JP3861370B2 - Raffinose synthase gene, method for producing raffinose and transformed plant - Google Patents

Description

各々の反応は（ａ）ガラクチノール合成酵素（ＧＳ：EC2.4.1.123）、（ｂ）ラフィノース合成酵素（ＲＳ：EC2.4.1.82）（ｃ）スタキオース合成酵素（ＳＴＳ：EC2.4.1.67）により触媒される。
【０００４】
現在、ラフィノースは、甜菜から抽出され、スクロース精製過程において分離精製されている。しかし、ラフィノースはスクロースの結晶性を低下させるので、甜菜は低ラフィノースを目標に育種、改良され、甜菜中のラフィノース含量は０．０３％から０．１６％（Enzyme Microb. Technol., Vol.4 May, 130-135(1982)）と低い。従って、このような低含量の甜菜より効率的にラフィノースを得るのは容易ではない。
【０００５】
先に述べたように、ラフィノースは、ダイズをはじめとするマメ科の成熟種子に含まれているほか、甜菜、あるいはキュウリなどのウリ科植物に含まれている。ダイズの成熟種子中には、ダイズオリゴ糖として、スクロース（含有量約５％）、スタキオース（同約４％）、ラフィノース（同約１％）が含まれている。これらのダイズオリゴ糖は、脱脂ダイズから除蛋白した画分に回収され、濃縮後、機能性食品などに利用されている。しかし、オリゴ糖全体の中でもラフィノースは１０％であり、量的にも少ない。
【０００６】
一方、ラフィノースの酵素的合成法も報告されている（Trends in Glycoscience and Glycotechnology 7.34, 149-158(1995)）。これは、α-ガラクトシダー ゼの縮合反応によりガラクトビオースを合成し、さらにこのガラクトビオースをガラクトシル基の供与体としてスクロースにガラクトシル転移反応により転移させて、ラフィノースを合成する方法である。しかし、この反応は、乳糖加水分解物１．９ｋｇよりガラクトビオースが３５０ｇ合成され、ガラクトビオース１９０ｇとスクロース７６０ｇよりラフィノース１００ｇが得られる反応であり、生成するラフィノースの収率が低く、効率的な合成法には至っていない。
【０００７】
以上のような方法の他に、生合成系酵素遺伝子の形質転換により、ラフィノース含量の高い植物を育種する方法も考えられる。例えば、Ｋｅｒｒらはガラクチノール合成酵素遺伝子をクローニングし、ナタネを形質転換した（WO93/02196）。しかし、その結果、ＧＳ活性は増加したが、ラフィノース族オリゴ糖は逆に低下し、ガラクチノール合成酵素を導入することによるラフィノース族オリゴ糖の生合成を増加させるという目的は達成されなかった。したがって、植物のラフィノース族オリゴ糖の含量を増加させるする方法は提供されていない。
【０００８】
一方、ラフィノ―ス族オリゴ糖を低減化することも求められている。先に述ベたように、ラフィノース族オリゴ糖は、主に、ダイズなど豆類、ナタネ、綿実など様々な植物の種子中の貯蔵糖と、キュウリやメロンなどウリ科植物にみられる転流糖として、また、耐冷性を獲得したロゼット葉、甜菜、など植物に広く存在するが、ダイズ、ナタネ、綿菜などの搾油されたミールには、これらのラフィノース族オリゴ糖が含まれている。これらミールのほとんどは、飼料として利用されているが、α−ガラクトシダーゼを持たないヒトや動物は、直接ラフィノース族オリゴ糖を消化することはできない。さらに、ラフィノース族オリゴ糖は、腸内細菌が資化しガスを発生させるなどにより、飼料の代謝エネルギー効率を低下させることが知られており、飼料中のラフィノース族オリゴ糖を除くことで、トリの飼料効率が上昇したと報告されている（Coon, Proceeding Soybean Utilization Alternatives. Univrsity of Minnesota, 203-211 (1989)）。このようなことから、ラフィノース族オリゴ糖の減少したダイズ、ナタネ、綿実などの飼料作物が望まれている。
【０００９】
また、これらの植物の中では、油の含量を多くする育種がなされてきた。光合成産物は、油脂、蛋白質、ラフィノース族オリゴ糖を含む糖質に分配されている。ダイズでは、油脂量と糖質量に逆の相関があることが報告されている。ラフィノース族オリゴ糖の生成を抑制することにより、同じ光合成の能カのダイズにおいて油脂含量を増加させることが期待できる。
【００１０】
以上の観点から、Ｋｅｒｒらは、交配選抜育種により、ラフィノース族オリゴ糖が８０％から９０％低下した低ラフィノース族オリゴ糖ダイズ品種を作出したと報告している（WO93/00742）。しかしこれは、品種の作出であり、栽培適性や、耐病性などに対応した様々な品種に応用できるものではない。また、広く様々な植物に適用できるものではない。
【００１１】
甜菜、サトウキビなどにも含まれるラフィノースは、砂糖の結晶性を低下させることが知られている。従って、ラフィノースの生成がなければ、これら植物での砂糖の生成効率が上がることが期待できるが、ラフィノースを含まないテンサイは作出されていない。
【００１２】
上述したように、従来精製されたラフィノース合成酵素は、酵素活性として確認されているのみであり、酵素の同定はなされていなかった。また、その活性も低いものであり、活性の高いラフィノース合成酵素が望まれていた。また、従来のラフィノースの製造法は収率が低く、効率のよいラフィノースの製造法が望まれていた。その一方で、ラフィノ―ス族オリゴ糖が低減化された植物を育種することも望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、活性の高いラフィノース合成酵素及びこれをコードするＤＮＡの取得、効率的なラフィノースの酵素的合成法、及びラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡの植物における利用法を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、キュウリからラフィノース合成酵素を精製することに成功した。また、このラフィノース合成酵素をコードする遺伝子をクローニングするために、本発明者らは鋭意検討を行った。その結果、キュウリのラフィノース合成酵素ペプチド断片のアミノ酸配列より推定した塩基配列をもとに一本鎖ＤＮＡを化学合成し、この一本鎖合成ＤＮＡをプライマーとして、キュウリから抽出したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ラフィノース合成酵素遺伝子に特異的なＤＮＡ断片を得た。さらに、このＤＮＡ断片をプローブとしてキュウリ由来ｃＤＮＡライブラリーに対しハイブリダイゼーションを行い、ラフィノース合成酵素遺伝子を単離する方法を採用し、ラフィノース合成酵素遺伝子を単離した。この単離したラフィノース合成酵素遺伝子断片を用い、植物で発現可能な制御領域を有するキメラ遺伝子を作成し、植物を形質転換した。さらに、導入したラフィノース合成酵素遺伝子により、内在性ラフィノース合成酵素の機能を制御し、ラフィノース族オリゴ糖の低減化した植物を作出するに至った。
すなわち本発明は、下記性質を有するラフィノース合成酵素を提供する。
【００１５】
（１）作用及び基質特異性：スクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する。
【００１６】
（２）至適ｐＨ：約６〜８
（３）至適温度：約３５〜４０℃
（４）分子量：
▲１▼ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子量：約７５ｋＤａ〜９５ｋＤａ
▲２▼ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）により測定される分子量：約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａ
▲３▼還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定される分子量：約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａ
（５）阻害：
ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド、ミオイノシトールにより阻害される。
【００１７】
本発明は、上記ラフィノース合成酵素の具体的な態様として、アミノ酸配列中に、配列表配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列を含むラフィノース合成酵素を提供する。
【００１８】
また、本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質であるラフィノース合成酵素を提供する。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活性を有するタンパク質。
【００１９】
本発明はまた、スクロース及びガラクチノールに上記ラフィノース合成酵素を作用させてラフィノースを生成させることを特徴とするラフィノースの製造方法を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、上記ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡ、及び、
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活性を有するタンパク質。
【００２１】
本発明は、上記ＤＮＡの具体的態様として、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを提供する。
【００２２】
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５６〜２４０７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５６〜２４０７からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２３】
さらに本発明は、ラフィノース合成酵素遺伝子又はその一部と、植物細胞で発現可能な転写制御領域とを含むキメラ遺伝子、及び、このキメラ遺伝子で形質転換された植物を提供する。
【００２４】
また本発明は、前記キメラ遺伝子で植物を形質転換し、この遺伝子を植物細胞内で発現させることにより、前記植物のラフィノース族オリゴ糖含量を変化させる方法を提供する。
【００２５】
以下、上記（１）〜（５）に記載の性質を有するラフィノース合成酵素、又は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質であるラフィノース合成酵素を、単に「ラフィノース合成酵素」ということがある。また、ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡ、又はラフィノース合成酵素をコードし、さらに非翻訳領域を含むＤＮＡを、「ラフィノース合成酵素遺伝子」ということがある。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
＜１＞本発明のラフィノース合成酵素
本発明のラフィノース合成酵素は、下記性質を有する。
【００２８】
（１）作用及び基質特異性：スクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する。
【００２９】
（２）至適ｐＨ：約６〜８
（３）至適温度：約３５〜４０℃
（４）分子量：
▲１▼ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子量：約７５ｋＤａ〜９５ｋＤａ
▲２▼ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）により測定される分子量：約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａ
▲３▼還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定される分子量：約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａ
（５）阻害：
ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド、ミオイノシトールにより阻害される。
【００３０】
上記の性質を有するラフィノース合成酵素は、キュウリ本葉より単離、精製されたものであり、発明者により初めて同定された。このキュウリ由来のラフィノース合成酵素は、後記実施例に示すように、その酵素タンパク質のアミノ酸配列中に、配列表配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列を含んでいる。また、その全アミノ酸配列を、配列表配列番号５に示す。
【００３１】
ラフィノース合成酵素は、ウリ科植物、例えばメロン（Cucumis melo）、キュウリ（Cucumis sativas）などの植物から得られる。特に、これらの植物の葉、 特に葉脈系、及び種子等の組織がラフィノース合成酵素の含有量が多い。
【００３２】
次に、本発明のラフィノース合成酵素の製造法の例として、キュウリからラフィノース合成酵素を単離・精製する方法を説明する。
播種後６〜１０週間のキュウリ本葉より、葉脈系を集め、液体窒素下で乳鉢等を用いて磨砕し、緩衝液を加えて蛋白質を抽出する。その際、ラフィノース合成酵素の分解、失活等を防ぐための物質、例えばＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）等のプロテアーゼ阻害剤や、ポリクラールＡＴ（セルバ(Ｓ ｅｒｖａ)社製）等を加えてもよい。この抽出液から濾過及び遠心分離により不 溶物を除去し、粗抽出液を得る。
【００３３】
上記のようにして得られる粗抽出液を、通常のタンパク質の精製法、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過、塩析等を組み合わせて分画することによって、ラフィノース合成酵素を精製することができる。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）等の強塩基性陰イオン交換体や、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製）等の弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラムを用いることによって行うことができる。ラフィノース合成酵素を含む抽出液をこれらのカラムに通液させて酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＨｉＴｒａｐＱカラムを用いた場合には、カラムに吸着したラフィノース合成酵素活性は、０．３Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。また、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬでは溶出液として０．０５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌ濃度勾配が、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーでは溶出液として０．０１Ｍ〜０．３Ｍのリン酸濃度勾配が好ましい。
【００３５】
上記の操作の順は特に問わず、また、各操作は２回又はそれ以上繰り返してもよい。また、それぞれのカラムに試料液を通液する前に、透析等によって試料液を適当な緩衝液に交換しておくことが望ましい。さらに、それぞれの段階で試料液を濃縮してもよい。
【００３６】
精製の各段階においては、分画されたフラクション中に含まれるラフィノース合成酵素活性を測定し、活性の高いフラクションを集めて次の段階に供試することが好ましい。ラフィノース合成酵素活性を測定する方法としては、例えば、Lehle,H らにより報告されている放射性同位体を用いる方法（Eur.J.Biochem.,38,103-110(1973)）が挙げられる。また、この変法として、反応温度と基質濃度を 変更してもよい。例えば、最終濃度として、１０ｍＭ ¹⁴Ｃ-スクロース、２０ｍＭ ガラクチノール、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)エタンスルホン酸）-ＮａＯＨ，ｐＨ７．０、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む反応液に、１０μｌの酵素液を加えて５０μｌとする。これを、３２℃、１時間インキュベートして反応を行い、２００μｌのエタノールを加え、９５℃で３０秒間加熱して、反応を停止する。この反応液の遠心上清をワットマン３ＭＭ濾紙にスポットし、ｎ−プロパノール：酢酸エチル：水＝４：１：２にて展開した。¹⁴Ｃのラフィノースへの取り込みを調べ、これをラフィノース合成酵素活性（ｎｍｏｌ／時間）とする。
【００３７】
本発明者は、上記の方法に代わる方法として、ラフィノース合成反応により生成するラフィノースをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により定量することによって、ラフィノース合成酵素活性を測定する方法を開発した。この方法によれば、Lehle,Hらの方法に比べて簡便かつ迅速に測定することができ、特に 精製操作における活性フラクションの検出には好適である。以下に本方法を説明する。
【００３８】
ラフィノース合成反応は、最終濃度が下記の組成になるように調製した反応液に１０〜５０μｌのラフィノース合成酵素液を添加して１００μｌとし、３２℃で６０分間、反応を行う。
【００３９】
〔反応液組成（最終濃度）〕
2.5 mM スクロース
5 mM ガラクチノール
5 mM ＤＴＴ
20 mM トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００４０】
上記のようにして反応を行った後、反応液の４倍容のエタノールを加え、９５℃で３０秒間加熱して反応を停止する。これを遠心し、遠心上清を減圧乾固した後、蒸留水に溶解し、ＨＰＬＣにて反応生成物中のラフィノースを定量し、ラフィノース酵素活性とする。ＨＰＬＣは、例えば、糖分析システムＤＸ５００（CarboPac PA1カラム、パルスドアンペロメトリー検出器（ダイオネクス社製））を用いて行うことができる。
【００４１】
反応時間を変化させたときの生成ラフィノース量を上記の方法により測定した結果を図１に示す。図から明らかなように、本方法により、ラフィノース合成酵素活性を直線性よく、かつ簡便に測定することができる。
【００４２】
精製されたラフィノース合成酵素の精製度の確認や分子量の測定は、ゲル電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素学的性質は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イオン等を反応液に添加し、残存酵素活性を測定することによって、検討すればよい。さらに、ラフィノース合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。
【００４３】
前記したラフィノース合成酵素の性質は、このようにして決定されたものであるが、測定条件によって異なる結果が得られる場合があることに留意すべきである。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量の測定は、用いるゲルろ過剤や緩衝液の種類、あるいは分子量マーカーによって、影響される。また、酵素活性は、同じｐＨであっても緩衝液の種類又は塩濃度によって異なることが多い。したがって、ラフィノース合成酵素の同定に際しては、個々の性質のみではなく、総合的な検討を行うことが好ましい。
【００４４】
本発明のラフィノース合成酵素は、上記のようにキュウリから単離・精製することによって得られるが、異種タンパク質の醗酵生産に通常用いられている方法によって、後述するラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを適当な宿主に導入し、発現させることによっても製造することができる。
【００４５】
ラフィノース合成酵素遺伝子を発現させるための宿主としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をはじめとする種々の真核細胞が考えられるが、植物細胞、特にタバコ、キュウリ、シロイヌナズナ（アラビドプシス）等の植物由来の細胞が望ましい。
【００４６】
形質転換に用いる組み換えプラスミドは、発現させようとする細胞の種類に応じた発現ベクターに、ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを挿入することで調製可能である。植物の発現ベクターは、植物で働くプロモーターＤＮＡ配列、またはそれらを複数個組み合わせたものと、植物で働くターミネーターＤＮＡ配列を持ち、その両側に外来遺伝子を挿入できる配列を有するものであればよい。
【００４７】
このようなプロモーターには、植物体全体で発現するＣａＭＶ ３５ＳＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ １９ＳＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等、緑色組織で発現するＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニットプロモーター等、種子などの部位特異的に発現するナピン（ｎａｐｉｎ）、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）等の遺伝子のプロモーター等が挙げられる。さらに、上記のようなターミネーターとしてはノパリン合成酵素ターミネーター、ＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニット３’側部位等が挙げられる。
【００４８】
植物用の発現ベクターとしてｐＢＩ１２１、ｐ３５Ｓ−ＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等が市販されているのでこれを用いてもよい。ウイルスＲＮＡを発現するベクターを用い、そのコードしている外皮蛋白質などの遺伝子をラフィノース合成酵素遺伝子に置換してもよい。
【００４９】
形質転換には通常用いられている方法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等を、供試する宿主細胞に応じて用いればよい。ラフィノース合成酵素活性の検出には、ラフィノース合成酵素精製を行った方法を用いることができる。その際、試料を陰イオン交換カラムに通すなどして、あらかじめα‐ガラクトシダーゼを除いておくことが望ましい。
【００５０】
キュウリ由来のラフィノース合成酵素をコードする遺伝子とは、発現した時にラフィノース合成酵素活性を有するものであればすべて含まれるが、好ましくは、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する遺伝子、又は配列表の配列番号４記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。尚、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子とは、コドンの縮重を考慮すると種々の塩基配列が包含される。即ち、このような種々の塩基配列の中から、遺伝子発現系の諸要素、たとえば宿主細胞の種類等による優先コドン、転写されたＲＮＡにより形成される高次構造の回避などを考慮して選択すればよい。選択された塩基配列は、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【００５１】
＜２＞本発明のラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡ
ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡは、キュウリなどの植物体から単離したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることによって、取得することができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ラフィノース合成酵素タンパク質の部分アミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（polymerase chain reaction）によって増幅することによって、取得することができる。
【００５２】
以下に、キュウリ由来のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから本発明のＤＮＡを取得する方法を具体的に説明する。
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡの抽出部位としては、ラフィノース合成酵素遺伝子が発現していればキュウリ植物体のどこを用いても良く、様々な生長段階の葉、茎、蕾、果実、種子等より得ることができるが、望ましくは果実をつけた後の展開葉、特に葉脈部分を材料とするのがよい。
【００５３】
キュウリ組織から全ＲＮＡを抽出するには、効率よく損傷の少ないＲＮＡが得られるならば方法は制限されず、例えば、フェノール／ＳＤＳ法、グアニジンイソチオシアネート／塩化セシウム法等、公知のいずれの方法によっても可能である。こうして得た全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）担体を用いてｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを分離できる。また、全ＲＮＡを抽出せずにｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを得ることのできるキット（ＭＰＧ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＰＧ，ＩＮＣ．社等）を使用しても良い。
【００５４】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用するプローブのＤＮＡ断片は、ＰＣＲを行うことで得ることができる。既にわかっているペプチド断片のアミノ酸配列、例えば配列表配列番号１〜３に示すアミノ酸配列より推定される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを化学合成し、これをプライマーに用いてＰＣＲを行う。プライマーには、得られているペプチド断片のアミノ酸配列のどの部分を用いてもよいが、コドンの縮重が少なく、複雑な高次構造を形成しないと思われる配列を選ぶのが望ましい。また、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ：ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ａ Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＡＤＥＭＩＣ ｐｒｅｓｓ ＩＮＣ．ｐ２８〜３８）を行っても良い。
【００５５】
このようなＰＣＲの鋳型には、ｃＤＮＡライブラリー、一本鎖ｃＤＮＡを用いることが望ましい。ＰＣＲ反応に逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ、場合によっては全ＲＮＡを用いても良い。
【００５６】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためには、まずｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを鋳型にし、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等を用い、逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次にグブラ−ホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ）法、オカヤマ−バーグ（０ｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ、１９８９）等により二本鎖ｃＤＮＡを合成する。ラフィノース合成酵素遺伝子の発現量が少ない場合には、ＰＣＲを利用したｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｃａｐｆｉｎｄｅｒ ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）等）を用いて、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅してもよい。このようにして合成したｃＤＮＡは、平滑末端化、リンカーの付加、ＰＣＲによる制限酵素サイトの付加等を行うことにより、ファージベクター、プラスミド等のクローニングベクターにクローニングできる。
