WO2023153016A1

WO2023153016A1 - 信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システム

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Publication number: WO2023153016A1
Application number: PCT/JP2022/037165
Authority: WO
Inventors: 健太辻井; 昌人浅井; 孝嗣武宮; 嘉晃山内
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2022-02-09
Filing date: 2022-10-04
Publication date: 2023-08-17
Also published as: WO2023153316A1

Abstract

データ処理装置１２は、フローサイトメータシステム１を構成する光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、プロセッサは、フローサイトメータシステム１を用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を基にした光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの強度信号を取得し、強度信号のデジタル値ＤＮを、光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄのゲインＧ及び信号光の量子効率Ｑ_Ｓで除算することにより、光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに入射する信号光の仮想ホトン数Ｓを計算し、信号光の仮想ホトン数Ｓを基にデータ解析を実行するように構成されている。

Description

信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システム

　実施形態の一側面は、信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システムに関する。

　従来から、細胞等の試料を対象にレーザ光を利用して計数、選別、及び特性解析する技術としてフローサイトメトリーが知られている。例えば、下記特許文献１には、光源に対して軸方向に配置され、前方散乱成分を感知する第１のセンサと、第１のセンサに対してある角度に置かれ、側方散乱成分及び／又は蛍光成分を感知する第２のセンサとを具備するフローサイトメトリーシステムが開示されている。

特表２０１３－５０４０５１号公報

　上述したような従来の装置においては、センサの検出特性のばらつきによってセンサからの出力信号に変動が生じる場合がある。センサの出力信号の変動を抑えるためにセンサにおける供給電圧等の設定パラメータを調整することもできるが、この場合は、調整の度合いによって同一の入射強度の光が異なる出力信号の値として検出される。その結果、調整の度合いによって異なる分析結果が生じる場合があった。

　そこで、実施形態の一側面は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、フローサイトメトリーによる分析結果のばらつきを低減することが可能な信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システムを提供することを課題とする。

　実施形態の第一の側面に係る信号処理方法は、フローサイトメータを構成する光電子増倍管の出力を処理する信号処理方法であって、フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を基にした光電子増倍管の出力電流信号を第１電流信号として取得し、第１電流信号の値を、光電子増倍管のゲインで除算することにより、光電子増倍管に入射する信号光の光子数あるいは光電子増倍管の光電変換部から放出される光電子数のいずれかである解析評価値を計算し、解析評価値を基にデータ解析を実行する。

　あるいは、実施形態の第二の側面に係る信号処理装置は、フローサイトメータを構成する光電子増倍管の出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、プロセッサは、フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を基にした光電子増倍管の出力電流信号を第１電流信号として取得し、第１電流信号の値を、光電子増倍管のゲインで除算することにより、光電子増倍管に入射する信号光の光子数あるいは光電子増倍管の光電変換部から放出される光電子数のいずれかである解析評価値を計算し、解析評価値を基にデータ解析を実行するように構成されている。

　あるいは、実施形態の第三の側面に係る信号処理システムは、上述した信号処理装置と、光電子増倍管と、信号光を光電子増倍管に導く光学系と、を備える。

　上記第一の側面、上記第二の側面、あるいは上記第三の側面によれば、フローサイトメータを用いて生じた信号光が光電子増倍管によって検出されて第１電流信号が取得され、その第１電流信号の値から、光電子増倍管に入射する信号光の光子数あるいは光電子増倍管の光電変換部から放出される光電子数である解析評価値が計算され、計算された解析評価値を基にデータ解析が実行される。その結果、定量的に信号光を解析することができ、フローサイトメトリーによる分析結果のばらつきを低減することができる。

　本開示のいずれかの側面によれば、フローサイトメトリーによる分析結果のばらつきを低減することができる。

実施形態にかかるフローサイトメータであるフローサイトメータシステム１の概略構成図である。図１のデータ処理装置１２のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。データ処理装置１２の機能構成を示すブロック図である。図３の解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。図３の解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。実施形態に係る信号処理方法の手順を示すフローチャートである。実施形態に係る信号処理方法の手順を示すフローチャートである。従来のフローサイトメトリーによるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。従来のフローサイトメトリーによるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。

　以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。

　図１は、実施形態にかかるフローサイトメータ（信号処理システム）であるフローサイトメータシステム１の概略構成図である。フローサイトメータシステム１は、フローサイトメトリーを実施するためのシステムであり、流体システム２、光学システム（光学系）３、及び電子システム（信号処理装置）４によって構成される。

　流体システム２は、細胞あるいは粒子等の分析対象物を含むサンプル流体が注入され、サンプル流体に含まれる分析対象物を細いチャネル５内に整列させて通過させることが可能なフローセル６を含んで構成される。このフローセル６には、ゲーティングされた分析対象物を電場制御等によってソーティング（分類および振り分け）する機能（図示せず）も設けられている。

