JPH10508690A

JPH10508690A - 細胞の有糸分裂の分析における改善された正確度

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Publication number: JPH10508690A
Application number: JP8512646A
Authority: JP
Inventors: リーデービッドカメンツキイ
Original assignee: コンピュサイトコーポレーション
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-05
Publication date: 1998-08-25
Also published as: AU3888995A; WO1996011448A1; EP0793830A1; US5633945A; EP0793830A4; CA2201868A1; IL115506A; IL115506A0

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡによって吸収される螢光染料で着色された細胞が、サイトメータで検査される。分裂の工程（Ｇ０相）においてではなく、実際に２つの細胞に分裂（Ｇ２相）しないがＤＮＡの２つの全補体を有する細胞およびＤＮＡを複製する（Ｓ相）工程における細胞について、全ての細胞の総量が、ＤＮＡの補体を有する細胞群をあらわす全ての螢光と対比して細胞数のヒストグラムを作成するために集計される（図２）。総量およびヒストグラムや、正確度，ピークの前兆値，分離相に与える影響において、統計上のエラー，焦点を合わせる問題，バックグラウンドの不正確な測定などによるエラーが、Ｇ０およびＧ２ピークおよびＳ相（図１４）から信号関数とエラー関数との畳み込みのモデルを作成し、脱畳み込みによってエラー関数を取り除くことにより訂正される。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の有糸分裂の分析における改善された正確度図面および好ましい実施例の詳細な開示フローサイトメータの作用の一般的な概略において、上述の従来技術に対する特別な例（フローサイトメータの特性）で、図１ａ（図１中）は、光源によって発生する光線の間を通る細胞懸濁液と、光分散検出器と、螢光収集レンズとを含むサイトメータである。光分散検出器と螢光収集レンズは、それぞれ光分散および螢光を集め、適当な電子装置で、検出されたデータがヒストグラムに変換される。サイトメータを基礎とする顕微鏡と同様に一般的な概略において、また上述の米国特許の文献において、図１ｂ（図１中）で、可動ステージを有する顕微鏡１６が、細胞標本をのせたスライド２８を検査するために用いられる。標本は、光源１２によって照射されるとともに螢光を発せられ、センサ２０，２２で光分散を検出し、センサ２４，２６で螢光を検出し、検出された光からヒストグラムが作成される。図２において、フローチャートに示すように、図１ａや図１ｂのようなサイトメータから得られる細胞の統合された螢光を基礎として、細胞の分析によりヒストグラムアレイが作成される。細胞リストの各要素は、細胞の統合された螢光の記録を含む。ヒストグラムアレイはメモリー中に形成され、それは２００チャンネルまたはアレイ要素で構成される。ヒストグラム要素は、０に対して準備動作に入る。ヒストグラムのチャンネルＮは、統合された螢光がスケール＊Ｎとスケール＊（Ｎ＋１）の間にある細胞リスト中の細胞の数を含む。リスト中に細胞がなくなるまで、細胞リストから次の細胞が選択される。ヒストグラムは、チャンネル中の細胞の計数を含む。統合された螢光はスケールで分割され、増加のためにチャンネルのインデックス０〜１９９を生じ、またはインデックス＞＝２００を生じる。インデックスが２００より小さければ、対応するチャンネルにおける計数に１が追加される。