JPH10507365A - Methods for reducing sugar levels in organisms - Google Patents

Methods for reducing sugar levels in organisms

Info

Publication number
JPH10507365A
JPH10507365A JP8513606A JP51360695A JPH10507365A JP H10507365 A JPH10507365 A JP H10507365A JP 8513606 A JP8513606 A JP 8513606A JP 51360695 A JP51360695 A JP 51360695A JP H10507365 A JPH10507365 A JP H10507365A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amylase
potato
tubers
organism
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8513606A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ジェット ディナ クレイバーグ，
トーブ， マーテル， アイダ， エルザ クリステンセン，
ジョン， エリック ニールセン，
ブジャーン， ムンク ハンセン，
Original Assignee
ダニスコ エイ／エス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ダニスコ エイ／エス filed Critical ダニスコ エイ／エス
Publication of JPH10507365A publication Critical patent/JPH10507365A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2422—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from plant source

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 アミロペクチンまたはアミロースを酵素的に分解し得る生物において、特定の還元糖のレベルを低減させる方法が記載される。好ましい方法は、生物中でα-アミラーゼの活性を少なくとも部分的に阻害する工程を包含する。   (57) [Summary] Methods are described for reducing the level of certain reducing sugars in an organism that can degrade amylopectin or amylose enzymatically. A preferred method involves at least partially inhibiting the activity of α-amylase in an organism.

Description

【発明の詳細な説明】 生物中の糖のレベルを低減させる方法 本発明は、生物中の糖のレベルを低減させる方法に関する。より詳細には、本 発明は、低減された糖のレベルを有する植物またはその一部（例えば、果実、種 子、塊茎、苗条など）あるいはその産物および、その植物またはその一部あるい はその産物の食料としての利用に関する。さらに詳細には、本発明は、植物（好 ましくはジャガイモ）のような生物中の還元糖グルコースのレベルを低減させる ことに関する。 いくつかの場合には、生物、特に植物中の糖のレベルを低減させることが望ま しくあり得る。例えば、低いレベルの糖（特にグルコース）を有することが望ま しくあり得る。なぜなら、植物のような食料における高レベルの糖の存在は、食 物産業にとっていくつかの場合には、望ましくないことがあり得るからである。 例えば、食料のカロリー値を低減させるのに、食料において低レベルの糖を有す ることは望ましくあり得る。これを達成する一つの方法は、食料を形成する前に 糖を抽出することである。しかし、このプロセスは非常に煩雑であり、そして時 間がかかる。さらに、非常に費用がかかる。 さらなる例としては、食料中の還元糖の存在は、高温に曝される場合（例えば 焼く過程または揚げる過程を通じて）、変色（例えば、Maillard反応（１）によ る黒化）を引き起こし得る。このような観点から、還元糖が食料中のタンパク質 物質とともに残留物を形成し、しばしば黒色を呈する物質を生じると考えられる 。当然、還元糖のレベルが高くなるほど、黒化した残留物の形成は増加する。特 に、これは、例えばそのような反応によって黒化したポテトフライ（pomme frit e）、チップ(chips)、クリスプ（crisps）などを産生するジャガイモを用いるこ とが望ましくないジャガイモ産業において重要な問題である。 還元糖の総レベルは、寒冷な条件（例えば約２℃〜４℃）下では、温暖な条件 （例えば、約10℃〜16℃）下よりも約10倍大きいことが天然のジャガイモにおい て観察されている。従って、チップ/クリスプ産業（ならびにポテトフライ産業 ）では、低温でジャガイモを貯蔵するのは望ましくない。 しかし、ジャガイモを低温で貯蔵するのは好ましい。なぜなら、このような条 件下では、発芽を防止するために化学薬品を適用する必要がないからである。 塊茎中の全ての非リン酸化およびリン酸化還元糖（例えばグルコースおよびフ ルクトース）は、Maillard反応（１、２）に寄与するが、一方、非還元糖（スク ロース）は寄与しない。スクロース分子は、グルコース１分子とフルクトース１ 分子を含むので、ジャガイモ塊茎の貯蔵の間、特に冷蔵（例えば４℃で保存）し た塊茎の還元糖の生成は、スクロース分子（３、４、５、６）の分解に起因する ものと一般に考えられている。これは、Isherwood（1973）（４）によって示さ れるように、冷蔵の間に、スクロースがはじめに蓄積され、次いでグルコースお よびフルクトース（より詳細には、リン酸化糖）に分解することを示す。 ジャガイモ塊茎の貯蔵の間のグルコースおよびフルクトースの蓄積は、全体の 因子に依存する。主要な因子は、実際の品種である。チップおよびクリスプを作 製する産業に有用である、温暖な温度（８℃〜12℃）での保存においてさえ、還 元糖の蓄積量が少ない品種はごくわずかしか知られていない。例えばジャガイモ 薄片中の還元糖が熱い食用油（184℃の熱さ）に接触するとすぐに、Maillard反 応（１、２）と呼ばれる非酵素的プロセスが開始する。このプロセスでは、還元 糖が塊茎薄片中の遊離アミノ酸と反応して、呈色した長いポリマー性分子を形成 する。生産されたポテトチップまたはクリスプは暗褐色から黒色を有し、そして 、このポテトチップは焦げた味がする。 ジャガイモ塊茎中の遊離アミノ酸の実際の蓄積は、Maillard反応（７）の程度 を制御する制限要因ではないということが認められている。その代わりに、塊茎 中の還元糖の実際の含量が制限要因であると一般的に考えられている。クリスプ 産業には１mg/g塊茎程度に低い含量がより理想的ではあるが、2.5mg/g塊茎〜３m g/g塊茎以下の還元糖レベルを有する塊茎は、チップまたはクリスプの製造に通 常容認される（８、９）。過剰な還元糖を除去するために塊茎薄片を湯通し（bl anch）することは可能であるが、還元糖のレベルが３mg/g塊茎以上の場合には、 まだ十分に良好ではない（これはまた、費用がかかる方法でもある）。フレンチ フライ/チップ産業では、５mg/g塊茎程度に高いレベルが容認され得るが、塊茎 がそのレベルより多い還元糖を含んでいる場合は容認されない（８、９）。 チップ/クリスプ産業によって代表的に用いられる二つの品種は、Saturnaおよ びRecordである。例えば、Bintjeのような品種は、非常に早い季節にチップまた はクリスプを製造するのに用いられる、周知の食用ジャガイモである。が、すぐ にそのグルコースおよびフルクトースの蓄積は高くなりすぎる。チップ/クリス プの製造に全く適さない品種は、古くからのデンプン品種であるDianellaであり 、その還元糖の含量はチップ/クリスプの製造に用いるには多すぎる。 それゆえ、チップまたはクリスプ産業は、他の品種と比べて相対的に低いレベ ルの還元糖を蓄積する特定の品種に非常に依存している。 任意の品種の還元糖の含量を決定する際に重要である他の要因は、保存される 前の収穫された作物の成熟度である。これは、実際の成長する時期によって非常 に影響され、例えば寒期、雨期には幾分未成熟な作物が産生される。これらは、 完熟した作物よりも高く、かつより変動するレベルの還元糖を蓄積する(8、2、1 、10)。少なくとも10個のパラメータ（例えば、温度、降水量、土壌耕作など） のモニタリングを含む、英国における100の穀物用地の３年にわたる調査が、Kir kman、Youngら（1991）（11）によって行われた。彼らの研究により、収穫され た作物の還元糖の（平均）含量に独占的に関連し得る単一の因子は存在しないこ とが明らかになった。しかし、包括的な分析が、ある一つの結果、すなわち特定 の作物の還元糖の含量は、用地特異的であるということを明らかにした。良好な クリスプの色を呈する作物を生産する畑は、粗悪なクリスプの色を呈するジャガ イモを生産する畑よりも、各年平均していつも良好な作物を生産する。 最後に、ジャガイモが保存される実際の保存温度が重要である。産業に用いら れる全ての既知のジャガイモの品種は、冷蔵（７℃以下）すると、非常に高く、 かつ許容し得ないレベルの還元糖を必然的に蓄積する。これは、現時点では加工 に用いられる全てのジャガイモが、７℃よりも高い温度（例えば８℃〜10℃）で 保存されていることを意味する（８、12）。しかし、保存期間はしばしば10ヶ月 程度の長さであり、そしてジャガイモ塊茎の休止（rest）は約２ヶ月〜４ヶ月で ある。従ってこれは、発芽を防ぐために塊茎を化学的に処理しなければならない ことを意味する（８）。ここで「休止」とは、目立った発芽を有しない塊茎を意 味する。 発芽する塊茎は、加工において問題を生じさせる。なぜなら、芽が毒性の化合 物であるソラニン（ジャガイモ植物の全ての緑色の部分として）を含有するから である。従って、塊茎のスライスを行う前に、これらの芽を切り取らなければな らない。さらに、芽は温暖な保存温度（７℃以上）で速く成長し、そしてその間 に塊茎中のデンプンを消費し、生産物中のデンプンの損失を引き起こす。それら を放置すると、作物全体がクリスプの生産に適しなくなる（12）。 寒冷な条件（例えば3℃〜4℃）下で保存されたジャガイモ塊茎は、12ヶ月以上 経っても、いかなる有意な成長する芽を発生しないことは周知のことである。な ぜなら、これが種ジャガイモを保存する際の貯蔵温度だからである。 このように工業的視点からは、低温でより長い期間保存し得るジャガイモの品 種を入手することは可能である。 貯蔵されたジャガイモ塊茎中に蓄積する還元糖は、ジャガイモデンプン粒子の 分解によって産生されることが一般的に認められている。 デンプンは、不溶性の多糖炭水化物である。デンプンは植物の主要なエネルギ ー備蓄の１つである。デンプンはしばしば多くの植物の無色の色素体（アミロプ ラスト）中、貯蔵組織中、および葉緑体のストローマ中に見出される。デンプン は２つの主要な成分：アミロースおよびアミロペクチンを含む。両方の成分は、 α（1,4）-結合グリコシル残基の直鎖からなるが、それに加えて後者の成分はα （1,6）分岐を含む（13）。 酵素α-アミラーゼは、デンプンの分解に関与する多くの酵素のうちの一つで ある。α-アミラーゼは、穀類由来が最も知られている。ここで、α-アミラーゼ は、アミロースおよびアミロペクチン分予中のα-1-4グルコシド結合を分解し、 それによってマルトース、マルトトリオースおよびα-デキストリン（アミロペ クチン分岐のα-1-6グルコシド結合を含有する分子）を遊離させる（15、16）。 デンプン粒子における最初の攻撃の後、デンプンホスホリラーゼ、β-アミラー ゼ、α-グルコシダーゼ、脱分岐酵素、および不均化酵素のような他の酵素が、 最終的なグルコースおよびグルコース-1-リン酸の生成を手伝う（16）。グルコ ースは、ヘキソキナーゼによって速やかにリン酸化され、グルコース-1-リン酸 におけるホスホグルコムターゼの作用物でもあるグルコース-6-リン酸になる。 グルコース-6-リン酸は、ホスホヘキソースイソメラーゼによって、フルクトー ス-6-リン酸に変換される。グルコース-1-リン酸は、UDPG-ピロホスホリラーゼ の作用によりUTPと反応し、UDPGを生産する。これは、スクロースシンターゼま たはスクロース-P-シンターゼのいずれかの作用により、フルクトースまたはフ ルクトース-6-リン酸のいずれかと反応し、それによってスクロース-6-リン酸を 生成する。 最終的に、ホスファターゼはスクロース-6-リン酸を切断し、スクロースを遊 離し、次いでインベルターゼはスクロースをグルコースおよびフルクトースに分 解し得る。 このように、デンプンの全体的な分解は、多くの酵素の作用、多数の中間体の 形成およびいくつかの中間生成物の間での多数の平衡反応の形成を包含し、そし て関与する高度に複雑な反応である。しかし、どの酵素が、そして保存中のジャ ガイモ塊茎中でそれらが正確にはどのように機能するのかということについての 現在の理解はまだ限られている（１）。このような観点から、酵素α-アミラー ゼは、温暖貯蔵された塊茎よりも、冷蔵された塊茎において高い反応性を有する という報告はほとんどなされていない（23、25、63、64）。これは、他の酵素、 例えばβ-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ（23）、およびインベルターゼ（25） についても同様に報告されている。 何人かの研究者は、低い保存温度での還元糖の蓄積の原因となるのはどの酵素 であるかを選びだそうと試みてきた。例えば、研究には、デンプンホスホリラー ゼ（最初にリン酸化反応によってデンプンを最初に分解する）（アミラーゼによ る加水分解反応と反対である）（17、18）；ホスホフルクトホスホリラーゼ（PF P）（低温不安定性であり、それによってヘキソースが解糖サイクルに入るのを 妨げ、そしてヘキソースの蓄積を導くことが報告されている）（８）；ホスホフ ルクトキナーゼ（PFK）（これもまた低温不安定性であり、それによってヘキソ ースが解糖サイクルに入るのを妨げることが報告されている）（8、19、20）； およびインベルターゼ（冷蔵保存した塊茎中では、温暖な温度で保持した塊茎と 比較してレベルが高い）（21）についての調査が挙げられる。また、α-および β-アミラーゼならびにα-グルコシダーゼを温暖および寒冷の両方で保存した塊 茎中で測定した結果は、これらの酵素が温暖保存した塊茎に比べて寒冷保存した 塊茎において高いレベルを有し（22、23、24）、そしてそれゆえ、還元糖の蓄積 に寄与し得たことを示すと報告されている。 一方、他の研究者らは、保存されたジャガイモ塊茎にはごく少量のα-アミラ ーゼ活性が存在し、それゆえ分解は加リン酸分解であるに違いないと結論づけて いる（3、25、26）。酵素が温暖または寒冷保存された塊茎のいずれかにおいて より多い量またはごく少量で存在するか否かにかかわらず、どの酵素が、保存さ れたジャガイモの塊茎中の還元糖グルコースおよびフルクトースの実際の蓄積の 原因となっているのかはまだ知られていない。 過去に、研究者らは、ジャガイモ中の還元糖のレベルを低減させることを試み る方法を調べてきた。特に、4th International Congress of Plant Molecular Biology in Amsterdam（19-24 June 1994）では、この目的を達成することを試 みる３つのアプローチが考察された。 最初のアプローチは、Rita Zrennerら（27）によるものであり、そしてジャガ イモ中のアンチセンス液胞インベルターゼを発現するのに35Sプロモーターを用 いることに関する。この研究者らは、アンチセンスインベルターゼを含有するジ ャガイモ中では、室温で保存された塊茎中のデンプン、グルコース、フルクトー ス、およびスクロースの量は、コントロール（すなわち、非形質転換ジャガイモ ）と比較して、差異を示さないことを見出した。冷蔵された塊茎は、非形質転換 コントロール保存塊茎とは対照的に、インベルターゼ酵素の強い阻害（75％まで ）を示した。明らかに、液胞インベルターゼの発現（mRNAレベル）は、冷蔵の44 時間後に増加しており、この高レベルは６週間に至るまで維持され、それからそ れは非形質転換コントロール塊茎では再び低下した。 冷蔵したトランスジーンジャガイモ中の種々の糖（グルコース、フルクトース 、スクロース）のレベルを測定することにより、この研究者らは、総量はコント ロールと同じであるが、ヘキソース（例えば、グルコースおよびフルクトース） に対するスクロースの割合は変化していたことを見出した。このことについては 、 グルコースおよびフルクトースは約50％が減少したが、その代わりに等量のスク ロースが増加した。 いくらかのヘキソースの除去が最初の６週間観察されたが、スクロースのレベ ルが増加したにもかかわらず、このアプローチは満足できるものではないことに 注意することは重要である。なぜなら、ジャガイモは、産業規模では６週間より もずっと長く、しばしば10ヶ月にもおよぶ期間保存されるからである。 このように産業レベルでは、このアプローチは低温条件での還元糖のレベルを コントロールと比較して50％しか低減しないという問題は言うまでもなく、長期 にわたってジャガイモ中の還元糖のレベルを低減させるという問題を解決しない 。 第２のアプローチは、MonsantoのKishoreらによるものであり、そして還元糖 のレベルを低減することを期待して、E．coli gene ADP-グルコースピロホスホ リラーゼ（ADPGPP）を、デンプン含量を増加させるために使用することに関する 。しかし、Kishoreらは、トランスジーン塊茎中で産生されたADPGPPタンパク質 の量およびデンプンのレベルの増加との間に、還元糖のレベルの減少は言うまで もなく、いかなる相関をも全く見出さなかった。４℃で４ヶ月保存した、増加し たデンプンの含量を有する塊茎に関するさらなる研究では、明らかにより明るい 色のポテトフライ（pommes frites）を産生する。しかし、この研究者らは、糖 のレベルまたは根本的な機構を説明し得る他のものについて報告しなかった。ポ テトフライの製造は、ヘキソースのレベルの増加に対して、ポテトクリスプほど 極めて敏感ではないということが注意されるべきである。さらに、この研究者ら は、増加したデンプン含量を有する彼らのトランスジェニックジャガイモからの クリスプの製造について報告しなかった。この研究者らは、低温保存に関する他 のデータを全く明らかにしなかった。それゆえ、このアプローチは、低温条件下 で還元糖のレベルを低減させるという問題は言うまでもなく、ジャガイモ中の還 元糖のレベルを低減させるという問題を解決しない。 第３のアプローチは、Duveningら（28）、Virginら（29）、Lorberthら（30） 、Abelら（31）、Blundyら（32）、DonathおよびDruger（33）、Geuveia（34、3 5）、Krauseら（36）、Rouwendalら（38）、Burrell、およびMooney（37）によ るものであり、E．coli 酵素と同様に植物由来の種々の炭素代謝をコードする遺 伝子配列を有するジャガイモの形質変換に関する。これらの例の各々では、糖お よびデンプンの量に影響がなかったか、または糖のレベルがかなり増加している のにも関わらず、デンプンのレベルがより低かった。それゆえ、同様に、このア プローチは、低温条件で還元糖のレベルを低減させるという問題は言うまでもな く、ジャガイモ中の還元糖のレベルを低減させるという問題を解決しない。しか し、このアプローチは、食物産業が直面している、ジャガイモ中の還元糖（例え ばグルコースおよびフルクトース）のレベルを低減させることの困難さを明確に 強調している。 それゆえ、生物中（特にジャガイモ中）の還元糖のレベルを低減することを可 能にする必要がある。より詳細には、グルコースのレベルを低減する必要がある 。また、低温条件下で還元糖のレベルを低減する必要性が特にある。 本発明の第１の局面によると、グルコースのレベルを他の還元糖のレベルと比 較して、選択的に低減する方法が提供されていて、それは少なくとも生物中のα -アミラーゼの活性を部分的に阻害することを包含する。 本発明の第２の局面によると、生物中の他の還元糖のレベルと比較して、グル コースのレベルを選択的に低減する方法が提供され、これは少なくとも生物中の α-アミラーゼの活性を部分的に阻害することを包含する。ここで、生物はアミ ロペクチンあるいはアミロースを酵素的に分解し得る生物である。 本発明の第３の局面によると、アミロペクチンあるいはアミロースを酵素的に 分解し得る細胞、組織、器官、またトランスジェニック生物が提供され、それら は外来のヌクレオチド配列を含む。ここで、それらの発現由来の転写産物は、細 胞、組織、器官、またはトランスジェニック生物中のα-アミラーゼの活性を少 なくとも部分的に阻害する。 本発明の第４の局面によると、本発明の外来ヌクレオチド配列ならびにプロモ ーターを含有する構築物、形質変換ベクター、また発現ベクターが提供される。 本発明の第５の局面によると、本発明の生物から調製される食料が提供される 。 本発明の第６の局面によると、本発明の生物から調製されるベークドポテトま たはフライドポテトが提供される。 本発明の第７の局面によると、グルコースのレベルを選択的に低減させるため のアンチセンスα-アミラーゼの使用が提供される。他の還元糖のレベルと比較 して、酵素的にアミロペクチンまたはアミロースを分解し得る生物に関する。 好ましくは、α-アミラーゼの活性は、α-アミラーゼをコードするヌクレオチ ド配列の第２の転写産物に結合し得る、第１の転写産物をコードする外来ヌクレ オチド配列を生物中で発現させ、それによって第２の転写産物の翻訳を防止する ことにより、阻害される。 好ましくは、外来ヌクレオチド配列は、配列番号１として示される配列に少な くとも部分的にアンチセンスな配列を有する。 好ましくは、外来ヌクレオチド配列は、配列番号２として示される配列を有す るか、またはその変異体、ホモログ、またはフラグメントである。ここで、変異 体、ホモログ、またはフラグメントは、α-アミラーゼ活性を阻害し得る（例え ば第２の転写産物の翻訳の防止）。 好ましくは、外来ヌクレオチド配列は、35Sプロモーターの制御の下で発現さ れる。 好ましくは、前記生物は植物である。 好ましくは、前記生物はジャガイモである。 好ましくは、前記食料はクリスプ、チップ、またはポテトフライである。 本発明に関する実験では、α-アミラーゼ活性は低温条件下で増大する。上記 で説明したように、α-アミラーゼは、デンプンの分解に関与する酵素の一つで ある。ジャガイモα-アミラーゼはEP-B-0470145の主題である。 このような観察に基づいて、アンチセンスα-アミラーゼを35Sプロモーターの 制御下に設置し、ジャガイモ植物中に形質転換した。しかし、驚くべきことに、 本発明は、アンチセンスα-アミラーゼの発現が長い期間にわたって、ジャガイ モ中のまさに還元糖グルコースのレベルにおいて著しい減少を導いたこと（特に 、温暖な条件下で）を示す。 詳細には、一定のままであるフルクトースのレベルとは異なり、グルコースの レベルの総体的な減少は、温暖な条件の下では約70％であり、また低温の条件下 では総体的な減少量は約40％であった。 このように、本発明は、温暖および寒冷な保存温度の両方で保存されたジャガ イモ塊茎中の内在性α-アミラーゼの少なくとも部分的な阻害が、塊茎中のグル コースレベルに特に影響することを示す。 これらの結果は、非常に驚くべきことに、現在の考え、当初に予想した保存さ れたジャガイモ塊茎中のデンプンの分解の結果であるスクロース、グルコースな らびにフルクトースのそれぞれの低減（前記を参照のこと）と一致する。 さらに、スクロースの蓄積中の低減に応じて、グルコースとフルクトースの類 似した、そして比例的な低減が起こったと少なくとも予測した。 また、以下のジャガイモ抽出物の調査（本発明に関連する）により、α-アミ ラーゼ活性を有し、そしてβ-アミラーゼ活性を有しない画分は、基質アミロー スとインキュベートした場合、生成物であるグルコースおよびマルトースを与え ることが明らかになった。また、アンチセンス配列で形質変換されたトランスジ ェニックジャガイモ株中での、少なくとも部分的なα-アミラーゼ酵素の阻害が 、いかなるジャガイモの品種中においても明白にグルコースのレベルを低減させ ることは、非常に驚くべきことである。 それゆえ、ジャガイモα-アミラーゼはグルコースの蓄積に直接寄与するとし ても、それはまたマルトースおよびデキストリンの生産にも関連している。 このように、α-アミラーゼの活性の部分的阻害が、フルクトースの蓄積に影 響することなく、グルコースのレベルを特異的に低減させることは驚くべきこと である。 本発明と一致して、温暖に保存した塊茎中の、グルコースレベルにおける70％ 程度の高い減少を見出したが、フルクトースレベルは一定であった。塊茎中には 、デンプンホスホリラーゼおよびβ-アミラーゼのような他のデンプン分解酵素 が存在しているので、それら（特にデンプンホスホリラーゼ）は、α-アミラー ゼの活性の除去を代償し得ると予想されていた。しかし、予想された代償効果は 起こらなかった。 本発明の他の実施態様は、組織特異的プロモーター、温度誘導性プロモーター 、または天然のα-アミラーゼプロモーター（それらの組合せを含む）の制御の 下で、本発明の外来ヌクレオチド配列の発現を包含する。本発明はまた、前記の ものを含有する構築物を包含する。 好ましい温度誘導性プロモーターの例は、図15に示すようなプロモーターであ る。配列番号３として示すような配列を含むプロモーターは、Solanum tuberosu mから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに相当するヌクレオチド配列を含む プロモーター、または、それらの変異体、ホモログ、またはフラグメントである 。 高度に好ましい組織特異的プロモーターの例は、配列番号３として示すプロモ ーターである。このプロモーターは塊茎に特異的な低温誘導性プロモーターであ る。 本発明のさらなる実施態様は、デンプンの分解に関与する少なくとも他の１つ の酵素の少なくとも１つの阻害剤の存在を含む。この阻害剤は、例えば、本発明 の外来ヌクレオチドの発現は、液胞インベルターゼ（例えばアンチセンスインベ ルターゼ）の活性を少なくとも部分的に阻害する、外来ヌクレオチド配列の発現 と組み合せ得る。 用語「他の還元糖と比較して選択的に低減する」は、他の還元糖（特にフルク トース）のレベルよりも、グルコースのレベルが特異的に低減されていることを 意味する。好ましい実施態様では、この用語は、グルコースのレベルがフルクト ースのレベルよりも十分に低いことを意味する。 用語「還元糖」は、当該分野における通常の意味で用いられている。すなわち 、陽性Benedict試験および、過マンガン酸カリウム溶液を脱色する能力により示 されるような、溶液中で還元剤として作用する能力を有する糖である。ほとんど の単糖類は還元糖であり、スクロースを除くほとんどの二糖類もまた還元糖であ る。代表的な還元糖としては、グルコースならびにフルクトースが挙げられる。 用語「少なくとも部分的にα-アミラーゼの活性を阻害する」は、好ましくは 、少なくとも約15％の阻害が存在することを意味する。より好ましくは、少なく とも約50％の阻害が存在する。さらにより好ましくは、少なくとも約70％、また はより高い（例えば95％）阻害が存在することである。 用語「α-アミラーゼの活性を阻害する」は、生物のα-アミラーゼそれ自体が 阻害されることを含む。この用語はまた、α-アミラーゼ遺伝子の複製のレベル を低減することを含む。この用語はまた、α-アミラーゼ遺伝子の転写産物のレ ベルを低減することを含む。好ましくは、この用語は後者を意味する。 用語「配列番号１として示されるような配列に、少なくとも部分的にアンチセ ンスである」は、ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列の少なく ともいくつかに対しアンチセンスであるが、ここでこのヌクレオチド配列は、α -アミラーゼの活性を少なくとも部分的に阻害し得る転写産物を発現することを 意味する。 好ましい実施態様では、このヌクレオチド配列は、配列番号２として示される 配列と少なくとも実質的に同一の配列を有する（すなわち、配列番号２と同一で あるか、あるいはその変異体、ホモログ、またはフラグメントである）。より好 ましい実施態様では、このヌクレオチド配列は配列番号２に示す配列である。 用語「構築物」（それは例えば用語「抱合体」、「カセット」、および「ハイ ブリット」と同意語である）は、直接的または間接的にプロモーターに付着して いる外来のヌクレオチド配列を包含する。間接的な付着の例としては、イントロ ン配列（例えばSh-1イントロンまたはADHイントロン）のような適切なスペーサ ー基がプロモーターとGOIとの間にある場合である。 その構築物はまた、例えばそれが転移されている植物細胞において遺伝子構築 物の選択を可能にするマーカーを含有し得、または発現し得る。例えば植物に使 用され得る様々なマーカーが存在する（例えばマンノース）。マーカーの他の例 は、抗生物質耐性（例えばG418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイ シン、およびゲンタマイシンに対する耐性）を提供するマーカーを包含する。 用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロでの発現能力を有する構 築物を意味する。 用語「形質転換ベクター」は、１つの種から別の種へ（例えばE.coliプラスミ ドから植物細胞へ）の転移能力を有する構築物を意味する。 用語「ヌクレオチド」はゲノムDNA、cDNA、および合成DNAを包含する。 用語「外来の」は、ヌクレオチド配列が本発明の生物に対して天然でないこと を意味する。一例として、本発明の好ましい実施態様では、アンチセンス−αア ミラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ジャガイモに対して天然ではない。 本発明に関して、用語「生物」は、アミロペクチンまたはアミロースを酵素分 解する能力を有する任意の生物を包含する。そのような生物の典型的な例は、植 物、藻類、真菌類、および細菌類、ならびにそれらの細胞株を包含する。好まし くは、この用語は植物またはその細胞、好ましくは双子葉植物、より好ましくは ジャガイモを意味する。 本発明に関して用語「トランスジェニック生物」は、本発明に従う発現可能な 構築物またはそのような構築物の生産物のいずれかを含有する生物を意味する。 例えばトランスジェニック生物は、適切な外来プロモーター（例えば、35Sプ ロモーターまたは低温誘導性プロモーター（本明細書中に記載のような））の制 御下で外来ヌクレオチド配列（本明細書中に記載のような）を；または天然プロ モーター（たとえば天然α−アミラーゼプロモーター）制御下で外来のヌクレオ チド配列を含有し得る。 用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、得られるヌクレ オチド配列が、それぞれ上記第二転写物の翻訳を妨げ得る転写物を発現する能力 または発現系（例えば、本発明に従う形質転換細胞またはトランスジェニック生 物）においてプロモーターとして作用する能力を有する場合、配列からの１つ( またはそれ以上)の核酸の任意の置換（substitution）、変化、改変、置換（rep lacement）、欠失または配列への付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、得ら れるヌクレオチド配列がそれぞれ上記第二転写物の翻訳を妨げ得る転写物を発現 する能力またはプロモーターとして作用する能力を有する場合、構造および／ま たは機能に関して相同性を含む。配列相同性に関して、好ましくは少なくとも75 %、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%の相同性、よ り好ましくは少なくとも95%、より好ましくは98%の相同性がある。 遺伝子改変植物の構築における基本的原理は、挿入された遺伝物質の安定した 維持を得るように、植物ゲノムにおいて遺伝情報を挿入することである。遺伝情 報を挿入するためにいくつかの技術が存在し、２つの主な原理は遺伝情報の直接 導入およびベクター系の使用による遺伝情報の導入である。 一般的な技術の総説はPotrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol［1 991］42:205-225）およびChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）の論文に見出され得る。 ゆえに、ある局面では、本発明はベクター系に関し、その系は本発明に従うヌ クレオチド配列または構築物を有し、そして植物（例えばSolanaceae科の植物、 特にSolanum属の植物、その中でも特にSolanum tuberosum）のゲノムにヌクレオ チド配列または構築物を導入し得る。 ベクター系は１つのベクターを含有し得るが、好ましくは２つのベクターを含 有する；２つのベクターの場合、そのベクター系はバイナリーベクター系と通常 称される。バイナリーベクター系はさらに詳細にGynheung Anら（1980）,バイナ リーベクター,Plant Molecular Biology Manual A3,1-19に記載されている。 所定のプロモーターまたは構築物による植物細胞の形質転換のために広範囲に 使用される系は、Agrobacterium tumefaciens由来のTi−プラスミドまたはAgrob acterium rhizogenes由来のRi−プラスミドの使用を基礎にしている（Anら(1986 ),Plant Physiol.81,301-305およびButcher D.N.ら(1980),Tissue Culture Meth ods for Plant Pathologists,D.S.IngramsおよびJ.P.Helgeson編,203-208）。 いくつかの異なるTi-およびRi-プラスミドが構築されており、それは上述の植 物または植物細胞構築物の構築に適している。そのようなTi-プラスミドの制限 されない例はpGV3850である。 本発明のヌクレオチド配列または構築物は、T-DNAボーダーのすぐ周囲の配列 の分解を避けるように、好ましくはT-DNAの末端配列間でまたはT-DNA配列に隣接 してTi-プラスミドへ挿入されるべきである。それは、これらの少なくとも１つ の領域が植物ゲノムへの改変されたT-DNAの挿入に不可欠であると考えられるか らである。 上記の説明から理解されるように、本発明のベクター系は好ましくは、植物に 感染するのに必要な配列（例えばvir領域）およびT-DNA配列の少なくとも１つの ボーダー部分を含有するものであり、そのボーダー部分は同じベクター上で遺伝 子構築物として位置付けられる。さらに、ベクター系は好ましくはAgrobacteriu m tumefaciens Ti-プラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes Ri-プラスミド またはその誘導体である。これらのプラスミドは周知であり、そしてトランスジ ェニック植物の構築物に広く使用されていて、これらのプラスミドまたはそれら の誘導体を基礎にする多くのベクター系が存在するからである。 トランスジェニック植物の構築において、ヌクレオチド配列または構築物はま ず、ベクターが複製し得、そして植物に挿入される前にその操作が容易である微 生物内で構築され得る。 有用な微生物の例はE.coliであるが、上記の性質を有する他の微生物も使用さ れ得る。上記で定義したベクター系がE.coliにおいて構築されているとき、もし 必要であれば、適切なAgrobacterium株（例えばAgrobacterium tumefaciens）中 に転移される。 従って、本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するTi-プラスミドは、 本発明のヌクレオチド配列または構築物を有する、Agrobacterium細胞を得るよ うに、適切なAgrobacterium株（例えばA.tumefaciens）に好ましくは転移され、 続いてDNAが改変される植物細胞に転移される。 Agrobacteriumによる植物組織の直接感染は、広く使用されており、そしてBut cher D.N.ら(1980)、Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,D.S．In gramsおよびJ.P.Helgeson編,203-208に記載されている簡単な技術である。Potry kus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)およびChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)もまた参照のこと。 CA-A-2006454に報告されたように、大量のクローニングベクターが利用可能で あり、それはE.coliの複製系および形質変換細胞の選択を可能にするマーカーを 含有する。ベクターは、例えばpBR332、pUCシリーズ、M13 mpシリーズ、pACYC 1 84などを含有する。このようにして、構築物またはヌクレオチド配列はベクター の適切な制限位置へ導入され得る。含有されるプラスミドはE.coliの形質変換の ために使用される。E.coli細胞を適切な栄養培地で培養し、そして次いで収集し 、そして溶菌する。次いでプラスミドを回収する。分析の方法としては、一般的 に配列分析、制限分析、電気泳動法、およびさらに生化学−分子生物学的方法が 使用される。各操作後、使用したDNA配列を制限処理し、そして次のDNA配列と連 結し得る。各配列は同一のまたは異なるプラスミドにクローン化され得る。植物 における望ましいヌクレオチド配列または構築物の各導入方法の後、さらなるDN A配列決定が必要であり得る。例えば形質転換のために、植物細胞のTi-またはRi -プラスミドが使用される場合、少なくともTi-およびRi-プラスミドのT-DNAの右 境界、ならびに、しかししばしば右および左の境界が、導入された遺伝子の領域 を隣接させるように、結合され得る。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用 は、集中的に調べられていて、そしてEP 120 516;Hoekema,The Binary Plant Ve ctor System Offset-drukkerij Kanters B.B.、Alblasserdam,1985,第５章；Fra leyら,Crit.Rev.Plant Sci.,4:1-46、およびAnら,EMBO J.(1985)4:277-284にも 詳しく記載されている。 植物組織のAgrobacteriumによる直接感染は、使用され得る別の簡単な技術で ある。典型的には、感染される植物を傷つける。これは例えば、剃刀で植物に切 り目を入れること、または針で植物に穴をあけること、または研磨剤で植物をこ することによって行う。次いでその傷にAgrobacteriumを（例えば溶液中で）接 種する。 あるいは植物の感染は、植物の特定の部または組織（すなわち葉、根、茎また は植物の他の部の一部）で行われ得る。次いで、接種された植物または植物部を 適切な培養培地で生育し、そして成熟植物に生長させる。 植物細胞が構築されるとき、これらの細胞は、周知の組織培養法（例えば、ア ミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどの必要な成長因子を与えた適切な培養培地 でその細胞を培養することによる）に従って増殖および維持され得る。形質転換 細胞の遺伝子改変植物への再生は、細胞または組織培養物からの植物の再生につ いての公知の方法（例えば、抗生物質を用いて形質転換シュートを選択すること 、および適度な栄養、植物ホルモンなどを含有する培地でシュートを継代培養す ることによる）を用いて達成され得る。 それゆえ要約すると、本発明の非常に好ましい実施態様は、それゆえ、生物に おいてα−アミラーゼの活性を少なくとも部分的に阻害することにより、アミロ ペクチンまたはアミロースを酵素分解する能力を有する生物において特異的還元 糖（すなわちグルコース）のレベルを低減させる方法に関する。 次のサンプルは、ブタペスト条約に基づき、以下の認定された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St Machar Drive,Aberdeen,Scotland,AB2 IRY,United Kingdom）に1994年10 月20日に寄託されている： DH5α-pJK4 寄託番号NCIMB 40691。 