　光学システム３は、フローセル６内を通過する分析対象物をフローサイトメトリーにより光学的に分析するシステムである。この光学システム３は、レーザ光源７、レンズ８、フィルタ９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ、ダイクロイックミラー１０ｂ，１０ｃ、光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄを含んで構成され、フローサイトメトリーによって分析対象物から発生した各種の光を光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに導光する。レーザ光源７は特定周波数で単一波長帯のレーザ光（励起光）を生成する光源装置であり、レンズ８はレーザ光源７から出射されたレーザ光をフローセル６内のチャネル５に集光する。フィルタ９ａは、レーザ光の照射によってサンプル流体から生じた前方散乱光を透過させる。ダイクロイックミラー１０ｂは、レーザ光の照射によってサンプル流体から生じた側方散乱光を反射し、サンプル流体から生じた蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー１０ｃは、ダイクロイックミラー１０ｂを透過した蛍光のうちの第一の波長帯の蛍光を反射し、透過した蛍光のうちの残余の波長帯の蛍光を透過させる。フィルタ９ｂは、ダイクロイックミラー１０ｂによって反射された側方散乱光を透過させ、フィルタ９ｃは、ダイクロイックミラー１０ｃによって反射された第一の波長帯の第一の蛍光を透過させる。フィルタ９ｄは、ダイクロイックミラー１０ｃを透過した蛍光のうち第二の波長帯の第二の蛍光を透過させる。光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄは、それぞれ、前方散乱光、側方散乱光、第一の蛍光、及び第二の蛍光の光軸上に設けられ、前方散乱光、側方散乱光、第一の蛍光、及び第二の蛍光のそれぞれの強度を測定する。

　電子システム４は、データ処理装置１２を含んで構成され、光学システム３によって測定された光の強度を解析するための装置である。具体的には、データ処理装置１２は、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに電気的に接続され、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの各チャネルで検出された強度を示す強度信号を基にヒストグラムあるいはドットプロット（サイトグラムともいう。）等を作成するデータ解析を実行するとともにゲーティング処理を実行する。また、データ処理装置１２は、ゲーティング処理を基に、サンプル流体に含まれる分析対象物を対象にソーティング（分類および振り分け）を実行する。

　次に、図２および図３を参照して、データ処理装置１２の構成を説明する。図２は、データ処理装置１２のハードウェア構成の一例を示すブロック図であり、図３は、データ処理装置１２の機能構成を示すブロック図である。

　図２に示すように、データ処理装置１２は、物理的には、プロセッサであるＣＰＵ（Central　Processing　Unit）１０１、記録媒体であるＲＡＭ（Random　Access　Memory）１０２又はＲＯＭ（Read　Only　Memory）１０３、通信モジュール１０４、及び入出力モジュール１０６等を含んだコンピュータ等であり、各々は電気的に接続されている。なお、データ処理装置１２は、入出力デバイスとして、ディスプレイ、キーボード、マウス、タッチパネルディスプレイ等を含んでいてもよいし、ハードディスクドライブ、半導体メモリ等のデータ記録装置を含んでいてもよい。また、データ処理装置１２は、複数のコンピュータによって構成されていてもよい。

　図３に示すように、データ処理装置１２は、機能的な構成要素として、信号取得部２０１、計算部２０２、及び解析部２０３を備えている。図３に示すデータ処理装置１２の各機能部は、ＣＰＵ１０１及びＲＡＭ１０２等のハードウェア上にプログラムを読み込ませることにより、ＣＰＵ１０１の制御のもとで、通信モジュール１０４、及び入出力モジュール１０６等を動作させるとともに、ＲＡＭ１０２におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。データ処理装置１２のＣＰＵ１０１は、プログラムを実行することによって図３の各機能部を機能させ、後述する信号処理方法に対応する処理を順次実行する。なお、ＣＰＵ１０１は、単体のハードウェアでもよく、ソフトプロセッサのようにＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に実装されたものでもよい。ＲＡＭやＲＯＭについても単体のハードウェアでもよく、ＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に内蔵されたものでもよい。プログラムの実行に必要な各種データ、及び、プログラムの実行によって生成された各種データは、全て、ＲＯＭ１０３、ＲＡＭ１０２等の内蔵メモリ、又は、ハードディスクドライブなどの記録媒体に格納される。以下、データ処理装置１２の機能的な構成要素の機能について詳細に説明する。

　信号取得部２０１は、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの各チャネルから出力された強度信号（出力電流信号）を取得する。取得する強度信号は、それぞれの光電子増倍管において、フローサイトメトリーによって生じた前方散乱光、側方散乱光、あるいは、蛍光等の信号光に強度に応じた増倍電子による電流を検出することによって得られたアナログ信号である。信号取得部２０１は、取得した各チャネルの強度信号をデジタル値ＤＮに変換して計算部２０２に出力する。なお、信号取得部２０１のＡ／Ｄ変換の機能は、データ処理装置１２の外付けの回路部によって実現されてもよい。

　計算部２０２は、信号取得部２０１から出力された各チャネルのデジタル値ＤＮを、各チャネルに入射した現実の光子（ホトン）の数に準じた指標（解析評価値）である仮想ホトン数（光子数）へ変換する計算を実行する。ここで、計算部２０２による計算機能の説明に先立って、本願の発明者らにより検討された信号光の強度及びノイズの理論モデルについて説明する。

　検討された理論モデルによれば、強度信号の平均値Ａ_Ｓ［ＤＮ：デジタルナンバー］及び強度信号のノイズσ_ｔｈｉｓ（標準偏差）［ＤＮ　ｒｍｓ］は、下記式（１）及び下記式（２）によって表される。

