JPH10507362A - Ｈｅｒ４ヒトレセプタチロシンキナーゼ - Google Patents

Ｈｅｒ４ヒトレセプタチロシンキナーゼ

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JPH10507362A JP8513469A JP51346996A JPH10507362A JP H10507362 A JPH10507362 A JP H10507362A JP 8513469 A JP8513469 A JP 8513469A JP 51346996 A JP51346996 A JP 51346996A JP H10507362 A JPH10507362 A JP H10507362A
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Abstract

(57)【要約】 HER4/p180erbB4と命名された表皮増殖因子レセプタに関連する新規レセプタチロシンキナーゼの、分子クローニング、発現および生物学的特徴付けを記載する。乳癌細胞の細胞分化を誘発できるHER4リガンドをも開示する。幾つかのヒトの癌および神経および筋肉起源の幾つかの組織におけるHER4の発現の観点から、HER4−由来のおよびHER4−関連生物学的組成物の種々の診断並びに治療的利用法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 HER4ヒトレセプタチロシンキナーゼ 本出願は、1993年11月10日付けで出願された米国特許出願第08/150,704号の一 部継続出願であり、後者はまた1992年11月24日付けで出願された米国特許出願第 07/981,165号の一部継続出願であり、これら特許出願各々の全記載を本明細書に 組み入れる。 1．序論 本発明は、一般的にはHER4/p180erbB4(HER4)と呼ばれる表皮増殖因子に関連す る、新規なレセプタチロシンキナーゼ、およびHER4−由来のまたはHER4−関連生 物学的成分を含む新規な診断並びに治療組成物を意図するものである。本発明は 、一部にはヒトHER4、その完全なヌクレオチドコード配列および該HER4レセプタ タンパクの機能的特性に基づくものである。より具体的には、本発明は、例えば HER4をコードするポリヌクレオチド分子、HER4ポリペプチ、HER4ポリペプチのエ ピトープを認識する抗−HER4抗体、HER4と相互作用するリガンドを含む、HER4生 体関連物質(biologics)、および基本的にはこのような分子に基づく診断および 治療用組成物並びに方法を意図する。数種のヒト癌および神経および筋肉由来の 幾つかの組織におけるHER4の発現の観点から、本発明は効果的な生物学的療法を 工夫することを可能とする体系を提供する。以下、部分的には、本発明の種々の 局面およびその特定の態様を具体的に例示する実験例によって、本発明を詳細に 説明する。 2．発明の背景 実質上全ての型の細胞が、固有のチロシンキナーゼ活性〔これを介して種々の 成長並びに分化因子が、ある範囲に及ぶ生物学的作用を媒介する（アーロンソン (Aaronson)，Science，1991，254:1146-52に概説されている)]をもつ、貫膜レセ プタ分子を発現している。この群のレセプタチロシンキナーゼ(RTKs)に含まれる のは、ポリペプチド成長因子、例えば表皮増殖因子(EGF)、インシュリン、血小 板由来の増殖因子(PDGF)、ニューロトロフィン（即ち、NGF)および繊維芽細胞成 長因子(FGF)に対するレセプタである。最近、以前に特徴付けされた、幾つかの レセプタに対するリガンドが同定された。これらは、c-キット(c-kit: 幹細胞因 子)、met(肝細胞成長因子)、trk(神経成長因子)(それぞれ、ツェボ(Zsebo)等，C ell，1990，63:195-201; ボッタルド(Bottardo)等，Science，1991，251:802-04 ; およびカプラン(Kaplan)等，Nature，1991，350:158-160を参照のこと)に対す るリガンドを包含する。更に、可溶性因子NDF、またはヒレグリン−α(HRG−α) が、HER4と高い関連性をもつレセプタであるHER2に対するリガンドとして同定さ れた（ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-72;ヘルメス(Holmes)等，Science，19 92，256:1205-10）。 該ヒレグリンは、初めHER2に対する特異的リガンドとして単離された、一群の 分子である(ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-72;ホルメス(Holmes)等，Scienc e，1992，256:1205-10; フォールズ(Falls)等，Cell，1993，72:801-815;および マルチオニ(Marchionni)等，Nature，1993，362:312-318)。ラットの同族体はHE R2/Neuとの相互作用を通して、乳癌細胞の分化を誘発する、該同族体の能力に基 づいて、Neu 分化因子(NDF)と命名された（ベン(Wen)等の上記文献）。ヒレグリ ンは、また神経由来の細胞中でのその豊富な発現および２つの最近特徴付けされ たニューロトロフィン活性をコードするヒレグリン遺伝子の交互スプライス形状 を識別することに基づいて、神経系の発生並びに維持において重要な役割を演ず ると考えられている。神経由来の因子の一つは、アセチルコリンレセプタ誘起活 性(ARIA)と呼ばれる（フォールズ等の上記文献）。このヒレグリンイソタイプは 、神経筋接合部を形成する際に、神経伝達物質受容体合成の刺激の原因となる。 第二の因子は、グリア増殖因子(GGF)と呼ばれ、これはこの分子の、中枢および 末梢神経系内のグリア細胞に対して、増殖的影響を及ぼすことを反映する（マル チオニ(Marchionni)等の上記文献）。ヒレグリンのイソ型であると考えられる、 付随的で、しかもあまり特徴付けされていない分子はp45、gp30およびp75 を含 む（ループ(Lupu)等，Science，1990，249:1552-1555; ループ(Lupu)等，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，1992，89:2287-2291）。 幾つかのHER4−中和抗体は、ヒト乳癌細胞のヒレグリン活性化を阻止すること ができない。ヒレグリンは胸部、結腸および神経起源の細胞中のHER2のチロシン ホスホリル化のみを活性化し、組み換えHER2を過度に発現する繊維芽細胞または 卵巣細胞系における該活性化を行わない（ペレス(Peles)等，EMBO J.，1993，12 :961-971）。 成長因子−レセプタチロシンキナーゼシグナル通路における種々のヒト悪性腫 瘍と遺伝的異常との間の生物学的関係が存在することが知られている。最も顕著 なこの種の関係は、特にレセプタチロシンキナーゼのEFG レセプタ(EFGR)群を包 含する（アーロンソンの上記文献）。３種のヒトEGFR群の構成員、即ちEGFR、HE R2/P185erbB2およびHER2/P160erbB3が同定され、かつ当業者には知られている（ それぞれ、ウルリッヒ(Ullrich)等，Nature，1984，309:418-25; クーセンズ(Co ussens)等，Science，1985，230:1132-39; プローマン(Plowman)等，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，1990，87:4905-09）。他の種からのEGFR−関連分子も同定さ れている。 他のEGFR−群の構成員の完全ヌクレオチドコード配列も、他の生物から決定さ れており、それはショウジョウバエEGFR(“DER”: リブネ(Livneh)等，Cell，19 85，40:599-607)、線虫EGFR(“let-23”:アロイアン(Aroian)，Nature，1990，3 48:693-698)、鶏EGFR(“CER”: ラックス(Lax)等，Mol．Cell Biol.，1988，8:1 970-1978)、ラットEGFR(ペッチ(Petch)等，Mol．Cell Biol.，1990，10:2973-29 82)、ラットHER2/Neu(バーグマン(Bargmann)等，Nature，1986，319:226-230)お よび魚類から単離され、キシフォフォラス(Xiphophorus)メラノーマ関連キナー ゼと呼ばれる新規な構成員を含む(“Xmrk”:ウイットブロット(Wittbrodt)等，N ature，1989，342:415-421)。更に、PCR 技術は、新規なレセプタをコードする ことができ、あるいは公知のレセプタの種−特異的同族体を表す、他の短いDNA フラグメントの単離に導いた。最近の一例は、該EGFR群と最も関係の深い54アミ ノ酸をコードするフラグメントである、tyro-2(ライC.＆レムケG.(Lai，C．& Le mke，G.)，Neuron，1991，6:691-704)の単離である。 EGFR−群レセプタの過剰発現が、しばしば種々の活動的なヒト表皮癌に見られ る。特に、EGFRの高い発現は、より活発な乳癌、膀胱癌、肺癌および胃癌と関連 している（例えば、ニール(Neal)等，Lancet，1985，1:366-68; セインスバリー (Sainsburry)等，Lancet，1987，1:1398-1402;ヤスイ(Yasui)等，Int．J．Cance r，1988，41:211-17;ベール(Veale)等，Cancer，1987，55:513-16 を参照のこと ）。更に、HER2の増幅および過剰発現は広範囲のヒト悪性腫瘍、特に乳癌および 卵巣癌と関連しており、そのためにHER2の過剰発現と低い臨床上の予後および／ または高い再発確率との間に強い相関が存在することが確立されている（例えば 、スラモン(Slamon)等，Science，1987，235:177-82; Science，1989，244:707- 12を参照のこと）。HER2の過剰発現は、また胃、子宮内膜、唾液腺、膀胱および 肺の癌を包含する他のヒト癌と相関関係をもっている（ヨコタ(Yokota)等，Lanc et，1986，1:765-67; フクシギ(Fukushigi)等，Mol．Cell Biol.，1986，6:955- 58; ヨネムラ(Yonemura)等，Cancer Res.，1991，51:1034; ウエイナー(Weiner) 等，Cancer Res.，1990，50:421-25;ゲリン(Geurin)等，Oncogene Res.，1988， 3:21-31;センバ(Semba)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，82:6497-6501; ゾー(Zhau)等，Mol．Carcinog.，1990，3:354-57; マッカン(McCann)等，Cancer ，1990，65:88-92を参照）。極最近、HER2の過剰発現と胃癌との間には、強い関 連性があることが報告された(ジェンヌ(Jaehne)等，J．Cancer Res．Clin．Onco l.，1992，118:474-79)。最後に、最近報告されたHER3レセプタの、増幅された 発現が、広範なヒト腺癌において観測された（ポラー(Poller)等，J．Path.，19 92，168:275-280;クラウス(Krause)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1989，86 :9193-97; 1991年９月４日付けの欧州特許出願第91301737号、EP 444 961号）。 EGFRに特異的に結合することのできる、幾つかの構造的に関連した可溶性のポ リペプチドが同定され、かつ特徴付けされており、これらはEGF 、トランスフォ ーミング増殖因子−α(TGF−α)、アンフィレグリン(amphiregulin: AR)、ヘパ リン−結合EGF(HB-EGF)およびワクシニアウイルス成長因子(VGF)(それぞれ、サ バージ(Savage)等，J．Biol．Chem.，1972，247:7612-21;マーカート(Marquardt )等，Science，1984，223:1079-82;ショヤブ(Shoyab)，Science，1989，243:107 4-76;ヒガシヤマ(Higashiyama)等，Science，1991，251:936-39;ツバルツィック (Twardzik)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，82:5300-04を参照)。EGFR− 群のレセプタにおける、この厳密な構造上の関連性にも拘らず、これらリガンド の何れについても、最終的にHER2またはHER3と相互作用することが示されてはい ない。 最近、幾つかのグループがHER2に対する特異的リガンドを同定したことを報告 した。これらリガンドの幾つか、例えばgp30(ループ(Lupu)等，Science，1990， 249:1552-55; バクス(Bacus)等，Cell Growth and Differentiation，1992，3:4 01-11)が、EGFRおよびHER2両者と相互作用し、一方でその他のものはHER2と特異 的に結合することを報告している(ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-72;ペレス (Peles)等，Cell，1992，69:205-16;ホルムス(Holmes)等，Science，1992，256: 1205-10;ループ(Lupu)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1992，89:2287-91;フ アン(HUANG)等，J．Biol．Chem.，1992，276:11508-121)。これらリガンドのう ちで最も良く特徴付けされているものは、ras-形質転換Rat1-EJ 細胞から精製さ れ、クローン化されたneu分化因子((NDF)(ベン(Wen)等およびペレス(Peles)等の 上記文献)、およびヒトMDA-MB-231細胞から精製され、クローン化されたヒレグ リン(HRG−α、−β1、−β2、−β3(ホルムス(Holmes)等の上記文献)である。NDF およびHRG-αは、93% の配列同一性を有し、また同一のタンパクのラットとヒ トとの相同性体であると考えられる。これらタンパクは両方共に、同様なサイズ (44-45kDa)をもち、MDA-MB-453細胞中のHER2のチロシンホスホリル化を高め、か つEGF-レセプタではなく、またヒト乳癌細胞についての架橋の研究において、HE R2と結合することが報告されている。更に、NDF はヒト乳腺腫瘍細胞のミルク− 産生、成長−阻害細胞への分化を誘発することが示され、一方該ヒレグリン群は 、培養されたヒト乳癌細胞単層の増殖を刺激することが報告されている。 興味あることに、該ヒレグリン群の構成員は多くの乳腺癌細胞系内のHER2のチ ロシンホスホリル化を刺激することができるが、卵巣癌細胞系SKOV3 またはHER2 でトランスフェクションされた繊維芽細胞中のこのレセプタに作用することはで きない(ペレス(Peles)等，EMBO J.，1993，12:961-971)。これらの観測は、HER2 を活性化するヒレグリンに対する他のレセプタの存在を示唆している。該レセプ タチロシンキナーゼ群の構成員間のこのような交叉−活性化は、既に報告されて おり、またリガンドにより誘発されるレセプタヘテロダイマー化事象により生ず るものと考えられている（ワダ(Wada)等，Cell，1990，61:1339-1347）。最近に なって、HER3がヒレグリンに結合することが報告され(キャラウエイ(Carraway) 等，J．Biol．Chem.，1994，269:14303-14306)、また実際にこのレセプタがHER2 の該ヒレグリン−媒介チロシンキナーゼ活性化に関与しているものと考えられて いる(キャラウエイ等の上記文献およびスリウコウスキー(Sliwkowski)等，J．Bi ol．Chem.，1994，269:14661-14665)。 リガンド結合に応答して、レセプタポリペプチドが調節シグナルを導入する手 段は十分には理解されておらず、かつ依然として徹底的な検討の課題となってい る。しかしながら、この過程における重要な要素は、明らかにされつつあり、そ の例は、細胞表面レセプタおよびこれによるホスホリル化が、シグナル導入にお いて基本的な役割を保持しているという認識を包含する。このシグナル過程にお けるホスホリル化の関与に加えて、レセプタダイマー化およびレセプタクロスト ークという細胞内現象は、回路の主要な要素として機能し、該回路を介して、リ ガンド結合が結果的な細胞応答の引き金となる。貫膜レセプタチロシンキナーゼ に対するリガンドの結合は、レセプタのダイマー化を誘起し、隣接する細胞質ド メインの相互作用を介する、キナーゼ機能の活性化に導く。レセプタクロストー クとは、例えば或るレセプタの、他のレセプタのキナーゼ活性化を含むメカニズ ムを通して活性化することにより媒介される、２またはそれ以上の近接レセプタ 分子間の細胞内の連絡を意味する。このような現象の特に関係深い一つの例はEG F とEGFRとの結合であり、これは該EGFRキナーゼドメインおよびHER2の交叉−ホ スホリル化の活性化をもたらす(コーカイ(Kokai)等，Cell，1989，58:287-92;ス ターン(Stern)等，EMBO J.，1988，7:995-1001;キング(King)等，Oncogene，198 9，4:13-18)。 3．発明の概要 HER4は、レセプタチロシンキナーゼのEGFR−群の第四の構成員であり、かつ正 常な細胞機能ばかりでなく、幾つかのヒト癌と関連する正常な増殖調節の喪失に も関与していると考えられる。この点に関連して、HER4は表皮を起源とする幾つ かの癌、例えば乳房の腺癌と密接な関連性をもつものと思われる。該HER4自体、 HER4コード配列の発見並びにその解明は、この細胞表面レセプタの異常発現およ び／または機能が含まれる、ヒト癌の診断並びに治療に関する多数の新規な研究 を展開させた。 本発明の始原型HER4ポリペプチドをコードする完全なヌクレオチド配列を本明 細書に開示し、以下に述べる本発明のいくつかの一般的な局面に関する基礎を与 える。即ち、本発明はHER4ポリヌクレオチド分子の並びに利用に直接係わる態様 を包含する。更に、本発明はHER4ポリペプチド、例えば以下の章に記載され、か つ特徴付けされる、該始原型のHER4ポリペプチドを提供する。該始原型のHER4分 子とほぼ等価な構造上の特性をもつポリペプチドも、本発明の範囲に含まれる。 更に、本発明は、幾つかの細胞表面上で発現されるHER4と相互作用して、結果的 にその成長および／または分化に影響を与えるポリペプチドをも包含する。 本発明は、また抗−HER4抗体をも意図し、該抗体は種々の用途をもち、例えば本 発明により提供されるヒト癌診断および治療のための新規な生物学的研究で利用 できるが、これらに限定されない。 本発明は、更にHER4リガンドの同定およびその精製方法にも関連する。 本発明は、更にHER4とHER2との間の見掛け上の機能的相関の発見に関わり、ま た本発明の治療上の特徴は、この関係の出願人による予備的理解に基づくものを 包含する。出願人のデータは、HER4とHER2とが、ヘテロダイマー形成またはレセ プタクロストークの何れかによって相互作用することを強く示唆しており、また 該HER4レセプタが細胞挙動に及ぼす作用を媒介するメカニズムのひとつが、この ような相互作用であると考えられる。逆の結果は、HER2の活性化が、幾つかの情 況下では、HER4を通して媒介されることである。 これに関して、ヒレグリンは、HER2およびHER4を発現する細胞内の、HER2のホ スホリル化を誘発すると思われる。ヒレグリンは直接HER2を刺激しないが、HER4 のチロシンホスホリル化を刺激することにより、作用する。 該ヒレグリンシグナル導入路の第一の要素としての、HER4の認識は、ヒト癌の 診断および治療のための新規な多数の研究を展開させる。該癌においては、ヒレ グリンおよび／またはHER4の異常な発現および／または機能が含まれる。かくし て、本発明の治療的局面は、HER4リガンドまたはHER4レセプタ自体に対するアン タゴニスト、アゴニストまたは抗体による、HER2およびHER4に及ぼすリガンドの 作用を媒介することを含む。 本発明は、またHER4発現腫瘍細胞を特異的に標的とし、かつこれを殺すキメラ タンパク、このようなキメラタンパクをコードするポリヌクレオチド、および癌 および他のヒト悪性腫瘍の診断、治療両者において利用する方法にも関連する。 出願人のデータは、このような組み換えキメラタンパクが、該HER4レセプタと特 異的に結合し、かつ表面にHER4を発現する腫瘍細胞に対して細胞毒性をもつこと を立証している。該分子の細胞−結合部分の特異性および該毒素部分の潜在的細 胞毒性両者の二官能の保持性は、該タンパクを極めて強力な標的試薬とする。 本発明は、更に癌細胞上での、HER4指向性細胞毒性物質の該細胞毒性活性の測 定を可能とし、かくして強力な診断手段を与える方法にも関連し、これは該タン パクの治療的利用に先立って、個々の悪性腫瘍に及ぼす、これら物質の有効性の 予後のために特に興味ある。 4．図面の簡単な説明 第1/1 〜1/5 図は、ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:1]および位置34〜3961のコ ード配列をもつHER4の推定されたアミノ酸配列(1308個のアミノ酸配列)[SEQ ID NO:2]を示す。ヌクレオチド番号は左側に与えられ、アミノ酸の番号は配列上方 にある。 第2/1 〜2/4 図は、ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:3]および交互3'末端をもち および自己ホスホリル化ドメインをもつHER4をコードするcDNAの推定されたアミ ノ酸配列[SEQ ID N0: 4]を示す。この配列はヌクレオチド3168まで、第1/1 〜1/ 5 図に示したHER4の配列と等価であり、ここで該配列の一致性はなくなり、該読 み取り枠は13アミノ酸後方で終端し、伸びた固有の3'- 未翻訳領域を伴う。 第3/1 〜3/3 図は、ヌクレオチド配列[SEQ ID NO: 5]および切頭N-末端をもつ HER4をコードするcDNAの推定されたアミノ酸配列[SEQ ID NO: 6]を示す。この配 列は該HER4配列の3'−部分を含み、ここで該切頭配列のヌクレオチド位置156 は 第1/1 〜1/5 図に示された完全なHER4配列の位置2335(該HER4キナーゼのATP-結 合サイトをコードする領域から丁度下流側)と整合する。該切頭配列の初めの155 個のヌクレオチドは、HER4に固有のもので、また該HER4遺伝子のイントロン内の 潜在プロモータを由来とする転写体の5'−領域を表す可能性がある（第6.2.2.章 以下）。 第4/1 〜4/2 および５図は、第1/1 〜1/5 図に示された完全な長さのHER4レセ プタと整合したヒトHER4の２つの変異型の推定されたアミノ酸配列を示す。配列 は単一−文字コードを使用して表示され、かつ配列番号は右側に与えられ、完全 HER4配列を上部にまた該変異型配列を下部に示した。同一の残基は整列させた残 基間のコロンにより示されている。 第4/1 〜4/2 図は、交互3'−末端をもち、自己ホスホリル化ドメインを欠いた HER4を表す[SEQ ID NO: 4]。この配列は、アミノ酸1045までは、第1/1 〜1/5 図 に示されたHER4の配列と同等であり、該アミノ酸1045において同一性を失い、停 止コドンに至る前に、13アミノ酸が連なる。 第５図は、切頭N-末端をもつHER4である[SEQ ID NO: 6]。この配列は、アミノ 酸768 で始まる、第1/1 〜1/5 図に示されたHER4の3'−部分と同等である（第6. 2.2.章以下）。 第6/1 〜6/2 図は、ヒトHER4の推定されたアミノ酸配列および他のヒトEGFR− 群の構成員(EGFR[SEQ ID NO: 6]; HER2[SEQ ID NO: 8]; HER3[SEQ ID NO: 9]） との整合性を示す。配列は単一−文字コードを使用して表示され、かつ配列番号 は左側に与えられている。同一の残基はドットで示され、ギャップを最適の配列 に対して導入し、システイン残基を星印でマークし、N-結合グリコシル化サイト をプラス(+)で示す。潜在的なタンパクキナーゼＣホスホリル化サイトを矢印で 示した(HER4アミノ酸位置679、685 および699)。予想されたATP-結合サイトは４ つの丸で囲んだ＋で示され、C-末端チロシンは白抜きの三角形で示され、該EGFR 中の主要な自己ホスホリル化サイトが保存されたHER4中のチロシンは黒色の三角 形で示してある。予想された細胞外ドメインは、位置25における矢印でマークさ れたシグナル配列の境界部から、アミノ酸位置650〜675 に横たわる疎水性貫膜 ドメインまで伸びている。右側に種々のサブドメインが標識されており、Ｉ、II 、III およびIVは細胞外ドメインであり（ドメインIIおよびIVはシステインに富 むドメインである）、TMは貫膜ドメインであり、TKはチロシンキナーゼドメイン である。ドメインＩ、III、TKは枠で囲んである。 第７図は、HER4（1308アミノ酸）、EGFR（1210アミノ酸）、HER2（1255アミノ 酸）、HER3（1342アミノ酸）のタンパクドメインと比較して配列した、HER4のハ イドロパシープロフィールである。該シグナルペプチドは、点描のボックスで示 され、該システインに富む細胞外サブドメインは陰影が付され、該貫膜ドメイン は黒色に塗り潰した領域であり、また該細胞質チロシンキナーゼドメインは点描 部分である。HER4と他のEGFR−群の構成員との間の％アミノ酸配列相同性が示さ れている。Sig はシグナルペプチドであり、Ｉ、II、III およびIVはそれぞれ細 胞外ドメインであり、TMは貫膜ドメインであり、JMは傍膜(juxtamembrane)ドメ インであり、CaInはカルシウム流入およびインターナリゼーションドメインであ り、3'UTR は3'未翻訳領域である。 第8Aおよび8B図は、HER4プローブにハイブリッド化したヒト組織のノーザンブ ロット分析を示す。RNA サイズマーカー（キロベース単位で）を左側に示す。レ ーン１〜８はそれぞれ膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳および心臓由来 のpoly(A)+mRNA２μｇを表す。第8A図は、HER4プローブにハイブリッド化したヒ ト組織由来の、3'−自己ホスホリル化ドメインからのmRNAのノーザンブロット分 析を示す。第8B図は、HER4プローブにハイブリッド化したヒト組織由来の、5'− 細胞外ドメインからのmRNAのノーザンブロット分析を示す。 第9Aおよび9B図は、CHO-KI細胞中で安定に発現された組み換えHER4のイムノブ ロット分析を示し、その手順は以下の第7.1.3.章以降に概説されている。組み換 えHER4を発現するCHO-KI細胞からの膜調製物は、7%SDS-ポリアクリルアミドゲル 上で分離し、ニトロセルロースに転写する。第9A図において、ブロットは、HER4 と交叉反応するHER2のC-末端(Ab3; NY、ユニオンデールのオンコジーヌサイエン ス(Oncogene Science)社)に対するモノクローナル抗体とハイブリッド化されて いる。