このサンプルは、プラスミドpJK4（後述する）を含有するE.coli細菌（DH5α- ）ストックである。 次のサンプルは、ブタペスト条約に基づき、以下の認定された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St Machar Drive,Aberdeen,Scotland,AB2 1RY,United Kingdom）に1994年8月 26日に寄託されている： DH5α-gPAmy 351(寄託番号NCIMB 40682)。 このサンプルは、ジャガイモ（Solanum tuberosum）から単離されたEcoR1 5.5 ゲノムDNAフラグメントを含有するプラスミドpBluescriptを含有するE.Coli細菌 ストックである。EcoR1 5.5フラグメントは、プロモーター領域およびジャガイ モα−アミラーゼ遺伝子の構造遺伝子の５’非翻訳配列の一部を含有する。プラ スミドは、pBSベクター（Shortら[1988]Nuc.Acid.Res.16:7583-7600）のポリリ ンカーにEcoR1 5.5kbジャガイモフラグメントを挿入することにより形成された 。プロモーターはEcoR1での酵素消化によりプラスミドから単離され得、そして 次いで典型的な分離技術（例えばゲル）により抽出され得る。 次に、実施例のみを用いて本発明を説明するが、実施例では以下の図を参照す るべきである。 図１はpIV21およびpEPLのそれぞれの地図である； 図２はAmyZ４クローンのヌクレオチド配列である； 図３はpBKS-プラスミドの制限地図である； 図４はgPAmy351クローンの制限地図である。 図５はAmyZ４クローンのアンチセンスヌクレオチド配列である； 図６はpJK５の制限地図である； 図７はpJK４の制限地図である； 図８は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのグルコースおよびフルクトースレ ベルのグラフを示す； 図９は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのグルコースおよびフルクトースレ ベルのグラフを示す； 図10は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのα-アミラーゼ活性のグラフを示 す； 図11は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのβ-アミラーゼ活性のグラフを示 す； 図12は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのグルコースおよびフルクトースレ ベルのグラフを示す； 図13は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのα-アミラーゼ活性のグラフを示 す； 図14は本発明のトランスジェニックジャガイモならびにコントロールジャガイ モの４℃（冷条件）および12℃（温条件）でのβ-アミラーゼ活性のグラフを示 す；そして 図15はgPAmy 351クローンにおけるプロモーターの配列である（前記参照）。 さらに詳細には、図４はプラスミドgPAmy351の表現図である。強調部分は、ジ ャガイモ(Solanum tuberosum)から単離されるEcoRI-SalIフラグメントである。E coRI-SalIフラグメントは、EcoRIの5.5 kbフラグメント（サブクローンEco 5.5 と呼ぶ）を含み、図面の下部に示された線で示す。EcoRI 5.5 kbフラグメントは 、プロモーター領域およびジャガイモα-アミラーゼの構造遺伝子の５'の非翻訳 配列の一部を含む。以下の制限酵素部位を図４に示す：E:EcoRI、Ha:HaeIII、Sp :SspI、H:HindIII、P:Pvul，S:SalI。さらに推定CAATおよびTATAボックスおよび ATG開始部位を示す。イントロンは白抜きの棒で、そしてエキソンは黒塗りの棒 で示す。Eco 5.5は、pBluescript M13-プラスミドまたはpBSK-プラスミドにクロ ーン化され得る。材料および方法 Solanum tuberosum L．ssp．tuberosum cvs Dianella、Saturna、Bintjeおよ びRecordの塊茎は、Denmark南部のHoleby付近に位置する畑から採収した。４品 種とも全て定着する。Dianellaは、デンプンの生産に用いられ、Bintjeは、食用 のジャガイモとして優れ、そしてSaturnaおよびRecordは、チップ／クリスプ産 業で用いられている。 「Ceralpha」キットおよび「Betamyl」キットは、Megazyme(Aust)Pty.Ltd.，6 Altona Place，North Rocks，NSW 2151，Australiaから入手した。 糖測定キット（スクロース／Ｄ-グルコース／Ｄ-フルクトース）は、Boehring er Mannheimから入手した。他の全ての化学薬品は、Sigma、Merck、Ferak、Difc o Lab.もしくはBDH Chemicals Ltdから入手した。菌株およびプラスミド LBA4404(41)： Agrobacterium tumefaciens株Ach５のストレプトマイシン耐 性の派生体において無力化（disarmed）pTI Ach５プラス ミドp AL4404を含有する。 pBI121： 参考文献(42、43)を参照 pCaMVCN 参考文献44、45を参照 pBR322： 参考文献46を参照 pUC19： 参考文献40を参照 pHC79： 参考文献47を参照培地およびプレート Ｌ-ブロス（LB）培地： １１当たり：５ｇの酵母エキス、５ｇ のNZアミド、５ｇ のNaCl、５ｇのバクト -ペプトン。オートクレーブで処理する。 LB-プレート： LB培地に１ｌ当たり15gのBactoアガーを加える。オートクレーブで処理する。 プラスチックのペトリ皿に注ぐ（25 ml/皿）。 AXI-プレート： LBプレートに１ｌ当たり35mgのアンピシリン、120mg のIPTG（イソプロピルチ オガラクトシド）、40mgのXgal（ジメチルホルムアミドに溶解）を、オートクレ ーブで処理後に加える。［Xgal：５-ブロモ-４クロロ-３インドリル-β-Ｄ-ガラ クトシド。］ Kan-プレート： LBプレートに１ｌ当たり50mgのカナマイシンを、オートクレーブで処理後に加 える。 YMB培地： １ｌ当たり：0.66gのK2HPO4-3H2O。0.2gのMgSO4。0.1gのNaCl。 10.0gのマンニ トール。0.4gの酵母エキス。pH7.0に調整する。オートクレーブで処理する。 液体MBa培地： １ｌ当たり：4.4gのMS塩（MurashigeおよびSkoog basal salt(48)、Sigma）。20 gのスクロース。NaOHでpH5.7に調整する。 固体MBa培地： 液体MBa培地に0.8% Difcoアガーを加える。 MBa co： 固体MBa培地に１ｌ当たり0.5mg のt-Zeatin（トランス異性体、Sigma）および 2.0mg の2,4 D(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、Sigma)を加える。 固体MBb培地： 固体MBa培地に、１ｌ当たり20gのスクロースの代わりに30gのスクロースを加 える。 水： 材料および方法において用いられる水は、使用前に常に蒸留し、そしてオート クレーブで処理した。植物の取り扱い cv Dianella、cv Saturna、cv Bintjeおよびcv Recordのトランスジェニック 系統およびコントロール系統を無菌条件下インビトロでマイクロプロパゲートし た。pJK４もしくはpJK５のいずれかで形質転換した個々のトランスジェニック系 統および非形質転換コントロール系統を増殖チャンバ内のアガー中で無菌に保っ た。 無菌の植物から切断する一つの節（葉を含む）を5.5cmポットに移植し、そし て温室内で覆いをして設置した。植物を強くするために覆いを徐々に除去した（ 20日以上）。インビトロでマイクロプロパゲートしたジャガイモ植物を、およそ 10〜12cmの高さになったときに手で畑に移植した。畑はジャガイモ畑のための一 般的な農地制御の取り扱いを用いて処理した。それぞれの系統（トランスジェニ ック系統か非トランスジェニックのコントロール系統のいずれか）は２または４ 反復で配置した。採収時に、２または４反復で全ての系統由来の全ての塊茎を収 集し、混合し、そして無作為に２つの部分に分けた。１つは暗下４℃（冷保存条 件）、および他方は暗下12℃（温保存条件）に設置した。抽出の手順 個々の塊茎を流水で洗浄し、ふき取って乾燥し、そして塊茎の頂点（tuber ap ex）から塊茎の接着点（attachment）の部分まで（縦方向）の中程から、薄片を 切り出した。薄片を秤量（約20g）し、そしてワーリングブレンダーに37mlカッ プを用いて抽出緩衝液でホモジナイズされる前に直ちに細片に切断した。用いた 抽出緩衝液は、本質的にFan，1975(49)によって記載されたもので、サンプル当 たり0.01M酢酸カルシウムを有する４mlの0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）および、0.0 2gの亜硫酸ナトリウムを有する１mlのH2Oとからなる。 ホモジェネートをミラクロース(miracloth)を介して濾過し、そして濾液を10k rpmで10分間、４℃でSigma 202MK遠心分離器にて遠心分離し、澄明な上清を得た 。 抽出物を２つのチューブに分けた。一方は酵素分析のために、直に-20℃で保 存し、そして他方は糖分析のために10分間煮沸し、そして次いで-20℃で保存し た。酵素活性の測定 α-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ活性の測定のための「Ceralpha」または「 Betamyl」法をそれぞれ用いた。キット（CeralphaまたはBetamyl）内に含まれる 基質は、供給者の指図に従って調製した。基質はCeralphaキット中に、ブロック されたｐ-ニトロ-フェニルマルトヘプタオシド(BPNPG7)、グルコアミラーゼおよ びα-グルコシダーゼを含み、Betamylキット中にp-ニトロ-フェニルマルトペン タオシド(PNPG5)およびα-グルコシダーゼを含む。0.1mlの基質を0.35mlの50mM クエン酸ナトリウム（pH6.5）および0.05mlのジャガイモ抽出物に添加し、そし て30℃で30分間インキュベートした。０、10、20および30分に、0.1mlを取り出 し、そして反応を停止するために0.15mlの停止液と混合した。停止液は、0.5Mグ リシン、２mM EDTAをNaOHでpH10.0に調整したものを用いた。 個々のサンプルをエライサ（Elisa）-プレートに移動し、そして吸光度をエラ イサ-リーダーを用いて405nmで測定した。50mMクエン酸ナトリウム（pH6.5）を 含有する溶液をブランクとして用いた。必要に応じて、ジャガイモ抽出物は、ク エン酸ナトリウム緩衝液中で５、10または20倍に希釈した。 活性はOD405/h/mg抽出タンパク質として表した。個々のサンプルは２連で測定 した。α-アミラーゼアッセイにおいて、放出されたｐ-ニトロフェノールの量は インキュベーション時間に正比例した。β-アミラーゼアッセイの場合について も、最初の10分のインキュベーション後はこれと同様であった。 アミロース加水分解は、I2/KI染色法に従った。250μl の1.2%ジャガイモアミ ロースの0.1M 酢酸ナトリウム（pH７）溶液を50μlの40mg/ml BSAおよび100μl の抽出物とともにインキュベートした。酵素反応は40℃で行った。反応は20μl の３M HClを50μlの酵素反応サンプルに添加することによって停止した。１mlの I2/KI（１：1000に希釈した0.026g/ml I2+0.26g/ml KI）を添加し、そしてアミ ロース の量を620nmで分光測定法で測定した。 タンパク質濃度はBradford(50)に従い、Bio-Radタンパク質アッセイキット(Ca 、USA)を用い、標準物質としてγ-グロブリンを用いて測定した。クロマトグラフィーによる酵素の分離 ジャガイモにおけるデンプンを加水分解する酵素をより十分に研究するため皮 をむいたジャガイモを抽出し、そしてタンパク質をアフィニティークロマトグラ フィーにより、続いてアフィニティーゲル材料に結合するフラクションのゲル濾 過によって分離した。溶出したタンパク質をデンプン関連の基質を加水分解する ために使用し、そして生成物をDionex HPLCで分析した。 100gの皮をむいたジャガイモを100mlの緩衝液（50mM酢酸塩（pH5.5）、20mM D TT）および10gのDowexとワーリングブレンダー中でホモジナイズした。ホモジナ イゼーション後抽出物をミラクロース（miracloth）を介して濾過し、そして濾 液は14,000rpmで10分間、４℃で遠心分離した。 上清を30分間ゆっくりと撹拌することによって、20%(NH4)2SO4で沈殿させた。 沈殿したタンパク質を遠心分離により回収し、そして捨てた。次いで上清をBlue Sepharoseカラムに通塔した。 アフィニティーカラム材料のBlue Sepharose CL-6B（Pharmacia）は、架橋し たアガロースゲルSepharose CL-6Bに色素のCibacron Blue F3G-Aが共有結合した ものである。32mlカラムを用い、50mM Tris（pH6.4）で平衡化した。流速は30ml /hとした。40mlの上清サンプルをカラムに通塔した。非結合タンパク質を64mlの 50mM Tris（pH6.4）で溶出した。次いでアフィニティー材料に結合したタンパク 質を、総量400mlの緩衝液中の０〜0.5M NaClの上昇グラジエントで溶出した。８ mlのフラクションを集めた。全ての操作は４℃で行った。フラクションをα-ア ミラーゼ、β-アミラーゼおよびタンパク質について分析した。 β-アミラーゼ活性を包含するフラクションをプールし、そしてAmicon（メン ブランYM-10）を用いる加圧透析により約５倍に濃縮し、６mlとした。このフラ クションを50mM Tris（pH７）、0.1M NaClで平衡化したPD-10ゲル濾過カラム(Ph armacia)で脱塩した。 200μlのサンプルのフラクションをゲル濾過カラムFPLC Superose12(Pharmaci a)でクロマトグラフした。カラムを50mM Tris（pH７）、0.1M NaClで平衡化した 。ランニング時間は80分であった。サンプルを手動でエッペンドルフチューブに 回収した。タンパク質をUV280nmによって記録した。全体で６回のゲル濾過操作 を行った。ランニングからピークをプールした。サンプルはピーク１からピーク ９のように定義した。生成物の分析 サンプルピーク１からピーク９による炭水化物の加水分解由来の生成物の分析 のために、以下の基質を用いた：マルトペンタオース（８mg/ml）、可溶性デン プン（２mg/ml）およびアミロース（５mg/ml）。酵素反応混合液は200μlの基質 、200μl の50mM酢酸ナトリウム（pH6.5）および100μlの酵素調製物を含有した 。混合液は37℃で20時間インキュベートした。反応は５分間煮沸することにより 停止した。次いで20μlのサンプルをDionex HPLCで分析した。 分析は、電流の検出様式で用いられるパルス電気化学的検出器を備えたDionex 4500iで行った。CarboPac PA1カラム(4×250mm)を用いた。サンプルを以下のグ ラジエントで溶出した：緩衝液 ： グラジエント： 糖の測定 糖の分析は、煮沸したジャガイモ抽出物（前述参照）を用いて行い、そしてBo ehringer Mannheimからのスクロース／Ｄ-グルコース／Ｄ-フルクトース試験キ ットを供給者の指示に従って用いた。反応はエライサ-プレートにおいて、キッ トで推薦される方法に比べて全成分の容積を12で分割することにより３回繰り返 して行った。エライサ-リーダーを340nmで測定するために用いた。 プラスミドの調製はEP-B-0470145に記載のとおりであった。特に、小規模での プラスミドDNAの調製は以下のように行った。 プラスミドを有する細菌株を、添加したアンピシリン(35μg/ml)を含む２mlの L-Broth(LB)培地中で一晩増殖させた。操作を1.5mlのEppendorfチューブ内で行 い、そして遠心分離をEppendorf遠心分離機中で４℃で実施した。一晩培養物由 来の細胞を２分間遠心分離することにより採集し、１mlの10mM Tris-HCl(pH8.5) 、50mM EDTAで洗浄し、そして２分間遠心分離した。ペレットを150μlの15％ス クロース、50mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM EDTAに、ボルテックスして懸濁した。5 0μlの４mg/mlのリゾチームを加え、そして混合物を30分間室温で、そして30分 間氷上でインキュベートした。400μlの氷冷した水を加え、そして混合物を５分 間氷上に置き、70〜72℃で15分間インキュベートし、そして15分間遠心分離した 。上清に75μlの5.0M過塩素酸ナトリウムおよび200μlのイソプロパノール（イ ソプロパノールは室温で保存した）を加え、そして混合物を15分間４℃で遠心分 離した。 ペレットを300μlの0.3M酢酸ナトリウム中に懸濁し、そして２〜３容量の冷エ タノールを加えた。沈殿は、−80℃で５分間または、−20℃で一晩のいずれかで 保存し、５分間遠心分離し、バキュームで２分間乾燥させ、そして20μlの水に ペレットを再溶解することにより達成した。収量は５〜10μgのプラスミドDNAで あった。 プラスミドDNAの大規模調製は、単純に小規模調製を10倍にスケールアップし て達成した。15ml corexチューブ中で作業し、全ての成分を10倍スケールアップ した。遠心分離をSorvall冷却遠心分離機中で４℃で行った。上記からの変更の みを以下に示す。70〜72℃のインキュベーションの後は、遠心分離は17,000rpm で30分間であった。イソプロパノールを加えた後、および冷エタノールを加えた 後は、遠心分離は17,000rpmで15分間であった。最終的なプラスミドDNAのペレッ トを水に懸濁し、そしてEppendorfチューブに移し、次いで短くスピンして残渣 を取り除いた。上清を0.3M酢酸ナトリウムに調整し、そして２〜３容量の冷エタ ノールを加えた。ペレットを40μlの水に再懸濁した。通常収量は20〜28μgのプ ラスミドDNAであった。 非常に純粋なプラスミドDNAを得るためには、スケールアップした方法由来の2 00〜300μgの単離したプラスミドDNAを、CsCl勾配上でバンド化した。固形のCsC lを水と混合し(１：１w/v)、そして0.2mg/mlのエチジウムブロミドを加えた。こ の溶液をクイックシールポリアロマーチューブおよびプラスミドDNA（固形のCsC lと混合した(１：１w/v)）に注ぎ込んだ。チューブを満たし、シールし、そして Beckman VTI 65ローター中で48,000rpmで16〜18時間、15℃で遠心分離した。遠 心分離はブレーキを用いないで停止させた。バンド化されたプラスミドDNAをシ リンジを用いてチューブから引き抜き、そしてエチジウムブロミドをCsCl飽和イ ソプロパノールで７〜８回抽出した。CsClは10mM Tris-HCl(pH8.0)、１mM EDTA 中で48時間、３回緩衝液をかえながら透析により取り除いた。DNAは、0.3M酢酸 ナトリウムに調整し、そして２〜３容量の冷エタノールを加えることにより沈殿 させた。 E.coli からの小規模のプラスミドの調製の後に、通常LiCl沈殿を行って、DNA 溶液からRNAを取り除いた。小規模で調製したプラスミドDNAを、100μlの蒸留水 に溶解した。１容量の５M LiClを加え、そして混合物を−20℃で30分間インキュ ベートし、その後12,000rpmで15分間、４℃で遠心分離した。上清を新たなエッ ペンドルフチューブに移し、そして２容量のTE緩衝液または水を加えた。2.5容 量の96％エタノールでの沈殿は、−80℃で10分間または−20℃で一晩のいずれか で保存することにより達成した。DNAは、12,000rpmで15分間、４℃で遠心分離す ることにより沈殿させ、バキュームで２分間乾燥させ、そして18μlのTEまたは 水に再溶解させた。 ゲノムジャガイモDNAを、Dellaportaら（1983）および引用文献51の報告され た論文に従って単離した。pEPL および pIV21(DW2t)の構築 制限酵素による切断、ゲル電気泳動、フラグメントの単離、サブクローニング および配列決定を、EP-B-0470145など(1989)(52)に概説されたように行った。 pEPL を、CAT 遺伝子がPstI 切断によって除去された pCaMVCN(44,45)から構 築する。小さなリンカー(リンカー：PstI-BamHI-BaII-PstI)をこのプラスミドPs tI部位に挿入する。得られたプラスミドをpLise(pL)と呼ぶ。PL をHincII とBgI II とで切断し、得られる 35Sプロモーターと NOSターミネーターとを含むフラ グメントを EcoRV と BgIIIとを用いて切断される別の pLプラスミドに、クロー ニングする。EcoRV および HincIIは共に、平滑末端化部位である。得られる構 築物を、pEnhanced-Lise(pEL)と呼ぶ。pEL は、それが250 bpのプロモーターの 上流配列の縦列重複を持つ変異体 35S プロモーターを含む点で pCaMVCN と本質 的に異なっている。変異体 35S プロモーターは、天然の 35S プロモーターより も約10倍高い転写活性を有する(53)。 pEL をPstIと BgIIIとで切断し、それによって NOSターミネーターを除去し、 そして代わりに CaMV ターミネーター(DW2t)を挿入する。最後に、リンカー(Pst I-BamHI-SmaI-SacI-SaII-SphI)を、増強されたE35Sプロモーターと CaMV ターミ ネーターとの間に存在する PstI 部位に挿入する。このプラスミドは pEPLと呼 ばれる（図１を参照）。 pIV21 を、PvuIIとBgIIIとの切断物が pBR322(46)配列ではない配列の主要部 分を除去されている pHC79(47)より構築する。ストレプトマイシン耐性を有する PvuII-BgIII フラグメント(SpRSmR,R702)を連結した。得られたプラスミドを p IV1 と呼ぶ。pIV1 の HindIIIと EcoRI との切断物から、非pBR322 配列の残存 物を取り除いた。pUC19(40)の EcoRI/HindIIIポリリンカーを、pIV1中の HincII /EcoRI部位の間に挿入した。このプラスミドを pIV10と命名する。pBI121由来の 800bpの 35Sプロモーター(BamHIとHindIIIとで切断された)を、pIV10中の xbaI -HindIII部位にクローニングし、それによってプラスミド pIV21を作製した。最 後に、pEPL 由来の約230bpの BamHI/EcoRI フラグメント（DW2終結を有する）を pIV21 に挿入し、それによって図１に示されるpIV21(DW2t)プラスミドを作製し た。DNA のハイブリダイゼーション ゲノムジャガイモ DNAまたはプラスミド DNAを適切な制限酵素で切断し、Hybo nd N または N+ メンブレン(Amersham International)を用いたサザントランス ファー(Southern)のために使用し、そして供給者の説明書(55)に従ってハイブリ ダイズした。Agrobacterium tumefaciens の形質転換 LBA 4404 株を、100mg/ml のリファンピシン（Sigma）および 500 mg/ml のス トレプトマイシン(Sigma)を含む YMBプレート(pH 7.0)にて維持した。2.5 ml の LB培地(pH 7.4)にこの細菌を接種した。懸濁液を振盪培養機中で 28℃にて300 〜340 rpmで 24時間増殖させた。次いで、この懸濁液をLBで 1:9 に希釈し、そ してさらに 2〜3時間、28℃、300〜340rpm でインキュベートした。0D が0.5〜 １のとき、25 ml の細胞アリコートを 50 ml の遠沈管に回収し、10,000 rpm、 ４℃で５分間冷却遠心分離した。遠沈管を氷上に置き、ペレットを0.5 ml の20 mM CaCl2に再懸濁した。この再懸濁した細胞の 0.1 ml アリコートを、1 ml ク リオチューブ(cryotube)にて、液体窒素中で瞬間冷凍し、そして−80度で保存し た。 凍結融解法（56）を用いた形質転換を以下のように行った： LBA 4404 コンピテントセルの溶液0.1ｍｌCaCl2アリコートを、氷上で解凍し 、そして１μg のプラスミド DNA を添加した。混合物を、37℃で５分間インキ ュベートし、１ml の LB（pH 7.4）を添加した。室温で４時間振とう（100rpm） しながらインキュベーションを行い、続いて10,000rpm、４℃で30秒間遠心分離 した。ペレットを、100μlの LBで再懸濁し、50 mg/l のカナマイシン(Sigma)を 含む YMB プレートに播種した。 プレートを、28℃で48時間インキュベートするかもしくはコロニーが適切なサ イズになるまでインキュベートした。これは選択の第一ラウンドであった。カナ マイシン耐性を付与する NPT II遺伝子を含むプラスミドで形質転換した細菌の みが、カナマイシンプレート上で生存可能である。 選択の第２ラウンドのために、６つの得られたコロニーを、100mg/ml のリフ ァンピシン、500mg/lのストレプトマイシン、および 50mg/l のカナマイシン を含む YMB プレートに移した。LBA 4404は、リファンピシンおよびストレプト マイシンに耐性であり、このプラスミドは、カナマイシンに対する耐性を付与す る。このプレートを、コロニーが適切なサイズに達するまで（約４〜５日）28℃ でインキュベートした。 コロニーをプラスミド含有量について試験した。このコロニーのプラスミド調 製物を作成し、そして DNA を適切な制限酵素で切断し、１％アガロースゲル上 で電気泳動を行い、プラスミドと挿入フラグメントが適切な正しいサイズを有し ていることを確認した。切断した DNA を、Hybond N+メンブレンにブロットし、 適切に放射性標識したプローブ（プラスミドDNAフラグメントあるいは挿入物の フラグメント）とハイブリダイズさせた。 形質転換した LBA 4404 を、−80℃で保存した。100mg/lのリファンピシン、5 00 mg/lのストレプトマイシン、および 50 mg/lのカナマイシンを含む 2mlの LB 培地にこの細菌を接種し、28℃で48時間振とうしながら(300〜340rpm)インキュ ベートした。その懸濁液を滅菌した35％グリセロールで1:1に希釈し、クリオチ ューブにチューブあたり800μl分注し、−80℃で保存した。植物形質転換 形質転換した LBA 4404 細菌の培養物を、2 ml の YMB(pH 7.0)にこの細菌を 接種し、28℃で24時間インキュベートすることにより作成した。懸濁液を1:10に 希釈し、さらに18時間インキュベートした。細菌を、10,000rpm、４℃で10分間 遠心分離し、そしてペレットを 2.5mlの 2mM 硫酸マグネシウムで２回リンスし 、液体 MBa中に、OD660nmが0.5になるよう再懸濁した。 形質転換に使用したジャガイモ植物材料(plant material)を、2μM の STSを 添加した MBa 培地でインビトロで維持した(57,58)。先端シュートおよび節の増 殖も行い、葉が大きければそれらを取り除いた。80 mlの培地を含む容器につき ５つのシュートを25℃で成長させ、そして継代培養の30〜35日後、節を形質転換 に用いた。 微小増殖(micropropagate)した植物の茎を、節間（これらは移植片が約４mmの 長さであるよう分割され得る）のみを使用するために、節のちょうど上と下で 切断した。この移植片を、細菌の懸濁液に30分間浮かべ、濾紙上にブロットして 乾燥し、同時培養プレート（MBa co）に移した。移植片を、液体 MBa で湿らせ た濾紙で覆い、そしてプレートを布で３日間覆い25℃で放置した。次いで移植片 を、800 mg/lを含有する液体 MBa で洗浄した。1 mlあたり２つの移植片を18時 間振盪し、次いでブロットして乾燥し、そして選択培地に移した。 選択培地は、１リットルあたり 50mg のカナマイシン、800mg のカルベニシリ ン(Duchefa)、0.1 mgの GA3（ジベレリン酸、Sigma）、および1 mg のt-ゼアチ ンを添加した固体 MBb培地であった。カルベニシリンを添加して残存するアグロ バクテリアを殺した。 選択培地を、３週間ごとに継代培養した。ジャガイモ全植物の再生 継代培養により１cm以上になった移植片由来のシュートを回収し、400 mg/lの カルベニシリン、2μM のSTS、および 0.5 mg/l のt-ゼアチンを含む固体 MBa培 地に移した。約２週間後、シュートを根形成培地に移した。また、根形成培地は 、2μM STSを添加した固体MBa培地である。 5 μM STS ストックを、７ml の水に溶解した 0.19 gのNa2S2O3-5H2O、および 10.19 mgの AgNO3から作成し、そして濾過滅菌した。 約２週間後、シュートは根を形成し、土壌に植え付けられる状態であった。 苗木を微温水でリンスして、残りの培地を取り除き、TKS 2 instant sphagnum (Flora Gard,Germany)を入れた小さな鉢に植え付けた。苗木は植え付けの間湿気 を保ち、その後これに給水した。鉢を、湿度100％で21〜23℃のプラスチック製 の「テント」に、苗木が土壌に根付くまで置いた。その後、テントを取り除き、 植物に定期的に給水した。 ４週間の成長後、苗木を、大きい鉢（直径27 cm）に植え換え、16時間明で22 ℃、および８時間暗で15℃の成長チャンバーに移した。植物が萎えたとき、塊茎 を回収した。β−グルクロニダーゼ（GUS）活性の組織化学的位置測定 組織を、かみそり刃によって小片に切断し、X-gluc(X-gluc:5-ブロモ-4-クロ ロ-3-インドリル-β-グルコロニド)溶液に置いて小片を覆った。X-gluc 溶液は 、0.1 M NaPO4(pH 7.0)、１mM K3(Fe(CN)6)、0.1 mM K4(Fe(CN)6)-3H2O、10 mM Na2 EDTAおよび３％スクロースを含む緩衝液に 50 mg の X-gluc を溶解した溶 液である(59)。 これらの部分を X-gluc 中で37℃で２〜12時間インキュベートした。蒸発を防 ぐよう注意した。X-gluc を除去し、そして96％エタノールを組織部分に添加し てクロロフィルおよび他の色素を抽出した。エタノール中でのインキュベーショ ンは、５℃で一晩行い、翌日組織を２％スクロース溶液に移し、約１時間後に解 剖顕微鏡下で検査した。統計分析 両方の貯蔵温度における個々の糖含量と貯蔵期間中に測定された酵素活性との 間の有意差を調べるために、一因子分散分析を行った。 統計分析をSAS協会からのプログラムJMPRバージョン２を使用して行った。JMP は、AppleRMacintoshR用の統計視覚化ソフトウェアである。バイナリープラスミドpJK4およびpJK5の構築 ジャガイモα-アミラーゼのコード配列は、プラスミドpAmyZ4由来のものであ る（EP-B-0470145の詳細な説明を参照のこと）。簡単に述べると、pAmyZ4は、40 7アミノ酸長のジャガイモα-アミラーゼ前駆体をコードし、そして、さらにプラ スミドpBSK-のポリリンカーのEcoRI部位に位置する149bpの5'非翻訳配列および2 01bpの3'非翻訳配列を含んでいる（ジャガイモAmyZ4センス配列については図２ を参照のこと）。図３のpBKS-のマップを参照のこと。このcDNAクローンを以下 でのように２つのアンチセンスクローンを調製するために使用する。 α-アミラーゼアンチセンス構築物を、SacIおよびEcoRVでpAMYZ4 cDNAクロー ンを切断することによって作製した。次に、この1640bpのフラグメントをSmaIお よびSacIで切断したpIV21(DW2t)プラスミドにサブクローニングし、pIVZ4Sac-Ec oプラスミドを作製した。これは、α-アミラーゼをコードする配列を35Sプロモ ーターの下流およびDW2tターミネーターの上流にアンチセンス方向に配置してい る（アンチセンス配列については図５を参照のこと）。pIVZ4Sac-Ecoの部分的な HindIII切断は、アンチセンスα-アミラーゼおよびDW2tターミネーターが続く35 Sプロモーターを含むおよそ2580bpのフラグメントを遊離させる。このフラグメ ントをHindIIIで切断したpBI121ベクターにサブクローニングし、そして得られ るバイナリープラスミドをpJK5と名付ける（図６を参照のこと）。 もう一つのα-アミラーゼアンチセンス構築物を、pAMYZ4由来のSacIおよびEco RVフラグメントを使用して再度作製したが、今回は、このフラグメントをSmaIお よびSacIで切断したpEPLプラスミドにサブクローニングする（pEPLプラスミドの 構築については材料と方法を参照のこと）。これは、強化された35Sプロモータ ー(E35S)の下流およびDW2tターミネーターの上流にアンチセンス配列が配置され ている。このプラスミドをpEPLZ4Sac-Ecoと名付け、そしてE35Sプロモーター、 アンチセンスジャガイモ配列およびDW2tターミネーターを含む部分的なHindIII フラグメントをさらに、HindIIIで切断したpBI121中にサブクローニングし、そ の方法でバイナリープラスミドpJK4を作製した。図７を参照のこと。 構築物pJK4およびpJK5のDNAをE.coli JM109細胞から精製し（プラスミド単離 、材料と方法を参照のこと）、そしてpJK4中の挿入物の特異的な方向を35S配列 の-90位の前方の51bpをプライムする(prime)プライマーを使用した配列決定によ り確認した。ジャガイモ植物の形質転換および生産 pJK4およびpJK5構築物の適切なコントロール試験の後、材料と方法で説明した ように、pJK4およびpJK5をAgrobacterium LBA4404株に形質転換した。材料と方 法で記述したように、形質転換されたAgrobacteriaを用いて、Dianella,Satuma, RecordおよびBintje品種のジャガイモ茎切片を形質転換した。 得られた各植物小体由来の葉をGUS試験し（材料と方法を参照のこと）、そし てポジティブであれば、次に、植物をポットに移し、22℃で16時間の明期および 15℃で８時間の暗期の生育室で生育させた。ポット生育植物由来の塊茎をトラン スジェニック状態を確認するために同様にGUS試験し、その後、ゲノムDNAを材料 と方法に記述したように単離した。 表１は、40個の独立したトランスジェニックジャガイモ植物の組み込まれたコ ピーの分布を示す。ゲノムDNAをそれぞれの植物から単離し、そしてHindIIIで切 断した。HindIIIは、GUS遺伝子が完全である全ての構築物中のGUS遺伝子の一方 の末端で、そしてGUS遺伝子のもう一方の末端（例えば図６参照）でT-DNAのレフ トボーダーを切断する。 GUS遺伝予を含むpBI121由来のSstI-BamHIの切断フラグメントとのハイブリダ イゼーションおよび、その後のそれぞれのレーンでのポジティブバンド数の計測 により、組み込まれたコピー数を十分に予測する。組み込まれたアンチセンスα -アミラーゼ配列で形質転換されたジャガイモ植物（カナマイシン上で生育し、 そしてGUSポジティブな塊茎を示す）は、野外試験に対するミクロ繁殖(micropro pagation)のために選択された。野外試験のための植物の取り扱いについては、 材料と方法を参照のこと。 表２と表３は、それぞれ1993年と1994年の野外試験のために選択された独立し たトランスジェニック系統の数を示している。 全てのインビトロでミクロ繁殖した形質転換ジャガイモ植物の葉をGUS活性で 染色した。その後、この結果を、野外生育植物由来の葉のGUS染色活性と比較し た。これらの結果の比較により、個々のジャガイモ系統は典型的であり、そして 、葉においてGUS遺伝子を安定に発現していることが示された。さらに、両方の 生育室トランスジェニック植物ならびに野外生育植物との注意深い観察により、 安定に組み込まれた構築物は、明らかにトランスジェニック植物の表現型に影響 し ないことが示される。野外または生育室のトランスジェニック植物または非形質 転換コントロール植物間で、外観における明白な差は見られなかった。 構築物（pJK4およびpJK5）が、ジャガイモα-アミラーゼ配列の前方に支配的 な構成的な35Sプロモーター（53）を含んでいても、インビボAmyタイプ１または Amyタイプ3/4遺伝子のいずれかをコードする遺伝子はジャガイモの葉において発 現しない。このことは、葉でのα-アミラーゼタイプ１および3/4のセンスメッセ ンジャーRNAの明らかな欠損による葉の代謝における問題を引き起こさない。 要約すると、作製された構築物pJK4およびpJK5は、既に周知の存在するジャガ イモ品種に望ましくない影響を生じなかった。このことは、本発明の活用には重 要である。トランスジェニックジャガイモ植物は、最初に形質転換された特定の 品種（Satuma、Record、DianellaまたはBintje品種、材料と方法を参照のこと） のようにふるまい、そして、似ている。従って、トランスジェニック植物は表現 型の点で典型的であった。1993 年と1994年に採取した塊茎を用いた貯蔵実験 28個の独立したトランスジェニック系統（1993年野外試験の４回の繰り返しに おいて）および40個の独立したトランスジェニック系統（1994年野外試験の２回 の繰り返しにおいて）からの野外生育塊茎を、４〜６ヶ月間、暗所で、４℃およ び12℃の両方で貯蔵した。２週間毎に、各系統および各貯蔵温度からの、３また は５個の塊茎（少ない場合には２個の塊茎）を1993年野外試験貯蔵物から抜き取 った。次に、抜き取った塊茎を材料と方法中の「抽出手順」で説明したように処 理した。1994年の野外試験貯蔵物から選別された系統を、貯蔵温度あたり3-5個 の塊茎を抜き取り、そしてこれらを上記のように処理した。1993 年野外試験由来の貯蔵塊茎の糖分析 糖分析を材料と方法で述べたように行った。それぞれ一個の塊茎を、二糖であ るスクロース（フルクトースの一分子に結合した一つのグルコースから構成され る）、グルコースおよびフルクトースの含量について分析した。これらの糖（お よび特に還元リン酸化糖のグルコースおよびフルクトース）を測定するために使 用したキットは、塊茎抽出物中の総量を測定する。二つの系統（トランスジェニ ックRecordおよびトランスジェニックBintje）は、対応するインビトロでミクロ 繁殖した系統、非形質転換コントロール系統と比較して有意に低いレベルの還元 糖を示した。この時、塊茎α-アミラーゼをアンチセンスした可能な効果は、28 個の独立したトランスジェニックジャガイモ系統のうち2個で見られ得る。この 観察された頻度は、（60）で観察された頻度とよく対応している。（60）におい て、ジャガイモウリジンジホスホネートグルコースピロホスホリラーゼ酵素をア ンチセンスする構築物で形質転換された80個の独立したジャガイモ系統うち４個 では、特定のメッセンジャーRNAレベルが明らかに減少していることが示されて いる。トランスジェニックBintje系統（K125-2.1と呼ぶ）で得られた結果のみを 、以下の段落で概説して述べる。４℃および12℃貯蔵後のトランスジェニックK125-2.1およびコントロール系統の 塊茎における還元糖のレベル それぞれ４℃および12℃貯蔵後の、トランスジェニックBintje系統K125-2.1（ pJK5で形質転換された系統（材料と方法を参照のこと））および非形質転換Bint jeコントロール系統のそれぞれの個々の還元糖（グルコースおよびフルクトース ）のレベルを図8Aおよび8Bに示す。K125-2.1およびBintjeコントロールの両方か ら抜き取った塊茎は、12℃貯蔵後に抜き取った塊茎と比較して４℃での貯蔵後で は、還元糖を蓄積していることは図から明らかである。それぞれの系統と貯蔵温 度からの５つの塊茎を、指示された日付で抜き取り、そして個々に材料と方法で 説明したように分析した。抜き取った５つの塊茎の平均還元糖含量を図８に示す 。糖含量の変化は、例えば、個々の植物間より、他の人によっても野外生育物で 観察された(22,23)ように、塊茎間で非常に大きかった。従って、全ての結果を 統計分析で確認した。その時、４℃で貯蔵した塊茎における還元糖のレベルは、 予想されたとおり、12℃で貯蔵した塊茎と比較した両系統で有意に高い。しかし 、BintjeコントロールおよびK125-2.1とを比較した場合、正確なレベルにおいて 差がある。