これは、細胞がなくなるまで繰り返される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年５月３日【補正内容】【図１】【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図６】【図７】【図８】【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【図１３】【図１４】【図１５】【図１６】【図１７】【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月２日【補正内容】明細書細胞の有糸分裂の分析における改善された正確度発明の分野本発明は、癌の段階や発達の予測において細胞有糸分裂を決定するために細胞のＤＮＡ含有量をサイトメトリーで測定することに関するものである。発明の背景細胞は有糸分裂で増殖し、そして個々の細胞は有糸分裂による進行によって、即ち細胞中のＤＮＡの量を測定することによって同定するか又は分類することができる。細胞は一般的に３つのクラス又は「集団」に分類される：ａ）正常な細胞、又は分裂期にない（Ｇ₀期）細胞であって、これら細胞は通常集団バルクを形成する。これらの細胞はＤＮＡの基線の補体（comp lement）を有している；ｂ）基線値を超える少量の種々の追加的ＤＮＡを有するＤＮＡ複製期（Ｓ期）の細胞；ｃ）ＤＮＡの２つの完全な補体を有しているが実際には２つの細胞に分裂していない（Ｇ₂期）細胞。種々の治療の有効性は癌の発達段階に依存しているので、医師や腫瘍学者は、各期の細胞の百分率を決定することが患者の癌発達の予測に有用であることを見い出している。Ｓ及びＧ₂期の細胞がより多い細胞集団は細胞の有糸分裂速度がより速いので多分より重篤な悪性状態を示している。ＤＮＡの染料吸収特性は、種々の細胞タイプ又はクラスを識別するために、デバイスや開発された方法で使用されている。これによって、大規模な細胞分析で上記の各集団に含まれる細胞の百分率を計算することができる。通常の方法では、蛍光染料を使用して細胞を染色するが、染料は細胞中のＤＮＡによってだけ取り込まれる。細胞をレーザーで走査すると染料が励起されて蛍光が発生し、各細胞からこうして得られる光線量は概ね細胞のＤＮＡ含有量に比例する。サイトメーター又はフローサイトメーター（それぞれ細胞の静止スライド試料及び細胞が整列した流動細胞試料を使用する）を使用してこのような蛍光発生、光線測定及び種々のＤＮＡ含有量を有する細胞の百分率の比例的決定を実施する。フローサイトメーターの特徴は、例えば、フローサイトメトリーアンドソーティング(Flow Cytometry and Sorting)、11〜25頁（Wiley-Liss，Inc．1990年、第２版）のフローサイトメーターの特徴でハラルド B．スティーン（Harald．B. Steen）によって記載されており、そしてこの開示は参照として本明細書に組み入れる。顕微鏡に基づく静止試料サイトメーターは、ルイス A．カメントスキィ（Louis A．Kamentsky）に付与された米国特許第5,072,382及び5,107,422号に開示されており、そしてこれら特許の開示も参照として本明細書に組み入れる。典型的には、数千個の細胞をサイトメトリー試料で走査し、そしてそれらの相対的ＤＮＡ含有量を細胞ＤＮＡ含有量のヒストグラムの形態で記録し、そしてこれを癌の予測に使用する。相対的百分率の精度は癌の発達段階のより良い理解に、そして適当な治療に関する決定に関して重要である。過去においては、ヒストグラムの細胞集団の分布は標準的な統計的方法を使用して分析されてきた。このような方法ではＧ₀期とＧ₂期の各々における誤差は定数変動係数を有するガウス分布としてモデル化されている。Ｓ期は、１次若しくは２次多項式又は一連の台形として多数の異なる方法でモデル化されている。このモデルに最小２乗適合を適用して３つの実際の集団数を得る(Flow Cytometry and Sorting、第２版、415〜444頁（Wiley-Liss，INc．1990年）の「データ処理」でPhillip N．Deanが記載したようにして)。