JPH11514521A

JPH11514521A - Modified plants and plant products

Info

Publication number: JPH11514521A
Application number: JP9517171A
Authority: JP
Inventors: スミス，アリソン，メアリー; デンヤー，カイ
Original assignee: プラントバイオサイエンスリミティド
Priority date: 1995-11-03
Filing date: 1996-11-04
Publication date: 1999-12-14
Also published as: CA2235619A1; EP0871744A1; AU720418B2; WO1997016554A1; AU7323996A; GB9522589D0

Abstract

(57)【要約】細胞（特に植物細胞）のマルト−オリゴサッカライド(MOS)含量は調節され、その細胞による変化されたα−グルカン（例えばデンプン）生産を引きおこす。アミロースのような非分枝α−グルカン及びアミロペクチンのような分枝α−グルカンの生産における粒子結合デンプンシンターゼＩ（GBSSＩ）活性は、MOS 含量を調節することによって改変される。 (57) [Summary] The malto-oligosaccharide (MOS) content of a cell, especially a plant cell, is regulated, causing altered α-glucan (eg, starch) production by the cell. The activity of particle-bound starch synthase I (GBSSI) in the production of unbranched α-glucans such as amylose and branched α-glucans such as amylopectin is modified by adjusting the MOS content.

Description

【発明の詳細な説明】改変植物及び植物産物本発明は、植物改変、特に植物によって産生されるデンプンα−グルカンの性質を変えるためにα−グルカンシンターゼである植物酵素“GBSSＩ”の活性の操作による改変に関する。GBSSＩ活性は、GBSSＩによるアミロース（いくつかのα −１，６結合を有する又はそれを有さない非分枝のα−１，４グルカン）合成のために必要であることが見い出されているマルト−オリゴサッカライド成分を制御することにより、調節される。GBSSＩに対するマルト−オリゴサッカライドの利用性が削減されるなら、その酵素はアミロースのかわりにアミロペクチン（分枝α−１，４，α−１，６グルカン）に広がる。穀類の内孔、ポテトの塊茎及びエンドウの胚のような保存器官からのデンプン粒子は２又はそれ超のデンプンシンターゼのイソフォームを含む。その全ては、粒子結合デンプンシンターゼ（granule-bound starch synthase）Ｉ（GBSSＩ）として言及されるであろう約60KDa の高度に保存された排他的に粒子が結合したイソフォーム−通常主要粒子結合タンパク質、及び１又は複数の他のイソフォームを有する。GBSSＩを欠く変異体の分析は、このイソフォームが、野生型保存器官のデンプンの約30重量％を含む比較的非分枝のグルカンポリマーであるアミロースの合成のために特異的に必要とされることを示した(Smith and Martin 1993 )。これにより、（“ワキシータンパク質（waxy protein）”としても知られる）GBSSＩは、デンプンのアミロース構成物の合成の原因であることが受け入れられている（Smith 及びMartin 1993，Smithら、1995，Martin及びSmit ｈ 1995に報告される証拠）。 GBSSＩクラス以外のGBSSの機能は確立されていない。これらの他のイソフォームがいずれの有意な程度までもアミロースを合成することができないことがGBSS Ｉを欠く変異体のデンプンの研究から明らかである（例えばDenyerら、1995ａ， Hyltonら、1995）。しかしながら、これらのイソフォームがその粒子内のアミロペクチンの合成に寄与するか否かは知られていない。（GBSSIIと呼ばれる）発達中のエンドウ胚の77KDa GBSSのようなGBSSＩ以外のGBSSのいくつかはアミロプラストの可溶性画分内で見い出されており、デンプン粒子と関連している（Denyer ら、1993）。このようなイソフォームは可能性であるなら、アミロペクチン合成に極めて関連があるようであり、それが成長する粒子のマトリックス内に捕獲され得る。他のGBSS、例えば発達中のコムギの内乳の 100〜105KDa GBSS はデンプン粒子と全体的に会合しないなら支配的であるようである（Denyerら、1995ｂ）。これにより、現在、他のGBSSがアミロースの合成に関与することを示唆する証拠はない（Hyltonら、1995，Denyerら、1995ａ）。アミロース合成は、ろうタンパク質の排他的特性であり得る。この広く受け入れられている仮説にかかわらず、高等植物から単離したデンプン粒子によるアミロース合成を証明した者はいない。ADP グルコース（ADPG）からのグルコースは、ADPGが単離されたデンプン粒子に補給される時に作物の保存器官のデンプンに直ちに組み込まれることが確立されている（例えばFrydman 及びCardini 1967，Macdonald 及びPreiss 1983，Smith 1990，Hylton ら、1995， Denyerら、1995ｂ）。しかしながら、この組み込みはアミロペクチン内であり、アミロースではない（Babaら、1987）。本発明は、生体内に存在するが明らかに単離されたデンプン粒子内でない低分子量のグルカン（マルト−オリゴサッカライド；MOSと呼ぶ）が、G BSSＩによるアミロース合成のために必要とされるという驚くべき発見に基づく。マルトオリゴサッカライドなしではアミロースでなくアミロペクチンを増やす。これについての証拠は本明細書に詳細に記載されるが要約すると、１．発達中のエンドウの胚及び発達中のポテト塊茎からの単離したデンプン粒子は、ADPGから主に分枝したα−グルカン鎖内にグルコースを組み込む。極めて少いグルコースがアミロース内に組み込まれる。２．GBSSＩと他のGBSSイソフォームの両方がこのアミロペクチンの合成に寄与する。GBSSＩタンパク質及びアミロースを完全に欠くが第２のGBSSイソフォームを保持する変異エンドウの発達中の胚から単離されたデンプン粒子（lam 変異体：Denyerら1995ａ）はADPGからのグルコースをアミロペクチンに組み込むが、それは野生型エンドウからのデンプンよりデンプンに基づいてかなり低い比率であった。これは、野生型エンドウ胚からの単離されたデンプン粒子によるアミロペクチン合成のかなりの割合がGBSSＩによるものであることを示す。３．野生型エンドウ胚及びポテト塊茎の単離されたデンプン粒子へのMOS の添加はADPGからのグルコースの量及びその組み込みのパターンの実質的なシフトを増加させる。アミロペクチンの組み込みは減少し、そしてゲル浸透カラム上のアミロースと同じ移動度の低分子量材料への組み込みが実質的に増加する。マルトース（Ｇ２）からマルトヘプタオース（Ｇ７）の範囲のMOS はこのシフトを引きおこすことが示された。グルコースはこの効果を有さない。４．MOS の存在下でのADPGからのアミロースの合成は、排他的に GBSSＩの機能である。MOS はADPGからのグルコースの、GBSSＩを欠くlam 変異体の単離したデンプン粒子への組み込みに効果がない；組み込みはMOS が存在するか否かにかかわらずアミロペクチン内であった。５．高等植物の保存器官の抽出液は、ADPGからのグルコースの、単離したデンプン粒子への組み込みへのMOS の効果によく似た化合物を含む。ADPGをエンドウ又はポテトのホモジネートに供給した場合、グルコースはそのホモジネート内の粒子内のアミロペクチンとアミロースとの両方に組み込まれる。ホモジネートの可溶性構成物を除去するためのそのホモジネートの迅速な洗浄は、ADPGからのグルコースの組み込みの全体の比率を低下させ、アミロースへの組み込みの損失を引きおこす。そのホモジネートの熱安定性可溶性画分の、単離された粒子への添加はADPGからのグルコースの組み込みを促進し、MOS の添加と同様に、アミロペクチンからアミロース合成に向かうシフトを引きおこす。６．MOS の効果によく似た植物抽出物中の化合物はMOS 自体である。MOS をグルコースに特異的に転化するであろう酵素であるα−グルコシダーゼとのポテト塊茎のホモジネートの熱安定性可溶性画分のインキュベーションは、この画分が、ADPGからのグルコースの単離したデンプン粒子への組み込みを刺激し、そしてアミロースからアミロペクチンへ合成を再度方向づける能力を破壊する。これらの結果は、生体内のアミロプラスト中のMOS の存在がGBSSＩによるアミロースの合成のために欠くことができないこと及びMOS の欠如下ではGBSSＩ活性はアミロースからアミロペクチンへ再度方向づけられることを示す。従って、本発明は、プランタ（planta）内でのMOS レベルの操作がその植物により産生されるデンプンの操作、特にデンプンのアミロペクチン構成物の性質の操作のための手段を提供することを理解した。この研究に含まれるもの及び適用は何倍にもなる。植物の保存器官のアミロプラスト中のMOS のレベルの操作はGBSSＩによるアミロース合成及びアミロペクチンの鎖へのGBSSＩの作用に影響を与えるだろう。従って、その植物によって作り出されたデンプンの特性が改変されよう。テンプンを改良し、新規特性を作り出しそしてそれを研究することにかなりの関心がある。デンプンは、食物、紙、油、にかわ、タバコ及び織物を含む多くの工業において多くの関心のあるものである。例えば、改良等されたデンプンは、ビール、動物食物、ベーキング製品、例えばビスケット、ドーナッツ、パイ、ポテトチップスに、かんづめ食物、例えばスープ、果実及び野菜に、穀物に、香辛料、例えばケチャップに、脂肪及び油、例えばマーガリンに、乾燥食物、シロップ及び甘味料に、他の多数の食物に、建築材料、例えば厚紙、セラミック、繊維板及び繊維ガラス、塗料に、多くの化学製品及び方法に、クレヨン及びチョーク、コード、ひもに、治金、爆薬、ゴム、織物、染料にそしてタバコに用いられる。ポテトデンプンは、製紙工業におけるサイジング及び表面コーティングに、綿、梳毛糸及びスパンレイヨンラップに、そして織物工業における糸ぬい及び服を仕上げるのに用いられる。 “ワキシーコーン(Waxy corn)は、そのデンプンが、一般的なコーンスターチ中の72％アミロペクチン及び28％アミロース（非分枝α−グルカン）と比べて全体的にアミロペクチン（分枝α−グルカン）で構成されているものである。ワキシー座においていくつかの対立遺伝子が観察されている。例えば、その議論について“CORN−Improvement，Seed Production and Uses”，Jugenheimer（1976），John Wiley & Sons，USAを参照のこと。 WageningenのAgricultural University 及びCPRO InstituteのVi sserらのグループは、ワキシ−デンプンポテトを作り出すためにワキシ−タンパク質発現を目標にするアンチセンス技術を用いた。この研究は、製紙工業により委任されたものであり、デンプン改変及びその重要性における関心ある更なる説明を供する。本発明の第１の態様によれば、植物細胞中に存在するマルトオリゴサッカライド(MOS)の量を調節することを含む方法を提供する。特に植物の保存器官のアミロプラストに関心がある。細胞中のマルト−オリゴサッカライドのレベルを変えることは、アミロース及びアミロペクチンのGBSSＩ産生に影響を与え、それにより産生されるデンプンの性質に影響を及ぼす。本発明の一実施形態において、細胞中のマルト−オリゴサッカライドが涸渇される、発達中の保存器官のアミロプラストからMOS を減少させ又は除去するいずれのメカニズムもGBSSＩによるアミロース合成を防ぎ又は減少させる。その粒子内のアミロペクチンの鎖へのGBSSＩの作用は同時に増加する。これは、アミロースを欠き、又はそれのレベルが減少し、そして野生型デンプン並びにGBSSＩを欠く又は極めて低レベルのGBSSＩを有する変異及びトランスジェニック植物のデンプン（例えばトウモロコシ、オオムギ、モロコシ属ライス及びアマラントウス（ Amaranthus）、ポテトのamf 変異体、エンドウのlam 変異体、及びいずれかのGB SSＩを含むアンチセンス構成物を発現するトランスジェニックポテト：Smith 及びMartin 1993 の特定の文献）のそれと異なるアミロペクチン構造を有し、野生型デンプンのそれと異なり得るデンプンを生ずる。MOS を欠如し、又は極めて低レベルのMOS を有する植物のアミロペクチンは野生型植物又は同じ種のGBSSＩの変化されたレベルを有する植物からのアミロペクチンより長い枝を有するはずであり、そして同じ種の野生型植物からのアミロペクチンより長い枝を有し得る。これにより、本発明の態様は、植物細胞内で生産されたアミロペクチンを改変する方法（又は植物細胞内で改変されたアミロペクチンを生産する方法）であって、細胞内のマルト−オリゴサッカライド(MOS)の量を調節することを含む方法を提供する。細胞内のMOS レベルを変えることはGBSSＩの作用に影響を与え、これにより、細胞のアミロース及びアミロペクチン成分を変える。好ましい実施形態において、MOS は細胞内で（実質的に全体であることを含む）全体的に又は部分的に）涸渇され、改変されたアミロペクチン産物を導く。細胞内で生産されるデンプン（特にデンプンのアミロペクチン構成物）を改変することにおける、植物細胞内のマルト−オリゴサッカライドのレベルを減少させる物質の使用が本発明の更なる態様として供される。植物細胞中のMOS のレベルは以下の方法により定量的に評価することができる。最初に、細胞の代謝を極めて迅速に停止させる。典型的には、その組織を、液体窒素の温度に冷やしたトングにとめ、次に１Ｍ過塩素酸で解凍する。次に代謝物の酵素アッセイに適した中性pHでの組織の可溶性抽出物を調製する。上述の例において、組織の過塩素酸抽出物を５Ｍ炭酸ナトリウムのような適切なアルカリ溶液で中性にし、その生じた不溶性過塩素酸カリウムを遠心によって除去する。その抽出物をスクロース及びグルコースを除去するのに必要とされる酵素及び他の因子と一緒にインキュベートする。これは、例えば、Lowry 及びPassonneau（ 1971）により記載されるように、適切な濃度のインベルターゼ、グルコース６− リン酸デヒドロゲナーゼ、アデノシン三リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド：及び塩化マグネシウムの添加によって行うことができる。次にその抽出物をMOS をグルコースに加水分解するために過剰のα−グルコシダーゼ及びα −アシログルコシダーゼとインキュベートし、そのグルコースを、例えばLowry 及びPassonneau（1971）により記載されるようにアッセイする。組織中のMOS の量及び性質は、イオン交換クロマトグラフィーにより（上述のように調製された）抽出液から得られる可溶性中性化合物を含む画分を利用するいくつかの方法によって研究することができる。これらの方法は、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、及びパルスアンペロメトリー検出を併う高性態陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。アミロプラスト中のMOS の部分的又は全体的除去は、それを何か他のものに変換する基質としてMOS を用いる酵素を用いて行うことができる。例えば、適切な酵素はMOS をグルコースに変える。上述の酵素、又はGBSSＩに対するMOS 利用性を減少させる他の物質を植物細胞に供する１つの方法は、コード化核酸配列の細胞内での発現による。この目的のために好ましい酵素は、強いマルターゼ活性（即ちマルトースについて低いKm）を有し得、そしておそらくイソマルターゼ活性がほとんどもしくは全くない（即ちα−１，６結合への作用がほとんどないが全くない）又はデンプン粒子との活性がほとんどもしくは全くないα−グルコシダーゼ（EC ３．２．１．20）である。明らかに、その酵素は、細胞の細胞質内でおこり得るpHの範囲内で至適pHを有することが好ましい(典型的には 6.5〜7.8) 。このような活性を有する酵素は、Needlemanら（1978）により記載されるように、特異的基質４−ニトロペニルグルコシドを加水分解するそれらの能力によって同定することができる。適切なpHでの適切な基質の濃度での酵素のインキュベーションは、加水分解が進むにつれ黄色の外観になる。マルトース又はいずれかの他のMOS についてのKmは、その反応が直線的に進行するように確立された所定の期間、マルトース又は他のMOS の濃度の範囲での適切なpHでの酵素のインキュベーションによって規定することができる。いずれかの安定で特異的かつセンシティブな手段による（例えばLowry 及び Passonneau，1971により記載されるような酵素アッセイによる）所定期間にわたって作られたグルコースの量の測定は、その基質についての酵素のアフィニティーをCornish-Bowden（1995）によってこの目的のために記載されるいずれかの方法によって計算することができる酵素活性の定量的評価を供する。酵素の至適pHは、異るpHの範囲（典型的には 5.5〜8.5 の範囲）における適切な基質との酵素のインキュベーション、及び次の各々のpHで加水分解される基質の量の測定によって発見することができる。デンプンへの酵素の作用は、デンプン粒子又はそれから得られる可溶性ポリマーとの酵素のインキュベーションに基づく還元糖の生産量の測定によって検査することができる。還元糖の測定のための適切な方法は、Bernfeld（1951）により記載される。上述の全ての方法が、市販の酵素から又はいずれかの適切な生物からの精製もしくは部分的精製によって得られる精製された又は部分的に精製された酵素に適用することができる。精製の方法は、Needleman ら（1978）によりイーストについて記載されるものに例示される。上述の技術は、いずれかの適切な生物から調製された細胞抽出物において酵素を研究するのにも用いることができる。しかしながら、いずれの当業者も、細胞抽出物がMOS 及び／又はデンプンの加水分解を行うことができるいくつかの活性を含み得、そしてこれらの活性のいずれか一の特性の限定は部分的精製なしでは可能でないことを認めるであろう。バクテリアバチルス・アミロリチクス（Bacillus amylolyticus）のマルターゼ及びイーストサッカロマイセス・カルスベルジエンシス（Saccharo myces carlsbergensis）のMAL6座においてコードされたマルターゼが適切であり（Kelly 及びFogarty 1983）：サッカロマイセスマルターゼについての遺伝子がクローン化されている(Hong及びMarmur 1986)。必要なら、いずれの当業者も、例えばバチルス・セレウス(Bacillus cereus) からのオリゴ−１，６−グルコシダーゼをクローンするのに用いられる大腸菌形質転換の明らかな改良（Watanabeら、1990）により、又はマルトースのための構造遺伝子内に変異を有することにより炭素源としてマルトースを利用することができないサッカロマイセス株の補足によって、バクテリアからのいずれかの要求されるマルトターゼのための遺伝子をクローンすることができる（Federotfら、 1982）。アミロース合成を促進する植物MOS を破壊することによりGBSSＩによるアミロース合成よりむしろアミロペクチン合成を許容するα−グリコシダーゼの効能は、本明細書に詳細に記載される実験により証明される。遺伝子は、当業者に周知であるデータベースで利用できる配列からの情報を用いてクローンすることができる。核酸を得る方法は、オリゴヌクレオチド又は誤オリゴヌクレオチドを含む核酸分子の、標的／候補核酸へのハイブリダイゼーションを含み得る。標的又は候補核酸は、例えば、そのような核酸を含むことが知られている又はそれを含むと予想される生物から得ることができるゲノム又はcD NAライブラリーを含み得る。成功したハイブリダイゼーションを同定し、標的／候補核酸を更なる研究及び／又は使用のために単離することができる。ハイブリダイゼーションは、核酸をプロービングすること及び（周知の技術に従う）適切なストリンジェント条件下での陽性ハイブリダイゼーションを同定すること及び／又はPCR のような核酸増幅の方法におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用に関連し得る。プローピングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定された小数のハイブリダイゼーションで単純なパターンとなるのに十分にストリンジェントであるものである。少しの陽性クローンのみが残るまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを次第に増加させることが当業者に公知である。プロービングのかわりとして、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、 DNA 配列を増幅するようデザインされたオリゴヌクレオチドを、PCR 反応又は慣用的手順を用いる核酸の増幅に関する他の方法に用いることができる。例えば、 “PCR protocols ; A Guide to Methods and Applicutions ”，Eds．Innisら、 1990，Academic Press，New Yorkを参照のこと。アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができ、そして適切なら、その候補核酸からの生物のコドン利用性が誘導される。核酸増幅又はプロービングに用いるためのオリゴヌクレオチドは、約10又はそれ未満のコドン（例えば６，７又は８）を有し得、即ちそれは約30又はそれ未満のヌクレオチド長（例えは18.2又は24）である。このようなPCR 産物が関心の遺伝子に相当するか否かの評価は種々の方法で行うことができる。このような反応からのPCR バンドは産物の複合混合物を含み得る。個々の産物をクローンすることができ、その各々を個々にスクリーニングすることができる。それは、関心の植物への導入に基づいて機能を評価するために形質転換によって分析することができる。本発明に用いられるヌクレオチド配列は、利用できるものから選択された野生型配列（例えば遺伝子）、又はこのような配列の１又は複数のヌクレオチドの挿入、付加、欠失又は置換による突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子をコードし得る。ヌクレオチドの変換又はそれにおける差は、遺伝コードの縮重により、コードされたアミノ酸配列の変化に反映してもしなくてもよい。いずれの場合でも、本発明に役立つ変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能的特徴、即ち議論されるようなマルトース活性を保持するものである。もちろん、コードされたアミノ酸配列に差を作らない核酸への変化も含まれる。その核酸は、組換えベクターの形態、例えばプラスミド又はアグロバクテリウムバイナリーベクター（Van den Elzenら、1985）の形態であり得る。その核酸は植物細胞内での発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下にあり得る。ゲノムDNA の場合、これは、それ自体のプロモーター及び調節因子を含み得、そしてcDNAの場合、これは宿主細胞内の発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下にあり得る。当業者は、組換え遺伝子発現のためのベクターを作製し、プロトコルをデザインすることが十分に可能である。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切なベクターを選択し又は作製することができる。更に詳しくは、例えばMolecular Cloning : a Laboratory Manuaに２nd edition，Sambrookら、19 89，Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。核酸の操作のため、例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのDNA の導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における多くの周知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology， Second Edition，Ausubel ら、eds.，John Wiley & Sons，1992に詳細に記載される。Sambrookら及びAusubel らの開示は引用により本明細書に組み込まれる。植物で広範囲で成功して以前から用いられている特定の手順及びベクターは、Be ran(1984)並びにGuerineau 及びMullineaux（1993）により記載される。抗生物質、例えばカナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、セクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホゼートに対する耐性のような選択表現型を供するキメラ遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる（Herrera-Estrellaら、19 83；van den Elzenら、1985）。作物の発達中の保存器官のアミロプラストへのα−グルコシダーゼの活性の導入又は上昇は、その酵素をコードする配列の核酸を含む植物細胞を作り出すための植物形質転換のいずれかの適切な方法を用いて達成することができる。形質転換された植物細胞及び組織から植物を再生することができる。例えば、関心の遺伝子を有するアグロバクテリウム細胞及び適切な構成物中のカナマイシン耐性をコードする遺伝子との塊茎スライスのインキュベーションによりポテトを形質転換することができる(Spychalla 及びBevan，1993)。タバコフィーダー層上に２日間、同時培養した後、アグロバクテリウムに対して選択するためにセホタキシムを含むMurashige 及びSkoog(MS)培地上にディスクを移し、次に形質転換した細胞の増幅について選択するためにMS培地、セホタキシム及びカナマイシンを含む寒天プレートに移した。苗条をそのディスクから切除し、土に移す前にカナマイシンを含むMS培地に２回、副次培養する。選択された遺伝子構成物を細胞に導入し場合、当業者に公知である特定の考慮が払われなければならない。挿入されるべき核酸は、転写を誘導するであろう有効な調節因子を含む構成物内にアセンブルされるべきである。その構成物を細胞内に輸送する利用できる方法がなければならない。その構成物が細胞膜内にあるなら、内在性染色体材料内への組み込みがおこってもおこらなくてもよい。最後に、植物を考える限り、その標的細胞型は細胞が完全な植物に再生され得るようでなければならない。その配列を含むDNA セグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝操作について既に知られている標準的技術によって作り出すことができる。DNA は、いずれかの適切な技術を用いて、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウムによって行われるジスアームドTi−プラスミドベクター（EP-A-270 355，EP-A-0116718，NAR 12（22）8711 - 87215 1984）、パーティクルもしくはマイクロプロジェクティルボンバードメント（US 5100792，EP-A-444882，EP-A- 434616）マイクロインジェクション(WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP 175966，Green ら（1987）Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press) 、エレクトロポレーション（EP 290395，WO 8706614 Gelvin Debey ser - see a ttached）、他の形態の直接的DNA 取込み（DE 4005152，WO 9012096，US 468461 1）、リポソーム媒介性DNA 取込み（例えばFreeman らPlant Cell Physiol．29 : 1353(1984)）、又はボルテキシング法（例えばKindle，PNAS U．S．A．87 : 1 228（1990d）を用いて植物細胞に形質転換することができる。植物細胞の形質転換のための物理的方法は、Oard，1991，Biotech．Adv．9 : 1-11に報告される。アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物種を形質転換するために当業者に広く用いられている。現在、ほとんど全ての経済的に関連する単子葉植物における安定な豊富なトランスジェニック植物のルーチン生産に対する実質的な前進がある(Toriyama、ら（1988）Bio/Technology 6，1072- 1074 ; Zhang、ら（1988）Plant Cell Rep．7，379-384 ; Zhang、ら（1988）Th eor Appl Genet 76，835-840 ; Shimamoto、ら（1989）Nature 338，274-276 ; Datta、ら（1990）Bio/Technology 8，736-740 ; Christou、ら（1991）Bio/Tec hnology 9，957-962 ; Peng、ら（1991）International Rice Research Institu te，Manila，Philippines 563-574 ; Cao、ら（1992）Plant Cell Rep．11，585 -591 ; Li、ら（1993）Plant Cell Rep．12，250-255 ; Rathore、ら（1993）Pl ant Molecular Biology 21，871-884 ; Fromm、ら（1990）Bio/Technology 8，8 33-839 ; Gordon-Kamm、ら（1990）Plant Cell 2，603-618 ; D'Halluin，et al ．（1992）Plant Cell 4，1495-1505 ; Walters、ら（1992）Plant Molecular B iology 18，189-200 ; Koziel、ら（1993）Biotechnology 11，194-200 ; Vasil ，I．K．（1994）Plant MolecularBiology 25，925-937 ; Weeks、ら（1993）Pl ant Physiology 102，1077-1084 ; Somers、ら（1992）Bio/Technology 10，158 9-1594 ; WO92/14828)。豊富なトランスジェニック植物の生産は穀類コメ、トウモロコシ、コムギ、オート及びオオムギにおいて達成されている(Shimamoto，K．（1994）Current Opi nion in Biotechnology 5，158-162.; Vasil、ら（1992）Bio/Technology 10，6 67-674 ; Vainら、1995，Biotechnology Advances 13（4）; 653-671 ; Vasil， 1996，Nature Biotechnology 14 page 702)。アグロバクテリウムが効能なく又は無効である場合、マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的DNA 取込みが好ましい。あるいは、形質転換過程の効能を増強するために、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムでコートした微小粒子でのボンバードメント(EP-A-486234)又は創傷を導くためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリウムとの同時培養(EP-A-4862 33)を用いることができる。形質転換の後、当該技術で標準であるように、例えば単一細胞、カルス組織又は葉の円盤状組織から再生することができる。ほとんどいずれの植物も、植物の細胞、組織及び器官から全体を再生することができる。利用できる技術は、Vasi l ら、Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants，Vol I，II and III ，Laboratory Procedures and Their Applications，Academic Press，1984、及びWeissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989に報告される。形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換するその効能並びに特定の選択された方法で本発明を行う者の経験及び能力によって決定されよう。核酸を植物細胞内に導入するための特定の形質転換システムの選択は本発明に本質的でなく、又は本発明を限定するものでもなく、また植物再生のための技術の選択も同様である。導入された遺伝子の産物がアミロプラストを標的とし得るようにポテトを形質転換するための適切な方法は、Shewmakerら（1994）の研究によって例示される。プラスミドpCGN11325 は35Ｓプロモーター、シグナルペプチド及びエンドウリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニット遺伝子の成熟タンパク質の16アミノ酸を含む。関心の酵素をコードする遺伝子を、そのスモールサブユニットの16アミノ酸と一緒にフレーム内融合としてプラスミド内にクローン化した。その融合遺伝子を切り出し、パタチンプロモーターカセットpCGN2162にクローン化した。700 塩基対パタチンプロモーター、シグナルペプチド、スモールサブユニットの16アミノ酸、関心の遺伝子及び 300 塩基対nos ３’領域を含むDNA セグメントを切除し、バイナリーベクターpC GN1557にクローン化した。次にこのプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404 に移し、ポテトを形質転換するのに用いた。タンパク質のアミロプラストへの標的づけを達成するためのこの方法の効能は、ポテト塊茎内で発現されたタンパク質の正確なプロセッシングを示すイムノブロットにより示される。ポテトにおいてデンプン構造の変更をもたらすその方法の能力は、バクテリアのグリコーゲンシンターゼをコードする遺伝子を誘導するためのその使用により示される（Sheumaker ら、1994）。形質転換された植物のアミロペクチンは、対照植物より少い長い枝及び多い短い枝を有した。作物の保存器官のアミロプラストへα−グルコシダーゼを標的づ 91）の研究によって例示される。上述のものと同様の手順において、これらの研究者らは、シグナルペプチド及びトウモロコシの成熟ワキシ−タンパク質の34アミノ酸を大腸菌のβ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子に融合した。アグロバクテリウムに基づく方法によるポテト植物へのその構成物の導入は、そのトランスジェニック植物のクロロプラスト及びアミロプラスト内でのその融合タンパク質の発現を誘導した。細胞内のMOS のレベルは、MOS を作り出すことができる１又は複数の内在性酵素の活性のその細胞内での減少によって減少され得る。このような酵素、並びにそれらをコードする遺伝子の同定及びクローニングのための方法は、本明細書に他所で議論される。活性の減少は、アンチセンスRNA がその細胞内で形成されるような、アンチセンス方向における遺伝子又はその一部の細胞内への導入によって達成することができる。遺伝子又はその一部は、内在性酵素をコードする遺伝子と配列において十分に類似した内在性酵素又は他の酵素をコードするだろう。その遺伝子の導入は、本明細書に他所に議論されるように、いずれかの適切な形質転換法によって達成することができる。酵素活性の減少をもたらすアンチセンス方向における遺伝子を含む構成物の開発及び使用は、ポテト植物内で特定形態のデンプンシンターゼの大きな減少をもたらすためにこの技術を用いたEdwards ら（1995）及びMarshallら（1996）の研究により例示される。本発明の更なる態様は、植物のデンプン生産性細胞であって、該細胞内のマルト−オリゴサッカライドのレベルが、等価の野生型細胞内のレベルと比較して削減されており、そして前記デンプンが、等価の野生型細胞により生産されるデンプンと比較して増加した又は改良されたアミロペクチン構成物を有することを特徴とするデンプン生産性細胞を提供する。好ましくは、マルト−オリゴサッカライドのレベルは、異種のコード化核酸からの（開示されるような）マルトース活性を有するポリペプチドの細胞内での発現に関して削減される。用語“異種”とは、問題のヌクレオチド中の遺伝子／配列が、遺伝子工学を用いて、即ちヒトの介入により、植物の細胞又はその祖先内に導入されていることを示す。その遺伝子は、ゲノム外ベクター上であってもゲノム内に好ましくは安定に組み込まれてもよい。その細胞は、当該技術で利用できるいずれかの適切な技術を用いて、例えば形質転換により、核酸の細胞又はその祖先への導入による酵素をコードする核酸を含み得る。