図8Aおよび8Bの点線は、ジャガイモ塊茎をフレンチフライ（チップ） を作るために使用するべき場合、ジャガイモ塊茎が含み得る還元糖含量の上限を 示 す（5mg/g塊茎生重量、8）。この時、コントロールBintje系統またはK125-2.1系 統からの塊茎のどちらも、４℃貯蔵後、チップ/クリスプに使用することができ なかった。 12℃で貯蔵した両方の系統からの塊茎はチップ/クリスプに使用できる。 クリスピング（チップ/クリスプ作製）に使われるジャガイモ塊茎の還元糖の 上限含量を図8Aおよび8Bに破線で示している（2.5mg/g塊茎生重量,8）。ジャガ イモBintje品種は、よくテーブルポテトとして使われ、そしてフレンチフライ作 製に使われる場合がある。新ジャガイモの季節のごく初期にだけ、Bintjeをチッ プ/クリスプ作製用に使用し得る。この期間は、普通10月よりかなり前であり、1 0月にBintje品種から作られたチップ/クリスプは、暗褐色であり、そして味が悪 い。この理由は図８Bにはっきりと示されており、コントロールBintje系統から の塊茎は、非常に高すぎるレベルのグルコースおよびフルクトースを含むからで ある。10月から１月（採取時期）に12℃で貯蔵した塊茎でも同様である（カーブ は破線より上であるが、フレンチフライ限界である点線より下である）。これと は対照に、形質転換Bintje系統K125-2.1は、12℃貯蔵後、この系統をフレンチフ ライだけではなくチップ/クリスプ作製に使用するのに明らかに十分低い還元糖 含量をもつ塊茎を生じた（図8Aを参照のこと）。 それぞれ4℃および12℃貯蔵後のK125-2.1およびコントロールBintje塊茎の還 元糖レベルの比較により、12℃貯蔵後だけでなく、4℃貯蔵後のK125-2.1はコン トロールBintje塊茎よりも有意に低い還元糖レベルを有することが示される。こ の比較を、図9A（4℃貯蔵から抜き取った塊茎の還元糖含量の比較）および図9B （12℃貯蔵から抜き取った塊茎）に示す。統計分析（材料と方法を参照のこと） の結果を表４に示す。 有意性試験は、Students t検定を使用して行い、個々の変数項の下で各系統対 を比較した。 「還元糖」と名付けられた行は、K125-2.1からの34個の個々の塊茎およびコン トロールBintjeからの29個の塊茎を示された還元糖の含量について分析した結果 である。平均±標準誤差が示され、そして１つ、２つまたは３つの星は有意性の レベルを示す。K125-2.1からの塊茎の還元糖の量は、同じ貯蔵温度でのコントロ ールBintjeからの塊茎と比較して４℃および12℃貯蔵の両方より有意に低い(P>0 .001)。 ４℃および12℃で貯蔵後のK125-2.1の塊茎およびコントロールBintje塊茎のα -アミラーゼ活性 塊茎抽出物におけるαアミラーゼ活性を、材料および方法に説明したように測 定した。酵素活性を塊茎から製造した抽出物において測定し、塊茎から糖含有量 （上記を参照）も測定した。従って、サンプリング期間および日付は、糖の日付 （sugar date）（図８および９）に対応する。図10では、α-アミラーゼ活性がO D405nm/時間/mgタンパク質として示され、そして各点はほとんどの場合、独立し て分析された５つの塊茎の平均値を示す。 α-アミラーゼ活性（megazymeキットを用いた）は、貯蔵されたジャガイモの 塊茎において、Cochraneら（22、23）により既に測定されているが、しかし、こ れらの結果は、用いられた抽出手順が異なるので本明細書に示す結果と直接比較 できない。本明細書に示されるデータが抽出タンパク質１mgあたりの活性として 示されているのに対して、Cochraneにより得られたデータは、塊茎の乾燥重量１ ｇあたりの活性として示されており、そして最後に、抽出アッセイ条件（抽出物 量、インキュベーション緩衝液、pHなど）も異なる。 図10および表５は、K125-2.1由来の塊茎（平均で）が、４℃で貯蔵（P>0.001 ）および12℃で貯蔵（P>0.01）の両方の後で、コントロール系統Bintjeと比較し て有意に低いα-アミラーゼ活性を有することを示す。図10Ａおよび表５のα-ア ミラーゼ「４℃貯蔵」の行は、４℃で貯蔵した塊茎の結果を示し、そして、図10 Ｂおよび表５のα-アミラーゼ「12℃貯蔵」の行は、12℃で貯蔵した塊茎の結果 を示す。 要するに、K125-2.1の塊茎は、塊茎を４℃で貯蔵するのか、または12℃で貯蔵 するのかによらず、コントロールBintje系統よりも有意に低減した糖レベルを有 するだけではなく、コントロール系統と比較して有意に低いα-アミラーゼ活性 を有する。 ４℃および12℃で貯蔵後のK125-2.1およびコントロールBintjeの塊茎のβ-ア ミラーゼ活性 β-アミラーゼを、α-アミラーゼと同じ塊茎抽出物において測定した。β-ア ミラーゼの決定のための抽出方法は、材料および方法に説明される。糖の測定に ついてのように、塊茎間でより大きな変動が見られ、従って、個々に分析した５ つ（多くの場合）の塊茎の平均値は、図11ＡおよびＢにおいて点で示される。図 11Ａは、K125-2.1およびコントロールBintje系統から得られた４℃で貯蔵したサ ンプリングした塊茎の結果のβ-アミラーゼ活性を示す。この結果から得られた 統計分析は、K125-2.1またはコントロールBintjeの塊茎からのβ-アミラーゼ活 性において有意差が存在しないことを示す（表５のβ-アミラーゼ「４℃貯蔵」 の行を参照のこと）。図11Ｂおよび表５のβ-アミラーゼの「12℃貯蔵」の行に 示すのと同様に、12℃貯蔵からサンプリングした塊茎においてK125-2.1とコント ロールBintjeとの間のβ-アミラーゼ活性に有意差は存在しない。そのうえ、形 質転換していないコントロールBintjeと比較してトランスジェニックBintje系統 であるK125-2.1で見られるα-アミラーゼ活性の低減は、α-アミラーゼアンチセ ンス構築物（pJK5）による特異的な阻害の結果であり、何らかの粗い（coarse） 制御機構の結果ではない。なぜなら、β-アミラーゼがコントロール系統と同様 にとどまっているにもかかわらず、α-アミラーゼの活性のみが影響されたから である。 個々の還元糖（グルコースおよびフルクトースならびにスクロース）を測定す ることにより、全く新しくかつ予期しない結果が明らかになった。これらの知見 をここで考察する。 アンチセンスで阻害されたα-アミラーゼ塊茎のグルコースレベルだけが影 響され、フルクトースは影響されない ４℃貯蔵および12℃貯蔵の両方のK125-2.1とコントロールBintjeの塊茎との間 の個々のグルコースレベルおよびフルクトースレベルを比較することにより、ト ランスジェニックの塊茎において特異的にグルコースレベルだけが低減すること が示された。 図13Ｂは、K125-2.1およびコントロールBintjeの塊茎の両方のフルクトースレ ベルを示す（記した日付でサンプリングし、多くの場合、個々に分析した５つの 塊茎の平均値を示す）。４℃貯蔵または12℃貯蔵のどちらからサンプリングされ たかによらず、K125-2.1とコントロールBintjeとの塊茎の間に有意差が見られな いことが図から明らかである（表３「フルクトース」の行も参照のこと）。一方 、図12Ａで示すように、K125-2.1およびコントロールBintjeの塊茎の特異的グル コースレベルには大きな差が見られる。 12℃で貯蔵された塊茎において、K125-2.1はコントロールBintjeと比較して有 意に低いグルコースレベルを示し（P>0.001）、これはコントロールと比較して7 0％の減少（平均で）に達する。 さらに、コントロールBintjeと比較して、４℃で貯蔵されたK125-2.1の塊茎の 還元糖レベルにおいて以前見られた減少は、グルコースレベルにおいてのみであ る（図12Ａを参照のこと）。 K125-2.1における４℃貯蔵後の低いグルコースレベルは、コントロールBintje 塊茎のレベルより有意に（P>0.001）低く、そしてここで減少は（平均で）40％ であり、一方、フルクトースレベルは同じのままである（表３、４℃貯蔵の行「 グルコース」および「フルクトース」を参照のこと）。 従って、本発明の構築物による結果は、非常に驚くべきである。なぜなら、フ ルクトースはスクロースを作るための十分な基質を供給するためにグルコースに 変換され、ついでスクロースは等量のグルコースとフルクトースとに分解される ことが期待されたであろうからである。特に４℃貯蔵のトランスジェニックBint je系統においてフルクトースのプールが影響されないらしいが、一方、フルクト ースに影響しないでグルコースが40％減少するという事実は、α-アミラーゼ酵 素が４℃または12℃のいずれかで貯蔵されたジャガイモの塊茎の特異的なグルコ ースレベルに直接関与することを明らかに示す。 酵素活性のさらなる特徴付け ジャガイモ由来のデンプン分解酵素活性をさらに徹底的に特徴付けるために、 ジャガイモを抽出し、そして酵素をアフィニティークロマトグラフィー（Blue S epharose CL-6B）によって部分的に分離した。アフィニティーカラムに結合した タンパク質を、ゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに分離した結果、９つの ピーク（ピーク１からピーク９）が得られた。精製工程については、材料および 方法で詳細に述べる。 デンプン関連多糖の加水分解を、一部はアミロースを基質としてI2/KI染色法 で、そして一部はα-アミラーゼおよびβ-アミラーゼについてp-ニトロフェニル オリゴ糖を基質として用いて（Megazymeキット）分光測光法により分析した（材 料および方法を参照のこと）。結果を表６に示す。 表６における酵素活性は、ピーク３およびピーク７がα-アミラーゼ活性を含 むが、ピーク２が主にβ-アミラーゼ活性を含むことを示す。これらの３つのピ ークはまたアミロースを分解し、ここで最も高いデンプン分解活性（Amylytic a ctivity）はピーク３およびピーク７に見い出される。 Dionex HPLCにおける最終生成物の解析は、ピーク７がアミロースの加水分解 からグルコースおよびマルトースを生産することを示した。同様の結果がピーク ３においても見られたが、しかしグルコースおよびマルトースの増加はピーク７ についてよりもずっと少なかった。これらの最終生成物は、残りのピーク画分に ついては検出されなかった。ピーク７において単離されたデンプン分解活性は、 アミロースを基質としたときに最終生成物であるグルコースおよびマルトースを 蓄積するのみであり、可溶性デンプンまたはマルトペンタオースを基質として用 いたときには蓄積しない。反対に、ピーク３はマルトペンタオースを、マルトー ス、マルトトリオースおよびマルトヘキサオースに分解する。グルコースは検出 されなかった。 最終的にピーク７において分離された酵素活性であるα-アミラーゼが、アミ ロースからグルコースおよびマルトースを生成する。しかし、ピーク３からの酵 素活性もまたα-アミラーゼを含むが、さらに例えば不均化酵素のような他の夾 雑物も含む。 これらの結果は、ジャガイモ由来のα-アミラーゼがアミロースをグルコース およびマルトースに加水分解することを明らかに示す。さらに、これらの結果を トランスジェニックK125-2.1 Bintje系統で得られた結果と組み合わせて考察す ると、ジャガイモの塊茎のα-アミラーゼが塊茎のグルコース含量に直接影響し 、そして酵素の生成を一部阻害することによってグルコースの十分な減少を達成 し得ることを示す。これにより、グルコース総量の驚くべきかつ著しい減少が導 かれる。従って、本発明は、ポテトチップ（chip）およびポテトフライ、および ジャガイモのソテーおよびクリスプ（crisp）産業に有用な新しいジャガイモ系 統を提供する。 低い温度（例えば４℃）で貯蔵したジャガイモの塊茎における還元糖レベルは 、温暖温度（例えば12℃、例えば図８ＡおよびＢを参照のこと）で貯蔵した塊茎 において見られる糖レベルよりも10倍まで高い。従って、塊茎を温暖貯蔵で維持 するならば、温暖貯蔵した塊茎において70％ほど（そして、おそらくより強いア ンチセンス効果によってさらに）グルコースレベルを減少させることにより、多 く の既に公知の品種を、チップおよび/またはクリスプのいずれかの品種に変換し 得る。よい品種の選択には糖含有量以外（例えば、病気に対する耐性、収穫量、 芽の深さ、皮の色、塊茎の形など）にも他の多くの特性が重要であり、そしてこ れらの特性は必ずしも低い還元糖含有量と同時に生じるわけではないために、こ れは産業界に有益である。 しかし、ここで記載するように、さらに驚くべき利点は、本発明の塊茎は低温 （７℃未満）で貯蔵できること、および温暖貯蔵した塊茎と比較してもなお還元 糖が蓄積されないことである。このことは非常に有利である。 α-アミラーゼ活性およびβ-アミラーゼ活性は、低温で貯蔵した塊茎において より高い 低温貯蔵した、および温暖貯蔵したK125-2.1の塊茎において見られる特異的な α-アミラーゼ活性を比較すると、図13Ａで示すように低温で貯蔵した塊茎にお いてより高い活性が存在することが示された。これは図13Ｂで示すように、温暖 貯蔵した塊茎と比較した低温貯蔵したコントロールBintjeの塊茎の場合について も同様である。それぞれのサンプリング点は、個々に分析した５つ（多くの場合 ）の塊茎から得られた平均レベルである。12℃で貯蔵した塊茎と比較して４℃で 貯蔵した塊茎に見られるより高いα-アミラーゼ活性は、K125-2.1およびコント ロールBintjeのどちらにおいても有意に（P>0.05）高い（表５、α-アミラーゼ 、「12℃４℃」の２行を参照のこと）。 これは、図14ＡおよびＢならびに表５のβ-アミラーゼの行の「12℃４℃」（P >0.05）に見られるように、β-アミラーゼ活性についての場合も同様である。 特にα-アミラーゼ活性におけるこの上昇は、コントロールと比較して、低温 で貯蔵したK125-2.1の塊茎におけるグルコースの特異的減少が平均で40％であり 、温暖貯蔵した塊茎において見られた70％ではない理由を説明する。K125-2.1に おいてアンチセンスα-アミラーゼ配列（図マップ JK5を参照のこと）の前のプ ロモーターは優勢で構成的な35Sプロモーターであり、従って温暖温度（12℃） と比較して低い温度（４℃）においてより強い発現を示すとは考えられない。 従って、より適切なプロモーターを用いることにより、さらに大量のアンチセ ンスα-アミラーゼが発現され、それによりグルコースのレベルが40％を越えて 、例えば70％も低減すると考えられる。 低温で貯蔵し得るジャガイモ品種の作成 低温（７℃未満）貯蔵の後に還元糖を蓄積しない塊茎を生産するか、または少 なくともチップにする（chipping）か、またはクリスプにする（crisping）ため の限界より多い還元糖含有量を有さないジャガイモ品種は、以下のようにして得 られ得る： アンチセンスα-アミラーゼ配列（例えばpJK4、pJK5で用いたような）の前に 、おそらくその前にエンハンサーを有する低温誘導型プロモーター（例えばgPAm y351（図４または（65）を参照のこと））を含有する構築物を、例えば、Saturn aまたはRecord（低糖品種）のようなジャガイモ品種、あるいはその他の品種に 、材料および方法において説明したように形質転換する。本発明によると、畑で 栽培した塊茎（インビトロで微小増殖した塊茎または植え付けた塊茎由来のいず れか）を低い温度で貯蔵することが可能である。それゆえ、これらの塊茎はフラ イに適する。 本発明の別の実施態様は、アンチセンスα-アミラーゼ配列（例えばpJK4、pJK 5）とジャガイモの液胞インベルターゼのアンチセンス配列との組み合わせであ る。このふたつのアンチセンス配列は、どちらもひとつのプロモーターの制御下 にもう一方の配列と直接接続して置かれ得る（またはこれらの配列は、それ自身 のプロモーターおよびターミネーターを有し得る）。これは、例えばE35Sプロモ ーター（例えばpJK4において見られるように）または35Sプロモーター（pJK5に おいて見られるように）あるいは先に説明したような低温誘導型プロモーター（ 例えば結局はエンハンサーを有するgPAmy351）であり得る。なぜなら、液胞イン ベルターゼをアンチセンス化することは、報告（27）されるように低温貯蔵した 塊茎においてのみの効果的であるからである。 この二重構築物は、α-アミラーゼの作用によるデンプン粒子の分解によって グルコースが放出されるのを部分的またはほぼ完全に防ぐ。この構築物はまた、 少なくとも一部のグルコースおよびフルクトースをスクロース分子の形で維持し 、 それにより少なくともいくらかのフルクトースおよびおそらくほとんど残りのグ ルコースを取り除く。このようにして、形質転換していないコントロールの塊茎 においてそうでなければ存在するグルコースおよびフルクトースの実質的な量は 、これらのトランスジェニック塊茎においては存在しない。低温貯蔵した塊茎に おいては、グルコースおよびフルクトースの量が10倍まで高いことから、塊茎を 低い温度で貯蔵するためには少なくとも90〜95％を、二重構造物により取り除か なくてはならない。 本発明のさらに別の実施態様は、E.coli ADP-グルコースピロホスホリラーゼ （WO91/19806）またはオオムギADP-グルコースピロホスホリラーゼあるいはジャ ガイモ自身のADP-グルコースピロホスホリラーゼ（EP-A-0455316）のいずれかを アンチセンスα-アミラーゼ配列と組み合わせてセンス方向でコードする配列の 組み合わせである。例えば上記の二重構築物のようなそれ自身のプロモーターを 有するそれぞれの配列を持つ二重構築物において、または同じジャガイモ植物を ２回形質転換することのいずれか。初めに、例えばpJK4を用いてカナマイシン耐 性により選抜し、その後、例えばE.coli由来のマンノース-6-リン酸イソメラー ゼ遺伝子を含むベクターを用いて形質転換し、次いでマンノースで選抜する。形 質転換したジャガイモ品種は、前記のように低温での貯蔵および温暖温度で貯蔵 の後、フライにされ得る。 アンチセンスα-アミラーゼ配列と他の任意のデンプン分解酵素とを組み合わ せることも可能である。これは、β-アミラーゼのような他の酵素のレベルが、 低温貯蔵の塊茎において同様に上昇するからである（23）。従って、α-アミラ ーゼおよびβ-アミラーゼについてのアンチセンス配列（例えば（EP-B-0470145 ）において教示されるように、例えばダイズクローン（66）またはサツマイモク ローン（67）を用いる低ストリンジェントのハイブリダイゼーションにより得ら れる）の組み合わせは、グルコース量をさらにより減少させる。 他の組み合わせとして、アンチセンスα-アミラーゼは、PFK遺伝子（センスま たはアンチセンス）またはPFP遺伝子（センスまたはアンチセンス）、あるいは デンプン合成またはデンプン分解のいずれかに関与する他の任意の遺伝子と組み 合わせるために有益であり得る。本発明の組み合わせのさらなる例としては、ア ンチセンスα-アミラーゼと以下の少なくとも一つとの組み合わせが挙げられる: 分枝酵素（センスまたはアンチセンス）、またはスクロースシンターゼ（センス またはアンチセンス）、またはスクロース-P-シンターゼ（センスまたはアンチ センス）、またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼ（センスまたはアンチセン ス）、またはADP-グルコースピロホスホリラーゼ（センスまたはアンチセンス） 、またはデンプンホスホリラーゼ（センスまたはアンチセンス）、またはβ-ア ミラーゼ（センスまたはアンチセンス）、またはα-グリコシダーゼ（センスま たはアンチセンス）、またはβ-グリコシダーゼ（センスまたはアンチセンス） 、または不均化酵素（センスまたはアンチセンス）、または宿鎖酵素（センスま たはアンチセンス）、またはホスホグルコムターゼ（センスまたはアンチセンス ）、またはホスホヘキソースイソメラーゼ（センスまたはアンチセンス）、また はヘキソキナーゼ（センスまたはアンチセンス）、またはフルクトース-6ホスフ ェート-2キナーゼ（センスまたはアンチセンス）、またはフルクトース-2,6-ビ スホスファターゼ（センスまたはアンチセンス）、または他のインベルターゼ（ センスまたはアンチセンス）。 他のタイプの組み合わせは、ジャガイモのアンチセンスα-アミラーゼと、他 の植物の遺伝子（双子葉植物ならびに単子葉植物の、例えばADP-グルコースピロ ホスホリラーゼ（例えばオオムギ由来））、または例えば細菌由来のプルラナー ゼ（pullanase）または他の適切な細菌の酵素のような細菌または真菌の遺伝子 のいずれかとの組み合わせであり得る。好ましい組み合わせは、ADP-グルコース ピロホスホリラーゼ（phyrophosphorylase）とジャガイモのアンチセンスα-ア ミラーゼとの組み合わせである。 センスADP-グルコースピロホスホリラーゼ、アンチセンスα-アミラーゼ、お よびアンチセンス液胞インベルターゼを含有するような三重構築物を有すること もまた可能である。この構築物は、低温で貯蔵した塊茎における還元糖のレベル を95％ほど低減させ得る。 本発明の他の改変は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであ る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                    Methods for reducing sugar levels in organisms   The present invention relates to a method for reducing the level of sugar in an organism. More specifically, the book The invention relates to plants having reduced sugar levels or parts thereof (eg, fruits, seeds). Offspring, tubers, shoots, etc.) or their products and their plants or parts thereof Refers to the use of its products as food. More specifically, the present invention relates to a plant (good) Preferably reducing the level of reducing sugar glucose in organisms such as potatoes About things.   In some cases, it is desirable to reduce the level of sugar in organisms, especially plants. It is possible. For example, it is desirable to have low levels of sugar (especially glucose) It is possible. Because the presence of high levels of sugar in foods such as plants, In some cases, it may be undesirable for the goods industry. For example, having low levels of sugar in foods to reduce the caloric value of the food It can be desirable. One way to achieve this is before forming food It is to extract sugar. However, this process is very complicated and sometimes It takes time. In addition, it is very expensive.   As a further example, the presence of reducing sugars in foodstuffs can be high when exposed to high temperatures (eg, Discoloration (e.g., through the baking or frying process) Blackening). From this point of view, reducing sugars are It is thought to form a residue with the substance, often producing a blackish substance . Of course, the higher the level of reducing sugar, the greater the formation of darkened residue. Special In the meantime, this is, for example, the pomme frit blackened by such a reaction. e), use potatoes that produce chips, crisps, etc. Is an important issue in the undesirable potato industry.   The total level of reducing sugars is lower in cold conditions (eg, about 2 ° C to 4 ° C), (Eg, about 10 ° C to 16 ° C) Smell that is about 10 times larger than under natural potatoes Has been observed. Therefore, the chip / crisp industry (as well as the potato fry industry ), It is not desirable to store potatoes at low temperatures.   However, it is preferable to store the potatoes at low temperatures. Because such an article Under these circumstances, it is not necessary to apply chemicals to prevent germination.   All non-phosphorylated and phosphorylated reducing sugars in tubers (eg, glucose and Lactose contributes to the Maillard reaction (1, 2), while the non-reducing sugar (sucrose) Loin) does not contribute. The sucrose molecule consists of one glucose molecule and one fructose. During storage of potato tubers, it should be refrigerated (eg, stored at 4 ° C) because it contains molecules. Tuber reducing sugars are produced by decomposition of sucrose molecules (3,4,5,6) Is generally considered one. This is shown by Isherwood (1973) (4). During refrigeration, sucrose first accumulates and then glucose and And fructose (more specifically, phosphorylated sugars).   The accumulation of glucose and fructose during storage of potato tubers is Depends on factors. The main factor is the actual variety. Make chips and crisps Useful even in storage at warm temperatures (8 ° C to 12 ° C), useful for the manufacturing industry Very few varieties are known to have low amounts of original sugar. For example potato As soon as the reducing sugars in the flakes come in contact with the hot cooking oil (heat of 184 ° C), the Maillard anti A non-enzymatic process called reaction (1,2) starts. In this process, the reduction Sugar reacts with free amino acids in tuber flakes to form long colored polymeric molecules I do. The produced potato chips or crisps have a dark brown to black color, and , This potato chip tastes burnt.   The actual accumulation of free amino acids in potato tubers depends on the degree of the Maillard reaction (7). Is not a limiting factor in controlling Instead, tubers It is generally believed that the actual content of reducing sugars in is the limiting factor. Crisp For industrial purposes a content as low as 1 mg / g tuber is more ideal, but 2. 5mg / g tuber ~ 3m Tubers with reducing sugar levels below g / g tuber can be used for chip or crisp production. Accepted (8, 9). Blanch tuber flakes to remove excess reducing sugar (bl anch), but if the level of reducing sugars is 3 mg / g tuber or higher, Not yet good enough (this is also an expensive method). French In the fly / chip industry, levels as high as 5 mg / g tuber may be acceptable, Is unacceptable if it contains more than that level of reducing sugars (8, 9).   Two varieties typically used by the chip / crisp industry are Saturna and And Record. For example, varieties like Bintje tend to chip or Is a well-known edible potato used to make crisps. But soon Their glucose and fructose accumulation is too high. Chip / Chris A variety that is not at all suitable for the production of starch is Dianella, an old starch variety , Its reducing sugar content is too high to use for chip / crisp production.   Therefore, the chip or crisp industry has a relatively low level compared to other varieties. Is highly dependent on the particular variety that accumulates reducing sugars.   Other factors that are important in determining the content of reducing sugars in any variety are preserved The maturity of the previous harvested crop. This depends on the actual growing season. Some immature crops are produced during the cold and rainy seasons, for example. They are, Accumulate higher and more variable levels of reducing sugars than ripe crops (8, 2, 1 ,Ten). At least 10 parameters (eg temperature, precipitation, soil cultivation, etc.) A three-year survey of 100 grain lands in the UK, including monitoring of This was done by kman, Young et al. (1991) (11). Harvested by their research That there is no single factor that can be exclusively related to the (average) content of reducing sugars in crops It became clear. However, a comprehensive analysis is one result, It was revealed that the content of reducing sugars in Japanese crops was site-specific. Good The vineyards that produce crisp colored crops are potatoes with poor crisp color On average each year, they always produce better crops than potato-producing fields.   Finally, the actual storage temperature at which the potatoes are stored is important. Used for industry All known potato varieties are very high when refrigerated (7 ° C or less) And inevitably accumulate unacceptable levels of reducing sugars. This is currently processing All potatoes used in the process at temperatures higher than 7 ° C (eg 8 ° C to 10 ° C) It means that it is preserved (8, 12). But the shelf life is often 10 months And the potato tuber's rest is about two to four months is there. This therefore requires that the tubers be chemically treated to prevent germination (8). Here, “rest” means a tuber having no noticeable germination. To taste.   Germinating tubers cause problems in processing. Because buds are toxic compounds Because it contains the product solanine (as all green parts of potato plants) It is. Therefore, these sprouts must be cut off before slicing the tubers. No. In addition, the shoots grow fast at warm storage temperatures (above 7 ° C), while Consumes starch in tubers, causing starch loss in the product. Those If left unchecked, the entire crop will not be suitable for crisp production (12).   Potato tubers stored under cold conditions (eg 3 ° C to 4 ° C) should be more than 12 months It is well known that over time, it does not produce any significant growing shoots. What This is because this is the storage temperature for storing seed potatoes.   Thus, from an industrial point of view, potato products that can be stored at lower temperatures for longer periods of time It is possible to get seeds.   Reducing sugar that accumulates in stored potato tubers is a potential source of potato starch particles. It is generally accepted that it is produced by degradation.   Starch is an insoluble polysaccharide carbohydrate. Starch is the main energy of plants -One of the reserves. Starch is often a colorless plastid of many plants (amylop (Last), in storage tissue, and in chloroplast stroma. Starch Contains two major components: amylose and amylopectin. Both ingredients are consists of a straight chain of α (1,4) -linked glycosyl residues, but in addition the latter component is α Including (1,6) branch (13).   