しかしながら、この統計的モデル化によって得られる値は、同一試料における細胞分布データの実際の目視検査で得られると予想される結果と矛盾するか又は顕著にかけ離れていることが見い出されている。特に、これらの先行技術の方法で決定されるＳ期モデルはしばしば過大評価されることが見い出されている。これは、診断手段として、このようにして得られたヒストグラムの価値を制限する。それ故、本発明の１つの目的は、相対的細胞集団をそれらのＤＮＡ含有量に基づいて正確に測定する方法を提供することである。本発明の更なる目的は、大規模なサイトメトリー細胞走査によって相対的細胞集団をそれらのＤＮＡ含有量に基づいて正確に測定する上記方法を提供することである。本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴並びに利点は以下の考察や図面から一層明白になろう。図面の簡単な説明図１ａ及び１ｂは、それぞれフローサイトメーター及び顕微鏡に基づくサイトメーターの図解図である。図２は、サイトメトリー測定及び分析から得られる典型的なヒストグラムを作成するためのフローチャート及びその説明であり；図３は、Ｇ₀及びＧ₂ピーク並びにＳ領域を有する典型的な初期ヒストグラムであり；図４〜１３は、Ｇ₀及びＧ₂ピーク並びにＳ領域を正確に測定するためのガウス誤差関数によるヒストグラムの段階的たたみこみ分解及び再たたみこみを表わし；図１４は、図４〜１３で測定され修正されたＧ₀及びＧ₂ピーク並びにＳ領域の組合せヒストグラムであり；図１５は、先行技術の統計的方法に従って誤差を修正した同一試料のヒストグラムであり；図１６は、隠れた異数体ピークを有するヒストグラムであり；そして図１７は、異数体及び二倍体ピークを目視的に分離している図１６のヒストグラムである。発明の要約一般的には、本発明は、正常な細胞中のＤＮＡの基線の補体から２つの細胞に分離する前のＤＮＡの２つの完全な補体を有する細胞までの範囲に亘るＤＮＡの種々の補体を有する生物学的試料、例えば血液細胞試料における細胞集団の相対的百分率をより正確に決定する方法を含んでいる。本発明の方法は：ａ）個々の細胞内のＤＮＡだけに取り込まれる蛍光染料で細胞の試験試料を染色し；ｂ）レーザーのような蛍光発生手段を使用して、細胞内に取り込まれた染料を励起させて、細胞内のＤＮＡ含有量に実質的に比例した光線を個々の細胞から発生させ；ｃ）試験試料内の細胞数に比例して発生した光線を測定しそしてこの測定された光線を前記細胞内のＤＮＡ含有量に関連させ；ｄ）種々のＤＮＡ含有量を有する前記試験試料の相対的細胞集団のヒストグラムを作成し；ｅ）種々のＤＮＡ含有量を有する各細胞集団について、蛍光測定によって決定される細胞数と特定の値（シグナル関数）のＤＮＡ含有量との関係を、この測定に固有の誤差関数に関連してモデル化し；そしてｆ）たたみこみ分解手段を用いてシグナル関数から誤差関数をたたみこみ分解し、そして種々のＤＮＡ含有量の各集団のヒストグラムを修正して、実質的にシグナル関数だけを反映させる、ステップを含んでいる。発明の詳細な説明先行技術では、分析用ヒストグラムはシグナル（実際のＤＮＡ含有量のヒストグラム）が：Ｈ（ｘ）＝∫Ｓ(ｘ')Ｅ(ｘ−ｘ')ｄｘで表わされる誤差関数によってたたみこまれるという前提で作成されそして修正されていた。上記式中、ｘは細胞中のＤＮＡ量を表わし、そしてシグナル関数Ｓは特定のＸというＤＮＡ値を有する細胞の数を表わす。先行技術の統計的方法では変数係数が最小値を見い出すことによって最適に調整されると仮定して、変数係数を有する関数Ｓ(ｘ')を仮定しそしてヒストグラムＨ(ｘ)の積分値と実験値間の差異を最小にするようにこれらの係数を計算する。しかしながら、このような仮定における誤謬は、より多くの係数を有するＳ( ｘ')の要素（例えば、２次多項式モデルのＳ期は３つの係数を有している）はより少ない係数を有するＳ(ｘ')の要素（例えば、１つの係数を有するＧ₀）より、それら要素に割り当てられる細胞が不釣り合いに多くなる傾向があるということにある。かくして、このような先行技術の分析では、Ｇ₀期とＧ₂期の細胞の少なくとも半分がＳ期に割り当てられる可能性がある。