　ここで、上記式におけるパラメータのうち、主に期待値に関わるものは大文字のアルファベットで表わされ、主にノイズに関わるものは小文字のギリシャ文字で表わされている。σ_Ｃは、フローサイトメータシステム１内で各チャネルの光電子増倍管の出力からデータ処理装置１２の信号取得部２０１までの間において、強度信号を伝達してデジタル値に変換するまでの機能を担う回路（以下、単に「Ａ／Ｄ変換用回路」という。）が発生するノイズ［ＤＮ　ｒｍｓ］を示し、Ｃは、Ａ／Ｄ変換用回路における光電子増倍管によって出力された電子数に対するデジタル値ＤＮの変換係数［ＤＮ／ｅ］を示し、Ｆは、増倍機構を有する光電子増倍管が持つ増倍揺らぎの程度を示す指数（過剰雑音係数）であり、Ｇは、光電子増倍管の持つ増倍率（ゲイン）、すなわち、入力電子数に対する出力電子数の比率［ｅ／ｅ］であり、Ｄは、光電子増倍管が持つ暗電流の有効電子数期待値［ｅ］である。有効値とは、光電子増倍管の出力する強度信号から統計計算上において無視できる成分を除いて算出された値を意味する（以下同様）。また、Ｑ_Ｂは、光電子増倍管に入射している背景光の波長スペクトルに応じた、光電子増倍管の光子から電子への変換効率（背景光の量子効率）［ｅ／ｐｈｏｔｏｎ］を示し、Ｂは、光電子増倍管に入射している背景光の入射光量における仮想ホトン数に準じた指標の期待値（背景光の仮想ホトン数期待値）［ｐｈｏｔｏｎ］を示す。「仮想ホトン数」とは、現実の光子数を定量性を保って相対的に示した値を意味する（以下同様）。また、Ｑ_Ｓは、光電子増倍管に入射している信号光の波長スペクトルに応じた、光電子増倍管の光子から電子への変換効率（信号光の量子効率）［ｅ／ｐｈｏｔｏｎ］を示し、Ｓは、光電子増倍管に入射している信号光の入射光量における光子数に準じた指標の期待値（信号光の仮想ホトン数期待値）［ｐｈｏｔｏｎ］を示し、ρは、レーザ光源７あるいはサンプル流体等を起因とした、光電子増倍管への入射よりも前に発生した信号光のばらつき度合いを、信号光量期待値に対する比率によって示した値（光源及びサンプル側のばらつき率）であり、Ａ_０は、Ａ／Ｄ変換用回路が持つ固有のオフセットを示す値（オフセット）［ＤＮ］である。

　なお、上記式（１），（２）において、Ｑ_Ｂ＊Ｂは、光電子増倍管に入射している背景光の有効光電子数［ｅ］を示し、Ｑ_Ｓ＊Ｓは、光電子増倍管に入射している信号光の有効光電子数［ｅ］を示している。これらの値は、上記式（１），（２）において、暗電流の有効電子数期待値Ｄと並んで、これらが検討された理論モデルにおける基軸物理量として扱われている。ここでいう有効光電子数とは、光電子増倍管において入射する光に応じて光電変換部から放出される光電子の数から、統計計算上において無視できる成分を除いて算出された値を意味する（以下同様）。

　光源及びサンプル側のばらつき率ρの値の変化の要因としては、主に、フローサイトメータシステム１のフローセル６内のチャネル５を流れる細胞等の分析対象物へのレーザ光の当たり方によるばらつきと、分析対象物毎に発生するばらつきとが存在する。レーザ光の当たり方によるばらつきには、レーザ光のチャネル５への当たり方のばらつきと、チャネル５内を流れる分析対象物の空間的なばらつきとが含まれる。また、分析対象物毎のばらつきには、分析対象物の大きさのばらつきと、分析対象物内に存在する測定対象となる分子あるいは分子構造の含有率のばらつきとが含まれる。ばらつき率ρに実質的に影響する要因は、レーザ光源７そのものにおける経時的な光量のばらつき、レーザ光のチャネル５への当たり方によるばらつき、チャネル５内の流速の経時的なばらつき、チャネル５内の分析対象物の空間的なばらつき、分析対象物の大きさのばらつき、分析対象物内に存在する分子あるいは分子構造の含有率のばらつき、分析対象物内に存在する分子あるいは分子構造の空間的なばらつき、分子あるいは分子構造物と染色蛍光との結合率のばらつき、染色蛍光の発光効率のばらつき、チャネル５を流れる分析対象物以外の異物によるばらつき、等が挙げられる。

　上記式（２）において、平方根内の第１項及び第２項は、信号光の仮想ホトン数期待値であるパラメータＳに依存せず、Ａ／Ｄ変換用回路のノイズを含む回路ノイズあるいは背景光と暗電流とによって主に変化する項であり、平方根内の第３項は、パラメータＳの平方根Ｓ^１／２に依存して、光子から電子への変換過程で発生するノイズ（ショットノイズ）によって主に変化する項であり、平方根内の第４項は、パラメータＳに依存して、光源及びサンプル側のばらつきによって主に変化する項である。この式から、信号光の強度が比較的低い場合では、第１項から第３項までの影響を考慮すれば強度信号のノイズの傾向が評価できるが、信号光の強度が高い場合には、第４項の影響も加味しなければ強度信号のノイズの傾向が評価できないことが明らかにされた。