The enzyme α-amylase is one of many enzymes involved in starch degradation. is there. α-Amylase is best known from cereals. Where α-amylase Breaks down the α-1-4 glucoside bond in the amylose and amylopectin fractions, This allows maltose, maltotriose and α-dextrin (amylope (Molecules containing the α-1-6 glucosidic bond of the Kuching branch) (15, 16). After the first attack on the starch particles, starch phosphorylase, β-amylor Other enzymes, such as gut, α-glucosidase, debranching enzymes, and disproportionases, Helps produce final glucose and glucose-1-phosphate (16). Gluco Is rapidly phosphorylated by hexokinase and glucose-1-phosphate Glucose-6-phosphate, which is also an action of phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphate is converted to fructose by phosphohexose isomerase. Is converted to 6-phosphate. Glucose-1-phosphate is UDPG-pyrophosphorylase Reacts with UTP to produce UDPG. This is sucrose synthase or Or fructose or fructose by either action of sucrose-P-synthase. Reacts with any of the lactose-6-phosphate, thereby converting sucrose-6-phosphate Generate.   Eventually, phosphatases cleave sucrose-6-phosphate and free sucrose. Release, and then invertase separates sucrose into glucose and fructose. I can figure it out.   Thus, the overall degradation of starch is due to the action of many enzymes, many intermediates. Formation and formation of a number of equilibrium reactions between several intermediate products, and Is a highly complex reaction involving. However, which enzymes, and during storage About exactly how they work in potato tubers Current understanding is still limited (1). From this point of view, the enzyme α-Amirror Zeze is more reactive in chilled tubers than in warm-stored tubers Few have been reported (23, 25, 63, 64). This is another enzyme, For example, β-amylase, α-glucosidase (23), and invertase (25) Has also been reported.   Some researchers suggest that which enzymes cause the accumulation of reducing sugars at low storage temperatures I've been trying to pick out For example, research includes starch phosphorylation Zea (first degrades starch by phosphorylation first) (by amylase (17, 18); phosphofructophosphorylase (PF P) (cold instability, which prevents hexose from entering the glycolysis cycle (8); Phosphoff Lactokinase (PFK), which is also cold-labile, Have been reported to prevent glucose from entering the glycolysis cycle) (8, 19, 20); And invertase (in tubers kept refrigerated, tubers kept at a warm temperature (Compared to a higher level) (21). Also, α- and Mass stored β-amylase and α-glucosidase in both warm and cold conditions The results measured in the stem showed that these enzymes were stored colder than tubers that were warmly stored. Has high levels in tubers (22,23,24) and therefore accumulates reducing sugars It is reported that it was able to contribute to   On the other hand, other researchers found that very small amounts of α-amilla were found in stored potato tubers. Conclude that protease activity is present and therefore the degradation must be phosphorolytic (3, 25, 26). Enzymes in either warm or cold stored tubers Which enzymes, whether present in higher or very small amounts, are stored Of the actual accumulation of reducing sugars glucose and fructose in pickled potato tubers The cause is not yet known.   In the past, researchers have tried to reduce the level of reducing sugars in potatoes I've been looking into ways to do that. In particular, 4th International Congress of Plant Molecular Biology in Amsterdam (19-24 June 1994) tried to achieve this goal. Three approaches to look at were considered.   The first approach was by Rita Zrenner et al. (27), and Use 35S promoter to express antisense vacuolar invertase in potato About being. The researchers found that disense containing antisense invertase In potatoes, starch, glucose, fructose in tubers stored at room temperature And the amounts of sucrose and control (ie, untransformed potatoes). ) Was found to show no difference. Refrigerated tubers are non-transformed Strong inhibition of the invertase enzyme (up to 75% )showed that. Apparently, vacuolar invertase expression (mRNA levels) was not Increased after hours, this high level was maintained for up to six weeks and then It was reduced again in the untransformed control tubers.   Various sugars (glucose, fructose) in refrigerated transgene potatoes By measuring the level of sucrose, the researchers found that the total Same as roll, but hexoses (eg, glucose and fructose) The ratio of sucrose to was changed. About this , Glucose and fructose were reduced by about 50%, but instead Loin increased.   Some hexose removal was observed for the first six weeks, but the level of sucrose This approach is not satisfactory, despite the increase in It is important to be careful. Because potatoes are more than six weeks on an industrial scale For much longer, often up to 10 months.   Thus, at the industrial level, this approach reduces the level of reducing sugars at low temperatures. Not to mention the problem of reducing only 50% compared to the control, long term The problem of reducing the level of reducing sugars in potatoes over a period of time .   The second approach is by Kishore et al. Of Monsanto, and reducing sugars In hopes of reducing the level of coli gene ADP-glucose pyrophospho Use of lylase (ADPGPP) to increase starch content . However, Kishore et al. Reported that ADPGPP protein produced in transgene tubers Between the increase in the amount of starch and the level of starch, not to mention the decrease in the level of reducing sugars And did not find any correlation at all. Stored at 4 ° C for 4 months, Further studies on tubers with a reduced starch content show clearly brighter Produces colored potato frites. However, the researchers found that sugar Did not report levels or others that could explain the underlying mechanism. Po The production of tet fries is about the same as potato crisps for increasing hexose levels. It should be noted that it is not very sensitive. In addition, the researchers From their transgenic potatoes with increased starch content Crisp production was not reported. The researchers said that other Did not reveal any data. Therefore, this approach is Needless to say, reducing the level of reducing sugars in potatoes It does not solve the problem of reducing the level of original sugar.   The third approach is Duvening et al. (28), Virgin et al. (29), Lorberth et al. (30). Abel et al. (31), Blundy et al. (32), Donath and Druger (33), Geuviaia (34, 3). 5), by Krause et al. (36), Rouwendal et al. (38), Burrell, and Mooney (37) E. A gene encoding various plant-derived carbon metabolisms as well as the E. coli enzyme The present invention relates to transformation of a potato having a gene sequence. In each of these examples, And starch levels were not affected or sugar levels were significantly increased Nevertheless, the starch level was lower. Therefore, this The approach, not to mention the problem of reducing reducing sugar levels at low temperature conditions, goes without saying. And does not solve the problem of reducing the level of reducing sugars in potatoes. Only However, this approach addresses the reducing sugars in potatoes (eg, Clarifies the difficulty of reducing levels (eg glucose and fructose) Stressed.   Therefore, it is possible to reduce the level of reducing sugars in living organisms, especially in potatoes. Need to be able to More specifically, the level of glucose needs to be reduced . There is also a particular need to reduce the levels of reducing sugars under low temperature conditions.   According to a first aspect of the present invention, the level of glucose is compared to the level of other reducing sugars. In comparison, a method is provided for selectively reducing at least α in organisms. -Partially inhibiting the activity of amylase.   According to a second aspect of the present invention, compared to the level of other reducing sugars in an organism, A method is provided for selectively reducing the level of a course, at least in organisms. and partially inhibiting the activity of α-amylase. Here, the creature is An organism capable of enzymatically degrading lopectin or amylose.   According to a third aspect of the present invention, amylopectin or amylose is enzymatically Degradable cells, tissues, organs, and transgenic organisms are provided. Contains the foreign nucleotide sequence. Here, the transcripts derived from their expression are Reduces the activity of α-amylase in cells, tissues, organs, or transgenic organisms. Inhibits at least partially.   According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a foreign nucleotide sequence and a promoter of the present invention. Constructs, transformation vectors, and expression vectors containing the protein.   According to a fifth aspect of the present invention there is provided a food prepared from the organism of the present invention. .   According to a sixth aspect of the present invention, baked potato or baked potato prepared from the organism of the present invention. Or french fries are provided.   According to a seventh aspect of the present invention, to selectively reduce glucose levels The use of an antisense α-amylase is provided. Compare with other reducing sugar levels And an organism capable of enzymatically degrading amylopectin or amylose.   Preferably, the activity of the α-amylase is a nucleotide encoding α-amylase. Foreign nucleic acid encoding a first transcript that can bind to a second transcript of the Expressing an otide sequence in an organism, thereby preventing translation of a second transcript In this way, it is inhibited.   Preferably, the foreign nucleotide sequence is less than the sequence set forth as SEQ ID NO: 1. It has an antisense sequence at least partially.   Preferably, the foreign nucleotide sequence has the sequence shown as SEQ ID NO: 2 Or a variant, homolog, or fragment thereof. Where the mutation The body, homolog, or fragment can inhibit α-amylase activity (eg, (Prevention of translation of the second transcript).   Preferably, the foreign nucleotide sequence is expressed under the control of a 35S promoter. It is.   Preferably, the organism is a plant.   Preferably, the organism is a potato.   Preferably, the food is a crisp, chip, or fried potato.   In experiments involving the present invention, α-amylase activity increases under low temperature conditions. the above Α-amylase is one of the enzymes involved in starch degradation is there. Potato α-amylase is the subject of EP-B-0470145.   Based on these observations, antisense α-amylase was Placed under control and transformed into potato plants. But surprisingly, The present invention is directed to potato expression over a long period of time when antisense α-amylase is expressed. Just led to a significant decrease in the level of reducing sugar glucose in , Under warm conditions).   Specifically, unlike fructose levels, which remain constant, glucose The overall decrease in levels is about 70% under warm conditions and under cold conditions The overall reduction was about 40%.   Thus, the present invention provides a method for storing jaguar stored at both warm and cold storage temperatures. At least partial inhibition of endogenous α-amylase in potato tubers Indicates a particular effect on the course level.   These results, very surprisingly, reflect the current thinking, Sucrose, glucose, etc. as a result of the breakdown of starch in potato tubers This is consistent with the respective reduction of fructose (see above).   In addition, glucose and fructose species may respond to the reduction during sucrose accumulation. We expected at least that a similar and proportional reduction had occurred.   In addition, the following investigation of potato extract (related to the present invention) revealed that The fraction having the enzyme activity and no β-amylase activity is the substrate amylose When incubated with glucose, give the products glucose and maltose. It became clear that. In addition, transgenes transformed with antisense sequences At least partial inhibition of the α-amylase enzyme in enzymatic potato strains Clearly reduces glucose levels in any potato variety That is very surprising.   Therefore, it is assumed that potato α-amylase directly contributes to glucose accumulation. However, it is also related to the production of maltose and dextrin.   Thus, partial inhibition of α-amylase activity affects fructose accumulation. It is surprising to specifically reduce glucose levels without affecting It is.   Consistent with the present invention, 70% of glucose levels in warmly stored tubers Fructose levels were constant, although a high degree of reduction was found. In the tuber And other amylolytic enzymes such as starch phosphorylase and β-amylase Are present, so that they (especially starch phosphorylases) It was expected that the elimination of zeolitic activity could be compensated. However, the expected price effect is Did not happen.   Another embodiment of the present invention relates to a tissue-specific promoter, a temperature-inducible promoter. Or control of the natural α-amylase promoter (including combinations thereof) Below, the expression of a foreign nucleotide sequence of the invention is included. The present invention also relates to the aforementioned And constructs containing the same.   Examples of preferred temperature-inducible promoters are those as shown in FIG. You. The promoter containing the sequence as shown as SEQ ID NO: 3 is Solanum tuberosu m isolated from 5. Contains the nucleotide sequence corresponding to the 5 Kb EcoR1 fragment A promoter or a mutant, homolog or fragment thereof .   An example of a highly preferred tissue specific promoter is the promoter shown as SEQ ID NO: 3. Data. This promoter is a tuber-specific cold-inducible promoter. You.   A further embodiment of the present invention relates to at least one of the other which participates in starch degradation. The presence of at least one inhibitor of the enzyme. This inhibitor can be used, for example, in the present invention. Expression of foreign nucleotides in vacuolar invertase (eg, antisense invertase) Expression of a foreign nucleotide sequence that at least partially inhibits the activity of Can be combined with   The term “selectively reduce as compared to other reducing sugars” refers to other reducing sugars, especially That the level of glucose is specifically lower than the level of means. In a preferred embodiment, the term refers to glucose levels Significantly lower than the source level.   The term "reducing sugar" is used in its ordinary sense in the art. Ie Indicated by positive Benedict test and ability to decolorize potassium permanganate solution Is a sugar that has the ability to act as a reducing agent in solution, such as Almost Monosaccharides are reducing sugars, and most disaccharides except sucrose are also reducing sugars. You. Representative reducing sugars include glucose and fructose.   The term “at least partially inhibits the activity of α-amylase” is preferably Means that there is at least about 15% inhibition. More preferably, less Both have about 50% inhibition. Even more preferably, at least about 70%, and Is that there is a higher (eg, 95%) inhibition.   The term “inhibiting the activity of α-amylase” refers to the fact that α-amylase in an organism Including being inhibited. The term also refers to the level of α-amylase gene replication Including reducing. This term also refers to the transcription of the α-amylase gene. Including reducing bells. Preferably, the term refers to the latter.   The term "sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 contains at least partially "Is a nucleotide sequence that is less than the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Both are antisense to some, where the nucleotide sequence is -Expressing a transcript that can at least partially inhibit the activity of amylase; means.   In a preferred embodiment, this nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 2 Has a sequence at least substantially identical to the sequence (ie, identical to SEQ ID NO: 2) Or a variant, homolog, or fragment thereof). Better In a preferred embodiment, the nucleotide sequence is the sequence shown in SEQ ID NO: 2.   The term "construct" (eg, the terms "conjugate", "cassette", and "high" Synonymous with “blit”) is directly or indirectly attached to the promoter Foreign nucleotide sequences. Examples of indirect attachment include intro A suitable spacer, such as an intron sequence (eg, Sh-1 or ADH intron) Group is between the promoter and the GOI.   The construct can also be used to construct genes, for example, in plant cells in which it has been transferred. It may contain or express a marker that allows for selection of the product. For example, for plants There are various markers that can be used (eg, mannose). Other examples of markers Indicates antibiotic resistance (eg, G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin) Resistance to syn, and gentamicin).   The term "expression vector" refers to a construct that has the ability to express in vivo or in vitro. Means a structure.   The term "transformation vector" refers from one species to another (eg, E. coli). coli plasmid (From plant to plant cell).   The term "nucleotide" includes genomic DNA, cDNA, and synthetic DNA.   The term "exogenous" means that the nucleotide sequence is not native to the organism of the invention. Means As an example, in a preferred embodiment of the present invention, the antisense-α The nucleotide sequence encoding the milases is not native to potatoes.   In the context of the present invention, the term "organism" refers to amylopectin or amylose Includes any organism that has the ability to understand. A typical example of such an organism is a plant Organisms, algae, fungi, and bacteria, and their cell lines. Preferred In particular, the term refers to a plant or a cell thereof, preferably a dicot, more preferably Potato means.   The term "transgenic organism" in the context of the present invention is expressible according to the present invention. An organism containing either a construct or the product of such a construct is meant.   For example, a transgenic organism can be constructed using a suitable foreign promoter (eg, a 35S promoter). Control of the promoter or cold-inducible promoter (as described herein) Under the control of an exogenous nucleotide sequence (as described herein); A foreign nucleoside under the control of a motor (eg, a natural α-amylase promoter) It may contain a pseudo sequence.   