本発明によって、このような誤った細胞タイプ割当てが回避される。特定の値のＤＮＡを有する細胞の数を表わすように定義されるシグナル関数は、上記のように記載しそして表わしたように、誤差関数Ｅによるシグナル関数Ｓのたたみこみにおいて、その値の誤差関数（誤差関数は、例えば、統計的誤差、集中の問題、バックグラウンドの不正確な測定等から生じる）と相互作用させてモデル化される。本発明の方法によれば、逆高速フーリエ変換を用いて、ヒストグラムＨ(ｘ)、細胞分布Ｓ(ｘ)及び誤差関数Ｅ(△ｘ)間の関係は次のように表わされる：かくして、細胞分布Ｓ(ｘ)は、ヒストグラムの高速フーリエ変換を誤差関数の高速フーリエ変換で割った量の逆高速フーリエ変換を実施することによって、ヒストグラムＨ(ｘ)と誤差関数（Ｅ△ｘ）から誘導される。誤差関数は△ｘだけでなくｘにも依存するが、これは十分に小さいので誤差関数は関数から顕著には逸脱せず、Ｇ₀及びＧ₂ピークの測定値分布の△ｘだけに依存する。従って、変換は、Ｇ₀でのＤＮＡ値の定数変動係数（ＣＯＶ）倍に等しい標準偏差を使用して、区分的分析又はたたみこみ分解で実施される。明らかになるＧ₀ピークはヒストグラムから除く。同様に、Ｇ₂で変換を実施し、そしてそのピークはその位置で除く。この方法で得られるたたみこみ分解は最も一般的にはガウス誤差関数と仮定し、そしてその標準偏差はＧ₀ピークの主要稜の標準偏差である。本発明によれば、たたみこみ分解はシグナル関数と共にたたみこまれた任意の誤差関数に同等に適用可能であるので、これはガウス誤差関数だけに限定されるものではない。かくして、例えば、機械の固有の誤差関数は、全ての細胞がＧ₀期にある細胞試料を使用して測定することができる。次に、この誤差関数をたたみこみ分解及び再たたみこみの間ガウス誤差関数の代わりに使用する。ガウス誤差関数に係わるたたみこみ分解に関して、誤差関数は完全なガウス分布ではなく、従って、このようにして誘導されたＧ₀ピークは完全なデルタ関数ではないと理解すべきである。それ故、ヒストグラムは、高すぎるＣＯＶ推定による「環化（ringing）」（ピークの負偏差）を表わしていると思われる。従って、発見されたことは、たたみこみ分解されたヒストグラムのＧ₀部分はＧ₀ピークのどちらかの側に８％広がっており、その百分率はたたみこみ分解されたドメインにおいてはＣＯＶに関して不変であると仮定されることである。発見されたことは２つのヒストグラム：（ａ）たたみこみ分解されたドメインにおけるＧ₀期の細胞のヒストグラム（Ｇ₀期（ｘ））及び（ｂ）たたみこみ分解されたドメインにおけるＧ₀期でない細胞のヒストグラム（〜Ｇ₀期（ｘ））を作成することである。〜Ｇ₀期（ｘ）は次のようにして変換してたたみこみ分解されていないドメインに戻す：Ｈ'(ｘ)＝Ｆ^-1（Ｆ（〜Ｇ₀期（ｘ）★Ｆ（Ｅ(△ｘ)）同様な操作を適用してＧ₂期を決定する：式中、顕微鏡に基づくサイトメーターでは、Ｅ'(△ｘ)は、Ｇ₂集団がＧ₀集団の２倍のＤＮＡを有しているので、標準偏差がＥ(△ｘ)の２倍のガウス分布である。従って、定数ＣＯＶはＧ₀集団のＣＯＶの２倍であると仮定される（測定が非直線性であるフローサイトメーターでは、Ｇ₂蛍光の測定値はＧ₀の約195％であり、そしてこの百分率の差異がフローサイトメーター測定で使用される)。Ｇ₂及びＳ集団の細胞数を得るために、Ｇ₀期と同じ発見百分率を使用する。上記方法は、異数体集団（細胞の幾つかが、それら細胞ＤＮＡの誤って製造された多数のコピーを有している細胞集団）の正確な細胞数を得るために、異数体集団のヒストグラムにも適用できる。しかしながら、異数体ピークは非異数体細胞のＳ期の最上部で重なる。異数体ピークの正確な細胞数を得るために、異数体ピークからＳ期を除く。図面の詳細な説明と好ましい実施態様フローサイトメーター操作の一般的な概説では、そして上記した先行技術（フローサイトメーターの特徴）を特に参照すると、図１ａ（図１中）は、流動細胞懸濁物が光源励起ビーム、光散乱検出器及び蛍光発生集光レンズ間を通過するサイトメーターを示している。