　上記のチャネル毎のパラメータのうち既知である変換係数Ｃ、ゲインＧ、及び信号光の量子効率Ｑ_Ｓは、ユーザによりデータ処理装置１２に入力され、予めＲＡＭ１０２等の内部の記録媒体に記憶される。計算部２０２は、各チャネルに関して記憶されているパラメータを利用して次のようにして各チャネルで検出された信号光に対応する仮想ホトン数を計算する。

　すなわち、計算部２０２は、フローサイトメトリーによる検出を停止させ、光電子増倍管への信号光の入射がない状態で光電子増倍管から出力された強度信号（出力電流信号）のデジタル値ＤＮを複数イベント分取得し、デジタル値ＤＮの平均値（第１平均値）Ａ_Ｓ＝０及び標準偏差（第２ノイズ値）σ_Ｓ＝０を計算および取得する。計算された平均値Ａ_Ｓ＝０及び標準偏差σ_Ｓ＝０は、式（１）及び式（２）の理論式を適用すれば、下記式（３）及び下記式（４）に示すような値に近似する。

そして、計算部２０２は、計算したパラメータＡ_Ｓ＝０，σ_Ｓ＝０を内部の記録媒体に記憶させる。

　加えて、計算部２０２は、レーザ光の強度を所定強度に変更する、適当な発光光量となるビーズあるいは染色蛍光体を使う、または、フローサイトメータ側に校正用光源を搭載する、等の方法により、信号光の強度が十分に大きい状態で測定対象のサンプル流体を対象にフローサイトメトリーによる検出を開始させ、光電子増倍管から出力された強度信号（出力電流信号）のデジタル値ＤＮを複数イベント分取得し、デジタル値ＤＮの平均値（第２平均値）Ａ_Ｓ≫Ｈ及び標準偏差（第３ノイズ値）σ_Ｓ≫Ｈを計算および取得する。上記レーザ光の強度、ビーズ、染色蛍光体、または、校正用光源は、分析対象物が発光する光量の上限値、または、信号処理回路の入力上限電圧等に応じて決定される。計算された標準偏差σ_Ｓ≫Ｈ及び平均値Ａ_Ｓ≫Ｈは、式（１）及び式（２）の理論式を適用すれば、下記式（５）及び下記式（６）に示すような値に近似する。従って、計算部２０２は、平均値Ａ_Ｓ≫Ｈ及び標準偏差σ_Ｓ≫Ｈを基に、下記式（７）を用いて、ばらつき率ρを計算することができる。

そして、計算部２０２は、計算したパラメータρを、内部の記録媒体に記憶させる。

　加えて、計算部２０２は、レーザ光の強度を２種類に変更する、改めて適当な発光光量となる２種類のビーズや染色蛍光体を使う、フローサイトメータ側へ２種類の光量を発する校正用光源を搭載する、または、十分に光量の大きい状態に対してＮＤフィルタを用い減光する等によって、信号光の強度を高低の２種類に変更した状態のそれぞれにおいて、測定対象のサンプル流体を対象にフローサイトメトリーによる検出を開始させ、それぞれの状態で光電子増倍管から出力された強度信号（出力電流信号）のデジタル値ＤＮを複数イベント分取得する。さらに、計算部２０２は、光電子増倍管への入射光量が高い場合のデジタル値ＤＮの平均値Ａ_Ｈ及び標準偏差σ_Ｈと、光電子増倍管への入射光量が低い場合のデジタル値ＤＮの平均値Ａ_Ｌ及び標準偏差σ_Ｌを、計算および取得する。また、計算部２０２は、平均値Ａ_Ｈ，Ａ_Ｌ、標準偏差σ_Ｈ，σ_Ｌ、及び平均値Ａ_Ｓ＝０を基に、下記式（８）を用いて、過剰雑音係数Ｆを計算する。

そして、計算部２０２は、計算したパラメータＦを、内部の記録媒体に記憶させる。

　上記のようにして記憶したチャネル毎のパラメータを参照して、計算部２０２は、レーザ光の強度を測定に適した所定値に設定した状態で測定対象のサンプル流体のフローサイトメトリーによる検出を開始させ、各チャネルの光電子増倍管から出力された強度信号（第１電流信号）のデジタル値ＤＮを取得する。さらに、計算部２０２は、記憶した各チャネルのパラメータを参照し、下記式（９）を計算することにより、デジタル値ＤＮの示す強度信号の平均値Ａ_Ｓから仮想ホトン数Ｓを導出する。

すなわち、計算部２０２は、強度信号の平均値Ａ_Ｓから平均値Ａ_Ｓ＝０を減算し、減算した値を、変換係数Ｃ、ゲインＧ、及び信号光の量子効率Ｑ_Ｓによって除算することにより、光電子増倍管に入射する信号光の仮想ホトン数Ｓを計算する。