The term “variant”, “homolog” or “fragment” refers to the resulting nucleic acid. The ability of the otide sequences to express transcripts, each of which can hinder the translation of the second transcript Or an expression system (eg, a transformed cell or transgenic organism according to the invention). Product) has the ability to act as a promoter in one of the sequences ( Or more), substitution, alteration, modification, substitution (rep lacement), deletions or additions to the sequence. In particular, the term "homolog" Transcripts whose respective nucleotide sequences can interfere with translation of the second transcript Structure or / and ability to act as a promoter. Or homology with respect to function. For sequence homology, preferably at least 75 %, More preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology, More preferably there is at least 95%, more preferably 98% homology.   The basic principle in the construction of genetically modified plants is that the stable The insertion of genetic information in the plant genome to gain maintenance. Genetics There are several techniques for inserting information, and two main principles are Introduction and introduction of genetic information through the use of vector systems.   A review of general techniques is available in Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1 991] 42: 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April) 1994 17-27).   Thus, in one aspect, the invention relates to a vector system, wherein the system comprises a nucleic acid according to the invention. A nucleotide sequence or construct, and a plant (eg, a plant of the family Solanaceae, The genome of Solanum genus plants, especially Solanum tuberosum) Peptide sequences or constructs can be introduced.   The vector system may contain one vector, but preferably contains two vectors. Yes; in the case of two vectors, the vector system is usually a binary vector system Called. The binary vector system is described in more detail in Gynheung An et al. (1980), Binner And described in Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.   Extensive for transformation of plant cells with a given promoter or construct The system used is Ti-plasmid from Agrobacterium tumefaciens or Aggrob It is based on the use of Ri-plasmids from acterium rhizogenes (An et al. (1986 ), Plant Physiol. 81,301-305 and Butcher D. N. Et al. (1980), Tissue Culture Meth ods for Plant Pathologists, D. S. Ingrams and J. P. Helgeson ed., 203-208).   Several different Ti- and Ri-plasmids have been constructed, which are Or a plant cell construct. Limitations of such Ti-plasmid An example not done is pGV3850.   The nucleotide sequence or construct of the present invention comprises a sequence immediately surrounding the T-DNA border. Preferably between or adjacent to the end sequences of the T-DNA to avoid degradation of And inserted into the Ti-plasmid. It is at least one of these Is it Possible to Insert the Modified T-DNA into the Plant Genome? It is.   As will be appreciated from the above description, the vector system of the present invention is preferably used in plants. At least one of the sequences necessary for infection (eg the vir region) and the T-DNA sequence It contains a border portion, which is inherited on the same vector. It is positioned as a child construct. Furthermore, the vector system is preferably Agrobacteriu m tumefaciens Ti-plasmid or Agrobacterium rhizogenes Ri-plasmid Or a derivative thereof. These plasmids are well known and Widely used in the construction of transgenic plants, these plasmids or There are many vector systems based on derivatives of   In the construction of transgenic plants, the nucleotide sequence or construct is The vector can replicate and is easy to manipulate before it is inserted into the plant. It can be constructed in an organism.   Examples of useful microorganisms are E. coli, but other microorganisms with the above properties are also used. Can be The vector system defined above is E. When constructed in E. coli, If necessary, in an appropriate Agrobacterium strain (eg Agrobacterium tumefaciens) Is transferred to   Thus, a Ti-plasmid having a nucleotide sequence or construct of the invention To obtain an Agrobacterium cell having the nucleotide sequence or construct of the present invention. As described above, an appropriate Agrobacterium strain (eg, A. tumefaciens), preferably Subsequently, the DNA is transferred to the plant cell to be modified.   Direct infection of plant tissue by Agrobacterium is widely used, and cher D. N. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, D. S. In grams and J. P. This is a simple technique described in Helgeson, ed., 203-208. Potry kus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) and Christou See also (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27).   As reported in CA-A-2006454, large quantities of cloning vectors are available. Yes, it is E. markers that allow selection of E. coli replication systems and transformed cells contains. Vectors include, for example, pBR332, pUC series, M13 mp series, pACYC1 84, etc. In this way, the construct or nucleotide sequence is Can be introduced to the appropriate restriction position. The contained plasmid is E. coli. coli transformation Used for E. The E. coli cells are cultured in a suitable nutrient medium and then harvested. And lyse. The plasmid is then recovered. As a method of analysis, general Include sequence analysis, restriction analysis, electrophoresis, and even biochemical-molecular biological methods. used. After each operation, the DNA sequence used is restricted and linked to the next DNA sequence. Can be tied. Each sequence can be cloned on the same or different plasmids. plant After each method of introducing the desired nucleotide sequence or construct in A sequencing may be required. For example, for transformation, Ti- or Ri -If a plasmid is used, at least to the right of the T-DNA of the Ti- and Ri-plasmids The border, and often the right and left border, is the region of the introduced gene. Are adjacent to each other. Use of T-DNA for transformation of plant cells Has been intensively investigated and EP 120 516; Hoekema, The Binary Plant Ve ctor System Offset-drukkerij Kanters B. B. , Alblasserdam, 1985, Chapter 5; Fra ley et al., Crit. Rev. Plant Sci. , 4: 1-46, and An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-284 It is described in detail.   Direct infection of plant tissue with Agrobacterium is another simple technique that can be used. is there. Typically, it injures the infected plant. This can be done, for example, with a razor Making a hole in the plant, drilling the plant with a needle, or grinding the plant with an abrasive Do by doing. The wound is then contacted with Agrobacterium (eg, in solution). To seed.   Alternatively, the infection of the plant may be caused by a particular part or tissue of the plant (ie, leaves, roots, stems or Can be performed on other parts of the plant). The inoculated plant or plant part is then Grow in a suitable culture medium and grow into mature plants.   When plant cells are constructed, these cells may be prepared using well-known tissue culture techniques (eg, Appropriate culture medium with necessary growth factors such as amino acids, plant hormones and vitamins By culturing the cells in). Transformation Regeneration of cells into genetically modified plants involves regeneration of plants from cells or tissue culture. Known methods (eg, selecting transformed shoots using antibiotics) And subculture shoots in medium containing appropriate nutrients, plant hormones, etc. Through the use of   Therefore, in summary, a highly preferred embodiment of the present invention is therefore At least partially inhibit the activity of α-amylase in Specific reduction in organisms capable of enzymatically degrading pectin or amylose A method for reducing the level of sugar (ie, glucose).   The following samples are based on the following accredited depositaries (The Budapest Treaty) National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) at 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 IRY, United Kingdom) 1994 Deposited on 20 March:   DH5α-pJK4 accession number NCIMB 40691.   This sample was E. coli containing plasmid pJK4 (described below). coli bacteria (DH5α- ) Stock.   The following samples are based on the following accredited depositaries (The Budapest Treaty) National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) at Aug. 1994 on 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, United Kingdom) Deposited on 26th:   DH5α-gPAmy 351 (Accession No. NCIMB 40682).   This sample was from EcoR15 isolated from potato (Solanum tuberosum). Five E. containing plasmid pBluescript containing genomic DNA fragments. Coli bacteria It is stock. EcoR1 5. The 5 fragment contains the promoter region and potato It contains a part of the 5 'untranslated sequence of the structural gene of the α-amylase gene. Plastic Smid was prepared using the pBS vector (Short et al. [1988] Nuc. Acid. Res. 16: 7583-7600) EcoR1 5. Formed by inserting a 5kb potato fragment . The promoter can be isolated from the plasmid by enzymatic digestion with EcoR1, and It can then be extracted by typical separation techniques such as gels.   Next, the present invention will be described using only examples, but the examples refer to the following drawings. Should be.   Figure 1 is a map of each of pIV21 and pEPL;   FIG. 2 is the nucleotide sequence of the AmyZ4 clone;   FIG. 3 is a restriction map of pBKS-plasmid;   FIG. 4 is a restriction map of the gPAmy351 clone.   FIG. 5 is the antisense nucleotide sequence of the AmyZ4 clone;   Figure 6 is a restriction map of pJK5;   Figure 7 is a restriction map of pJK4;   FIG. 8 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. Glucose and fructose at 4 ° C (cold conditions) and 12 ° C (hot conditions) Show the bell graph;   FIG. 9 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. Glucose and fructose at 4 ° C (cold conditions) and 12 ° C (hot conditions) Show the bell graph;   FIG. 10 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. FIG. 4 shows graphs of α-amylase activity at 4 ° C. (cold condition) and 12 ° C. (warm condition). You;   FIG. 11 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. FIG. 6 shows graphs of β-amylase activity at 4 ° C. (cold condition) and 12 ° C. (warm condition). You;   FIG. 12 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. Glucose and fructose at 4 ° C (cold conditions) and 12 ° C (hot conditions) Show the bell graph;   FIG. 13 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. FIG. 4 shows graphs of α-amylase activity at 4 ° C. (cold condition) and 12 ° C. (warm condition). You;   FIG. 14 shows the transgenic potato and the control potato of the present invention. FIG. 6 shows graphs of β-amylase activity at 4 ° C. (cold condition) and 12 ° C. (warm condition). And   FIG. 15 shows the promoter sequence in the gPAmy 351 clone (see above).   More specifically, FIG. 4 is a representation of the plasmid gPAmy351. The emphasis is on It is an EcoRI-SalI fragment isolated from potato (Solanum tuberosum). E The coRI-SalI fragment was from EcoRI 5. 5 kb fragment (subclone Eco 5. Five ) And indicated by the lines shown at the bottom of the figure. EcoRI 5. The 5 kb fragment , Promoter region and 5 'non-translation of structural gene of potato α-amylase Contains part of the sequence. The following restriction sites are shown in Figure 4: E: EcoRI, Ha: HaeIII, Sp : SspI, H: HindIII, P: Pvul, S: SalI. Further estimated CAAT and TATA boxes and Shows the ATG start site. Introns are white bars, and exons are black bars Indicated by Eco 5. 5 is cloned into pBluescript M13- or pBSK-plasmid. Can be implemented.Materials and methods   Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum cvs Dianella, Saturna, Bintje and And Record tubers were collected from a field located near Holeby in the south of Denmark. 4 dishes All seeds settle. Dianella is used for starch production, Bintje is edible Potatoes, and Saturna and Record from Chips / Crisps Used in industry.   “Ceralpha” kit and “Betamyl” kit are available from Megazyme (Aust) Pty. Ltd., 6  Obtained from Altona Place, North Rocks, NSW 2151, Australia.   Sugar measurement kit (sucrose / D-glucose / D-fructose) is available from Boehring Obtained from er Mannheim. All other chemicals are Sigma, Merck, Ferak, Difc o Obtained from Lab. or BDH Chemicals Ltd.Strains and plasmids LBA4404 (41): Streptomycin resistance of Agrobacterium tumefaciens strain Ach5                 Disarmed pTI Ach5 Plus in Sex Derivatives                 Contains mido pAL4404.                pBI121: see references (42, 43)                See pCaMVCN references 44, 45                pBR322: see reference 46                pUC19: see reference 40                pHC79: see reference 47Media and plates L-broth (LB) medium: Per 11: 5 g yeast extract, 5 g NZ amide, 5 g NaCl, 5 g bacto -peptone. Treat in an autoclave. LB-plate:   Add 15 g Bacto agar per liter to LB medium. Treat in an autoclave. Pour into plastic Petri dishes (25 ml / dish). AXI-plate:   35 mg of ampicillin per liter and 120 mg of IPTG (isopropyl Ogalactoside) and 40 mg of Xgal (dissolved in dimethylformamide) Add after processing. [Xgal: 5-bromo-4chloro-3 indolyl-β-D-gala Cuctoside. ] Kan-plate:   Add 50 mg kanamycin per liter to the LB plate after autoclaving. I can. YMB medium: Per liter: 0.66g KTwoHPOFour-3HTwoO. 0.2g MgSOFour. 0.1 g NaCl. 10.0 g of mannini Thor. 0.4 g yeast extract. Adjust to pH 7.0. Treat in an autoclave. Liquid MBa medium: Per liter: 4.4 g of MS salt (Murashige and Skoog basal salt (48), Sigma). 20 g sucrose. Adjust to pH 5.7 with NaOH. Solid MBa medium:   Add 0.8% Difco agar to liquid MBa medium. MBa co:   0.5 mg / l of t-Zeatin (trans isomer, Sigma) and Add 2.0 mg of 2,4 D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, Sigma). Solid MBb medium:   Add 30g sucrose per liter to solid MBa medium instead of 20g sucrose I can. water:   The water used in the materials and methods is always distilled before use and Treated in a clave.Plant handling   Transgenic of cv Dianella, cv Saturna, cv Bintje and cv Record Strain and control strains are micropropagated in vitro under aseptic conditions. Was. Individual transgenic lines transformed with either pJK4 or pJK5 And untransformed control lines are kept sterile in agar in the growth chamber. Was.   One node (including leaf) cut from a sterile plant is transplanted into a 5.5 cm pot, and then And placed in a greenhouse. The cover was gradually removed to strengthen the plants ( 20 days or more). Potato plants micropropagated in vitro were When they reached a height of 10-12 cm, they were transplanted into the field by hand. Field is one for potato field Treated using general farmland control practices. Each strain (Transgeni 2 or 4 for either the control strain or the non-transgenic control strain) Placed in repetitions. At harvest, collect all tubers from all lines in 2 or 4 replicates Collected, mixed and randomized into two parts. One is 4 ° C in the dark (cold storage strip) And the other was placed in the dark at 12 ° C. (warm storage conditions).Extraction procedure   The individual tubers are washed with running water, wiped dry, and tuber ap ex) to the tuber attachment point (in the vertical direction) I cut it out. Weigh the flakes (approximately 20 g) and place them in a 37 ml cup in a Waring blender. Immediately cut into strips before homogenizing with extraction buffer using a pump. Using The extraction buffer is essentially that described by Fan, 1975 (49), 4 ml of 0.05 M acetate buffer (pH 5.0) with 0.01 M calcium acetate and 0.0 1 ml H with 2 g sodium sulfiteTwoO.   The homogenate is filtered through miracloth and the filtrate is 10k Centrifuged for 10 minutes at 4 ° C in a Sigma 202MK centrifuge at 4 ° C to obtain a clear supernatant .   The extract was split into two tubes. One is kept at -20 ° C immediately for enzyme analysis. And the other is boiled for 10 minutes for sugar analysis and then stored at -20 ° C. Was.Measurement of enzyme activity   “Ceralpha” or “Ceralpha” for the measurement of α-amylase or β-amylase activity Betamyl 'method was used for each. Included in kit (Ceralpha or Betamyl) Substrates were prepared according to the supplier's instructions. Substrates are blocked in the Ceralpha kit P-nitro-phenylmaltoheptaoside (BPNPG7), glucoamylase and P-nitro-phenylmaltopene in Betamyl kit Including taoside (PNPG5) and α-glucosidase. 0.1 ml substrate to 0.35 ml 50 mM Add to sodium citrate (pH 6.5) and 0.05 ml potato extract and add And incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Remove 0.1 ml at 0, 10, 20 and 30 minutes And mixed with 0.15 ml of stop solution to stop the reaction. Stop solution is 0.5M Lysine and 2 mM EDTA adjusted to pH 10.0 with NaOH were used.   Transfer individual samples to an Elisa-plate and measure absorbance It was measured at 405 nm using an Isa-reader. 50 mM sodium citrate (pH 6.5) The solution contained was used as a blank. If necessary, extract the potato extract Diluted 5, 10 or 20-fold in sodium enate buffer.   Activity is OD405/ h / mg expressed as extracted protein. Each sample is measured in duplicate did. In the α-amylase assay, the amount of p-nitrophenol released is It was directly proportional to the incubation time. About β-amylase assay This was similar after the first 10 minutes of incubation.   Amylose hydrolysis is based on ITwo/ KI staining method was followed. 250 μl of 1.2% potato fir 50 μl of 40 mg / ml BSA and 100 μl of 0.1 M sodium acetate (pH 7) solution Of the extract. The enzyme reaction was performed at 40 ° C. Reaction is 20 μl Was stopped by adding 50 μl of 3M HCl to the enzyme reaction sample. 1 ml ITwo/ KI (0.026g / ml I diluted 1: 1000)Two+0.26 g / ml KI) and add Loin Was measured spectrophotometrically at 620 nm.   