更に、それらの細胞を含む植物及びそのための種子は、いずれかの利用できる植物育種技術に従って、ゲノムが要求される核酸を含むハイブリッドを形成するために適切な親を交配することによって作り出すことができる。また、本発明によれば、コードされたポリペプチドの発現のための調節配列の作用的制御下でマルターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んだ、開示されるようなデンプン生産性植物細胞を提供する。そのポリペプチドの発現は、細胞内のマルト−オリゴサッカライドを涸渇させ、かわりにアミロースと反対にアミロペクチンへのGBSSＩの作用を引きおこし、改質されたアミロペクチンを作り出す。本発明の更なる態様は、ヌクレオチドの配列を含むベクターの植物細胞への導入を含む上述の植物細胞を作る方法を提供する。このような導入は、ヌクレオチドの配列をゲノムに導入するためのベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えに従い得る。次に、導入された核酸によりコードされたポリペプチドは、形質転換された材料から再生された植物中の細胞を含む細胞及びその子孫内で発現され得る。植物のゲノム内に安定に組み込まれた遺伝子は、世代から世代へ植物の子孫に渡るので、これらの子孫は要求される表現型を示すはずである。本発明は、議論されるような植物細胞を含む植物も提供する。このような植物は開示されるような改質されたアミロペクチン及びデンプンを作り出す。本発明による植物に、１又は複数の特性において本当に育種しないものであり得る。植物品種、特に植物育種家権（Plant Breeders’Rights）に従う登録できる植物品種は排除され得る。植物は、植物の細胞又はその祖先に導入されたトランスジーンをそのゲノム内に安定に含むだけなので、“植物品種”と考える必要はないことが注意される。植物に加えて、本発明は、このような植物のいずれかのクローン、種子、自殖又はハイブリッド後代及び子孫、並びに切断物、種子のようなこれらのいずれかのいずれか一部を供する。本発明は、切断物及び種子等を含む再生又は増殖、有性又は無性に用いることができるいずれかの部分であるいずれかの植物むかごを提供する。本発明は、穀物及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ポテト、タピオカ、コメ、モロコシ属の種、雑穀、キャッサバ、オオムギ、エンドウ及び他の根、塊茎又は種子作物を含む作物のような植物、原則としてデンプンのソースであるいずれかの植物に用いるのに特に有益である。アミロペクチン及び／又はデンプンは、植物の細胞内でのその生産の後、本発明に従って植物から抽出することができる。デンプン及び／又はアミロペクチンは、いずれかの利用できる技術を用いて得ることができる。例えば、ポテトデンプンは、塊茎から容易に分離され、そして19世紀初期には、家庭的使用のため世帯が一般に準備された。工業スケールにおいて、デンプンは、例えば以下のラインに沿った方法を用いて、ポテトから得ることができる：ポテトは円柱状の穴のあるスクリーンにより覆われた迅速に回転する垂直ハンマーミル内で水の流れにおいて分解される。これを通して、ポンプが一連の遠心回転ふるいに押しやられ、通過させられる。そのふるいを通過したデンプン懸濁液は、洗浄水を添加して、可溶性の不純物を除去するためのいくつかの遠心分離機を通り、次に真空フィルター、145℃での空気の向流を併うプレリミナリーコンベヤードライヤーを通り、次に 145℃のサイクロン分離機を併う一連のブロワーを通って進む。これにより、本発明の更なる態様は、開示されるように本発明により植物又は植物細胞から得られる又はそれから得ることができるデンプン又はアミロペクチンを提供する。植物から除去されたデンプン又はアミロペクチンは、精製し、組成物に調剤することができる。このようなデンプン又はアミロペクチンを含む組成物は、１又は複数の、即ち少くとも１の付加物構成物を含み得る。このような組成物は、食物製剤、工業製剤等を含む。デンプン及びデンプンを含む組成物の使用は先に議論されている。 “マルト−オリゴサッカライド”は、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースのような本明細書で実験的に研究されたモノ−及びオリゴマーの各々の含む、デンプン粒子内でポリマーの一部を形成するよりむしろ細胞内で可溶性であるα−１，４又はα−１，４，α１，６のグルカンのいずれかを個々に又は集合的に含む。マルト−オリゴサッカライド“成分”への言及は組成（質）及び／又はレベル（量）に対してである。 “調節する”及び“変える”のような用語はヒトの介入の結果として何らかの制御が行われることに関して用いられる。細胞内のMOS のレベルに関して、その介入は、その介入のないレベルと比較して、即ち例えば同じ種の植物の、等価の野生型細胞と比較して、MOS のレベルを増加又は減少させることができる。（MO S レベルに関して野生型である細胞は、もちろん全ての点において野生型であり得ない。）削減又は涸渇により細胞中のMOS のレベルを調節するかわりに、GBSSＩの作用をアミロペクチンからアミロースに向かわせるために、そのレベルを増加させることができる。発達中の保存器官のアミロプラスト内のMOS の濃度を増加させるいずれのメカニズムも、GBSSＩ活性のためのプライマーの利用性又はデンプン粒子内のアミロペクチンに関するアミロースのためのGBSSＩのアフィニティーを増加させる。これは、デンプン内のアミロペクチンに対するアミロースの比率を増加させ、アミロース分子の大きさ及び／又は構造にも影響を与え得る。MOS の濃度の増加は、MOS を発生させることができるいずれかの酵素のアミロプラスト内への導入によって引きおこすことができる。これらのグルカンは、発達中のデンプン保存器官中に存在することが知られているいくつかの酵素、即ちβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、不均化酵素、枝切り酵素及びデンプンホスホリラーゼにより生体内で形成され得る。グルカンは、枝切り酵素、デンプンホスホリラーゼ及びバクテリアのアミロスクラーゼを含む他の酵素によっても形成することができる。これらの酵素のうち最初の４つは、デンプンシンターゼ及びデンプン枝つくり酵素によって合成された新生グルカン鎖の開裂又は再配置によってグルカンを形成することができる。デンプンホスホリラーゼは、グルコース１−リン酸からグルカンを形成することができる（Steu p 1988，1990 ; Takaha ら、1993）。本発明のこの態様に用いるための典型的に好ましい酵素は、完全なデンプン粒子に対して低い又はごくわずかな活性を有し、デンプンホスホリラーゼ又はβ− アミラーゼであり得る。明らかに、全ての細胞質内でおこり得るpHの範囲内(典型的には 6.5〜7.8)の至適pHが好ましい。これらの酵素の活性の同定及びキャラクタリゼーションのための方法は、Steup(1990)により広範囲に議論される。ホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、不均化酵素及び枝切り酵素のプラスチドのイソフォームのための遺伝子がクローン化されている（Nakanoら、 1989，Lin ら、1991，Sonnewald ら、1995，Yoshida ら、1992，Siggens 1987， Monroeら、1991，Kreissら、1987，Takahaら、1993，Jamesら、1995）。これらの酵素のDNA配列は、上述の引用文献及びデータベースに記載されており、例えばα−グルコシダーゼについて上述される方法を用いて、これら及び更なる酵素をコードする遺伝子をクローンするのに用いることができる。保存器官のアミロプラスト内の活性は、議論されるように、植物形質転換のいずれかの適切な方法によって、これらの遺伝子の１つの導入によって増加させることができる。例えば、これは、amf 座に変異を有するポテト塊茎のアミロプラストへのamf 遺伝子産物の成功した導入についてvan der Leijら（1991）により用いられるアグロバクテリウム−リゾゲネス（Agrobacterium-rhizogenes）に基づく方法によって行うことができる。形質転換に用いられる遺伝子は、好ましくは、同時抑制の潜在的な問題を避けるために、形質転換されたものから異なる種からのものであるべきである。α−アミラーゼのための遺伝子は植物及びバクテリアからクローンされている（例えばYoshida ら1992，Siggens 1987，Monroeら1991，Kreiss ら、1987）ので、この活性は、植物形質転換のいずれかの適切な方法においてこれらの遺伝子のいずれかの使用を通して保存器官のアミロプラストに導入され得る。これらの遺伝子の産物は、典型的には、植物のプラスチド以外のかつバクテリアの細胞の外側の細胞区画に方向づけられる。それゆえ、アミロプラストへの β−アミラーゼ活性の導入のための適切な構成物の調製は、有利には、触媒活性を有するが標的配列を欠くタンパク質の一部分の選択を含む。タンパク質の構造 −機能関連についての情報は、当業者がタンパク質の上述の領域を選択するのを可能にする（例えばJanacek 1994，Kawazuら、1987）。アミロプラスト内でのβ −アミラーゼの発現のための適切なプラスミドの作製及び導入は、例えばα−グルコシダーゼについて先に議論されるように、当該技術で利用できるいずれかの適切な技術を用いて行うことができる。これにより、本発明は、MOS レベルを減少させることに関して先に開示及び議論されるものと同様の種々の観点において、植物細胞中のMOS のレベルを増加させることに関する。細胞もしくは組織抽出物内のグルカン合成酵素又は精製されたデンプン粒子内の酵素の活性は、ADPGからのグルコシル成分をα−１，４結合によりグルカンに組み込む酵素、抽出物又は粒子の能力によって同定することができる。好ましいアッセイの方法は、Jennerら（1994）により記載される。細胞の粒子結合デンプンシンターゼ活性の活性又は性質の改変は、細胞内のMO S 成分の変換によりもたらされるデンプン構造において変化の程度又は性質を変えるのに用いることができる。多くの植物種からのGBSSＩをコードする遺伝子をクローンした（Ainsnorth ら、1993を参照のこと）。そして配列が利用できる。例えば上述されるような、適切な方法を用いて、いずれかの適切な種からGBSSＩ遺伝子をクローンするために、DNA 配列は当業用により用いられ得る。これらの配列は、再び上述されるように、いずれかの適切な形質転換技術により、粒子結合デンプンシンターゼ活性の性質を増加もしくは減少させ又はそれを変えるような方法において植物内に導入することができる。内在性酵素をコードする遺伝子の導入により、増加をもたらすことができる。アンチセンス方向における内在性酵素をコードする遺伝子の導入を通して減少をもたらすことができる。酵素の性質の変更は、GBSSＩ又は他の種からの同様のタンパク質をコードする遺伝子、又はそれがコードするGBSSＩの特性が改変されているような変異にかけられている遺伝子の導入によってもらたすことができる。改変されたGBSSＩ又は他の種からのGBSSＩは、その内在性GBSSＩに加えて導入されたタンパク質が合成されるように野生型植物内に導入することができ、又はそれは、内在性GBSSＩ活性がアンチセンスRNA の発現の変異により減少され又は除去されている細胞内に導入することができる。本発明は、実験結果及び添付の図面を引用して詳細に説明され、そして例示されるであろう。本発明の更なる態様及び実施形態、並びに本明細書に開示されるものの改良は、当業者に明らかであろう。図：図１ａ：Sepharose CL−２Ｂのカラムからの可溶化エンドウデンプンの溶出。 ■＝ヨウ素と混合した画分の 595nmの吸光度。□＝ヨウ素と混合した画分の最大吸光度の波長図１ｂ：エンドウ胚からの単離したデンプン粒子の、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースとのインキュベーションのメタノール／KCl 不溶性産物を充填したSepharos e CL−２Ｂのカラムからの¹⁴Ｃの溶出。■＝１時間のインキュベーション。□＝０時間のインキュベーション（対照）。dps：秒当りの壊変図２：Sepharose CL−２Ｂのカラムからの¹⁴Ｃの溶出プロフィールへのイソアミラーゼの枝切りの効果。エンドウ胚からの単離したデンプン粒子の２つのサンプルを１時間、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕とインキュベートした。次にメタノール／KCl 不溶性産物をイソアミラーゼと共にインキュベートする（□）か、又は更なる処理を行わなかった（■）。図３：野生型胚（■）及びlam 変異体胚（□）からのデンプンの、ADP〔Ｕ−¹ ⁴ Ｃ〕グルコースとの１時間のインキュベーションの後のメタノール／KCl 不溶性産物への¹⁴Ｃの組み込みの比較。図４：野生型及びlam 変異体エンドウ胚の粒子結合タンパク質の比較。デンプン粒子をSDS 含有サンプル緩衝液中で煮沸して遠心し、そしてその上清をSmith(1990)によって記載されるように SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。トラック１及び８＝分子量マーカー（KDa で示した大きさ）。トラック２−４＝野生型エンドウの３つの異なるさやからの胚からのデンプン。トラック５−７＝lam 変異体エンドウの３つの異なるさやからの胚からのデンプン。トラック２−７は全て同量のデンプンからのタンパク質を含む。図５：デンプン粒子による ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへの植物抽出物からの熱安定性可溶性化合物の効果。新しく収集したエンドウ胚 (250〜350mg)を 100mM Mops（pH7.2），５mM MgCl₂，50ml・ｌ^-1グリセロール、２ mM DTT，１ｇ・ｌ^-1ウシ血清アルブミン中で乳鉢内でホモジネートした。そのホモジネートを、直接（非洗浄のデンプン粒子）で用いるか、又はそのホモジネートの１mlアリコートを５分間、10000ｇで遠心して可溶性材料を含む上清及びデンプン粒子を含むペレットを供した。その上清を除去して、そのペレットをホモジニゼーション媒体中に再度懸濁することにより３回洗い、次に５分間、10 000ｇで遠心し、そして次にホモジニゼーション媒体中に再度懸濁して１mlの最終容量を供した。洗浄した（■）及び洗浄しなかった（□）デンプン粒子のサンプルを、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースと共に１時間、インキュベートし、そのメタノール／KCl 不溶性産物をSepharose CL−２Ｂクロマトグラフィーにかけた。図６：アミロース合成への可溶性抽出物の刺激効果へのα−グルコシダーゼ処理の効果。単離したデンプン粒子並びに処理した及び処理していない上清画分は表２に記載されるものであった。Mops媒体（■）、処理した上清（○）及び処理していない上清（□）に懸濁した粒子のアッセイの産物をSepharose CL−２Ｂでのクロマトグラフィーにかけた。図７：野生型エンドウ胚からのデンプン粒子によるメタノール／KCl 不溶性産物への ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへのマルト−オリゴサッカライドの効果。100mMマルトース（□）、100mMマルトトリオース（○）及び 100mMのマルトヘキサオース（×）を含むもの並びに添加物を含まないもの（■ ）のインキュベーションを１時間、行った。図８：野生型エンドウ胚（□＝マルトトリオースを含むもの、■＝マルトトリオースを含まないもの）及びlam 変異体エンドウ胚（○＝マルトトリオースを含むもの、●＝マルトトリオースを含まないもの）からのデンプン粒子による ADP 〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへのマルトトリオースの効果の比較。図９：発達中のポテト塊茎からのデンプン粒子によるメタノール／KCl 不溶性産物への ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへのマルト−オリゴサッカライドの効果。インキュベーションは、100mMマルトトリオースを含むもの（□）又は添加物を含まないもの（■）で１時間、行った。図10：Sepharose CL−４Ｂのカラムからの枝切りされた¹⁴Ｃ−標識デンプンの溶出。ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースと共に１時間、インキュベートしたエンドウ粒子及びデンプン粒子からの単離したデンプン粒子のサンプルを、カラムに充填する前にイソアミラーゼとインキュベートした。ヨウ素と混合した画分の 595nm の吸光度としての非標識サンプルの溶出（■）；及び ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースとインキュベートしたサンプルからの¹⁴Ｃ−標識したメタノール／KCl 不溶性産物の溶出（□）。図11：アミロース合成へのポテト塊茎の不溶性抽出物の刺激性の影響へのα−グルコシダーゼでのプレ処理の効果。発達中の塊茎の５ｇサンプルを調製した。発達中の塊茎の２つの重複５ｇサンプルを調製した。実験手順に記載されるようにデンプン粒子の単離のために１つを用いた。他方は 0.5ｇのポリビニルポリピロリドンを含む全部で10mlの50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)中に乳鉢内に抽出した。遠心した後、その上清（可溶性抽出物）を５分間、煮沸し、次にサンプルを35℃で18時間、1.25unit・ml^-1のα−グルコシダーゼ（イースト）と共に又はそれなしでインキュベートした。再び煮沸した後、全てのサンプルをpH ７にした。そのデンプン粒子を媒体Ａ（■）、α−グルコシダーゼ処理可溶性抽出物（○）又は非処理可溶性抽出物（□）中に25mg・ml^-1で再度懸濁し、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースと共に１時間、インキュベートした。メタノール／KCl − 不溶性産物をSepharose CL−２Ｂでクロマトグラフィーにかけた。図12：野生型及びlam 変異体エンドウ胚からのデンプン粒子による ADP〔Ｕ−¹⁴ Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへのマルトトリオースの効果の比較。野生型：□、100mMマルトトリオースを含むもの；■、マルトトリオースを含まないもの；lam 変異体：○，100mMマルトトリオースを含むもの；●、マルトトリオースを含まないもの。図13：発達中のポテト塊茎からのデンプン粒子によるメタノール／KCl 不溶性産物への ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みへのマルト−オリゴサッカライドの効果。インキュベーションは、100mMのマルトトリオースを含んだもの（□）又は添加物のないもの（■）である。本明細書に言及される全ての文献は引用により組み込まれている。材料及び方法植物材料エンドウは、円種系（round-seeded line）(ピスム・サチブム（Pisum sativu m ）L.，BCl/12 RR：この係の誘導についてはSmith 1990を参照のこと)又はその円種系由来の低アミロース(lam)変異体系（SIM503）（Denyerら、1995ａ）のものであった。両方を、Dr．Cliff Hedley及びDr．Trevor Wang，John Innes Cent re，Norwichから得た。植物をDenyerら（1995ａ）により記載されるように成長させた。ポテト（サラヌム・ツベロスム（Salanum tuberosum）L．cv Desiree）をEdwards ら（1995）により記載されるように成長させた。デンプンの調製デンプンを、Smith（1990）に本質的に従って発達中のエンドウ胚から調製した。新鮮な重量 200〜400mg の胚１〜３ｇを４℃で５〜15mlの100mM Tris-aceta te(pH７)，0.5Ｍ NaCl，１mMジチオトレイトール(DTT)、１mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）で乳鉢内でホモジナイズした。そのホモジネートを２つの層のMiracloth(Behring Diagnostics，La Jolla，CA，USA)に通してろ過し、その残留物を更に５〜15mlの抽出媒体でそのフィルタークロス中で洗った。その組み合わせたろ液を30分、４℃で撹拌し、次に10分、2000ｇで遠心にかけた。その上清及びそのペレットの表面からの緑色の材料を捨てて、そのペレットを10mlの抽出媒体中に再度懸濁した。この遠心及び再度懸濁する手順を抽出媒体で１回、そして50mM Tris-acetate（pH８），1mM DTT，１mM EDTA で３回、くり返した。そのペレットを、−20℃に冷やしたアセトン中に再度懸濁し、15分、沈降させ、そして次にその上清を捨てた。このアセトン洗浄を更に２回くり返し、その洗ったデンプンを室温で空気下で乾燥させた。そのデンプンを直ちに用いるか又は２ヶ月まで−20℃で保存した。抽出媒体が 50mM Tris-acetate（pH８），1mM DTT，１mM EDTA であり、４℃ での撹拌を省き、そして抽出媒体での洗浄の全回数を３〜４にした以外は、エンドウ胚について上述されるのと同質的に同様に発達中のポテト塊茎（各々10〜10 0 ｇの新鮮な重量）からデンプンを調製した。 ADP グルコースとの粒子のインキュベーションデンプン粒子を 100mMの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸(Mops，p H7.2)、５mM MgCl₂，50ml・ｌ^-1グリセロール、２mM DTT，１ｇ・ｌ^-1ウシ血清アルブミン中に40μｌ当り１mgで再度懸濁した。各々のインキュベーションは10 μｌのデンプン懸濁液及び90μｌの100mM Bicine（pH8.5），25mMの酢酸カリウム、10mMの DTT，５mMのEDTA，18.5 GBq・mol^-1の１mMのADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコース(Amersham International，Bucks，UK)を含んでおり、それを１時間、25℃ でインキュベートした。そのインキュベーションを、90℃で２分、加熱した後10 ｇ・ｌ^-1のKCl を含む750ml・ｌ^-1のメタノール水溶液(メタノール−KCl)３mlを加えるか、又はメタノール−KCl のみを加えるかのいずれかにより終えた。最少で５分の室温でのインキュベーションの後、その沈殿したデンプンを５分間、20 00ｇでの遠心により収集した。その上清を捨てて、そしてそのペレットを 0.3ml の蒸留水に再度懸濁した。このメタノール−KCl洗浄、遠心及び再度の懸濁を、最後の遠心の後に蒸留水を省き、そしてそのペレットを最少で10分、室温で空気中で乾燥させた以外は同様に更に２回、くり返した。その洗浄したデンプンペレットを１Ｍ NaOH 50μｌに溶かし、50μｌの蒸留水で希釈し、そしてゲルろ過クロマトグラフィーにかけた。イソアミラーゼ消化デンプン粒子をADP グルコースとインキュベートし、上述のメタノール−KCl で洗浄した。その乾燥したデンプンペレットを、4000ユニットのイソアミラーゼ（Sigma，Poole，Dorset，UK）を含む25μｌの50mM酢酸ナトリウム (pH3.5)に再度懸濁し、24時間、37℃でインキュベートした。次にデンプンを50 μｌの１Ｍ NaOH に溶かし、25μｌの蒸留水で希釈し、そしてゲルろ過クロマトグラフィーにかけた。 Sepharose CL−２Ｂでのゲルろ過のクロマトグラフィーサンプルは、20mg・ml^-1で１Ｍ NaCl に溶かしそして0.5ＭのNaOHに蒸留水で希釈した非標識デンプン又は上述のように調製した¹⁴Ｃ標識デンプンのいずれかであった。その溶けたデンプンの50μｌサンプルを、100mMのNaOHで平衡化したS epharose CL−２Ｂのカラム（0.5cm i.d.×30cm）に適用し、この溶液で溶出した（Denyerら、1995ａ）。0.15〜0.17mlの画分を分当り１画分の比率で収集した。非標識サンプルからの画分中のグルカンを、Denyerら（1995ａ）に記載されるように、ヨウ素とのそれらの反応によって検出した。標識グルカンを含むサンプルからの画分中の放射能を、画分当り１又は３mlのHiSafeII溶液シンチレーション流体(Beckman Ltd.，High Wycombe，Bucks，UK)を用いて、Wallac 1410 カウンター（Wallac UK，Milton Keynes，UK）での液体シンチレーション計数により測定した。 SDS−ポリアクリルアミドゲル Denyerら（1995）に記載される通りである。粒子結合デンプンシンターゼ活性のアッセイアッセイは、最終容量100μｌの、100mM Bicine(pH8.5)，25mM 酢酸カリウム、10mM DTT，５mM EDTA，2.3 GBq・mol^-1の１mM ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコース（A mersham International，Bucks，UK）及び10μｌのデンプン粒子の懸濁液を含んでいた。アッセイを、15 分、25℃でインキュベートし、次に２分間、90℃に加熱した。対照は、デンプン粒子をアッセイに加えた直後に90℃に加熱した。全てのアッセイ及び対照は重複して行った。デンプンをメタノール−KCl で沈殿させ、最終的ペレットを0.3μ ｌの蒸留水に溶かし次に３mlのHiSafeII液体シンチレーション流体に溶かした以外は上述の通り洗浄した（ADP グルコースとのデンプン粒子のインキュベーション）。液体シンチレーション計数により放射能を測定した。結果 GBSSの産物の同定エンドウ胚から単離したデンプン粒子のデンプンシンターゼ活性を、10ｇ・ｌ^-1 KClを含む 750ml・ｌ^-1メタノール(メタノール／KCl)に不溶性である材料への ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みとして測定した。この活性はA DP グルコースに特異的であり（１mMでUDP グルコースにほとんど活性がなく、その活性は同濃度でのADP のグルコースでの活性の３％未満であった）、その組み込みは少くとも１時間、時間に対して一次的であった。¹⁴Ｃ標識メタノール／ KCl 不溶性材料がアミログルコシダーゼとのインキュベーションの後に完全に溶けた（不図示）ことは、その反応の産物がグルカン（α−１，４，α−１，６結合）であったことを示す。基質の添加直後に終えた対照アッセイにおいては、グルカンへの¹⁴Ｃの組み込みは最小であった（１時間インキュベートしたアッセイのそれの３％未満）。エンドウデンプンのSepharose CL−２Ｂクロマトグラフィーは、アミロース及びアミロペクチン構成物を明確に分離させた（図１ａ）。アミロペクチンはグルカンの溶出の最初のピークであり、そしてアミロースは第２のピークである（De nyerら、1995ａ）。ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースとの単離したデンプン粒子のインキュベーションからのメタノール／KCl 不溶性産物をSepharose CL−２Ｂのカラムでのクロマトグラフィーにかけた場合、¹⁴Ｃはアミロペクチンピークにおいて支配的に溶出した（図１ｂ）。７回の実験において、そのカラムから溶出された全¹⁴Ｃの割合としてのアミロペクチンピークにおける¹⁴Ｃの平均回収率は78±12％（平均± SD）であった。これら及び次の実験においてカラムから溶出する画分中で回収された全¹⁴Ｃは、カラムに適用したそれの70〜100 ％であったので、カラム上の標識産物の大きな損失はなかった。アミロペクチンとの¹⁴Ｃ同時溶出がアミロペクチンにおいてであるか又は高分子量アミロース分子においてであるかを研究するために、その産物を、カラムへの適用の前に枝切りするためにイソアミラーゼで処理した。イソアミラーゼ処理した後、¹⁴Ｃがカラムからかなり遅く溶出したこと（図２）は、低い分子量であることを示す。イソアミラーゼのかわりの緩衝液での対照処理においては、¹⁴Ｃの溶出の位置はかわらなかった（データは示さない）。これらの結果は、直鎖ポリマーよりむしろアミロペクチン分子の枝へのGBSSによる¹⁴Ｃグルコースの組み込みと一貫している。これらの実験に用いたデンプン粒子を、水性媒体中で、次に冷やしたアセトン中で数回、発達中のエンドウ胚の不溶性抽出物を洗浄することによって調製し、次に空気中で乾燥して、アッセイする前２ヶ月まで、−20℃で保存した。これらの調製物又は保存方法がGBSSによって作られた産物の型に影響を与えるか否かを決定するために、次のかわりの方法によって調製した粒子をアッセイした：１） −20℃で保存されていない新しく調製した粒子及び２）水性媒体で洗ったが、アセトンで洗わなかったか又は空気乾燥した新しく調製した粒子、上述の実験の両方において、¹⁴Ｃの溶出プロファイルは図１ｂに示すものと本質的に同じであり；その組み込みはアミロペクチンに極めて大きかった。 Hyltonら（1995）は、オオムギ胚乳からの機械的に損傷したデンプン粒子は完全な粒子より高いGBSS活性を有すること、及び活性の増加のほとんどがGBSSＩ以外のイソフォームのためであることを見い出した。この結果の見地において、我々は、我々の実験においてグルコースの組み込みのパターンが粒子への損傷によって影響を受けるか否かを研究した。乳鉢内で粉砕することによるよりむしろかみそり刃で、発達中のエンドウ胚を抽出媒体内に切り刻むことにより、最小の機械的損傷で粒子を調製した。切り刻んだエンドウ胚から調製された粒子の（デンプン１mg当りの）活性は、粉砕によって調製した粒子のそれのほぼ半分であった。しかしながら、合成した産物の性質に変化はなかった（示さない）。ポリマーへの¹⁴Ｃの組み込みのパターンに変化はなく；粉砕よりむしろ切り刻むことにより調製した粒子における組み込みのほとんどはアミロペクチン内へのものであった（示さない）。 ¹⁴Ｃ標識アミロペクチン鎖の大きさの分析 ¹⁴Ｃが組み込まれるアミロペクチン鎖の平均の長さを研究するために、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕とのエンドウデンプン粒子のインキュベーションの生成物をイソアミラーゼで枝切りし、Sepharose CL−４Ｂのカラムまでのクロマトグラフィーにかけた。図10に示す実験にかいてカラムから溶出するグルカンの最初のピークは完全に枝切りされていないアミロペクチンからなっていた。カラムからより遅く溶出するグルカンは、枝切りされたアミロペクチンの鎖からなっていた。¹⁴Ｃ標識及び非標識アミロペクチン鎖の溶出プロファィルの比較は、前者のピークが後者より早く溶出したことを示した。これは、インキュベーションの間、デンプンシンターゼにより延長された鎖がアミロペクチン分子における平均鎖よりかなり長かったことを示唆する。野生型及びlam 変異体胚からのデンプンの比較観察されたアミロペクチンの延長がGBSSＩ，GBSSII又はこれらイソフォームの両方の活性のためであるか否かを研究するために、我々は、野生型及びlam 変異体エンドウ胚からの、ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃ−グルコースのデンプンへの組み込みを比較した。lam 変異体からのデンプン粒子はGBSSＩを欠くので、これらの粒子への組み込みはGBSSII単独にならなければならない。lam 変異体胚からの粒子への組み込みは、全体的に、アミロペクチン画分内へであった（図３）。これは、エンドウ胚のGBSSIIは、その粒子内のアミロペクチン枝を延長することができることを示す。先に報告されるように、lam 変異体胚の粒子への¹⁴Ｃグルコースの全組み込みは、デンプンに基づいて野生型胚の粒子より低かった（Denyerら、1995ａ）。この組み込みの減少は単にGBSSＩの欠如のためであるのか否か、又はその変異がGB SSIIの量の減少をも引きおこすのか否かを研究するために、両方のデンプンからの粒子結合タンパク質を抽出し、SDS−ポリアクリルアミドゲルで比較した（図４）。デンプン１mg当りのGBSSIIの量は野生型及び変異体で同じであった。GBSS の活性がデンプン間の構造の差により大きく影響を受けないと仮定すると、これは、ADP グルコースからのグルコースをアミロペクチンに組み込む能力における野生型及びlam 胚のデンプン間の差がGBSSＩの活性に帰することを示唆する。 GBSSの産物への保存器官の可溶性画分の効果上述の実験は、単離したデンプン粒子中のGBSSＩがADP グルコースからのグルコースをアミロース分子よりむしろアミロペクチンにかなり転移させることを示す。このイソフォームは生体内でアミロースの合成の原因であるので、生体内に存在するが単離されたデンプン粒子中には存在しないいくつかの因子がアミロース合成のために要求され得る。アミロース合成のために要求される可溶性因子がそれらの調製の間にデンプン粒子から洗い落とされているか否かを研究するために、我々は、（可溶性及び不溶性画分の両方を含む）発達中のエンドウ胚の粗ホモジネートによるADP〔Ｕ −¹⁴Ｃ〕グルコースからの組み込みのメタノール／KCl 不溶性産物を比較し、そのホモジネート由来のデンプン粒子を洗った（図５）。粗ホモジネートは、アミロースへのはっきりとしたより大きな組み込みのため、洗浄したデンプン粒子より高い全体の組み込みを供した。粗抽出物の遠心により得られる可溶性画分を洗浄したデンプン粒子にもどして加えた時、アミロースへの組み込みの刺激が、粗ホモジネート中のアミロース同成と同様に観察された。この添加の前にその可溶性抽出物を煮沸することは、アミロース合成を刺激する能力に影響を与えず、このことは刺激因子が熱安定性であることを示し、そして可溶性酵素が要求されないことを示唆する（示さない）。我々は、発達中のポテト塊茎が、GBSSの活性を刺激することができる可溶性因子も含むか否かを研究した。塊茎の粗ホモジネートのGBSS活性は、同じホモジネートからの洗浄したデンプン粒子中の活性よりかなり大きい。エンドウ胚でと同様に、煮沸した可溶性抽出物の、洗浄したデンプン粒子への添加はGBSS活性を刺激し（表１）、アミロースの合成を促進する（図11）。全体として、これらの実験は、エンドウ胚及びポテト塊茎の可溶性抽出液がその粒子中にアミロース合成を刺激する非酵素的因子を含むことを示唆する。Lelo irら（1961）は、GBSS活性がマルトース、マルトトリオース又はマルトテトラオースの存在によって刺激されることを見い出し、ファセオルス・ブルガリス（Ph aseolus vulgaris ）から単離された粒子においてGBSSのための基質として機能し得ることを示唆する証拠を供した。Leloirらの研究は、我々のデンプン粒子の調製物中でいずれかの大きな程度までも存在しない活性であるUDP グルコースからのグルコースの転移に関するが、我々の可溶性抽出物中の刺激因子はアミロース合成のためのプライマーとして機能するマルト−オリゴサッカライドである可能性が高いようである。これを研究するために、ポテト塊茎の煮沸した可溶性抽出物をα−グルコシダーゼ（マルトース）で処理してマルト−オリゴサッカライドを除去した。この処理は、単離されたデンプン粒子のGBSS活性を刺激し、そして¹⁴ Ｃのアミロースへの組み込みを促進するその抽出物の能力を除去した（表２、図６）。３つの別個の実験において、媒体Ａ中に再度懸濁したデンプン粒子の活性に対する粒子結合デンプンシンターゼ活性は非処理可溶性抽出液中に再度懸濁したデンプン粒子について154.3％±16.5％（平均±SD）であり、α−グルコシダーゼ処理可溶性抽出液中に再度懸濁したデンプン粒子について109.8％± 8.9％（平均±SD）であった。これらの実験の１つの分析からの結果を表11に示す。全体として、これらの実験は、エンドウ胚及びポテト塊茎の可溶性抽出物はデンプン粒子内でアミロース合成を刺激することができるマルト−オリゴサッカライドを含むことを示唆する。それゆえ我々は、精製したマルト−オリゴサッカライドが、単離された粒子によるアミロース合成を促進することができるか否かを研究した。その結果を以下に示す。 GBSS活性へのマルト−オリゴサッカライドの効果エンドウ胚からの単離したデンプン粒子に供した場合、マルトースからマルトヘキサオースまでの範囲の小さなマルト−オリゴサッカライドは、アミロースと同じ位置に又はそれより少し後にSepharose CL−２Ｂから溶出する材料への、AD P〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃ−グルコースの組み込みを刺激した。アミロペクチンへの組み込みは減少し（図７）そしてアミロースト同じ位置又はアミロースより少し後の位置に Sepharose CL−２Ｂカラムから溶出する材料への組み込みはかなり刺激された。マルトヘプタオース及び４〜10のグルコース単位とのマルト−オリゴサッカライドの混合物は、同様の効果を有した（データは示さない）。マルトースでは、その効果は10mMの濃度で明らかであり、100mMで十分に飽和した。100mMのグルコースも 100mMのセルビオースも組み込みにいずれの効果もなかったことは、その刺激効果がマルトオリゴサッカライドに特異的であることを示した（データ示さない）。マルト−オリゴサッカライドの存在下でのアミロースの合成がGBSSＩ，GBSSII 又はその両方の活性のためであるか否かを決定するために、野生型及びlam 変異体胚からの粒子によりマルトトリオースの存在下で形成された産物を比較した（図８及び図１２）。