第9B図において、ブロットは、HER4およびHER2の共通エピトープに対する ヒツジ抗−ペプチドポリクローナル抗体とハイブリッド化されている。レーン１ は、親CHO-KI細胞を表し、レーン２〜４は、それぞれCHO-KI／HER4細胞クローン ６、21および３を表す。180kDaHER4タンパクおよび130kDaの交叉−反応種に注目 すべきである。予備染色した高分子量マーカー（CA、リッチモンドのバイオラド (BioRad)社）のkDa 単位のサイズは左側に与えられている。 第10Ａ〜10Ｄ図は、乳癌分化因子によるHER4チロシンキナーゼの特異的活性化 （第８章以下を参照のこと）を示す。各々EGFR−群のチロシンキナーゼレセプタ （EGFR、HER2、HER3およびHER4）の単一の構成員を過剰に発現する、４種の組み 換え細胞系を、第7.1.2.および8.1.章以下に記載する方法に従って調製した。こ の４種の組み換え細胞系各々由来の細胞を、種々のリガンド処方物で刺激し、第 8.2.章以下に記載するアッセイを利用して、レセプタチロシンホスホリル化につ きアッセイした。第10Ａ図はCHO/HER4#3細胞に関するものであり、第10Ｂ図はCH O/HER2細胞に関するものであり、第10Ｃ図はNRHER5細胞に関し、第10Ｄ図は293/ HER3細胞に関するものである。細胞は、レーン１ではバッファーコントロール、 レーン２では100ng/mlのEGF、レーン３では200ng/mlのアンヒレグリン、レーン ４では10mlのフェニルカラム画分17（第９章以下）、レーン５では10μｌのフェ ニルカラム画分14（第９章以下および以下の第11図に関する説明参照）によって 刺激した。該予備染色した高分子量マーカーの(kDaで表した)サイズは各パネル の左側に与えられている。各シリーズのホスホリル化されたレセプタは、221kDa のマーカーの直ぐ下を移動する。該ゲルの底部のバンドは重要ではなく、二次抗 体と、免疫沈降で使用した抗体との反応によるものである。 第11Ａ〜11Ｆ図は、HepG2 細胞の、状態調節された培地から精製された該MDA- MB-453−細胞の生物学的および生化学的特性を示す（以下の第９章）。第11Ａお よび11Ｂ図は、形態的な分化の誘発を示す。HepG2 細胞由来の状態調節された培 地を硫酸アンモニウム分画に掛け、次いでPBS に対する透析にかけた。この物質 の希釈物を、MDA-MB-453単層に、指定されたタンパク濃度にて添加した。第11Ａ 図はコントロール、第11Ｂ図はウエル当たり80ng、第11Ｃ図はウエル当たり2.0 μｇ、第11Ｄ図は230 nmにおける吸収で追跡したフェニル-5PWカラム溶出プロフ ィール、第11Ｅ図は以下のリガンド処方を使用したMDA-MB-453チロシン自己ホス ホリル化の刺激、即ちナシ（因子を添加しなかったコントロール）；TGF-α(50n g/ml); CM(16-倍濃厚なHepG2 状態調節された培地、ウエル当たり２μｌおよび1 0μｌにてテスト);画分(フェニルカラム画分13〜20、ウエル当たり10μl)、第11 Ｆ図は、第11Ｅ図に示されたホスホリル化シグナルの、濃度法による分析結果を 示す。 第12Aおよび12B図は、NDF-誘起チロシンホスホリル化の結果を示す。第12A図 はMDA-MB-453細胞（レーン１、mockトランスフェクションCOS 細胞上澄；レーン ２、NDF トランスフェクションCOS 細胞上澄）、第12B図はCHO/HER421-2細胞（ レーン１、２：mockトランスフェクションCOS 細胞上澄；レーン３、４：NDF ト ランスフェクションCOS 細胞上澄）である。以下の第10章参照。チロシンホスホ リル化は以下の第8.2.章に記載するチロシンキナーゼ刺激アッセイによって測定 した。 第13Ａおよび13Ｂ図は、ヒト染色体２バンドq33 に対するHER4遺伝子の領域的 位置を示す。第13Ａ図はヒト染色体上の124 個のハイブリダイゼーションサイト の分布を示し、第13Ｂ図は、染色体２の図上のオートラジオグラフ粒子の分布を 表す。 第14図は、HER4-Ig 融合タンパクのアミノ酸配列[SEQ ID NO:10]を表す（以下 の第5.4.章参照）。 第15図は、組み換えヒレグリンが、HER4のチロシンホスホリル化を誘起するこ とを示す。チロシンホスホリル化レセプタは、抗−ホスホチロシンMab によるウ エスタンブロッティングにより検出した。矢印は、該HER2およびHER4タンパクを 示す。MAD-MB453 またはCHO/HER4細胞の単層を、ラットヒレグリン発現プラスミ ド(HRG)またはcDM8ベクターコントロール(-)でトランスフェクションしたCOS-１ 細胞からの培地と共にインキュベートした。この培地は直接(1X)または20−倍(2 0X、およびベクターコントロール)に濃縮した後に適用した。可溶化した細胞を 抗−ホスホチロシンMab により免疫沈降させた。CHO/HER2細胞の単層を、トラン スフェクションしたCOS-1 細胞上澄または２種のHER2に対するMab(Mab 28および 29)と共に、上記の如くインキュベートした。溶解した細胞を抗−HER2Mab によ り免疫沈降させた。 第16Ａ〜16Ｃ図は、ヒトCEM 細胞中での組み換えHER2およびHER4の発現を示す 図である。HER2、HER4またはその両組み換えレセプタを安定に発現する、トラン スフェクションしたCEM 細胞を選別した。第16Ａ図において、組み換えHER2は、 抗-HER2 Mab(Ab-2)を使用した細胞溶解物の免疫沈降および他の抗-HER2 Mab(Ab- 3)を使用したウエスタンブロッティングにより検出した。第16Ｂ図では、組み 換えHER4を、HER4特異的ウサギ抗−ペプチド抗−血清を使用した35S-標識した細 胞溶解物を免疫沈降することにより検出した。第16Ｃ図では、一方または両方の 組み換えレセプタを発現する３種のCEM 細胞系を選択し、かつ各アリコートを培 地コントロール(-)、２種のHER2−刺激Mab(Mab28および29)、またはイソタイプ 適合コントロールMab(18.4)と共にインキュベートした。溶解した細胞を抗-HER2 Mab(Ab-2)によって免疫沈降させ、かつチロシンホスホリル化HER2を抗−ホスホ チロシンMab を使用したウエスタンブロッティングにより検出した。予備染色し た高分子量のマーカー(バイオーラド(Bio-Rad))のkDa 単位で表したサイズは左 側に与えられており、また矢印はHER2およびHER4タンパクを示す。 第17Ａ〜17Ｃ図は、ヒレグリンかHER4を発現するCEM 細胞中のチロシンホスホ リル化を誘起することを示す。HER2またはHER4のみ(CEM 1-3およびCEM 3-13)を 発現するあるいはこれらを一緒に(CEM 2-9)発現する３種のCEM 細胞系を、mock- (-)またはヒレグリントランスフェクション(+)COS-1細胞由来の7X濃縮上澄と共 にインキュベートした。溶解した細胞を抗−ホスホチロシンMab(PY20)で免疫沈 降(IP)させた。第17Ａ図では、HER2−特異的抗−HER2Mab(Ab-2)が、第17Ｂ図で は、HER4−特異的Mab(6-4)が、また第17Ｃ図では、各場合におけるチロシンホス ホリル化レセプタが、抗-ホスホチロシンMab を使用したウエスタンブロッティ ングによって検出した。予備染色した分子量マーカー（バイオラド）のkDa 単位 で表したサイズは、左側に与えられており、また矢印は該HER2およびHER4タンパ クを示す。HRG は組み換えラットヒレグリンである。 第18図は、ヨウ素化ヒレグリンのHER4に対する共有結合による架橋を示す。12 5 I−ヒレグリンは、CHO/HER4またはCHO/HER2細胞に、４℃にて２時間に渡り添加 した。洗浄した細胞をBS3で架橋し、溶解し、かつ該タンパクを7%PAGEを使用し て分離した。標識バンドはホスホルイメージャー(phosphorimager)で検出した。 分子量マーカーは左側に示されている。 第19Ａ〜19Ｄ図は、HepG2 状態調節した培地由来のp45 の精製を示す。カラム 画分を、そのMDA-MB-453細胞の分化を誘発する能力についてテストした。活性画 分を、水平のバーで示されるようにプールした。第19Ａ図は、濃縮したHepG2 状 態調節培地を、50% 硫酸アンモニウム沈殿処理にかけることを示す。この段階で 得られる上澄を、フェニル−セファロースを使用した疎水性相互作用クロマトグ ラフィーにかけた。次いで、該プールした画分をDEAE−セファロースカラム処理 にかけた。第19Ｂ図は、DEAE−セファロースカラム流下物を、CM−セファロース クロマトグラフィー処理にかけた結果を示す。第19Ｃ図は、ヘパリン-5PWカラム を使用したMAD-MB-453分化因子のアフィニティークロマトグラフィーの結果を示 す。1.3mNaCl近傍で溶出する画分35-38 をプールした。第19Ｄ図は、該分化因子 のサイズ排除クロマトグラフィー処理の結果を示す。検量標準物質の分子量はkD a 単位で示されている。 第20図は、活性サイズ排除カラム画分（30および32）のアリコート(25 μl)を 12.5% ポリアクリルアミドゲル上で、還元条件下にて、電気泳動処理した結果を 示す。該ゲルを銀−染色した。バイオ−ラドの銀染色標準物質の分子量はkDa 単 位で示されている。 第21Ａ〜21Ｃ図は、p45 によるチロシンホスホリル化の刺激を示す。第21Ａ図 は、チロシンホスホリル化の誘導に関連して、サイズ排除カラム画分を、MAD-MB -453細胞についてテストした結果を示す。次いで、細胞溶解物を、4-15% ポリア クリルアミドゲル上で電気泳動処理した。ニトロセルロースに転写した後、タン パクを化学発光によって検出される燐タンパクおよびホスホチロシン抗体でプロ ーブした。支配的にホスホリル化されたタンパクの分子量が示されている。第21 Ｂ図は、HER4(CHO/HER4)またはHER2(CHO/HER2)に対する発現プラスミドでトラン スフェクションした細胞について実施した実験の結果を示す。細胞単層をp45（ サイズ排除カラム画分32; 100 ng/ml)の存在下または不在下にてインキュベート した。次いで、サンプルを、7.5%ポリアクリルアミドゲルを使用して、該CHO/HE R2細胞溶解物を分離したことを除き、第21Ａ図に示したように処理した。第21Ｃ 図は、CHO/HER2細胞を、p185erbB2の細胞外ドメインに対するN29 モノクローナ ル抗体の存在下、または不在下でインキュベートした結果を示す。細胞溶解物を 、p185erbB2に対するAb-3モノクローナル抗体により免疫沈殿させた。沈殿した タンパクをSDS-PAGEにかけ、かつ燐タンパクを以下の第13.4．章に記載するよう にして検出した。 第22Ａおよび22Ｂ図は、125I-p45の、CHO-KI、CHO-HER2およびCHO/HER4細胞に 対する結合並びに架橋を示す。第22Ａ図は、125I-p45のCHO/HER4細胞に対する結 合のスキャッチャード分析の結果を示す。増大する種々の濃度の125I-p45を、細 胞の単層と共に４℃にて２時間インキュベートした。非−特異的結合を、全ての 細胞関連放射能データ値から差し引いた。スキャッチャードプロット並びに該結 合データの飽和曲線が図示されている。第22Ｂ図は、共有結合により架橋を示す 図である。125I-p45は、過剰の未標識のp45 の存在下または不在下で添加し、４ ℃にて２時間接触させた。該細胞を洗浄して、未結合のヨウ素化物質を除去した 後、架橋剤ビス-(スルホサクシンイミジル)-スベレートを該細胞に添加し、４℃ にて45分間接触させた。細胞を溶解し、得られるタンパクを7.5%ポリアクリルア ミドゲル上での電気泳動によって分離した。タンパク標準物質の分子量はkDa 単 位で示されている。該放射性種の可視化のためにモレキュラーダイナミックスホ スホイメージャー(Molecular Dynamics PhosphoImager)を使用した。 第23Ａおよび23Ｂ図は、IPTG誘発性のT7プロモータの制御下で、アンヒレグリ ン(AR)、ヒレグリンβ２、およびPE40の疎水性リーダー配列をコードするHAR-TX β２発現プラスミドの構築を示す図である。第23Ａ図は、HAR-TXβ２をコードす る発現プラスミドpSE8.4の模式的な図である。第23Ｂ図は、HAR β２のアミノ酸 配列、ARリーダー配列を含むHAR-TXβ２のリガンド部分およびラットヒレグリン β２のアミノ酸配列を示す[SEQ ID NO:40]。 第24Ａおよび24Ｂ図は、キメラHAR-TXβ２のcDNA配列[SEQ ID NO:41]およびそ の推定アミノ酸配列[SEQ ID NO:42]を示し、該アンヒレグリン(AR)リーダー配列 およびラットヒレグリンシュードモナス外毒素PE40のコード配列を含む。該２つ の部分間のリンカー配列は、該配列上のバーで示されており、該リガンド部分は 5'(N- 末端)に位置し、該PE40外毒素部分は該配列の3'(C- 末端)部分に位置して いる。ヌクレオチドは右側に番号付けされ、またアミノ酸は該配列の下部に番号 付けされている。 第25図は、キメラHAR-TXb2タンパクの精製を示し、種々の精製段階における、 クーマシーブリリアントブルーで染色したSDS-PAGE(4-20%)が図示されている。 レーン１〜５は還元条件下で泳動させた。レーン１は分子量標準物質であり、レ ーン２は再螺旋化したHAR-TXβ２(20X濃縮)であり、レーン３は、POROS HS流下 体(20X濃縮)であり、レーン４はPOROS HS流出液であり、レーン５はソース15S溶 出液(純粋HAR-TXβ２、２μg)であり、レーン６は非還元条件下で泳動させた２ μｇのHAR-TXβ２に関する。 第26図は、膜を主体としたELISA 結合分析であり、該精製したHAR-TXβ２タン パクの結合活性を測定するために実施した。HER4発現ヒト乳癌細胞系から調製し た膜に対するHAR-TXβ２の結合（○）およびPE40の結合（●）を示す。 第27図は、トランスフェクションされたCEM 細胞中の、HAR-TX bβ２により誘 発されたチロシンホスホリル化を示す。HER4およびHER2を同時に発現するCEM 細 胞(H2,4)、それぞれHER4のみ(H4)、HER2のみ(H2)、HER1のみ(H1)を発現するCEM 細胞を、HAR-TXβ２の存在下(+)または不在下(-)でインキュベートし、次に溶解 し、かつモノクローナル抗-ホスホチロシン抗体PY20によってイムノブロット分 析した。矢印は該ホスホリル化レセプタバンドを示し、その分子量はkDa 単位で 示されている。 第28Ａおよび28Ｂ図は、腫瘍細胞系に及ぼすHAR-TXβ２の細胞毒性作用を示す 図である。第28Ａ図は、HAR-TXβ２との48時間のインキュベーション後の、腫瘍 細胞系LNCaP(■)、AU565(○)、SKBR3(●)およびSKOV3(□)に及ぼす、HAR-TXβ２ の細胞毒性作用を、カルセイン(calcein)-AMから開裂された蛍光性カルセインの 定量により評価した結果である。第28Ｂ図は、HAR-TXβ２とヒレグリンβ２-Ig との競合細胞毒性を示す。LNCaP 細胞を、50ng/ml のHAR-TXβ２と共に、ヒレグ リンβ２-Ig(□)またはL6-Ig(■)の増大する濃度(2-5000ng/ml)にてインキュベ ートした。これらデータは３回のアッセイの平均を表す。 第29図は、HER3(L2987)を発現するまたはHER2およびHER3(H3396)を同時に発現 する腫瘍細胞中の、HAR-TXβ２により誘起されたチロシンホスホリル化を示す図 である。細胞を、HAR-TXβ２の存在下(+)または不在下(-)でインキュベートし、 次に溶解し、かつモノクローナル抗−ホスホチロシン抗体PY20によってイムノブ ロット分析した。該ホスホリル化レセプタは矢印で示され、その分子量はkDa 単 位で示されている。 5．発明の詳細な説明 本発明は、HER4/p180erbB4(“HER4”)、レセプタチロシンキナーゼのヒトEGF( HER)/neu 亜群の密接に関連した、かつ別々の構成員、並びにHER4−コードポリ ヌクレオチド（例えば、cDNA、ゲノムDNA、RNA、アンチセンスRNA 等）、HER4ポ リヌクレオチドコード配列からのHER4の成熟型および先駆体型の製造、組み換え HER4発現ベクター、HER4同族体および誘導体、抗−HER4抗体、HER4リガンド、お よびHER4ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リガンド並びに抗体の、ヒト腫瘍学 および神経生物学分野における、診断上かつ治療上の利用に関する。 上記第２章で論じたように、HER2が広範囲のヒト悪性腫瘍と結合することが報 告されており、従ってその活性化メカニズム並びに関与する分子の同定は、特に 臨床的観点から興味がある。本発明は、HER2のHER4−媒介ホスホリル化を包含す る、該HER4およびHER2レセプタ間の見掛け上の機能的関係を、特に分子内レセプ タクロストークまたはレセプタダイマー化を通して明らかにする。これに関連し て、本発明は、またHER2のHER4−媒介ホスホリル化を包含すると思われる、乳癌 細胞の細胞分化を誘発できるHER4リガンドを提供する。更に、本出願人のデータ は、報告されたように（ペレス(Peles)等，Cell，1992，69:205-216）直接HER2 を通してではなく、HER4との直接的な相互作用によりおよび／またはHER2／HER4 錯体との相互作用を通して、ヒレグリンがかかる細胞における生物学的作用を媒 介することの証拠を提供する。HER2およびHER4両者を発現する細胞系では、ヒレ グリンのHER4に対する結合は、これら２種の関連するレセプタのヘテロダイマー 形成によりまたは細胞内レセプタクロストークによって、HER2を刺激できる。 最近、HER3もヒレグリンに結合することが報告された（上記第２章を参照）。 しかしながら、種々の観察は、HER3のヒレグリン−媒介活性化が、発現の内容に よって著しく変動することが示され、このことは他の細胞成分がHER3の活性化の 調節に関与している可能性があることを示唆している（キャラウエイ＆カントレ イ(Carraway and Cantley)，Cell，1994，78:5-8に概説されている）。 特に示されない限り、本発明の実施は、当分野で公知の分子生物学、分子クロ ーニング、マイクロバイオロジー、イムノロジー、および組み換えDNA 技術を使 用する。このような技術は文献全体に記載され、かつ説明されており、幾つかの より包括的な刊行物、例えばサンブルック(Sambrook)等のモレキュラークローニ ング；アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning; A Laboratory Manual)(1 989 年、第二版)に見出すことができる。 5.1．HER4ポリヌクレオチド 本発明の一局面は、HER4ポリヌクレオチドを意図し、これは第1Aおよび1B図に 示された始原型のHER4ポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチド、こ れらに関連するまたはこれらに相補的なポリヌクレオチドを包含し、また組み換 えベクターおよびこのような組み換えポリヌクレオチドを組み込んだ細胞系をも 意図する。本明細書で使用する用語「組み換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、 cDNA、合成または半合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これらは、その起源 または処置によって、これが事実上結合している該ポリヌクレオチドの如何なる 部分とも結合せず、また実際にこれが結合しているもの以外のポリヌクレオチド に結合することができ、かつリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌ クレオチド同族体の一本鎖または二本鎖ポリマーまたはこれらの組み合わせを含 む。この用語は、また当分野で公知の種々の変性体を包含し、これらは放射性お よび化学的標識、メチル化、キャップ形成、ヌクレオチド間変性、例えば帯電し た結合（例えば、ホスホロトチオエート(phosphorothothioates)、ホスホロジト チオエート(phosphorodithothioates)）および非−帯電結合（例えば、メチルホ スホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダイト(phosphoamidites)、カル バマイト(carbamites)等）による変性体並びにペンダント部分、インターカルケ ーター(intercalcators)、キレーター(chelators)、アルキレーター(alkylators )等を含むもの等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。関連ポリ ヌクレオチドは、約200 またはそれ以上のヌクレオチドの隣接した伸びを有し、 かつ第1Aおよび1B図に示したヌクレオチド配列内のヌクレオチドの対応する配列 に対して少なくとも約80% の相同をもつものである。このようなHER4ポリヌクレ オチドおよびベクターの幾つかの特定の態様は、実施例部分の第６および７章以 下に与えられている。 HER4ポリヌクレオチドは、例えば分子クローニングおよび化学的合成法を包含 する、当分野で公知の種々の一般的な技術を利用して得ることができる。本発明 の始原型HER4ポリペプチド（第1Aおよび1B図）並びに数種のHER4ポリペプチド変 異体をコードするcDNAの分子クローニングの一方法は、例として以下の第６章に 記載されている。EGFR、HER2、HER3およびXmrkの配列の保存された領域は、縮重 オリゴヌクレオチドプライマーの選択のために利用され、これは次にHER4を単離 するのに利用される。これら配列の多くは、アミノ酸の同一性をもつ広い領域を もつから、短いPCR フラグメントが固有の分子を表すのか、あるいは単にEGFR、 HER2またはHER3の種−特異性のかたわれを表すのかを、決定することは困難であ る。しばしば一つのタンパクについての種の差異は、２つの別々のタンパクに対 する種内部の差異と同程度に大きい。例えば、魚のXmrkはヒトEGFRに対して、47 /55(85%)のアミノ酸同一性をもつ領域を有し、これが魚のEGFRであろうことを示 唆するが、この領域においてXmrkと同等(57/57)なアミノ酸配列を有するもう一 つのクローンの単離は、そのフランキング配列におけるヒトEGFRに対するより高 い相同性を示し(92%アミノ酸相同性)、このことはXmrkではなく、該クローンが 該魚のEGFRであることを示唆する(ウイットブロット(Wittbrodt)等，Nature，19 89，342:415-421)。以下の第６章に説明するように、マウスHER4/erbB4PCR フラ グメントが、実際に独特の遺伝子であり、EGFR、HER2またはHER3のマウス同族体 ではないことを、マウスEGFR、erbB2 およびerbB3 に対応するゲノムフラグメン トを単離することにより、確認する必要があった。これらクローンの配列分析は 、このフラグメントが該EGFR群の新規な構成員であることを立証した。特に、マ ウスクローンの領域は、60/64 の範囲の、ヒトHER2に対するアミノ酸同一性を有 するが、同一種（マウス）からの他のEGFR同族体のアミノ酸およびDNA 配列との 比較は、これが新規な転写配列をコードすることを厳格に確立した。 HER4ポリヌクレオチドは、HER4−様の活性を発揮するおよび／またはHER4−コ ードmRNAを発現する種々の細胞源から得ることができる。この点に関連して、本 出願人は、HER4ポリヌクレオチドに対する適当な幾つかのヒト細胞源を同定した が、これらは脳、小脳、下垂体、心臓、骨格筋および種々の乳癌細胞系を包含す るが、これらに限定されない（以下の第６章を参照）。 例えば、HER4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このような細胞 源から単離しかつ精製されたRNA からのcDNAクローニングによって、あるいはゲ ノムクローニングによって得ることができる。クローンのcDNAまたはゲノムライ ブラリーのいずれかを当分野で周知の技術を使用して調製し、該HER4遺伝子の任 意の部分に対して実質的に相補性のヌクレオチドプローブを使用して、特定のHE R4をコードするDNA につきスクリーニングすることができる。種々のPCR クロー ニング技術を使用して、本発明の該HER4ポリヌクレオチドを得ることもできる。 HER4ポリヌクレオチドの単離に適した幾つかのPCR クローニングプロトコールが 文献に報告されている（例えば、PCR プロトコール：アガイドトゥーメソッズ＆ アプリケーションズ(PCR protocols: A Guide to Methods and Applications) ， イニス(Inis)等編，1990，アカデミックプレスを参照のこと）。 発現ベクターの構築のために、該所定のHER4の完全なコード領域を含むポリヌ クレオチドを、完全な長さのクローンとして単離するか、あるいは２以上のポリ ヌクレオチドを一緒にスプライシングすることにより調製できる。また、HER4− コードDNA は、完全にまたは部分的に、当分野において標準的な技術を使用する 化学合成によって製造することができる。ヌクレオチドのコード配列の固有の縮 重のために、該所定のHER4ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを 組み換え発現のために使用できる。かくして、例えば第1Aおよび1B図に与えられ た本発明の始原型HER4をコードするヌクレオチド配列は、同一のHER4生成物が得 られるように、ヌクレオチドを置換することにより変更することができる。 本発明は、また本発明のHER4ポリヌクレオチドの、幾つかの有用な用途をも提 供し、該用途はHER4発現ベクターの調製、HER4を検出しおよび／またはクローニ ングするためのプライマーおよびプローブ、および診断薬の調製における使用を 包含するが、これらに限定されない。HER4ポリヌクレオチドに基づく診断は、当 分野で公知の種々のハイブリダイゼーションおよびPCR アッセイを包含し、そこ ではHER4ポリヌクレオチドを、適当ならば、プライマーまたはプローブとして使 用する。本発明の特定の一つの局面は、PCR キットに関わり、該キットはPCR 反 応中にcDNA合成を引き起こすことのできるプライマーを含み、ここで該プライマ ーの各々は本発明のHER4ポリヌクレオチドである。このようなキットは、異常な HER4発現によって特徴付けられる幾つかのヒト癌の診断において有用である可能 性がある。例えば、幾つかのヒト癌、例えばヒト乳癌は、その正常な細胞のかた われと比較して、過剰なHER4発現を生ずる可能性がある。かくして、胸部組織に おけるHER4過剰発現mRNAの検出は、腫瘍形成の徴候であり得る。もう一つの関連 する態様においては、HER2の過剰発現およびHER4の発現または過剰発現によって 特徴付けられるヒト癌は、HER2およびHER4mRNA両者の検出を可能とする、ポリヌ クレオチドに基づくアッセイキットによって、例えばそれぞれ該HER2およびHER4 遺伝子中の分枝配列由来の、一連のPCR プライマー対を含有するキットによって 診断し得る。 5.2．