光散乱検出器と蛍光検出器は、それぞれのアウトプットを集めて蛍光及び光散乱を検出し、そして検出されたデータは適当な電子装置でヒストグラムに変換される。顕微鏡に基づくサイトメーターに関する同様な一般的概説では、そして上記した米国特許を参照すると、図１ｂ（図１中）では、可動ステージを有する顕微鏡１６を使用して細胞標本を載せたスライド２８が走査される。標本に照明を当てそして光源１２で蛍光を発生させ、センサー２０と２２は光の散乱を感知しそしてセンサー２４と２６は蛍光発生を感知し、そしてそれによって検出された光からヒストグラムを作成する。図２では、ヒストグラム配列は、図１ａ又は１ｂのようなサイトメーターから得られる細胞の集積蛍光に基づいて、フローチャートで示されるように、細胞の分析によって作成される。細胞リストの各要素は細胞の集積蛍光の記録を有している。ヒストグラム配列はメモリーに作成され、そしてそれは200のチャンネル又は配列要素で構成されている。ヒストグラム要素は０に初期設定する。ヒストグラムのチャンネルＮには、細胞の集積蛍光が目盛り★Ｎと目盛り★（Ｎ＋１）の間にある細胞リスト中の細胞の数が含まれている。リスト中にそれ以上細胞がなくなるまで細胞リストから次々に細胞を選択する。ヒストグラムにはそのチャンネル中の細胞数が含まれている。集積された蛍光を目盛りで割り、そしてそれによってチャンネルの指数を０から199に増加させるか、又は≧200の指数を得る。指数が200未満である場合、対応するチャンネル中の数に１を加える。それ以上細胞がなくなるまで上記を繰り返す。種々の要素を説明するヒストグラムの図３〜１３を参照すると、その後の段階は総ＤＮＡのヒストグラムをＧ₀、Ｓ及びＧ₂成分に分けることに係わっている：１．最初の方法で作成された初期ヒストグラムである図３のヒストグラムで開始して、大部分の細胞を有するチャンネルＡがピークチャンネルであることを決定する；２．ヒストグラムの主要稜の半極大（チャンネルＢ、ヒストグラムの左側、これはピークチャンネルの細胞数の1/2を有している）から定数変動係数（ＣＯＶ）を決定し、そしてこのＣＯＶは２つのチャンネル間の距離をピークチャンネル数で割ったものの0.85倍である；３．標準偏差がピークチャンネル数のＣＯＶ倍に等しいガウスヒストグラムを作成する。ガウスヒストグラムの各チャンネルの値は定数のｅ^-x2/σ²倍（式中ｘはチャンネル数でありそしてσは標準偏差である）である；４．細胞分布ヒストグラムの高速フーリエ変換を実施し、そしてこれをガウス分布の高速フーリエ変換（図４で示される）で割り、そして得られた量の逆高速フーリエ変換を実施して図５のたたみこみ分解ヒストグラムを得る；５．たたみこみ分解ヒストグラムをピークチャンネルより８％高いチャンネル（ピークチャンネル★1.08）で２つのヒストグラムに切断する。チャンネル０から切断チャンネルまでのヒストグラムは図６のたたみこみ分解Ｇ₀ピークであり、そして切断チャンネルからチャンネル199までのヒストグラムは図７で示されるたたみこみ分解Ｇ₂ピーク及びＳ領域である；６．たたみこみ分解Ｇ₀ピークの高速フーリエ変換にガウス分布の高速フーリエ変換を掛け、そしてその後、得られたものの逆高速フーリエ変換を実施して図８に示されるような元のヒストグラムのＧ₀部分を得る；７．標準偏差が元のガウス分布の２倍である第二のガウスヒストグラムを作成する；８．元のヒストグラムのＧ₂及びＳ部分の高速フーリエ変換を第二のガウス分布の高速フーリエ変換で割り、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を実施してたたみこみ分解Ｇ₂及びＳを得る；９．たたみこみ分解ヒストグラムを、ピークチャンネルの２倍からピークチャンネルの16％を引いたチャンネル（ピークチャンネル★1.84）で切断し、チャンネル０から切断チャンネルの間の部分はたたみこみ分解Ｓであり（図１１）、そして切断チャンネルからチャンネル199の間の部分はたたみこみ分解Ｇ₂である（図１０）；１０．