マルトトリオースはlam 変異体胚からのデンプン粒子により合成される産物に効果を有さず、このことは、GBSSII単独ではマルト−オリゴサッカライドの存在下でアミロースを合成することができないことを示す。それゆえ、マルト−オリゴサッカライドの存在下で野生型粒子において観察されたアミロース合成は、GBSSＩの活性のためであるようである。ポテト塊茎からのデンプンのGBSS活性へのマルト−オリゴサッカライドの効果我々は、エンドウデンプンへのマルト−オリゴサッカライドの効果を、発達中のポテト塊茎から単離されたデンプンへの効果と比較した。Sepharose CL−２Ｂカラムは、エンドウデンプンからよりポテトデンプンからアミロース及びアミロペクチンを分離することにおいて有効でなかった（示さない）が、マルトトリオースの欠如下で ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃの組み込みがアミロペクチンピーク内で大きいことが明らかであった。図13を参照のこと。マルトトリオースの存在下で、アミロペクチンへの組み込みは劇的に削減され、アミロースへの組み込みは増加した（図９）。これらの結果はエンドウデンプンで得られた結果と同様であり、ポテトデンプンのGBSSＩがマルトトリオースの欠如下でアミロペクチンを延長し、マルトトリオースの存在下でアミロースを合成するという考えで一貫していた。議論我々の結果は、発達中のエンドウ胚のGBSSＩ及びGBSSIIの両方がデンプン粒子内でグルカンを延長することを示す。GBSSＩは、アミロペクチンの枝を延長し、マルトース及びグルコースのより高いオリゴマーを延長することができる。GBSS IIは、アミロペクチンを延長することができるが、明らかにマルト−オリゴサッカライドを延長することができない。これにより、GBSSＩのみがアミロースの合成を開始することができる。我々は、我々の本研究から、GBSSIIは、いったんこれらの分子が特定の大きさに達したなら、アミロースの延長に寄与することができるという可能性を除外することができない。本明細書に記載される発達中のエンドウ胚のGBSSＩの特性は、全般的にこのクラスのデンプンシンターゼの特性を示すはずである。Babaら（1987）は、サツマイモ塊茎から単離された粒子が ADP〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕グルコースからの¹⁴Ｃを主にアミロペクチンに組み込むことを示した。これらの実験においてマルト−オリゴサッカライドは供されなかった。Leloirら（1961）は、マルト−オリゴサッカライドは発達中のマメからの粒子におけるデンプン合成のためのプライマーとして機能し得ることを示した。我々は、ポテト塊茎及びエンドウ胚からの単離された粒子内でアミロース合成を刺激するためにマルト−オリゴサッカライドが要求されることを示した。多くのデンプン保存器官からのデンプンはエンドウのGBSSIIに大きさ、抗原特性及び／又は配列において極めて類似したGBSSを有する。GBSSIIクラスの全てのメンバーの特性は同様であるようであり、従って、エンドウ以外のデンプンの粒子内のこれらのイソフォームによるアミロペクチンの延長もおこり得る。しかしながら、GBSSＩ以外のGBSSの型及び数には異なるソースからのデンプンの間でバリエーションがある（Smithら、1995）。現在、我々は、その粒子内でアミロペクチンを延長するGBSSＩ及びGBSSII以外のGBSSの能力に関する情報は有していない。異なるソースからのデンプンは、GBSSＩ以外のGBSSが全GBSS活性に寄与する程度においても種々である。例えば、GBSSIIの活性はポテト塊茎中のGBSSＩの活性と比べて極めて低い（Edwardら、1995）。これは、エンドウデンプン中よりかなり低いポテトデンプン中のマルトトリオースの存在下でのアミロペクチンへの組み込みを説明することができる（図８及び９）。これにより、その粒子内でのアミロペクチン合成へのGBSSの寄与は、これらの酵素のその全活性及び特性の両方が種々であり得るので、デンプン間で異なり得る。単離した粒子において、GBSSＩの全体の活性及びその産物の性質にマルト−オリゴサッカライドのアベイラビリティーによる。我々は、α−グルコシダーゼによるデグラデーションに感受性がありそして単離された粒子中でアミロース合成を刺激する化合物のエンドウ及びポテトの粗抽出物中での存在を証明した。これらのマルト−オリゴサッカライドはデンプン分解酵素の作用により生体内で生産され得る。このような分解酵素がデンプン合成の間に存在し、そしてこれらのいくつかが色素体のものであることを示すことが長い間、知られている。我々の結果は、分解酵素の１つの役割はアミロース合成のためのプライマーを作り出すことであり得ることを示唆する。発達中のポテト塊茎の粗抽出物の画分中のGBSS活性発達中の塊茎のサンプルをホモジネートし、（デンプン粒子を含む）ペレットを洗浄し、そして（可溶性材料を含む）上清画分をエンドウ胚について図５に記載されるように調製した。デンプンシンターゼ活性をホモジネート及び上清においてアッセイし、後者を前者から差し引いて、ホモジネート中のGBSS活性を供した。その洗浄したペレットの半分を 1.5ml抽出媒体に再度懸濁し、1.5mlの煮沸した上清も同様にして、両方のサンプルをデンプンシンターゼ活性についてアッセイした。煮沸した上清は検出できるデンプンシンターゼ活性を含まなかった。これらの実験において、アミロペクチン（ポテト；Sigma，Poole，Dorset，UK）が５mg・ml^-1でそのアッセイにおいて含まれていた。値は２つの別個に抽出した塊茎からのサンプルについてである。発達中のポテト塊茎の粗抽出物によるGBSS活性の刺激へのα−グルコシダーゼ処理の効果発達中の塊茎の各々５ｇの２つの重複サンプルを調製した。１つは材料及び方法に記載されるようにアセトン洗浄したデンプン粒子の単離のために用いた。他方は全部で10mlの50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）中で乳鉢中で 0.5ｇのポリビニルポリピロリドンで抽出した。遠心した後、その上清を５分間、煮沸して、次にサンプルを、35℃で、1.25unit・ml^-1のα−グルコシダーゼ（イースト）と共に、又はそれなしで一晩、インキュベートした。再び煮沸した後、全ての上清サンプルをpH７にし、アッセイのための（他の塊茎のサンプルから調製した）デンプン粒子を再度懸濁するのに用いた。緩衝液＝材料及び方法に記載されるようなMo ps媒体中に再度懸濁したデンプン、非処理上清＝α−グルコシダーゼなしでインキュベートした上清、処理上清＝α−グルコシダーゼとインキュベートした上清。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Modified plants and plant products The present invention relates to the modification of plants, in particular the properties of starch α-glucan produced by plants. Manipulation of the activity of α-glucan synthase, a plant enzyme “GBSSI”, to alter the quality Regarding modification by work. GBSSI activity was measured by amylose (some α Unbranched α-1,4 glucans with or without -1,6 bonds) To control the malto-oligosaccharide component that has been found necessary for It is adjusted by controlling. Malto-oligosaccharide to GBSSI If availability is reduced, the enzyme may be replaced with amylopectin (amylose) instead of amylose. Branches α-1,4, α-1,6 glucan). Starch from preserved organs such as cereal pits, potato tubers and pea embryos The particles comprise two or more isoforms of starch synthase. All of them Particle-bound starch synthase I (GBSSI) Highly conserved exclusively of about 60 KDa will be referred to as exclusively bound particles Isoforms-usually major particle binding proteins, and one or more other isoforms Have a system. Analysis of mutants lacking GBSSI indicates that this isoform Amylo, a relatively unbranched glucan polymer containing about 30% by weight of government starch (Smith and Martin 1993 ). This results in (also known as "waxy protein") ) It has been accepted that GBSSI is responsible for the synthesis of the amylose constituents of starch. (Smith and Martin 1993, Smith et al., 1995, Martin and Smit h 1995)). GBSS functions other than the GBSSI class have not been established. These other isophores Is unable to synthesize amylose to any significant degree in GBSS It is evident from studies of starch in mutants lacking I (see, eg, Denyer et al., 1995a, Hylton et al., 1995). However, these isoforms may cause amylo in the particles. It is not known whether it contributes to the synthesis of pectin. Development (called GBSSII) Some GBSS other than GBSSI such as 77KDa GBSS in pea embryos It is found in the soluble fraction of the strike and is associated with starch particles (Denyer Et al., 1993). If such isoforms are possible, amylopectin synthesis Seems to be very relevant to the Can be Other GBSS, such as 100-105 KDa GBSS for developing wheat endosperm Dominant if not totally associated with the particle (Denyer et al., 1995b) . This suggests that other GBSSs are now involved in amylose synthesis. There is no basis (Hylton et al., 1995, Denyer et al., 1995a). Amylose synthesis is waxy It may be an exclusive property of the protein. Despite this widely accepted hypothesis, starch isolated from higher plants Nobody has demonstrated amylose synthesis by microparticles. ADP glucose (ADPG) Their glucose is preserved when ADPG is replenished to the isolated starch particles. It has been established that it is readily incorporated into organ starch (eg, Frydman and And Cardini 1967, Macdonald and Preiss 1983, Smith 1990, Hylton et al., 1995, Denyer et al., 1995b). However, this integration is within amylopectin, Not amylose (Baba et al., 1987). The present invention relates to starch particles that are present in vivo but are clearly isolated A low molecular weight glucan (malt-oligosaccharide; called MOS) that is not within Based on the surprising discovery that it is required for amylose synthesis by BSSI . Increase amylopectin but not amylose without maltooligosaccharides . The evidence for this is described in detail herein, but in summary, 1. Isolated starch granules from developing pea embryos and developing potato tubers The offspring incorporate glucose into the α-glucan chain, which is mainly branched from ADPG. extremely Less glucose is incorporated into the amylose. 2. Both GBSSI and other GBSS isoforms contribute to this amylopectin synthesis I do. A second GBSS isoform completely lacking GBSSI protein and amylose Starch particles isolated from the developing embryo of a mutant pea carryinglam Mutant : Denyer et al. 1995a) incorporated glucose from ADPG into amylopectin. It has a much lower ratio based on starch than starch from wild-type peas. Was. This is because amylope by isolated starch particles from wild-type pea embryos This shows that a significant proportion of the cutin synthesis is due to GBSSI. 3. Addition of MOS to isolated starch particles of wild-type pea embryos and potato tubers Addition will cause a substantial shift in the amount of glucose from ADPG and its pattern of incorporation. increase. Amylopectin incorporation is reduced, and The incorporation of the same mobility as mirose into low molecular weight materials is substantially increased. Mart MOS in the range from source (G2) to maltoheptaose (G7) subtract this shift. It was shown to cause offense. Glucose does not have this effect. 4. Synthesis of amylose from ADPG in the presence of MOS is exclusively This is the function of GBSSI. MOS is a lam mutant lacking GBSSI of glucose from ADPG Has no effect on incorporation into isolated starch particles; incorporation involves MOS Whether in amylopectin or not. 5. The extract of the preserved organs of the higher plants is the isolated dengue of glucose from ADPG. Includes compounds that mimic the effect of MOS on incorporation into pun particles. ADPG pea Or, if fed to a potato homogenate, the glucose in the homogenate It is incorporated into both amylopectin and amylose in the particles. Homogenate A rapid wash of the homogenate to remove soluble constituents can be achieved by Decrease the overall rate of incorporation of Lucose and reduce the loss of incorporation into amylose Wake up. Addition of the thermostable soluble fraction of the homogenate to the isolated particles Addition promotes the incorporation of glucose from ADPG and, like the addition of MOS, amylope Causes a shift from Kuching towards amylose synthesis. 6. The compound in plant extracts that mimics the effects of MOS is MOS itself. MOS Potato with α-glucosidase, an enzyme that will be specifically converted to Lucose Incubation of the thermostable soluble fraction of the tuber homogenate indicates that this fraction Stimulates the incorporation of glucose from ADPG into isolated starch particles, and Destroys the ability to redirect synthesis from amylose to amylopectin. These results indicate that the presence of MOS in amyloplasts in vivo is Indispensable for the synthesis of loin and GBSSI activity in the absence of MOS Indicates redirection from amylose to amylopectin. Therefore, the book The invention is a planter (plantaMOS-level manipulations within) are produced by the plant For manipulating starch, particularly for manipulating the properties of the amylopectin constituents of starch Understood to provide the means. The work involved and applications are multiplied. Amylop, a conserved organ in plants Manipulation of the level of MOS in the last was amylose synthesis and amylopecti Will affect the action of GBSSI on the chain of amino acids. Therefore, made by the plant The properties of the issued starch will be modified. Improve the starch and create new properties And there is considerable interest in studying it. Starch, food, paper, oil Of interest in many industries, including glue, tobacco and textiles. You. For example, improved starch can be used in beer, animal food, baking products, e.g. For example, biscuits, donuts, pies, potato chips, kanzame food, for example Soups, fruits and vegetables, cereals, spices, such as ketchup, fats and oils, For example, margarine, dry food, syrups and sweeteners, and many other foods. Building materials such as cardboard, ceramic, fiberboard and fiberglass, paints, and many chemicals Products and methods include crayons and chalk, cords, strings, metallurgy, explosives, rubber, Used for textiles, dyes and tobacco. Potato starch is used in the paper industry For sizing and surface coating, cotton, worsted yarn and spun rayon wrap, And it is used for finishing sewing and clothing in the textile industry. “Waxy corn is a common corn starch Compared to 72% amylopectin and 28% amylose (unbranched α-glucan) It is physically composed of amylopectin (branched α-glucan). Armpit Several alleles have been observed at the Si locus. For example, the discussion "CORN-Improvement, Seed Production and Uses", Jugenheimer (1976) See John Wiley & Sons, USA. Agricultural University of Wageningen and Vi of CPRO Institute A group of sser et al. developed waxy-tamper to produce waxy-starch potatoes. Antisense technology targeting cytoplasmic expression was used. This research was conducted by the paper industry. A delegated and interesting further theory on starch modification and its significance Provide light. According to a first aspect of the present invention, a maltooligosaccharide present in a plant cell is provided. A method comprising adjusting the amount of MOS (MOS). In particular, the preservative organs of plants I'm interested in Loplast. Change the level of malto-oligosaccharides in cells Affects the production of amylose and amylopectin GBSSI, thereby Affects the properties of the starch produced. In one embodiment of the invention, the malto-oligosaccharide in the cell is depleted. To reduce or eliminate MOS from amyloplasts in developing conserved organs These mechanisms also prevent or reduce amylose synthesis by GBSSI. The particles The effect of GBSSI on the amylopectin chains in the brain increases at the same time. This is amyllow Lacks, or has reduced levels of, and lacks wild-type starch and GBSSI. Of mutant and transgenic plants with low or very low levels of GBSSI Pun (eg, corn, barley, sorghum rice and Amaranthus ( Amaranthus) with potatoamf Mutant, pealam Mutant, and any GB Transgenic potato expressing antisense constructs containing SSI: Smith and Amylopectin structure that differs from that of This produces a starch which can differ from that of the type starch. Lack of MOS or extremely low Amylopectin in plants with low levels of MOS can be found in wild-type plants or the same species of GBSSI. Should have longer branches than amylopectin from plants with altered levels And may have longer branches than amylopectin from wild-type plants of the same species. Thereby, an embodiment of the present invention modifies amylopectin produced in plant cells. (Or a method of producing modified amylopectin in plant cells). Modulating the amount of malto-oligosaccharides (MOS) in cells I will provide a. Changing the intracellular MOS level affects the action of GBSSI, This alters the amylose and amylopectin components of the cell. Preferred implementation In the embodiment, the MOS is totally or partially (including substantially whole) within the cell. (Partially) leads to a depleted and modified amylopectin product. Produced intracellularly Planting in modifying starch, especially the amylopectin constituents of starch The use of substances that reduce the level of malto-oligosaccharides in cells It is provided as a further additional embodiment. The level of MOS in plant cells can be quantitatively evaluated by the following method . First, cell metabolism is stopped very quickly. Typically, the tissue is Stop on tongs cooled to body nitrogen temperature and then thaw with 1M perchloric acid. Then metabolism Prepare a soluble extract of the tissue at a neutral pH suitable for the enzymatic assay of the product. The above example The perchloric acid extract of the tissue is then replaced with a suitable alkali such as 5M sodium carbonate. Neutralize with solution and remove the resulting insoluble potassium perchlorate by centrifugation. Enzymes and others needed to remove the extract from sucrose and glucose Incubate with the factor. This is, for example, the case for Lowry and Passonneau ( Appropriate concentrations of invertase, glucose 6- Phosphate dehydrogenase, adenosine triphosphate, nicotinamide adenine dinucle Reotide: and magnesium chloride can be added. Next, Excess α-glucosidase and α-glucosidase to hydrolyze the effluent to MOS to glucose. -Acylglucosidase and incubate And its glucose is described, for example, by Lowry and Passonneau (1971). Assay as follows. The amount and nature of MOS in tissue can be determined by ion-exchange chromatography. Soluble neutral compounds obtained from extracts (prepared as described above) by fee Can be studied by several methods utilizing fractions containing these Methods include thin-layer chromatography, paper chromatography, and pulsed light. Includes high-grade anion exchange chromatography with amperometric detection. Partial or total removal of MOS in amyloplast changes it to something else. It can be performed using an enzyme that uses MOS as the substrate to be replaced. For example, The enzyme turns MOS into glucose. MOS availability for the above enzymes or GBSSI One method of providing plant cells with other substances that reduce the amount of nucleic acid is to encode the nucleic acid sequence. Due to intracellular expression. Preferred enzymes for this purpose are those with strong maltase activity ( Ie it may have a lower Km for maltose and possibly isomaltase activity Little or no (i.e., little effect on α-1,6 bond, No) or α-glucosida with little or no activity with starch particles (EC 3.2.1.20). Clearly, the enzyme is in the cytoplasm of the cell It is preferable to have an optimal pH within the range of possible pH (typically 6.5-7.8) . Enzymes having such activities are described by Needleman et al. (1978). In addition, due to their ability to hydrolyze the specific substrate 4-nitrophenyl glucoside, Can be identified. Incubate the enzyme at the appropriate substrate concentration at the appropriate pH The solution takes on a yellow appearance as the hydrolysis proceeds. The Km for maltose or any other MOS is that the reaction is Maltose or other MOS concentration for a predetermined period established to progress linearly Can be defined by incubation of the enzyme