【００５７】
ハイブリダイゼンション用のプローブには、上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片のうち、ラフィノース合成酵素ｃＤＮＡに特徴的な部分を選ぶ。また、５’末端側に近いＤＮＡ断片を選ぶのが望ましい。このように選んだ増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応液から精製する。この際、増幅したＤＮＡ断片をプラスミドを用いてサブクローニングし、プラスミドを大量調製してから制限酵素で切断し、電気泳動後にゲルを切り出して精製しても、また、プラスミドを鋳型にＰＣＲを行って、目的部分だけを増幅して用いてもよい。さらには、最初に増幅したＤＮＡ断片の量が十分に多い場合には、増幅したＤＮＡ断片をサブクローニングせずに電気泳動し、目的ＤＮＡ断片のバンドを含むゲル断片を切り出し、そのゲル断片から精製してもよい。
【００５８】
ｃＤＮＡライブラリーから目的クローンを得るためのスクリーニングにはハイブリダイゼーションを行う。上記の方法で得られたＤＮＡ断片はラベルしてハイブリダイゼーションのプローブとすることができる。ラベルにはラジオアイソトープ、ビオチン等、種々のものを用いることができるが、ランダムプライミング法でラベルすることが望ましい。また、スクリーニングにはハイブリダイゼーションではなくＰＣＲを用いてもよい。さらに、ハイブリダイゼーションとＰＣＲを組み合わせてもよい。
【００５９】
上記のようにして得られたキュウリ由来のラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、及びこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号４に例示する。また、このアミノ酸配列のみを配列番号５に示す。後記実施例３で得られたラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＭｏｓｓｌｏｘＣＲＳを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９の形質転換体ＡＪ１３２６３は、平成８年１１月１９日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブダペスト条約に基づき国際寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４８が付与されている。
【００６０】
本発明のＤＮＡは、コードされるラフィノース合成酵素の活性、すなわちスクロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むラフィノース合成酵素タンパク質をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従って、キュウリ由来ラフイノース合成酵素を構成する７８４アミノ酸残基全体に対し、３５から４０％以上の相同性を有し、ラフイノース合成酵素活性を有するものであってもよい。さらに、好ましくは、５１０番日のアミノ酸から６１０番日のアミノ酸の間において、６５％の相同性を有することである。さらに好ましくは、「数個」が、２から４０個、好ましくは、２から２０個、さらに、２から１０個である。
【００６１】
遺伝子全長において、約５０％以上の相同性があり、かつ、その中で約３００塩基にわたる６５％以上の相同性がある遺伝子を含む。そのような遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを用いて、キュウリ由来ラフイノース合成酵素遺伝子に対し相同性を有する遺伝子を検索することによって、塩基配列情報を得ることができる。ホモロジー解析プログラムはＬｉｐｍａｎ−Ｐｅｒｓｏｎ法を採用したＧＥＮＥＴＩＸ−ＭＡＣ（遺伝子情報処理ソフトウエア、ソフトウエア開発社）などを用いてもよく、また、インターネット上に公開されているものを使用してもよい。このような方法により得られた塩基配列は遺伝子全長を含む場合と、遺伝子全長を含まない場合がある。遺伝子全長を含まない場合は、目的植物組織より抽出したＲＮＡを鋳型に、キュウリ由来ラフイノース合成酵素遺伝子と相同性の高い部位に対応するプライマーを用い、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法にて、容易に全長遺伝子を取得することができる。得られた全長遺伝子は、Soluble Protein Expression System(lNVITROGEN社)や、Tight Control Expression System (INVITROGEN社）や、QIAexpress System(QIAGEN社)などのキットが提供する適当な発現ベクターに組み込み、遺伝子を発現させ、記載の方法でラフィノース合成酵素活性を測定し、活性を有するクローンを選抜すればよい。
【００６２】
このようなラフィノース合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００６３】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、キュウリの個体差、品種間差、遺伝子の多コピー化、各器官、組織の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれる。
【００６４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のラフィノース合成酵素活性を調べることにより、ラフィノース合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号４に記載の塩基配列のうち、塩基番号５６〜２４０７からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラフィノース合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ラフィノース合成酵素タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ペクターにつなぎラフィノ―ス合成酵素活性を記述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００６５】
尚、本発明のＤＮＡを、ラフィノース合成酵素のアンチセンスＲＮＡを発現させるために用いる場合には、このＤＮＡは活性のあるラフィノース合成酵素をコードしている必要はない。また、センスＲＮＡによっても、相同性のある内在性遺伝子の機能を抑制することができる。このような場合も、ＤＮＡが活性あるラフイノース合成酵素遺伝子をコードしている必要はなく、また、全長を含まなくてもよく、好ましくは、６０％の相同性を有するＮ末端側翻訳領域が５００塩基対程度あれぱよい。
【００６６】
本発明者らが目的とする、キュウリ由来のラフィノース合成酵素のｃＤＮＡのクローニングに成功した方法は上述の通りであるが、それ以外に下記の方法が挙げられる。
【００６７】
（１）キュウリ由来のラフィノース合成酵素を単離精製し、決定されるアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合成する。
【００６８】
（２）キュウリ植物体から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベクター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからラフィノース合成酵素遺伝子を、ハイブリダイゼーンション又はＰＣＲによって取得する。尚、染色体由来のラフィノース合成酵素遺伝子は、コード領域にイントロンが含まれることが予想されるが、このようなイントロンによって分断されたＤＮＡであっても、ラフィノース合成酵素をコードする限り本発明のＤＮＡに含まれる。
【００６９】
（３）ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを分子量等によって分画し、ホイートジャーム又はウサギ網状赤血球を用いたインビトロ翻訳系に供し、ラフィノース合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡが存在する画分を決定し、それより目的のｃＤＮＡ断片を作製、取得する。
【００７０】
（４）抗キュウリラフィノース合成酵素抗体を作製し、蛋白質発現ベクターにｃＤＮＡライブラリーを乗せ、適当な宿主に感染させてｃＤＮＡがコードする蛋白質を発現させ、先程の抗体を用いて目的のｃＤＮＡをスクリーニングしても良い。
【００７１】
（５）ペプチド断片のアミノ酸配列から適当なプライマーを合成し、ＲＡＣＥ法によって、末端を含む配列を増幅し、これをクローニングしてもよい。
【００７２】
＜３＞本発明のラフィノースの製造法
本発明のラフィノースの製造法においては、スクロース及びガラクチノールに上記ラフィノース合成酵素を作用させてラフィノースを生成させる。ラフィノース合成酵素は、スクロースとガラクチノールに作用させると、ガラクチノールを構成するガラクトース残基がスクロースに転移し、ラフィノースが生成する。その際、ガラクチノールを構成するミオイノシトールが生成する。
【００７３】
ラフィノースの製造に使用するラフィノース合成酵素は、植物体から抽出した酵素であっても、本発明のＤＮＡを用いた遺伝子組換え法によって製造した酵素であってもよい。
【００７４】
スクロース及びガラクチノールにラフィノース合成酵素を作用させるには、ラフィノース合成酵素又はラフィノース合成酵素生産能を有する細胞をアルギン酸ゲルやポリアクリルアミドゲル等の担体に固定化した固定化酵素又は固定化細胞をカラムに充填し、このカラムにスクロース及びガラクチノールを含む溶液を通液してもよい。担体及びラフィノース合成酵素又は細胞を担体に固定化する方法は、通常のバイオリアクターに用いられる材料及び方法を採用することができる。
【００７５】
ラフィノース合成反応は、例えば、スクロース及びガラクチノールを含む水溶液又は緩衝液等の溶液に、ラフィノース合成酵素を添加することによって行われる。前記溶液のｐＨは、約６〜８の範囲内、特にｐＨ７前後に調整されることが好ましい。また、反応温度は約２８〜４２℃、好ましくは３５〜４０゜Ｃの範囲 内、特に３８℃前後であることが好ましい。尚、本発明のラフィノース合成酵素は、約ｐＨ５〜８の範囲、特にｐＨ６付近で安定である。また、本酵素は少なくとも約４０℃以下の温度範囲で安定である。
【００７６】
本発明のラフィノース合成酵素は、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド、ＭｎＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂、ＮｉＣｌ₂によって酵素活性が阻害されるので、こ れらの物質が反応液に含まれないことが望ましい。
【００７７】
反応液に加えるガラクチノール及びスクロースの濃度は、ガラクチノール ５ ｍＭ以上、スクロース １．５ｍＭ以上が好適である。また、反応液に加えるラ フィノース合成酵素の添加量は、基質量に応じて添加すればよい。
【００７８】
反応液に含まれる未反応のスクロース、ガラクチノール及び酵素反応により生じるミオイノシトールからラフィノースを分離する方法としては、例えばゲル濾過クロマトグラフィーが挙げられる。
【００７９】
＜４＞本発明のキメラ遺伝子及び形質転換植物
本発明のキメラ遺伝子は、ラフィノース合成酵素遺伝子又はその一部と、植物細胞で発現可能な転写制御領域とを含む。ラフィノース合成酵素遺伝子としては、前記＜２＞に記載した本発明のラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡが挙げられる。さらに、本発明のキメラ遺伝子をアンチセンス遺伝子として利用する場合には、ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡの他に、ラフィノース合成酵素遺伝子の非翻訳領域又はその一部であっても、使用できる場合がある。非翻訳領域としては、例えば配列表配列番号４において塩基番号１〜５５（５’非翻訳領域）、あるいは２４０８〜２５１７に示す配列（３’非翻訳領域）が挙げられる。
【００８０】
本発明のキメラ遺伝子において、転写制御領域が、ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡに、このＤＮＡコード鎖に相同なｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）を発現するように連結されている場合は、このキメラ遺伝子が導入された植物細胞はラフィノース合成酵素を発現し、ラフィノース族オリゴ糖含量が増加する。一方、前記転写制御領域が、前記ＤＮＡのコード鎖に相補的な配列を有するＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を発現するように前記ＤＮＡに連結されている場合、および、ラフィノース合成酵素遺伝子の一部の断片、好ましくは、上流コード領域の約２００塩基対以上に対するセンスＲＮＡを発現するように連結されている場合、これらのキメラ遺伝子が導入された植物細胞は、内在性ラフィノース合成酵素の発現が抑制され、ラフィノース族オリゴ糖が低減化する。
【００８１】
上記のように、本発明のキメラ遺伝子で植物を形質転換し、この遺伝子を植物細胞内で発現させることにより、前記植物のラフィノース族オリゴ糖含量を変化させることができる。
【００８２】
本発明を適用する植物としては、油糧植物であるダイズ、ナタネ、ワタ、砂糖を生産するテンサイ、サトウキビ、モデル植物としてシロイヌナズナ等が挙げられる。
【００８３】
また、植物細胞で発現可能な転写制御領域としては、前述したような、植物全体で発現するＣａＭＶ ３５ＳＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ １９ＳＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等、緑色組織で発現するＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニットプロモーター等、種子などの部位特異的に発現するナピン（ｎａｐｉｎ）、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）等の遺伝子のプロモーター領域等が挙げられる。また、キメラ遺伝子の３’末端には、ノパリン合成酵素ターミネーター、ＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニット３’側部位等のターミネーターが連結されてもよい。
【００８４】
キメラ遺伝子で植物を形質転換には通常用いられている方法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等を、供試する宿主細胞に応じて用いればよい。
【００８５】
植物にキメラ遺伝子を導入する形質転換法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等が挙げられる。
アグロバクテリウム法として具体的には、バイナリーベクターを用いる方法がある。すなわち、Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡ、大腸菌などの微生物で機能可能な複製起点、及びベクターを保持する植物細胞または微生物細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含むベクターを植物に感染させ、この植物から採取した種子を生育させ、マーカー遺伝子の発現を指標としてベクターが導入された植物を選択する。得られた植物について、ラフィノース合成酵素活性を測定するか、あるいはラフィノース族オリゴ糖の含量が変化したものを選択することによって、目的とする形質転換植物を取得することができる。
【００８６】
以下に、ダイズにキメラ遺伝子を導入する方法について説明する。ダイズ形質転換には、パーティクルガン法（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 145 (1989)、TIBTECH, 8, 145 (1990)、Bio/Technology, 6, 923 (1988)、Plant Physiol., 87, 671 (1988)、Develop. Genetics, 11, 289 (1990)、Plant cell Tissue & Organ Culture, 33, 227 (1993)）、アグロバクテリウム法（Plant Physiol., 91, 1212 (1989)、 WO94/02620、 Plant Mol. Biol., 9, 135 (1987)、Bio/Technology, 6, 915 (1988)）、エレクトロポレーション法（Plant Physiol., 99, 81 (1992)、Plant Physiol., 84, 856 (1989)、Plant Cell Reports, 10, 97 (1991)）のいずれの方法も用いることができる。
【００８７】
パーティクルガン法においては、エンビオジェニック（embyogenc）組織、あるいは、開やく後３０日から４０日の未熟種子の胚軸を用いればよい。約１ｇのエンビオジェニック組織をペトリ皿に広げ、日的のキメラ遺伝子をコーテイングした金粒子、タングステン粒子などを打ち込めばよい。組織は、１時間から２時問後液体培地に移し、培養する。２週間後、形質転換体選抜のための抗生物質入りの培地に移し、培養する。６週間後に、緑色の耐性不定胚が得られるので、これをさらに新しい培地に移して培養し、植物体を再生させる。あるいは、胚軸を用いた場合には、胚軸を無菌的に摘出し、パーティクルガンで処理した後、高濃度のサイトカイニンを含むＭＳ培地（Murashige and Skoog, Physiologia Plantrum, 15, 473-497 (1962)）にて培養をする。暗黒下で、２週間培養した後、サイトカイニンの含量を低下させたＭＳ培地にて１２時間から１６時間、光照射下で室温で培養する。このとき、選抜マーカーとして用いた抗生物質を培地に添加しておくことが望ましい。移植組織より多芽体が形成したら、ホルモン無添加の培地に移すことで、発根させる。この幼植物体を温室に移し、栽培する。
【００８８】
アグロバクテリウムを用いる方法では、植物組織としてコチルドナリーノッド（Cotyldonary nod）を用いることが望ましい。アグロパクテリウムは、市販のＬＢＡ４４０４、Ｃ５８、Ｚ７０７などを用いることができるが、望ましくは、Ｚ７０７がよい。ベクターは、ｐＭＯＮ５３０（Monsanto Co.）に目的遺伝子を挿入したプラスミドなどを用いることができる。ダイレクト・フリーズ・ソー（Direct freeze thaw）方法（An et al., Plant Mol. Biol. Mannual A3:1-19, 1988）などによって、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｚ７０７（Hepburn et al., J, Gen. Microbiol, 131, 2961 (1985)）にプラスミドを導入する。このキメラ遺伝子で形質転換したアグロバクテリウムは、一晩培養し、５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、Ｂ５懸濁培地に懸濁する。ダイズ種子は滅菌し１／１０濃度のＢ５培地にて３日間培養し、発芽させる。子葉を切り出し、アグロバクテリウムの懸濁液で、２時間供培養する。この子葉をＢ５培地（ガンボルグ(Gamborg)Ｂ５塩(Exp. Cell. Res., 50, 151 (1968)、ガンボルグＢ５ビタミン、３％スクロース。５μＭベンジルアミノプリン、１０μＭ ＩＢＡ、１００μＭ アセトシリンゴン含有）に移し、２５℃、２３時間光照射（６０μEm^-2S^-1）の条件下で３日問培養する。次に、アグロバクテリウムを除去するためにＢ５培地（５μＭ ベンジルアミノプリン、１００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌ バンコマイシン、５００ｍｇ／Ｌ セファタキシム(cefotaxime)）にて４日間２５℃で毎日培地を交換しながら培養する。その後、Ｂ５培地（２００ｍｇ／Ｌカナマイシン）にて培養する。１から２カ月でマルチシュートが形成される。これを、Ｂ５培地（０．５８ｍｇ／Ｌ ジベレリン、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン）で培養し、シュートを伸長させる。次に、Ｂ５培地（１０μＭ ＩＢＡ）に移し、発根させる。発根した幼植物体は、馴化し、温室にて栽培することによって形質転換体を得ることができる。
【００８９】
ラフィノース合成酵素遺伝子を導入した形質転換体植物の確認は、形質転換体より、ＤＮＡを抽出し、ラフィノース合成酵素遺伝子をプローブに用いてサザンハイプリダイゼーションを行えば容易に確認できる。
【００９０】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
はじめに、以下の実施例において、各精製工程における活性画分の確認及び酵素の特性検討に用いたラフィノース合成酵素活性の測定法を説明する。
【００９１】
＜ラフィノース合成酵素活性測定法＞
ラフィノース合成酵素の活性は、ラフィノース合成反応により生成したラフィノースをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により定量することによって行った。ＨＰＬＣは、糖分析システムＤＸ５００（CarboPac PA1カラム、パルスドアンペロメトリー検出器（ダイオネクス社製））を用いて行った。
【００９２】
ラフィノース合成反応は、最終濃度が下記の組成になるように調製した反応液に１０〜５０μｌのラフィノース合成酵素液を添加して１００μｌとし、３２℃で６０分間、反応を行った。
【００９３】
〔反応液組成（最終濃度）〕
2.5 mM スクロース
5 mM ガラクチノール
5 mM ＤＴＴ
20 mM トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００９４】
上記のようにして反応を行った後、反応液の４倍容のエタノールを加え、９５℃で３０秒間加熱して反応を停止した。これを遠心し、遠心上清を減圧乾固した後、蒸留水に溶解し、糖分析システムにて反応生成物中のラフィノースを定量し、ラフィノース酵素活性とした。
【００９５】
【実施例１】
キュウリからのラフィノース合成酵素の精製
＜１＞キュウリからのラフィノース合成酵素の抽出
播種後６〜１０週間のキュウリ（品種「ＳＵＹＯＵ」）本葉より、葉脈系を集め、液体窒素にて凍結し、−８０℃にて保存した。凍結した葉脈系約２００ｇを液体窒素下で乳鉢にて磨砕し、緩衝液１（４０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０)、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリ ド）、１％ポリクラールＡＴ；セルバ社製）を加え、蛋白質を抽出した。抽出液は、ガーゼやミラクロス（カルバイオケム−ノボバイオケム(Calbiochem-Novobiochem)社）などのフィルターにて濾過し、濾液を４℃、約３０，０００×ｇで６０分間遠心した。得られた遠心上清を粗抽出液とした。
【００９６】
＜２＞陰イオン交換クロマトグラフィー（１）
上記で得られた粗抽出液約５６０ｍｌを、緩衝液２（２０ｍＭ トリス塩酸緩 衝液(ｐＨ７．０)、５ｍＭ ＤＴＴ）にて平衡化した強塩基性陰イオン交換クロ マトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐＱ；ファルマシア社製、１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）を５本連結したカラムに供し、ラフィノース合成酵素活性をカラムに吸着させた。続いてカラムの５倍容の緩衝液３（２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０)、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）にてカラムを洗浄して非吸着蛋 白質を洗い流した後、５０ｍｌの緩衝液４（２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０)、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）にてラフィノース合成酵素活性を カラムから容出させた。
【００９７】
＜３＞陰イオン交換クロマトグラフィー（２）
上記の溶出液約７５ｍｌを透析チューブ（Ｐｏｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＭＷＣ Ｏ：１０，０００；スペクトラ(Ｓｐｅｃｔｒａ)社製）に入れ、１０Ｌの緩衝液５（２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０)、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）に対して、４℃で一晩透析した。透析した試料を緩衝液５で平衡化した弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ；東ソー社製、２．２×２０ｃｍ）に供し、ラフィノース合成酵素活性をカラムに吸着させた。続いてカラムの５倍容の緩衝液５にてカラムを洗浄して非吸着蛋白質を洗い流した後、２０カラム容に対し０．０５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌ濃度勾配を直線的にかけて酵素活性を溶出し分画した。
【００９８】
＜４＞ゲル濾過クロマトグラフィー
上記で得られた溶出液約１６０ｍｌを、濃縮器（セントリプレップ１０；Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて６．５ｍｌに濃縮した。この濃縮液３ｍｌずつをゲルろ過クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ；ファルマシア社 製、２．６ｃｍ×６０ｃｍ）に供した。カラムの平衡化と溶出は、緩衝液６（２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０)、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、 ０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて行った。分画した各画分のうち、ラフィノース合成酵素活性を有する画分を集めた。
【００９９】
＜５＞ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
ゲル濾過で分画したラフィノース合成酵素活性画分約２５ｍｌを、セントリプレップ１０にて濃縮し、さらに、緩衝液７（０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝 液(ｐＨ７．０)、５ｍＭ ＤＴＴ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて緩衝 液交換を行った。得られた濃縮液約１．２ｍｌを、あらかじめ同緩衝液にて平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ−１；バイ オラッド社製、０．７×５．２）に供し、ラフィノース合成酵素活性を吸着させた。カラムを、カラム体積の５倍量（１０ｍｌ）の同緩衝液にて洗浄した後、２０カラム容に対し、０．０１Ｍ〜０．３Ｍのリン酸濃度勾配を直線的にかけて酵素活性を溶出し分画した。
【０１００】
＜６＞ハイドロキシアパタイトリクロマトグラフィー
上記のようにして得られたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる活性画分を同様にしてリクロマトし、精製ラフィノース合成酵素画分（約２ｍｌ）とした。
【０１０１】
本活性画分の蛋白質量は約２００μｇであった。また、全活性は５７００ｎｍｏｌ／時間であり、蛋白質当たりの比活性は約２８μｍｏｌ／時間／ｍｇであった。この活性画分は、後述するように電気泳動上で分子量約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａの単一バンドを示すタンパク質のみを含んでいた。得られた精製酵素標品の比活性は、粗抽出液の約２０００倍であり、ＨｉＴｒａｐＱによる強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー後の酵素量に対する回収率は１２％であった。精製の結果を表１にまとめた。
【０１０２】
【表１】