HER4ポリペプチド 本発明は、もう一つの局面では、HER4ポリペプチドを意図し、該ポリペプチド はここに提供される始原型のHER4ポリペプチド、並びに該始原型HER4分子のアミ ノ酸配列由来のポリペプチドまたは該アミノ酸配列に対して実質上相同性のポリ ペプチドを包含する。ここで言う「ポリペプチド」とは、合成または組み換え手 段によって調製された、あるいは天然源から単離された、ポリペプチドを意味す る。またここで使用する「実質上相同」なる用語は、始原型HER4の一次構造（第 1Aおよび1B図）における対応する一連なりのアミノ酸配列に対して、約90% を越 えるアミノ酸相同性をもつ、約80またはそれ以上のアミノ酸残基を含むポリペプ チドを意味する。用語「始原型HER4」とは、第1Aおよび1B図に与えたような先駆 体または成熟HER4のアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味し、これは同様にこ こに与えられる共通cDNAヌクレオチド配列によって、あるいは同一のアミノ酸配 列をコードする任意のポリヌクレオチド配列によりコードされる。 本発明のHER4ポリペプチドは、第1Aおよび1B図に与えられた始原型HER4の配列 に相対的に、アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができ、これらは サイレント変異をもたらし、結果として生物活性生成物を作成する。このような アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／ または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電 したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含し、正に帯電したア ミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、同様な親水性値をもつ、非帯電の極性 頭部基または非極性の頭部基をもつアミノ酸は以下のものを包含する。即ち、ロ イシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミ ン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンを包含する。 第1Aおよび1B図に与えられた該HER4ポリペプチドはレセプタチロシンキナーゼ のEGFR−群を特徴付ける基本的な構造上の特徴の全てを有する(ハンクス(Hanks) 等，Science，1988，241:42-52)。この先駆体は、貫膜領域に特徴的な、26個の アミノ酸を含む単一の疎水性領域を含み、該貫膜領域は該タンパクを、625 アミ ノ酸の細胞外リガンド結合ドメインと、633 個のアミノ酸を含むC-末端細胞質ド メインとに分割している。該リガンド結合ドメインは、更に４個のサブドメイン (I-IV)に分割でき、これらは２つのシステインに富む領域(II，残基186-334;お よびIV，残基496-633)および２つのフランキング領域(I，残基29-185; およびII I，残基335-495)を含み、これらはリガンド結合に対する特異性を規定できる（ ラックス(Lax)等，Mol．Cell Biol.，1988，8:1970-78）。HER4の細胞外ドメイ ンは、HER3に最も類似しており、ここでHER4のドメインII-IV はHER3の各ドメイ ンに対して56-67%の同一性をもつ。これとは対照的に、EGFRおよびHER2の同一の 領域は、それぞれHER4に対して43-51%および34-46%の相同性を示す（第6Aおよび 6B図）。EGFRおよびHER2の４つの細胞外サブドメインは、39-50%の同一性をもつ 。HER4は、また該HER2タンパクがドメインIVにおける第四のシステインを欠いて いる点を除いて、EGFR、HER2およびHER3の該細胞外部分に存在する50個全てのシ ステインを保存している。HER4中には、11個の潜在的なN-結合グリコシル化サイ トが存在し、EGFR中には12個の潜在的サイトのうち４個が保存され、HER2中の８ 個のサイトの３個が保存され、かつHER3中の10サイト中の４個が保存されている 。 HER4の該貫膜ドメインに続き、37アミノ酸をもつ細胞質性隣接膜領域がある。 この領域は、EGFRに対して最高の相同性をもち(73%のアミノ酸が同一)、第1Aお よび1B図の配列中のアミノ酸残基番号679(セリン)および699(スレオニン)におけ る、２つの共通タンパクキナーゼＣホスホリル化サイトを含み、その後者はEGFR およびHER2中に存在する。特に、HER4はEGFRのThr654に類似するサイトをもたな い。該EGFR中のこの残基のホスホリル化は、リガンド−誘発性インターナリゼ ーションを遮断し、かつその貫膜シグナリングにおいて重要な役割を演ずる（リ ブネ(Livneh)等，Mol．Cell Biol.，1988，8:2302-08）。HER4は、またHER2のTh r694に類似するThr692を含む。このスレオニンはEGFRおよびHER3には含まれず、 該HER2キナーゼのマイトジェンおよび形質転換活性に対して、細胞−型特異性を 付与することが提案されている（ディフィオレ(DiFiore)等，EMBO J.，1992，11 :3927-33）。HER4の隣接膜領域は、EGFRのThr699に相同な位置における、アミノ 酸番号699(スレオニン)において、MAPキナーゼ共通ホスホリル化サイトを含有し 、EGFRは、EGF 刺激に応答して、MAP キナーゼによりホスホリル化される(タキ シマ(Takishima)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1991，88:2520-25)。 HER4の残留する細胞質部分は、276 アミノ酸チロシンキナーゼドメイン、該EG FRのリガンド−誘発性インターナリゼーションに必要とされるドメインに対して 相同の38個のアミノ酸をもつ酸性のヘリックス構造（チェン(Chen)等，Cell，19 89，59:33-43）、および他のEGFR−関連タンパクの該自己ホスホリル化ドメイン に特徴的な18個のチロシン残基を含む、282アミノ酸領域（第6Aおよび6B図）を 含む。該276アミノ酸チロシンキナーゼドメインは、チロシンキナーゼの診断上 の構造的モチーフの全てを保存し、かつEGFR(79%の同一性)およびHER2(77%の同 一性)の触媒ドメインに最も大きく関連しており、また低い程度にHER3(63%の同 一性)と関連している。これと同一の領域において、EGFRとHER2とは83% の同一 性をもつ。種々の保存された構造上のモチーフの例は以下に挙げるものを含む。 即ち、燐酸基転移反応に関与していると予想される遠位のリジン残基をもつ、AT P-結合モチーフ(GXGXXG)[SEQ ID NO:11]（ハンクス(Hanks)等，198，Science，2 41:42-52;ハンター＆クーパー(Hunter & Cooper),ジィエンザイムズ(The Enzyme s)，Vol．17,(ボイヤー＆クレブス(Boyer & Krebs)編集)，pp．191-246(1986年 、アカデミックプレス)、チロシンキナーゼ特異的シネーチャー(signature)配列 (DLAARN[SEQ ID NO:12]およびPIKWMA[SEQ ID NO:13])およびTyr875（第6Aおよび 6B図）、多くのチロシンキナーゼ中でしばしば自己ホスホリル化サイトとして作 用する残基（ハンター＆クーパーの上記文献）、および全ての公知のタンパクキ ナーゼにおいて、高度にまたは完全に保存された約15残基（プローマン(Plowman )等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87:4905-09; ハンクス (Hanks)等の上記文献）を包含する。HER4のC-末端の282 個のアミノ酸は、HER2( 27%)およびEGFR(19%)との限られた相同性しかもたない。しかしながら、各EGFR −群レセプタの該C-末端ドメインは、プロリンに富み、かつ一般的にはチロシン 残基の近傍に集中した、2-7 個のアミノ酸の広がりを保存している。これらの残 基はTyr1068、Tyr1086、Tyr1148 およびTyr1173 において、EGFRの主チロシン自 己ホスホリル化サイトを含む（第6Aおよび6B図、黒塗りの三角、マルゴリス(Mar golis)等，J．Biol．Chem.，1989，264:10667-71）。 5.3．HER4ポリペプチドの組み換えによる合成 本発明のHER4ポリペプチドは、該所定のHER4ポリペプチドをコードするDNA の クローニングおよび発現によって製造できる。このようなDNA を結合して、当分 野で周知のかつ融合されたまたは成熟型の、幾つかの適当な宿主生物中で使用す るのに適した、発現ベクターとすることができ、また分泌を可能とするシグナル 配列を含むことができる。原核および真核の両宿主発現系を、クローニングHER4 ポリペプチドの製造において使用できる。例えば、始原型HER4先駆体コード配列 またはその機能的等価物を、該先駆体の正確なプロセッシングを可能とする宿主 細胞中で利用することができる。また、成熟HER4に対するコード配列を、該成熟 HER4分子の直接的発現のために利用できる。該HER4先駆体コード配列の機能的等 価物は、適当な宿主細胞内で発現された場合に、HER4の合成、プロセッシングお よび／または輸送を指示することのできる、任意のDNA 配列を包含する。 組み換えDNA 技術を利用したHER4ポリペプチドの製造は、説明の目的で４つの 工程に分割できる。即ち、(1)該所定のHER4ポリペプチドをコードするDNA の単 離もしくは生成；(2)該所定のHER4ポリペプチドの合成を指示できる発現ベクタ ーの構築；(3)該HER4コード配列を複製並びに発現できる適当な宿主細胞のトラ ンスフェクションまたは形質転換および／または該初期生成物のプロセッシング による該所定のHER4ポリペプチドの製造;および(4)該所定のHER4生成物の同定並 びに精製工程である。 5.3.1．HER4をコードするDNA の単離または生成 HER4−コードDNA またはその機能的等価体を使用して、該所定のHER4ポリペプ チド生成物の発現を指示するであろう、組み換え発現ベクターを構築することが できる。特定の態様では、該始原型HER4ポリペプチドをコードするDNA（第1Aお よび1B図）、またはそのフラグメントもしくはその機能的な等価体を使用して、 適当な宿主細胞内での、該組み換えHER4生成物の発現を指示するであろう組み換 え分子を生成することができる。HER4−コードヌクレオチド配列は、HER4−様の 活性を生じおよび／またはHER4−コードmRNAを発現する種々の細胞源から得るこ とができる。例えば、HER4−コードcDNAは、以下の第６章に記載されるように、 胸部腺癌細胞系MDA-MB-453(ATCC HTB131)から得ることができる。更に、幾つか のヒト細胞源が、HER4cDNAを得るのに適しており、その例は種々の類表皮腫およ び乳癌細胞、および正常な心臓、腎臓および脳細胞を挙げることができるが、こ れらに限定されない（以下の第6.2.3.章を参照）。 該HER4コード配列は、このような細胞源から単離し精製したRNA の分子クロー ニングにより、あるいはゲノムクローニングによって得ることができる。クロー ンのcDNAまたはゲノムライブラリーは、当分野で周知の技術を使用して調製する ことができ、該HER4遺伝子の任意の部分に対して実質上相補的なヌクレオチドプ ローブを使用して、特定のHER4−コードDNA につきスクリーニングすることがで きる。また、cDNAまたはゲノムDNA を、適当なオリゴヌクレオチドプライマーに よるPCR クローニング用の鋳型として使用することも可能である。完全な長さの クローン、即ち該所定のHER4の全コード領域を含むクローンを、発現ベクターの 構築のために選択することができ、あるいはオーバーラップcDNAを一緒に結合し て完全なコード配列を形成することも可能である。あるいはまた、HER4−コード DNA は、完全にまたは部分的に、当分野では標準的な技術を利用した、化学的合 成によって製造することも可能である。 5.3.2．HER4発現ベクターの構築 HER4ポリペプチドの組み換え発現のために、当業者には周知の、種々の発現ベ クター／宿主系を何れも利用することができる。このような系は、微生物、例え ば該所定のHER4コード配列を含有する、組み換えバクテリオファージDNA、プラ スミドDNA またはコスミドDNA 発現ベクターで形質転換されたバクテリア；該所 定のHER4コード配列を含有する、組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵 母；該所定のHER4コード配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例え ば、バクロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；該所定のHER4コード配列を含有 する、組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスC aMV; タバコモザイクウイルスTMV)で感染させた、あるいは該所定のHER4コード 配列を含有する、組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）に より形質転換した植物細胞系；またはDM染色体（例えば、マウス細胞系）中で、 安定に増幅された（例えば、CHO/dhfr、CHO/グルタミンシンセターゼ）または不 安定に増幅された、該HER4のDNA の多重コピーを含むように操作された細胞系を 含む、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウ イルス）で感染した動物細胞系を挙げることができるが、これらに制限されるも のではない。 これらベクターの発現エレメントの強度および特異性は異なっている。使用し た該宿主／ベクター系に依存して、多数の適当な転写並びに翻訳エレメントの任 意の一つを使用することができる。例えば、哺乳動物細胞系内でクローニングす る場合には、哺乳動物細胞のゲノムから単離したプロモータ（例えば、マウスの メタロチオネインプロモータ）、またはこれら細胞内で成育するウイルスから単 離したプロモータ(例えば、ワクシニアウイルスの7.5Kプロモータまたはモロニ ー(Moloney)マウスザルコーマウイルスのLTR)を使用することができる。組み換 えDNA または合成技術によって作成されるプロモータを使用して、該挿入された 配列の転写を達成することも可能である。 挿入されたタンパクコード配列の十分な翻訳のためには、特定の開始シグナル も必要とされる。これらのシグナルは、ATG 開始コドンおよび隣接配列を含む。 HER4遺伝子自体の開始コドンおよび隣接配列を含む完全なHER4遺伝子が、適当な 発現ベクター中に挿入された場合には、付随的な翻訳調節配列は必要とされない かもしれない。しかしながら、該コード配列の一部のみが挿入された場合には、 該ATG 開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルを与える必要がある。更に、 該開始コドンが、該HER4コード配列の読み取り枠と一致して、該完全な挿入断片 の翻訳を保証する必要がある。これらの外因性の翻訳調節シグナルおよび開始コ ドンは、天然および合成を含む種々の起源のものであり得る。発現効率は、転写 減衰配列、エンハンサーエレメント等を含めることによって、高めることができ る。 例えば、感染細胞中での発現を開始するためのベクターとして、アデノウイル スを使用した場合、該所定のHER4コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節 複合体、例えば後期プロモータおよび三部分リーダー配列に結合することができ る。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組み換え技術によっ て該アデノウイルスゲノムに挿入することができる。該ウイルスゲノムの非必須 領域（例えば、領域E3またはE4）への挿入は、生存性で感染宿主中でHER4を発現 できる組み換えウイルスを与える。同様に、ワクシニア7.5Kプロモータも使用で きる。HER4を発現するのに利用可能なもう一つの発現系は昆虫細胞系である。一 つのこのような系においては、オートグラファカリフォルニカヌクレアーポリヒ ドロシスウイルス(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus:AcNPV )を、外来遺伝子の発現用ベクターとして使用する。このウイルスはスポドプテ ラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で成育する。該HER4コード配列 は、該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内でクローニング し、かつAcNPV プロモータ（例えば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下に置く ことができる。該HER4コード配列の首尾良い挿入は、該ポリヘドリン遺伝子の不 活性化および非−封入組み換えウイルス（即ち、該ポリヘドリン遺伝子によりコ ードされるタンパク質様のコートをもたないウイルス）の生成に導く。 次に、これらの組み換えウイルスをスポドプテラフルギペルダ細胞の感染に使 用して、そこで該挿入遺伝子を発現させる。更に別の方法は、両種性パッケージ ング細胞系において調製したレトロウイルスベクターを使用し、これは多くの細 胞型中での高い効率での発現を可能とする。この方法は、細胞型特異的プロセッ シング、該挿入されたタンパクコード配列の調節または機能を評価することを可 能とする。 更に、該挿入された配列の発現を調節し、あるいは所定の特定の様式で該遺伝 子生成物を修飾またはプロセッシングする、宿主細胞系統を選択することができ る。幾つかのプロモータからの発現は、ある種の誘導物質（例えば、メタロチオ ネインプロモータに対しては、亜鉛およびカドミウムイオン）の存在下で高める ことができる。従って、該組み換えHER4ポリペプチドの発現は、調節することが できる。このことは、該クローン化外来遺伝子のタンパク生成物が宿主細胞にと って致死的である場合には、重要である。更に、タンパク質生成物の変性（例え ば、ホスホリル化）およびプロセッシング（例えば、開裂）は該タンパクの機能 にとって重要である。種々の宿主細胞が、タンパクの翻訳後のプロセッシングお よび修飾のための特徴的なかつ特異的なメカニズムを有している。適当な細胞系 または宿主系を選択して、発現される該外来タンパクの正確な修飾およびプロセ ッシングを保証することができる。 5.3.3．HER4遺伝子生成物を発現する形質転換体 該組み換えコード配列を含み、かつ該所定のHER4ポリペプチド製品を発現する 該宿主細胞は、少なくとも４つの一般的な方法、即ち(a)DNA-DNAN、DNA-RNA ま たはRNA-アンチセンスRNA ハイブリダイゼーション; (b)「マーカー」遺伝子機 能の存在または不在; (C)該宿主細胞中でのHER4mRNA転写物の発現により測定さ れるような、該転写レベルの評価; および(D)イムノアッセイによって測定され および後の生物学的活性によって表されるような、該HER4生成物の検出、によっ て同定できる。 該第一の方法においては、例えば発現ベクター中に挿入されたHER4コード配列 の存在は、該HER4コード配列に対して相同性であるポリヌクレオチドを含有する PCR 反応用のハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマーを使用 した、DNA-DNA ハイブリダイゼーションによって検出できる。 該第二の方法において、該組み換え発現ベクター／宿主系は幾つかの「マーカ ー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセ ート(MTX)に対する抵抗性、メチオニンスルホキシミン(MSX)に対する抵抗性、形 質転換表現型、バクロウイルス中での封入体形成等）の有無に基づき、同定しか つ選別することができる。例えば、該HER4コード配列が該ベクターのマーカー 遺伝子配列内に挿入された場合、このコード配列を含有する組み換え体は、該マ ーカー遺伝子機能が存在しないことによって同定できる。あるいはまた、マーカ ー遺伝子を、該HER4配列とのタンデム状態で、該HER4コード配列発現を調節する のに使用したものと、同一のまたは異なるプロモータの制御下に置くことができ る。誘導または選別に応答する、該マーカーの発現は、該HER4コード配列の発現 を表す。本明細書に例として記載する特別な一態様においては、選別可能なマー カーとしてのグルタミン合成酵素を組み込んだHER4発現ベクターを構築し、CHO 細胞のトランスフェクションのために利用し、CHO 細胞中でのHER4の増幅された 発現を、MSX の高い濃度について選別することにより、達成する。 第三の方法において、該HER4コード領域の転写活性は、ハイブリダイゼーショ ンアッセイにより評価できる。例えば、ポリアデニル化RNA を単離し、かつ該HE R4コード配列またはその特定の部分に対して相同なプローブを使用したノーザン ブロット法により分析することができる。あるいはまた、該宿主細胞の全核酸を 抽出し、かかるプローブに対するハイブリダイゼーションにつきアッセイするこ とも可能である。 第四の方法においては、HER4の該発現は、例えばウエスタンブロット、イムノ アッセイ、例えば放射性免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ等によって免疫学的 に評価することができる。また、HER4の発現は生物学的に活性な生成物を検出す ることにより評価できる。該宿主細胞が該遺伝子生成物を分泌する場合には、培 養したトランスフェクタント(transfectant)宿主細胞から得た細胞を含まない培 地を、HER4活性につきアッセイすることができる。該遺伝子生成物が分泌されな い場合には、細胞溶解物をかかる活性につきアッセイすることができる。何れの 場合にも、HER4に対するリガンド結合、HER4ホスホリル化、またはHER4の他の生 物活性を測定するアッセイを利用することができる。 5.4．抗−HER4抗体 本発明は、またHER4ポリペプチドのエピトープを認識するポリクローナルおよ びモノクローナル抗体をも意図する。抗−HER4抗体は、腫瘍学の分野における種 々の有用な応用をもつことが期待され、その幾つかを一般的に以下に記載する。 抗−HER4抗体の種々の用途のより詳細なかつ具体的な説明は、以下の章および小 区分に与えられる。簡単にいえば、抗−HER4抗体は培養された細胞、組織サンプ ルおよびインビボサンプル中のHER4ポリペプチド発現を検出し、定量するために 利用できる。HER4のこのような免疫学的検出は、例えば異常なまたは減衰された HER4発現により特徴付けられる、腫瘍形成の同定、追跡およびその予後における 補助のために利用することができる。更に、該HER4構造の異なる部分からのエピ トープを認識するモノクローナル抗体は、本来のHER4と該分子の種々の亜成分お よび／または変異型の検出および／またはこれらの間の識別のために使用するこ とができる。抗−HER4抗体処方物も、特にヒトの癌を効果的に処置することを可 能とする、有用な生物学的調節剤として具体化される。抗−HER4抗体は、種々の 診断および治療用途に加えて、多数の工業上および研究上の用途をもつことが、 当業者には明らかであろう。その例は、HER4ポリペプチドの精製のためのアフィ ニティー試薬としての抗−HER4抗体の利用およびHER4の生合成、代謝および生物 学的機能を明らかにするための免疫学的プローブとしての用途を包含する。 抗−HER4抗体は、HER4によって直接または間接的に媒介される細胞の機能およ び挙動に影響を与えるのに有用であり得る。一例として好ましいHER4抗体による HER4生物学的活性の調節は、HER2の活性化に影響を与え、またその結果としてHE R2により生ずる細胞内シグナルを調節する可能性がある。この点に関連して、抗 −HER4抗体は、HER2の、リガンド−誘発性のHER4−媒介活性化を効果的に遮断す るのに有用であり得、結果としてHER2の生物学的活性に影響を与える。従って、 HER4リガンドとして作用することのできる抗−HER4抗体は、HER4の生物学的活性 を誘発し、および／またはHER2の生物学的活性に及ぼす、リガンド−誘発性のHE R4−媒介作用を起こさせ、細胞応答、例えば分化、成長阻害等をもたらす。 更に、細胞毒性化合物と複合化した抗−HER4抗体は、このような化合物で、HE R4を発現する腫瘍細胞を選択的に攻撃するのに使用でき、腫瘍細胞の死滅、およ び該腫瘍を減少または根絶する。特定の一態様において、HER4に結合でき、かつ このような細胞中にインターナリゼーションできる、毒素と複合化した抗体を、 目標とした細胞毒性作用の達成のために、系統的に投与される。放射性核種およ び毒素を複合化した抗−HER4抗体の調製並びに使用については、以下の第5.5.章 で更に説明する。 HER2の過剰形成は、幾つかのヒトの癌と関連している。出願人のデータは、HE R2の過剰形成が見られる幾つかのヒトの癌において、HER4が発現されることを示 している。従って、抗−HER4抗体は、HER4の発現と共にHER2を過剰に発現する細 胞、例えば乳房腺癌細胞（但し、これに限定されない）に、成長および分化調節 作用を及ぼすことができる。従って、本発明は該HER4レセプタに結合して、HER2 またはHER2−HER4機能性を調節して、該ターゲット細胞内の応答性に影響を与え ることのできる抗体を含む。HER2生物学的活性のHER4−媒介調節を含む癌の治療 のために、これら２種のレセプタ間の細胞内分子相互作用に選択的かつ特異的に 作用できる試薬を、インターナリゼーションされる抗−HER4抗体に複合化するこ とができる。このような試薬の特異性は、乳癌細胞等の、HER2およびHER4を同時 に発現する細胞内でのみ生物学的効果を発揮できる。 当分野で公知の様々な手順が、HER4のエピトープに対するポリクローナル抗体 の製造のために利用できる。ポリクローナル抗体の製造のために、幾つかの宿主 動物、例えばウサギ、マウス、ラット等（これらに制限されない）が、HER4ポリ ペプチド処方物の１回以上の注射による免疫化によって抗−HER4抗体を製造する のに利用できる。種々のアジュバントを使用して、該宿主動物中の免疫応答性を 高めることができる。該アジュバントは、宿主の種に依存して、フロインド（完 全および不完全）アジュバント、リゾレシチン等の無機ゲル、プルロニックポリ オール、ポリアニオン、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニ ン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG( バクシルカルメット−ゲラン(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリ ウムパルブム(Corynebacterium parvum)等が挙げられるが、これらに制限されな い。 