at the appropriate pH in the range You. By any stable, specific and sensitive means (eg Lowry and Over a period of time) (by an enzyme assay as described by Passonneau, 1971). The measurement of the amount of glucose produced is determined by the enzyme's affinity for its substrate. Any one described for this purpose by Cornish-Bowden (1995) Provides a quantitative assessment of enzyme activity that can be calculated by the method. The optimal pH for the enzyme should be appropriate in different pH ranges (typically in the range 5.5-8.5). Incubation of enzymes with different substrates, and substrates that are hydrolyzed at each of the following pHs: Can be found by measuring the amount of The action of enzymes on starch is Based on the incubation of the enzyme with the microparticles or the soluble polymer obtained therefrom. It can be tested by measuring the production of reducing sugars. For measuring reducing sugars A suitable method is described by Bernfeld (1951). All of the above methods can be used to purify from commercially available enzymes or from any suitable organism. Or purified or partially purified enzyme obtained by partial purification. Can be used. Purification was performed on yeast by Needleman et al. (1978). Are described. The techniques described above can be prepared from any suitable organism. It can also be used to study enzymes in prepared cell extracts. However However, any person skilled in the art will recognize that cell extracts may be capable of hydrolyzing MOS and / or starch. May include several activities that can be performed and any one of these activities It will be appreciated that limiting properties is not possible without partial purification. Bacterial Bacillus amylolytics (Bacillus amylolyticus) Maltase and yeast Saccharomyces callus versiensis (Saccharo myces carlsbergensis) is suitable for maltase encoded at the MAL6 locus (Kelly and Fogarty 1983): Gene for Saccharomyces maltase It has been cloned (Hong and Marmur 1986). If necessary, any person skilled in the art, for example, Bacillus cereus (Bacillus cereus) Coli form used to clone oligo-1,6-glucosidase from By a clear improvement of the transformation (Watanabe et al., 1990) or by a configuration for maltose. Maltose can be used as a carbon source by having mutations in the gene Any request from bacteria due to the inability to supplement Saccharomyces strains The gene for maltase to be cloned can be cloned (Federotf et al., 1982). By destroying plant MOS, which promotes amylose synthesis, by GBSSI Α-Glycosidases that allow amylopectin synthesis rather than amylose synthesis Efficacy is demonstrated by the experiments described in detail herein. Genes use information from sequences available in databases known to those of skill in the art. And can be cloned. Methods for obtaining nucleic acids can be oligonucleotide or erroneous. Hybridization of nucleic acid molecules, including oligonucleotides, to target / candidate nucleic acids May be included. A target or candidate nucleic acid, for example, is known to include such a nucleic acid. Genome or cD obtainable from an organism that is or is expected to contain it It may include an NA library. Identify successful hybridizations and target / Candidate nucleic acids can be isolated for further study and / or use. Hybridization involves probing the nucleic acid and (using well-known techniques). Follow) positive hive under appropriate stringent conditions Identifying redidation and / or in nucleic acid amplification methods such as PCR And the use of oligonucleotides as primers. Proping Because of the favorable conditions, the fraction identified as positive can be further studied Stringent enough to yield a simple pattern in hybridization It is something that is. Hybridization until only a few positive clones remain It is known to those skilled in the art that the stringency of a protein is gradually increased. Instead of probing, still use nucleic acid hybridization, Oligonucleotides designed to amplify DNA sequences can be used in PCR reactions or conventional Other methods for amplifying nucleic acids using manual procedures can be used. For example, “PCR protocols; A Guide to Methods and Applications”, Eds. Innis et al. See 1990, Academic Press, New York. Based on amino acid sequence information, considering the degeneracy of the genetic code, Tide probes or primers can be designed and, where appropriate, The codon usage of the organism from the candidate nucleic acid is derived. Oligonucleotides for use in nucleic acid amplification or probing are about 10 or more. May have fewer codons (eg 6, 7, or 8), ie it is about 30 or less (For example, 18.2 or 24). Evaluation of whether such a PCR product corresponds to the gene of interest is performed by various methods. I can. PCR bands from such reactions may contain a complex mixture of products. You. Individual products can be cloned, each of which can be individually screened. Can be It is to assess function based on its introduction into the plant of interest By transformation Can be analyzed. The nucleotide sequence used in the present invention may be a wild type selected from available ones. Insertion of a type sequence (eg, a gene) or one or more nucleotides of such a sequence Mutants, derivatives, variants or alleles due to insertion, addition, deletion or substitution Can be loaded. Nucleotide changes or differences in nucleotides are due to the degeneracy of the genetic code. And may or may not reflect changes in the encoded amino acid sequence. Any place In any event, variants, derivatives and alleles useful in the present invention will be dependent on the wild-type gene. Functional characteristics of the encoded polypeptide, i.e., maltose activity as discussed It retains the nature. Of course, make no difference in the encoded amino acid sequence Changes to nucleic acids are also included. The nucleic acid may be in the form of a recombinant vector, such as a plasmid or Agrobacterium. In the form of a binary vector (Van den Elzen et al., 1985). The nucleic acid Is under the control of appropriate promoters and regulatory elements for expression in plant cells. obtain. In the case of genomic DNA, this includes its own promoter and regulatory elements. Obtained, and in the case of cDNA, this includes the appropriate promoter and promoter for expression in the host cell. And regulatory factors. One of skill in the art will prepare vectors for recombinant gene expression and design protocols. It is fully possible to Promoter sequence, terminator fragment , Polyadenylation sequences, enhancer sequences, marker genes and other appropriate An appropriate vector containing the sequence can be selected or made. For more information, see Examples For example, Molecular Cloning: a Laboratory Manua, 2nd edition, Sambrook et al., 19 89, see Cold Spring Harbor Laboratory Press. For nucleic acid manipulation, For example, preparation of nucleic acid constructs, mutagenesis, sequencing, introduction of DNA into cells and genes Expression and protein analysis Many well-known techniques and protocols are described in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, 1992. It is. The disclosures of Sambrook et al. And Ausubel et al. Are incorporated herein by reference. Certain procedures and vectors that have been used extensively and successfully in plants in the past include Be ran (1984) and Guerineau and Mullineaux (1993). Antibiotics such as kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, Rusulfuron, methotrexate, zentamicin, secutinomycin, imida Chimeric inheritance conferring selective phenotypes such as resistance to zolinone and glyphosate Offspring can be used (Herrera-Estrella et al., 19). 83; van den Elzen et al., 1985). Induction of .ALPHA.-glucosidase activity on amyloplasts of conserved organs during crop development Entering or raising is to create a plant cell that contains the nucleic acid of the sequence encoding the enzyme. Can be achieved using any suitable method of plant transformation. Transformation Plants can be regenerated from the replaced plant cells and tissues. For example, in Agrobacterium cells having the gene of interest and in suitable constructs For incubation of tuber slices with a gene encoding kanamycin resistance More potatoes can be transformed (Spychalla and Bevan, 1993). tobacco After co-culturing for 2 days on the feeder layer, select against Agrobacterium. Transfer the disc onto Murashige and Skoog (MS) medium containing cefotaxime for MS media, cefotaxime and then select for amplification of transformed cells. And transferred to an agar plate containing kanamycin. Cut the shoots from the disc, Subculture twice to MS medium containing kanamycin before transferring to soil. When introducing the selected gene construct into the cell, certain considerations known to those of skill in the art Must be paid. The nucleic acid to be inserted will induce transcription. It should be assembled into a composition containing effective modulators. The composition There must be available ways to transport within. Its constituents are in the cell membrane If so, integration into the endogenous chromosomal material may or may not occur. last In addition, as far as plants are concerned, their target cell type is such that cells can be regenerated into whole plants. Must. Plants transformed with a DNA segment containing that sequence will be And can be produced by standard techniques already known. DNA Using any suitable technique, for example, agro Disarmed Ti-plasmid vectors performed by bacteria (EP-A-270 355, EP-A-0116718, NAR 12 (22) 8711-87215 1984), particles or Microprojectile bombardment (US 5100792, EP-A-444882, EP-A- 434616) Microinjection (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press) , Electroporation (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debey ser-see a ttached), other forms of direct DNA uptake (DE 4005152, WO 9012096, US 468461) 1), liposome-mediated DNA uptake (eg, Freeman et al., Plant Cell Physiol. 29 : 1353 (1984)) or the vortexing method (for example, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1). 228 (1990d) can be used to transform plant cells. Plant cell transformation Physical methods for the conversion are described in Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: Reported on 1-11. Agrobacterium transformation is known to those skilled in the art for transforming dicotyledonous plant species. Widely used. Now almost all economically Routine life of stable abundant transgenic plants in related monocots There is substantial progress towards production (Toriyama, et al. (1988) Bio / Technology 6, 1072- 1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7,379-384; Zhang, et al. (1988) Th eor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio / Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio / Tec. hnology 9,957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institut te, Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11,585 -591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Pl. ant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio / Technology 8, 8 33-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al. . (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular B iology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil , I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Pl. ant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio / Technology 10, 158. 9-1594; WO92 / 14828). Abundant transgenic plants are produced from cereal rice, corn, wheat, And barley (Shimamoto, K. (1994) Current Opi nion in Biotechnology 5, 158-162 .; Vasil, et al. (1992) Bio / Technology 10, 6. 67-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4); 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702). If Agrobacterium is ineffective or ineffective, Preference for rubombardment, electroporation and direct DNA uptake . Alternatively, enhance the efficacy of the transformation process A combination of different techniques, for example, Agrobacterium-coated micro Bombardment with particles (EP-A-486234) or microprojections to guide wounds Co-culture with Agrobacterium after electrification bombardment (EP-A-4862 33) can be used. After transformation, as is standard in the art, for example, single cells, callus tissue or Can be regenerated from leaf disc tissue. Almost any plant is a plant The whole can be regenerated from cells, tissues and organs. Available technology is Vasi l et al., Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III , Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, and And Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. The particular choice of transformation technique depends on its ability to transform a particular plant species, as well as its particularity. It will be determined by the experience and ability of those practicing the invention in certain selected ways. Nuclear The selection of a particular transformation system for introducing acids into plant cells is essential to the present invention. It is not intended to be limiting or to limit the present invention and to select technologies for plant regeneration. The same applies to the selection. Characterize potatoes so that the product of the introduced gene can target amyloplasts Suitable methods for conversion are exemplified by the work of Shewmaker et al. (1994). . Plasmid pCGN11325 contains 35S promoter, signal peptide and pea. Maturation of the broth bisphosphate carboxylase small subunit gene Contains 16 amino acids of the protein. The gene encoding the enzyme of interest is Into the plasmid as an in-frame fusion with the 16 amino acids of the It has become Cut out the fusion gene, Cloned into the lomotor cassette pCGN2162. 700 base pair patatin promoter -, Signal peptide, 16 amino acids of small subunit, gene of interest and The DNA segment containing the 300 bp nos 3 'region was excised and the binary vector pC It was cloned into GN1557. This plasmid is then used for Agrobacterium tumefari. Science (Agrobacterium tumefaciensTransfer to strain LBA4404 and transform potatoes Used for To achieve protein targeting to amyloplasts. The efficacy of the method is to accurately process the protein expressed in potato tubers. Indicated by the indicated immunoblot. Changed starch structure in potatoes The ability of the method to produce Indicated by its use to induce offspring (Sheumaker et al., 1994). Transformation Amylopectin of the isolated plant has fewer long branches and many short branches than the control plant Was. Targeting α-Glucosidase to Amyloplast, a Crop Preserving Organ 91). In a similar procedure as described above, these studies The investigators found that 34 peptides of the signal peptide and the maize mature waxy protein were The amino acid was fused to the gene encoding β-glucuronidase of E. coli. Aggro The introduction of that component into potato plants by a bacterium-based method is Chloroplasts of transgenic plants and their fusion proteins in amyloplasts The expression of protein was induced. The level of MOS in the cell is determined by one or more endogenous enzymes capable of producing MOS. The activity of the element can be reduced by a decrease in its intracellular activity. Such enzymes, as well as Methods for the identification and cloning of the genes encoding them are described herein. Discussed elsewhere. Active Decreases occur in the antisense direction, such that antisense RNA is formed in the cell. Can be achieved by introducing a gene or a part thereof into cells. The gene or part thereof is sufficiently similar in sequence to the gene encoding the endogenous enzyme. It may encode a similar endogenous or other enzyme. The introduction of the gene was Achieved by any suitable transformation method, as discussed elsewhere in the textbook be able to. Includes genes in antisense orientation that result in reduced enzyme activity The development and use of such constructs has led to the development of specific forms of starch synthase in potato plants. Edwards et al. (1995) and Marshall et al. (1996). A further aspect of the present invention is a starch producing cell of a plant, wherein Tri-oligosaccharide levels are reduced compared to levels in equivalent wild-type cells. Has been reduced and the starch is produced by an equivalent wild-type cell. It has an increased or improved amylopectin composition as compared to pun. A starch producing cell is provided. Preferably, malto-oligosacchara Id levels are determined by maltose activity (as disclosed) from heterologous encoding nucleic acids. Is reduced with respect to intracellular expression of a sexually active polypeptide. The term "heterologous" means that the gene / sequence in the nucleotide in question is genetically