【０１０３】
【実施例２】
ラフィノース合成酵素の特性の検討
実施例１で得られた精製ラフィノース合成酵素の特性を検討した。
【０１０４】
＜１＞分子量測定
（１）ゲルろ過クロマトグラフィー
精製ラフィノース合成酵素を１０μｌとり、この試料および分子量マーカー（ゲル濾過用分子量マーカーキット：ファルマシア社製）をゲルろ過クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ；ファルマシア社製）に供した。
カラムの平衡化と溶出は、緩衝液６（２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．０) 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて行った。その結果、ラフィノース合成酵素の分子量は、約７５ｋＤａ〜９５ｋＤａと推定された。
【０１０５】
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）
精製ラフィノース合成酵素を１０μｌとり、同量のサンプル緩衝液（０．０６２５Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ６．８)、１５％グリセロール、０．００１％ＢＰＢ）を加え、電気泳動サンプルとした。このサンプル１０μｌを１０％ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製、マルチゲル１０）に供し、０．０２５Ｍ トリ ス−０．１９２Ｍ グリシン緩衝液(ｐＨ８．４)で４０ｍＡ、約６０分泳動した。泳動後、シルベストステイン銀染色キット（ナカライテスク社製）にて染色した。その結果、分子量は約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａと推定された。
【０１０６】
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
精製ラフィノース合成酵素を１０μｌとり、同量のサンプル緩衝液（０．０６２５Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ６．８)、２％ ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％メルカプトエタノール、０．００１％ＢＰＢ）を加え沸騰浴中で１分間加熱し、電気泳動サンプルとした。このサンプル１０μｌを１０〜２０％グラジエントポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製）に供し、０．１％ＳＤＳを含む０．０２５Ｍ トリス−０．１９２Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ８．４）で４０ｍＡ、約７０分泳動した。泳動後、シルベストステイン銀染色キット（ナカライテスク社製）にて染色した。結果を図２に示す。その結果、分子量は約９０ｋＤａ〜１００ｋＤａと推定された。
【０１０７】
＜２＞反応至適温度
前記のラフィノース合成酵素活性測定法にしたがって、種々の温度条件下（２８℃、３２℃、３６℃、４０℃、４４℃、４８℃、５２℃）でラフィノース合成酵素活性を測定した。各反応液に加えた酵素液は、２μｌとした。３２℃での酵素活性を１００としたときの各温度での相対活性を図３に示す。その結果、ラフィノース合成酵素は、約２５〜４２゜Ｃにわたる範囲で活性を示し、反応至適温 度は、３５〜４０℃付近であった。
【０１０８】
＜３＞至適反応ｐＨ
前記のラフィノース合成酵素活性測定法にしたがって、種々のｐＨ条件下（ｐＨ４〜１１）でラフィノース合成酵素活性を測定した。各反応には、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５ 〜７．５）、５０ｍＭ ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６〜７）、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜８．５）、５０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９ 〜１１）を用いた。また、各反応液に加えた酵素液は、２μｌとした。結果を図４に示す。
【０１０９】
その結果、ラフィノース合成酵素はｐＨ５〜１０の範囲で活性を示し、反応至適ｐＨは、用いた緩衝液の種類によっても異なるが、６〜８付近であった。
【０１１０】
＜４＞阻害剤及び金属イオンの検討
精製ラフィノース合成酵素の反応液に、各種の酵素阻害剤又は金属イオンを終濃度で１ｍＭとなるように添加し、ラフィノース合成酵素活性を前記と同様にして測定した。阻害剤又は金属イオンを添加しない場合の酵素活性に対する残存活性を表２に示す。ヨードアセトアミドは酵素活性を顕著に阻害し、Ｎ−エチルマレイミドも阻害効果を示した。また、ＣａＣｌ₂、ＣｕＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂は阻害 効果がほとんど認められなかったが、ＭｎＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂、ＮｉＣｌ₂は阻害 効果を示した。
【０１１１】
【表２】