　加えて、計算部２０２は、上記のようにして計算した仮想ホトン数Ｓと、記憶した各チャネルのパラメータを参照することにより、デジタル値ＤＮの示す強度信号の標準偏差（第１ノイズ値）σ_ｔｈｉｓを導出する。詳細には、計算部２０２は、下記式（１０）を利用して、標準偏差σ_Ｓ＝０を二乗した値に、変換係数Ｃ、ゲインＧ、信号光の量子効率Ｑ_Ｓ、ばらつき率ρ、過剰雑音係数Ｆ、及び仮想ホトン数Ｓによって計算した値を加算し、加算した値の平方根を求めることにより、標準偏差（第１ノイズ値）σ_ｔｈｉｓを計算する。その後、計算部２０２は、この標準偏差σ_ｔｈｉｓを、変換係数Ｃ、ゲインＧ、及び信号光の量子効率Ｑ_Ｓで除算することにより、標準偏差σ_ｔｈｉｓ［ＤＮ　ｒｍｓ］を仮想ホトン数に換算した標準偏差σ_ｔｈｉｓ［ｐｈｏｔｏｎ　ｒｍｓ］に変換することができる。

　解析部２０３は、計算部２０２によって計算されたチャネル毎の仮想ホトン数Ｓ及びチャネル毎の標準偏差σ_ｔｈｉｓのデータを基に、データ解析を実行する。具体的には、複数のチャネルの仮想ホトン数Ｓを基にヒストグラム及びドットプロットを生成し、それらを入出力デバイスに出力する。また、解析部２０３は、生成したドットプロットを対象にゲーティング処理を行い、異なる分析対象物の集団の境界を画定する。さらに、解析部２０３は、流体システム２を制御することにより、分析対象物の集団の境界を基に、集団を分類及び振り分けするソーティング処理を実行させることもできる。

　図４及び図５は、解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。図４には、抗体Ａに対応する蛍光チャネルの仮想ホトン数と抗体Ｂに対応する蛍光チャネルの仮想ホトン数との関係をプロットしたドットプロットが示され、ゲーティング処理によって画定された境界が実線で示されている。このように、ゲーティング処理により検出対象の全体の分析対象物中の集団の割合が計算及び出力され、抗体Ａ及び抗体Ｂの両方が陰性の集団の割合“３６．６％”、抗体Ｂのみが陽性の集団の割合“３４．７％”、抗体Ａのみが陽性の集団の割合“２７．７％”、抗体Ａ，Ｂの両方が陽性の割合“１．０５％”と出力される。図５には、蛍光色素Ｃｙ５を用いた蛍光チャネルの仮想ホトン数と蛍光色素ＴＲを用いた蛍光チャネルの仮想ホトン数との関係をプロットしたドットプロットが示されている。このように、ゲーティング処理によって集団の境界を画定する際には、集団の仮想ホトン数の平均値Ｓを中心とした、その平均値Ｓに対応する標準偏差σ_ｔｈｉｓで決定されるゲート区間の範囲Ｗの境界を自動で画定することができる。標準偏差σ_ｔｈｉｓで決定される範囲Ｗは、例えば、仮想ホトン数がＳ±３×σ_ｔｈｉｓの範囲に設定される。

　次に、図６及び図７を参照して、フローサイトメータシステム１を用いた光電子増倍管の出力信号の処理方法の手順を説明する。図６には、フローサイトメータシステム１によるチャネル毎のパラメータの事前準備の処理を示し、図７には、サンプル流体を対象としたフローサイトメトリーによる分析処理を示す。

　まず、図６を参照して、ユーザによって、チャネル毎のパラメータのうち既知である変換係数Ｃ、ゲインＧ、及び信号光の量子効率Ｑ_Ｓがデータ処理装置１２に入力される（ステップＳ１０１）。その後、フローサイトメータシステム１において各チャネルに信号光が入射しない状態で、データ処理装置１２によって各チャネルのデジタル値ＤＮのデータが複数イベント分取得される（ステップＳ１０２）。そうすると、データ処理装置１２において、各チャネルのパラメータＡ_Ｓ＝０，σ_Ｓ＝０が取得及び保存される（ステップＳ１０３）。

　次に、フローサイトメータシステム１においてレーザ光を所定強度に変更する、適当な発光光量となるビーズあるいは染色蛍光体を使う、または、フローサイトメータ側に校正用光源を搭載する、等の方法により、信号光の強度が十分に大きい状態で、データ処理装置１２によって、測定対象のサンプル流体を対象に信号光を検出することにより、各チャネルのデジタル値ＤＮのデータが複数イベント分取得される（ステップＳ１０４）。そうすると、データ処理装置１２において、各チャネルのパラメータρが取得及び保存される（ステップＳ１０５）。

　さらに、フローサイトメータシステム１においてレーザ光の強度を２種類に変更する、適当な発光光量となる２種類のビーズ又は蛍光色素を用いる、２種類の光量の校正用光源を用いる、あるいは、十分に明るい状態から２種類のＮＤフィルタを用いる、等を行い、信号光の強度を高低の２種類に変更した状態で、データ処理装置１２において、測定対象のサンプル流体を対象に信号光が検出されることにより、各チャネルのデジタル値ＤＮのデータが複数イベント分取得される（ステップＳ１０６）。そうすると、データ処理装置１２において、各チャネルのパラメータＦが取得及び保存される（ステップＳ１０７）。以上により、事前準備処理が完了される。