engineered. That is, introduced into plant cells or their ancestors by human intervention. Is shown. The gene is preferably safe in the genome, even on extra-genomic vectors. It may be incorporated into the routine. The cells can be transformed, for example, using any suitable technique available in the art. The nucleic acid encoding the enzyme by transduction of the nucleic acid into the cell or its ancestors May be included. In addition, the plant containing those cells Products and their seeds are genomic according to any available plant breeding technique. Mating appropriate parents to form a hybrid containing the required nucleic acid Can be produced by According to the present invention, there is also provided a regulatory sequence for expression of the encoded polypeptide. Nucleotides encoding polypeptides having maltase activity under active control A starch-producing plant cell as disclosed, incorporating the sequence of I will provide a. Expression of the polypeptide is determined by intracellular malto-oligosaccharides. Depletion, and instead induces the action of GBSSI on amylopectin as opposed to amylose To produce modified amylopectin. A further aspect of the present invention relates to Producing a plant cell as described above, including introducing a vector containing the sequence of leotide into the plant cell Provide a way. Such introductions introduce nucleotide sequences into the genome. Recombination between the vector and the plant cell genome. Next, the introduced nuclear Acid-encoded polypeptides are used in plants regenerated from transformed material. And the progeny thereof, including the cells in which they reside. Stable pairs in the plant genome These progeny are essential because the incorporated genes pass from plant to plant progeny from generation to generation. It should indicate the required phenotype. The invention also provides a plant comprising a plant cell as discussed. Plants like this Produces modified amylopectin and starch as disclosed. The present invention May not really breed in one or more characteristics. Planting Product varieties, especially plant products that can be registered according to Plant Breeders' Rights Species can be excluded. A plant can be a transgene introduced into a plant cell or its ancestor. Do not need to be considered “plant varieties” because they only contain Is noted. In addition to plants, the invention relates to clones of any of such plants. , Seeds, selfed or hybrid progeny and progeny, as well as cuts, seeds Provide any one of them. The present invention relates to regeneration including cut products and seeds. Or any part that can be used for growth, sexual or asexual use Provide plant baskets. The present invention relates to cereals and legumes, corn, wheat, potato, tapioca, rice, Sorghum seeds, millet, cassava, barley, peas and other roots, tubers or Plants, such as crops, including seed crops, which are in principle any source of starch It is particularly useful for use with other plants. Amylopectin and / or starch, after their production in plant cells, It can be extracted from plants according to the light. Starch and / or amylopectin Can be obtained using any available technique. For example, potato den Pun is easily separated from tubers and, in the early 19th century, The obi has been prepared in general. On an industrial scale, starch is, for example, Potatoes can be obtained from potatoes using the following method: Water flow in a rapidly rotating vertical hammer mill covered by a screen Is decomposed. Through this, the pump is forced into a series of centrifugal sieves , Let through. The starch suspension that passed through the sieve was added with washing water. Through several centrifuges to remove soluble impurities, then vacuum filtration Through a preliminary conveyor dryer with countercurrent air at 145 ° C. And then through a series of blowers with a 145 ° C cyclone separator. Thereby, a further aspect of the invention is a plant or plant according to the invention as disclosed. Starch or amylopecty obtained from or obtainable from plant cells Offer. The starch or amylopectin removed from the plant is purified and dispensed into the composition. Can be Compositions comprising such a starch or amylopectin may comprise one or more May include a plurality, ie, at least one, of the adduct constituents. Such a composition is Product preparations, industrial preparations, etc. The use of starch and compositions containing starch has been discussed earlier. Has been discussed. "Malt-oligosaccharide" is maltose, maltotriose, malto Tetraose, maltopentaose, maltohexaose and / or maltohep Each of the mono- and oligomers experimentally studied herein, such as taose, Including soluble in cells rather than forming part of the polymer within the starch particles Either α-1,4 or α-1,4, α1,6 glucans individually or Include jointly. References to malto-oligosaccharide "components" may refer to composition (quality) and / or level. (Amount). Terms such as "modulate" and "alterate" may not have any effect as a result of human intervention. Used for controlling. Regarding the level of MOS in cells, The intervention is compared to the level without that intervention, i.e. the equivalent of, for example, plants of the same species. The level of MOS can be increased or decreased compared to wild type cells. (MO Cells that are wild-type with respect to S levels are, of course, wild-type in all respects. I can't get it. ) Instead of regulating MOS levels in cells by reduction or depletion, GBSSI acts The level of amylopectin from amylopectin to amylose be able to. Any mechanism that increases the concentration of MOS in amyloplasts of a developing conserved organ Mechanism is also due to the availability of primers for GBSSI activity or Discloses GBSSI affinity for amylose for amylopectin in starch particles Increasing the number of people. This is due to the amylose to amylopectin in the starch. To increase the ratio of amino acids and affect the size and / or structure of the amylose molecule. You. An increase in the concentration of MOS is due to an increase in the concentration of any enzyme capable of generating MOS. It can be caused by introduction into Loplast. These glucans are known to be present in developing starch storage organs. Some enzymes, namely β-amylase, α-amylase, disproportionase, debranching Enzymes and starch phosphorylase in vivo. Glucan Contains debranching enzymes, starch phosphorylase and bacterial amylosucrase It can also be formed by other enzymes. The first four of these enzymes are New glucan synthesized by starch synthase and starch branching enzyme Glucans can be formed by chain cleavage or rearrangement. Starch phospho Lylase can form glucan from glucose 1-phosphate (Steu p 1988, 1990; Takaha et al., 1993). Typically preferred enzymes for use in this aspect of the invention are whole starch granules Has low or negligible activity on offspring, starch phosphorylase or β- It can be an amylase. Clearly, within the range of possible pH in all cytoplasms (reference The optimum pH is 6.5 to 7.8). Identification and activity of these enzymes Methods for kutaization are discussed extensively by Steup (1990). E Of suphorylase, α-amylase, β-amylase, disproportionase and debranching enzyme The gene for the plastid isoform has been cloned (Nakano et al., 1989, Lin et al., 1991, Sonnewald et al., 1995, Yoshida et al., 1992, Siggens 1987, Monroe et al., 1991, Kreiss et al. 1987, Takaha et al., 1993, James et al., 1995). The DNA sequences of these enzymes are It is described in cited documents and databases, for example, for α-glucosidase. The genes encoding these and additional enzymes are cloned using the methods described above. Can be used to Activities within amyloplasts of conserved organs are discussed As such, these genes can be transformed by any suitable method of plant transformation. It can be increased by one introduction. For example, thisamf Of potato tubers with mutations in the locus to amyloplastsamf An approach used by van der Leij et al. (1991) for the successful transfer of gene products. Globobacterium rhizogenes (Agrobacterium-rhizogenes) Can be done. The genes used for transformation are preferably co-repressed. To avoid potential problems with different species from the transformed one. Should be. Genes for α-amylase are cloned from plants and bacteria. (Eg, Yoshida et al. 1992, Siggens 1987, Monroe et al. 1991, Kreiss 1987), so that this activity can be exploited in any suitable method of plant transformation. Can be introduced into the amyloplasts of the preserved organ through the use of any of these genes You. The products of these genes are typically non-plastid and It is directed to the outer cell compartment of the rear cell. Therefore, to amyloplast The preparation of a suitable construct for the introduction of β-amylase activity is advantageously carried out with catalytic activity And selection of a portion of the protein that lacks the target sequence. Protein structure -Information on functional relevance is available to those of skill in the Enable it (eg Janacek 1994, Kawazu et al., 1987). Β in amyloplast -The preparation and introduction of a suitable plasmid for the expression of amylase As discussed above for lucosidase, This can be done using any suitable technique available in surgery. This allows the present invention to disclose and discuss earlier regarding reducing MOS levels. Increased levels of MOS in plant cells in various aspects similar to those discussed About making things. In glucan synthase or purified starch particles in cell or tissue extracts The activity of the enzyme is that the glucosyl component from ADPG is converted to glucan by α-1,4 linkage. It can be identified by the ability of the enzyme, extract or particle to incorporate. preferable The method of the assay is described by Jenner et al. (1994). Modification of the activity or properties of the particle-bound starch synthase activity of the cells Change the degree or nature of the change in the starch structure resulting from the conversion of the S component. Can be used to obtain The genes encoding GBSSI from many plant species have been cloned (Ainsnorth et al.). , 1993). And an array is available. For example, as described above. To clone the GBSSI gene from any appropriate species using a sophisticated method The DNA sequence can be used by those skilled in the art. These sequences can be obtained by any suitable transformation technique, again as described above. Increase or decrease the nature of the particle-bound starch synthase activity or reduce it. It can be introduced into plants in such a way as to vary. Codes for endogenous enzymes An increase can be brought about by the introduction of a gene. Antisense direction Can be reduced through the introduction of genes encoding endogenous enzymes in . Altered enzyme properties encode GBSSI or similar proteins from other species Mutation that alters the properties of the gene or the GBSSI it encodes It can be obtained by introducing a gene that has been used. Modified GBSSI or GBSSI from other species is In the wild-type plant so that the introduced protein is synthesized in addition to the endogenous GBSSI Or that endogenous GBSSI activity is responsible for the generation of antisense RNA. It can be introduced into cells that have been reduced or eliminated by the current mutation. The present invention is described in detail with reference to experimental results and the accompanying drawings, and is illustrated by way of example. Will be. Additional aspects and embodiments of the present invention and those disclosed herein Improvements will be apparent to those skilled in the art. Figure: FIG. 1a: Elution of solubilized pea starch from a column of Sepharose CL-2B. ■ = absorbance at 595 nm of the fraction mixed with iodine. □ = Maximum fraction mixed with iodine Absorbance wavelength FIG. 1b: ADP [U-¹⁴C] Gluco Sepharos loaded with methanol / KCl insoluble product from incubation with glucose e From the CL-2B column¹⁴Elution of C. 1 = 1 hour incubation. □ = 0 hour incubation (control). dps: decay per second Figure 2: Sepharose CL-2B from column¹⁴Isoa to C elution profile The effect of millase branching. Two samples of starch particles isolated from pea embryo Pull for 1 hour, ADP [U-¹⁴C]. Next, methanol / KCl Incubate the insoluble product with isoamylase (□) or further process (). Figure 3: Wild-type embryo (■) andlam ADP [U-¹ ^Four C] Insoluble in methanol / KCl after 1 hour incubation with glucose To sex products¹⁴Comparison of C incorporation. Figure 4: Particle-bound proteins of wild-type and lam mutant pea embryos Comparison. The starch particles are boiled and centrifuged in a sample buffer containing SDS, and the The supernatant was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis as described by Smith (1990). It was subjected to electrophoresis. Tracks 1 and 8 = molecular weight markers (size indicated in KDa). Track 2-4 = starch from embryos from three different pods of wild-type peas. Track 5-7 =lam Demp from embryos from three different pods of mutant pea N. Tracks 2-7 all contain the same amount of protein from starch. Figure 5: ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Incorporation of C Of heat-stable soluble compounds from plant extracts on the growth. Freshly collected pea embryo (250-350mg) in 100mM Mops (pH 7.2), 5mM MgCl_Two, 50ml ・ l^-1Glycerol, 2 mM DTT, 1 g · l^-1Homogenized in bovine serum albumin in a mortar. So Can be used directly (non-washed starch particles) or the homogenate A 1 ml aliquot of the nate is centrifuged at 10,000 g for 5 minutes and the supernatant containing the soluble material and And a pellet containing starch particles. Remove the supernatant and remove the pellet. Wash three times by resuspension in homogenization medium, then 5 min. Centrifuge at 000 g and then resuspend in homogenization medium to 1 ml The final volume was provided. Washed (■) and unwashed (□) starch particles Pull the ADP [U-¹⁴C] Incubate with glucose for 1 hour, The tanol / KCl insoluble product was subjected to Sepharose CL-2B chromatography. Figure 6: α-Glucosidase treatment on the stimulatory effect of soluble extract on amylose synthesis Effect of reasoning. The isolated starch particles and the treated and untreated supernatant fractions It was as described in Table 2. Mops medium (■), treated supernatant (○) and treatment Suspended supernatant (□) The product of the turbid particle assay can be chromatographed on Sepharose CL-2B. I did. Figure 7: Insoluble methanol / KCl production by starch particles from wild-type pea embryos ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Malto-oligosa for incorporation of C The effect of coloride. 100mM maltose (□), 100mM maltotriose (○) and Those containing 100 mM maltohexaose (x) and those without additives (■ ) Was performed for 1 hour. Figure 8: Wild-type pea embryos (□ = maltotriose-containing, ■ = maltotriose Not containing aus) andlam Mutant pea embryo (including maltotriose ADP with starch particles from [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Ratio of the effect of maltotriose on the incorporation of C Comparison. Figure 9: Insoluble methanol / KCl by starch particles from developing potato tubers ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Malto-oligos for incorporation of C Saccharide effect. Incubation includes 100 mM maltotriose (□) or one containing no additive (■) was performed for 1 hour. Figure 10: Branched off column of Sepharose CL-4B¹⁴C-labeled starch Elution. ADP [U-¹⁴C] Pea incubated for 1 hour with glucose A sample of starch particles isolated from particles and starch particles is packed into a column Prior to incubation with isoamylase. 595nm of fraction mixed with iodine Elution of unlabeled sample as absorbance (■); and ADP [U-¹⁴C] Glucose From a sample incubated with¹⁴C-labeled methanol / KCl insoluble Product elution (□). Figure 11: Irritability of insoluble extracts of potato tubers on amylose synthesis Effect of pre-treatment with α-glucosidase on the effect. 5g sample of a developing tuber Was prepared. Two overlapping 5 g samples of developing tubers were prepared. Note in the experimental procedure One was used for the isolation of starch particles as indicated. The other is 0.5g of poly Mortar in a total of 10 ml of 50 mM sodium acetate (pH 5.5) containing vinyl polypyrrolidone Extracted within. After centrifugation, boil the supernatant (soluble extract) for 5 minutes, then 1.25unit ・ ml for 18 hours at 35 ℃^-1Α-glucosidase (yeast) Incubated with or without. After boiling again, all samples are brought to pH It was 7. The starch particles were subjected to medium A (■), α-glucosidase-treated soluble extraction. 