【０１１２】
＜５＞ミオイノシトールによる阻害
ラフィノース合成反応の反応生成物であるミオイノシトールによる阻害を調べた。各種濃度のミオイノシトールを反応液に添加し、ラフィノース合成酵素活性を測定した。結果を図５に示す。添加したミオイノシトールの濃度とともに酵素活性は阻害された。
【０１１３】
＜６＞安定ｐＨ
５０ｍＭ ビストリス塩酸緩衝液（ｐＨ５〜８、０．５ｍＭ ＤＴＴを含む）、又は２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜８、０．５ｍＭ ＤＴＴを含む）中で、前記陰イオン交換クロマトグラフィー（２）で得られたラフィノース合成酵素画分を４時間、４℃にてインキュベートした後、ラフィノース合成酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液のｐＨに対する酵素活性を図６に示す。いずれのインキュベート条件においてもラフィノース合成活性が認められ、特にｐＨ５〜７．５の範囲で安定であった。
【０１１４】
＜７＞安定温度
２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、５ｍＭ ＤＴＴを含む）にて、前記陰イオン交換クロマトグラフィー（２）で得られたラフィノース合成酵素画分を２８℃、３２℃、３７℃又は４０℃で６０分インキュベートした後、ラフィノース合成酵素活性を測定した。その結果、本酵素は、２８℃〜４０℃の範囲で前記インキュベート処理を行わなかった対照区と比較して８０％〜１００％の活性を有し、安定であった。
【０１１５】
＜８＞アミノ酸配列の解析
精製ラフィノース合成酵素のシステイン残基を還元ピリジルエチル化し、脱塩した。これをリジルエンドペプチダーゼ（Achromobacter protease 1、和光純薬工業社製）にて３７℃、１２時間消化し、ペプチド断片化した。得られたペプチド混合液を逆相ＨＰＬＣ（カラム：ウォーターズ μBondasphere(φ2.1×150 mm、C₁₈、300Å)、ウォーターズ社製(ミリポア社)）に供し、各ペプチド断片を分離取得した。溶媒には０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用い、アセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。取得したペプチド断片のうち、３つの断片について、アミノ酸配列をプロテインシークエンーサーにより決定した。決定された各ペプチドのアミノ酸配列を配列表配列番号１〜３に示す。以下、これらのペプチドを、それぞれ順にペプチド１、２、及び３という。
【０１１６】
【実施例３】
ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡの取得
＜１＞ＰＣＲ法によるラフィノース合成酵素ｃＤＮＡの部分断片の単離
キュウリの主葉脈２２ｇを液体窒素中で乳鉢を用いて磨砕した。この磨砕物を、８０℃に余熱した抽出バッファー（１００ｍＭ塩化リチウム、１００ｍＭトリス−塩酸(ｐＨ８．０)、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）と等量のフェノールを混合したものに加え、撹拌後、フェノールと等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、再び撹拌を行い、この混合液を４℃で９２５０×ｇ、１５分間遠心処理し、上清を採取した。この上清に対して繰り返しフェノール処理、クロロホルム：イソアミルアルコール処理を行い、遠心上清を得た。この上清に等量の４Ｍ塩化リチウムを加え、−７０℃で１時間静置した。
【０１１７】
室温にて解凍後、４℃で９２５０×ｇ、３０分間遠心処理し沈殿を得た。この沈殿を２Ｍ塩化リチウム、８０％エタノールにより１回ずつ洗浄し、乾燥後２ｍｌのジエチルピロカーボネート処理水に溶解し、精製全ＲＮＡとした。得られた全ＲＮＡは２．３８ｍｇであった。
【０１１８】
この全ＲＮＡ全量を、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いたｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ精製キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ ＣＬＯＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）に供し、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ分子を精製し、４２．５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを得た。
【０１１９】
上記のようにして得られたｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ混合物からラフィノース合成酵素ｃＤＮＡを単離するために、ＰＣＲ法による増幅を行った。ＰＣＲに用いるプライマーは、実施例２で決定したキュウリ由来のラフィノース合成酵素のペプチド断片のアミノ酸配列から、図７に示す一本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号６〜２２）を合成した。各プライマーの配列において、ＲはＡ又はＧを、ＹはＣ又はＴを、ＭはＡ又はＣを、ＫはＧ又はＴを、ＤはＧ、Ａ又はＴを、ＨはＡ、Ｔ又はＣを、ＢはＧ、Ｔ又はＣを、ＮはＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣ、又はイノシン（塩基はヒポキサンチン）を、それぞれ表す。
【０１２０】
プライマーとして、５’側プライマーにＡ（Ａ１（配列番号６）、Ａ２（配列番号７）、Ａ３（配列番号８）、Ａ４（配列番号９））、３’側プライマーにＤ’（Ｄ’１（配列番号２１）、Ｄ’２（配列番号２２））の組み合わせと、５’側プライマーにＣ２（配列番号１４））、及び３’プライマーにＢ’１(配列番号１８)、あるいはＢ’２(配列番号１９)を用いたときに、約５４０塩基対のＤＮＡが増幅された。この断片をＴＡクローニングキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＢＶ社製）を用いてプラスミドｐＣＲＩＩにクローニングし、塩基配列を解析したところ、両末端のプライマー配列の内側にペプチド１、２のアミノ酸配列をコードしている塩基配列が存在し、前記増幅断片はラフィノース合成酵素遺伝子に由来するＤＮＡ断片であることがわかった。
【０１２１】
さらに、クローニングした上記ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片のラフィノース合成酵素遺伝子上での位置を特定するために、ＲＡＣＥキット（３’Ａｍｐｉｆｉｎｄｅｒ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いて、３’ＲＡＣＥを行った。
【０１２２】
前記ｃＤＮＡ混合物を鋳型に、５’側プライマーにＣ（Ｃ１(配列番号１３)、Ｃ２(配列番号１４)）、３’側プライマーにはオリゴ（ｄＴ）とアンカー配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらにこうして得られた増幅断片を鋳型に、Ｃより内側に位置するＤ（Ｄ１(配列番号１５)、Ｄ２(配列番号１６)）を５’側プライマーに、３’側プライマーにはオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、Ｃ１（配列番号１３）、Ｃ２（配列番号１４）とオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーで増幅したＤＮＡを鋳型に、Ｄ２（配列番号１６）とオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーでＰＣＲを行ったときのみ、約２４００塩基対のＤＮＡ断片が増幅した。また、５’側プライマーにＣ（Ｃ１(配列番号１３)、Ｃ２(配列番号１４)）、３’側プライマーにはオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーを用いてＰＣＲを行い、さらにこうして得られた増幅断片を鋳型に、５’側プライマーにＥ（配列番号１７）、３’側プライマーにはオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、いずれの場合も、約３００塩基対のＤＮＡ断片を増幅した。
【０１２３】
同様に、前記ｃＤＮＡ混合物を鋳型に、５’側プライマーにＡ（Ａ１(配列番号６)、Ａ２(配列番号７)、Ａ３(配列番号８)あるいはＡ４(配列番号９)）、３’側プライマーにはオリゴ（ｄＴ）とアンカー配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらにこうして得られた増幅断片を鋳型に、Ａより内側に位置するＢ（Ｂ１(配列番号１０)、Ｂ２(配列番号１１)あるいはＢ３(配列番号１２)）、３’側に同じオリゴ（ｄＴ）−アンカープライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、Ａのいずれのプライマーを用いたときも、Ｂ２プライマーを用いたときに約２０００塩基対のＤＮＡ断片を得た。そこで、Ａ２、Ｂ２プライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片をクローニングした。塩基配列を解析したところ、５’側にプライマー作成に用いたペプチド断片１のアミノ酸配列をコードする塩基配列が存在した。また、３’側にはｐｏｌｙ（Ａ）配列と、その上流にペプチド断片３に対応する塩基配列が存在した。
【０１２４】
先のＰＣＲの結果と合わせると、ラフィノース合成酵素ペプチド断片は、そのＮ末端側から２、１、３の順に並んでおり、先にＰＣＲによって得られた約５４０塩基対のＤＮＡ断片は、ラフィノース合成酵素遺伝子上の５’末端に近い部分であることがわかった。ラフィノース合成遺伝子全長を含むｃＤＮＡクローンをスクリーニングするためには、プローブとするＤＮＡが５’末端側に近い部分を検出できることが望ましいため、このＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。
【０１２５】
＜２＞ラフィノース合成酵素ｃＤＮＡのコード領域全長のクローニング
まず、以下のようにしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。＜１＞で得られたｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ ３．８μｇからＴｉｍｅ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを、λファージベクターλＭＯＳＳｌｏｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位に組み込んだ後、ＧｉｇａｐａｃｋII Ｇｏｌｄパッケージングキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ ＣＬＯＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて、ファージ蛋白質中に取り込ませ、キュウリのｃＤＮＡライブラリーを調製した。なお、本ライブラリーのタイターは１．４６×１０⁷ｐｆｕ／μｇベクターであった。
【０１２６】
上記のキュウリのｃＤＮＡライブラリーから１．４×１０⁵ｐｆｕに相当するファージを宿主細胞エシェリヒア・コリ ＥＲ１６４７に感染させた後、直径９０ｍｍの寒天プレート１４枚に、プレートあたり１．０×１０⁴ｐｆｕとなるように蒔いた。これを３７℃で約６．５時間培養した後、プレート上に形成されたファージプラークをナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に転写した。
【０１２７】
次に、上記ナイロンメンブレンを、アルカリで処理して転写されたＤＮＡを変性させ、中和した後に洗浄した。その後、このナイロンメンブレンを８０℃で２時間処理することでＤＮＡをメンブレン上に固定した。
【０１２８】
得られたナイロンメンブレンに対し、＜１＞で得た約５４０塩基対のＤＮＡ断片をプローブに用い、陽性クローンのスクリーニングを行った。上記の約５４０塩基対のＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後に電気泳動し、約５４０塩基対のインサートのみを切り出して精製したものを、ＤＮＡラベル・検出システム（Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ラベリング・検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製））を用いてフルオレセインラベルし、プローブとした。前記のナイロンメンブレンを６０℃で３０分間、プレハイブリダイゼーションを行い、次いでラベルしたプローブを加えて６０℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ラベルされたＤＮＡを検出するための抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗フルオレセイン抗体）は、５００００倍に希釈して用いた。このスクリーニングにおいて陽性クローンの候補株を得た。得られた候補株について上記と同様にしてスクリーニングをさらに２回繰返し、純化した陽性クローンを取得した。
【０１２９】
上記の陽性クローンをエシェリヒア・コリＢＭ２５．８に感染させ、カルベニシリンを含む選択培地上で培養することで、ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターλＭＯＳＳｌｏｘ−ＣＲＳを切り出した。このプラスミドの挿入ｃＤＮＡの長さは約２．５ｋｂであった。さらにこのプラスミドで腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、これを塩基配列を解析するための試料とした。
【０１３０】
挿入ｃＤＮＡの塩基配列の解析にはＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いる従来公知の方法で行った。
【０１３１】
その結果、配列表の配列番号４に示す２３５２塩基対よりなる塩基配列が明らかとなった。この配列中には、本発明者らが用いたＤＮＡプローブの塩基配列と一致する部分が存在した。また、塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を配列番号４及び配列番号５に示した。このアミノ酸配列中には、本発明者らが得たキュウリ由来のラフィノースシンターゼのペプチド１（配列番号５中、アミノ酸番号２１５〜２４４）、２（配列番号５中、アミノ酸番号６１〜７９）及び３（配列番号５中、アミノ酸番号７５６〜７６９）と一致する部分が存在し、ラフィノース合成酵素をコードすることが確認された。
【０１３２】
上記のようにして得られたラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭｏｓｓｌｏｘＣＲＳを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９の形質転換体ＡＪ１３２６３は、平成８年１１月１９日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブダペスト条約に基づき国際寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４８が付与されている。
【０１３３】
【実施例４】
ラフィノース合成酵素をコードするＤＮＡを含むキメラ遺伝子及び形質転換植物
＜１＞キメラ遺伝子を含むプラスミドの構築
アグロバクテリウムとしてＬＢＡ４４０４、バイナリーベクターとしてｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、シロイヌナズナにラフィノース合成酵素のＤＮＡ断片を導入した。ｐＢＩ１２１は、ｐＢＩＮ１９由来のプラスミドであり、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ構造遺伝子（ＮＰＴII）、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、及びＮｏｓ−ｔｅｒが接続し、これらの両側に植物への移行が可能な配列を有する。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流にはＳｍａＩ部位があり、この部位に挿入されたインサートは該プロモーターの制御下で発現する。
【０１３４】
バイナリーベクターｐＢＩ１２１に、実施例３で得られたラフィノース合成酵素遺伝子断片を挿入した。ラフィノース合成酵素遺伝子をＤｒａＩ消化し、配列表配列番号４において３０番目から１３４２番目までの塩基を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により調製した。この断片をｐＢＩ１２１のＳｍａＩサイトにライゲーションした。このライゲーション反応液を用いてエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、形質転換株から組換えプラスミドを調製した。得られた組換えプラスミドのうち、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターにラフィノース合成酵素ＤＮＡ断片が逆向きに接続したもの（アンチセンス）、正の向きに接続したもの（センス）ものを２種選択し、それぞれ、ｐＢＩＲＳ１及びｐＢＩＲＳ９と命名した。
【０１３５】
上記のようにして得られたプラスミドを、トリペアレンタルメイティングによりアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入した。
シロイヌナズナの形質転換は以下のように行った。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の種子は、吸水処理後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む８０％エタノールにて５分間、同じく１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０％次亜塩素酸ナトリウムで１０分間処理し、滅菌水で５回洗浄して殺菌した。これを、１％低融点アガロースに懸濁し、ＭＳ培地（ＭＳ基本培地(Murashige and Skoog, Physiologia Plantrum, 15, 473-497 (1962))、Ｂ５ビタミン、１０ｇ／Ｌ スクロース ０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、ｐＨ５．８）にまいた。これを、２２℃、１６時間光照射、８時間暗期の培養室にて１週間培養し、双葉が展開したものをロックウールに定植した。同条件で培養を続け、約３週間後、植物が抽台し、茎の高さが数ｃｍになったところで摘心をした。摘心後１週間し、伸長した側枝の最初の花が開花した状態まで生育させた。
【０１３６】
ラフィノース合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを導入したアグロバクテリウムの前培養を２ｍｌのＬＢ培地で行った。これを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌストレプトマイシン含有のＬＢ培地に接種し２８℃で、約１日培養した。室温で集菌し、浸潤用懸濁培地（１／２ＭＳ塩、１／２ガンボルグ(Gamborg)Ｂ５ビタミン、５％スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、ｐＨ５．７（ＫＯＨ）、使用直前にベンジルアミノプリンを最終濃度０．０４４μＭ、またシルウェット(ＳｉｌｗｅｔＬ７７)を１Ｌ当たり２００μｌ（最終濃度０．０２％）加える）に菌液のＯＤ₆₀₀が０．８になるように懸濁した。
【０１３７】
浸潤を行う植物より開花結実している花を取り除いた。ロックウールを逆さにして、前記アグロバクテリウム懸濁液に結実していない花を漬け、デシケータに入れて、４０ｍｍＨＧで１５分間減圧した。２から４週間で、種子を集めた。収穫した種子は、デシケータで保存した。
【０１３８】
つぎに、選抜培地にて、形質転換体を選抜した。先に述ベたように種子を殺菌し、選抜培地（ＭＳ塩、ガンボルグＢ５ビタミン、１％スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、ｐＨ５．８、０．８％寒天；オートクレーブ後、選択用抗生物質、カルベニシリン（最終濃度１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン（最終濃度５０ｍｇ／Ｌ）を加える）にて２２℃で培養し、耐性植物を選抜した。耐性植物は新しい培地に移し、本葉が展開するまで育てた。ここの植物から種子を収穫した。同様の選抜を繰り返し、Ｔ３種子を獲得した。Ｔ３種子について、先に述ベた方法によりラフィノース含量を定量した。結果を３に示す。
【０１３９】
【表３】

【０１４０】
【発明の効果】
本発明により、精製されたラフィノース合成酵素、ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノース合成酵素遺伝子と植物で発現可能な制御領域を有するキメラ遺伝子、及びこのキメラ遺伝子が導入された植物が提供される。
【０１４１】
本発明のラフィノース合成酵素を用いることにより、スクロース及びガラクチノールから効率よくラフィノースを合成することができる。また、本発明のラフィノース合成酵素遺伝子又はキメラ遺伝子を利用することにより、植物のラフィノース族オリゴ糖含量を変化させることができる。
【０１４２】
【配列表】

【０１４３】

【０１４４】

【０１４５】

【０１４６】

【０１４７】

【０１４８】

【０１４９】

【０１５０】

【０１５１】

【０１５２】

【０１５３】

【０１５４】

【０１５５】

【０１５６】

【０１５７】

【０１５８】

【０１５９】

【０１６０】

【０１６１】

【０１６２】

【０１６３】

【図面の簡単な説明】
【図１】 ラフィノース合成反応によって生じるラフィノース生成量と反応時間との関係を示す図。
【図２】 ラフィノース合成酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真。Ｍは分子量マーカーを、Ｓはラフィノース合成酵素を含む試料を示す。数字は分子量（ｋＤａ）を表す。
【図３】 ラフィノース合成酵素活性に対する反応温度の影響を示す図。
【図４】 ラフィノース合成酵素活性に対する反応ｐＨの影響を示す図。
【図５】 ラフィノース合成酵素活性に対するミオイノシトールの影響を示す図。
【図６】 ラフィノース合成酵素の安定ｐＨ範囲を示す図。
【図７】 合成プライマーとペプチドのアミノ酸配列との関係を示す図。ＲはＡ又はＧを、ＹはＣ又はＴを、ＭはＡ又はＣを、ＫはＧ又はＴを、ＤはＧ、Ａ又はＴを、ＨはＡ、Ｔ又はＣを、ＢはＧ、Ｔ又はＣを、ＮはＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣを、Ｉはイノシンを表す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for synthesizing raffinose using raffinose synthase, raffinose synthase or a cell extract containing raffinose synthase, DNA encoding raffinose synthase, and use of this DNA in plants. Raffinose has bifidobacteria growth activity and is used in various fields as a raw material for food or as a pharmaceutical product such as an organ preservation solution.
[0002]
[Prior art]
Raffinose is one of the raffinose family oligosaccharides in which galactose is α-1,6 linked to the glucosyl group of sucrose. In addition to raffinose, raffinose genus oligosaccharides include stachyose to which two galactoses are bonded, and vervasose to which three are bonded. These sugars are stored sugars in the seeds of various plants such as beans, rapeseed, and cottonseed, as tumble sugars found in cucurbitaceous plants such as cucumbers and melons, and rosette leaves and sugar beet (sugar sugar) that have acquired cold resistance. Widely found in plants such as Japanese radish).
[0003]
The biosynthesis of raffinose family oligosaccharides is as follows:

Each reaction consists of (a) galactinol synthase (GS: EC 2.4.1.123), (b) raffinose synthase (RS: EC 2.4.1.82) (c) stachyose synthase (STS: EC 2.4.1.67) Catalyzed by
[0004]
Currently, raffinose is extracted from sugar beet and separated and purified in the sucrose purification process. However, raffinose lowers the crystallinity of sucrose, so sugar beet is bred and improved with the aim of low raffinose, and the raffinose content in sugar beet is 0.03% to 0.16% (Enzyme Microb. Technol., Vol. 4 May, 130-135 (1982)). Accordingly, it is not easy to obtain raffinose more efficiently than such a low content of sugar beet.
[0005]
As described above, raffinose is contained in legumes such as soybeans, and in cucurbits such as sugar beet and cucumber. Mature soybean seeds contain sucrose (content: about 5%), stachyose (about 4%), and raffinose (about 1%) as soybean oligosaccharides. These soybean oligosaccharides are recovered in a fraction deproteinized from defatted soybean, and after concentration, are used for functional foods and the like. However, raffinose is 10% of all oligosaccharides, and the amount is also small.
[0006]
On the other hand, an enzymatic synthesis method of raffinose has also been reported (Trends in Glycoscience and Glycotechnology 7.34, 149-158 (1995)). This is a method of synthesizing raffinose by synthesizing galactobiose by condensation reaction of α-galactosidase, and further transferring this galactobiose to sucrose by galactosyl transfer reaction as a donor of galactosyl group. However, this reaction is a reaction in which 350 g of galactobiose is synthesized from 1.9 kg of lactose hydrolyzate, and 100 g of raffinose is obtained from 190 g of galactobiose and 760 g of sucrose, and the yield of raffinose produced is low and efficient. No new synthesis method has been reached.
[0007]
In addition to the above method, a method of breeding a plant having a high raffinose content by transformation of a biosynthetic enzyme gene is also conceivable. For example, Kerr et al. Cloned a galactinol synthase gene and transformed rapeseed (WO93 / 02196). However, as a result, although GS activity increased, raffinose group oligosaccharide fell conversely, and the objective of increasing biosynthesis of raffinose group oligosaccharide by introducing galactinol synthase was not achieved. Thus, no method has been provided for increasing the content of raffinose family oligosaccharides in plants.
[0008]
On the other hand, it is also required to reduce raffinose family oligosaccharides. As mentioned earlier, raffinose oligosaccharides are mainly used for storage sugars in the seeds of beans such as soybeans, rapeseed, and cottonseed, and invert sugars found in cucurbits and melons such as cucumbers. Moreover, although it exists widely in plants, such as rosette leaf and sugar beet which acquired cold tolerance, these raffinose group oligosaccharides are contained in oiled meals, such as soybean, rapeseed, and cottonseed. Most of these meals are used as feed, but humans and animals that do not have α-galactosidase cannot directly digest raffinose family oligosaccharides. In addition, raffinose family oligosaccharides are known to reduce the metabolic energy efficiency of feed, for example by intestinal bacteria assimilating and generating gas, and by removing raffinose family oligosaccharides in feed, It has been reported that feed efficiency has increased (Coon, Proceeding Soybean Utilization Alternatives. Univrsity of Minnesota, 203-211 (1989)). For these reasons, forage crops such as soybean, rapeseed, cottonseed, etc. with reduced raffinose family oligosaccharides are desired.
[0009]
Moreover, breeding which increases the oil content has been made among these plants. The photosynthetic products are distributed to carbohydrates including fats and oils, proteins, and raffinose family oligosaccharides. In soybean, it has been reported that there is an inverse correlation between the amount of fat and oil and the sugar mass. By suppressing the production of raffinose family oligosaccharides, it is expected that the fat content is increased in soybeans having the same photosynthetic ability.
[0010]
In view of the above, Kerr et al. Reported that a low raffinose oligosaccharide soybean cultivar having a raffinose oligosaccharide reduction of 80% to 90% was produced by cross selection breeding (WO93 / 00742). However, this is the production of varieties and cannot be applied to various varieties corresponding to cultivation suitability and disease resistance. Moreover, it cannot be applied to a wide variety of plants.
[0011]
Raffinose, which is also contained in sugar beet and sugarcane, is known to reduce the crystallinity of sugar. Therefore, without the production of raffinose, the sugar production efficiency in these plants can be expected to increase, but no sugar beet that does not contain raffinose has been produced.
[0012]
As described above, the conventionally purified raffinose synthase has only been confirmed as an enzyme activity, and the enzyme has not been identified. Moreover, its activity is low, and raffinose synthase with high activity has been desired. Further, the conventional method for producing raffinose has a low yield, and an efficient method for producing raffinose has been desired. On the other hand, it is also desired to breed plants with reduced raffinose family oligosaccharides.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and obtains a highly active raffinose synthase and a DNA encoding the same, an efficient method for enzymatic synthesis of raffinose, and utilization of the DNA encoding the raffinose synthase in plants. The challenge is to provide a law.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in purifying raffinose synthase from cucumber. In addition, the present inventors diligently studied to clone a gene encoding this raffinose synthase. As a result, a single-stranded DNA was chemically synthesized based on the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence of the raffinose synthase peptide fragment of cucumber, and poly (A) extracted from cucumber using this single-stranded synthetic DNA as a primer. ⁺ PCR was performed using cDNA prepared from RNA as a template to obtain a DNA fragment specific for the raffinose synthase gene. Further, the raffinose synthase gene was isolated by hybridization with a cucumber-derived cDNA library using this DNA fragment as a probe to isolate the raffinose synthase gene. Using this isolated raffinose synthase gene fragment, a chimeric gene having a control region that can be expressed in a plant was prepared, and the plant was transformed. Furthermore, the function of endogenous raffinose synthase was controlled by the introduced raffinose synthase gene, leading to the creation of plants with reduced raffinose family oligosaccharides.
That is, the present invention provides a raffinose synthase having the following properties.
[0015]
(1) Action and substrate specificity: Raffinose is produced from sucrose and galactinol.
[0016]
(2) Optimum pH: about 6-8
(3) Optimum temperature: about 35-40 ° C
(4) Molecular weight:
(1) Molecular weight measured by gel filtration chromatography: about 75 kDa to 95 kDa
(2) Molecular weight measured by polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE): about 90 kDa to 100 kDa
(3) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions: about 90 kDa to 100 kDa
(5) Inhibition:
Inhibited by iodoacetamide, N-ethylmaleimide, myo-inositol.
[0017]
The present invention provides, as a specific embodiment of the raffinose synthase, a raffinose synthase containing each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 3 in the amino acid sequence.
[0018]
Moreover, this invention provides the raffinose synthase which is a protein shown to the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, and raffinose from sucrose and galactinol. Protein with activity to produce.
[0019]
The present invention also provides a method for producing raffinose, characterized in that raffinose is produced by allowing the raffinose synthase to act on sucrose and galactinol.
[0020]
The present invention further includes DNA encoding the raffinose synthase, and
A DNA encoding the protein shown in the following (A) or (B) is provided.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, and raffinose from sucrose and galactinol. Protein with activity to produce.
[0021]
The present invention provides the following DNA (a) or (b) as a specific embodiment of the above DNA.
[0022]
(A) At least base number 5 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing 6 ~ 240 7 DNA comprising a nucleotide sequence consisting of
(B) At least base number 5 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing 6 ~ 240 7 A DNA encoding a protein that hybridizes with a base sequence consisting of sucrose under stringent conditions and has an activity of generating raffinose from sucrose and galactinol.
[0023]
Furthermore, the present invention provides a chimeric gene comprising a raffinose synthase gene or a part thereof and a transcriptional control region that can be expressed in plant cells, and a plant transformed with this chimeric gene.
[0024]
The present invention also provides a method for changing the raffinose group oligosaccharide content of the plant by transforming the plant with the chimeric gene and expressing the gene in a plant cell.
[0025]
Hereinafter, the raffinose synthase having the properties described in the above (1) to (5) or the raffinose synthase which is the protein of the above (A) and (B) may be simply referred to as “raffinose synthase”. In addition, DNA encoding raffinose synthase or DNA encoding raffinose synthase and further including an untranslated region may be referred to as “raffinose synthase gene”.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0027]
<1> Raffinose synthase of the present invention
The raffinose synthase of the present invention has the following properties.
[0028]
(1) Action and substrate specificity: Raffinose is produced from sucrose and galactinol.
[0029]
(2) Optimum pH: about 6-8
(3) Optimum temperature: about 35-40 ° C
(4) Molecular weight:
(1) Molecular weight measured by gel filtration chromatography: about 75 kDa to 95 kDa
(2) Molecular weight measured by polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE): about 90 kDa to 100 kDa
(3) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions: about 90 kDa to 100 kDa
(5) Inhibition:
Inhibited by iodoacetamide, N-ethylmaleimide, myo-inositol.
[0030]
The raffinose synthase having the above properties has been isolated and purified from cucumber true leaves and was first identified by the inventor. This cucumber-derived raffinose synthase includes the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in the amino acid sequence of the enzyme protein, as shown in Examples below. The entire amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
[0031]
Raffinose synthase is obtained from cucurbitaceae plants such as melon (Cucumis melo) and cucumber (Cucumis sativas). In particular, the leaves of these plants, particularly the vein system and seeds, have a high content of raffinose synthase.
[0032]
Next, as an example of the method for producing the raffinose synthase of the present invention, a method for isolating and purifying raffinose synthase from cucumber will be described.
From the cucumber true leaves 6 to 10 weeks after sowing, the vein system is collected and ground using a mortar or the like under liquid nitrogen, and a buffer solution is added to extract the protein. At this time, a substance for preventing the degradation or inactivation of raffinose synthase, for example, a protease inhibitor such as PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), polyclar AT (manufactured by Selva), etc. may be added. Good. Insoluble matters are removed from the extract by filtration and centrifugation to obtain a crude extract.
[0033]
The raffinose synthase is obtained by fractionating the crude extract obtained as described above in combination with a conventional protein purification method, for example, anion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, gel filtration, salting out, etc. Can be purified.
[0034]
Anion exchange chromatography uses, for example, a column packed with a strongly basic anion exchanger such as HiTrapQ (Pharmacia) or a weakly basic anion exchanger such as DEAE-TOYOPEARL (Tosoh). Can be done by. An extract containing raffinose synthase is passed through these columns to adsorb the enzyme to the columns, the column is washed, and then the enzyme is eluted using a high salt concentration buffer. At that time, the salt concentration may be increased stepwise, or a concentration gradient may be applied. For example, when a HiTrapQ column is used, the raffinose synthase activity adsorbed on the column is eluted with about 0.3M NaCl. Further, in DEAE-TOYOPEARL, a NaCl concentration gradient of 0.05 M to 0.35 M is preferable as an eluent, and in a hydroxyapatite chromatography, a phosphoric acid concentration gradient of 0.01 M to 0.3 M is preferable as an eluent.
[0035]
The order of the above operations is not particularly limited, and each operation may be repeated twice or more. In addition, before passing the sample solution through each column, it is desirable to exchange the sample solution with a suitable buffer solution by dialysis or the like. Further, the sample solution may be concentrated at each stage.
[0036]
In each step of purification, it is preferable to measure raffinose synthase activity contained in the fractionated fraction, collect fractions with high activity, and use them in the next step. Examples of the method for measuring the raffinose synthase activity include a method using a radioisotope reported by Lehle, H et al. (Eur. J. Biochem., 38, 103-110 (1973)). As a variation of this, the reaction temperature and substrate concentration may be changed. For example, the final concentration is 10 mM ¹⁴ To a reaction solution containing C-sucrose, 20 mM galactinol, 25 mM HEPES (2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid) -NaOH, pH 7.0, 5 mM DTT (dithiothreitol) Add 10 μl of enzyme solution to make 50 μl. This is incubated at 32 ° C. for 1 hour to carry out the reaction, 200 μl of ethanol is added, and the reaction is stopped by heating at 95 ° C. for 30 seconds. The centrifugal supernatant of this reaction solution was spotted on Whatman 3MM filter paper and developed with n-propanol: ethyl acetate: water = 4: 1: 2. ¹⁴ The incorporation of C into raffinose is examined, and this is defined as raffinose synthase activity (nmol / hour).
[0037]
As an alternative to the above method, the present inventor has developed a method for measuring raffinose synthase activity by quantifying raffinose produced by a raffinose synthesis reaction by HPLC (high performance liquid chromatography). According to this method, measurement can be carried out more easily and quickly than the method of Lehle, H et al., And it is particularly suitable for detecting active fractions in purification operations. The method will be described below.
[0038]
In the raffinose synthesis reaction, 10-50 μl of raffinose synthase solution is added to a reaction solution prepared so that the final concentration becomes the following composition to make 100 μl, and the reaction is performed at 32 ° C. for 60 minutes.
[0039]
[Reaction solution composition (final concentration)]
2.5 mM sucrose
5 mM Galactinol
5 mM DTT
20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)
[0040]
After performing the reaction as described above, 4 times the volume of ethanol of the reaction solution is added, and the reaction is stopped by heating at 95 ° C. for 30 seconds. This is centrifuged, and the centrifugal supernatant is dried under reduced pressure, then dissolved in distilled water, and raffinose in the reaction product is quantified by HPLC to obtain raffinose enzyme activity. HPLC can be performed using, for example, a sugar analysis system DX500 (CarboPac PA1 column, pulsed amperometry detector (Dionex)).
[0041]
The results of measuring the amount of raffinose produced when the reaction time is changed by the above method are shown in FIG. As is apparent from the figure, the raffinose synthase activity can be easily measured with good linearity by this method.
[0042]
Confirmation of the degree of purification and measurement of molecular weight of the purified raffinose synthase can be performed by gel electrophoresis, gel filtration chromatography, or the like. Enzymatic properties can be examined by measuring the enzyme activity by changing the reaction temperature or pH, or by adding various enzyme inhibitors or metal ions to the reaction solution and measuring the residual enzyme activity. do it. Furthermore, the stable pH range and stable temperature range can be examined by measuring the enzyme activity after exposing raffinose synthase to various pH conditions or temperature conditions for a certain period of time.
[0043]
It should be noted that the above-mentioned properties of raffinose synthase are determined in this way, but different results may be obtained depending on the measurement conditions. For example, the measurement of molecular weight by gel filtration chromatography is affected by the type of gel filtration agent and buffer used, or the molecular weight marker. In addition, enzyme activity often varies depending on the type of buffer or salt concentration even at the same pH. Therefore, when identifying raffinose synthase, it is preferable to conduct comprehensive examinations as well as individual properties.
[0044]
The raffinose synthase of the present invention can be obtained by isolation and purification from cucumber as described above, but DNA encoding raffinose synthase described later is appropriately obtained by a method usually used for fermentation production of heterologous proteins. It can also be produced by introducing it into a suitable host and expressing it.
[0045]
As hosts for expressing the raffinose synthase gene, various prokaryotic cells such as Escherichia coli, and various eukaryotic cells such as Saccharomyces cerevisiae can be considered. Plant cells, particularly cells derived from plants such as tobacco, cucumber and Arabidopsis (Arabidopsis) are desirable.
[0046]
A recombinant plasmid used for transformation can be prepared by inserting a DNA encoding raffinose synthase into an expression vector corresponding to the type of cell to be expressed. The plant expression vector may be any promoter DNA sequence that works in plants, a combination of them, or a terminator DNA sequence that works in plants, and a sequence that can insert a foreign gene on both sides thereof.
[0047]
Examples of such promoters include NaMV (seeds) such as CaMV 35SRNA promoter, CaMV 19SRNA promoter, and nopaline synthase promoter expressed in the whole plant, RubisCO small subunit promoter expressed in green tissue, etc. Examples thereof include promoters of genes such as napin) and phaseolin. Furthermore, examples of the terminator as described above include nopaline synthase terminator, RubisCO small subunit 3 ′ side site, and the like.
[0048]
Since pBI121, p35S-GFP (manufactured by CLONTECH) and the like are commercially available as plant expression vectors, these may be used. A vector that expresses viral RNA may be used to replace the encoded coat protein and other genes with a raffinose synthase gene.
[0049]
For transformation, a commonly used method, Agrobacterium method, particle gun method, electroporation method, PEG method or the like may be used according to the host cell to be tested. For the detection of raffinose synthase activity, a method in which raffinose synthase purification is performed can be used. At that time, it is desirable to remove α-galactosidase in advance by passing the sample through an anion exchange column.
[0050]
The gene encoding raffinose synthase derived from cucumber includes all genes having raffinose synthase activity when expressed, but preferably has DNA encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing Examples thereof include a gene or a gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing includes various base sequences in consideration of codon degeneracy. That is, it is selected from these various base sequences in consideration of various elements of the gene expression system, for example, preferential codons depending on the type of host cell, etc., and avoidance of higher order structures formed by transcribed RNA. That's fine. The selected base sequence may be DNA cloned from the natural world or artificially chemically synthesized DNA.
[0051]
<2> DNA encoding the raffinose synthase of the present invention
DNA encoding raffinose synthase is poly (A) isolated from plants such as cucumber ⁺ It can be obtained by preparing a cDNA library from RNA and screening this cDNA library by hybridization. A probe used for hybridization can be obtained by amplification by PCR (polymerase chain reaction) using an oligonucleotide synthesized based on a partial amino acid sequence of raffinose synthase protein as a primer.
[0052]
Below, poly (A) derived from cucumber ⁺ A method for obtaining the DNA of the present invention from RNA will be specifically described.
poly (A) ⁺ As an RNA extraction site, any cucumber plant body may be used as long as the raffinose synthase gene is expressed, and it can be obtained from leaves, stems, strawberries, fruits, seeds, etc. in various growth stages. Desirably, the developed leaf after attaching the fruit, particularly the vein portion, should be used as the material.
[0053]
The method for extracting total RNA from cucumber tissue is not limited as long as RNA with low damage can be obtained efficiently. For example, any known method such as phenol / SDS method, guanidine isothiocyanate / cesium chloride method, etc. Is also possible. From the total RNA thus obtained, poly (A) using an oligo (dT) carrier ⁺ RNA can be isolated. In addition, poly (A) without extracting total RNA ⁺ A kit capable of obtaining RNA (MPG Direct mRNA Purification Kit, CPG, INC., Etc.) may be used.
[0054]
A DNA fragment of a probe used for screening a cDNA library can be obtained by performing PCR. Single-stranded DNA having a base sequence deduced from the amino acid sequence of the already known peptide fragment, for example, the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing, is chemically synthesized, and PCR is performed using this as a primer. As the primer, any part of the amino acid sequence of the obtained peptide fragment may be used, but it is desirable to select a sequence that is less likely to form a complex higher order structure with less codon degeneracy. Alternatively, RACE (Rapid Amplification of cDNA End: PCR PROTOCOLS A Guide to Methods and Applications, ACADEMI press INC. P28-38) may be performed.
[0055]
As such a PCR template, it is desirable to use a cDNA library or a single-stranded cDNA. When a thermostable DNA polymerase having reverse transcriptase activity is used in the PCR reaction, poly (A) ⁺ RNA, or in some cases, total RNA may be used.
[0056]
In order to prepare a cDNA library, first, poly (A) ⁺ RNA is used as a template, and single-stranded cDNA is synthesized by reverse transcriptase using oligo (dT) primer, random primer, etc., and then the Gubler and Hoffman method, Okayama-Berg method (Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor press, 1989) is used to synthesize double-stranded cDNA. When the expression level of the raffinose synthase gene is small, the cDNA may be amplified by PCR using a PCR library preparation kit (Capfinder PCR cDNA Library Construction Kit (CLONTECH) or the like). The cDNA synthesized in this way can be cloned into a cloning vector such as a phage vector or a plasmid by blunting, adding a linker, adding a restriction enzyme site by PCR, and the like.
[0057]
As a probe for hybridization, a portion characteristic of raffinose synthase cDNA is selected from the DNA fragments obtained by the above PCR. It is desirable to select a DNA fragment close to the 5 ′ end. The amplified DNA fragment thus selected is purified from the PCR reaction solution. At this time, the amplified DNA fragment can be subcloned using a plasmid, the plasmid is prepared in large quantities and then cleaved with a restriction enzyme, and the gel is cut out and purified after electrophoresis. Alternatively, PCR can be performed using the plasmid as a template. Only the target portion may be amplified and used. Furthermore, when the amount of the DNA fragment initially amplified is sufficiently large, the amplified DNA fragment is electrophoresed without subcloning, and the gel fragment containing the band of the target DNA fragment is excised and purified from the gel fragment. May be.
[0058]
Hybridization is performed for screening to obtain the target clone from the cDNA library. The DNA fragment obtained by the above method can be labeled as a probe for hybridization. Various labels such as radioisotope and biotin can be used as the label, but it is desirable to label by a random priming method. In addition, PCR may be used for screening instead of hybridization. Furthermore, hybridization and PCR may be combined.
[0059]
The base sequence of the DNA encoding the raffinose synthase derived from cucumber obtained as described above and the amino acid sequence deduced from this base sequence are exemplified in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. Further, only this amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5. A transformant AJ13263 of Escherichia coli JM109 carrying the plasmid pMossloxCRS containing the DNA fragment containing the DNA encoding raffinose synthase obtained in Example 3 described later was introduced on November 19, 1996 by the Ministry of International Trade and Industry. It has been deposited internationally based on the Budapest Treaty at the Institute of Biotechnology, Institute of Technology (Postal Code 305, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) and has been assigned the accession number FERM BP-5748.
[0060]
As long as the activity of the encoded raffinose synthase, that is, the activity of producing raffinose from sucrose and galactinol is not impaired, one or several amino acid substitutions, deletions at one or more positions, It may encode a raffinose synthase protein containing an insertion, addition, or inversion. Here, “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. This is because, depending on the amino acid, there are highly related amino acids such as isoleucine and valine, and such amino acid differences do not greatly affect the three-dimensional structure of the protein. Therefore, it may have a homology of 35 to 40% or more with respect to the entire 784 amino acid residues constituting the cucumber-derived raffinose synthase and have raffinose synthase activity. Further, preferably, there is 65% homology between the 510th amino acid and the 610th amino acid. More preferably, the “several” is 2 to 40, preferably 2 to 20, and further 2 to 10.
[0061]
It includes genes having a homology of about 50% or more in the full length of the gene and 65% or more of homology over about 300 bases. For such a gene, base sequence information can be obtained by searching for a gene having homology to a cucumber-derived raffinose synthase gene using a database such as GenBank. As the homology analysis program, GENEX-MAC (gene information processing software, software development company) adopting Lipman-Person method or the like, or those published on the Internet may be used. The base sequence obtained by such a method may or may not include the full length of the gene. When not including the full length of the gene, using RNA extracted from the target plant tissue as a template, using a primer corresponding to a site highly homologous to the cucumber-derived raffinose synthase gene, 5′RACE method, 3′RACE method, A full-length gene can be easily obtained. The resulting full-length gene is incorporated into an appropriate expression vector provided by a kit such as Soluble Protein Expression System (lNVITROGEN), Tight Control Expression System (INVITROGEN), or QIAexpress System (QIAGEN) to express the gene. The raffinose synthase activity may be measured by the method described above, and a clone having activity may be selected.
[0062]
The DNA encoding the protein substantially identical to the raffinose synthase is modified by, for example, site-directed mutagenesis so that the amino acid at a specific site is substituted, deleted, inserted, or added. Can be obtained. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes a method of treating raffinose synthase-encoding DNA in vitro with hydroxylamine or the like, and Escherichia bacterium carrying the DNA encoding raffinose synthase using ultraviolet irradiation or N-methyl-N′-nitro. -N-nitrosoguanidine (NTG) or a method of treating with a mutagen usually used for artificial mutation such as nitrous acid.
[0063]
In addition, base substitution, deletion, insertion, addition, or inversion as described above is based on individual differences in cucumbers, varietal differences, multiple copies of genes, differences in organs, tissues, etc. Naturally occurring mutations are also included.
[0064]
By expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the raffinose synthase activity of the expression product, DNA encoding a protein substantially the same as raffinose synthase can be obtained. Further, from a DNA encoding a mutated raffinose synthase or a cell holding the same, for example, a DNA having a base sequence consisting of base numbers 56 to 2407 and a stringent of the base sequences described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing By isolating a DNA that hybridizes under such conditions and encodes a protein having raffinose synthase activity, a DNA encoding a protein substantially identical to the raffinose synthase protein can be obtained. The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, for example, DNAs with high homology, for example, DNAs having 50% or more homology hybridize and DNA with lower homology than that. A salt corresponding to 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, which does not hybridize with each other, or is a condition for washing of ordinary Southern hybridization Conditions for hybridizing at a concentration are mentioned. Genes that hybridize under these conditions include those that have generated stop codons along the way and those that have lost activity due to mutations in the active center. -Can be easily removed by measuring the synthase activity by the method described.
[0065]
When the DNA of the present invention is used for expressing raffinose synthase antisense RNA, the DNA need not encode an active raffinose synthase. Also, sense RNA can suppress the function of homologous endogenous genes. In such a case as well, the DNA does not need to encode an active raffinose synthase gene, and may not include the full length. Preferably, the N-terminal translation region having 60% homology is 500. That's about base pairs.
[0066]
The method that the present inventors have succeeded in cloning the cDNA of raffinose synthase derived from cucumber is as described above, but the following method is also included.
[0067]
(1) Isolating and purifying raffinose synthase derived from cucumber and chemically synthesizing the entire base sequence based on the determined amino acid sequence or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
[0068]
(2) Chromosomal DNA is prepared from a cucumber plant, a chromosomal DNA library is prepared using a plasmid vector or the like, and a raffinose synthase gene is obtained from the library by hybridization or PCR. The raffinose synthase gene derived from a chromosome is expected to contain an intron in the coding region, but even if it is a DNA fragmented by such an intron, the DNA of the present invention can be used as long as it encodes raffinose synthase. include.
[0069]
(3) poly (A) ⁺ RNA is fractionated by molecular weight, etc., and subjected to an in vitro translation system using wheat germ or rabbit reticulocytes to determine the fraction containing mRNA encoding a polypeptide having raffinose synthase activity. A cDNA fragment is prepared and obtained.
[0070]
(4) Prepare an anti-cucumber raffinose synthase antibody, place the cDNA library on a protein expression vector, infect a suitable host to express the protein encoded by the cDNA, and screen for the target cDNA using the previous antibody. You may do it.
[0071]
(5) An appropriate primer may be synthesized from the amino acid sequence of the peptide fragment, and the sequence including the terminal may be amplified by the RACE method and cloned.
[0072]
<3> Process for producing raffinose of the present invention
In the method for producing raffinose of the present invention, raffinose is produced by allowing the raffinose synthase to act on sucrose and galactinol. When raffinose synthase acts on sucrose and galactinol, the galactose residue constituting galactinol is transferred to sucrose to produce raffinose. In that case, myo-inositol which comprises galactinol produces | generates.
[0073]
The raffinose synthase used for the production of raffinose may be an enzyme extracted from a plant body or an enzyme produced by a genetic recombination method using the DNA of the present invention.
[0074]
To make raffinose synthase act on sucrose and galactinol, the column is packed with immobilized enzyme or immobilized cells in which raffinose synthase or raffinose synthase-producing cells are immobilized on a carrier such as alginate gel or polyacrylamide gel. Then, a solution containing sucrose and galactinol may be passed through this column. As a method for immobilizing a carrier and raffinose synthase or cells to the carrier, materials and methods used in ordinary bioreactors can be adopted.
[0075]
The raffinose synthesis reaction is performed, for example, by adding raffinose synthase to an aqueous solution or buffer solution containing sucrose and galactinol. The pH of the solution is preferably adjusted within the range of about 6 to 8, particularly around pH 7. The reaction temperature is about 28 to 42 ° C., preferably 35 to 40 ° C., particularly about 38 ° C. The raffinose synthase of the present invention is stable in the range of about pH 5 to 8, particularly around pH 6. The enzyme is stable at least in the temperature range of about 40 ° C. or lower.
[0076]
The raffinose synthase of the present invention contains iodoacetamide, N-ethylmaleimide, MnCl ₂ ZnCl ₂ NiCl ₂ Since the enzyme activity is inhibited by this, it is desirable that these substances are not contained in the reaction solution.
[0077]
The concentration of galactinol and sucrose added to the reaction solution is preferably 5 mM or more of galactinol and 1.5 mM or more of sucrose. Further, the amount of raffinose synthase added to the reaction solution may be added according to the base mass.
[0078]
Examples of the method for separating raffinose from unreacted sucrose, galactinol and myo-inositol produced by the enzyme reaction contained in the reaction solution include gel filtration chromatography.
[0079]
<4> Chimeric gene and transformed plant of the present invention
The chimeric gene of the present invention comprises a raffinose synthase gene or a part thereof and a transcriptional control region that can be expressed in plant cells. Examples of the raffinose synthase gene include DNA encoding the raffinose synthase of the present invention described in <2> above. Furthermore, when the chimeric gene of the present invention is used as an antisense gene, in addition to DNA encoding raffinose synthase, an untranslated region of raffinose synthase gene or a part thereof may be used. is there. As an untranslated region, for example, base numbers 1 to 55 (5 ′ untranslated region) in SEQ ID NO: 4 or 240 8 The sequence (3 ′ untranslated region) shown in ˜2517 can be mentioned.
[0080]
In the chimeric gene of the present invention, when the transcription control region is linked to DNA encoding raffinose synthase so as to express mRNA (sense RNA) homologous to this DNA coding strand, this chimeric gene is introduced. The plant cells thus expressed express raffinose synthase and the raffinose family oligosaccharide content increases. On the other hand, when the transcription control region is linked to the DNA so as to express RNA (antisense RNA) having a sequence complementary to the coding strand of the DNA, and a part of the raffinose synthase gene When ligated to express a sense RNA for a fragment, preferably about 200 base pairs or more of the upstream coding region, plant cells into which these chimeric genes have been introduced have suppressed expression of endogenous raffinose synthase. , Raffinose family oligosaccharides are reduced.
[0081]
As described above, the raffinose group oligosaccharide content of the plant can be changed by transforming a plant with the chimeric gene of the present invention and expressing the gene in a plant cell.
[0082]
Examples of plants to which the present invention is applied include soybeans, rapeseed, cotton, sugar beet that produce sugar, sugarcane, and Arabidopsis as model plants.
[0083]
Examples of transcription control regions that can be expressed in plant cells include CaMV 35SRNA promoter, CaMV 19SRNA promoter, nopaline synthase promoter, etc. that are expressed in the whole plant, RubisCO small subunit promoter that is expressed in green tissue, etc. Examples thereof include promoter regions of genes such as napin and phaseolin that are expressed in a site-specific manner such as seeds. In addition, terminators such as nopaline synthase terminator and RubisCO small subunit 3 ′ side site may be linked to the 3 ′ end of the chimeric gene.
[0084]
Methods commonly used for transforming plants with chimeric genes, such as the Agrobacterium method, particle gun method, electroporation method, and PEG method, may be used depending on the host cell to be tested.
[0085]
Examples of transformation methods for introducing chimeric genes into plants include the Agrobacterium method, particle gun method, electroporation method, and PEG method.
A specific example of the Agrobacterium method is a method using a binary vector. That is, a plant is infected with a vector containing T-DNA derived from a Ti plasmid, a replication origin that can function in microorganisms such as E. coli, and a marker gene for selecting a plant cell or microorganism cell that holds the vector. The collected seed is grown, and a plant introduced with the vector is selected using the expression of the marker gene as an index. About the obtained plant, the target transformed plant can be obtained by measuring the raffinose synthase activity or selecting a plant with a changed raffinose oligosaccharide content.
[0086]
Hereinafter, a method for introducing a chimeric gene into soybean will be described. For soybean transformation, the particle gun method (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 145 (1989), TIBTECH, 8, 145 (1990), Bio / Technology, 6, 923 (1988), Plant Physiol. , 87, 671 (1988), Develop. Genetics, 11, 289 (1990), Plant cell Tissue & Organ Culture, 33, 227 (1993)), Agrobacterium method (Plant Physiol., 91, 1212 (1989), WO94 / 02620, Plant Mol. Biol., 9, 135 (1987), Bio / Technology, 6, 915 (1988)), electroporation method (Plant Physiol., 99, 81 (1992), Plant Physiol., 84 , 856 (1989), Plant Cell Reports, 10, 97 (1991)).
[0087]
In the particle gun method, an embryonic tissue or an embryonic axis of an immature seed 30 to 40 days after opening may be used. About 1 g of the biogenic tissue is spread on a Petri dish, and gold particles, tungsten particles or the like coated with a daily chimeric gene may be implanted. The tissue is transferred to a liquid medium after 1 to 2 hours and cultured. Two weeks later, the cells are transferred to a medium containing antibiotics for selection of transformants and cultured. After 6 weeks, a green resistant somatic embryo is obtained, which is transferred to a new medium and cultured to regenerate the plant body. Alternatively, when the hypocotyl is used, the hypocotyl is aseptically removed, treated with a particle gun, and then MS medium containing a high concentration of cytokinin (Murashige and Skoog, Physiologia Plantrum, 15, 473-497 (1962) )). After culturing in the dark for 2 weeks, the cells are cultured in MS medium with reduced cytokinin content for 12 to 16 hours at room temperature under light irradiation. At this time, it is desirable to add the antibiotic used as the selection marker to the medium. When multi-buds are formed from the transplanted tissue, they are rooted by transferring to a medium without hormones. This young plant is transferred to the greenhouse and cultivated.
[0088]
In the method using Agrobacterium, it is desirable to use Cotyldonary nod as the plant tissue. Commercially available LBA4404, C58, Z707, etc. can be used as agrobacterium, but Z707 is preferable. As the vector, a plasmid in which a target gene is inserted into pMON530 (Monsanto Co.) can be used. Agrobacterium tumefaciens Z707 (Hepburn et al., J) by the direct freeze thaw method (An et al., Plant Mol. Biol. Mannual A3: 1-19, 1988) and the like. , Gen. Microbiol, 131, 2961 (1985)). Agrobacterium transformed with this chimeric gene is cultured overnight, centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes, and suspended in B5 suspension medium. Soybean seeds are sterilized, cultured in B5 medium at 1/10 concentration for 3 days, and germinated. The cotyledons are cut out and cultured for 2 hours in an Agrobacterium suspension. This cotyledon was added to B5 medium (Gamborg B5 salt (Exp. Cell. Res., 50, 151 (1968), Gamburg B5 vitamin, 3% sucrose. 5 μM benzylaminopurine, 10 μM IBA, 100 μM acetosyringone). Transferred and irradiated with light at 25 ° C. for 23 hours (60 μEm ^-2 S ^-1 ) Incubate for 3 days under the conditions. Next, in order to remove Agrobacterium, the medium is changed every day at 25 ° C. for 4 days in B5 medium (5 μM benzylaminopurine, 100 mg / L carbenicillin, 100 mg / L vancomycin, 500 mg / L cefotaxime). Incubate. Thereafter, the cells are cultured in B5 medium (200 mg / L kanamycin). Multishoots are formed in 1 to 2 months. This is cultured in B5 medium (0.58 mg / L gibberellin, 50 mg / L kanamycin) to elongate the shoot. Then transfer to B5 medium (10 μM IBA) and root. The rooted young plant body is acclimatized and can be cultivated in a greenhouse to obtain a transformant.
[0089]
Confirmation of a transformant plant into which a raffinose synthase gene has been introduced can be easily confirmed by extracting DNA from the transformant and performing Southern hyperpridation using the raffinose synthase gene as a probe.
[0090]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
First, in the following examples, a method for measuring raffinose synthase activity used for confirmation of active fractions in each purification step and examination of enzyme characteristics will be described.
[0091]
<Raffinose synthase activity measurement method>
The activity of raffinose synthase was determined by quantifying raffinose produced by the raffinose synthesis reaction by HPLC (high performance liquid chromatography). HPLC was performed using a sugar analysis system DX500 (CarboPac PA1 column, pulsed amperometry detector (Dionex)).
[0092]
The raffinose synthesis reaction was carried out at 32 ° C. for 60 minutes by adding 10 to 50 μl of raffinose synthase solution to a reaction solution prepared so that the final concentration had the following composition to make 100 μl.
[0093]
[Reaction solution composition (final concentration)]
2.5 mM sucrose
5 mM Galactinol
5 mM DTT
20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)
[0094]
After carrying out the reaction as described above, 4 times the volume of ethanol of the reaction solution was added, and the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 30 seconds. This was centrifuged, and the centrifugal supernatant was dried under reduced pressure, dissolved in distilled water, and raffinose in the reaction product was quantified with a sugar analysis system to obtain raffinose enzyme activity.
[0095]
[Example 1]
Purification of raffinose synthase from cucumber
<1> Extraction of raffinose synthase from cucumber
From the cucumber (variety “SUYOOU”) true leaves 6 to 10 weeks after sowing, the vein system was collected, frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 ° C. About 200 g of the frozen vein system is ground in a mortar under liquid nitrogen, and buffer 1 (40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 5 mM DTT, 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 1% polyclar AT ; Manufactured by Selva) and the protein was extracted. The extract was filtered through a filter such as gauze or Miracloth (Calbiochem-Novobiochem), and the filtrate was centrifuged at about 30,000 × g for 60 minutes at 4 ° C. The obtained centrifugal supernatant was used as a crude extract.
[0096]
<2> Anion exchange chromatography (1)
About 560 ml of the crude extract obtained above was equilibrated with buffer 2 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 5 mM DTT) and a strongly basic anion exchange chromatography column (HiTrapQ; Pharmacia). Manufactured, 1.6 cm × 2.5 cm) was applied to a connected column, and raffinose synthase activity was adsorbed on the column. Subsequently, the column was washed with 5 column volumes of buffer 3 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.2 M NaCl, 5 mM DTT) to wash away non-adsorbed protein, and then 50 ml of buffer. Raffinose synthase activity was extracted from the column with Solution 4 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.3 M NaCl, 5 mM DTT).
[0097]
<3> Anion exchange chromatography (2)
About 75 ml of the above eluate was placed in a dialysis tube (Pormembranes MWC O: 10,000; manufactured by Spectra), 10 L of Buffer 5 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.05 M NaCl, Dialyzed overnight at 4 ° C. against 5 mM DTT). The dialyzed sample was applied to a weakly basic anion exchange chromatography column (DEAE-TOYOPEARL; manufactured by Tosoh Corporation, 2.2 × 20 cm) equilibrated with buffer 5, and raffinose synthase activity was adsorbed onto the column. Subsequently, the column was washed with 5 times the volume of buffer solution 5 to wash away non-adsorbed proteins, and then the enzyme activity was eluted by linearly applying a NaCl concentration gradient of 0.05 M to 0.35 M to 20 column volumes. It was fractionated.
[0098]
<4> Gel filtration chromatography
About 160 ml of the eluate obtained above was concentrated to 6.5 ml using a concentrator (Cent Reprep 10; manufactured by Amicon). Each 3 ml of this concentrated solution was applied to a gel filtration chromatography column (Superdex 200 pg; 2.6 cm × 60 cm, manufactured by Pharmacia). Column equilibration and elution were performed using buffer 6 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.1 M NaCl, 5 mM DTT, 0.02% Tween 20). Among the fractions fractionated, fractions having raffinose synthase activity were collected.
[0099]
<5> Hydroxyapatite chromatography
About 25 ml of raffinose synthase active fraction fractionated by gel filtration was concentrated with Centriprep 10, and further buffer 7 (0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 5 mM DTT, 0.02 Buffer exchange was performed using% Tween 20). About 1.2 ml of the obtained concentrated solution was applied to a hydroxyapatite column (Bio-Scale CHT-1; manufactured by Biorad, 0.7 × 5.2) previously equilibrated with the same buffer, and raffinose synthase. The activity was adsorbed. After washing the column with 5 times the column volume (10 ml) of the same buffer, the enzyme activity was eluted with a linear gradient of 0.01 M to 0.3 M phosphate concentration over 20 column volumes. I drew it.
[0100]
<6> Hydroxyapatite trichromatography
The active fraction obtained by the hydroxyapatite chromatography obtained as described above was rechromatographed in the same manner to obtain a purified raffinose synthase fraction (about 2 ml).
[0101]
The protein content of this active fraction was about 200 μg. The total activity was 5700 nmol / hour, and the specific activity per protein was about 28 μmol / hour / mg. As will be described later, this active fraction contained only a protein showing a single band having a molecular weight of about 90 kDa to 100 kDa on electrophoresis. The specific activity of the obtained purified enzyme preparation was about 2000 times that of the crude extract, and the recovery rate with respect to the amount of enzyme after strong basic anion exchange chromatography with HiTrapQ was 12%. The results of purification are summarized in Table 1.
[0102]
[Table 1]