The protein concentration was determined according to Bradford (50) according to the Bio-Rad Protein Assay Kit (Ca , USA) and γ-globulin as a standard substance.Separation of enzymes by chromatography   Skin to better study enzymes that hydrolyze starch in potatoes Extract the peeled potatoes and remove the protein by affinity chromatography Gel filtration of fractions that subsequently bind to the affinity gel material Separated by excess. Hydrolyzes eluted proteins to starch-related substrates And the product was analyzed by Dionex HPLC.   100 g of peeled potatoes were added to 100 ml of buffer solution (50 mM acetate (pH 5.5), 20 mM D TT) and 10 g of Dowex and homogenized in a Waring blender. Homogena After the extraction, the extract is filtered through miracloth and filtered. The liquid was centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.   The supernatant was gently agitated for 30 minutes to give 20% (NHFour)TwoSOFourWas precipitated. The precipitated protein was collected by centrifugation and discarded. The supernatant is then  It passed through a Sepharose column.   The affinity column material Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) Dye Cibacron Blue F3G-A was covalently bound to agarose gel Sepharose CL-6B Things. Equilibration was performed with 50 mM Tris (pH 6.4) using a 32 ml column. Flow rate is 30ml / h. 40 ml of the supernatant sample was passed through the column. 64ml unbound protein Elution was performed with 50 mM Tris (pH 6.4). Then the protein bound to the affinity material The quality was eluted with an ascending gradient of 0-0.5 M NaCl in a total volume of 400 ml buffer. 8 ml fractions were collected. All operations were performed at 4 ° C. Fraction α-a Analyzed for mylases, β-amylases and proteins.   Fractions containing β-amylase activity are pooled and Amicon (men The solution was concentrated about 5-fold by pressure dialysis using Blanc YM-10) to 6 ml. This hula The PD-10 gel filtration column (Ph) equilibrated with 50 mM Tris (pH 7) and 0.1 M NaCl armacia).   Fractions of the 200 μl sample were applied to the gel filtration column FPLC Superose12 (Pharmac Chromatographed in a). The column was equilibrated with 50 mM Tris (pH 7), 0.1 M NaCl . The running time was 80 minutes. Manually transfer samples to Eppendorf tubes Collected. Protein was recorded by UV280nm. A total of 6 gel filtration operations Was done. Pooled peaks from running. Sample is from peak 1 to peak 9 was defined.Product analysis   Analysis of products from hydrolysis of carbohydrates by sample peak 1 to peak 9 The following substrates were used: maltopentaose (8 mg / ml), soluble den Pun (2 mg / ml) and amylose (5 mg / ml). Enzyme reaction mixture is 200 μl substrate Contained 200 μl of 50 mM sodium acetate (pH 6.5) and 100 μl of enzyme preparation . The mixture was incubated at 37 ° C. for 20 hours. The reaction is boiled for 5 minutes Stopped. A 20 μl sample was then analyzed on a Dionex HPLC.   The analysis was performed by a Dionex with a pulsed electrochemical detector used in a current detection mode.  I went at 4500i. A CarboPac PA1 column (4 × 250 mm) was used. Samples below Eluted with a gradient:Buffer :Gradient: Sugar measurement   Sugar analysis was performed using boiled potato extract (see above) and Sucrose / D-glucose / D-fructose test key from ehringer Mannheim The kit was used according to the supplier's instructions. The reaction is performed on the ELISA plate. Repeat 3 times by dividing the volume of all components by 12 compared to the method recommended in I went. An Elisa-Reader was used to measure at 340 nm.   The preparation of the plasmid was as described in EP-B-0470145. Especially on a small scale Preparation of plasmid DNA was performed as follows.   Plasmid-bearing bacterial strain was added to 2 ml of added ampicillin (35 μg / ml). Grow overnight in L-Broth (LB) medium. Operate in 1.5 ml Eppendorf tube And centrifugation was performed at 4 ° C. in an Eppendorf centrifuge. Overnight culture The incoming cells are collected by centrifugation for 2 minutes and 1 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) , Washed with 50 mM EDTA and centrifuged for 2 minutes. Pellet 150 μl 15% The cells were suspended in sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), and 50 mM EDTA by vortexing. Five 0 μl of 4 mg / ml lysozyme is added and the mixture is allowed to stand for 30 minutes at room temperature and for 30 minutes Incubated on ice. 400 μl of ice-cold water are added and the mixture is left for 5 minutes Place on ice, incubate at 70-72 ° C for 15 minutes and centrifuge for 15 minutes . Add 75 μl of 5.0 M sodium perchlorate and 200 μl of isopropanol (a (Sopropanol was stored at room temperature) and the mixture was centrifuged for 15 minutes at 4 ° C. Released.   The pellet is suspended in 300 μl of 0.3 M sodium acetate and 2-3 volumes of cold Tanol was added. Precipitation is either at −80 ° C. for 5 minutes or at −20 ° C. overnight. Store, centrifuge for 5 minutes, vacuum dry for 2 minutes, and add to 20 μl water Achieved by redissolving the pellet. Yield is 5-10 μg of plasmid DNA there were.   For large-scale preparation of plasmid DNA, simply scale up the small-scale preparation 10-fold. Achieved. Work in a 15ml corex tube and scale up all components 10x did. Centrifugation was performed at 4 ° C. in a Sorvall refrigerated centrifuge. Of the change from the above Is shown below. After incubation at 70-72 ° C, centrifugation is 17,000 rpm For 30 minutes. After adding isopropanol and adding cold ethanol Afterwards, the centrifugation was at 17,000 rpm for 15 minutes. Pellet of final plasmid DNA Suspension in water and transfer to an Eppendorf tube, then spin briefly to remove residue Was removed. The supernatant was adjusted to 0.3 M sodium acetate and 2-3 volumes of cold ethanol Knoll was added. The pellet was resuspended in 40 μl of water. Typical yields are 20-28 μg Rasmid DNA.   In order to obtain very pure plasmid DNA, two 00-300 μg of isolated plasmid DNA was banded on a CsCl gradient. Solid CsC l was mixed with water (1: 1 w / v) and 0.2 mg / ml ethidium bromide was added. This Transfer the solution to a quick-seal polyallomer tube and plasmid DNA (solid CsC (1: 1 w / v)). Fill the tube, seal, and Centrifuged at 48,000 rpm for 16-18 hours at 15 ° C. in a Beckman VTI 65 rotor. Far Separation was stopped without brake. Remove the banded plasmid DNA Pull out of the tube using a syringe and remove ethidium bromide from CsCl saturated Extracted 7-8 times with sopropanol. CsCl is 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA The buffer was removed by dialysis three times for 48 hours. DNA is 0.3M acetic acid Adjust to sodium and precipitate by adding 2-3 volumes of cold ethanol I let it.   Following the preparation of small-scale plasmids from E. coli, usually LiCl precipitation is performed to The RNA was removed from the solution. Plasmid DNA prepared on a small scale is added to 100 μl of distilled water. Was dissolved. One volume of 5M LiCl is added and the mixture is incubated at -20 ° C for 30 minutes. The mixture was then centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. Remove the supernatant to a new Transfer to a Pendorf tube and add 2 volumes of TE buffer or water. 2.5 volumes Precipitation with an amount of 96% ethanol is performed either at -80 ° C for 10 minutes or at -20 ° C overnight. This was achieved by storage at DNA is centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C And dried in a vacuum for 2 minutes and 18 μl of TE or Redissolved in water.   Genomic potato DNA was reported by Dellaporta et al. (1983) and ref. Isolated according to the article.pEPL And construction of pIV21 (DW2t)   Restriction enzyme digestion, gel electrophoresis, fragment isolation, subcloning And sequencing was performed as outlined in EP-B-0470145 et al. (1989) (52).   pEPL is constructed from pCaMVCN (44,45) in which the CAT gene has been removed by PstI digestion. Build. A small linker (linker: PstI-BamHI-BaII-PstI) was added to this plasmid Ps Insert at the tI site. The resulting plasmid is called pLise (pL). PL is HincII and BgI II and a plasmid containing the resulting 35S promoter and NOS terminator. Fragment into another pL plasmid that is cut with EcoRV and BgIII. To synchronize. EcoRV and HincII are both blunt-ended sites. Obtained structure The structure is called pEnhanced-Lise (pEL). pEL is a 250 bp promoter Essentially pCaMVCN in that it contains a mutant 35S promoter with tandem duplication of upstream sequences Are different. Mutant 35S promoters are better than native 35S promoters. Also have about 10-fold higher transcriptional activity (53).   pEL is cut with PstI and BgIII, thereby removing the NOS terminator, And insert CaMV terminator (DW2t) instead. Finally, the linker (Pst I-BamHI-SmaI-SacI-SaII-SphI) with the enhanced E35S promoter and CaMV terminator. Insert into the PstI site that is located between the This plasmid is called pEPL. (See FIG. 1).   pIV21 is the major part of the sequence in which the cleavage product of PvuII and BgIII is not the pBR322 (46) sequence Construct from pHC79 (47) which has been removed. Has streptomycin resistance  PvuII-BgIII fragment (SpRSmR, R702). Put the resulting plasmid into p Call it IV1. Non-pBR322 sequence remaining from HindIII and EcoRI digests of pIV1 The thing was removed. The EcoRI / HindIII polylinker of pUC19 (40) was replaced with HincII in pIV1. Inserted between the / EcoRI sites. This plasmid is named pIV10. from pBI121  The 800 bp 35S promoter (cut with BamHI and HindIII) was added to xbaI in pIV10. Cloning into the -HindIII site, thereby creating plasmid pIV21. Most Later, an approximately 230 bp BamHI / EcoRI fragment from pEPL (with DW2 termination) was into pIV21, thereby creating the pIV21 (DW2t) plasmid shown in FIG. Was.DNA Hybridization   Cut genomic potato DNA or plasmid DNA with appropriate restriction enzymes and Southern Trans using nd N or N + membrane (Amersham International) Used for Southern and hybridized according to the supplier's instructions (55). Soy.Agrobacterium tumefaciens Transformation   LBA strain 4404 was transformed with 100 mg / ml rifampicin (Sigma) and 500 mg / ml Maintained on YMB plates (pH 7.0) containing treptomycin (Sigma). 2.5 ml  The bacteria were inoculated into LB medium (pH 7.4). The suspension is placed in a shaking incubator at 28 ° C for 300 Grow at 340340 rpm for 24 hours. The suspension was then diluted 1: 9 with LB and And incubated at 28 ° C, 300-340 rpm for another 2-3 hours. 0D is 0.5 ~ At 1, collect 25 ml aliquots into 50 ml centrifuge tubes, 10,000 rpm, Centrifugation was performed at 4 ° C for 5 minutes. Place the tube on ice and transfer the pellet to 0.5 ml of 20 mM CaClTwoWas resuspended. A 0.1 ml aliquot of this resuspended cell is Flash frozen in liquid nitrogen in a cryotube and stored at -80 ° C Was.   Transformation using the freeze-thaw method (56) was performed as follows:   LBA 4404 Competent cell solution 0.1 ml CaClTwoThaw aliquots on ice And 1 μg of plasmid DNA was added. Incubate the mixture at 37 ° C for 5 minutes. And 1 ml of LB (pH 7.4) was added. Shake at room temperature for 4 hours (100 rpm) Followed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 seconds at 4 ° C. did. Resuspend the pellet in 100 μl LB and add 50 mg / l kanamycin (Sigma). Seed YMB plate.   Incubate the plate at 28 ° C for 48 hours or And incubated until it became This was the first round of choice. Kana Bacteria transformed with a plasmid containing the NPT II gene conferring mycin resistance Only viable on kanamycin plates.   For the second round of selection, the six resulting colonies were picked at 100 mg / ml Ampicin, 500 mg / l streptomycin, and 50 mg / l kanamycin Was transferred to a YMB plate containing. LBA 4404 is rifampicin and strepto This plasmid confers resistance to kanamycin. You. The plates are incubated at 28 ° C. until the colonies reach the appropriate size (about 4-5 days). Incubated.   Colonies were tested for plasmid content. Plasmid signature of this colony The product is made and the DNA is cut with the appropriate restriction enzymes and run on a 1% agarose gel. Electrophoresis and ensure that the plasmid and insert have the correct size Confirmed that. Blot the cut DNA on a Hybond N + membrane, Properly radiolabeled probe (for plasmid DNA fragments or inserts) Fragment).   Transformed LBA 4404 was stored at -80 ° C. 100 mg / l rifampicin, 5 2 ml LB containing 00 mg / l streptomycin and 50 mg / l kanamycin Inoculate the culture with the bacteria and incubate at 28 ° C with shaking (300-340 rpm) for 48 hours. I was vate. The suspension was diluted 1: 1 with sterile 35% glycerol and 800 μl per tube was dispensed into tubes and stored at −80 ° C.Plant transformation   Transfer the culture of the transformed LBA 4404 bacteria into 2 ml of YMB (pH 7.0). It was made by inoculating and incubating at 28 ° C. for 24 hours. 1:10 suspension Diluted and incubated for an additional 18 hours. Bacteria at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C Centrifuge and rinse the pellet twice with 2.5 ml of 2 mM magnesium sulfate. , In liquid MBa, OD660Resuspended so that nm became 0.5.   The potato plant material used for transformation was reconstituted with 2 μM STS. In vitro maintained in supplemented MBa medium (57,58). More tips and knots Breeding was also done, and if the leaves were large they were removed. Per container containing 80 ml of medium Five shoots are grown at 25 ° C. and the nodes are transformed 30-35 days after subculture It was used for.   The stems of the micropropagated plants are internodes (these are approximately 4 mm Just above and below the clause to use only Cut. Float the explant for 30 minutes in the bacterial suspension and blot on filter paper. Dried and transferred to co-culture plates (MBa co). Wet the graft with liquid MBa The plate was covered with a cloth and left at 25 ° C. for 3 days. Then the graft Was washed with liquid MBa containing 800 mg / l. 2 grafts per ml at 18:00 Shake, then blot, dry and transfer to selection medium.   The selection medium was 50 mg kanamycin and 800 mg carbenicilli per liter. (Duchefa), 0.1 mg GAThree(Gibberellic acid, Sigma), and 1 mg t-zeati This was a solid MBb medium supplemented with thiophene. Aggro remaining after adding carbenicillin Killed bacteria.   The selection medium was subcultured every three weeks.Regeneration of whole potato plants   The transplant-derived shoots that became 1 cm or more by subculture were collected, and 400 mg / l Solid MBa medium containing carbenicillin, 2 μM STS, and 0.5 mg / l t-zeatin Moved to the ground. After about two weeks, the shoots were transferred to root formation medium. Also, the root formation medium , A solid MBa medium supplemented with 2 μM STS.   5 μM STS stock was added to 0.19 g Na in 7 ml water.TwoSTwoOThree-5HTwoO, and 10.19 mg AgNOThreeAnd sterile filtered.   After about two weeks, the shoots had formed roots and were ready to be planted in the soil.   The seedlings are rinsed with warm water to remove the remaining medium, and TKS 2 instant sphagnum (Flora Gard, Germany) in small pots. Seedlings are damp during planting And then watered. Pots are made of plastic at 21% to 23 ° C with 100% humidity The seedlings were placed in a "tent" until they took root in the soil. Then remove the tent, Plants were regularly watered.   After 4 weeks of growth, the seedlings were replanted into large pots (27 cm in diameter) and Transferred to growth chamber at 15 ° C. and dark for 8 hours. When the plant withers, tubers Was recovered.Histochemical localization of β-glucuronidase (GUS) activity   The tissue is cut into small pieces with a razor blade and X-gluc (X-gluc: 5-bromo-4-clo (R-3-Indolyl-β-glucoronide) solution to cover the small pieces. X-gluc solution , 0.1 M NaPOFour(pH 7.0), 1 mM KThree(Fe (CN)6), 0.1 mM KFour(Fe (CN)6) -3HTwoO, 10 mM NaTwo A solution prepared by dissolving 50 mg of X-gluc in a buffer containing EDTA and 3% sucrose. It is a liquid (59).   These portions were incubated in X-gluc at 37 ° C for 2-12 hours. Prevent evaporation I was careful. Remove X-gluc and add 96% ethanol to tissue section To extract chlorophyll and other pigments. Incubation in ethanol Perform overnight at 5 ° C, transfer the tissue the next day to a 2% sucrose solution, and dissolve after about 1 hour. They were examined under a necroscope.Statistical analysis   The difference between individual sugar content at both storage temperatures and the enzyme activity measured during the storage period One-way analysis of variance was performed to examine the significant differences between.   Statistical analysis program JMP from SAS AssociationRPerformed using version 2. JMP AppleRMacintoshRStatistical visualization software forConstruction of binary plasmids pJK4 and pJK5   The coding sequence for potato α-amylase is from plasmid pAmyZ4. (See the detailed description in EP-B-0470145). Briefly, pAmyZ4 is 40 Encodes a 7-amino acid long potato α-amylase precursor, and 149 bp 5 'untranslated sequence and 2 located at the EcoRI site of the polylinker of pmid pBSK- It contains a 3 bp untranslated sequence of 01 bp (see FIG. 2 for the potato AmyZ4 sense sequence). checking). See the pBKS- map in FIG. This cDNA clone is Used to prepare two antisense clones as in   The α-amylase antisense construct was cloned into the pAMYZ4 cDNA clone with SacI and EcoRV. It was prepared by cutting the metal. Next, this 1640 bp fragment was And subcloned into the pIV21 (DW2t) plasmid cut with SacI, and pIVZ4Sac-Ec o A plasmid was prepared. This converts the sequence encoding α-amylase to the 35S promoter. Downstream of the DW2t terminator and upstream of the DW2t terminator in the antisense direction. (See FIG. 5 for antisense sequence). pIVZ4Sac-Eco partial HindIII cleavage is followed by antisense α-amylase and DW2t terminator 35 An approximately 2580 bp fragment containing the S promoter is released. This flag Was subcloned into the pBI121 vector cut with HindIII and the resulting The resulting binary plasmid is named pJK5 (see FIG. 6).   