25 mg / ml in the product (○) or untreated soluble extract (□)^-1Re-suspend with ADP [ U-¹⁴C] Incubated with glucose for 1 hour. Methanol / KCl − The insoluble product was chromatographed on Sepharose CL-2B. Figure 12: Wild type andlam ADP [U-U] by starch particles from mutant pea embryos¹⁴ C] from glucose¹⁴Comparison of the effect of maltotriose on C incorporation. field Raw type: □, containing 100 mM maltotriose; △, not containing maltotriose Things;lam Mutant: ○, containing 100 mM maltotriose; ●, maltotriose Not containing aus. Figure 13: Insoluble methanol / KCl by starch particles from developing potato tubers ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Malto-oligos for incorporation of C Saccharide effect. Incubation contains 100 mM maltotriose (□) or without additives (■). All documents mentioned herein are incorporated by reference. Materials and methods Plant material Pea is a round-seeded line (Pismum Sachibum (Pisum sativu m ) L., BCl / 12 RR: See Smith 1990 for guidance on this engagement.) Low amylose derived from a circular species (lam) Mutation system (SIM503) (Denyer et al., 1995a) It was. Both are Dr. Cliff Hedley and Dr. Trevor Wang, John Innes Cent re, obtained from Norwich. Grow plants as described by Denyer et al. (1995a) I let it. Potatoes (Saranum Tuberosum)Salanum tuberosum) L. cv Desiree) Was grown as described by Edwards et al. (1995). Preparation of starch Starch was prepared from a developing pea embryo essentially according to Smith (1990) Was. 1 to 3 g of embryos weighing 200 to 400 mg fresh at 4 ° C. in 5 to 15 ml of 100 mM Tris-aceta te (pH 7), 0.5 M NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM ethylenediamine Homogenized in a mortar with tetratetraacetic acid (EDTA). The homogenate Filter through a layer of Miracloth (Behring Diagnostics, La Jolla, CA, USA) Was washed in the filter cloth with an additional 5 to 15 ml of extraction medium. That pair The combined filtrate was stirred for 30 minutes at 4 ° C. and then centrifuged at 2000 g for 10 minutes. That Discard the green material from the surface of the supernatant and the pellet and pour the pellet into 10 ml. Resuspended again in the extraction medium. This centrifugation and resuspension procedure is performed once with the extraction medium, Then, it was repeated three times with 50 mM Tris-acetate (pH 8), 1 mM DTT, and 1 mM EDTA. The pellet was resuspended in acetone cooled to −20 ° C. and allowed to settle for 15 minutes, Then the supernatant was discarded. Repeat this acetone wash two more times. The dried starch was dried at room temperature under air. Use the starch immediately or 2 Stored at -20 ° C for up to a month. The extraction medium is 50mM Tris-acetate (pH 8), 1mM DTT, 1mM EDTA, 4 ℃ With the exception that the stirring in the extraction medium was omitted and the total number of washes with the extraction medium was 3-4. Developing potato tubers homogenously as described above for dough embryos (10-10 each) 0 g of fresh weight). Incubation of particles with ADP glucose The starch particles were treated with 100 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (Mops, p H7.2), 5mM MgCl_Two, 50ml ・ l^-1Glycerol, 2mM DTT, 1g ・ l^-1Bovine serum Resuspended in albumin at 1 mg per 40 μl. 10 incubations each μl of starch suspension and 90 μl of 100 mM Bicine (pH 8.5), 25 mM potassium acetate 10 mM DTT, 5 mM EDTA, 18.5 GBq · mol^-11 mM ADP [U-¹⁴C] Gluco Agar (Amersham International, Bucks, UK) for 1 hour at 25 ° C Incubated. The incubation was heated at 90 ° C. for 2 minutes, followed by 10 minutes. g ・ l^-1750ml ・ l containing KCl^-13 ml of methanol aqueous solution (methanol-KCl) Finished by either adding or by adding only methanol-KCl. Minimum After 5 minutes incubation at room temperature for 5 minutes, the precipitated starch is Collected by centrifugation at 00g. Discard the supernatant and dispense the pellet with 0.3 ml In distilled water. This methanol-KCl wash, centrifugation and resuspension After the last centrifugation, remove the distilled water and allow the pellet to air at room temperature for a minimum of 10 minutes. The same procedure was repeated twice, except that the inside was dried in the same manner. Its washed starch pellets Dissolve the kit in 50 μl of 1 M NaOH, dilute with 50 μl of distilled water, and Chromatography. Isoamylase digestion Incubate the starch particles with ADP glucose and add the meta Washed with Knol-KCl. The dried starch pellets are added to 4000 units of 25 μl of 50 mM sodium acetate containing soamylase (Sigma, Poole, Dorset, UK) (pH 3.5) and incubated for 24 hours at 37 ° C. Then 50 starch Dissolve in 1 μl of 1 M NaOH, dilute with 25 μl of distilled water, and use gel filtration chromatography. I went to graphy. Chromatography for gel filtration on Sepharose CL-2B Sample is 20mg ・ ml^-1Dissolve in 1M NaCl with 0.5M NaOH with distilled water Diluted unlabeled starch or prepared as described above¹⁴Any of C-labeled starch Met. A 50 μl sample of the dissolved starch was equilibrated with 100 mM NaOH for S Apply to epharose CL-2B column (0.5 cm i.d. × 30 cm) and elute with this solution. (Denyer et al., 1995a). Fractions of 0.15-0.17 ml were collected at a rate of one fraction per minute . Glucans in fractions from unlabeled samples were described in Denyer et al. (1995a). As detected by their reaction with iodine. Sump containing labeled glucan The radioactivity in the fractions from the fractions was determined by scintillation with 1 or 3 ml of HiSafe II solution per fraction. Fluid (Beckman Ltd., High Wycombe, Bucks, UK) using Wallac 1410 cow Liquid scintillation counting (Wallac UK, Milton Keynes, UK) It was measured. SDS-polyacrylamide gel As described in Denyer et al. (1995). Assay for particle-bound starch synthase activity The assay was performed in a final volume of 100 μl, 100 mM Bicine (pH 8.5), 25 mM potassium acetate. , 10 mM DTT, 5 mM EDTA, 2.3 GBq · mol^-1Of 1 mM ADP [U-¹⁴C] Glucose (A mersham International, Bucks, UK) and 10 μl of a suspension of starch particles. Was out. Assay 15 Incubated at 25 ° C for 2 minutes and then heated to 90 ° C for 2 minutes. Control is starch The particles were heated to 90 ° C. immediately after being added to the assay. All assays and controls are duplicates I went. The starch is precipitated with methanol-KCl and the final pellet is after dissolving in 1 l of distilled water and then in 3 ml of HiSafe II liquid scintillation fluid. The outside was washed as above (incubation of starch particles with ADP glucose). ). Radioactivity was measured by liquid scintillation counting. result Identification of GBSS products The starch synthase activity of the starch particles isolated from the pea embryo was determined to be 10 g · l^-1 750ml ・ l containing KCl^-1For materials that are insoluble in methanol (methanol / KCl) ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Measured as incorporation of C. This activity is A It is specific for DP glucose (it has almost no activity on UDP glucose at 1 mM, Its activity was less than 3% of the activity of glucose at the same concentration of ADP). The penetration was at least one hour, time-dependent.¹⁴C-labeled methanol / KCl insoluble material completely dissolved after incubation with amyloglucosidase The sign (not shown) indicates that the product of the reaction is glucan (α-1,4, α-1,6 ). In control assays that were completed immediately after addition of substrate, To Lucan¹⁴C incorporation was minimal (assays incubated for 1 hour) Less than 3% of that of). Sepharose CL-2B chromatography of pea starch is amylose and And amylopectin components were clearly separated (FIG. 1a). Amylopectin is a glue The first peak of can elution and amylose is the second peak (De nyer et al., 1995a). ADP [U-¹⁴C] Isolation of isolated starch particles with glucose Ncubesi The methanol / KCl insoluble product from the solution is separated on a Sepharose CL-2B column. When subjected to mattography,¹⁴C is predominantly soluble in the amylopectin peak (FIG. 1b). In seven experiments, all eluted from the column¹⁴Percent of C Combined amylopectin peak¹⁴The average recovery of C was 78 ± 12% (average ± SD). In these and subsequent experiments, the fractions eluted from the column were All¹⁴C was 70-100% of that applied to the column, so the label on the column was There was no major loss of knowledge. With amylopectin¹⁴C co-elution is in amylopectin or high The product is loaded onto a column to study whether it is in a molecular weight amylose molecule. Treated with isoamylase for debranching prior to application. Isoamylase treatment After doing¹⁴The fact that C eluted very slowly from the column (FIG. 2) indicates that at low molecular weights Indicates that In control treatment with buffer instead of isoamylase,¹⁴C Did not change position (data not shown). These results are By GBSS on branches of amylopectin molecules rather than limers¹⁴C glucose set Is consistent. The starch particles used in these experiments were placed in an aqueous medium and then cooled in acetone. Prepared by washing the insoluble extract of the developing pea embryo several times in It was then dried in air and stored at -20 ° C for up to 2 months before assaying. these Whether the preparation or preservation of the product will affect the type of product produced by GBSS To determine, particles prepared by the following alternative method were assayed: 1) Freshly prepared particles not stored at -20 ° C and 2) washed with aqueous medium Freshly prepared particles that have not been washed with seton or air dried, both of the above experiments In¹⁴The elution profile of C is essentially the same as that shown in FIG. The integration is amylope Kuching was extremely large. Hylton et al. (1995) reported that mechanically damaged starch particles from barley endosperm were completely eliminated. Have greater GBSS activity than all particles, and most of the increase in activity is less than GBSSI Was found to be for the outer isoform. In light of this result, In our experiments, the pattern of glucose incorporation was I studied whether it would be affected. Rather than by grinding in a mortar A razor blade cuts the developing pea embryo into the extraction medium to minimize Particles were prepared with mechanical damage. Of particles prepared from chopped pea embryos (den The activity (per mg of pun) was almost half that of the particles prepared by milling . However, there was no change in the properties of the synthesized product (not shown). polymer To¹⁴C incorporation pattern unchanged; by chopping rather than grinding Most of the incorporation in the prepared particles is in amylopectin. (Not shown). ¹⁴Analysis of C-labeled amylopectin chain size ¹⁴To study the average length of the amylopectin chain into which C is incorporated, ADP [ U-¹⁴C] and the product of incubation of the pea starch particles with isoamido After debranching with the enzyme, chromatography on a column of Sepharose CL-4B I did. For the experiment shown in Figure 10, the first peak of glucan eluted from the column was complete. It consisted entirely of unbranched amylopectin. Dissolves slower from column The glucan emanating consisted of debranched amylopectin chains.¹⁴C sign The comparison of the elution profiles of unlabeled and unlabeled amylopectin chains shows that the former peak is the latter. It showed that it eluted earlier. This means that during the incubation, the starch The chain extended by intase is significantly longer than the average chain in the amylopectin molecule What you said Suggest. Wild type andlam Comparison of starch from mutant embryos The observed elongation of amylopectin was caused by GBSSI, GBSSII or their isoforms. To study if it was due to both activities, we used wild-type andlam Mutation ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴C-glucose de Incorporation into starch was compared.lam Starch particles from mutants lack GBSSI Therefore, incorporation into these particles must be GBSSII alone.lam Strange Incorporation into particles from heterozygous embryos was entirely within the amylopectin fraction (FIG. 3). This indicates that the pea embryo GBSSII extends the amylopectin branch within its particles. It can be lengthened. As reported earlier,lam Of mutant embryos into particles¹⁴Full integration of C glucose Was lower than particles of wild-type embryos based on starch (Denyer et al., 1995a). This Whether the decrease in incorporation was simply due to the lack of GBSSI, or whether the mutation To study whether it also causes a reduction in the amount of SSII, both starches Was extracted and compared on SDS-polyacrylamide gel (Figure 4). The amount of GBSSII per mg of starch was the same in wild type and mutant. GBSS Assuming that the activity of is not significantly affected by structural differences between starches, this Is in the ability to incorporate glucose from ADP glucose into amylopectin Wild type andlam It suggests that differences between embryonic starches are attributable to GBSSI activity. Effect of soluble fraction of stored organs on the product of GBSS The experiments described above show that GBSSI in isolated starch particles was obtained from glucose from ADP glucose. Demonstrates significant transfer of course to amylopectin rather than amylose molecule You. Since this isoform is responsible for the synthesis of amylose in vivo, Existing but isolated den Some factors not present in the pun particles may be required for amylose synthesis You. Soluble factors required for amylose synthesis are modified during their preparation. To study whether or not it has been washed out of the particles, we (soluble and ADP [U] by crude homogenate of developing pea embryo (including both insoluble fractions) −¹⁴C] Compare the insoluble methanol / KCl insoluble products from glucose and compare Was washed (FIG. 5). The crude homogenate is Cleaned starch particles for a clear and larger incorporation into the loin Higher overall integration was provided. Wash the soluble fraction obtained by centrifuging the crude extract. When added back to the purified starch particles, the stimulus for incorporation into amylose is rough. It was observed in the same manner as in the synthesis of amylose in the homogenate. Before this addition its soluble Boiling the sexual extract does not affect its ability to stimulate amylose synthesis, This indicates that the stimulator is thermostable and that no soluble enzyme is required. (Not shown). We show that developing potato tubers are soluble factors that can stimulate GBSS activity. We studied whether children were included. The GBSS activity of the crude tuber homogenate is the same Significantly greater than the activity in the washed starch particles from the plate. Same as in pea embryo Similarly, the addition of a boiled soluble extract to washed starch particles does not impair GBSS activity. Intense (Table 1), promotes the synthesis of amylose (FIG. 11). Overall, these experiments involved soluble extracts of pea embryos and potato tubers. Suggest that a non-enzymatic factor that stimulates amylose synthesis is contained in the particles. Lelo ir et al. (1961) reported that GBSS activity was maltose, maltotriose or maltotetrao. Found to be stimulated by the presence ofPh aseolus vulgaris Acts as a substrate for GBSS in particles isolated from Provided evidence suggesting to obtain. The work of Leloir et al. From UDP glucose, which is an activity not present to any great extent in the product Glucose transfer, but the stimulant in our soluble extract is amylose Malto-oligosaccharides that can function as primers for synthesis Seems to be high. To study this, a boiled soluble extract of potato tubers The product is treated with α-glucosidase (maltose) to produce a malto-oligosaccharide. Was removed. This treatment stimulates the GBSS activity of the isolated starch particles, and¹⁴ The ability of the extract to promote incorporation of C into amylose was eliminated (Table 2, (Fig. 6). In three separate experiments, the activity of starch particles re-suspended in medium A was measured. Particle-bound starch synthase activity is dependent on the resuspension of the unreacted soluble extract. 