[0103]
[Example 2]
Study on characteristics of raffinose synthase
The characteristics of the purified raffinose synthase obtained in Example 1 were examined.
[0104]
<1> Molecular weight measurement
(1) Gel filtration chromatography
10 μl of the purified raffinose synthase was taken, and this sample and molecular weight marker (molecular weight marker kit for gel filtration: manufactured by Pharmacia) were applied to a gel filtration chromatography column (Superdex 200 pg; manufactured by Pharmacia).
Column equilibration and elution were performed using buffer 6 (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 0.1 M NaCl, 5 mM DTT, 0.02% Tween 20). As a result, the molecular weight of raffinose synthase was estimated to be about 75 kDa to 95 kDa.
[0105]
(2) Polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE)
10 μl of purified raffinose synthase was taken, and the same amount of sample buffer (0.0625 M Tris-hydrochloric acid (pH 6.8), 15% glycerol, 0.001% BPB) was added to prepare an electrophoresis sample. 10 μl of this sample was applied to a 10% polyacrylamide gel (manufactured by Daiichi Chemicals Co., Ltd., Multigel 10), and electrophoresed with 0.025 M Tris-0.192 M glycine buffer (pH 8.4) at 40 mA for about 60 minutes. After the electrophoresis, the gel was stained with a sylveststein silver staining kit (manufactured by Nacalai Tesque). As a result, the molecular weight was estimated to be about 90 kDa to 100 kDa.
[0106]
(3) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Take 10 μl of purified raffinose synthase and add the same amount of sample buffer (0.0625M Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% mercaptoethanol, 0.001% BPB) to the boiling bath. The sample was heated for 1 minute to prepare an electrophoresis sample. 10 μl of this sample was applied to a 10-20% gradient polyacrylamide gel (manufactured by Daiichi Chemicals), 40 mA, about 70 with 0.025 M Tris-0.192 M glycine buffer (pH 8.4) containing 0.1% SDS. Electrophoresis was performed. After the electrophoresis, the gel was stained with a sylveststein silver staining kit (manufactured by Nacalai Tesque). The results are shown in FIG. As a result, the molecular weight was estimated to be about 90 kDa to 100 kDa.
[0107]
<2> Optimum reaction temperature
The raffinose synthase activity was measured under various temperature conditions (28 ° C., 32 ° C., 36 ° C., 40 ° C., 44 ° C., 48 ° C., 52 ° C.) according to the above-described method for measuring raffinose synthase activity. The enzyme solution added to each reaction solution was 2 μl. The relative activity at each temperature when the enzyme activity at 32 ° C. is taken as 100 is shown in FIG. As a result, raffinose synthase showed activity in the range of about 25-42 ° C, and the optimum temperature for the reaction was around 35-40 ° C.
[0108]
<3> Optimum reaction pH
Raffinose synthase activity was measured under various pH conditions (pH 4 to 11) according to the raffinose synthase activity measurement method described above. For each reaction, 50 mM citrate buffer (pH 4-6), 50 mM potassium phosphate buffer (pH 5.5-7.5), 50 mM bis-Tris buffer (pH 6-7), 20 mM Tris-HCl buffer (PH 7 to 8.5), 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9 to 11) was used. The enzyme solution added to each reaction solution was 2 μl. The results are shown in FIG.
[0109]
As a result, raffinose synthase showed activity in the range of pH 5-10, and the optimum reaction pH was around 6-8, although it varied depending on the type of buffer used.
[0110]
<4> Investigation of inhibitors and metal ions
Various enzyme inhibitors or metal ions were added to the purified raffinose synthase reaction solution to a final concentration of 1 mM, and raffinose synthase activity was measured in the same manner as described above. Table 2 shows the residual activity relative to the enzyme activity when no inhibitor or metal ion is added. Iodoacetamide significantly inhibited enzyme activity, and N-ethylmaleimide also showed an inhibitory effect. CaCl ₂ CuCl ₂ MgCl ₂ Had little inhibitory effect, but MnCl ₂ ZnCl ₂ NiCl ₂ Showed an inhibitory effect.
[0111]
[Table 2]