HER4のエピトープに対するモノクローナル抗体は、連続的な細胞系の培養によ る抗体分子の製造のために与えられた、任意の技術を利用して調製することがで きる。これら技術は初めにケーラー＆ミルシュタイン(Kohler and Milstein (Na ture，1975，256:495-497)により記載されたハイブリドーマ技術、極最近のヒト B-細胞ハイブリドーマ技術（コスボール(Kosbor)等，Immunology Today， 1983，4:72）およびEBV-ハイブリドーマ技術(コル(Cole)等，モノクローナル抗 体および癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，アランR.リス社 (Alan R．Liss，Inc.)，pp．77-96)を包含するが、これらに限定されない。更に 、適当な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子を、適当な生物学的活性 をもつヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメ ラ抗体」の製造のために開発された技術を利用することができる(モリソン(Morr ison)等，Proc．Natl．Acad．Sci.，1984，81:6851-6855; ニューバーガー(Neub erger)等，Nature，1984，312:604-608;タケダ(Takeda)等，Nature，1985，314: 452-454)。また、一本鎖抗体の製造用に開示された技術（米国特許第4,946,778 号）を、HER4−特異的一本鎖抗体の製造のために適用することができる。抗−HE R4モノクローナル抗体の組み換えヒトまたはヒトに適合させた態様は、ヒトの治 療用途用の好ましい態様である。ヒトに適合させた抗体は、文献に記載された手 順に従って調製することができる（例えば、ジョーンズ(Jones)等，Nature，198 6，321:522-25; ライヒマン(Reichman)等，Nature，1988，332:323-27; ベルホ イエン(Verhoeyen)等，Science，1988，239:1534-36）。ヒトに適合させた抗−H ER2モノクローナル抗体の製造のための、最近開示された「遺伝子変換変異形成 」法も、ヒトに適合させた抗−HER4抗体の製造において使用できる(カーター(Ca rter)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1992，89: 4285-89)。また、重および 軽領域のランダムな組み合わせをもつ組み換えファージライブラリを生成するた めの技術を利用して、組み換え抗−HER4抗体を調製することができる(例えば、 ヒューズ(Huse)等，Science，1989，246: 1275-81)。 一例として、抗−HER4モノクローナル抗体は、マウスを、選択的にHER4を過剰 発現する細胞（例えば、ATCCに寄託されているCHO/HER421-2細胞）または部分的 に精製した組み換えHER4ポリペプチドで免疫することにより生成することができ る。一態様において、完全な長さのHER4ポリペプチド（第1Aおよび1B図）は、バ クロウイルス系内で発現され、該組み換え細胞の膜画分を、マウスの免疫化のた めに使用した。次いで、ハイブリドーマを、ョンCHO/HER4細胞（例えば、ATCCに 寄託されているCHO HER4 21-2 細胞）についてスクリーニングして、HER4の細胞 外ドメインと反応性のモノクローナル抗体を同定する。このようなモノクローナ ル抗体は、HER4に結合するNDF またはHepG2-識別因子を遮断する能力、該細胞表 面に結合し、かつそこに滞留する能力もしくはHER4を発現する細胞内にインター ナリゼーションする能力、およびHER4チロシン自己ホスホリル化を直接向上調節 (upregulate)または減衰調節(downregulate)し、および／または細胞の成長また は分化の調節を生ずる、HER4−媒介シグナルを直接誘起する能力について評価す ることができる。これに関連して、HER2に対するモノクローナル抗体N28 および N29 は高い親和性で、特異的にHER2に結合する。しかしながら、モノクローナル 抗体N29 の結合は、レセプタのインターナリゼーションおよび減衰調節、形態学 的識別、および意識喪失したマウス中のHER2発現腫瘍細胞の阻害をもたらす。こ れとは対照的に、HER2発現細胞に結合するモノクローナル抗体N28 は、自己ホス ホリル化の刺激、およびインビボおよびインビトロ両者における腫瘍細胞成長の 促進をもたらす（ベイカス(Bacus)等，Cancer Res.，1992，52:2580-89;スタン コフスキー(Stancovski)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1991，88:8691-95） 。更に別の態様においては、可溶性組み換えHER4−イムノグロブリン(HER4-Ig) 融合タンパクが発現され、これはプロテインＡ(Protein A)アフィニティーカラ ム上で精製される。このようなHER4-Ig 融合タンパクの一つのアミノ酸配列は第 14図に与えられている。この可溶性のHER4-Ig 融合タンパクは、従ってファージ ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、該抗体結合サイ トの可変領域のあらゆる可能な組み合わせが、該ライブラリー中で該ファージの 表面上に提示されるように工夫されている。組み換え抗−HER4抗体は、該HER4-I g 融合タンパクを特異的に認識するファージから増殖する。 該分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により生成し 得る。例えば、このようなフラグメントは、以下に挙げるものを包含するが、こ れらに制限されない。即ち、完全な抗体分子のペプシン消化によって製造できる F(ab)'E2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元す ることにより生成し得るFab'フラグメント、および該抗体分子をパパインおよび 還元剤で処理することにより生成できる２つのFab フラグメントを包含する。ま た、Fab 発現ライブラリーを構築することができ（ヒューズ(Huse)等，Science ，1989，246:1275-1281）、かくしてHER4タンパクに対する所定の特異性をもつ モ ノクローナルFab フラグメントの迅速かつ容易な同定が可能となる。 5.5．HER4リガンド 本発明の一局面は、HER4リガンドを意図する。ここで、定義した如く、HER4リ ガンドは180Kの貫膜タンパクHER4/p180erbB4またはその機能的同族体に結合でき 、またチロシンキナーゼ活性を高めることができる。HER4/p180erbB4-リガンド の機能的同族体は、HER4チロシンキナーゼ活性を高めることを可能とする。該チ ロシンキナーゼ活性の増進は、自己ホスホリル化を刺激でき、かつHER4により媒 介される生物学的活性に影響を与える。HER4へのHER4リガンドの結合がチロシン ホスホリル化を開始させ、かつ乳癌細胞の分化に影響を与えることは、第12およ び13章に記載した系中で観測された。 本発明のHER4リガンドはNDF、即ちras-形質転換ラット繊維芽細胞から単離し た44kDa の糖タンパク（ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-572）、多重イソタ イプとして存在するヒレグリン、そのヒト同族体(ペレス(Peles)等，Cell，1992 ，69:205-218およびホルムス(Holmes)等，Science，1992，256:1205-1210)を包 含し、これらはp45(即ち、45K のヘパリン−結合糖タンパクを含み、これはタン パクのヒレグリン−群と幾つかの共通した特徴を有し、該共通した特徴は分子量 、乳癌細胞の分化の誘発能力、MDA-MB453 細胞中のチロシンホスホリル化の活性 化、およびN-末端アミノ酸配列（第13章以下）を含む)、gp30およびp75(ループ( Lupu)等，Science，1990，249:1552-1555およびループ(Lupu)等，Proc．Natl．A cad．Sci．USA，1992，89:2287-2291)を含む。 本発明のHER4リガンドは合成または組み換え手段によって調製でき、あるいは 天然源から単離することもできる。本発明のHER4リガンドは、該リガンドが、HE R4レセプタ結合能力およびチロシンキナーゼ活性化能力を維持するかぎりにおい て、NDF、p45 または他のヒレグリンもしくは当分野で公知の任意のHER4リガン ドに対して、アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができる。このよ うなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性およ び／または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ 酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジ ンおよびアルギニンを包含し、同様な親水性値をもつ非帯電の極性頭部基または 非極性頭部基をもつアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、 アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン 、チロシンを含む。 5.5.1．HER4リガンドの組み換え発現 本発明のHER4リガンドは、所定のHER4リガンドをコードするDNAのクローニン グおよび発現によって作成し得る。このようなDNA は、当分野で周知であり、融 合または成熟型で、多数の許容される宿主生物中で使用するのに適している、多 数の発現ベクターに結合することができ、また分泌を可能とするシグナル配列を 含むことができる。原核および真核両者の宿主発現系を、組み換えHER4リガンド の調製において使用できる。例えば、HER4リガンド先駆体コード配列またはその 機能的等価物を、該先駆体を正確にプロセッシングすることのできる宿主細胞中 で使用することができる。また、成熟HER4リガンドに対するコード配列は、該成 熟HER4リガンド分子を直接発現するように、使用することができる。該HER4リガ ンド先駆体コード配列の機能的等価物は、適当な宿主細胞内で発現させた場合に は、該HER4リガンドの合成、プロセッシングおよび／または輸送を指令できる、 任意のDNA 配列を包含する。 組み換えDNA 技術を利用したHER4リガンドの製造は説明の都合上四段階の工程 に分割できる。即ち、(1)該所定のHER4リガンドをコードするDNA の単離または 生成、(2)該所定のHER4リガンドの合成を指示することのできる発現ベクターの 構築、(3)該HER4リガンドコード配列を複製し、かつ発現し、および／または初 期生成物をプロセッシングして、該所定のHER4リガンドを生成することのできる 適当な宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換、および(4)該所定のHER 4リガンド生成物の同定および精製段階である。 5.5.2．HER4コードDNA の単離 HER4リガンドーコード核酸配列は、ヒト肝細胞癌細胞系、特にATCCから承認番 号HB8065として入手できるHepG2 細胞から得ることができる。更に、多数のヒト 細胞源が、HER4リガンドコード核酸を得るのに適しており、これらはATCCから承 認番号HTB 26として入手できるMDA-MB-231細胞、即ち脳組織（フォール(Falls) 等，Cell，1993，72:801-815およびマルチオニ(Marchionni)等，Nature，1993， 362:312-318)およびHER4/ERBB4遺伝子によってコードされる、180K貫膜タンパク HER4/p180erbB4に結合でき、かつチロシンキナーゼ活性を高めることができる任 意の細胞源を包含する。 HER4リガンドを同定するためのアッセイで使用する方法は、以下の第5.8.章で 説明する。 以下の第5.3.2.および5.3.3.章に記載される技術を、HER4リガンド発現ベクタ ーの構築およびHER4リガンド遺伝子生成物を発現する組み換え形質転換体の同定 に適用する。 5.5.3．抗−HER4リガンド抗体 本発明は、またHER4リガンドポリペプチドのエピトープを認識するポリクロー ナルおよびモノクローナル抗体を意図する。抗−HER4リガンド抗体は、腫瘍学の 分野において種々の有用な用途をもつことが期待される。簡単に言えば、抗−HE R4リガンド抗体は、培養細胞、組織サンプル、およびインビボでのHER4リガンド ポリペプチド発現の検出および定量のために使用することができる。例えば、該 HER4リガンドの種々の部分を由来とするエピトープを認識するモノクローナル抗 体は、結合を検出し、および／または該リガンドの非−結合領域の結合から識別 するのに使用することができる。抗−HER4リガンド抗体処方物も、特定のヒト癌 の効果的な処置を可能とする有用な生物調節剤として、本発明においてもくろま れている。抗−HER4リガンド抗体は、HER4を介して媒介されるシグナル導入を遮 断し、かくして望ましからぬ生物学的応答を阻害するのに利用できる。抗−HER4 リガンド抗体の種々の診断並びに治療上の利用性に加えて、多数の工業上および 研究上の用途が、当業者には明らかであり、例えば抗−HER4リガンド抗体の、HE R4リガンドポリペプチドの精製のためのアフィニティー試薬としての利用、およ びHER4リガンドの生合成、代謝および生物学的機能を評価するための免疫学的な プローブとしての利用を包含する。 抗−HER4リガンド抗体は、HER4によって直接または間接的に媒介される細胞機 能および挙動に影響を与えるのに有用であり得る。一例として抗−HER4リガンド 抗体によるHER4の生物学的活性の調節は、HER2の活性化に影響を与え、また結果 としてHER2により発生する細胞内シグナルを調節する。これに関連して、抗−HE R4リガンド抗体は、HER2の、リガンド−誘発性HER4−媒介活性化を効果的に遮断 するのに有用であり、かくしてHER2の生物学的活性に影響を与え得る。逆に、HE R4リガンドとして作用できる抗−HER4リガンド抗体は、HER4の生物学的活性を発 揮させ、および／またはHER2の生物学的活性に及ぼす、リガンド誘発性HER4媒介 作用の発揮させるのに利用でき、結果として分化、増殖阻害等の細胞応答をもた らす。 付随的に、細胞毒性化合物と複合化された抗−HER4リガンド抗体は、このよう な化合物を選択的に、HER4を発現する腫瘍細胞に作用させるのに使用して、腫瘍 細胞を死滅させ、かつ該腫瘍の減少または根絶をもたらすことができる。 当分野で公知の種々の手順が、HER4リガンドのエピトープに対する抗体の製造 に利用できる（上記第5.4.章参照）。 5.6．診断法 本発明は、またヒトの腫瘍形成状態、特に表皮起源の癌並びにより特定的には ヒト乳癌の検出に関連する。一態様において、第1Aおよび1B図に与えられた共通 HER4cDNA配列の部分に対応するオリゴマーを、ヒトの生物学的サンプル、例えば 血液、血清、または組織生検サンプル中のHER4mRNAのレベルを定量的に検出する のに使用する。ここでは、適当なハイブリダイゼーションまたはPCR フォーマッ トアッセイを利用して、腫瘍形成の徴候として、異常に高いレベルでHER4を発現 する細胞または組織を検出する。関連する一態様において、HER4mRNAの検出は、 適当なHER2配列を使用したHER2mRNAの過剰発現の検出とを組み合わせて、HER2と HER4との間の機能的な相関が存在する可能性のある腫瘍形成を同定することがで きる。 もう一つの態様においては、標識した抗−HER4抗体または抗体誘導体を使用し て、生物学的サンプル中のHER4の存在を検出（ここでは、種々の当分野で周知の イムノアッセイフォーマットを使用）し、またこれをその場での診断的放射線免 疫像形成法(radioimmunoimaging)のために利用することも可能である。一般的な 診断並びにステージング技術は、転移性腫瘍について、身体の総合的な走査を日 常的に与えることはない。従って、例えば蛍光物質、化学発光物質、および放射 性分子により標識した抗−HER4抗体が、この制限を排除できる。好ましい態様に おいては、γ−線放出性診断用放射性核種を、HER4のエピトープに対して特異的 であるが、他のEGFR−群の構成員とは有意に交叉反応しないモノクローナル抗体 に付着させる。この標識した抗体を、次に全身的に患者の体内に注入し、γ線カ メラを使用して、HER4分子の分布および密度について全身の撮像を得、コンピュ ータと組み合わせた断層撮像法または磁気共鳴撮像法を利用して、局所化された 画像を得、かくして必要ならばその状態を確認および／または評価する。好まし い診断用の放射性核種はテクネチウム-99m、インジウム-111、ヨウ素-123および ヨウ素-131を包含するがこれらに限定されない。 組み換え抗体−メタロチオネインキメラ(Ab-MTs)は、最近開示されたようにし て発生させることができる（ダス(Das)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1992 ，89:9749-53）。このようなAb-MTsは、該メタロチオネインのキレート化機能の ために、テクネチウム-99mを担持することができ、また化学的に接合するキレー ト形成剤を凌駕する利点をもたらす可能性がある。特に、高度に保存されたメタ ロチオネインの構造が、最小の免疫原性を与え得る。 5.7．HER4リガンドの同定のためのアッセイ 該EGFR−群の単一の構成員を過剰に発現する細胞系は、第７章以下に記載され るような適当な発現ベクターをもつ、種々の親細胞型のトランスフェクションに より発生させることができる。候補リガンド、または部分的に精製された処方物 を、このような細胞に適用して、レセプタ結合および／または活性化についてア ッセイすることができる。例えば、HER4発現プラスミドでトランスフェクション され、検出可能なEGFR、HER2またはHER3を含まないCHO-KI細胞系を使用して、HE R4-特異的リガンドをスクリーニングできる。このような細胞系の特定の一態様 は、以下の第７章に記載され、ATCCに寄託されている(CHO/HER4 21-2)。リガ ンドは、HER4の自己ホスホリル化、DNA 合成の刺激、形態的分化の誘発、培地中 の血清または増殖因子要求性の軽減、および標識され、精製された増殖因子の直 接結合を検出することにより同定できる。本発明は、また該HER4レセプタにより 媒介される生物学的活性に影響を与える能力に基づいて、HER4リガンドの強力な 類似体をテストするためのバイオアッセイにも関連する。 5.8．癌療法における本発明の利用 5.8.1．標的癌療法 本発明は、また異常なHER4の発現および／または機能を含むヒト癌およびHER2 の過剰発現がHER4の隣接発現と同時に起こる癌（例えば、ヒト乳癌およびHER4を 過剰発現し、またはHER4の発現と共にHER2を過剰に発現する他の腫瘍形成を包含 するが、これらに制限されない）の治療方法をも意図する。本発明の癌療法は、 一般的に複合化されていない、毒素−または放射性核種−複合化HER4抗体、リガ ンド、およびその誘導体またはフラグメントによる治療に基づくものである。特 定の一態様においては、このようなHER4抗体またはリガンドは、正常な組織およ び器官に対し、最小の毒性を維持した、HER2および／またはHER4を過剰に発現す る幾つかの癌、例えば転移性の乳癌の全身的なおよび標的治療のために利用でき る。この点について重要なことは、抗−HER2モノクローナル抗体が、HER2を過剰 に発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが報告されたことである(ベイカ ス(Bacus)等，Cancer Res.，1992，52:2580-89)。複合化した抗体による治療に 加えて、HER4を介するヒレグリンのシグナリングの調節がHER2を過剰に発現する 細胞、例えば幾つかの乳癌細胞の成長並びに分化に影響を及ぼす手段を与える。 ここでは、HER4−中和モノクローナル抗体、NDF/HER4アンタゴニスト、HER4の活 性化に対してスーパーアゴニストとして作用するモノクローナル抗体またはリガ ンド、またはHER2とHER4との間の相互作用を、ヘテロダイマー形成を崩壊するか または該HER2基質のHER-媒介ホスホリル化を遮断することにより防止する薬物を 使用する。 標的免疫毒素−媒介癌療法に対して、種々の薬物または毒素、例えば植物およ びバクテリア毒素を、抗−HER4抗体およびそのフラグメントと複合化することが できる。例えば、植物リシニスコミュニス(Ricinis communis)由来の細胞毒素で あるリシンを、当分野で公知の方法(例えば、ブレーキー(Blakey)等，Prog．All ergy，1988，45:50-90;マーシュ＆ネビル(Marsh and Neville)，J．Immunol.，1 988，140:3674-78)を利用して、抗−HER4抗体と複合化することができる。一旦 リシンが該細胞の細胞質内に入ると、そのＡ鎖は60Ｓリボソームサブユニットを 不活性化することにより、タンパク合成を阻害する(メイ(May)等，EMBO J.，198 9，8:301-08)。リシンに対する免疫毒素は、従って著しい細胞毒性をもつ。しか しながら、リシン免疫毒素は理想的に特異性という訳ではない。というのは、そ のＢ鎖が見掛け上全ての細胞表面に結合でき、しかもリシンＡ鎖により作成され る免疫毒素のみが、高い特異性をもつに過ぎないからである。該リシンＡ鎖の組 み換えまたは脱グリコシル化形は、該免疫毒素の改善された生存性（即ち、循環 系からの緩慢な除去）をもたらす可能性がある。リシンＡ鎖と抗体とを複合化す る方法は公知である(例えば、ビテラ＆トルペ(Vitella and Thorpe),Seminarsin Cell Biology)，pp.47-58; サンダース(Saunders)，フィラデルフィア,1991)。 免疫毒素の該処方中で使用できる付随的な毒素はダウノルビシン、メトトレキセ ート、リボソーム阻害剤（例えば、トリコサンチン(trichosanthin)、トリコキ リン(trichokirin)、ゲロニン(gelonin)、サポリン(saporin)、モルモルジン(mo rmordin)およびアメリカヤマゴボウの抗−ウイルスタンパク）および種々のバク テリア毒素（例えば、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素）を包含するが、こ れらに制限されない。標的癌療法で使用する免疫毒素は、該標的癌細胞との抗体 相互作用を生ずる任意の経路で投与でき、その経路は、例えば全身的投与および 腫瘍サイトへの直接的注入を包含する。もう一つの治療法は、徐放系、例えば該 治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスによる、免疫毒素の 投与であり得る。種々の徐放性材料が確立され、かつ当業者には周知である。徐 放性カプセルは、その化学的特性に応じて、数週間から100 日以上までの期間に 渡り、免疫毒素分子を放出できる。該治療薬の化学的特性および生物学的安定性 に依存して、タンパクの安定化のための付随的な手段を利用することができる。 好ましい抗−HER4抗体を使用する、標的放射線療法については、標識のために 好ましい放射性核種はα、βおよびオージェ(Auger)電子放出器を包含する。α 線放出物質の例は、アスタチン211 およびビスマス212 を含み、β線放出物質は ヨウ素131、レニウム188、銅67およびイットリウム90を含み、またヨウ素125が オージェ電子放出物質である。 同様に、標的癌療法用の治療薬としての、毒素−複合化抗体の使用に関連して 示唆されたように、精製されたリガンド分子は化学的に細胞毒性物質と複合化で きる。更に、細胞毒素全体またはその一部に融合されたHER4結合（即ち、リガン ド）部分を含む、組み換えキメラポリペプチドは、該毒素またはその一部をコー ドするDNA を使用して、読み取り枠中に、該リガンドをコードするDNA を含むベ クターを構築することにより操作できる。このような組み換えリガンド−毒素は HER4発現癌細胞を特異的に攻撃するのに使用できる。このようなリガンド−毒素 の特別な態様をここに記載し、以下の第5.8.2.章および以下の第15章でより詳細 に説明する。 5.8.2．HER4発現腫瘍細胞を特異的に標的とするヒレグリン毒素の生成 本発明のもう一つの局面は、HER4発現腫瘍細胞を特異的に標的とし、かつこれ を死滅させる方法を開発することに関する。より詳しく言えは、HER4発現腫瘍細 胞は、このような腫瘍細胞を特異的に標的とし、かつ該細胞と融合タンパクと接 触させることにより死滅させる。ここで、該融合タンパクは、このような細胞上 で発現されるHER4を活性化することのできる、ポリペプチドと共有結合により結 合した細胞毒性ポリペプチドを含有する。 以下の第15章に例として記載される特定の態様においては、キメラヒレグリン β２リガンドと該細胞毒性物質PE40とを含む融合タンパクが、対応するキメラコ ード配列の発現により生成される。PE40はシュードモナス外毒素PEの誘導体、即 ちシュードモナスエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)によって作成される強 力な殺細胞剤である（フィッツジェラルド(Fitzgerald)等，Cell，1980，21:867 -873）。野性型タンパクPEは、３つのドメインを含み、その機能は細胞の識別、 膜トランスロケーションおよび延長因子２のADP リボシル化である。これは、細 胞表面レセプタと結合し、エンドサイト−シス小胞を介して該細胞に入り、かつ 延長因子２のADP-リボシル化を触媒することにより該細胞を殺す。該誘導体PE40 は野性型タンパクの細胞結合機能を持たないが、依然として強力な細胞毒性活性 を示す。特異的な細胞標的分子を有するPE40融合タンパクの生成は、既に記載さ れている（コンドー(Kondo)等，J．Biol．Chem.，1988，263:9470-9475(種々の モノクローナル抗体とのPE40融合);フリードマン(Friedman)等，Cancer Res.，1 993，53:334-339(BR96/PE40融合);米国特許第5,206,353 号(CD4/PE40 融合);米 国特許第5,082,927 号(IL-4/PE40融合)および米国特許第4,892,827 号(TGE−α/ PE40 およびIL-4/PE40 融合）。 以下の第15章に記載する、キメラヒレグリン−毒素タンパクHAR-TXβ２は、ア ンフィレグリン(AR)リーダー配列を含み、結果として該組み換えタンパクの精製 を容易にする。出願人のデータにより確認されたように、このARリーダーは、組 み換えヒレグリン−毒素の結合特異性に何の影響も与えない。関連する態様は、 例えば該ヒレグリン群の他の構成員、例えばヒレグリン−β１およびヒレグリン −α等に結合するPE40およびHER4を活性化できる他の分子を包含する。 培養した腫瘍細胞系を使用した細胞毒性アッセイにおいて、本出願人はキメラ ヒレグリン−PE40タンパクの細胞毒性の、HER4発現腫瘍細胞に対する特異性を立 証している。