たたみこみ分解Ｇ₂の高速フーリエ変換に第二のガウスの高速フーリエ変換を掛け、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を実施して元のヒストグラムのＧ₂部分を得る（図１２）；１１．たたみこみ分解Ｓの高速フーリエ変換に第二のガウス分布の高速フーリエ変換を掛け、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を実施して元のヒストグラムのＳ部分を得る（図１３）。図１４に示されるように、再たたみこみをしたＧ₀、Ｇ₂及びＳの組合せヒストグラムを有糸分裂分析のために作成する。先行技術の方法に従って作成した誤差修正ヒストグラム（図１５）は、同じ試料における分布の細胞データの実際に目視して調査して得られると思われる結果を有するヒストグラムと顕著に異なっている。これは、本発明の方法に従って作成した組合せヒストグラム（図１４）と対照的であり、そして本発明のヒストグラムは予想される実際の細胞データ分布のヒストグラムの跡を厳密にたどっている。示した例示的なヒストグラム、図１４（本発明の方法による）では、集団はＧ₀期が71.0％、Ｇ₂期が17％そしてＳ期が12％であり、そして当てはめＣＯＶは4.8％である。図１５（先行技術の統計的方法によるものであり、当てはめＣＯＶは同一である）では、集団はＧ₀期が6 0.10％、Ｇ₂期が14.5％そしてＳ期が25.3％である。予想される実際の値は、図１４の値からは僅か約３％しか乖離しておらず、先行技術の方法は特に不正確なＳ期の結果を提供している。本発明の方法は異数体集団のヒストグラムの分析にも同様に適用できる。図１６は、ＣＯＶが大きいために隠されている異数体ピークを有するヒストグラムである。先行技術の市販の統計モデルを使用しても２つのピークを見つけることができなかった。しかしながら、本発明のたたみこみ分解の方法を使用することによって（図１７のヒストグラムで描写されるように）、異数体ピーク１０は二倍体ピーク１１と明確に分離される。本発明によれば、異数体ピークのＳ期の値を得るためには、最初にＳ期は異数体ピークの範囲（±８％）で直線的であると仮定し、次に：（ａ）ヒストグラムを異数体ピークの周囲でたたみこみ分解し；（ｂ）ヒストグラムのチャンネル数を上記ピークの左16％から８％までで平均し；（ｃ）ヒストグラムのチャンネル数を上記ピークの右８％から16％までで平均し；（ｄ）次に、（ｂ）と（ｃ）で得られた数の最小をとり、そしてこれがＧ₀か又はＧ₂のどちらかに非常に近接する異数体ピークの原因である。Ｇ₀に近いピークでは、左平均にＧ₀期とＳ期の細胞が含まれている。Ｇ₂に近いピークでは、右平均にＧ₂期とＳ期の細胞が含まれている；（ｅ）次に、ステップ（ｄ）で得られた数を、ピークの左８％からピークの右８％までの全チャンネル数から差し引き；そして（ｆ）ピークの左８％から右８％までのチャンネル数を含むヒストグラムを再びたたみこんで異数体ピークを得て、次にこれを元のヒストグラムから除く。上記の説明及び図面は本発明の方法を例示するものであると理解され、そして本明細書に含まれる詳細は本発明を限定するものと解釈すべきではない。操作段階、分析装置の成分及びヒストグラムパラメーター等の変更は、以下の請求の範囲で特定される本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。請求の範囲１．生物学的細胞試料の精度の高いヒストグラムを作成する方法であって、該方法は：ａ）生物学的細胞の試験試料を、試料内の個々の細胞内のＤＮＡだけに取り込まれる蛍光染料で染色し；ｂ）蛍光発生手段を使用して細胞内に取り込まれた染料を励起させ、そしてそれによって、細胞内のＤＮＡ含有量に実質的に比例して個々の細胞から光線を発生させ；ｃ）試験試料内の細胞数に比例して発生した光線を測定し、そして測定された光線を前記細胞内のＤＮＡ含有量に関連させ；ｄ）種々のＤＮＡ含有量を有する前記試験試料の相対的細胞集団のヒストグラムを作成し；ｅ）種々のＤＮＡ含有量を有する細胞集団の各々について、蛍光測定によって決定される細胞数と特定の値のＤＮＡ含有量との関係を、前記測定に固有の誤差関数に関連したシグナル関数としてモデル化し；そしてｆ）たたみこみ分解手段を用いて前記誤差関数を前記シグナル関数からたたみこみ分解し、そして種々のＤＮＡ含有量の各集団のヒストグラムを修正して実質的にシグナル関数だけを反映させる、ステップを含む方法。