Another α-amylase antisense construct was constructed using SacI and Eco from pAMYZ4. This was re-created using the RV fragment, but this time, this fragment was And subcloning into the pEPL plasmid cut with SacI (of the pEPL plasmid See Materials and Methods for construction). This is an enhanced 35S promoter -An antisense sequence is located downstream of (E35S) and upstream of the DW2t terminator. ing. This plasmid was named pEPLZ4Sac-Eco, and the E35S promoter, Partial HindIII containing antisense potato sequence and DW2t terminator The fragment was further subcloned into pBI121 cut with HindIII and The binary plasmid pJK4 was prepared by the method described above. See FIG.   DNA for constructs pJK4 and pJK5 was purified from E. coli JM109 cells (plasmid isolation See, Materials and Methods) and the 35S sequence for the specific orientation of the insert in pJK4. By using a primer that primes the 51 bp in front of position -90. Confirmed.Transformation and production of potato plants   After appropriate control testing of pJK4 and pJK5 constructs, described in Materials and Methods Thus, pJK4 and pJK5 were transformed into Agrobacterium strain LBA4404. Material and direction As described in the method, using the transformed Agrobacteria, Dianella, Satuma, Potato stem sections of Record and Bintje varieties were transformed.   A GUS test is performed on the leaves obtained from each plant body (see Materials and Methods). If positive, the plants are then transferred to pots and subjected to a 16 hour light period at 22 ° C and They were grown in a dark growth room at 15 ° C. for 8 hours. Transform tubers from pot growing plants A GUS test is also performed to confirm sgenic status, and then genomic DNA is And as described in Methods.   Table 1 shows the integrated colony of 40 independent transgenic potato plants. The peak distribution is shown. Genomic DNA is isolated from each plant and cut with HindIII. Refused. HindIII is one of the GUS genes in all constructs where the GUS gene is complete. At the end of the GUS gene and at the other end of the GUS gene (see, eg, FIG. 6). Cut the border.   Hybridization with a cut fragment of SstI-BamHI from pBI121 containing the GUS gene Measurement of the number of positive bands in each lane after the Predicts the number of incorporated copies. Built-in antisense α -Potato plants transformed with amylase sequences (grown on kanamycin, And GUS-positive tubers show microproliferation (micropro pagation). For the handling of plants for field testing, See Materials and Methods.   Tables 2 and 3 are independent and selected for the 1993 and 1994 field trials, respectively. The number of transgenic lines is shown.   Leaves of all in vitro micropropagated transformed potato plants with GUS activity Stained. The results were then compared with the GUS staining activity of leaves from field grown plants. Was. By comparison of these results, the individual potato lines are typical, and It was shown that the GUS gene was stably expressed in leaves. In addition, both Careful observations with transgenic plants and field plants in the growth room Stably integrated constructs clearly affect the phenotype of transgenic plants I Not shown. Transgenic plants or non-traits in the field or in the growth room No apparent differences in appearance were seen between the transformed control plants.   Constructs (pJK4 and pJK5) predominate in front of the potato α-amylase sequence In vivo Amy type 1 or even containing a constitutive 35S promoter (53) Genes encoding any of the Amy type 3/4 genes are found in potato leaves. Does not appear. This indicates that α-amylase type 1 and 3/4 sense It does not cause problems in leaf metabolism due to apparent deficiency of the tanger RNA.   In summary, the constructed constructs pJK4 and pJK5 are There were no undesirable effects on potato varieties. This is important for utilizing the present invention. It is important. The transgenic potato plant is the first transformed particular Varieties (see Satuma, Record, Dianella or Bintje varieties, materials and methods) Behave like, and similar. Thus, transgenic plants are expressed Typical in terms of type.1993 Experiment using tubers collected in 1998 and 1994   28 independent transgenic lines (4 replicates of 1993 field trial) ) And 40 independent transgenic lines (twice in the 1994 field test) Field-grown tubers from 4) at 4 ° C. in the dark for 4-6 months. And 12 ° C. Every two weeks, three or three Extracts five tubers (two tubers in the fewest cases) from the 1993 field test storage Was. Next, the extracted tubers are processed as described in the “extraction procedure” in the materials and method. I understood. 3-5 strains per storage temperature selected from 1994 field test storage Tubers were removed and these were treated as described above.1993 Analysis of stored tubers from field tests   Sugar analysis was performed as described in Materials and Methods. Each tuber is made of disaccharide Sucrose (consisting of one glucose bound to one molecule of fructose) ), Glucose and fructose content. These sugars And especially the reduced phosphorylated sugars glucose and fructose). The kit used measures the total amount in the tuber extract. Two strains (Transgeni Record and transgenic Bintje) have the corresponding in vitro micro Significantly lower levels of reduction compared to bred and untransformed control lines Sugar showed. At this time, the possible effect of antisense of tuber α-amylase was 28 It can be found in two of the independent transgenic potato lines. this The observed frequency corresponds well with the frequency observed in (60). (60) Smell The potato uridine diphosphonate glucose pyrophosphorylase enzyme 4 of 80 independent potato lines transformed with antisense construct Shows that certain messenger RNA levels are clearly reduced I have. Only the results obtained with the transgenic Bintje strain (called K125-2.1) , Outlined in the following paragraphs.Transgenic K125-2.1 and control strain after storage at 4 ° C and 12 ° C Reducing sugar levels in tubers   Transgenic Bintje strain K125-2.1 (4 ° C and 12 ° C storage respectively) Lines transformed with pJK5 (see Materials and Methods) and untransformed Bint Each individual reducing sugar (glucose and fructose) in the je control line 8) and 8B are shown in FIGS. 8A and 8B. Both K125-2.1 and Bintje controls The tubers extracted from the tuber after storage at 4 ° C compared to the tubers extracted after storage at 12 ° C It is evident from the figure that N has accumulated reducing sugars. Each strain and storage temperature Five tubers from the degree are extracted at the indicated date and individually with the material and method Analyzed as described. The average reducing sugar content of the five tubers extracted is shown in FIG. . Changes in sugar content, for example, between individual plants and by field growth by others As observed (22,23), it was very large among the tubers. Therefore, all results Confirmed by statistical analysis. At that time, the level of reducing sugar in tubers stored at 4 ° C. As expected, significantly higher in both lines compared to tubers stored at 12 ° C. However At the correct level when compared to the Bintje control and K125-2.1 There is a difference. The dotted lines in FIGS. 8A and 8B show potato tubers French fried (chip) If used to make potato tubers, the upper limit of the reducing sugar content that potato tubers can contain Show (5 mg / g tuber raw weight, 8). At this time, control Bintje line or K125-2.1 line Both tubers can be used for chips / crisps after storage at 4 ° C. Did not.   Tubers from both lines stored at 12 ° C can be used for chips / crisps.   Potato tuber reducing sugar used for crisping (chip / crisp production) The upper limit content is indicated by a broken line in FIGS. 8A and 8B (2.5 mg / g tuber fresh weight, 8). Jaga Potato Bintje varieties are often used as table potatoes, and french fried May be used for manufacturing. Only at the very beginning of the new potato season, Can be used for making pu / crisps. This period is usually much earlier than October, 1 Chips / crisps made from Bintje varieties in May are dark brown and unpalatable No. The reason for this is clearly shown in FIG. Tubers contain very high levels of glucose and fructose is there. The same applies to tubers stored at 12 ° C from October to January (collection time) (curve Is above the dashed line, but below the dotted line which is the French fry limit). This and Is a control, the transformed Bintje strain K125-2.1, after storage at 12 ° C, Reducing sugars obviously low enough to be used for chip / crisp production as well as rye A tuber with a content was produced (see FIG. 8A).   Return of K125-2.1 and control Bintje tubers after storage at 4 ° C and 12 ° C, respectively Comparison of the original sugar levels shows that K125-2.1 after storage at 4 ° C as well as after storage at 12 ° C It is shown to have significantly lower reducing sugar levels than Troll Bintje tubers. This 9A (comparison of reducing sugar content of tubers extracted from storage at 4 ° C.) and FIG. 9B (Tubes extracted from storage at 12 ° C). Statistical analysis (see Materials and Methods) Table 4 shows the results.   Significance tests were performed using the Students t-test, and each paired pair was tested under individual variable terms. Were compared.   The line labeled "Reducing Sugar" contains 34 individual tubers and consorts from K125-2.1. Results of analyzing 29 tubers from Troll Bintje for the content of reducing sugars shown It is. Mean ± standard error is indicated, and one, two or three stars are of significance Indicates the level. The amount of tuber reducing sugars from K125-2.1 was Significantly less than both 4 ° C and 12 ° C storage compared to tubers from Bintje (P> 0 .001).   Α of tubers of K125-2.1 and control Bintje after storage at 4 ° C. and 12 ° C. -Amylase activity   Α-amylase activity in tuber extracts was measured as described in Materials and Methods. Specified. Enzyme activity was measured in extracts made from tubers, and sugar content from tubers was measured. (See above) were also measured. Therefore, the sampling period and date should be (Sugar date) (FIGS. 8 and 9). In FIG. 10, α-amylase activity is O D405nm/ Hr / mg protein, and each point is most often independent 5 shows the average value of the five tubers analyzed.   α-amylase activity (using the megazyme kit) In tubers, it has already been measured by Cochrane et al. (22, 23), but These results were directly compared to the results shown here due to the different extraction procedures used. Can not. The data presented here are expressed as activity per mg of extracted protein. In contrast to the data shown, the data obtained by Cochrane indicate that It is expressed as activity per gram, and finally, the extraction assay conditions (extract Volume, incubation buffer, pH, etc.).   FIG. 10 and Table 5 show that tubers from K125-2.1 (on average) were stored at 4 ° C. (P> 0.001). ) And after storage at 12 ° C (P> 0.01), compared to the control line Bintje Has significantly lower α-amylase activity. FIG. 10A and Table 5 The row for Millase “4 ° C. Storage” shows the results for tubers stored at 4 ° C. and FIG. B and the row for α-amylase “store at 12 ° C.” in Table 5 show the results for tubers stored at 12 ° C. Is shown.   In short, tubers of K125-2.1 store tubers at 4 ° C or at 12 ° C With significantly lower sugar levels than control Bintje strains But also significantly lower α-amylase activity compared to control strains Having.   Β-A of tubers of K125-2.1 and control Bintje after storage at 4 ° C and 12 ° C Millase activity   β-amylase was measured in the same tuber extract as α-amylase. β-a Extraction methods for the determination of mylases are described in Materials and Methods. For measuring sugar As was the case, there was greater variability between the tubers, and thus The average value of one (often) tubers is indicated by the dots in FIGS. 11A and B. Figure 11A was obtained from K125-2.1 and control Bintje strains and stored at 4 ° C. Figure 3 shows the resulting β-amylase activity of the tubers that were sampled. Obtained from this result Statistical analysis showed β-amylase activity from K125-2.1 or control Bintje tubers. Indicates that there is no significant difference in sex (β-amylase in Table 5 “store at 4 ° C.” Line). In FIG. 11B and the row of “Storing at 12 ° C.” of β-amylase in Table 5 As shown, control K125-2.1 in tubers sampled from 12 ° C storage. There is no significant difference in β-amylase activity between Roll Bintje. Besides, the shape Transgenic Bintje strain compared to untransformed control Bintje The reduction in α-amylase activity seen with K125-2.1 Result of specific inhibition by the RNA construct (pJK5), It is not the result of the control mechanism. Because β-amylase is similar to the control strain Because only α-amylase activity was affected, It is.   Measure individual reducing sugars (glucose and fructose and sucrose) This has revealed entirely new and unexpected results. These findings Is considered here.   Only glucose levels in α-amylase tubers inhibited by antisense are shadowed Affected, fructose unaffected   Between K125-2.1, both 4 ° C and 12 ° C storage, and control Bintje tubers By comparing the individual glucose and fructose levels of Only glucose levels are specifically reduced in transgenic tubers It has been shown.   FIG. 13B shows fructose sludge from both K125-2.1 and control Bintje tubers. Show bells (sampled on the date noted and often analyzed individually The average value of tubers is shown). Sampled from either 4 ° C storage or 12 ° C storage Regardless, there was no significant difference between the tubers of K125-2.1 and the control Bintje It is clear from the figure (see also the row in Table 3 "Fructose"). on the other hand As shown in FIG. 12A, specific glues of tubers of K125-2.1 and control Bintje There is a big difference between the course levels.   In tubers stored at 12 ° C, K125-2.1 was better compared to control Bintje. Showed significantly lower glucose levels (P> 0.001), which was A reduction of 0% (on average) is reached.   Furthermore, compared to the control Bintje, the tubers of K125-2.1 stored at 4 ° C Previous reductions in reducing sugar levels were only at glucose levels. (See FIG. 12A).   The low glucose level after storage at 4 ° C. in K125-2.1 is consistent with the control Bintje Significantly (P> 0.001) lower than the tuber level, and here the reduction is (on average) 40% While the fructose levels remain the same (Table 3, row of 4 ° C storage, “ Glucose "and" Fructose ").   Thus, the results with the constructs of the present invention are very surprising. Because Lactose is converted to glucose to supply enough substrate to make sucrose. Converted, then sucrose is broken down into equal amounts of glucose and fructose That would have been expected. Especially transgenic Bint stored at 4 ℃ The fructose pool does not seem to be affected in the je strain, while the fructose The fact that glucose is reduced by 40% without affecting glucose Specific Glucose in Potato Tubers Stored at 4 ° C or 12 ° C It clearly shows that it is directly involved in the source level.   Further characterization of enzyme activity   To characterize the potato-derived amylolytic enzyme more thoroughly, Potatoes are extracted and the enzyme is subjected to affinity chromatography (Blue S epharose CL-6B). Bound to affinity column Further separation of the proteins by gel filtration chromatography resulted in 9 Peaks (peak 1 to peak 9) were obtained. For the purification process, the materials and The method will be described in detail.   Hydrolysis of starch-related polysaccharides, partially using amylose as substrateTwo/ KI staining method And partly p-nitrophenyl for α-amylase and β-amylase Analysis was performed by spectrophotometry using oligosaccharides as substrates (Megazyme kit). See fees and methods). Table 6 shows the results.   In the enzyme activities in Table 6, peaks 3 and 7 include α-amylase activity. However, peak 2 mainly contains β-amylase activity. These three pics Also degrade amylose, where the highest amylolytic activity (Amylytic a ctivity) is found in peaks 3 and 7.   Analysis of the final product by Dionex HPLC showed that peak 7 showed hydrolysis of amylose. To produce glucose and maltose. Similar results peak 3, but an increase in glucose and maltose was observed at peak 7 Was much less than about. These final products are added to the remaining peak fraction. Was not detected. The amylolytic activity isolated in peak 7 is When using amylose as a substrate, the final products glucose and maltose Only accumulates and uses soluble starch or maltopentaose as substrate Does not accumulate. Conversely, peak 3 is maltopentaose and malto Decomposes into maltotriose and maltohexaose. Glucose detected Was not done.   Α-amylase, which is the enzyme activity finally separated at peak 7, is It produces glucose and maltose from the loin. However, the yeast from peak 3 The activity also includes α-amylase, but may also include other contaminants such as, for example, Includes miscellaneous items.   These results indicate that α-amylase from potatoes converts amylose to glucose. And hydrolyses to maltose. In addition, these results Consider in combination with the results obtained with the transgenic K125-2.1 Bintje strain Then, the potato tuber α-amylase directly affects the tuber glucose content. Achieves a sufficient reduction in glucose by partially inhibiting the production of enzymes That you can do it. This leads to a surprising and significant decrease in total glucose. I will Accordingly, the present invention provides potato chips and fries, and A new potato system useful for the potato saute and crisp industry To provide you with   Reducing sugar levels in potato tubers stored at low temperatures (eg, 4 ° C.) Tubers stored at a warm temperature (eg, 12 ° C., eg, see FIGS. 8A and B) Up to 10 times higher than the sugar levels found in Therefore, tubers are maintained in warm storage If so, about 70% (and perhaps stronger By lowering glucose levels (further by antisense effects), Ku Of known varieties to chips and / or crisps obtain. Choosing good varieties requires more than sugar content (eg disease resistance, yield, Many other properties are also important, such as bud depth, skin color, tuber shape, and so on. This is because these properties do not always coincide with the low reducing sugar content. It is beneficial to industry.   