154.3% ± 16.5% (mean ± SD) for starch particles, α-glucosidase 109.8% ± 8.9% (average) for starch particles resuspended in the treated soluble extract (Mean ± SD). The results from the analysis of one of these experiments are shown in Table 11. Whole and These experiments show that the soluble extracts of pea embryos and potato tubers Malto-oligosaccharides that can stimulate amylose synthesis in offspring Suggest that We therefore purify purified malto-oligosaccharides into isolated particles. Whether amylose synthesis could be promoted or not. The result is Shown in Effect of malto-oligosaccharide on GBSS activity Maltose to malt when applied to starch particles isolated from pea embryos Small malto-oligosaccharides, ranging up to hexaose, can be combined with amylose. AD to material eluted from Sepharose CL-2B at the same location or slightly later P [U-¹⁴C] glucose from¹⁴Stimulation of C-glucose incorporation. Incorporation into amylopectin Reduced (FIG. 7) and at the same position or slightly later than amylose Incorporation into the material eluted from the Sepharose CL-2B column was significantly stimulated. Malto-oligosaccharides with maltoheptaose and 4 to 10 glucose units A mixture of the compounds had a similar effect (data not shown). In maltose, Was evident at a concentration of 10 mM and was fully saturated at 100 mM. 100 mM glucose The fact that neither 100 mM nor 100 mM cellobiose had any effect on incorporation The intense effect was shown to be specific to maltooligosaccharides (data not shown). No). The synthesis of amylose in the presence of malto-oligosaccharide is GBSSI, GBSSII Or wild type and to determine if it is due to both activitieslam Mutation The products formed in the presence of maltotriose by particles from somatic embryos were compared ( 8 and 12). Malt trioselam By starch particles from mutant embryos It has no effect on the synthesized product, which indicates that GBSSII alone has It shows that amylose cannot be synthesized in the presence of saccharide. Soy sauce For example, the amino acids observed in wild-type particles in the presence of malto-oligosaccharides Loose synthesis appears to be due to GBSSI activity. Effect of malto-oligosaccharide on GBSS activity of starch from potato tubers We examined the effects of malto-oligosaccharides on pea starch during development. Was compared to the effect on starch isolated from potato tubers. Sepharose CL-2B Columns were prepared from potato starch to amylose and amylose from pea starch. Not effective in separating pectin (not shown), but maltotrio Under the lack of ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Incorporation of C in amylopectin peak It was clear that it was big. See FIG. In the presence of maltotriose Incorporation into amylopectin was dramatically reduced, and incorporation into amylose was Increased (FIG. 9). These results are similar to those obtained with pea starch. Potato starch GBSSI spreads amylopectin in the absence of maltotriose Longer and consistent with the idea of synthesizing amylose in the presence of maltotriose Was. Discussion Our results show that both GBSSI and GBSSII in developing pea embryos have starch particles. Indicates that glucan is prolonged within. GBSSI extends the branches of amylopectin, Higher oligomers of maltose and glucose can be extended. GBSS II can prolong amylopectin but apparently malto-oligosaccharides. I cannot extend my callide. As a result, only the GBSSI can be combined with the amylose. Configuration can begin. From our research, we found that GBSSII When these molecules reach a certain size, they can contribute to the extension of amylose. I cannot exclude the possibility that I can cut it. The GBSSI characteristics of the developing pea embryo described herein are generally It should exhibit the properties of ras starch synthase. Baba et al. (1987) Particles isolated from tuber tuber are ADP [U-¹⁴C] from glucose¹⁴Mainly C Incorporation into mylopectin has been shown. Malto-oligosa was used in these experiments. No saccharide was provided. Leloir et al. (1961) disclose malto-oligosaccharides. Is a primer as a primer for starch synthesis in particles from developing beans. It has shown that it can work. We have potato tubers and en Malto-origin to stimulate amylose synthesis in isolated particles from dough embryos Gosaccharide is required. Starch from many starch-storing organs is sized and peculiar to GBSSII in pea. They have very similar GBSS in gender and / or sequence. All GBSSII class The properties of the members seem to be similar, and thus the starch granules other than peas Prolongation of amylopectin by these isoforms in offspring can also occur. However However, the type and number of GBSS other than GBSSI may be different between starches from different sources. There is a relationship (Smith et al., 1995). Now we have amylope within that particle No information on the ability of GBSS other than GBSSI and GBSSII to extend Kuching No. Starch from different sources, GBSS other than GBSSI contributes to overall GBSS activity The degree also varies. For example, the activity of GBSSII is the activity of GBSSI in potato tubers. Extremely low compared to gender (Edward et al., 1995). This is better than in pea starch To amylopectin in the presence of maltotriose in very low potato starch The incorporation can be described (FIGS. 8 and 9). As a result, GBSS's contribution to amylopectin synthesis is dependent on both its overall activity and properties of these enzymes. And may vary between starches. In the isolated particles, the overall activity of GBSSI and the nature of its product Depends on Rigosaccharide availability. We are interested in α-glucosidase Amylose synthesis in isolated particles sensitive to degradation by The presence of a compound that irritates in pea and potato crude extracts was demonstrated. this These malto-oligosaccharides are produced in vivo by the action of amylolytic enzymes Can be done. Such degrading enzymes are present during starch synthesis, and It has been a long time to show that some are plastids ,Are known. Our results indicate that one of the roles of the degrading enzyme is for amylose synthesis. Suggest that this may be the case. GBSS activity in fractions of crude extracts of developing potato tubers Homogenize a sample of the developing tuber and pellet (including starch particles) And the supernatant fraction (containing soluble material) was recorded for pea embryos in FIG. Prepared to be loaded. Add starch synthase activity to homogenate and supernatant And assay the latter, subtracting the latter from the former to provide GBSS activity in the homogenate. Was. Re-suspend half of the washed pellet in 1.5 ml extraction medium and boil 1.5 ml In the same manner, the supernatant was used to update both samples for starch synthase activity. Say. The boiled supernatant contained no detectable starch synthase activity. In these experiments, amylopectin (potatoes; Sigma, Poole, Dorset, UK) Is 5mg ・ ml^-1Was included in the assay. Values extracted two separately For samples from tubers. .ALPHA.-Glucosidase to stimulate GBSS activity by crude extracts of developing potato tubers Processing effects Two duplicate samples of 5 g each of the developing tubers were prepared. One is the material and direction Used for isolation of acetone washed starch particles as described in the method. other Is 0.5 g of polyvinyl acetate in a mortar in a total of 10 ml of 50 mM sodium acetate (pH 5.5). Extracted with rupolipyrrolidone. After centrifugation, boil the supernatant for 5 minutes, then 1.25unit ・ ml at 35 ℃^-1With α-glucosidase (yeast) , Or without it overnight. After boiling again, remove all supernatant Bring the pull to pH 7 and use the starch (prepared from other tuber samples) for the assay. The particles were used to resuspend. Buffer = Mo as described in Materials and Methods Starch resuspended in ps medium, untreated supernatant = ingestion without α-glucosidase Cuvated supernatant, treated supernatant = supernatant incubated with α-glucosidase .

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１２月４日【補正内容】請求の範囲１．α−グルカンシンターゼ活性を有する植物細胞内で生産されるα−グルカンの分枝α−グルカン含量を変える方法であって、α−グルコシダーゼ酵素活性をコードする核酸で植物細胞を形質転換することにより、該形質転換された植物細胞及びその子孫が、マルターゼ活性を含むがイソ−マルターゼ活性をほとんど又は全く含まずそしてデンプン粒子に対する活性をほとんど又は全く含まないα −グルコシダーゼ酵素活性を発現し、それにより細胞のマルト−オリゴサッカライド(MOS)含量を涸渇し、そしてそれにより前記生産されたα−グルカンの分枝 α−グルカン含量を非分枝α−グルカン含有量に比べて増加させることを含む方法。２．α−グルカンシンターゼ活性を有する植物細胞内で生産されるα−グルカンの分枝α−グルカン含量を変える方法であって、酵素活性をコードする核酸で植物細胞を形質転換することにより、該形質転換された植物細胞及びその子孫が、完全なデンプン粒子に対してわずかな活性を有する細胞内のマルト−オリゴサッカライドを生成する酵素活性を発現し、それにより細胞のMOS 含量を増加させ、それにより前記生産されたα−グルカンの非分枝α−グルカン含量を分枝α− グルカン含量に比べて増加させることを含む方法。３．前記酵素活性が不均化酵素を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記酵素活性がデンプンホスホリラーゼを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。５．前記α−グルコシダーゼ酵素活性が、バチルス・アミロリチクス(Bacillu s amylolyticus )のマルターゼもしくはサッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）のMAL6 座によりコードされるマルターゼ又はそれらの突然変異体、誘導体、変異体もしくはアレレにより供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記α−グルカンシンターゼ活性が粒子結合デンプンシンターゼＩ（GBSS Ｉ）活性であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．前記細胞がα−グルカンポリマー保存区画を有し、そして前記方法が、前記α−グルコシダーゼ酵素活性を前記α−グルカンポリマー保存区画に標的づけることを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記α−グルカンポリマー保存区画がアミロプラストであることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記生産されたα−グルカンが、MOS 含量が変えられていない等価の細胞のそれと異なる性質の分枝α−グルカン含量を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 10．前記α−グルカンがデンプンであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 11．前記分枝α−グルカンがアミロペクチンであることを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の方法。 12．前記生産されたα−グルカンが前記細胞から除去されることを特徴とする請求項１〜11のいずれかに記載の方法。 13．前記α−グルカンが精製されることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14．前記生産されたα−グルカンが組成物に調剤されることを特徴とする請求項１〜13のいずれかに記載の方法。 15．α−グルコシダーゼ酵素活性をコードする核酸で形質転換され、それにより該形質転換された植物細胞が、マルターゼ活性を含むがイソーマルターゼ活性をほとんど又は全く含まずそしてデンプン粒子に対する活性をほとんど又は全く含まないα−グルコシダーゼ酵素活性を発現し、それにより細胞のマルト−オリゴサッカライド(MOS)含量が涸渇され、そしてそれにより前記生産されたα−グルカンの分枝α−グルカン含量がその非分枝α−グルカン含量に関して野生型MOS レベルを有する等価の細胞と比べて増加されることを特徴とするグルカンシンターゼ活性を有するα−グルカン生産性植物細胞。 16．酵素活性をコードする核酸で形質転換され、それにより該形質転換された植物細胞が、完全なデンプン粒子に対してわずかな活性を有する細胞内のマルト −オリゴサッカライド(MOS)を生成する酵素活性を発現し、それにより細胞のMOS 含量が増加され、そしてそれにより前記生産されたα−グルカンの非分枝α− グルカン含量がその分枝α−グルカン含量に関して分枝α−グルカン含量と比べて増加されることを特徴とするグルカンシンターゼ活性を有するα−グルカン生産性植物細胞。 17．前記酵素活性が不均化酵素を含むことを特徴とする請求項16に記載の細胞。 18．前記酵素活性がデンプンホスホリラーゼを含むことを特徴とする請求項16 に記載の細胞。 19．前記α−グルコシダーゼ酵素活性が、バチルス・アミロリチクス(Bacillu s amylolyticus )のマルターゼもしくはサッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)のMAL6座によりコードされるマルターゼ又はそれらの突然変異体、誘導体、変異体もしくはアレレにより供されることを特徴とする請求項15に記載の細胞。 20．前記α−グルカンシンターゼ活性が粒子結合デンプンシンターゼＩ（GBSSＩ）活性であることを特徴とする請求項15〜19のいずれかに記載の細胞。 21．前記細胞がα−グルカンポリマー保存区画を有し、そして前記α−グルコシダーゼ酵素活性が前記α−グルカンポリマー保存区画に標的づけられることを特徴とする請求項15〜20のいずれかに記載の細胞。 22．前記α−グルカンポリマー保存区画がアミロプラストであることを特徴とする請求項21に記載の細胞。 23．前記生産されたα−グルカンが、MOS 含量が変えられていない等価の細胞のそれと異なる性質の分枝α−グルカン含量を有することを特徴とする請求項15 〜22のいずれかに記載の細胞。 24．前記α−グルカンがデンプンであることを特徴とする請求項15〜23のいずれかに記載の細胞。 25．前記分枝α−グルカンがアミロペクチンであることを特徴とする請求項15 〜24のいずれかに記載の細胞。 26．植物、植物の一部又は植物のむかご内に含まれる請求項15〜25のいずれかに記載の細胞。 27．請求項15〜26のいずれかに記載の細胞を生産する方法であって、前記酵素活性をコードする配列を有する異種核酸を植物細胞に組み込むことを含む方法。 28．中に安定に組み込まれるように、前記異種核酸を細胞のゲノム核酸で組み換えることを含む請求項27に記載の方法。 29．前記核酸がベクターの形態で導入されることを特徴とする請求項27又は28 に記載の方法。 30．請求項15〜25のいずれか一に記載の細胞を含む植物。 31．請求項30に記載の植物の有性的もしくは無性的に増殖された子孫、クローンもしくは後代である植物、又は該植物、子孫、クローンもしくは後代のいずれか一部もしくはむかご。 32．請求項31に記載の植物の一部又はむかご。 33．生産されたα−グルカンが、増加された分枝α−グルカン含量を有する、 α−グルカンシンターゼ活性を有するα−グルカン生産性細胞を含む植物を生産する方法であって、マルターゼ活性を含むがイソ−マルターゼ活性をほとんど又は全く含まずそしてデンプン粒子に対する活性をほとんど又は全く含まないα− グルコシダーゼ酵素活性をコードする異種核酸を植物細胞に組み込み、該植物細胞から植物を再生し、それにより前記植物の細胞内の細胞のマルト−オリゴサッカライド(MOS)含量が、前記α−グルコシダーゼ酵素活性を発現する細胞内で涸渇され、そしてそれにより前記生産されたα−グルカンの分枝α−グルカン含量がその非分枝α−グルカン含量に関して、野生型MOS レベルを有する等価の細胞と比べて増加されることを含む方法。 34．生産されたα−グルカンが、増加された非分枝α−グルカン含量を有する、α−グルカンシンターゼ活性を有するα−グルカン生産性細胞を含む植物を生産する方法であって、完全なデンプン粒子に対してわずかな活性を有する前記細胞内のマルト−オリゴサッカライド(MOS)を生成する酵素活性をコードする異種核酸を植物細胞に組み込み、該植物細胞から植物を再生し、それにより前記植物の細胞内の細胞のマルト−オリゴサッカライド(MOS)含量が、前記酵素活性を発現する細胞内で増加され、そしてそれにより前記生産されたα−グルカンの非分枝α−グルカン含量がその分枝α−グルカン含量に関して、野生型MOS レベルを有する等価の細胞と比べて増加されることを含む方法。 35．前記酵素活性が不均化酵素を含むことを特徴とする請求項34に記載の方法。 36．前記酵素活性がデンプンホスホリラーゼを含むことを特徴とする請求項34 に記載の方法。 37．前記植物の子孫又は後代を有性的又は無性的に増殖又は繁殖させることを含む請求項33〜36のいずれかに記載の方法。 38．請求項15〜26のいずれかに記載の細胞からα−グルカンを除去することを含むα−グルカンを得る方法。 39．請求項29〜32のいずれかに記載の植物、植物の一部又は植物の子孫からα −グルカンを除去することを含むα−グルカンを得る方法。 40．前記α−グルカンを精製することを含む請求項38又は39に記載の方法。 41．前記除去されたα−グルカンを組成物に調剤することを含む請求項38〜40 のいずれかに記載の方法。 42．前記除去されたα−グルカンがデンプンであることを特徴とする請求項38 〜41のいずれかに記載の方法。 43．植物細胞内で生産された非分枝及び／又は分枝α−グルカンの含量を変えるための前記植物細胞内のマルト−オリゴサッカライド(MOS)のレベルの変更の使用。 44．前記MOS レベルが前記細胞内のα−グルカンポリマー保存区画において変えられることを特徴とする請求項43に記載の使用。 45．前記α−グルカンポリマー保存区画がアミロプラストであることを特徴とする請求項44に記載の使用。 46．前記MOS のレベルが減少され、そして前記α−グルカンが減少したレベルの非分枝α−グルカンポリマーを有することを特徴とする請求項43〜45のいずれかに記載の使用。 47．前記MOS のレベルが減少され、そして前記α−グルカンが、MOS 含量が変えられていない等価の細胞のそれと異なる性質の分枝 α−グルカン含量を有することを特徴とする請求項43〜45のいずれかに記載の使用。 48．前記MOS のレベルが増加され、そして前記α−グルカンが増加したレベルの非分枝α−グルカンポリマーを有することを特徴とする請求項43〜45のいずれかに記載の使用。 49．前記植物細胞内で生産されたα−グルカンが前記細胞から除去されることを特徴とする請求項43〜48のいずれかに記載の使用。 50．前記α−グルカンが精製されることを特徴とする請求項49に記載の使用。 51．前記α−グルカンが組成物に調剤されることを特徴とする請求項43〜50のいずれかに記載の使用。 52．前記α−グルカンがデンプンであることを特徴とする請求項43〜51のいずれかに記載の使用。 53．請求項１〜42のいずれかにより供される又はいずれかに記載の細胞、植物、又は植物の一部もしくはむかごを処理することによって生産されるα−グルカン。 54．デンプンである請求項53に記載のα−グルカン。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] December 4, 1997 [Details of Amendment] Claims 1. A method for changing the branched α-glucan content of α-glucan produced in a plant cell having α-glucan synthase activity, comprising transforming a plant cell with a nucleic acid encoding α-glucosidase enzyme activity, The transformed plant cells and progeny thereof express an α-glucosidase enzyme activity that contains maltase activity, but little or no iso-maltase activity, and little or no activity on starch particles, whereby the cell Depleting the malto-oligosaccharide (MOS) content of the resulting α-glucan and thereby increasing the branched α-glucan content of the produced α-glucan relative to the unbranched α-glucan content. 2. A method for changing the content of branched α-glucan of α-glucan produced in a plant cell having α-glucan synthase activity, said method comprising transforming a plant cell with a nucleic acid encoding an enzyme activity. Plant cells and their progeny express the enzymatic activity to produce intracellular malto-oligosaccharides with little activity on intact starch particles, thereby increasing the cell's MOS content, thereby increasing the A method comprising increasing the unbranched α-glucan content of the produced α-glucan relative to the branched α-glucan content. 3. 3. The method of claim 2, wherein said enzymatic activity comprises a disproportionate enzyme. 4. The method of claim 2, wherein the enzymatic activity comprises starch phosphorylase. 5. The α- glucosidase enzyme activity, maltase, or mutants thereof encoded by the MAL6 locus of maltase or Saccharomyces carlsbergensis Bacillus Amirorichikusu (Bacillu s amylolyticus) (Saccharomyces carlsbergensis ), derivatives, by variant or allele The method of claim 1 provided. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the α-glucan synthase activity is particle-bound starch synthase I (GBSS I) activity. 7. 7. The method of claim 6, wherein said cells have an α-glucan polymer storage compartment, and wherein said method comprises targeting said α-glucosidase enzyme activity to said α-glucan polymer storage compartment. . 8. The method of claim 7, wherein the α-glucan polymer storage compartment is amyloplast. 9. 9. The method according to any of the preceding claims, wherein the produced [alpha] -glucan has a branched [alpha] -glucan content of a property different from that of equivalent cells whose MOS content has not been changed. Ten. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the α-glucan is starch. 11． The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the branched α-glucan is amylopectin. 12． The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the produced α-glucan is removed from the cells. 13. 13. The method according to claim 12, wherein the α-glucan is purified. 14. 14. The method according to any one of claims 1 to 13, wherein the produced α-glucan is formulated into a composition. 15． Transformed with a nucleic acid encoding an α-glucosidase enzyme activity, whereby the transformed plant cells contain maltase activity but little or no iso-maltase activity and little or no activity on starch particles. expresses α-glucosidase enzyme activity, thereby depleting the malto-oligosaccharide (MOS) content of the cell, and thereby reducing the branched α-glucan content of the produced α-glucan to its unbranched α-glucan content. An α-glucan producing plant cell having glucan synthase activity, characterized in that its content is increased compared to equivalent cells having wild-type MOS levels. 16． The enzymatic activity which is transformed with the nucleic acid encoding the enzymatic activity, such that the transformed plant cells produce intracellular malto-oligosaccharides (MOS) with little activity on intact starch particles. Expression, thereby increasing the MOS content of the cell, and thereby increasing the unbranched α-glucan content of the produced α-glucan relative to its branched α-glucan content relative to the branched α-glucan content Α-glucan-producing plant cells having glucan synthase activity. 17． 17. The cell according to claim 16, wherein the enzyme activity includes a disproportionation enzyme. 