２．上記たたみこみ分解手段が前記ヒストグラムを：Ｈ(ｘ)＝∫Ｓ(ｘ')Ｅ(ｘ−ｘ')ｄｘ（式中、ｘは細胞中のＤＮＡの量を表わし、シグナル関数Ｓは特定のｘのＤＮＡ値を有する細胞数を表わし、そしてＥは誤差関数を表わす）として表わし；そして前記シグナル関数が：（式中、細胞分布Ｓ(ｘ)は、ヒストグラムの高速フーリエ変換を誤差関数の高速フーリエ変換で割った量の逆高速フーリエ変換を実施することによって、ヒストグラムＨ(ｘ)及び誤差関数（Ｅ△ｘ）から誘導される）で表わされるヒストグラムＨ(ｘ)、細胞分布Ｓ(ｘ)及び誤差関数Ｅ(△ｘ)間の関係を用いて高速フーリエ変換によって誤差関数からたたみこみ分解される、請求項１に記載の方法。３．前記試料が：ａ）分裂期でなく（Ｇ₀期）そしてＤＮＡの基線の補体を有している正常な細胞；ｂ）前記基線値を超える少量の種々の追加的ＤＮＡを有するＤＮＡ複製期（Ｓ期）の細胞；及びｃ）ＤＮＡの２つの完全な補体を有しているが実際には２つの細胞に分裂していない（Ｇ₂期）細胞、を含む細胞集団を含んでおり、そして前記ヒストグラムが細胞のＤＮＡ含有量に基づく相対的細胞集団の測定を含んでいる、請求項２に記載の方法。４．前記変換が、Ｇ₀でのＤＮＡ値を定数変動係数（ＣＯＶ）倍したものに等しい標準偏差を使用して、区分的たたみこみ分解で実施され、明白になるＧ₀ピークがヒストグラムから除かれ、そして変換がＧ₂で実施されて明らかになるＧ₂ ピークがヒストグラムから除かれる、請求項３に記載の方法。５．２つのヒストグラム（第一のヒストグラムはたたみこみ分解ドメインでＧ₀ 期の細胞（Ｇ₀期(ｘ)）を含んでおりそして第二のヒストグラムはたたみこみ分解ドメインでＧ₀期でない細胞（〜Ｇ₀期(ｘ)）を含んでいる）を作成するために第一の発見されたものが選択され、そして〜Ｇ₀期(ｘ)が：Ｈ'(ｘ)＝Ｆ^-1（Ｆ（〜Ｇ₀期(ｘ)）★Ｆ（Ｅ(△ｘ)）のようにして変換されてたたみこみ分解されていないドメインに戻され、そしてＧ₂期が：（式中、Ｅ'(△ｘ)は、標準偏差がＥ(△ｘ)の２倍のガウス分布である）と決定され、そして定数ＣＯＶはＧ₀集団の２倍であると仮定される、請求項４に記載の方法。６．たたみこみ分解されたヒストグラムのＧ₀部分がＧ₀ピークのどちらかの側に８％広がっていると発見的に仮定される、請求項５に記載の方法。７．細胞試料が更に細胞の幾つかがＤＮＡの幾つかの誤って製造された複数のコピーを有する異数体集団を含んでおり、そして異数体ピークが非異数体細胞のＳ期の最上部で重なっており、そして異数体ピークの正しい細胞数を得るためにＳ期が異数体ピークから除かれる、請求項３に記載の方法。８．ａ．０〜199のチャンネルを有するヒストグラムを、生物学的細胞試料のサイトメトリー測定から作成し、そして大部分の細胞を含有しピークチャンネルになるチャンネルを決定し；ｂ．ヒストグラムの主要稜の半極大から定数変動係数（ＣＯＶ）を決定し、そしてＣＯＶは、ピークチャンネル数で割った２つのチャンネル間の距離の0.85倍であり；ｃ．ピークチャンネル数のＣＯＶ倍と等しい標準偏差を有するガウスヒストグラムを作成し、ガウスヒストグラムの各チャンネルの値は定数のｅ^-x2/σ²倍（式中、ｘはチャンネル数であり、σは標準偏差である）であり；ｄ．細胞分布ヒストグラムの高速フーリエ変換を行い、そしてこれをガウスヒストグラムの高速フーリエ変換で割り、そして得られた量の逆高速フーリエ変換を実施してたたみこみ分解ヒストグラムを得て；ｅ．たたみこみ分解ヒストグラムを、ピークチャンネルより８％高いチャンネル（ピークチャンネル★1.08）で２つのヒストグラムに切断し、そしてチャンネル０から切断チャンネルまでのヒストグラムはたたみこみ分解Ｇ₀ピークであり、そして切断チャンネルからチャンネル199までのヒストグラムはたたみこみ分解Ｇ₂ピーク及びＳ領域であり；ｆ．