これらは前立腺癌、膀胱癌およびかなりの数の異なる型の乳癌（増 幅されたHER2発現をもつ乳癌細胞を包含する）を含有するが、これらに限定され ない。該分子の細胞結合部分の特異性およびPE40の細胞毒性能力両者の２機能性 の保持は、極めて強力で標的性の高い試薬を与える。 ヒレグリン−毒素の治療上有効な量は、治療すべき対照、投与経路および患者 の状態に依存するであろう。従って、服用量の力価を測定し、かつ投与経路を、 最適の治療効果が得られるように必要に従って変更すべきである。典型的な毎日 の投与量は、静脈内投与については、0.1 mg/kg〜1mg/kgの範囲、好ましくは0.1 〜0.5mg/kgの範囲である。固形腫瘍の退行のためには、４日置きに３回の服用な るスケジュールで、3-5 回服用できる。また、徐放性処方物（上記第5.8.1.章を 参照）の使用も、該薬物の投与のために考慮できる。ヒレグリン−毒素の治療上 の効率は、２〜10の範囲内であり得、これは腫瘍退行作用が、毒素投与量よりも ２〜10倍低いことが予想されることを意味する（以下の第15章参照）。望ましく は、該ヒレグリン−毒素は、所定の治療効果を達成する用量および頻度で投 与されるであろう。これは公知のアッセイを利用して追跡できる。 本発明のヒレグリン−毒素を使用した癌療法は、腫瘍の種類に依存して、化学 療法、外科手術および放射線療法と組み合わせることができる。低分子量毒素薬 剤を使用する利点の一つは、外科手術によっては突き止め且つ除去することがで きない転移性病巣を標的とすることができることである。ヒレグリン−毒素は、 またMDR(多重薬物耐性(Multi Drug Resistance))正の患者に対して特に有用であ る。というのは、多くの標準的な癌治療用の薬物がそうであるように、その作用 機構が、MDR 正の細胞のp-糖タンパクポンプにより阻害されないからである。 5.9．HER4リガンドの他の治療上の用途 HER4リガンドの付随的な治療上の用途は、過度の活性化というよりも、寧ろ不 十分なHER4レセプタチロシンキナーゼ活性化によって発症する他の諸疾患を包含 する。この点に関連して、タイプII糖尿病は、リガンド結合ドメインにおける変 異を含む、インシュリン−レセプタ内の変異によって起きる、不十分なインシュ リン−媒介シグナル導入の結果である(タイラ(Taira)等，Science，1989，245:6 3-66; オダワラ(Odawara)等，Science，1989，245:66-68; オベルメイヤー＆ク ッサー(Obermeier and Kusser)等，J．Biol．Chem.，1989，264:9497-9504)。こ のような疾患は、機能的リガンド−レセプタ相互作用を再−設定する、変性した リガンドまたはリガンド類似体によって治療できるかもしれない。 5.10．HER4類似体 HER4誘導体、類似体およびHER4関連ペプチドの製造並びに使用も、本発明にお いてもくろまれ、その範囲内に入るものである。このような誘導体、類似体およ びペプチドは、HER4特異的リガンドの結合に対して、本来のHER4と競合させるの に使用して、HER4シグナル導入および機能を阻害することができる。HER4機能の 阻害は、HER4の生物学的活性が関与する癌の治療を包含する（これらに制限され ない）幾つかの用途において有用である。 特定の一態様において、第1Aおよび1B図に示した該HER4ヌクレオチドコード配 列における、一連の欠失変異を構築し、かつ分析して、HER4リガンドの結合に必 要な最少のアミノ酸配列を決定することを可能とする。HER4コード配列の欠失変 異は、当分野で公知の方法で構築でき、該方法はヌクレアーゼおよび／または制 限酵素の使用、サイト−特異的変異形成技術、PCR 等を包含するが、これらに制 限されない。該変異を受け、発現されたポリペプチドは、HER4リガンドに対する 結合能につきアッセイすることができる。 次に、所定のHER4類似体をコードするDNA 配列を、バクテリアまたは真核生物 細胞中で過剰発現するための、適当な発現ベクター内にクローニングすることが できる。ペプチドは、多数の方法、例えばHER4リガンドまたは抗体を使用したイ オン−交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー（これ らに限定されない）で、細胞抽出物から精製することができる。また、ポリペプ チドは、固相技術で合成し、次いで樹脂から開裂し、かつ高速液体クロマトグラ フィーにより精製することによって合成できる。 6．実施例：HER4をコードするcDNAの単離 EGFRおよび関連タンパクHER2、HER3およびXmrkは、そのチロシンキナーゼドメ インにおいて高いアミノ酸相同性を示す(カプラン(Kaplan)等，Nature，1991，3 50:158-160;ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-72;ホルムズ(Holmes)等，Scienc e，1992，256:1205-10; ヒライ(Hirai)等，Science，1987，238:1717-20)。更に 、これらの触媒ドメインをコードするゲノム領域内に、エキソン−イントロン境 界が厳密に保存されている（ベン等の上記文献; リンドバーグ＆ハンター(Lindb erg and Hunter)，Mol．Cell Biol.，1990，10:6316-24; および未発表の観測） 。縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、これら４種のタンパクのキナーゼドメ イン由来の単一のエキソンまたは隣接エキソンによりコードされる保存されたア ミノ酸に基づいて設計された。これらのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR )で使用して、マウスEGFR、erbB2 およびerbB3 に対応するゲノムフラグメント を単離した。更に、高度に関連したDNA フラグメント（MER4と命名）を、これら 他の遺伝子とは別のものとして同定した。同様な方法を使用して、乳癌細胞系MD A-MB-453から、MER4のヒト同族体に相当するcDNAクローンを得た。このフラグメ ントをプローブとして使用して、幾つかの乳癌細胞系およびヒト心臓が、 該EGFR−関連転写物の豊富な源であることを見出した。cDNAライブラリーを、ヒ ト心臓およびMDA-MB-453細胞由来のRNA を使用して構築し、かつオーバーラッピ ングクローンを単離した。これはHER4/erbB4の完全な読み取り枠に広がるもので あった。 6.1．材料および方法 6.1.1．分子クローニング 縮重オリゴヌクレオチドの幾つかのプールを、EGFR−群の構成員（第１表）由 来の保存された配列に基づいて合成した（5'-ACNGTNTGGGARYTNAYHAC-3'[SEQ ID NO:14]; 5'-CAYGTNAARATHACNGAYTTYGG-3'[SEQ ID NO:16]; 5'-GACGAATTCCNATHAA RTGGATGGC-3'[SEQ ID NO:17]; 5'-AANGTCATNARYTCCCA-3'[SEQ ID NO:18],5'-TCC AGNGCGATCCAYTTDATNGG-3'[SEQ ID NO:19]; 5'-GGRTCDATCATCCARCCT-3'[SEQ ID N O:20]; 5'-CTGCTGTCAGCATCGATCAT-3'[SEQ ID NO:21]; TVWELMT[SEQ ID NO:22]; HVKITDFG[SEQ ID NO:23]; PIKWMA[SEQ ID NO:13]; VYMIILK[SEQ ID NO:24]; WEL MTF[SEQ ID NO:25]; PIKWMALE[SEQ ID NO:26]; CWMIDP[SEQ ID NO:27]。全ゲノ ムDNA を準密集(subconfluent)マウスK1735 メラノーマ細胞から単離し、40サイ クルのPCR におけるこれらオリゴヌクレオチドプライマーをもつ鋳型として使用 した。PCR 生成物をアガロースゲル上で分離し、ヒトEGFRおよびHER2のキナーゼ ドメインからの32P-標識プローブにハイブリッド化した。明確なDNA バンドを単 離し、配列分析のためにサブクローニングした。縮重したオリゴヌクレオチドH4 VWELM およびH4VYMIILを、PCR 増幅におけるプライマーとして使用して（プロー マン(Plowman)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87:4905-09）、マウスe rbB4 に対応する144 個のヌクレオチド挿入断片を含む一つのクローン(MER4-85) を同定した。この32P-標識挿入断片を使用して、該マウスerbB4 遺伝子の２つの エキソンを含有することが分かっているマウスT-細胞ゲノムライブラリー（CA州 ラジョラのストラタジーヌ(Stratagene)社）から17キロベースのフラグメントを 単離した。erbB4 エキソンのDNA 配列に基づいて、具体的なオリゴヌクレオチド (4M3070)を合成し、一本鎖MDA-MB-453cDNAの鋳型上で、縮重5'- オリゴヌクレオ チド(H4PIKWMA)を使用したPCR プロトコールで使用した。この反応は、ヒ トHER4に相当する260 ヌクレオチドのフラグメント(pMDAPIK)を生成した。cDNA ライブラリーを、λZAP II（ストラタジーヌ(Stratagene)社）内で、オリゴ(dT) - および特異的−感作MDA-MB453 およびヒト心臓RNA から構築した（プローマン (Plowman)等の上記文献およびプローマン(Plowman)等，Mol．Cell Biol.，1990 ，10:1969-81）。HER4−特異的クローンを、pMDAPIK 由来の32P-標識挿入断片に より該ライブラリーをプローブすることにより単離した。HER4の5'- 位置のクロ ーニングを完了するために、我々はPCR 法を利用し、cDNA末端の迅速な増幅を可 能とした（プローマン(Plowman)等の上記文献、フローマン(Frohman)等，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，1988，85:8998-9002）。全てのcDNAクローンおよび幾つ かのPCR により生成したクローンを、T7ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、両ストランドについて配列決定した（テーバー＆リチャ ードソン(Tabor and Richardson)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1987，84:476 7-71）。 6.1.2．ノーザンブロット分析 3'- および5'-HER4 特異的〔α32P]UTP-標識アンチセンスRNA プローブを、そ れぞれ線状化したプラスミドpHtlB1.6（ヌクレオチド3098で開始する800 bpのHE R4フラグメントを含有）およびp5'H4E7(HER4配列の5'- 末端由来の１kbのフラグ メントを含有)から合成した。組織分布解析（以下の第6.2.3.章）のための、該 ノーザンブロット（CA州、パロアルトのクロンテック(Clontech)社）は、レーン 当たりナイロン膜上に固定化されたヒト組織サンプル８個からのポリ(A)+mRNAを ２Mg含んでいた。フィルタを、RNA ハイブリダイゼーション混合物（50% ホルム アミド，5x SSC，0.5% SDS，10x デンハーツ(Denhardt's)溶液，100 μg/ml変性 ニシン精液DNA，100μg/ml tRNA および10μg/mlポリアデノシン）中で、数時間 60℃にて予備ハイブリッド化し、同一のバッファー中で60℃にて、32P-標識アン チセンスRNA プローブ1-1.5 x 106 cpm/mlと共に一夜ハイブリッド化した。この フィルタを0.1x SSC/0.1% SDS 中で65℃にて洗浄し、かつホスホイメージャー(P hosphoImager)(CA州、サニーベールのモレキュラーダイナミックス(Molecular D ynamics)社)上で一夜露光した。 6.1.3．HER4の半定量的PCR 測定 RNA は種々のヒト細胞系、新鮮な凍結組織および一次腫瘍から単離した。一本 鎖cDNAを、3'- 末端にT17 トラック(track)を含むオリゴヌクレオチド： で感作することにより、各RNA 10μｇから合成し、1%または5%の各一本鎖鋳型処 方物を使用して、２種のHER4−特異的オリゴヌクレオチドと共にPCR 反応を35サ イクル実施した： 反応生成物を2%アガロースゲル上で電気泳動させ、エチジウムブロミドにより染 色し、かつUV光ボックス上で写真撮影した。該291-bpのHER4−特異的バンドの相 対的強度を、第２表に示されるように、各サンプルについて見積もった。 6.2．結果 6.2.1．HER4をコードするcDNAクローンの配列分析 HER4をコードするおよびコードしないヌクレオチド配列の一部をコードするcD NAクローンを、上記第6.1.1.章で概説した方法に従って、PCR クローニングによ り単離した。これらのcDNAから組み立てた完全なHER4ヌクレオチド配列は、第1A および1B図に示されており、該配列は1308個のアミノ酸をもつポリペプチドをコ ードする、単一の読み取り枠を含む。該HER4コード領域は、33個のヌクレオチド の5'- 未翻訳の領域およびポリ(A)テイルで終端する1517個のヌクレオチドの3'- 未翻訳の領域と隣接している。25個のアミノ酸疎水性シグナル配列が、第1Aお よび1B図に示されたアミノ酸配列中の位置番号１における共通の開始メチオニン に続く。このシグナル配列に関連して、該成熟HER4ポリペプチドは、第1Aおよび 1B図に示された配列中のアミノ酸残基番号26(Gln)にて始まることが予想され、 これは該配列中の次の1283アミノ酸を伴うであろう。かくして、本発明の始原型 の成熟HER4は1284個のアミノ酸をもち、計算されたMr144,260 ダルトンおよび第 1Aおよび1B図の残基26〜1309に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドであ る。 該HER4ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列（第1Aおよび1B図）と、入 手可能なDNA およびタンパク配列データベースとの比較は、該HER4ヌクレオチド 配列が独特のものであり、かつHER2とのアミノ酸同一性60/64 およびラットEGFR 同族体tyro-2に対するアミノ酸同一性54/54 を示した。 6.2.2．関連cDNAの配列分析 該始原型HER4ポリペプチドに関連するポリペプチドをコードする幾つかのcDNA （第1Aおよび1B図）も、該MDA-MB-453cDNAライブラリーから単離したが、これは ２つの型を含んでいた。 該２つの型のcDNAの第一は、ヌクレオチド3168（第1Aおよび1B図中のアミノ酸 位置1045のArg をコードする）までの共通HER4ヌクレオチド配列と同一であり、 次いで急激に相同性から外れて、見掛け上は無関係の配列となった（第2Aおよび 2B図並びに第４図）。この残基の下流側に、読み取り枠が更に13アミノ酸続き、 その後停止コドンに至り、これは2 kbの3'- 未翻訳の配列およびポリ(A)テイル を伴う。このcDNAは、削除された該始原型HER4のC-末端自己ホスホリル化ドメイ ンを有するHER4変異体を与えることが予想されよう。 第二の型のcDNAは、各々該HER4共通配列と同一の3'- 配列をもつが、ヌクレオ チド2335（第1Aおよび1B図中のアミノ酸位置768 におけるGlu をコードする）の 5'- 末端側で相同性から外れ、更に114-154 ヌクレオチドのみが上流側に続く、 ４つの独立のクローンとして単離された（第３図および第５図）。ヌクレオチド 2335は、該HER2遺伝子におけるイントロン−エキソン結合の正確な位置であり（ クセンス(Coussens)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，82:6497-6501）、 このことは、これらのcDNAが、該フランキングイントロン内の潜在プロモータか ら開始するmRNAから誘導できることを示唆している。これらの5'- 切頭転写物は 第1Aおよび1B図の該HER4cDNA配列と同一の読み取り枠を含み、第1Aおよび1B図の アミノ酸位置772 におけるMet に対するコドンで開始している。これらのcDNAは 細胞質性HER4変異ポリペプチドをコードすることが予想され、該ポリペプチドは 該HER4キナーゼのATP-結合ドメインの直ぐ下流側で開始する。 6.2.3．HER4発現のヒト組織内分布 ヒト組織サンプルからのポリ(A)+mRNAのノーザンブロットを、上記第6.1.2.章 に説明したように、該自己ホスホリル化ドメインをコードする、HER4の3'- 末端 に、アンチセンスRNA プローブを使用してハイブリッド化した。約６kbのHER4mR NA転写体が同定され、かつ心臓および骨格筋内において最も豊富に存在すること が分かった（第８図のパネル１）。約15kbを越えるmRNAが脳内に検出され、低レ ベルにて心臓、骨格筋、腎臓および膵臓組織サンプル中にも検出された。 同一のブロットをストリッピングし、かつHER4の5'- 末端由来のプローブを使 用して、また上記と同様な手順を利用して、細胞外ドメインコード領域に再度ハ イブリッド化した。このハイブリッド化は、該15kbのmRNA種の分布を確証し、か つ心臓、骨格筋、腎臓および膵臓組織サンプル（第８図のパネル２）中で6.5 kb のmRNA種を検出し、また肺、肝臓および胎盤中に弱いシグナルを検出した。その 上、1.7-2.6 kbの少量の転写物も、膵臓、肺、脳、および骨格筋組織サンプル中 に検出された。種々のサイズのRNA 転写物の有意性は未知である。 種々のヒト組織をも、上記第6.1.3.章で記載した半−定量PCR アッセイを利用 して、HER4mRNAの存在につき調べた。得られた結果を、一次腫瘍サンプルおよび 新生物細胞系についてのアッセイ（本章の直後の第6.2.4.章）の結果と共に第２ 表に示す。これらの結果は、選択されたRNA サンプルについてのノーザンおよび 溶液ハイブリダイゼーション分析の結果と首尾よく相関している。HER4転写物発 現の最大のレベルは、心臓、腎臓および脳組織サンプル中に見られた。さらに、 高濃度のHER4mRNA発現が傍甲状腺、小脳、下垂体、脾臓、睾丸および乳房組織サ ンプル中に見られた。低い発現レベルが、胸腺、肺、唾液腺、および膵臓組織サ ンプル中に見られた。最後に低い負の発現が肝臓、前立腺、卵巣、副腎、結腸、 十二指腸、表皮および骨髄サンプル中に観測された。 6.2.4．一次腫瘍および新生物起源の種々の細胞系におけるHER4mRNA発現 幾つかの一次腫瘍および多数の新生物起源の種々の細胞系におけるHER4mRNA発 現プロフィールを、該HER4キナーゼドメインの配列由来のプライマーを使用した 半−定量的PCR アッセイ（上記第6.1.3.章）によって測定した。この結果を第２ 表に示す。この分析は、４種のヒト乳腺癌細胞系(T-47D，MDA-MB-453，BT-474お よびH3396)および神経芽腫(SK-N-MC)および膵臓癌(Hs766T)細胞系中のHER4RNAの 最大の発現を検出した。中間的発現が、３種の付随的な乳房の癌細胞系(MCF-7， MDA-MB-330，MDA-MB-361)において検出された。低いまたは検出不能の発現が乳 房の癌由来の他の細胞系(MDA-MB-231，MDA-MB-157，MDA-MB-468，SK-BR-3)、腎 臓(Caki-1，Caki-2，G-401)、肝臓(SK-HEP-1，HepG2)、膵臓(PANC-1，AsPC-1，C apan-1)、結腸(HT-29)、頸部(CaSki)、陰門(A-41)、卵巣(PA-1，Caov-3)、メラ ノーマ(SK-MEL-28)または種々の白血病細胞系に見出された。最後に、高レベル の発現が、ウイルムス（腎臓）および乳癌等の一次腫瘍サンプル中で観測された 。 7．実施例：HER4の組み換え発現 7.1．材料および方法 7.1.1．CHO-KI細胞および培養条件 CHO-KI細胞をATCCから得た（承認番号CCL 61）。これらの細胞は、イムノブロ ット法、チロシンホスホリル化および35S-標識免疫沈降分析により検出可能な、 如何なるEGFR、HER2またはHER3をも含まない。HER4を発現する、トランスフェク ション処理された細胞コロニーを、10% の透析した子牛血清、増大する濃度のメ チオニンスルホキシミンを補充した、グルタミンを含まない、グラスゴウ(Glasg ow)改良イーグル培地(GMEM-S;ギブコ(Gibco)製)中で選択した（ベビングトン(Be bbington)，1991，メソッズ：アコンパニオンツーメソッズインエンザイモロジ ー(Methods: A Companion to Methods in Enzymology)，2:136-145，アカデミッ クプレス）。 7.1.2．発現ベクターの構築およびトランスフェクション 始原型HER4の完全な４kbのコード配列を再度構築して、サイトメガロウイルス の即時型プロモータ（ベビングトンの上記文献）の制御下で、グルタミン合成酵 素発現ベクターpEE14 に挿入して、HER4発現ベクターpEEHER4 を生成した。この 構築物(pEEHER4)をMluIで線状化し、標準的な技術を利用した、燐酸カルシウム 沈殿法で、CHO-KI細胞中にトランスフェクションした。初期耐性コロニーを選別 するために、上記ベビングトンの文献に記載されているように、初期濃度25μM( L-MSX)のメチオニンスルホキシミンおよび10% の透析した子牛血清を補充したGM EM-Sからなる選択培地上で、該細胞を培養した。２週間後、孤立したコロニーを 48−ウエルプレートに移し、直ぐ下に記載するように、HER4発現イムノアッセイ のために展開した。MSX のより高い濃度を使用した後の選別ラウンドを利用し、 MSX の最大濃度に耐える細胞コロニーを単離した。種々のMSX 濃度にて選別され た幾つかのCHO/HER4クローンをこのようにして単離した。 7.1.3．HER4発現イムノアッセイ 密集的細胞単層を低張性溶解バッファー(10mM Tris pH7.4，1 mM KCl，2 mM M gCl2)中に４℃にて掻き取り、30ストロークでドーンス(dounce)均質化し、細胞 デブリスを3500 x gにて５分間遠心処理することにより除去した。膜画分を100, 000 x ｇにて20分間遠心処理して集め、得られたペレットを、2-メルカプトエタ ノールを含む高温ラエムリ(Laemmli)サンプル中に再懸濁した。同時的にHER4配 列と同一のHER2キナーゼドメインの19アミノ酸領域(残基927-945)またはHER4のC -末端近傍の領域をもつ一連なりの７個の連続した残基をもつ、HER2のC-末端の1 4個の残基に対して生成したHER2免疫試薬をを使用して、該HER4ポリペプチドの 発現を、溶解された細胞または膜処方物について、検出した。更に増幅すると、 HER4が、PY20抗−ホスホチロシン抗体(ICNバイオケミカルズ(Biochemicals))を 使用したイムノブロット法により、溶解した細胞抽出物から検出された。これは 、恐らく異常に高いレセプタ密度に起因するレセプタの凝集による、HER4の自己 活性化および自己ホスホリル化を反映するものと考えられる。より具体的には、 発現は、ブロット(PBS中の2.5%乾燥ミルク、0.2%のNP40)中に1:500 で希釈した1 25 I- 山羊抗−マウスIgF(ab')2(アマーシャム(Amersham)，UK)を第二の抗体とし て使用して、該ブロット中に1:50にて希釈したHER2に対する一次マウスモノクロ ーナル抗体(Neu-Ab3; オンコジーヌサイエンス(Oncogene Science))を使用した イムノブロット法で検出した。また、HER2残基929-947(NY，バレイスト リームのケンブリッジリサーチバイオケミカルズ(Cambridge Research Biochemi cals))に対するヒツジポリクローナル抗−ペプチド抗体を、第二の抗体としての 、ブロット中に1:200 で希釈した125I- プロテインＧ(アマーシャム(Amersham)) と共に、ブロット中に1:100 に希釈した一次免疫試薬として使用した。フィルタ をブロットで洗浄し、ホスホイメージャー（モレキュラーダイナミックス(Molec ular Dynamics)）上で一夜放置した。 7.2．結果 完全なヒト始原型HER4ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクシ ョンしたCHO-KI細胞を、上記の第7.1.章およびその次の章に概説したように、増 大する濃度のメチオニンスルホキシミンを含有する培地中での増幅された発現の ために選択した。HER4の発現は上記第7.1.3.章に記載したイムノアッセイを使用 して評価した。安定にHER4を発現する幾つかのトランスフェクションされたCHO- KI細胞クローンを単離した。特定のクローンの一つCHO/HER4 21-2 は、250 μM のMSX を補充した培地中で選別され、かつHER4を高いレベルで発現した。CHO/HE R4 21-2 細胞はATCCに寄託されている。 CHO/HER4細胞中で発現された組み換えHER4は、HER2よりも僅かに低い180,000 なる見掛けのMrにて移動し、一方でその親細胞CHO は交叉反応バンドを全く示さ なかった（第９図）。更に、130kDaのバンドも該CHO/HER4細胞中に検出され、ま た恐らく180kDaの成熟タンパクの分解生成物を表すものと思われる。CHO/HER4細 胞は、該HER4チロシンキナーゼのリガンド特異的結合および自己ホスホリル化を 同定するのに使用した（第９章およびそれ以下の章を参照のこと）。 8．実施例：EGFR−群のリガンドを検出するためのアッセイ 8.1．細胞系 各々ヒトEGFR−群の単一の構成員を発現する４つの組み換え細胞系を含むパネ ルを、以下の第8.2.章に記載するチロシンキナーゼ刺激アッセイで使用するため に生成した。この細胞系CHO/HER4 3は上記の第7.1.2.章に記載のようにして、生 成した。CHO/HER2細胞（クローン1-2500）を、dhfr- 欠失CHO 細胞中でのジヒド ロフォレートリダクターゼ−誘発遺伝子増幅により、組み換えヒトp185erbB2を 高レベルで発現するように選択した。このHER2発現プラスミドcDNeu は、完全な 長さのHER2コード配列を、変性pCDM8(CA州，サンジエゴのインビトロゲン(Invit rogen))発現ベクター内に挿入することにより生成した(シード＆アルフォ(Seed and Aruffo)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1987，84:3365-69)。ここで、pSV2 DHFR（SV40即時プロモータにより誘導されるマウスdhfrcDNAを含有する）由来の 発現カセットは該pCDM8 ベクターの固有のBamHI サイトに挿入した。この構築物 は、該CMV 即時型プロモータからのHER2の発現を行う。 NRHER5細胞（ベルー(Velu)等，Science，1987，1408-10）はDr．