　図７を参照して、フローサイトメータシステム１においてレーザ光の強度を測定に適した所定値に設定した状態で測定対象のサンプル流体のフローサイトメトリーによる検出が開始され、それに応じて、データ処理装置１２によって、各チャネルのデジタル値ＤＮのデータが取得される（ステップＳ２０１）。次に、データ処理装置１２において、各チャネルのデジタル値ＤＮを用いて、各チャネルのヒストグラム、及びドットプロットが生成される（ステップＳ２０２）。その際には、データ処理装置１２によって、記憶した各チャネルのパラメータＡ_Ｓ＝０，σ_Ｓ＝０，ρ，Ｆが参照され、各チャネルのデジタル値ＤＮが仮想ホトン数Ｓに変換されるとともに仮想ホトン数Ｓに対応する標準偏差σ_ｔｈｉｓが計算される（ステップＳ２０３）。

　その後、データ処理装置１２によって、生成したヒストグラム及びドットプロットに対して、計算した仮想ホトン数Ｓ及び標準偏差σ_ｔｈｉｓを用いたゲーティング処理が施される（ステップＳ２０４）。そして、データ処理装置１２によって、ゲーティング処理の結果に基づいて、ヒストグラム及びドットプロットに示されるデータ中の分析対象物の集団（ターゲット集団）の分類分けが行われる（ステップＳ２０５）。

　次に、データ処理装置１２においてソーティングが実行されるように設定されている場合（ステップＳ２０６；Ｙｅｓ）には、データ処理装置１２によって、分類分けされたターゲット集団に対してソーティングが行われるように制御される（Ｓ２０７）。一方、データ処理装置１２においてソーティングが実行されないように設定されている場合（ステップＳ２０６；Ｎｏ）には、データ処理装置１２によって、分類分けされたターゲット集団に対して全体に対する割合の計算等のデータ解析処理が行われる（Ｓ２０８）。

　以上説明した実施形態に係るフローサイトメータシステム１の作用効果について説明する。

　本実施形態に係るフローサイトメータシステム１においては、各チャネルにおいて生じた信号光が光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄによって検出されて強度信号が取得され、その強度信号のデジタル値ＤＮから光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに入射する信号光の仮想ホトン数Ｓが計算され、計算された信号光の仮想ホトン数Ｓを基にデータ解析が実行される。その結果、定量的に信号光を解析することができ、フローサイトメトリーによる分析結果のばらつきを低減することができる。特に、本実施形態では、解析評価値として仮想ホトン数が用いられているので、異なる装置間でのフローサイトメトリーによる分析結果のばらつきも低減することができる。

　また、本実施形態かかるデータ処理装置１２は、データ解析として、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を実行する。これにより、定量的な信号光の強度情報を基にゲーティング処理を行うことができ、解析対象の集団同定の精度を高めることができる。

　さらに、本実施形態に係るデータ処理装置１２においては、計算した信号光の仮想ホトン数Ｓからその仮想ホトン数Ｓに含まれるノイズに相当する標準偏差σ_ｔｈｉｓが計算され、ゲーティング処理においてその標準偏差σ_ｔｈｉｓを用いてゲート区間が設定される。これにより、解析対象の集団同定の精度をさらに高めることできる。

　さらに、本実施形態に係るデータ処理装置１２は、フローサイトメータシステム１において信号光の入射がない場合の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの強度信号のデジタル値ＤＮの平均値Ａ_Ｓ＝０を取得し、平均値Ａ_Ｓ＝０を減算した平均値Ａ_Ｓを用いて、信号光の仮想ホトン数Ｓを計算している。こうすれば、背景光および暗電流の影響を除いて信号光の仮想ホトン数Ｓを計算することができる。その結果、フローサイトメトリーによる分析結果の信頼性を高めることができる。

　また、本実施形態に係るデータ処理装置１２は、フローサイトメータシステム１において信号光の入射がない場合の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの強度信号のデジタル値ＤＮの標準偏差σ_Ｓ＝０を取得し、標準偏差σ_Ｓ＝０をさらに用いて、標準偏差σ_ｔｈｉｓを計算している。こうすれば、背景光および暗電流の影響を考慮して信号光の仮想ホトン数のノイズ成分を計算することができる。その結果、解析対象の集団同定の精度をより高めることできる。

　また、本実施形態に係るデータ処理装置１２は、フローサイトメータシステム１において所定強度のレーザ光に応じた信号光に基づいた光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの強度信号のデジタル値ＤＮの平均値Ａ_Ｓ≫Ｈと、そのデジタル値ＤＮの標準偏差σ_Ｓ≫Ｈを取得し、平均値Ａ_Ｓ≫Ｈ及び標準偏差σ_Ｓ≫Ｈをさらに用いて、標準偏差σ_ｔｈｉｓを計算している。かかる構成を採れば、光源の特性及び解析対象のばらつきを考慮して信号光の仮想ホトン数のノイズ成分を計算することができる。その結果、解析対象の集団同定の精度をより高めることできる。

　図８は、従来のフローサイトメトリーによるデータ解析において、一のシステムによって生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフであり、図９は、従来のフローサイトメトリーによるデータ解析において、別のシステムによって生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。このように、同じ分析対象物を含むサンプル流体を対象とした場合でも、２つのシステムでデータ解析による集団の比率が異なって計算される。例えば、抗体Ａ，Ｂの両方が陽性の割合が、一のシステムでは“０．７８％”と計算され、別のシステムでは“１０．１％”と計算され、両者によって計算される比率が大きく異なった値に計算される。これは、システムに含まれる装置の特性のばらつき、システムのオペレータによる装置の調整度合いのばらつき等が起因している。本実施形態によれば、このようなばらつきによる分析結果のばらつきを確実に低減することができる。