18． 17. The cell according to claim 16, wherein said enzymatic activity comprises starch phosphorylase. 19. The α- glucosidase enzyme activity, maltase, or mutants thereof encoded by the MAL6 locus of maltase or Saccharomyces carlsbergensis Bacillus Amirorichikusu (Bacillu s amylolyticus) (Saccharomyces carlsbergensis ), derivatives, by variant or allele 16. The cell according to claim 15, which is provided. 20. The cell according to any one of claims 15 to 19, wherein the α-glucan synthase activity is a particle-bound starch synthase I (GBSSI) activity. twenty one. 21. The cell of any of claims 15-20, wherein the cell has an [alpha] -glucan polymer storage compartment, and wherein the [alpha] -glucosidase enzyme activity is targeted to the [alpha] -glucan polymer storage compartment. twenty two. 22. The cell of claim 21, wherein the [alpha] -glucan polymer storage compartment is amyloplast. twenty three. 23. A cell according to any of claims 15 to 22, wherein the produced α-glucan has a branched α-glucan content of a different nature than that of an equivalent cell in which the MOS content has not been changed. twenty four. The cell according to any one of claims 15 to 23, wherein the α-glucan is starch. twenty five. The cell according to any one of claims 15 to 24, wherein the branched α-glucan is amylopectin. 26. The cell according to any one of claims 15 to 25, which is contained in a plant, a part of a plant, or a pot of a plant. 27. 27. A method for producing a cell according to any of claims 15 to 26, comprising incorporating a heterologous nucleic acid having a sequence encoding said enzymatic activity into a plant cell. 28. 28. The method of claim 27, comprising recombinating said heterologous nucleic acid with a genomic nucleic acid of a cell so that it is stably integrated therein. 29. The method according to claim 27, wherein the nucleic acid is introduced in the form of a vector. 30. A plant comprising the cell according to any one of claims 15 to 25. 31. 31. A plant that is a sexually or asexually grown progeny, clone or progeny of the plant of claim 30, or any part or bud of the plant, progeny, clone or progeny. 32. A part of a plant or a mulberry according to claim 31. 33. A method for producing a plant comprising α-glucan-producing cells having α-glucan synthase activity, wherein the produced α-glucan has an increased branched α-glucan content, wherein the plant comprises maltase activity, A heterologous nucleic acid encoding an α-glucosidase enzyme activity having little or no maltase activity and little or no activity on the starch particles is incorporated into the plant cells and the plant is regenerated from said plant cells, whereby the plant The malto-oligosaccharide (MOS) content of the cells within the cell is depleted in the cells expressing the α-glucosidase enzyme activity, and the branched α-glucan content of the produced α-glucan reduces its non-cellular content. A method comprising increasing with respect to branched α-glucan content compared to equivalent cells having wild-type MOS levels 34. A method for producing a plant comprising α-glucan-producing cells having α-glucan synthase activity, wherein the produced α-glucan has an increased unbranched α-glucan content, comprising the steps of: Heterologous nucleic acid encoding an enzymatic activity to produce malto-oligosaccharides (MOS) in the cells having little activity on the other hand is incorporated into the plant cells, and the plant is regenerated from the plant cells, whereby the plant cells are regenerated. The malto-oligosaccharide (MOS) content of the cell is increased in the cells expressing the enzyme activity, and the unbranched α-glucan content of the produced α-glucan increases its branched α-glucan content. A method comprising increasing with respect to content relative to equivalent cells having wild-type MOS levels. 35. 35. The method of claim 34, wherein said enzymatic activity comprises a disproportionate enzyme. 36. 35. The method of claim 34, wherein said enzymatic activity comprises starch phosphorylase. 37. 37. The method according to any of claims 33 to 36, comprising sexually or asexually growing or breeding the progeny or progeny of said plant. 38. A method for obtaining α-glucan, comprising removing α-glucan from the cell according to any one of claims 15 to 26. 39. A method for obtaining α-glucan, comprising removing α-glucan from the plant, part of the plant, or progeny of the plant according to any one of claims 29 to 32. 40. 40. The method of claim 38 or 39, comprising purifying the [alpha] -glucan. 41. 41. The method according to any of claims 38 to 40, comprising formulating the removed [alpha] -glucan into a composition. 42. 42. The method according to any one of claims 38 to 41, wherein the α-glucan removed is starch. 43. Use of altering the level of malto-oligosaccharides (MOS) in said plant cells to alter the content of unbranched and / or branched α-glucans produced in said plant cells. 44. 44. The use according to claim 43, wherein said MOS level is varied in an α-glucan polymer storage compartment in said cell. 45. 45. The use according to claim 44, wherein the [alpha] -glucan polymer storage compartment is amyloplast. 46. 46. Use according to any of claims 43 to 45, wherein the level of the MOS is reduced and the [alpha] -glucan has a reduced level of unbranched [alpha] -glucan polymer. 47. 46. The method of any of claims 43 to 45, wherein the level of the MOS is reduced and the α-glucan has a branched α-glucan content of a different nature than that of an equivalent cell in which the MOS content has not been altered. Use as described in Crab. 48. 46. Use according to any of claims 43 to 45, wherein the level of the MOS is increased and the [alpha] -glucan has an increased level of unbranched [alpha] -glucan polymer. 49. 49. Use according to any of claims 43 to 48, characterized in that [alpha] -glucan produced in said plant cells is removed from said cells. 50. 50. The use according to claim 49, wherein the [alpha] -glucan is purified. 51. 51. Use according to any of claims 43 to 50, wherein the [alpha] -glucan is formulated in a composition. 52. 52. Use according to any one of claims 43 to 51, wherein the [alpha] -glucan is starch. 53. An α-glucan provided by or according to any one of claims 1 to 42 or produced by treating a part or a basket of a plant. 54. 54. The α-glucan according to claim 53, which is starch.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. A method for producing α-glucan in a cell having α-glucan synthase activity, comprising controlling the content of malto-oligosaccharide (MOS) in the cell. 2. The method of claim 1, wherein the α-glucan synthase activity is particle-bound starch synthase I (GBSS I) activity. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the production of the α-glucan by the α-glucan synthase activity is modified by a change in MOS content. 4. 4. The method of claim 3, wherein said cells have an [alpha] -glucan polymer storage compartment, and wherein said method comprises modulating a MOS content in said [alpha] -glucan polymer storage compartment. 5. The method of claim 4, wherein the α-glucan polymer storage compartment is amyloplast. 6. The method according to any one of the preceding claims, comprising adjusting the MOS content such that the produced α-glucan has a controlled content of unbranched and / or branched α-glucan. Method. 7. 7. The method of claim 6, comprising adjusting the MOS content such that the produced α-glucan has a reduced level of unbranched α-glucan polymer. 8. 7. The method according to claim 6, further comprising adjusting the MOS content such that the produced α-glucan has a branched α-glucan content having a property different from that of an equivalent cell in which the MOS content is not controlled. The described method. 9. 9. The method according to claim 7, wherein the MOS content is adjusted using an enzyme using MOS as a substrate. Ten. The method of claim 9, wherein the level of the MOS is reduced. 11． The method according to claim 9 or 10, wherein the enzyme is not GBSSI. 12． 11. The method according to claim 9 or 10, wherein the enzyme is an [alpha] -glucosidase (EC 3.2.1.20) having a relatively strong maltase activity (i.e. low Km for maltose). 13. The enzyme is maltase encoded by Bacillus amylolyticus ( Bacillus amylolyticus ) maltase or Saccharromyces carl sbergensis ( Saccharromyces carl sbergensis ) MAL6 locus, or a mutant, derivative, mutant or allele thereof. The method according to claim 9, wherein: 14. 9. The method according to claim 6, wherein the level of the MOS is increased. 15． 15. The method of claim 14, wherein the level of MOS is increased by an enzyme that generates MOS in the cell. 16． 16. The method according to claim 15, wherein the enzyme is β-amylase, α-amylase, disproportionating enzyme, branching enzyme or starch phosphorylase. 17． 17. The method according to claim 15 or 16, wherein the enzyme has low or negligible activity on whole starch particles. 18． 14. The method according to any one of claims 9 to 13, comprising incorporating a nucleic acid encoding a product of the enzyme into the cell. 19. 18. The method according to any one of claims 15 to 17, comprising incorporating a nucleic acid encoding a product of the enzyme into the cell. 20. The method according to any of the preceding claims, wherein the produced α-glucan is removed from the cells. twenty one. 21. The method according to claim 20, wherein the α-glucan is purified. twenty two. The method according to claim 20, wherein the α-glucan is formulated in a composition. twenty three. The method according to any of the preceding claims, wherein the α-glucan is starch. twenty four. The method according to any of the preceding claims, wherein the unbranched α-glucan is amylose. twenty five. The method according to any of the preceding claims, wherein the branched α-glucan is amylopectin. 26. An α-glucan-producing cell having glucan synthase activity, wherein the intracellular MOS content is regulated and the α-glucan content is altered compared to equivalent cells having wild-type MOS levels. 27. 27. The cell of claim 26, comprising a heterologous nucleic acid of a sequence that expresses an enzyme that uses MOS as a substrate. 28. 27. The cell according to claim 26, comprising a heterologous nucleic acid having a sequence that expresses an enzyme that produces MOS. 29. 29. The cell according to any one of claims 26 to 28, which is contained in a plant, a part of a plant, or a plant basket. 30. 29. The method for producing a cell according to claim 27 or 28, comprising incorporating a heterologous nucleic acid having a sequence encoding a MOS regulatory enzyme into the cell. 31. 31. The method of claim 30, comprising recombining said heterologous nucleic acid with said cellular genomic nucleic acid so as to be stably integrated therein. 32. 32. The method according to claim 30, wherein the nucleic acid is introduced in the form of a vector. 33. The method according to any one of claims 30 to 32, wherein the α-glucan is starch. 34. The method according to any of claims 30 to 33, wherein the unbranched α-glucan is amylose. 35. The method according to any one of claims 30 to 34, wherein the branched α-glucan is amylopectin. 36. A plant comprising the cell according to any one of 26 to 28. 37. 37. A sexually or asexually grown progeny, clone or progeny of the plant of claim 36, or any part or basket of said plant, progeny, clone or progeny. 38. A part of a plant or a mulberry according to claim 36. 39. Α-glucan producing cells having glucan synthase activity, wherein the MOS content in the cells is regulated and the α-glucan content is altered as compared to equivalent cells having wild-type MOS levels A method for producing a plant containing sex cells, comprising the steps of incorporating a heterologous nucleic acid having a sequence encoding a MOS regulatory enzyme into a plant cell, and regenerating the plant from the plant cell. 40. 40. The method of claim 39, wherein the heterologous nucleic acid when in the plant cell expresses an enzyme that uses MOS as a substrate. 41. 40. The method of claim 39, wherein the heterologous nucleic acid when in a cell of the plant expresses an enzyme that produces MOS. 42. 42. The method according to any one of claims 39 to 41, comprising sexually or asexually growing or breeding the progeny or progeny of the plant. 43. A method for obtaining α-glucan, comprising removing α-glucan from the cell according to any one of claims 26 to 29. 44. A method for obtaining α-glucan, comprising removing α-glucan from a plant, a part of a plant, or a pot of a plant according to any one of claims 36 to 38. 45. 45. The method according to claim 43 or 44, comprising purifying the α-glucan. 46. The method according to any of claims 43 to 45, comprising formulating the removed α-glucan into a composition. 47. The method according to any of claims 43 to 46, wherein the α-glucan removed is starch. 48. An α-glucan produced by treating a cell, a plant, or a part of a plant or a basket, provided or described in any one of claims 1 to 42. 49. 50. The α-glucan according to claim 48, which is starch. 50. By expressing in said cells at least one of which is exogenous to the cell, (a) a suitable enzyme capable of modulating the MOS content and (b) a suitable enzyme capable of carbohydrate polymer synthesis. A transformed cell having a modified carbohydrate composition obtainable. 51. 51. The transformed cell according to claim 50, wherein said enzyme (a) can use MOS as a substrate. 52. 52. The transformed cell according to claim 50, wherein the enzyme (b) has an α-glucan synthase activity. 53. 53. The transformed cell of claim 52, wherein said α-glucan synthase activity is capable of modifying a branched α-glucan polymer. 54. 54. The transformed cell according to claim 53, wherein the α-glucan synthase activity is GBSSI activity. 55. 55. The transformed cell according to any of claims 50 to 54, wherein the enzyme capable of regulating the MOS content or using MOS as a substrate comprises: (a) a relatively strong maltase activity (i.e. lower Km) and having α- glucosidase for maltose (EC 3.2.1.20); (b) maltase or a mutant of Bacillus Amirorichikusu (Bacillus amylolyticus), derivatives, variants or allele; (c) with (d) is lower than the full α- glucan particles or slight activity; maltase or a mutant thereof encoded by MAL6 locus of Saccharomyces carlsbergensis (Saccharomyces carlsberge nsis), derivatives, variants or allele β-amylase; (e) α-amylase having low or little activity on intact α-glucan particles; f) a disproportionating enzyme having low or little activity on intact α-glucan particles; (g) a debranching enzyme having low or little activity on intact α-glucan particles; and (h) A transformed cell, characterized in that it is selected from starch phosphorylase having low or little activity on intact α-glucan particles. 56. Transformed cells with regulated MOS content. 57. The cell according to any one of claims 50 to 56, which is a plant cell. 58. 58. The cell of claim 57 which is cereal endosperm, cassava tuber, potato tuber or pea germ cells. 59. The cell according to claim 57 or 58, which is contained in a plant. 60. A plant comprising the cell according to claim 57 or 58. 61. A sexually or asexually grown progeny, clone or progeny of the plant of claim 60 or any part or basket of said plant, progeny, clone or progeny. 62. 61. The part of the plant or the mulberry according to claim 60. 63. A method of producing carbohydrate in a transformed cell, comprising regulating the amount of MOS in the transformed cell that contains an enzymatic activity capable of synthesizing a carbohydrate polymer, and then extracting the carbohydrate from the transformed cell. Including methods. 64. A method for producing carbohydrates in transformed cells, comprising regulating the amount of intracellular MOS by expressing appropriate glucoamylase activity in cells containing starch synthase activity capable of modifying amylose and / or amylopectin. And then extracting the carbohydrate from the transformed cells. 65. A method for producing carbohydrates in transformed cells, wherein the cells express a suitable α-glucosidase (EC 3.2.1.220) activity in cells containing a starch synthase activity capable of modifying amylose and / or amylopectin. Controlling the amount of MOS in the cell by extracting the carbohydrate from the transformed cell. 66. The method according to any one of claims 63 to 65, wherein the transformed cell is a plant cell. 67. 67. The method of claim 66, wherein said plant cells are comprised in a plant. 68. 67. The method of any of claims 63-66, comprising dispensing the carbohydrate into a composition after the extraction.