，ブライアン アメリカ合衆国，20902 メリーランド, シルバー スプリング，チルトン ドライ ブ 1610 (72)発明者 コティン，ロバート，エム. アメリカ合衆国，20850 メリーランド, ロックビル，イートン オーバールック 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．望ましいポリペプチドあるいはタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を細胞 に送達する一つの組成物であって （ａ）アデノ関連性ウイルスレプタンパク質あるいはアデノ関連性ウイルスレ プタンパク質をコード化する核酸配列、および （ｂ）遺伝子構築物であって、タンパク質あるいはポリペプチドもしくは対象 となる遺伝子転写物をコード化するＤＮＡ配列；タンパク質あるいはポリペプチ ドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化する前記ＤＮＡ配列を制御するプ ロモーター；更に第１アデノ関連性ウイルスＩＴＲあるいは部分もしくはその誘 導体、および第２アデノ関連性ウイルスＩＴＲあるいは部分もしくはその誘導体 を含み、前記第１および第２アデノ関連性ウイルスＩＴＲはタンパク質あるいは ポリペプチドもしくは対象となる遺伝子転写物をコード化する前記ＤＮＡ配列の 側面に位置し、また前記プロモーターはタンパク質あるいはポリペプチドもしく は対象とする遺伝子転写物を制御する遺伝子構築物、 よりなることを特徴とする組成物。 ２．請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで前記アデノ関連性ウイルス レプタンパク質がレプ７８、レプ６８、レプ５２、レプ４０、およびその断片あ るいは誘導体よりなるグループから選択されることを特徴とする組成物。 ３．請求の範囲第２項記載の組成物であって、ここで前記アデノ関連性ウイルス レプタンパク質がレプ７８タンパク質あるい は断片もしくはその誘導体であることを特徴とする組成物。 ４．請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで前記タンパク質あるいは対 象となるポリペプチドが治療薬であることを特徴とする組成物。 ５．請求の範囲第１項記載の組成物であって、前記アデノ関連性ウイルスレプタ ンパク質あるいはアデノ関連性レプタンパク質をコード化するＤＮＡを含む被包 媒体、および前記遺伝子構築物を更に含むことを特徴とする組成物。 ６．請求の範囲第５項記載の組成物であって、ここで前記被包媒体がリポソーム であることを特徴とする組成物。 ７．請求の範囲第６項記載の組成物であって、ここで前記リポソームが望ましい 標的細胞、組織、あるいは器官に特異的なリガンドを更に含有することを特徴と する組成物。 ８．請求の範囲第４項記載の組成物に含まれる遺伝子構築物で形質移入された真 核細胞。 ９．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第４項記 載の組成物を宿主に治療効果を生み出すのに有効な量で前記宿主に投与すること よりなることを特徴とする方法。 １０．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第８項 記載の真核細胞を宿主に投与し、前記真核細胞が前記宿主に治療効果を生み出す のに有効な量で投与されることよりなることを特徴とする方法。