　以上、本発明の種々の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。

　例えば、ドットプロットにおけるゲーティング処理は、電子システム４による自動設定に限らず、作業者の入力によって設定してもよいし、自動設定されたものを作業者の入力によって調整してもよい。また、実施形態における光電子増倍管は、ダイノードあるいは電子収集電極であるアノードを備えたもののみではなく、光電変換部から放出された光電子を半導体素子で増倍および検出するＨＰＤ（Ｈｙｂｒｉｄ　Ｐｈｏｔｏ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）でもよい。

　また、変形例として、データ処理装置１２は、解析評価値として、仮想ホトン数の代わりに有効光電子数（光電子数）を用いてもよい。その場合には、信号光の強度及びノイズの理論モデルとして、下記式（１１）及び下記式（１２）によって表される理論モデルが適用される。

　本変形例においては、計算部２０２は、上記実施形態と同様にして、暗電流の有効電子数期待値Ｅ_D、背景光の有効光電子数Ｅ_B、有効光電子数期待値ＥＳとして、パラメータＡ_ＥＳ＝０，σ_ＥＳ＝０、ばらつき率ρ、パラメータＦを計算し内部の記憶媒体に記憶させる。そして、計算部２０２は、測定対象のサンプル流体の検出が開始された際に、取得したデジタル値ＤＮを基に下記式（１３）を計算することにより、デジタル値ＤＮの示す強度信号の平均値Ａ_Ｓから、有効光電子数Ｅ_Ｓを導出する。

　さらに、計算部２０２は、下記式（１４）に、計算した有効光電子数Ｅ_Ｓと、記憶したパラメータσ_ＥＳ＝０，Ｆ及びばらつき率ρとを適用することにより、標準偏差σ_ｔｈｉｓを計算する。

その後、計算部２０２は、この標準偏差σ_ｔｈｉｓを変換係数Ｃ及びゲインＧで除算することにより、標準偏差σ_ｔｈｉｓ［ＤＮ　ｒｍｓ］を有効光電子数に換算した標準偏差σ_ｔｈｉｓ［ｅ　ｒｍｓ］に変換することができる。

　本変形例によっても、計算した有効光電子数Ｅ_Ｓ及び標準偏差σ_ｔｈｉｓを用いたゲーティング処理等のデータ解析が可能となり、定量的に信号光を解析することができ、フローサイトメトリーによる分析結果のばらつきを低減することができる。

　実施形態の第一の側面及び第二の側面においては、解析評価値は、光子数である、ことが好適である。この場合、さらに、フローサイトメトリーによる分析結果の装置間でのばらつきも低減することができる。

　また、上記第一の側面及び上記第二の側面においては、データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、ことが好適である。これにより、定量的な信号光の強度情報を基にゲーティング処理を行うことができ、解析対象の集団同定の精度を高めることができる。

　また、上記第一の側面においては、解析評価値、及び光電子増倍管のゲインを基に、解析評価値に含まれるノイズに相当する第１ノイズ値をさらに計算し、ゲーティング処理では、解析評価値及び第１ノイズ値を用いてゲートの区間を設定する、ことも好適である。また、上記第二の側面においては、プロセッサは、解析評価値、及び光電子増倍管のゲインを基に、解析評価値に含まれるノイズに相当する第１ノイズ値をさらに計算し、ゲーティング処理では、解析評価値及び第１ノイズ値を用いてゲートの区間を設定する、ことも好適である。この場合、計算した信号光の光子数からその光子数に含まれるノイズに相当する値が計算され、ゲーティング処理においてその値を用いてゲートの区間が設定される。これにより、解析対象の集団同定の精度をさらに高めることできる。

　またさらに、上記第一の側面においては、フローサイトメータにおいて信号光の入射がない場合の光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号の平均値を第１平均値として取得し、第１平均値を減算した第１電流信号の値を用いて、解析評価値を計算する、ことも好適である。またさらに、上記第二の側面においては、プロセッサは、フローサイトメータにおいて信号光の入射がない場合の光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号の平均値を第１平均値として取得し、第１平均値を減算した第１電流信号の値を用いて、解析評価値を計算する、ことも好適である。こうすれば、背景光および暗電流の影響を除いて信号光の光子数を計算することができる。その結果、フローサイトメトリーによる分析結果の信頼性を高めることができる。

　さらにまた、上記第一の側面においては、フローサイトメータにおいて信号光の入射がない場合の光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号のノイズ値を第２ノイズ値として取得し、第２ノイズ値をさらに用いて、第１ノイズ値を計算する、ことも好適である。さらにまた、上記第二の側面においては、プロセッサは、フローサイトメータにおいて信号光の入射がない場合の光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号のノイズ値を第２ノイズ値として取得し、第２ノイズ値をさらに用いて、第１ノイズ値を計算する、ことも好適である。こうすれば、背景光および暗電流の影響を考慮して信号光の光子数のノイズ成分を計算することができる。その結果、解析対象の集団同定の精度をより高めることできる。