シング−ジェ ンクング(Hsing-Jien Kung)（OH 州，クリーブランドのケースウエスターンリザ ーブユニバーシティー(Case Western Reserve University))から入手した。この マウス細胞系は、該ヒトEGFRを担持するレトロウイルスストックに感染した、NR 6 細胞から、クローニングにより単離され、これは細胞当たり約106個のヒトEGF Rを有することが分かっている。 該細胞系293/HER3は、p160erbB3の高レベルでの発現について選別された。そ の親細胞系、即ち293 ヒト胚の腎臓細胞は、本質的にアデノウイルスEla を発現 し、かつ低レベルでEGFRを発現する。この細胞系は線状化されたcHER3(プローマ ン(Plowman)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87:4905-09)およびpMClne oPolyA（単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータを有するネオマイシン選択性 マーカー；ストラタジーヌ(Stratagene)）の同時のトランスフェクションにより 樹立され、選別は500 μg/mlのG418を含有するDMEM/F12培地中で行われる。 8.2．チロシンキナーゼ刺激アッセイ 細胞を6-ウエルの組織培養プレート（ファルコン(Falcon)）に入れ、37℃にて 18−24時間付着させ、これら細胞を血清を含まない培地に移し少なくとも１時間 放置した。細胞の単層を、次に第7.3.章に示したリガンド処方物の量と共に５分 間37℃にてインキュベートした。次いで、該細胞をPBS で洗浄し、氷上で、ホス ファターゼ阻害剤を含有する0.5 mlのPBSTDS(10 mMのNaHPO4; 7.25; 150mM のNa Cl; 1%のトライトン(Triton)X-100;0.5%のデオキシコレート; 0.1%の SDS; 0.2%ナトリウムアジド; 1 mMのNaF; 1 mM のEGTA; 4 mMのナトリウムオルトバナ デート; 1%のアプロチニン;5 mg/mlのロイペプチン)により溶解させた。細胞デ ブリスを遠心処理(12000 xg，15分，４℃）によって分離し、透明な上澄を、CHO /HER4および293/HER3細胞については、１mgのホスホチロシンに対するマウスモ ノクローナル抗体(PY20;オハイオ州，クリーブランドのICN バイオケミカルズ(B iochemicals))と反応させ、CHO/HER2茶房については、１mgのHER2に対するマウ スモノクローナル抗体(Neu-Ab3，オンコジーヌサイエンスズ(Oncogene Sciences ))と反応させ、NRHER5細胞については、１mgの、ヒトEGFR（アマーシャム(Amers ham)）に対するマウスモノクローナル抗体EGFR-1と反応させた。４℃にて１時間 のインキュベーションの後、30μｌの、抗−マウスIgG-アガロース(PY20およびN eu-Ab3抗体について)、またはプロテインA-セファロース(EGFR-R1抗体について) の1:1 スラリー(PBSTDS 中)を添加し、該インキュベーションを更に30分継続さ せた。該ビーズを３回PBSTDS中で洗浄し、還元性の7%SDS-ポリアクリルアミドゲ ル上での電気泳動によって、該複合体を分離した。このゲルをニトロセルロース に転写し、TNET(10 mMのTris pH 7.4，75 mMのNaCl，0.1%のツイーン(Tween)-20 ，1 mMのEDTA)中で遮断した。TNET中で1:1000に希釈したPY20抗−ホスホチロシ ン抗体を一次抗体として使用し、次いでTNET中で1:500 に希釈した125I−山羊抗 −マウスIgF(ab')2を使用した。得られたブロットをTNETで洗浄し、かつホスホ イメージャー（モレキュラーダイナミックス(Molecular Dynamics)）上で露光し た。 8.3．結果 幾つかのEGF-群の構成ポリペプチドおよびリガンド処方物を、組み換えCHO 細 胞内で発現された４種のEGFR−群レセプタ各々のチロシンホスホリル化を刺激す る能力について、上記第8.2.章に記載のチロシンホスホリル化刺激アッセイを利 用してテストした。該４種の組み換え細胞系についてテストした特定の処方物お よび該アッセイにおいて得られた結果を、以下の表にまとめ、またこれら結果の 幾つかのオートラジオグラフを第10図に示した。 これらの結果は、部分的にEGFRとの相互作用を介して、成長調節シグナルを媒 介する４種の関連するリガンド、即ちEGF、AR、TGF-αおよびHB-EGFが、組み換 えCHO および293 細胞（第10図、パネル１、２、４、レーン２および３）中で発 現されたHER4、HER2またはHER3ではなく、組み換えNIH3T3細胞(EGFについては第 10図のパネル３、レーン２を参照)中で発現されたEGFRのチロシンホスホリル化 を刺激できることを示している。更に、以下でより詳細に論じられるように、こ のアッセイは、HepG2-由来の処方物（画分17）を、CHO/HER4細胞のみで発現され るHER4のチロシンホスホリル化を特異的に刺激できるHER4リガンドとして同定し た。 9．実施例：HER4リガンドの単離 9.1．材料および方法 9.1.1．細胞分化アッセイ HER2、HER3またはHER4に対する特異的リガンドの同定のために、MDA-MB-453細 胞のレセプタ発現プロフィールは、形態的な分化誘導活性に対する優れた指標を 提供する。この細胞系は、HER2およびHER3を発現することが知られているが、検 出可能なEGFRを含まない。半−定量的PBS アッセイの結果（第３表）は、MDA-MB -453細胞中でのHER4の高い発現レベルを示している。更に、本発明の始原型HER4 ポリペプチドをコードするcDNAを、まずこの細胞系から単離した（上記第６章参 照）。 MDA-MB-453細胞(7500/ウエル)を、5%の FBSおよび1x必須アミノ酸を補充した5 0mlのDMEM中で育成した。細胞を、24時間に渡り、96−ウエルプレートに付着さ せた。サンプルを上記培地で希釈し、最終体積50mlで該細胞単層に添加し、イン キュベーションを更に３日間継続した。次いで、細胞を形態的変化について、倒 立顕微鏡により調べた。 9.1.2．起源細胞 ヒトの癌細胞の培養物のパネル由来の、血清を含まない培地を、MDA-MB-453細 胞に及ぼす増殖調節活性につきスクリーニングした。ヒト肝癌細胞系HepG2 を、 該MDA-MB-453細胞の劇的な形態的分化を誘発する因子の源として同定した。 9.1.3．HER4リガンドの精製 上記第10.1.1．章に記載した該細胞分化アッセイを、精製手順全体を通じて使 用して、MDA-MB-453細胞中の形態的変化を誘起するカラム画分を追跡した。状態 調節した培地の大規模生産のために、HepG2 細胞を10% の子牛血清を含有するDM EM中で、ヌンク(Nunc)細胞工場を利用して、培養した。約70% の密集度にて、細 胞を洗浄し、次いで血清を含まないDMEMと共にインキュベートした。状態調節し た培地(HepG2-CM)を３日後に集め、新たな血清を含まない培地を該細胞に添加し た。２つの付随的なHepG2-CMの収穫物を、細胞工場につき集めた。この培地を遠 心処理し、かつ500 mMのPMSFの存在下で、-20℃にて保存した。 10ｌのHepG2-CMを、アミコン(Amicon)限外濾過装置（分子量カットオフ10,000 の膜）を使用して16−倍に濃縮し、20% および60% の硫酸アンモニウムにより周 期的な沈殿処理にかけた。15,000 xg での遠心処理後、得られた上澄をPBS に対 して十分に透析し、PBS で前もって平衡化したDEAE−セファロース(ファルマー シア(Pharmacia))カラムに通した。次いで、これを流下した画分を、PBS で平衡 化した4 mlのヘパリン−アクリリック(バイオ−ラド(Bio-Rad))カラムに適用し た。分化誘発活性をもつ画分は、0.4 〜0.8M NaCl の範囲で、該ヘパリンカラム から溶出した。活性ヘパリン画分をプールし、硫酸アンモニウムの濃度を2.0Mと し、５分間12,000x ｇにて遠心処理し、得られた上澄を、フェニル-5PWカラム(8 x75mm;ウォーターズ(Waters))に通した。結合タンパクを、0.1MNa2HPO4(pH 7.4) 中の2.0M硫酸アンモニウム乃至0.1MNa2HPO4の減少勾配により溶出した。透析し た画分を、本質的に公知(ベン(Wen)等，Cell，1992，69:559-72)の如く、MDA-MB -453細胞のチロシンホスホリル化についてアッセイした。但し、一次抗体として はPY20を使用し、かつセイヨウワサビパーオキシダーゼ−複合山羊F(ab')2抗− マウスIg(キャペル(Cappell))および化学発光物質を検出のために用いた。ホス ホリル化シグナルを、モレキュラーダイナミックスパーソナルデンシトメータを 使用して分析した。 9.2．結果 半−精製HepG2-由来の因子は、MDA-MB-453細胞内での分化を誘発する能力をも つことが立証された(第11図、パネル1-3)。第11図のパネル1-3に示された顕微鏡 写真を参照すると、未処理のMDA-MB-453細胞は穏やかな接着性をもちかつ丸みを 帯びた形態を呈する(第11図、パネル1)。対照的に、半−精製HepG2-由来の因子 は、これら細胞を、大きな核と増大した細胞質とをもつ顕著に平坦化された形態 を示すように導く(第11図、パネル２および3)。このHepG2-由来の因子の処方物 は、ヘパリンにも結合する。この特性は、その活性について精製するのに利用さ れた。 更に精製した場合、該HepG2-由来の因子は、0.1M硫酸アンモニウムにおいて、 フェニル疎水性相互作用カラムから溶出することが分かった（画分16〜18）。第 11図のパネル４は、フェニルカラム溶出プロフィールを示す。このフェニルカラ ム溶出画分のチロシンホスホリル化アッセイは、ヒト乳癌細胞の分化を誘起する ことが分かっている同一の画分が、MDA-MB-453細胞中の185kDaのタンパクのチロ シンホスホリル化を刺激することもできることを明らかにした(第11図、パネル5 )。特に、画分16は、デンシトメトリー分析により測定されるように、未刺激の 細胞内に見られるベースラインシグナルと比較して、4.5-倍も大きな、該ホスホ リル化シグナルの増加を誘起した(第11図、パネル6)。 該フェニル画分をも、各々がEGFR−群の単一の構成員を過剰に発現する、該細 胞系のパネルに対してテストした（上記第9.1.章）。画分17は、HER2、EGFRまた はHER3(第10図、パネル1-4、レーン4)のホスホリル化に直接影響を与えることな く、HER4キナーゼ(第10図、パネル１、レーン4)の有意なかつ特異的な活性化を 誘発した。隣接画分14をコントロールとして使用し、これは該EGFR−群のレセプ タの何れのホスホリル化にも、何の影響も及ぼさなかった(第10図、パネル1-4、 レーン5)。画分17中に存在する因子の更なる精製並びに分析は、該因子が40〜45 kDaをもち、NDF およびHRG とほぼ同一のサイズをもつ糖タンパクであることを 示す。該HepG2-由来の因子は、またNR5 細胞中のEGFRではなく、MDA-MB-453細胞 中のHER2/p185 のチロシンホスホリル化を刺激する限りにおいて、NDF およびHR G と同様な機能性を有し、かつHER2を過剰発現するヒト乳癌細胞の形態学的分化 を誘発する。 最近、幾つかの研究グループが、NDF およびHRG-αを包含する、HER2に対する 特異的リガンドの同定を報告した（上記第2.章参照）。これらの分子とは対照的 に、ここに記載するHepG2-由来の因子は、CHO/HER2細胞中のHER2のホスホリル化 を刺激しないが、CHO/HER4細胞中のHER4のホスホリル化を刺激した。これらの発 見は、該HepG2-由来の因子の、MDA-MB-453細胞、即ちHER2およびHER3を過剰発現 し、しかもHER4をクローン化する源であることが公知である細胞系のホスホリル 化を刺激する能力の観点から、興味あるものである。EGFRおよびHER2は相乗的に 作用することが示されているので、HER4も他のEGFR−群の構成員と相互作用可能 であると考えられる。この点に関連して、これらの結果は、NDF がMDA-MB-453細 胞中のHER4と結合して、HER2の活性化を達成できることを示唆している。直ぐ下 の第10章に記載する結果は、NDF が直接HER4と相互作用して、HER2の活性化を達 成する証拠を与える。 10．実施例：HER2の組み換えNDF-誘起、HER4媒介ホスホリル化 組み換えNDF をCOS 細胞中で発現させ、EGFR−群の他の公知の構成員、特にEG FRおよびHER2が実質的に存在しないアッセイ系において、HER4に及ぼすその活性 につきテストした。 完全な長さのラットNDF cDNAを、正常なラットの腎臓RNA から単離し、cDM8− を主体とする発現ベクターに挿入し、cNDF1.6 を生成した。この構築物をCOS 細 胞中で一次的に発現させ、状態調節した細胞上澄を、上記の第8.2.章に記載した チロシンキナーゼ刺激アッセイを利用して、NDF 活性につきテストした。cNDF1. 6 のトランスフェクションされた細胞由来の上澄は、第12図パネル１に示すよう に、mockでトランスフェクションされたCOS 培地と比較して、MDA-MB-453細胞中 のチロシンホスホリルかをより強く調節した。ホスホリル化は、NDF に添加後、 10−15分でピーク値に達した。 粗製NDF 上澄は、またEGFR(NR5細胞)、HER2(CHO/HER2 1-2500細胞)およびHER4 (CHO/HER4 21-2細胞)ホスホリル化する能力につきテストした。該NDF 処方物は 、EGFR、またはHER2含有細胞のホスホリル化には何等効果を示さないが、15分間 のインキュベーション後にはHER4のチロシンホスホリル化において、2.4〜４倍 の増加を誘発した（第12図、パネル２参照）。これらの発見は、NDF/HRG-αがそ の効果を、HER2に対する直接的な結合を通してではなく、HER4との直接的な相互 作用により媒介することを示す予備的な証拠を与える。HER2およびHER4両者を発 現する細胞系、例えばMDA-MB-453細胞および他の乳癌細胞において、NDF とHER4 との結合は、これら２つの関連する貫膜レセプタのヘテロダイマー形成によって 、または細胞内クロストークによってHER2を刺激することができる。NDF とHER4 とのとの間の直接的相互作用の正規の証明は、125I−NDF とCHO/HER4細胞との架 橋およびその結合特性に関する詳細な分析を必要とする。 11．実施例：HER4遺伝子の染色体マッピング 該遺伝子の5'部分(ヌクレオチド位置34-1303)に対応するHER4cDNAプローブを 使用して、その場でのHER4遺伝子のハイブリダイゼーションマッピングを実施し た。２名の正常な男性ドナーのリンパ細胞由来の中期染色体に対するその場での ハイブリダイゼーションを、3Hで標識したHER4プローブを使用して、比活性が2. 6x107 cpm/μｇとなるまで、公知の方法（マース(Marth)等，Proc．Natl． Acad．Sci．USA，1986，83:7400-04）で実施した。最終的なプローブの濃度はハ イブリダイゼーション混合物１μｌ当たり0.05μｇであった。スライドを一ヵ月 露光した。染色体はＱバンディング(Q banding)により同定した。 11.1．結果 オートラジオグラフィー粒子を有する全体で58の中期細胞を調べた。評価した 124のハイブリダイゼーションサイトのうち、38(31%)が染色体２（第13図）の長 いアームの遠位部分に位置していた。最大数の粒子（21粒子）がバンド33に位置 し、有意数の粒子がバンドq34(10粒子)およびq35(７粒子)に位置していた。他の ヒト染色体上での有意なハイブリダイゼーションは、検出されなかった。 12．実施例：HER4レセプタの活性化は、ヒレグリンによるシグナル導入に関与し ている 12.1．HER4のチロシンホスホリル化の、組み換えヒレグリン誘導 12.1.1．材料および方法 組み換えHER4またはHER2を発現するCHO 細胞を前に第８章で記載したようにし て生成した。細胞(1x105個のCHO/HER2およびCHO/HER4、並びに5x105個のMDA-MB4 53)を、24−ウエルプレートに接種し、24時間培養した。これら細胞を、血清を 含まない培地中で1-6 時間に渡り飢餓状態に置き、その後トランスフェクション したCOS 細胞由来の状態調節した培地または25μg/mlのHER2−刺激Mab(N28 およ びN29)（スタンコフスキー(Stancovski)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1991 ，88:8691-8695）を添加した。室温で10分間の処理後、細胞を溶解し（以下の第 13章）、かつ２μｇの抗−ホスホチロシンMab(PY20，ICN バイオケミカルズ(Bio chemicals))または抗−HER2Mab(c-neu Ab-2，オンコジーヌサイエンス(Oncogene Science))および抗−マウスIgG-アガロース(シグマ(Sigma))によって免疫沈降 した。上記の如く、PY20を使用してウエスタンブロットを実施し、バンドをモレ キュラーダイナミックスホスホイメージャーで検出した。 組み換えラットヒレグリンを、以下のように製造した。ラットヒレグリンの全 読み取り枠をコードする1.6 kbのフラグメント（および324 bpをもつ5'−未翻訳 配列）を、鋳型として正常なラット腎臓RNA を使用したPBS 法によって得た。こ のフラグメントをCDM8を主体とする発現ベクター(インビトロゲン(Invitrogen)) 内に挿入して、cNDF1.6 を生成した。この発現プラスミドを、DEAE−デキストラ ンクロロキン法(シード(Seed)等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1987，84:3365 -3369)を利用して、COS-1 細胞に導入した。ドゥルベコの改良イーグル培地(DME M)/10% FBS中で２日間育成した後、該培地をDMEMで置換し、かつインキュベーシ ョンを更に48時間維持した。清澄な状態調節された培地を、直接使用するか或い は0.1M酢酸に対して２日間透析し、乾燥し、DMEMに20倍の濃縮物として再度懸濁 した。 12.1.2．HER チロシンホスホリル化 第15図に示した如く、組み換えヒレグリンはHER4のチロシンホスホリル化を誘 起する。チロシンホスホリル化レセプタは、抗−ホスホチロシンMab ａによるウ エスタンブロット法により検出され、MDA-MB453 またはCHO/HER4細胞の単層を、 ラットヒレグリン発現プラスミド(HRG)またはcDM8ベクターコントロール(-)でト ランスフェクションしたCOS-1 由来の培地と共にインキュベートした。該培地を 、直接(1x)または20倍(20x，ベクターコントロール)濃度に濃縮した後に適用し た。溶解した細胞を、抗−ホスホチロシンMab ｂによる免疫沈降にかけ、CHO/HE R2細胞の単層を、上記の如く、トランスフェクションしたCOS-1 細胞上澄または HER2に対する２種の刺激性Mab(Mab 28および29)と共にインキュベートした。溶 解した細胞を抗−HER2Mab によって免疫沈降させた。矢印はHER2およびHER4タン パクを示す。 12.1.3．結果 HER4がヒレグリンによるシグナル発生に関与するか否かを決定するために、組 み換えラットヒレグリンの、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞のパネル におけるチロシンホスホリル化を刺激する能力を調べた。該卵巣細胞は転移的に ヒトHER2またはHER4を発現する。組み換えヒレグリンの活性は、最初にヒト乳癌 細胞の分化を刺激（データは提示せず）する能力およびMDA-MB453 細胞中で高分 子量タンパクのチロシンホスホリル化を誘発する能力（第15図、パネル１）によ り確認された。ヒレグリンはHER2のみを発現するCHO 細胞には何の作用を及ぼさ ず（第15図、パネル３）、しかもこれら細胞は機能性のレセプタをもつことが示 されている。というのは、そのチロシンキナーゼ活性が、HER2の細胞外ドメイン に対して特異的な２種の抗体の何れかによって刺激され（第15図、パネル３）得 るからである。しかしながら、ヒレグリンはHER4を発現するCHO 細胞中の180Kタ ンパクのチロシンホスホリル化を誘発できた（第15図、パネル２）。 リガンド−レセプタ相互作用の異なる種がEGF レセプタについて報告されてい る(ラックス(Lax)等，Mol．Cell Biol.,1988，8:1970-1978)。このような差異は 、我々がラットヒレグリンとヒトHER2との間の直接的相互作用の検出に失敗した ことによるものではないと考えられる。というのは、以前の研究により、ラット のヒレグリンがラットHER2/neuとは直接的に相互作用しないことが示されている からである（ペレス(Peles)等の上記文献）。更に、ラット、ウサギおよびヒト ヒレグリンは、高い配列相同性をもち、しかもヒトを起源とするその標的細胞に おけるチロシンホスホリル化を誘発することが明らかにされている(ベン(Wen)等 、ホルメス(Holmes)等およびフォールズ(Falls)等の上記文献)。 12.2．ヒトCEM 細胞中の組み換えHER2およびHER4の発現 12.2.1．材料および方法 cNHER2およびcNHER4発現プラスミドを、ヒトHER2およびHER4の完全コード配列 をcNEO細胞、即ちCDM8の固有のBamHI サイトに挿入されたSV2-NEO 発現単位を含 む発現ベクターに挿入することにより、生成した。これら構築物を線状化し、本 質的に既に記載されているように（ベン(Wen)等の上記文献）、バイオーラド(Bi o-Rad)のジーヌパルサー(Gene Pulser)装置を使用したエレクトロポーレーショ ンによってCEM細胞内にトランスフェクションした。安定なクローンを、500μg/ mlの活性ジェネチシン(Geneticin)を補充した、RPMI/10% FBSにおいて選別した 。HER2免疫沈降を、5x106細胞／反応を使用して、第15図に示されたように実施 し、また該HER2ウエスタンブロットを第二の抗−HER2Mab(c-neu Ab-3; オンコジ ーヌサイエンスズ(Oncogene Sciences))を使用して実施した。HER4の代謝性 標識のために、5x106細胞を４〜６時間、2%の FBSおよび250 μCi/ml［35S］発 現タンパク標識混合物（ニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear) ）を補充したメチオニンおよびシステインを含まない最小必須培地(MEM)中でイ ンキュベートした。細胞をRPMI中で２回洗浄し、上記のようにして溶解させた。 細胞溶解物を、次に各３μｌの２種のウサギ抗血清（ヒトHER4の細胞質ドメイン の２つの領域(864LARLLEGDEKEYNADGG88[SEQ ID NO:31]および1010EEDLEDMMDAEEY1022 [SEQ ID NO:32])に対応する合成ペプチドに対して、６時間４℃にてインキ ュベートした。免疫複合体を、５μｇの山羊抗−ウサギIg（キャペル(Cappel)） およびプロテインＧセファロース(ファルマーシア(Pharmacia))によって沈殿さ せた。タンパクを7%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ホスホイメージャ ー上で露光した。Mab-刺激アッセイのために、5x106個の細胞を、100 μｌのRPM I中に再度懸濁し、25μg/mlのMab を室温にて15分間かけて添加した。コントロ ールMab 18.4はヒトアンヒレグリンに対して特異的なマウスIgG1である(プロー マン(Plowman)等，Mol．Cell Biol.，1990，10:1969-1981)。Mab-処理に引き続 いて、細胞をPBS 中で洗浄し、溶解（以下の第13章）し、抗−HER2Mab(Ab-2)で 免疫沈殿した。チロシンホスホリル化したHER2を、第15図におけるように、PY20 ウエスタンブロットにより検出した。 12.2.2．ヒトCEM 細胞におけるHER2およびHER4の発現 ヒトCEM 細胞中の組み換えHER2およびHER4の発現は、第16図に示されている。 トランスフェクションされたCEM 細胞から、HER2またはHER4もしくはこれら両組 み換えレセプタを安定に発現するものを選別した。第16図のパネル１において、 組み換えHER2は、細胞溶解物の抗−HER2Mab(Ab-2)による免疫沈殿およびもう一 つの抗−HER2Mab(Ab-3)によるウエスタンブロットによって、検出した。第16図 のパネル２において、組み換えHER4は35S-標識細胞溶解物の、HER4−特異的ウサ ギ抗−ペプチド抗血清を使用した免疫沈殿によって検出した。第16図のパネル３ においては、３つのCEM 細胞系を選択したがこれらは組み換えレセプタの一方ま たは両者を発現し、また各々のアリコートを培地コントロール(-)、２つのHER2 −刺激性Mab(Mab 28および29)、またはイソタイプの適合コントロールMab (18.4)と共にインキュベートした。溶解した細胞を抗−HER2Mab(Ab-2)で免疫沈 殿させ、かつチロシンホスホリル化HER2を、抗−ホスホチロシンMab を使用した ウエスタンブロット法により検出した。予備染色した高分子量マーカー(バイオ −ラド(Bio-Rad))のkDa 単位のサイズは、左側に示され、また矢印は該HER2およ びHER4タンパクを表す。 12.2.3．結果 実施例12のこれら発見は、HER2のみではヒレグリンシグナルの導入のためには 不十分であるという初期の観測を支持している。この可能性を更に検証するため に、これら組み換えレセプタの何れかのみまたはその組み合わせを発現する、ヒ トCEM 細胞のパネルを樹立した。この所定のモデル系はヒトを起源とするもので ある。というのは、erbB群の構成員に対する試薬の多くが、ヒトの同族体に対し て特異的であるからである。CEM 細胞はヒトＴリンパ球芽細胞系であり、また種 々の免疫学的、生物学的およびインキュベーション学的分析によって、EGF レセ プタ、HER2、HER3またはHER4の発現性を欠いていることが見出された（データは 提示せず）。第16図は、HER2のみ(CEM 1-3)、HER4のみ(CEM 3-13)またはその両 者HER2およびHER4(CEM 2-9)を発現する、３種のCEM 細胞系を選別したことを立 証している。適当な細胞中での、機能的かつ構造的に完全なHER2の存在は、イソ タイプの適合コントロール抗体（第16図のパネル３）によるのではなく、HER2の 細胞外ドメインに対して特異的な２つの抗体の各々による、HER2チロシンホスホ リル化の誘発によって確認された。 12.3．HER4を発現するCEM 細胞中のチロシンホスホリル化のヒレグリン誘起 12.3.1．材料および方法 組み換えラットヒレグリンは第15図に記載のように調製し、かつRPMI中に7xで 希釈した。このHER4−特異的Mab を、マウスの組み換えHER4による免疫化（作成 中の文献）により調製した。CEM 細胞(5x106)を濃縮した上澄で10分間、室温に て処理し、第15図に記載したように、PY20または抗−HER2Mab(Ab-2)で沈殿させ た。