たたみこみ分解Ｇ₀ピークの高速フーリエ変換に、ガウスヒストグラムの高速フーリエ変換を掛け、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を行って元のヒストグラムのＧ₀部分を得て；ｇ．標準偏差が元のガウスヒストグラムの２倍である第二のガウスヒストグラムを作成し；ｈ．元のヒストグラムのＧ₂及びＳ部分の高速フーリエ変換を第二のガウスヒストグラムの高速フーリエ変換で割り、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を実施してたたみこみ分解Ｇ₂及びＳを得て；ｉ．ピークチャンネルの２倍からピークチャンネルの16％を引いたチャンネル（ピークチャンネル★1.84）でたたみこみ分解ヒストグラムを切断し、チャンネル０から切断チャンネルの間の部分はたたみこみ分解Ｓであり、そして切断チャンネルからチャンネル199の間の部分はたたみこみ分解Ｇ₂であり；ｊ．たたみこみ分解Ｇ₂の高速フーリエ変換に、第二のガウスヒストグラムの高速フーリエ変換を掛け、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を行って元のヒストグラムのＧ₂部分を得て；ｋ．たたみこみ分解Ｓの高速フーリエ変換に第二のガウスヒストグラムの高速フーリエ変換を掛け、そして得られたものの逆高速フーリエ変換を実施して元のヒストグラムのＳ部分を得て；ｌ．再たたみこみをしたＧ₀、Ｇ₂及びＳのヒストグラムを組み合わせる、ステップを含む、請求項３に記載の方法。９．前記異数体ピークを決定し、そしてヒストグラムのＳ期から分離させて異数体ピークのＳ期の値を得る請求項７に記載の方法であって、その際、Ｓ期は± ８％に広がる異数体ピーク範囲で直線的であると最初に仮定し、そして該方法は：（ａ）異数体ピークの周囲のヒストグラムをたたみこみ分解し；（ｂ）異数体ピークの左16％から８％までのヒストグラムのチャンネル数を平均し；（ｃ）異数体ピークの右８％から16％までのヒストグラムのチャンネル数を平均し；（ｄ）Ｇ₀か又はＧ₂のどちらかに非常に近接している異数体ピークの原因である（ｂ）と（ｃ）で得られた数の最小をとり、Ｇ₀に近い異数体ピークでは、左平均にＧ₀及びＳ期の細胞が含まれ、Ｇ₂に近い異数体ピークでは、右平均にＧ₂ 及びＳ期の細胞が含まれ；（ｅ）異数体ピークの左８％から異数体ピークの右８％までの全チャンネル数からステップ（ｄ）で得られた数を差し引き；そして、（ｆ）異数体ピークの左８％から右８％までのチャンネル数を含んでいるヒストグラムを、再たたみこみを実施して修正した異数体ピークを得て、元のヒストグラムから修正異数体ピークを除いて異数体ピークのＳ期の値を取得する、ステップを含む方法。【図２】【図１４】【図１５】【図１６】【図１７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．改善された正確度をもって生物細胞のサンプルのヒストグラムを作成する方法であって、次のステップを含む方法：ａ）生物細胞の試験サンプル中の個々の細胞に含まれるＤＮＡにのみ吸収される螢光染料で前記サンプルを着色するステップ；ｂ）前記細胞中に吸収された染料を励起するための螢光手段を用いて、前記細胞中のＤＮＡ含有量に比例して個々の細胞を発光させるステップ；ｃ）前記試験サンプル中の細胞の数に対応した光を測定し、測定した光を前記細胞に含まれるＤＮＡ含有量に関係づけるステップ；ｄ）異なるＤＮＡ含有量を有する前記試験サンプルの相対細胞群のヒストグラムを作成するステップ；ｅ）異なるＤＮＡ含有量を有するそれぞれの細胞群のために、前記螢光測定に固有のエラー関数に関連した信号関数として、螢光測定によって把握した特定の値のＤＮＡ含有量を有する細胞の数の関係のモデルをつくるステップ；およびｆ）脱畳み込み手段によって信号関数からエラー関数を除き、信号関数のみを反映した異なるＤＮＡ含有量のそれぞれにおいて前記ヒストグラムを訂正するステップ。