　また、上記第一の側面においては、フローサイトメータにおいて所定強度の励起光に応じた信号光に基づいた光電子増倍管の出力電流信号である第３電流信号の平均値である第２平均値と、当該第３電流信号のノイズ値である第３ノイズ値とを取得し、第２平均値及び第３ノイズ値をさらに用いて、第１ノイズ値を計算する、ことも好適である。また、上記第二の側面においては、プロセッサは、フローサイトメータにおいて所定強度の励起光に応じた信号光に基づいた光電子増倍管の出力電流信号である第３電流信号の平均値である第２平均値と、当該第３電流信号のノイズ値である第３ノイズ値とを取得し、第２平均値及び第３ノイズ値をさらに用いて、第１ノイズ値を計算する、ことも好適である。かかる構成を採れば、光源の特性及び解析対象のばらつきを考慮して信号光の光子数のノイズ成分を計算することができる。その結果、解析対象の集団同定の精度をより高めることできる。

　１…フローサイトメータシステム、２…流体システム、３…光学システム、４…電子システム（信号処理装置）、５…チャネル、６…フローセル、７…レーザ光源、８…レンズ、９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ…フィルタ、１０ｂ，１０ｃ…ダイクロイックミラー、１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ…光電子増倍管、１２…データ処理装置、２０１…信号取得部、２０２…計算部、２０３…解析部。

Claims

　フローサイトメータを構成する光電子増倍管の出力を処理する信号処理方法であって、
　前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を基にした前記光電子増倍管の出力電流信号を第１電流信号として取得し、
　前記第１電流信号の値を、前記光電子増倍管のゲインで除算することにより、前記光電子増倍管に入射する前記信号光の光子数あるいは前記光電子増倍管の光電変換部から放出される光電子数のいずれかである解析評価値を計算し、
　前記解析評価値を基にデータ解析を実行する、
信号処理方法。
　前記解析評価値は、前記光子数である、
請求項１に記載の信号処理方法。
　前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、
請求項１又は２に記載の信号処理方法。
　前記解析評価値、及び前記光電子増倍管のゲインを基に、前記解析評価値に含まれるノイズに相当する第１ノイズ値をさらに計算し、
　前記ゲーティング処理では、前記解析評価値及び前記第１ノイズ値を用いてゲートの区間を設定する、
請求項３に記載の信号処理方法。
　前記フローサイトメータにおいて前記信号光の入射がない場合の前記光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号の平均値を第１平均値として取得し、
　前記第１平均値を減算した前記第１電流信号の値を用いて、前記解析評価値を計算する、
請求項１～４のいずれか１項に記載の信号処理方法。
　前記フローサイトメータにおいて前記信号光の入射がない場合の前記光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号のノイズ値を第２ノイズ値として取得し、
　前記第２ノイズ値をさらに用いて、前記第１ノイズ値を計算する、
請求項４に記載の信号処理方法。
　前記フローサイトメータにおいて所定強度の励起光に応じた前記信号光に基づいた前記光電子増倍管の出力電流信号である第３電流信号の平均値である第２平均値と、当該第３電流信号のノイズ値である第３ノイズ値とを取得し、
　前記第２平均値及び前記第３ノイズ値をさらに用いて、前記第１ノイズ値を計算する、
請求項４に記載の信号処理方法。
　フローサイトメータを構成する光電子増倍管の出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、
　前記プロセッサは、
　前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を基にした前記光電子増倍管の出力電流信号を第１電流信号として取得し、
　前記第１電流信号の値を、前記光電子増倍管のゲインで除算することにより、前記光電子増倍管に入射する前記信号光の光子数あるいは前記光電子増倍管の光電変換部から放出される光電子数のいずれかである解析評価値を計算し、
　前記解析評価値を基にデータ解析を実行するように構成されている、
信号処理装置。
　前記解析評価値は、前記光子数である、
請求項８に記載の信号処理装置。
　前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、
請求項８又は９に記載の信号処理装置。
　前記プロセッサは、
　前記解析評価値、及び前記光電子増倍管のゲインを基に、前記解析評価値に含まれるノイズに相当する第１ノイズ値をさらに計算し、
　前記ゲーティング処理では、前記解析評価値及び前記第１ノイズ値を用いてゲートの区間を設定する、
請求項１０に記載の信号処理装置。
　前記プロセッサは、
　前記フローサイトメータにおいて前記信号光の入射がない場合の前記光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号の平均値を第１平均値として取得し、
　前記第１平均値を減算した前記第１電流信号の値を用いて、前記解析評価値を計算する、
請求項８～１１のいずれか１項に記載の信号処理装置。
　前記プロセッサは、
　前記フローサイトメータにおいて前記信号光の入射がない場合の前記光電子増倍管の出力電流信号である第２電流信号のノイズ値を第２ノイズ値として取得し、
　前記第２ノイズ値をさらに用いて、前記第１ノイズ値を計算する、
請求項１１に記載の信号処理装置。
　前記プロセッサは、
　前記フローサイトメータにおいて所定強度の所定強度の励起光に応じた前記信号光に基づいた前記光電子増倍管の出力電流信号である第３電流信号の平均値である第２平均値と、当該第３電流信号のノイズ値である第３ノイズ値とを取得し、
　前記第２平均値及び前記第３ノイズ値をさらに用いて、前記第１ノイズ値を計算する、
請求項１１に記載の信号処理装置。
　請求項８～１４のいずれか１項に記載の信号処理装置と、
　前記光電子増倍管と、
　前記信号光を前記光電子増倍管に導く光学系と、
を備える信号処理システム。