抗−HER4Mab による免疫沈降は、細胞溶解物をハイブリドーマ上澄の1:5 希 釈物と共に数時間インキュベートし、次いで２μｇのウサギ抗−マウスIg（キャ ペル(Cappel)）およびプロテインＡセファロースCL-4B(ファルマーシア(Pharmac ia))と共にインキュベートした。PY20ウエスタンブロットは第15図に記載のよう に実施した。 12.3.2．HER4を発現するCEM 細胞におけるチロシンホスホリル化のヒレグリンに よる誘発 第17図に示した如く、ヒレグリンはHER4を発現するCEM 細胞内のチロシンホス ホリル化を誘発する。HER2またはHER4のみを単独で(CEM 1-3CEM 3-13)、もしく は両者を一緒に(CEM 2-9)発現する、３種のCEM 細胞系を、７倍に濃縮した、moc k-(-)またはヒレグリン−トランスフェクション(+)COS-1 細胞由来の上澄と共に インキュベートした。溶解した細胞を、抗−ホスホチロシンMab(PY20)(第17図の パネル1)、HER2−特異的抗−HER2Mab(Ab-2)(第17図のパネル2)、またはHER4−特 異的Mab(6-4)(第17図のパネル3)と共に、免疫沈降処理(IP)した。各場合におい て、チロシンホスホリル化レセプタは、抗−ホスホチロシンMab を使用したウエ スタンブロット法により検出した。予備染色した分子量マーカー(バイオ−ラド( Bio-Rad))のkDa 単位のサイズは、左側に示されており、また矢印は該HER2およ びHER4タンパクを表す。 12.3.3．結果 次いで、CEM 細胞のパネルを、ヒレグリンで処理し、３種の異なるモノクロー ナル抗体(Mab)によって免疫沈降した後、細胞溶解物のホスホチロシンウエスタ ンブロットにより分析した。抗−ホスホチロシン抗体(PY20)による沈降は、再度 ヒレグリンが、HER2のみを発現する細胞中ではなく、HER4を発現する細胞中の、 チロシンホスホリル化を刺激できることを立証している(第17図のパネル1)。し かしながら、HER2の細胞外ドメインに対して特異的な抗体による沈降は、HER2が 同時にHER4をも発現する細胞内で、ヒレグリンに応答してチロシンホスホリル化 されることを立証している(第17図のパネル2)。更に、HER4−特異的Mab による 沈降は、HER2の発現とは無関係に、HER4のチロシンホスホリル化を誘発すること を立証している(第17図のパネル3)。多くの乳癌におけるHER2およびHER4の同時 発現のために、これらの発見は、ヒレグリン−HER2相互作用の初期の研究は、再 度の評価を必要とする可能性があることを示唆している。 12.4．HER4に対するヨウ素化ヒレグリンの共有結合による架橋 12.4.1．材料および方法 精製を簡略化するために、組み換えヒレグリンを、エピトープを付加した、ア ンヒレグリンとの融合体として生成した。セリン177 からチロシン239 までのラ ットヒレグリンの63アミノ酸を含むEGF-構造モチーフ（ベン等の上記文献）を、 ヒトアンヒレグリン先駆体のN-末端141 アミノ酸と融合した（プローマン等の上 記文献）。ヒレグリンのこの切頭部分は、既にE.コリ（ホルメスの上記文献）中 で発現させた場合に、活性であることが示されており、またアンヒレグリンのN- 末端残基は、該組み換えタンパクの免疫学的な検出および精製用のエピトープを 与える。このcDNAフラグメントは、COS-1 細胞中での一時的な発現のためのcDM8 を主体とする発現ベクターにスプライシングされた。組み換えヒレグリンは、HE R4チロシンホスホリル化の特異的刺激に基づいて活性であることが示されている ので、アニオン交換および逆相クロマトグラフィーにより精製した。精製された ヒレグリンは、250 μCiの125I−標識したボルトン−ハンター(Bolton-Hunter) 試薬(NEN)によりヨウ素化された。CHO/HER4またはCHO/HER2細胞を、４℃にて２ 時間、125I−ヒレグリン(105-cpm)と共にインキュベートした。細胞単層をPBS中 で洗浄し、３mMのビス（スルホサクシンイミジル）スベレート(BS3，ピアース(P ierce))を、氷上で30分かけて添加した。該細胞をトリス(Tris)−緩衝塩水で洗 浄し、SDS サンプルバッファー中に溶解し、7%ポリアクリルアミドゲル上で移動 しさせ、ホスホイメージャー上で可視化した。 12.4.2．結果 第18図に示した如く、以前の結合および共有結合による架橋の研究は、p45 が HER4に特異的に結合し、CHO/HER4細胞上で、５nMなるKdをもつ単一の高−アフィ ニティーサイトを示すことを立証している（以下の第13図）。以前の架橋研究 は、組み換えヒレグリンを使用してこれらの細胞について実施し、ヒレグリン− HER4レセプタ錯体に対応する高分子量種を明らかにした。 12.5．結果 上記データが立証するように、ヒレグリンはHER2の不在下で、HER4のチロシン ホスホリル化を誘発する。これとは対照的に、ヒレグリンはHER2を直接的に刺激 しない。しかしながら、HER4の存在下では、ヒレグリンは恐らくトランスホスホ リル化を通して、またはレセプタのヘテロダイマー化を通して、HER2のホスホリ ル化を誘発する。これら実験は全体として、HER4がヒレグリンに対するレセプタ であることを示唆している。 HER2を過剰に発現する多くの乳癌細胞は、ヒレグリンに対して応答性であるこ とが示されており、一方でHER2−正の卵巣および繊維芽細胞系は、該リガンドに 応答しない。この観測は、卵巣癌ではなく、研究された殆どのまたは全ての乳癌 細胞系において、HER4がHER2と同時に発現されるという事実により説明できた。 更に、ヒレグリン−応答性乳癌細胞におけるHER2の過剰発現は、高い結合率に導 き、一方でヒレグリン−非応答性卵巣または繊維芽細胞中のHER2の発現は何の効 果ももたない（ペレス等の上記文献）。 ノーザンおよびその場でのハイブリダイゼーション分析は、中枢および末梢神 経系の白質およびグリア細胞並びに心臓、骨格および平滑筋に、HER4が局在化し ていることを示す。この分布は、HER4が神経栄養因子、GGF およびARIAにより、 シグナル伝達に関与していることと一致する。ヒレグリンシグナル導入通路の主 要素としてHER4を認識することは、多様な生物学的効果をもたらす、分子的なメ カニズムを解明するのに役立つであろう。 13．実施例：HER4リガンド、p45 の精製 13.1．材料および方法 13.1.1．細胞培養および試薬 MDA-MB 453細胞を、ATCC(MD,ロックビル）から入手し、10% の子牛血清および アミノ酸(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies，Inc.))を補充した、ド ゥルベコ改良イーグル培地(DMEM)中で培養した。HepG2 細胞をDr．S.ラドカ(Rad ka)から入手し、10% の子牛血清含有DMEM中で培養した。血清を含まない状態調 節した培地の大規模生産のために、HepG2 細胞を、ヌンク細胞工場内で増殖させ た。高いルベルで組み換えヒトp185erbB2(CHO/HER2)または組み換えヒトp180erb B4 (CHO/HER4)の何れかを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-KI)を生 成し、第８章に記載したように培養した。ヒトHER2レセプタの細胞外部分に対す るN29 モノクローナル抗体は、Dr．Y.ヤーデン(Yarden)から贈呈されたものであ った。ヒトp185erbB2と反応するAb-3 c-neuモノクローナル抗体は、オンコジー ヌサイエンス社(Oncogene Science Inc.)から入手したものであった。 13.1.2．ヒト乳癌細胞分化アッセイ MDA-MB-453ヒト乳癌細胞は、p185erbB2を過剰に発現するが、その表面でEGFR を発現することはない（クラウス，EMBO J.，1987，6:605-610）。細胞分化アッ セイを利用して、クロマトグラフィー画分を、MDA-MB-453細胞中の表現型分化を 誘発するその能力を追跡した。 13.1.3．p45 の精製 HepG2細胞(HepG2-CM，60 1)により状態調節した培地を、アミコン(Amicon)限 外濾過ユニット（分子量カットオフ10,000の膜）を使用して26−倍に濃縮し、次 いで50% 硫酸アンモニウム((NH4)2SO44)沈降処理にかけた。25,000x ｇにて１時 間の遠心処理後、上澄を５つの別々の実験として、0.1MのNa2HPO4溶液中の1.9M の(NH4)2SO4(PH7.4)で平衡化した、フェニル−セファロースカラム(2.5x24.5cm; ファルマーシアLKB バイオテクノロジー社(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) )にかけた。結合タンパクを、0.1M燐酸バッファー中1.9M〜0Mの(NH4)2SO4(pH7.4 )なる線状減少勾配溶離液240 mlで溶出した。流量は70ml／時であり、各々5.8-m lの画分を集めた。活性画分をプールし、濃縮し、PBS に対して透析し、次いでP BS(pH 7.3)で平衡化したDEAE−セファロースカラム(2.5x25cm;ファルマーシア(P harmacia))に適用（３つの別々の実験）した。流量は１ml／分であった。該カラ ム流下液を、次にPBS(pH 7.3)で予備平衡化したCM−セファロースファースト フロー(Fast Flow)カラム(2.5x13.5cm;ファルマーシア(Pharmacia))にかけた。 タンパクを、PBS 乃至PBS 中1MのNaClなる勾配溶離液330-mlで、1ml/分の速度で 溶出した。各5mlの画分を集めた。活性物質をPBS で平衡化したTSKgelヘパリン- 5PW HPLC カラム(7.5x75 mm;(TosoHaas))処理にかけた。流量は0.5ml/分であっ た。50-ml の線形NaCl勾配(PBS乃至PBS 中2M）での溶離、次いで2M NaCl による イソクラティク溶離を利用して、該結合タンパクを溶出した。各１mlの画分を集 めた。タンパクの1.3M NaCl ピークに対応する活性画分をプールし、濃縮した。 100mM のNa2HPO4溶液(pH7.4)、0.01% ツイーン(Tween)20で平衡化した、プロテ イン(Protein)Pak SW-200サイズ排除クロマトグラフィーカラム(8X300mm; ウォ ーターズ(Waters))を使用して、最終段階の精製を行った。流量は0.5ml/分であ り、各々250-μｌの画分を集めた。次いで、カラム画分を、還元条件下でSDS-PA GE(12.5%ゲル）により分析し、かつタンパクを銀染色により検出した。 13.1.4．ウエスタンブロット法によるチロシン−ホスホリル化タンパクの検出 PBS-透析したカラム画分のアリコートを、PBS で200 μｌまで希釈し、次いで それぞれ5x105個のMDA-MB-453細胞、2x104個のCHO/HER2細胞または5x104個のCHO /HER2細胞を含有する48−ウエルプレートの個々のウエルに添加した。10分間の3 7℃でのインキュベーションに引き続き、細胞を洗浄し、次いで100 μｌの沸騰 電気泳動サンプルバッファー中で溶解した。溶解物を、100 ℃にて５分間加熱し 、遠心処理により透明化し、次にSDS-PAGEにかけた。電気泳動後、タンパクをニ トロセルロースに転写した。この膜を、室温にて２時間、10mMのTria-HCl(pH8.0 )，150mM のNaCl，0.05% のツイーン(Tween)20 中の6%ウシ血清アルブミンによ りブロックした。PY20モノクローナル抗−ホスホチロシン抗体(ICN; 22℃にて２ 時間)およびセイヨウワサビのパーオキシダーゼ−複合化山羊抗−マウスIgGF(ab ')2(キャペル(Cappel); 22℃にて１時間）を、それぞれ一次および二次プローブ 試薬として使用した。チロシン残基上のタンパクホスホリル化は、化学発光試薬 （アマーシャム社(Amersham Corp.)により検出した。 13.1.5．CHO/HER2刺激アッセイ CHO/HER2細胞を24−ウエルプレートに1x105細胞／ウエルにて接種し、24時間 培養した。p185erbB2の細胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体N29 (スタンコフスキー(Stancovski)等，PNAS，1991，88:8691-8695)を25μg/mlにて 添加した。室温での20分間のインキュベーションの後、培地を除去し、細胞を10 分間、氷上で、PBS-TDS(10mMの燐酸ナトリウム、pH 7.25、150 mMのNaCl、1%の トライトン(Triton)、0.5%のナトリウムデオキシコレート、0.1%の SDS、0.2%の NaN3、１mMのNaF、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド、20μg/mlの アプロチニン)中に、場合により攪乱しつつ、溶解させた。清浄化した抽出物を 、抗−p185erbB2抗体（Ab-3 c-neu; オンコジーヌサイエンス社）と共に、４℃ にて２時間インキュベートした。ウサギ抗−マウスIgG(キャペル)およびプロテ インＡ−セファロースを、次に添加し、サンプルを更に30分間インキュベートし た。免疫錯体をPBS-TDS で３回洗浄し、次に7%ポリアクリルアミドゲル上で分離 し、電気泳動によりニトロセルロースに移した。このレセプタのホスホリル化を 、PY20ホスホチロシン一次抗体(ICNバイオケミカルズ社）の1:1000希釈物および125 I−ヒツジ抗−マウスF(ab')2(アマーシャム社)の1:500 希釈物を使用したウ エスタンブロット法により評価した。 13.1.6．ヨウ素化したp45 の共有結合による架橋 HPLCで精製したp45(1.5 μg)を250 μCiの124I−標識したボルトン−ハンター 試薬（デュポン−ニューイングランドヌクレアー(Du Pont-New England Nuclear )から入手）によりヨウ素化した。125I-p45をファルマーシア(Pharmacia)PD-10 カラムを通して濾過することにより精製した。比活性は104cpm/ngであった。125 I-p45は、分化アッセイ並びにキナーゼ刺激アッセイ（データは提示せず）にお いて確認されるように、その生物学的活性を保持していた。放射性標識したp45 の結合は、12−ウエルプレート中で、2x105個のCHO/HER4細胞および4x105個のCH O-KIまたはCHO/HER2細胞について実施した。細胞単層を、１mlの氷冷結合バッフ ァー(44mM の重炭酸ナトリウム、50mMのBES[N-，N-ビス(2- ヒドロキシエチル)- 2-アミノエタンスルホン酸]，pH7.0，0.1% のウシ血清アルブミンを補充 したDMEM）で２回洗浄し、次いで氷上で、250ng/mlの未標識のp45 の不在下また は存在下で、50ng/ml の125I-p45と共に２時間インキュベートした。これら単層 を２回PBS で洗浄し、次いで１mlのビス（スルホサクシンイミジル）スベレート (BS3，ピアース、PBS 中)の存在下で氷上で45分間インキュベートした。上澄を 捨て、該反応を、PBS 中の0.2Mグリシンの添加により停止させた。細胞を洗浄し 、次いで0.1Mのジチオスレイトールを含有する沸騰電気泳動サンプルバッファー 150 μｌを添加することにより溶解させた。サンプルを５分間沸騰させ、各サン プルの50μｌを、7.5%ポリアクリルアミドゲルに載せた。乾燥ゲルを、モレキュ ラーダイナミックスホスホイメージャーを用いて分析し、次いでコダック(Kodak )X-omat AR フィルムに暴露した。 13.1.7．ヨウ素化されたp45 の結合分析 CHO/HER4細胞、CHO-KI細胞(105細胞／ウエル)、およびCHO/HER2細胞(2x105細 胞／ウエル)を、24−ウエルプレートに接種した。48時間後、細胞を結合バッフ ァーで洗浄し、次いで増大する濃度の125I-p45と共にインキュベートした。非特 異的結合を、過剰の未標識p45 の存在下で測定した。４℃にて２時間のインキュ ベーションの後、該細胞を３回結合バッファーで洗浄し、次いで0.1% SDSを含有 する0.5MNaOH500 μｌ中で溶解させた。細胞−関連放射能をγ−カウンタを使用 して測定した。コンピュータを備えたリガンド(LIGAND)プログラム(マンソン＆ ロッドバード(Munson and Rodbard)，Anal．Biochem.，1980，107:220-239)を使 用して、スキャッチャード分析を実施した。 13.1.8．N-末端アミノ酸配列 p45(25pmol)のN-末端アミノ酸配列分析を、以前に記載されたように実施した （ショヤブ(Shoyab)等，Proc．Natl．Acad．Sci.，1990，87:7912-7916）。 13.2．HER4リガンドp45 の精製 HER2細胞により状態調節した培地60ｌを出発物質として使用し、この精製工程 全体を通して、生物学的活性は上記第10.1.1．章に記載した細胞分化アッセイに より評価した。濃縮(1540 mgのタンパク)および硫酸アンモニウム沈降後、活性 物質(1010 mgのタンパク)を、フェニル−セファロースカラム(第19図、パネル1) 上に注いだ。カラム画分40-85(1Mの硫酸アンモニウムと0Mの硫酸アンモニウムと の間で溶出する348 mgのタンパク)がMDA-MB-453細胞における形態的変化を誘発 することを見出した。生物学的に活性なカラムの流下液(174mgのタンパク)をイ オン交換クロマトグラフィー（第19図、パネル２）にかけたところ、活性をもつ 画分は0.35〜0.48M NaClの範囲で溶出した。これらの活性画分をプールし(1.5mg のタンパク)分析用ヘパリンカラムにかけた(第19図、パネル3)。該ヘパリンカラ ムから0.97〜1.45M NaClの範囲で溶出した(画分27-38)。該ヘパリンカラム画分3 5-38のサイズ排除クロマトグラフィーはヒト乳癌細胞分化因子の均一な処方物を 与えた。溶出した主なタンパクピークは、70,000を越える分子量を有していた( 第19図、パネル4)。30 ng/mlにてアッセイした画分30および32は、このタンパク の生活性をもつことが確認され、表現型の変化は24時間後に明らかになった。こ れらカラム画分のSDS-PAGE分析および引き続き行った該ゲルの銀染色は、該生物 学的に活性なピークが45 kDa近傍で移動する単一のタンパクを含んでいた（第20 図）。弱い67 kDaのバンドは該ゲルの左側のレーンによって明らかであるように サンプルを全く含まない、染色人工物質に相当する。画分30-33 中に回収された 純粋なタンパクの量は、６μｇであると見積もられた。サイズ排除クロマトグラ フィーおよびSDS-PAGE分析により評価された分子量における差異は、このタンパ ク質が非−変性条件下でダイマーまたはオリゴマーを形成し得ることを示してい る。 13.3．p45 のN-末端アミノ酸配列 25pmolのp45 を直接アミノ酸配列決定に付し、配列：Ser-Gly-X-Lys-Pro-X-X- Ala-Ala[SEQ ID NO:33]を同定した。ここでＸは、正確なアミノ酸を割当できな いシークエネータサイクルである。この部分配列と、２つのタンパクデータベー ス（ゲンバンク(GenBank)公開73; EMBL公開32）との比較は、同定された残基と ヒレグリンのアミノ末端領域（ホルメス等の上記文献）との間の完全な相同性を 明らかにした。p45 のN-末端セリン残基は、ヒレグリンの推定されたアミノ酸の 残基20に対応する。 13.4．p45はタンパクのホスホリル化を刺激する 第21図のパネル１は、MDA-MB-453細胞内のチロシンホスホリル化に及ぼす、サ イズ排除クロマトグラフィーカラムから得た配列画分の刺激作用を示すものであ る。オートラジオグラムのデンシトメトリー解析は、画分30-34 が本質的に等力 価であることを明らかにした。均一に精製したp45 は、p180erbB4のチロシンホ スホリル化を特異的に刺激した（第21図のパネル２）。p45 は、CHO/HER2細胞中 のホスホリル化を刺激できなかったが、該細胞は機能的p185erbB2レセプタを発 現することが分かった。これは、p185erbB2の異なる領域に対して特異的な５種 のモノクローナル抗体との免疫反応性により証拠付けられた。p45 は、最近単離 されたp185erbB2リガンドに類似する、N-末端アミノ酸配列を有する。 13.5．p180erbB4に対するp45 の結合および共有結合による架橋 結合および架橋の研究を、p45 がp180erbB4に結合できることを確認するため に実施した。結合の研究は、CHO-KIおよびCHO/HER2細胞に対する125I-p45の特異 的結合は測定できなかったが、CHO/HER4細胞は、7x104レセプタ／細胞の、単一 の高いアフィニティーサイト（約5nM のKd）を示した(第22図のパネル1)。CHO-K I、CHO/HER2またはCHO/HER4細胞に対するヨウ素化されたp45 の架橋の結果は、 第22図のパネル２に示されている。架橋された種は、CHO-KIまたはCHO/HER2細胞 の何れにも観測されなかったが、４つの明確なバンドがCHO/HER4細胞に見られ、 45-、100-および210-kDa の種、並びに極めて高い分子量種として泳動した。未 標識のp45 の存在下で、125I-p45の結合は、大幅に減少した。該45kDa のバンド は、架橋されず、しかもp180erbB4に結合した125I-p45を表す。210kDaのバンド は、p45-p180erbB4錯体（リガンドとレセプタとの化学量論的等モル体であると 考えられる）に対応し、一方で該高分子量バンドは、該レセプタ−リガンド錯体 のダイマーであると推定される。該100kDaバンドは、125I-p45または共有結合的 に結合したp45 ダイマーと錯化した、該p180erbB4レセプタの細胞外ドメインの 切頭部分を表す可能性がある。c-キットリガンドは、架橋したダイマーに対する 優位体(precedence)を与える（ウイリアムス(Williams)等，Cell，1990，63:167 -174）。 13.6．結果 HER2により状態調節した培地から精製した該HER4リガンド、即ちp45 は、乳癌 細胞の分化を誘起し、かつMDA-MB-453細胞中の185kDaのタンパクのチロシンホス ホリル化を活性化する。p45 は、直接p185erbB2と結合することは出来ないが、H ER4／p180erbB4に対する特異性を示す。 14．実施例：キメラヒレグリン−毒素タンパクにより媒介される標的細胞毒性 14.1．材料および方法 14.1.1．試薬および細胞系 ヒレグリンβ2-Igおよびシュードモナス(Oseudomonas)外毒素(PE)に対するマ ウスモノクローナル抗体は、それぞれDr.-M.コルスコ(Colusco)およびDr．トニ ーサイアデック(Tony Siadek)によって提供されたものであった（WA，シアトル のブリストル−マイヤーズ−スキッブ(Bristol-Myers-Squibb)社）。細胞系BT47 4、MDA-MB-453、T47D、SKBR-3、およびMCF-7(全て乳癌細胞)、LNCaP(前立腺癌細 胞)、CEM(T-細胞白血病細胞)およびSKOV3(卵巣癌細胞)は、ATCC(MD 州、ロック ビル)から入手した。H3396 乳癌細胞系およびL2987 肺癌細胞系は、WA州、シア トルのブリストル−マイヤーズ−スキッブ(Bristol-Myers-Squibb)社で構築され た。AU565 乳癌細胞系は、セルカルチャーラボラトリー，ナーバルバイオサイエ ンスズラボラトリー(Cell Culture laboratory，Naval Biosciences Laboratory [CA 州、オークランドのナーバルサプライセンター(Naval Supply Center)]から 購入した。全ての細胞系はヒト由来のものであった。BR474 およびT47D細胞は、 10% の子牛血清(FBS)および10μg/mlのインシュリンを補充したIMDM中で培養し た。MCF-7、H3396、LNCaP およびL2987 細胞は、10% FBS を補充したIMDM中で培 養した。SKBR3 およびSKOV3 細胞は、10% FBS および0.5%の非−必須アミノ酸を 補充したMcCoys培地中で育成した。AU565 細胞は、15% FBS を補充したRPMI1640 培地中で培養し、CEM トランスフェクション生成物(第15.1.5．章参照) は、10% FBS および500 μg/mlのG418を補充したRPMI1640中で培養した。 14.1.2．HAR-TXβ２発現プラスミドの構築 ラットヒレグリンcDNA(ベン(Wen)等，Mol．Cell Biol.，1994，14:1909-1919) を、鋳型としてラット腎臓細胞由来のmRNAを使用した、RT-PCRによって単離した 。このcDNAは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、キメラリガン ドの5'末端を増幅するために、鋳型としてcARP(プローマン(Plowman)等，Mol．C ell Biol.，1990，10:1969-1981)使用した、２段階PCR 挿入クローニングプロト コールによって、ARリーダー配列をもつキメラ形で調製した： EGF-様ドメインPCR を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、cNDF 1.6 から増幅した(プローマン(Plowman)等，Nature，1993，366:473-475)： これらの生成物を併合し、オリゴヌクレオチドプライマーCARP5 およびXNDF10 53を使用して再度増幅した。該HAR(ヒレグリン−アンヒレグリン)構築体(cNANSH LIK)を、5'末端にNde I 制限サイトを、また3'末端にHind III制限サイトを挿入 するために、以下のようなオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCR 増幅し た： 得られた287 bpのDNA フラグメントをNde I およびHind IIIで消化し、連結し て、両立するように消化された発現プラスミドpBW7.0を構築したが、これは5'融 合サイトにおける枠内に、PE40(フリードマン(Friedman)等，Cancer Res.，1993 ，53:334-339)をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。得られた発現プラ スミドpSE8.4は、従ってIPTG−誘発性T7プロモータの制御下で、キメラヒレグリ ン−毒素タンパクをコードする遺伝子融合体を含んでいた。 14.1.3．組み換えHAR-TXβ２タンパクの発現および単離 該キメラタンパクHAR-TXβ２をコードするプラスミドpSE8.4を、E.コリ菌株BL 21(λDE3)内で形質転換した。細胞を、100 μg/mlのアンピシリンを含有するＴ ブロス中で、37℃にて、光学密度A650=4.8まで醗酵により成育させ、次いで１mM のイソプロピル-1- チオ−β-D- ガラクトピラノシド(IPTG)ちよってタンパクの 発現を誘発させた。90分後に、細胞を遠心処理によって収穫した。該細胞ペレッ トを-70℃にて凍結し、次いで解凍し、４℃にて、1% のタージトール(tergitol) を含有する、溶解バッファー(50mM のTris-HCl(pH8.0)、10mMのEDTA、１μg/ml のロイペプチン、２μg/mlのアプロチニン、１μg/mlのペプスタチン-A、0.5mM のPMSF)中に、均質化および超音波照射により再懸濁させた。