[0112]
<5> Inhibition by myo-inositol
Inhibition by myo-inositol, a reaction product of the raffinose synthesis reaction, was examined. Various concentrations of myo-inositol were added to the reaction solution, and raffinose synthase activity was measured. The results are shown in FIG. Enzyme activity was inhibited with the concentration of added myo-inositol.
[0113]
<6> Stable pH
In the anion exchange chromatography (2) in 50 mM Bistris hydrochloride buffer (pH 5-8, containing 0.5 mM DTT) or 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7-8, containing 0.5 mM DTT) The obtained raffinose synthase fraction was incubated at 4 ° C. for 4 hours, and then raffinose synthase activity was measured. The enzyme activity with respect to the pH of the buffer used for incubation is shown in FIG. Under any incubation condition, raffinose synthesis activity was observed, and it was particularly stable in the range of pH 5 to 7.5.
[0114]
<7> Stable temperature
The raffinose synthase fraction obtained by the anion exchange chromatography (2) in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (containing pH 7, 5 mM DTT) was obtained at 28 ° C., 32 ° C., 37 ° C. or 40 ° C. for 60 minutes. After incubation, raffinose synthase activity was measured. As a result, the present enzyme was stable with an activity of 80% to 100% compared to the control group in which the incubation treatment was not performed in the range of 28 ° C to 40 ° C.
[0115]
<8> Analysis of amino acid sequence
The cysteine residue of purified raffinose synthase was reduced to pyridylethyl and desalted. This was digested with lysyl endopeptidase (Achromobacter protease 1, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. for 12 hours to obtain peptide fragments. The obtained peptide mixture was subjected to reverse phase HPLC (column: Waters μBondasphere (φ2.1 × 150 mm, C ₁₈ , 300 、), manufactured by Waters (Millipore), and each peptide fragment was separated and obtained. The solvent was 0.1% TFA (trifluoroacetic acid), and elution was performed with an acetonitrile concentration gradient. Among the obtained peptide fragments, the amino acid sequences of three fragments were determined by a protein sequencer. The determined amino acid sequences of the peptides are shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in Sequence Listing. Hereinafter, these peptides are referred to as peptides 1, 2, and 3, respectively.
[0116]
[Example 3]
Acquisition of DNA encoding raffinose synthase
<1> Isolation of a partial fragment of raffinose synthase cDNA by PCR
22 g of the main cucumber veins were ground in liquid nitrogen using a mortar. This ground product is added to an extraction buffer (100 mM lithium chloride, 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS) mixed with an equal amount of phenol preheated to 80 ° C., and after stirring, phenol is added. An equivalent amount of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) was added, and the mixture was stirred again. This mixture was centrifuged at 9250 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. This supernatant was repeatedly subjected to phenol treatment and chloroform: isoamyl alcohol treatment to obtain a centrifugal supernatant. An equal amount of 4M lithium chloride was added to the supernatant and allowed to stand at -70 ° C for 1 hour.
[0117]
After thawing at room temperature, the mixture was centrifuged at 4250C for 30 minutes at 9250 xg to obtain a precipitate. This precipitate was washed once with 2M lithium chloride and 80% ethanol, dried and then dissolved in 2 ml of diethylpyrocarbonate-treated water to obtain purified total RNA. Total RNA obtained was 2.38 mg.
[0118]
The total amount of this total RNA was determined with poly (A) using an oligo (dT) cellulose column. ⁺ Poly (A) provided for RNA purification kit (manufactured by STRATAGENE CLONING SYSTEMS) ⁺ RNA molecules were purified and 42.5 μg of poly (A) ⁺ RNA was obtained.
[0119]
Poly (A) obtained as described above ⁺ Single-stranded cDNA was synthesized from RNA using reverse transcriptase SuperScriptII (GIBCO BRL). In order to isolate raffinose synthase cDNA from this cDNA mixture, amplification by PCR was performed. As the primers used for PCR, single-stranded oligonucleotides (SEQ ID NOs: 6 to 22) shown in FIG. 7 were synthesized from the amino acid sequence of the peptide fragment of raffinose synthase derived from cucumber determined in Example 2. In each primer sequence, R is A or G, Y is C or T, M is A or C, K is G or T, D is G, A or T, H is A, T or C , B represents G, T or C, N represents G, A, T or C, or inosine (base is hypoxanthine), respectively.
[0120]
As a primer, A (A1 (SEQ ID NO: 6), A2 (SEQ ID NO: 7), A3 (SEQ ID NO: 8), A4 (SEQ ID NO: 9)) is used as the 5 ′ primer, and D ′ (D′ 1 is used as the 3 ′ primer. (SEQ ID NO: 21), D′ 2 (SEQ ID NO: 22)), 5 ′ primer with C2 (SEQ ID NO: 14)), and 3 ′ primer with B′1 (SEQ ID NO: 18), or B′2 When (SEQ ID NO: 19) was used, DNA of about 540 base pairs was amplified. This fragment was cloned into plasmid pCRII using TA cloning kit (INVITROGENBV) and analyzed for nucleotide sequence. As a result, nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of peptides 1 and 2 were found inside the primer sequences at both ends. It was found that the amplified fragment was a DNA fragment derived from the raffinose synthase gene.
[0121]
Furthermore, in order to specify the position of the cloned PCR-amplified DNA fragment on the raffinose synthase gene, 3 ′ RACE was performed using a RACE kit (3 ′ Amplifier RACE Kit (manufactured by CLONTECH)).
[0122]
PCR was performed using the cDNA mixture as a template, C (C1 (SEQ ID NO: 13), C2 (SEQ ID NO: 14)) as a 5 ′ primer, and a primer having an oligo (dT) and an anchor sequence as a 3 ′ primer. The amplified fragment thus obtained was used as a template, D (D1 (SEQ ID NO: 15), D2 (SEQ ID NO: 16)) located inside C was used as a 5 'primer, and an oligo ( PCR was performed using dT) -anchor primer. As a result, PCR was performed with D2 (SEQ ID NO: 16) and oligo (dT) -anchor primer using DNA amplified with C1 (SEQ ID NO: 13), C2 (SEQ ID NO: 14) and oligo (dT) -anchor primer as a template. Only when the DNA fragment of about 2400 base pairs was amplified. Further, PCR was performed using C (C1 (SEQ ID NO: 13), C2 (SEQ ID NO: 14)) as the 5 ′ primer and an oligo (dT) -anchor primer as the 3 ′ primer, and the amplification thus obtained. PCR was performed using the fragment as a template, E (SEQ ID NO: 17) as the 5 ′ primer, and an oligo (dT) -anchor primer as the 3 ′ primer. As a result, in each case, a DNA fragment of about 300 base pairs was amplified.
[0123]
Similarly, A (A1 (SEQ ID NO: 6), A2 (SEQ ID NO: 7), A3 (SEQ ID NO: 8) or A4 (SEQ ID NO: 9)) as the 5 ′ primer and 3 ′ primer as the 5′-side primer using the cDNA mixture as a template PCR is performed using a primer having an oligo (dT) and an anchor sequence, and B (B1 (SEQ ID NO: 10) and B2 (SEQ ID NO: 11) located inside A are used with the amplified fragment thus obtained as a template. ) Or B3 (SEQ ID NO: 12)), and PCR was performed using the same oligo (dT) -anchor primer on the 3 ′ side. As a result, when any primer A was used, a DNA fragment of about 2000 base pairs was obtained when the B2 primer was used. Therefore, DNA fragments amplified using the A2 and B2 primers were cloned. When the nucleotide sequence was analyzed, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of peptide fragment 1 used for primer preparation was present on the 5 ′ side. In addition, a poly (A) sequence and a base sequence corresponding to peptide fragment 3 existed upstream of the poly (A) sequence.
[0124]
When combined with the results of the previous PCR, the raffinose synthase peptide fragments are arranged in the order of 2, 1, 3 from the N-terminal side, and the DNA fragment of about 540 base pairs previously obtained by PCR is the raffinose synthesis. It was found to be a portion near the 5 ′ end on the enzyme gene. In order to screen a cDNA clone containing the entire raffinose synthetic gene, since it is desirable that the DNA used as a probe can detect a portion close to the 5 ′ end, this DNA fragment was used as a probe for screening a cDNA library.
[0125]
<2> Cloning of the entire coding region of raffinose synthase cDNA
First, a cDNA library was prepared as follows. Poly (A) obtained in <1> ⁺ Double-stranded cDNA was synthesized from 3.8 μg of RNA using Time Saver cDNA synthesis kit (Pharmacia Biotech). The obtained cDNA was incorporated into an EcoRI restriction enzyme cleavage site of a λ phage vector λMOSSlox (Amersham), and then incorporated into a phage protein using a Gigapack II Gold packaging kit (STRATAGENE CLONING SYSTEMS). CDNA library was prepared. The library titer is 1.46 × 10. ⁷ pfu / μg vector.
[0126]
1.4 × 10 from the above cucumber cDNA library ^Five After infecting the host cell Escherichia coli ER1647 with a phage corresponding to pfu, 14 × 90 mm diameter agar plates were loaded with 1.0 × 10 6 per plate. ^Four I asked to be pfu. This was cultured at 37 ° C. for about 6.5 hours, and then the phage plaque formed on the plate was transferred to a nylon membrane (Hybond-N + manufactured by Amersham).
[0127]
Next, the nylon membrane was treated with alkali to denature and neutralize the transferred DNA, and then washed. Thereafter, the nylon membrane was treated at 80 ° C. for 2 hours to immobilize DNA on the membrane.
[0128]
The resulting nylon membrane was screened for positive clones using the DNA fragment of about 540 base pairs obtained in <1> as a probe. The above-mentioned DNA fragment of about 540 base pairs was electrophoresed after digestion with the restriction enzyme EcoRI, and only the insert of about 540 base pairs was excised and purified to obtain a DNA label / detection system (Gene Images labeling / detection system (Amersham). ))) To obtain a probe. The nylon membrane was prehybridized at 60 ° C. for 30 minutes, and then a labeled probe was added and hybridization was performed at 60 ° C. for 16 hours. An antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-fluorescein antibody) for detecting the labeled DNA was used after being diluted 50000 times. In this screening, candidate strains of positive clones were obtained. Screening of the obtained candidate strain was repeated twice in the same manner as described above to obtain a purified positive clone.
[0129]
The above positive clone was infected with Escherichia coli BM25.8 and cultured on a selective medium containing carbenicillin to cut out plasmid vector λMOSSlox-CRS containing cDNA. The length of the inserted cDNA of this plasmid was about 2.5 kb. Furthermore, enterococcus JM109 was transformed with this plasmid, plasmid DNA was prepared from the transformant, and this was used as a sample for analyzing the base sequence.
[0130]
The nucleotide sequence of the inserted cDNA was analyzed by a conventionally known method using Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer).
[0131]
As a result, a base sequence consisting of 2352 base pairs shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing was revealed. In this sequence, there was a portion that coincided with the base sequence of the DNA probe used by the present inventors. The amino acid sequences translated from the base sequences are shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. In this amino acid sequence, peptides 1 of raffinose synthase derived from cucumber obtained by the present inventors (amino acids 215 to 244 in SEQ ID NO: 5), 2 (amino acids 61 to 79 in SEQ ID NO: 5) and 3 It was confirmed that there was a portion that coincided with (amino acid numbers 756 to 769 in SEQ ID NO: 5) and encoded raffinose synthase.
[0132]
The transformant AJ13263 of Escherichia coli JM109 carrying the plasmid pMossloxCRS containing the DNA encoding the raffinose synthase obtained as described above was introduced on November 19, 1996 from the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science and Technology. It is deposited internationally based on the Budapest Treaty at the Industrial Technology Research Institute (Postal Code 305, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) and has been assigned the deposit number FERM BP-5748.
[0133]
[Example 4]
Chimeric gene containing DNA encoding raffinose synthase and transformed plant
<1> Construction of a plasmid containing a chimeric gene
A DNA fragment of raffinose synthase was introduced into Arabidopsis thaliana using LBA4404 as Agrobacterium and pBI121 (CLONTECH) as a binary vector. pBI121 is a plasmid derived from pBIN19, a nopaline synthase gene promoter, a neomycin phosphotransferase structural gene (NPTII), a nopaline synthase gene terminator (Nos-ter), a CaMV 35S promoter, a GUS (β-glucuronidase) gene, and a Nos -Ters are connected and have a sequence on both sides of them that can be transferred to plants. There is a SmaI site downstream of the CaMV 35S promoter, and the insert inserted at this site is expressed under the control of the promoter.
[0134]
The raffinose synthase gene fragment obtained in Example 3 was inserted into the binary vector pBI121. The raffinose synthase gene was digested with DraI, and a DNA fragment containing bases 30 to 1342 in SEQ ID NO: 4 was prepared by agarose gel electrophoresis. This fragment was ligated to the SmaI site of pBI121. Escherichia coli HB101 was transformed using this ligation reaction solution, and a recombinant plasmid was prepared from the transformed strain. Among the obtained recombinant plasmids, two types were selected, one in which the raffinose synthase DNA fragment was connected to the CaMV 35S promoter in the reverse direction (antisense) and the other in the positive direction (sense), and pBIRS1 And pBIRS9.
[0135]
The plasmid obtained as described above was introduced into Agrobacterium LBA4404 by triparental mating.
Transformation of Arabidopsis was performed as follows. Arabidopsis thaliana seeds were treated with water absorption after treatment with 80% ethanol containing 1% Tween 20 for 5 minutes, 10% sodium hypochlorite containing 1% Tween 20 for 10 minutes, and then 5 times with sterile water. Washed and sterilized. This was suspended in 1% low melting point agarose, MS medium (MS basic medium (Murashige and Skoog, Physiologia Plantrum, 15, 473-497 (1962)), B5 vitamin, 10 g / L sucrose 0.5 g / L MES, I went to pH 5.8). This was cultured for 1 week in a culture room of 22 ° C., 16 hours of light irradiation, and 8 hours of dark period, and what Futaba developed was planted in rock wool. Cultivation was continued under the same conditions, and after about 3 weeks, the plants were drawn out, and when the stalk height reached several centimeters, pinching was performed. One week after pinching, the plants were grown until the first flower of the elongated side branch was in bloom.
[0136]
Agrobacterium precultured with a recombinant plasmid containing a raffinose synthase gene was performed in 2 ml of LB medium. This was inoculated into LB medium containing 50 mg / L kanamycin and 25 mg / L streptomycin and cultured at 28 ° C. for about 1 day. Collected at room temperature, suspension medium for infiltration (1/2 MS salt, 1/2 Gamborg B5 vitamin, 5% sucrose, 0.5 g / L MES, pH 5.7 (KOH), benzylamino just before use. Add pudding to a final concentration of 0.044 μM and add 200 μl / liter of Silwet L77 (final concentration of 0.02%)) ₆₀₀ Was suspended to 0.8.
[0137]
The flowering and fruiting was removed from the infiltrating plant. The rock wool was turned upside down, and the flowers that did not bear fruit were dipped in the Agrobacterium suspension, placed in a desiccator, and decompressed at 40 mmHG for 15 minutes. Seeds were collected in 2 to 4 weeks. The harvested seeds were stored in a desiccator.
[0138]
Next, transformants were selected using a selection medium. Seed sterilization as described above, selection medium (MS salt, Gambol B5 vitamin, 1% sucrose, 0.5 g / L MES, pH 5.8, 0.8% agar; after autoclaving, antibiotics for selection , Cultured in carbenicillin (final concentration 100 mg / L, kanamycin (final concentration 50 mg / L) added) at 22 ° C., and selected resistant plants.The resistant plants were transferred to a new medium and grown until the true leaves developed. The seeds were harvested from this plant, and the same selection was repeated to obtain T3 seeds.The raffinose content of the T3 seeds was quantified by the method described above.
[0139]
[Table 3]