However, as described herein, a further surprising advantage is that the tubers of the present invention (Less than 7 ° C) and reduced even when compared to warmly stored tubers Sugar does not accumulate. This is very advantageous.   α-amylase activity and β-amylase activity were measured in tubers stored at low temperatures. taller than   Specificity found in cold and warm stored K125-2.1 tubers Comparing the α-amylase activities, as shown in FIG. Higher activity was found to be present. This is shown in FIG. On the case of control Bintje tubers stored cold compared to stored tubers The same is true for Each sampling point was individually analyzed for five (often 2) Average level obtained from tubers. At 4 ° C compared to tubers stored at 12 ° C The higher α-amylase activity found in stored tubers is due to K125-2.1 and control. Significantly (P> 0.05) higher in both rolls Bintje (Table 5, α-amylase , "12 ° C 4 ° C").   This is shown in FIG. 14A and B and in the row for β-amylase in Table 5 at “12 ° C. 4 ° C.” (P > 0.05), the same is true for β-amylase activity.   In particular, this increase in α-amylase activity Average reduction of glucose in tubers of K125-2.1 stored at 40% Explain why not the 70% found in warm stored tubers. K125-2.1 Before the antisense α-amylase sequence (see Figure Map JK5). Lomotor is the predominant and constitutive 35S promoter, and therefore warm (12 ° C) It is not expected to show stronger expression at lower temperatures (4 ° C.) as compared to.   Therefore, by using a more appropriate promoter, a larger amount of anti- Α-amylase is expressed, resulting in glucose levels exceeding 40% For example, it is thought that it is reduced by 70%.   Creation of potato varieties that can be stored at low temperatures   Produce tubers that do not accumulate reducing sugars after storage at low temperatures (below 7 ° C), or At least chipping or crisping Potato cultivars that do not have a reducing sugar content greater than the limit of Can be:   Before the antisense α-amylase sequence (eg used in pJK4, pJK5) , Possibly a cold-inducible promoter with an enhancer preceding it (eg gPAm A construct containing y351 (see FIG. 4 or (65)) was prepared, for example, by Saturn. For potato varieties like a or Record (low sugar variety) or other varieties Transform as described in Materials, Methods. According to the present invention, in the field Cultivated tubers (whether derived from in vitro microproliferated tubers or planted tubers) Can be stored at low temperatures. Therefore these tubers are hula Suitable for b.   Another embodiment of the present invention provides an antisense α-amylase sequence (eg, pJK4, pJK 5) is combined with the potato vacuolar invertase antisense sequence. You. Both antisense sequences are under the control of a single promoter. Can be placed in direct connection with the other array (or these arrays are themselves Promoter and terminator). This is for example the E35S Promo (For example, as found in pJK4) or 35S promoter (for pJK5 ) Or a cold-inducible promoter as described above ( For example, it may ultimately be gPAmy351) with an enhancer. Because the vacuole in Antisense of vertase was stored cold as reported (27). It is effective only in tubers.   This double construct is formed by the breakdown of starch particles by the action of α-amylase. Partially or almost completely prevent the release of glucose. This construct also Maintain at least some glucose and fructose in the form of sucrose molecules , This will result in at least some fructose and possibly little Remove Lucose. Control tubers that have not been transformed in this way The substantial amount of glucose and fructose otherwise present in Absent in these transgenic tubers. For cold-stored tubers In this case, since the amounts of glucose and fructose are up to 10 times higher, For storage at low temperatures at least 90-95% must be removed by double structure Must-have.   Yet another embodiment of the present invention relates to E. coli ADP-glucose pyrophosphorylase (WO91 / 19806) or barley ADP-glucose pyrophosphorylase or jade One of the potato's own ADP-glucose pyrophosphorylase (EP-A-0455316) The sequence encoding in the sense direction in combination with the antisense α-amylase sequence Combination. To have its own promoter, such as the double construct above In a double construct with each sequence having or with the same potato plant Either of the two transformations. First, kanamycin resistance using, for example, pJK4 And then, for example, mannose-6-phosphate isomerate from E. coli Transformation is carried out using a vector containing the ze gene, followed by selection with mannose. form Transformed potato varieties are stored at low and warm temperatures as described above. After, can be fried.   Combines antisense α-amylase sequence with any other amylolytic enzyme It is also possible to make it. This means that the levels of other enzymes, such as β-amylase, It also rises in cold-stored tubers (23). Therefore, α-Amira And antisense sequences for β-amylase (eg (EP-B-0470145). ), Such as soybean clone (66) or sweet potato Obtained by low stringency hybridization using Lone (67) ) Further reduces the amount of glucose.   In another combination, antisense α-amylase is used for the PFK gene (sense or Or antisense) or PFP gene (sense or antisense), or Combines with any other gene involved in either starch synthesis or starch degradation It can be beneficial to match. Further examples of combinations of the present invention include: And combinations of antisense α-amylase with at least one of the following: Branching enzymes (sense or antisense) or sucrose synthase (sense Or antisense) or sucrose-P-synthase (sense or antisense Sense) or UDP-glucose pyrophosphorylase (sense or antisense A) or ADP-glucose pyrophosphorylase (sense or antisense) , Or starch phosphorylase (sense or antisense), or β- Myrase (sense or antisense) or α-glycosidase (sense or antisense) Or antisense) or β-glycosidase (sense or antisense) Or disproportionating enzymes (sense or antisense), or stranded enzymes (sense or antisense) Or antisense) or phosphoglucomutase (sense or antisense) ) Or phosphohexose isomerase (sense or antisense); Is hexokinase (sense or antisense) or fructose-6 phosph Phosphate-2 kinase (sense or antisense) or fructose-2,6-bi Sphosphatase (sense or antisense) or other invertase ( Sense or antisense).   Other types of combinations include potato antisense α-amylase and other Plant genes (for dicotyledonous and monocotyledonous plants, such as ADP-glucose pyro Phosphorylase (eg, from barley)) or pullulana, eg, from bacteria Bacterial or fungal genes such as ullanase or other suitable bacterial enzymes Can be combined with any of the above. A preferred combination is ADP-glucose Pyrophosphorylase and potato antisense α-α Combination with Mirase.   Sense ADP-glucose pyrophosphorylase, antisense α-amylase, And having a triple construct containing antisense vacuolar invertase Is also possible. This construct reduces the levels of reducing sugars in tubers stored at low temperatures. Can be reduced by as much as 95%.   Other modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope of the invention. You.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニールセン， ジョン， エリック デンマーク国 コペンハーゲン エス デ ィーケイ−2300，エンベッジ 38 (72)発明者 ハンセン， ブジャーン， ムンク デンマーク国 セント ヘディンジ ディ ーケイ−4660，ラビベジ 11────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C H, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB , GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, M N, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU , SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventors Nielsen, John, Eric             Copenhagen es de, Denmark             IKE-2300, embed 38 (72) Inventors Hansen, Bujaan, Munch             St. Hedinge di Denmark             -K-4660, Rabibegi 11

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．細胞、組織、器官、または生物において他の還元糖のレベルと比較して、グ ルコースのレベルを選択的に低減させる方法であって、該細胞、組織、器官、ま たは生物中のα-アミラーゼの発現レベルを変える工程を包含する、方法。 ２．アミロペクチンまたはアミロースを酵素的に分解し得る細胞、組織、器官、 または生物において他の還元糖のレベルと比較して、グルコースのレベルを選択 的に低減させる方法であって、該細胞、組織、器官、または生物中のα-アミラ ーゼの活性を少なくとも部分的に阻害する工程を包含する、方法。 ３．前記α-アミラーゼの活性が、第１の転写産物をコードする外来ヌクレオチ ド配列の、前記細胞、組織、器官、または生物中における発現により阻害される 請求項１あるいは請求項２に記載の方法であって、ここで該第１の転写産物は、 α-アミラーゼをコードするヌクレオチド配列の第２の転写産物に結合し、それ により第２転写産物の翻訳を防止し得る、方法。 ４．前記外来のヌクレオチド配列が、配列番号１として示される配列に対して少 なくとも部分的にアンチセンスである配列を有する、請求項３に記載の方法。 ５．前記外来のヌクレオチド配列が、配列番号２に示される配列であるか、また はその変異体、ホモログ、またはフラグメントである、請求項４に記載の方法で あって、ここで、変異体、ホモログ、あるいはフラグメントが、第２の転写産物 の翻訳を防止し得る、方法。 ６．前記外来のヌクレオチド配列が、35Sプロモーターの制御下で発現される、 請求項３〜５のいずれかに記載の方法。 ７．前記細胞、組織、器官、または生物が、植物の構成要素または植物である、 請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．前記植物がジャガイモである、請求項７に記載の方法。 ９．アミロペクチンまたはアミロースを酵素的に分解し得る細胞、組織、器官、 またはトランスジェニック生物であって、外来ヌクレオチド配列を有し、ここで 該ヌクレオチド配列の発現に由来する転写産物は、該細胞、組織、器官中、また は生物中のα-アミラーゼの活性を少なくとも部分的に阻害する、細胞、組織、 器官、またはトランスジェニック生物。 １０．前記外来ヌクレオチド配列が請求項４または請求項５で規定される配列で ある、請求項９に記載の細胞、組織、器官、またはトランスジェニック生物。 １１．前記生物が請求項７または請求項８のいずれかで規定される生物である、 請求項９または請求項１０に記載の細胞、組織、器官、またはトランスジェニッ ク生物。 １２．プロモーターおよび請求項４または請求項５のいずれかで規定される外来 ヌクレオチド配列を含有する、構築物、形質転換ベクター、または発現ベクター 。 １３．請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞、組織、器官、または生物から調 製される食料。 １４．前記食料がフライドポテトまたはベークドポテトである、請求項１３に記 載の食料。 １５．前記食料がクリスプ、チップ、またはポテトフライである、請求項１４に 記載の食料。 １６．アミロペクチンまたはアミロースを酵素的に分解し得る細胞、組織、器官 中、または生物において、他の還元糖のレベルと比較して、グルコースのレベル を選択的に低減させるためのアンチセンスα-アミラーゼの使用。[Claims] 1. Compared to other reducing sugar levels in cells, tissues, organs, or organisms, A method for selectively reducing the level of glucose, wherein said cells, tissues, organs, or Or altering the expression level of α-amylase in the organism. 2. Cells, tissues, organs, capable of enzymatically degrading amylopectin or amylose, Or select glucose levels compared to other reducing sugar levels in the organism Alpha-amilla in said cell, tissue, organ, or organism. At least partially inhibiting the activity of the enzyme. 3. The activity of the α-amylase is determined by the presence of a foreign nucleoside encoding the first transcript. Is inhibited by the expression of the nucleotide sequence in the cell, tissue, organ, or organism. 3. The method according to claim 1 or claim 2, wherein the first transcript is binds to a second transcript of the nucleotide sequence encoding α-amylase, and The translation of the second transcript can be prevented. 4. The foreign nucleotide sequence is small relative to the sequence set forth as SEQ ID NO: 1. 4. The method of claim 3, having a sequence that is at least partially antisense. 5. The foreign nucleotide sequence is the sequence shown in SEQ ID NO: 2, Is a variant, homolog, or fragment thereof. And wherein the mutant, homolog, or fragment is a second transcript Method that can prevent translation of 6. The exogenous nucleotide sequence is expressed under the control of a 35S promoter, The method according to claim 3. 7. The cell, tissue, organ, or organism is a component or plant of a plant, The method according to any one of claims 1 to 6. 8. The method according to claim 7, wherein the plant is potato. 9. Cells, tissues, organs, capable of enzymatically degrading amylopectin or amylose, Or a transgenic organism having a foreign nucleotide sequence, wherein Transcripts derived from the expression of the nucleotide sequence are found in the cells, tissues, organs, and Is a cell, tissue, or cell line that at least partially inhibits the activity of α-amylase in an organism. Organ, or transgenic organism. 10. The foreign nucleotide sequence is a sequence defined in claim 4 or claim 5. A cell, tissue, organ, or transgenic organism according to claim 9. 11. The organism is an organism defined in any one of claims 7 or 8. A cell, tissue, organ, or transgenic cell according to claim 9 or claim 10. Creature. 12. A promoter and an exogenous gene as defined in claim 4 or claim 5. A construct, transformation vector, or expression vector containing a nucleotide sequence . 13. A cell, tissue, organ, or organism according to claim 9. Food made. 14． 14. The method according to claim 13, wherein the food is french fries or baked potatoes. Food listed. 15. 15. The method of claim 14, wherein the food is a crisp, chip, or fried potato. Food stated. 16. Cells, tissues and organs capable of enzymatically degrading amylopectin or amylose Medium or in organisms, the level of glucose as compared to the level of other reducing sugars Use of an antisense α-amylase to selectively reduce the amount of α-amylase.
JP8513606A 1994-10-21 1995-06-06 Methods for reducing sugar levels in organisms Pending JPH10507365A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9421287A GB9421287D0 (en) 1994-10-21 1994-10-21 A method of reducing the level of sugar in an organism
GB9421287.5 1994-10-21
PCT/EP1995/002197 WO1996012812A1 (en) 1994-10-21 1995-06-06 A method of reducing the level of sugar in an organism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10507365A true JPH10507365A (en) 1998-07-21

Family

ID=10763214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8513606A Pending JPH10507365A (en) 1994-10-21 1995-06-06 Methods for reducing sugar levels in organisms

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0787192A1 (en)
JP (1) JPH10507365A (en)
AU (1) AU2788295A (en)
CA (1) CA2202895A1 (en)
GB (2) GB9421287D0 (en)
WO (1) WO1996012812A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505287A (en) * 2002-11-08 2006-02-16 バイエル クロップサイエンス ゲーエムベーハー Method for reducing the acrylamide content of heat-treated foods

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2251738T3 (en) * 1996-07-30 2006-05-01 Universitat Heidelberg INVERTER INHIBITOR.
DE19709775A1 (en) 1997-03-10 1998-09-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleic acid molecules encoding corn starch phosphorylase
US5994623A (en) * 1997-04-09 1999-11-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Corn 4-α-glucanotransferase
ZA989782B (en) * 1997-10-30 1999-05-04 Mogen Int Pre-and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
WO1999036551A1 (en) * 1998-01-15 1999-07-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant phosphoglucomutase homologs
KR101516421B1 (en) * 2013-08-22 2015-05-26 김시언 Instant measuring method for glucose content of potato

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK198089D0 (en) * 1989-04-24 1989-04-24 Danske Spritfabrikker DNA MATERIALS AND USE THEREOF
AU644619B2 (en) * 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
IE913215A1 (en) * 1990-09-13 1992-02-25 Gist Brocades Nv Transgenic plants having a modified carbohydrate content
GB9117159D0 (en) * 1991-08-08 1991-09-25 Cambridge Advanced Tech Modification of sucrose accumulation
DE4213444A1 (en) * 1992-04-18 1993-10-28 Inst Genbiologische Forschung Prodn. of potato plants with suppressed tuber sprouting - by genetic modification to reduce sucrose concn.
JPH08510645A (en) * 1993-05-28 1996-11-12 モンサント・カンパニー How to improve the quality of stored potatoes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505287A (en) * 2002-11-08 2006-02-16 バイエル クロップサイエンス ゲーエムベーハー Method for reducing the acrylamide content of heat-treated foods
JP4699898B2 (en) * 2002-11-08 2011-06-15 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー Method for reducing the acrylamide content of heat-treated foods

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996012812A1 (en) 1996-05-02
MX9702912A (en) 1997-07-31
CA2202895A1 (en) 1996-05-02
EP0787192A1 (en) 1997-08-06
GB9421287D0 (en) 1994-12-07
GB9521449D0 (en) 1995-12-20
GB2294266A (en) 1996-04-24
AU2788295A (en) 1996-05-15
GB2294266B (en) 1997-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3511027B2 (en) DNA sequence encoding an enzyme capable of promoting the synthesis of linear α-1,4 glucan in plants, fungi and microorganisms
JP4068152B2 (en) Manipulation of cellulose and / or β-1,4-glucan
US6483010B1 (en) DNA molecules encoding enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing these molecules
AU2002333434B2 (en) Coffee plant with reduced alpha-D-galactosidase activity
US6307124B1 (en) Nucleic acid molecules encoding soluble starch synthases from maize
US20050009165A1 (en) Raffinose synthase gene, method for producing raffinose, and transgenic plant
US20070067874A1 (en) Plants which synthesize a modified starch, process for the production thereof and modified starch
AU8991198A (en) Improvements in or relating to stability of plant starches
JP2000509286A (en) Nucleic acid molecule encoding potato debranching enzyme
JPH10504453A (en) Novel isoamylase gene, compositions containing this gene, and methods of using isoamylase
CN101970668A (en) Plants with modified starch metabolism
JPH05317052A (en) Method of producing plasmid, vegetable cell and transformed plant, material substance for extracting potato tuber and sucrose and food and feed with enriched protein
US8796505B2 (en) Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment
JPH08510645A (en) How to improve the quality of stored potatoes
EA008669B1 (en) A method of increasing the total or soluble carbohydrate content or sweetness of an endogenous carbohydrate by catalysing the conversion of an endogenous sugar to an alien sugar
AU2006304484A1 (en) Nucleic acids and proteins associated with galactomannan synthesis in coffee
JPH10507365A (en) Methods for reducing sugar levels in organisms
JP3538428B2 (en) Plant promoter and gene expression method using the promoter
JPH09509841A (en) Methods for inhibiting and inducing flower bud formation in plants
Gupta et al. Fructan metabolism in Jerusalem artichoke and chicory
US20050160497A1 (en) Soybean raffinose synthase and a method for producing raffinose
JP4410318B2 (en) Raffinose synthase gene, method for producing raffinose and transformed plant
JPH11514521A (en) Modified plants and plant products
JP3861370B2 (en) Raffinose synthase gene, method for producing raffinose and transformed plant
JP4238909B2 (en) Raffinose synthase gene, method for producing raffinose and transformed plant