[0140]
【The invention's effect】
The present invention provides a purified raffinose synthase, a raffinose synthase gene, a chimera gene having a raffinose synthase gene and a control region that can be expressed in plants, and a plant into which the chimera gene has been introduced.
[0141]
By using the raffinose synthase of the present invention, raffinose can be efficiently synthesized from sucrose and galactinol. Moreover, the raffinose group oligosaccharide content of a plant can be changed by utilizing the raffinose synthase gene or chimeric gene of the present invention.
[0142]
[Sequence Listing]

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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of raffinose produced by a raffinose synthesis reaction and the reaction time.
FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of raffinose synthase. M represents a molecular weight marker, and S represents a sample containing raffinose synthase. The numbers represent molecular weight (kDa).
FIG. 3 is a graph showing the influence of reaction temperature on raffinose synthase activity.
FIG. 4 is a graph showing the effect of reaction pH on raffinose synthase activity.
FIG. 5 shows the effect of myo-inositol on raffinose synthase activity.
FIG. 6 shows a stable pH range of raffinose synthase.
FIG. 7 is a view showing the relationship between a synthetic primer and an amino acid sequence of a peptide. R is A or G, Y is C or T, M is A or C, K is G or T, D is G, A or T, H is A, T or C, B is G, T or C, N represents G, A, T or C, and I represents inosine.

Claims (12)

A raffinose synthase comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing and having the following properties.
(1) Action and substrate specificity: Raffinose is produced from sucrose and galactinol. (2) Optimum pH: about 6-8
(3) Optimum temperature: about 35-40 ° C
(4) Molecular weight:
i) Molecular weight measured by gel filtration chromatography: about 75 kDa to 95 kDa
ii) Molecular weight measured by polyacrylamide gel electrophoresis: about 90 kDa to 100 kDa
iii) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 90 kDa to 100 kDa
(5) Inhibition:
Inhibited by iodoacetamide, N-ethylmaleimide, myo-inositol. Raffinose synthase which is a protein shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, and raffinose from sucrose and galactinol. Protein with activity to produce.   A method for producing raffinose, wherein raffinose is produced by allowing the raffinose synthase according to claim 1 or 2 to act on sucrose and galactinol.   A DNA encoding the raffinose synthase according to claim 1 or 2. DNA encoding the protein shown in (A) or (B) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, and raffinose from sucrose and galactinol. Protein with activity to produce. The DNA according to claim 4, which is the DNA shown in (a) or (b) below.
(A) A DNA comprising a base sequence consisting of at least base numbers 56 to 2407 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotide numbers 56 to 2407, and has an activity to generate raffinose from sucrose and galactinol DNA encoding a protein. A chimeric gene comprising the raffinose synthase gene , which is the DNA according to any one of claims 4 to 6, and a transcription control region that can be expressed in plant cells. The transcription control regions, the raffinose synthase gene linked chimeric gene according to claim 7, wherein is to express an antisense RNA having a sequence complementary to the coding strand of the raffinose synthase gene. A plant transformed with the chimeric gene according to claim 7 or 8 . A method for changing the raffinose group oligosaccharide content of the plant by transforming the plant with the chimeric gene according to claim 7 or 8 , and expressing the gene in a plant cell.   A plant transformed with the DNA according to any one of claims 4 to 6.   A method for changing the raffinose group oligosaccharide content of the plant by transforming the plant with the DNA according to any one of claims 4 to 6 and expressing the DNA in a plant cell.

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