該HAR-TXβ２タン パクを含む封入体を含有する、該懸濁液の不溶性物質を遠心処理によりペレット 化し、0.5%のタージトール（第１回目の洗浄）、1MのNaCl（第２回目の洗浄）を 含有する溶解バッファーおよびバッファーのみ（第３回目の洗浄）で３回洗浄し た。 予備生成した封入体を含有する得られたペレットを、6.5Mグアニジン-HCl、0. 1MのTris-HCl(pH 8.0)、５mMのEDTAに溶解し、超音波照射し、迅速希釈(100倍) により、0.1MのTris-HCl(pH 8.0)、1.3Mの尿素、5 mMのEDTA、1 mMのグルタチオ ン、および0.1 mMの酸化したグルタチオンと、４℃にて再度混合した。低濃度の 変性剤尿素の添加は緩慢な再混合を可能とし、および凝集体の形成を防止するた めに利用した。この再混合したHAR-TXβ２タンパクを、50mMの燐酸ナトリウム(p H 7.0)で２倍に希釈し、同一のバッファーで予め平衡化した、カチオン交換樹脂 (ポロス(POROS)50 HS;MA州、ケンブリッジのパーセプティブバイオシステムズ(P erSeptive Biosystems))で処理した。該HAR-TXβ２タンパクを、50mMの燐酸ナト リウム(pH 7.0)中の450 nMのNaClの段階的勾配によって溶出し、画分をSDS-PAGE およびクーマシーブルー染色を利用して分析した。プールした画分の最終的な精 製は50mMの燐酸ナトリウム(pH 6.0)で平衡化した、ソース(Source)15Sカチオン 交換媒体(スウェーデン、ウプサラのファルマーシア(Pharmacia))を使用したク ロマトグラフィーで実施した。キメラHAR-TXβ２タンパクを、同一のバッファー 中の0-1 M NaClの勾配溶出により溶出し、SDS-PAGEで分析した。 14.1.4．結合活性の測定のためのELISA テスト 5x107MDA-BM-453細胞由来の膜を調製し、以前にH3396 ヒト乳癌細胞について 記載された（シーガル(Siegall)等，J．Immunol.，1994，152:2377-2384）よう に、96−ウエルプレートに塗布した。引き続き、該膜を、0.3-300 μg/mlのHAR- TXβ２またはPE40および第二の試薬としてのマウスモノクローナル抗−PE抗体EZ XA2-1H8 と共にインキュベートした（シーガル(Siegall)等の上記文献）。該毒 素部分PE40の単離体みを使用して、該膜処方物に対する非特異的結合活性を測定 し、HAR-TXβ２の特異的結合活性と比較した。 14.1.5．トランスフェクションしたCEM 細胞系のホスホチロシン分析 EGF-R 群の種々のレセプタを発現するCEM 細胞(1-5X106細胞)を、室温にて５ 分間、500ng/mlのHAR-TXβ２で刺激した。該細胞をペレット化し、溶解バッファ ー(50mMのTris-HCl，pH 7.4、150 mMのNaCl、5 mMのMgCl2、1%のNP40、0.5%のデ オキシコレート、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム、1 mMのオルトバナジン酸ナト リウム)0.1ml中で、４℃にて再懸濁させた。不溶性物質を10,000 xgにて30分間 遠心処理することによりペレット化し、サンプルをSDS-PAGEそれに引き続いて実 施した、抗−ホスホチロシン抗体4G10(CA 州、イルビンのICN)およびPY40(NY州 、レイクプラシッドのアップステートバイオテクノロジー(Upstate Biote chnology))を使用したウエスタンブロット分析により解析した。 14.1.6．細胞毒性アッセイ 細胞毒性アッセイのために、育成培地中の腫瘍細胞(105細胞/ml)を96−ウエル の平底組織培養プレートに添加した(0.1 ml/ウエル)、37℃にて16時間インキュ ベートした。細胞を48時間37℃にてHAR-TXβ２と共にインキュベートし、燐酸緩 衝塩水(PBS)で２度洗浄し、次いで200 μl/ウエルの1.5 μM カルセイン-AM(OR 州、オイゲン(Eugene)のモレキュラープローブズ社(Molecular Probes Inc.))を 添加した。これらのブレートを室温(RT)にて40分間、インキュベートし、蛍光を 励起／発光波長485/530 nmにて、フルオレッセンスコンセントレーションアナラ イザー(Fluorescence Concentration Analyzer; IL州、マンデレイン(Mundelein )のバクスターヒースケア社(Baxter Heathcare Corp.))を使用して測定した。カ ルセイン(Calcein)-AMは膜透過性で、見掛け上は非−蛍光発光性である。細胞内 エステラーゼによって加水分解された場合には、強い蛍光発光生成物、カルセイ ンを形成する。％細胞毒性は以前に記載されたように計算した（シーガル等の上 記文献）。HAR-TXβ２の細胞毒性作用の特異性を決定するために、競合的アッセ イを、LNCaP およびMDA-MB-453細胞について実施した。本質的に上記のように処 理したプレートを、ヒレグリンβ2-Ig(0.002-5.0μg/ml)の存在下での、増大す る濃度のHAR-TXβ２と共に、またはHAR-TXβ2(50ng/ml)と共にインキュベートし た。イソタイプ適合L6-Ig(ヘルストローム(Hellstrom)等，CancerRes.，1986，4 6:3917-3923)を、この競合アッセイのための負のコントロールとして使用した。 14.1.7．HER4に対するモノクローナル抗体の生成 バクロウイルス内で発現されたHER4を、4-6 週齢の雌BALB/c マウスに皮下注 射するための免疫原として使用した。免疫化は、４回（約１カ月間隔）、各時点 において20μｇのHER4タンパクを使用して実施した。免疫処理したマウスから脾 臓細胞を、最終の免疫化の４日後に取り出し、前に記載されたように（シーガル 等の上記文献）して、マウスミエローマ細胞系P2x63-Ag8.653 と融合した。正の ハイブリドーマ上澄を、HER4でトランスフェクションしたCHO 細胞で被覆したプ レート上でELISA スクリーニングにより選別し(プローマン(Plowman)等，Nature ，1993，366:473-475)、かつ親CHO 細胞およびヒト繊維芽細胞について選別した 。二次スクリーニングを、バクロウイルス／HER4膜で被覆したプレート上でELIS A により実施した。CHO/HER4およびHER4負細胞を使用して、更に２ラウンドのEL ISA を実施して、正ハイブリドーマを再度スクリーニングし、同定された誤った 正のサンプルを除去した。正ハイブリドーマを軟質寒天培地中でクローニングし 、HER4正のMDA-MB-453ヒト乳癌細胞系およびHER4およびHER2で同時にトランスフ ェクションしたCEM 細胞との反応性につきテストした。抗−HER4ハイブリドーマ 系6-4-11(IgG1)を軟質寒天培地中でクローニングし、天然のおよび変性されたHE R4に対する反応性についてスクリーニングした。第二の抗体(7-142，IgG2a)をも 選択し、これらがHER4の細胞質ドメインに結合することを見出した。 両抗体に関する特徴を第４表にまとめる（以下の第15.2.8．章を参照）。 14.1.8．腫瘍細胞系におけるHER2、HER3およびHER4タンパクの定量化 HER2、HER3およびHER4タンパクの細胞表面発現は、CAS レッドクロマゲン(Red Chromagen)装置(IL 州、エルムハーストのベクトンディックソンセルラーイメ ージングシステム(Becton Dickson Cellular Imaging System))により検出され る特異的抗体結合の定量により測定した。HER2染色は、一次抗体として、マウス 抗−HER2mAb 24.7(スタンコフスキー(Stancovski)等，Proc．Natl．Acad．Sci., 1991，88:8691-8695)を、また二次抗体としてビオチン処理した山羊抗−マウスI gG(PA州、ウエストグローブのジャクソンラボラトリー(Jackson Labs.))を使用 して、前に記載された（バクス(Bacus)等，Cancer Res.，1993，53:5251-5261） ようにして実施した。HER3およびHER4を検出するために、使用した上記の一次抗 体は、それぞれ2.5 μg/mlのマウス抗−HER3mAb RTJ2(CA 州、サンタクルーズの サンタクルーズバイオテック(Santa Cruz Biotech))あるいは15μg/mlのマウス 抗−HER4mAb 6-4-11であり、これらは引き続きビオチン処理したウサギ抗−マウ スIgG(CA州、サンフランシスコのザイメッドラボラトリーズ(Zymed Labs))と共 にインキュベートした。 この染色手順はRTにて以下のように実施した。即ち、細胞を10% 中性に緩衝さ れたホルマリン中で60分間固定し、水で洗浄し、トリス(Tris)緩衝塩水(TBS;0.0 5M のTris、0.15M のNaCl、pH 7.6)で濯いだ。非−特異的結合サイトを、10% の 山羊血清（HER2に対して）またはウサギの血清（HER3およびHER4に対して）と共 に、0.1%ウシ血清アルブミン/TBS中で15分間インキュベートすることにより遮蔽 した。引き続き、細胞を一次および二次抗体と共にそれぞれ30分および20分間イ ンキュベートし、アルカリホスファターゼと複合化したストレプタビジン（ジャ クソンラボラトリーズ(Jackson Labs)）と共に15分間インキュベートした。これ らの各工程間で、TBS で洗浄を行った。抗体結合の検出は、CAS レッドクロマゲ ン装置（上記のベクトンディッキンソンセルラーイメージングシステム(Becton Dickinson Cellular Imaging System)）を使用して、４分（HER2）、8-10分（HE R3）および10-12分（HER4）で達成された。細胞はCAS DNA 染色プロトコール（ ベクトンディッキンソンセルラーイメージングシステム）に記載されているよう に、逆染色(counterstained)された。 14.1.9．イメージ解析 イメージ解析を、以前に記載されたように（バクス(Bacus)等の1993年の上記 文献；バクス等，Cancer Res.，1992，52:2580-2589;ペレス(Peles)等，Cell，1 992，69:205-216）して実施した。HER2の定量化のために、CAS 200 イメージア ナライザー(Image Analyzer;ベクトンディッキンソンセルラーイメージングシス テム(Becton Dickinson Cellular Imaging System))の両固相撮像チャンネル、 顕微鏡を主体とする二色系を使用した。これら２つの撮像チャンネルは、使用す る染色剤の２つの成分に対して特異的に適合された。一つのチャンネルは、記載 (バクス(Bacus)等，Mol．Carcinog.，1990，3:350-362)のように、フォイルゲン 染色に従う場における全DNA を定量するために使用し、他方は免疫染色に従った 、HER2、HER3およびHER4タンパクのレベルを定量化するために使用した。細胞当 たりのDNA 量が既知である場合、細胞当たりの、平均の全HER2、HER3およびHER4 の量は計算により求めた。疎らに成育したAU565 細胞を、HER2タンパクのキャリ ブレーションのために使用した。その染色のレベルを、HER2タンパク含有率の10 0%として定義し(1.0相対量＝10,000光学密度の和)、HER2、HER3およびHER4 タンパクの全ての他の測定値を、この値に関連付けた。 14.1.10．HAR-TXβ２のLD50の測定 毒性の研究のために、HAR-TXβ２を種々の濃度で、0.2mlなる量で、静脈内投 与した。１群当たり二匹のマウスおよび２匹のラットに注射した。 14.2．結果 14.2.1．HAR-TXβ２の構築、発現および精製 アンヒレグリン(AR)、ヒレグリンβ２およびPE40からの親水性リーダー配列を コードし、IPTG誘発性T7プロモータの制御下にある、HAR-TXβ２発現ベクターを 上記第15.1.2．章に記載したようにして構築し、これを第23図のパネル１に模式 的に示した。このARリーダー配列を、ヒレグリンのN-末端に付加し、精製手順を 簡略化した(第23図のパネル2)。第24Ａおよび24Ｂ図は、HAR-TXβ２をコードす るcDNAの核酸配列と推定アミノ酸配列を示す。 キメラHAR-TXβ２タンパクを、封入体のE.コリ中で発現させた。組み換えタン パクを、上記の第15.1.2．章に記載したように変性し、かつ再生し、ポロス(POR OS)HSカラム上で、カチオン交換クロマトグラフィー処理した。半−精製HAR-TX β２タンパクを、主バンドが51 kDaにて泳動するように、PAGEおよびクーマシー ブルー染色により検出した(第25図のレーン2)。このポロス(POROS)HSカラムから の流下液は、少量のHAR-TXβ２のみを含有していた(第25図のレーン3)。ポロスH SクロマトグラフィーはHAR-TXβ２の純度>50%をもたらした(第25図のレーン4)。 更なる純度>95%までの精製はソース(Source)15Sカチオン交換樹脂を使用したク ロマトグラフィーにより実施した(第25図のレーン5)。精製されたHAR-TXβ２の モノマー性の特徴は、非−還元条件下でのSDS-PAGEにより決定し(第25図のレー ン6)、これは還元条件下でのパターンと同一の泳動パターンを示した(第25図の レーン5)。 14.2.2．HAR-TXβ２のMDA-MB-453細胞膜への結合 HAR-TXβ２の特異的結合活性を測定するために、ELISA アッセイを、HER4正の ヒト乳癌細胞系、即ちMDA-MB-453細胞の膜を、結合用のターゲットとして使用し て実施した。HAR-TXβ２は300 μg/mlまで、濃度依存性様式で、固定化した細胞 の膜に結合することを見出した（第26図）。PE40、即ち負のコントロールとして 使用した、HAR-TXβ２の毒素成分は、MDA-MB-453細胞の膜に結合しなかった。 14.2.3．トランスフェクションされたCEM 細胞上の、HER 型のチロシンホスホリ ル化 HAR-TXβ２の生物学的活性をテストするために、HER4レセプタホスホリル化ア ッセイを、ヒレグリンについて前に記載されたように(キャラウェイ(Carraway) 等，J．Biol．Chem.，1994，269:14303-14306)実施した。異なるHER 群の構成員 を発現するCEM 細胞を、HAR-TXβ２に暴露し、チロシンホスホリル化の刺激につ いて、ホスホチロシンイムノブロット分析（上記第４章、上記第15.1.5．章）に より解析した。第27図に示した如く、HAR-TXβ２は、HER2またはHER1のみを発現 する細胞中ではなく、HER4を単独でまたはHER2と共に発現するCEM 細胞中で、チ ロシンホスホリル化を誘発した。この結果は、HER4がHAR-TXβ２に応答して、チ ロシンホスホリル化を誘発するのに十分であり、かつ必要であることを立証して おり、このことはHER2およびHER1については正しくない。HAR-TXβ２が、HER1に よってトランスフェクションされたCEM 細胞中で、チロシンホスホリル化を誘発 しないという事実は、アンヒレグリンの親水性リーダー配列が、レセプタ群の構 成員間の選択的な相互作用における該ヒレグリン部分の特異性に影響を与えない ことを確証している。 14.2.4．腫瘍細胞に対するHAR-TXβ２の細胞毒性 HAR-TXβ２の細胞殺傷活性を、種々のヒト癌細胞系について測定した。AU565 およびSKBR3 乳癌およびLNCaP 前立腺癌は、HAR-TXβ２に敏感であって、それぞ れEC50値25、20、4.5ng/mlであり、一方でSKOV3 卵巣癌細胞はHAR-TXβ２に対し て感受性ではなかった(EC50 > 2000ng/ml)(第28図のパネル1)。LNCaP 細胞への ヒレグリンβ2-Igの添加は、HAR-TXβ２の細胞毒性作用を低下させた(第28図の パネル2)。これとは対照的に、L6-Ig、即ち非−関連性特異性をもつが、ヒトFc ドメイン（ヘルシトローム(Hellstrom)等の上記文献）と適合しているキメラマ ウス−ヒト抗体は、HAR-TXβ２の細胞毒性活性を阻害しなかった(第28図のパネ ル2)。かくして、HAR-TXβ２の細胞毒性作用は、特異的ヒレグリン−媒介結合に よるものであった。同様なデータが、MDA-MB-453細胞を使用した場合にも得られ た（データは提示せず）。 14.2.5．ヒト腫瘍細胞上のHER2、HER3およびHER4レセプタ密度：HAR-TXβ２媒介 細胞毒性との相関関係 細胞系がHAR-TXβ２に対する感受性を異にする理由を理解するために、該細胞 におけるHER2、HER3およびHER4の濃度を、レセプタ特異的モノクローナル抗体を 使用して、イメージ解析（上記第15.1.8．および15.1.9．章参照）によって定量 した（第４表）。これらのデータは、HER4の発現がヒレグリンにより導かれる細 胞毒性活性のために必要とされることを強く示している。検出可能な濃度でHER4 を発現する７つの腫瘍細胞系の全てが、HAR-TXβ2-媒介殺傷に対して感受性であ ることが分かっており、そのEC50値は1-125 ng/ml の範囲である。更に、異なる 細胞系の感受性は、HER4の発現レベルに直接関連しており、HER4の最低の検出可 能な濃度を示すMCF-7 細胞は、応答しなかった細胞の最低の感度(EC50=125ng/ml )であることがわかった。表面上において何等検出可能なHER4発現をしないこと が分かっている全体で４種の細胞系は、HAR-TXβ２に対して耐性であることが分 かった。そのうちの３種、即ちSKOV3、L2987 およびH3396 はHER4の不在下でHER 2およびHER3両者を示した。 14.2.6．HAR-TXβ２はHER4を発現しない腫瘍細胞中のチロシンホスホリル化を誘 発する ヒレグリンが、ヘテロダイマー構造にあるHER3およびHER2／HER3に直接結合す るという報告(キャラウエイ(Carraway)等，J．Biol．Chem.，1994，269:14303-1 4306;スリウコウスキー(Sliwkowski)等，J．Biol．Chem.，1994，269:14661-156 65)とは対照的に、HER3のみを発現またはHER2およびHER3を同時に発現する腫瘍 細胞(H3396 およびSKOV3)はHAR-TXβ２に対する感受性は低かった。H3396 およ びL2987 細胞の該キメラタンパクとの直接的相互作用は、HAR-TXβ２誘発に引き 続くホスホチロシンイムノブロットによって測定した。HAR-TXβ２は、HER2およ びHER3によりトランスフェクションされたCOS-7 細胞中で以前に観測された（ス リウコウスキー等の上記文献）ものと類似する両腫瘍細胞型におけるチロシンホ スホリル化を誘発することが分かった（第29図）。SKOV3 細胞は、ヒレグリンの 存在下または不在下で、同一のチロシンホスホリル化パターンを示すことが 分かっており、かくしてレセプタとヒレグリンとの間の直接的相互作用は確立で きなかった（データは提示せず）。しかしながら、以前の研究は、ヒレグリンが これら細胞に結合しないことを示している（ペレス等の上記文献）。 14.2.7．HAR-TXβ２の毒性 毒性の研究のために、HAR-TXβ２を第15.1.10.章に記載したように投与した。 マウスでは、2/2 が2 mg/kg にて死亡し、2/2 が1 mg/kg にて死亡し、1/2 が0. 75 mg/kgにて死亡し、また0/2 が0.5mg/kgにて死亡したので、LD50は約0.75mg/k gである（第５表）。ラットにおいては、測定されたLD50は僅かに高く、テスト 動物の50% が１mg/kg にて死亡した（第５表）。 14.2.8．HER4特異的モノクローナル抗体の諸特徴 本明細書に記載する、HER4特異的モノクローナル抗体の諸特徴を、第６表にま とめる。 15．微生物および細胞寄託 以下の微生物および細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション(Ameri can Type Culture Collection)に寄託されており、また以下の承認番号が付され ている。 本発明はここに開示した微生物および細胞系もしくは態様によってその範囲が 制限されるものではなく、これらは本発明の一局面を単に例示するためのもので あり、機能的に等価なあらゆるものが本発明の範囲内にある。事実、本明細書に 提示され、説明されたことに加えて、種々の改良が、上記の説明から当業者には 明らかであろう。このような改良は添付した請求の範囲に入るものである。ポリ ヌクレオチドおよびポリペプチドに対して与えられた全ての塩基対およびアミノ 酸残基数並びにサイズは近似であり、説明の目的で使用したものである。 本明細書において述べた全ての刊行物および特許出願は、本発明が関与する分 野における熟練者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、 各個々の刊行物または特許出願を、具体的にかつ個別に、参考文献として本明細 書に組み込む旨明記した場合と同程度に、本明細書に参考文献として組み込まれ るものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 シーガル クレイ アメリカ合衆国 ワシントン州 98020 エドモンズ エイス アベニュー サウス 639 (72)発明者 キュルスク ジャン ミッシェル フランス エフ−92500 リュイユ マル メゾン リュー ド カリエール 10 シ ンセラボ リサーチ (72)発明者 ヘルストローム インゲガールド アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノースイースト サーバー ド ライヴ 3925 (72)発明者 ヘルストローム カール イー アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノースイースト サーバー ド ライヴ 3925

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．第1Aおよび1B図に示したHER4ヌクレオチド配列の連続部分に対して80% を越 える相同性をもつ、少なくとも約200 個のヌクレオチドの配列を含むことを特徴 とする組み換えポリヌクレオチドまたはその補体。 ２．第1Aおよび1B図に示したHER4アミノ酸配列内の少なくとも約70個の連続する アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組み換えポリヌ クレオチド。 ３．第1Aおよび1B図に示したHER4ヌクレオチドコード配列内の、少なくとも約20 0 個のヌクレオチドの連続配列を含むことを特徴とする組み換えポリヌクレオチ ドまたはその補体。 ４．第1Aおよび1B図に示したHER4ヌクレオチドコード配列を含むことを特徴とす る組み換えポリヌクレオチドまたはその補体。 ５．DNA ポリヌクレオチドである、請求の範囲第１、２、３または４項に従う、 組み換えポリヌクレオチド。 ６．RNA ポリヌクレオチドである、請求の範囲第１、２、３または４項に従う、 組み換えポリヌクレオチド。 ７．検出可能な標識が付加されている、請求の範囲第１、２、３または４項に従 う組み換えポリヌクレオチドを含有することを特徴とするアッセイキット。 ８．ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におけるcDNA合成を感作し得る一対のプライマ ーを含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)キットであって、該各プライマーが請求の 範囲第５項に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、上記ポリメラー ゼ連鎖反応キット。 ９．更に、該プライマーがハイブリッド化している、該ヌクレオチド配列間の、 これらを含まない該HER4遺伝子の領域にハイブリッド化できるポリヌクレオチド プローブをも含有する、請求の範囲第８項に記載のPCR キット。 10．第1Aおよび1B図に示したHER4アミノ酸配列の連続部分に対して90% を越える 相同性をもつ、少なくとも約80個のアミノ酸の配列を含むことを特徴とするポリ ペプチド。 11．第1Aおよび1B図に示されたアミノ酸配列の、アミノ酸残基１〜1308を含む HER4ポリペプチド。 12．第1Aおよび1B図に示されたアミノ酸配列の、アミノ酸残基26〜1308を含むHE R4ポリペプチド。 13．第1Aおよび1B図に示されたアミノ酸配列の、アミノ酸残基１〜1045を含むHE R4ポリペプチド。 14．第1Aおよび1B図に示されたアミノ酸配列の、アミノ酸残基26〜1045を含むHE R4ポリペプチド。 15．第2Aおよび2B図に示されたアミノ酸配列を含む、HER4ポリペプチド。 16．第1Aおよび1B図に示されたアミノ酸配列の、アミノ酸残基772〜1308を含むH ER4ポリペプチド。 17．第３図に示されたアミノ酸配列を含む、HER4ポリペプチド。 18．可溶性ポリペプチドとヒトHER4との間の相互作用を阻害することのできる抗 体。 19．該可溶性ポリペプチドがヒレグリンである請求の範囲第18項記載の抗体。 20．HER4チロシン自己ホスホリル化を刺激できる抗体。 21．細胞中で、その成長または分化の調節をもたらす、HER4−媒介シグナルを誘 発できる抗体。 22．ATCCに寄託されたCHO/HER4 21-2 細胞内で発現されたHER4の、HepG2 画分17 により刺激されたチロシンホスホリル化を阻害することのできる抗体。 23．ヒトHER4に免疫特異的に結合する抗体。 24．HER4に結合した後に、細胞表面上に存在する、請求の範囲第23項に記載の抗 体。 25．HER4に結合した後に、該細胞にインターナリゼーションする、請求の範囲第 23項に記載の抗体。 26．ATCCに寄託されたCHO/HER4 21-2 細胞内で発現されたヒトHER4に、免疫特異 的に結合する抗体。 27．HER4の生物学的活性を中和する、請求の範囲第23項に記載の抗体。 28．薬物または毒素と複合化された、請求の範囲第23項に記載の抗体。 29．放射性標識された、請求の範囲第23項に記載の抗体。 30．ATCCに寄託されたプラスミドpBSHER4Y。 31．請求の範囲第10、11、12、13、14、15、16または17項に記載のポリペプチド をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクター。 32．請求の範囲第31項に記載の組み換えベクターでトランスフェクションされた 宿主細胞。 33．請求の範囲第10、11、12、13、14、15、16または17項に記載のポリペプチド をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクターであって、該コード配列 が、該ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞中で該コード配列の発現 を導くことができる、制御配列に機能可能に結合していることを特徴とする上記 組み換えベクター。 34．請求の範囲第33項に記載の組み換えベクターでトランスフェクションされた 宿主細胞。 35．ATCCに寄託された細胞系CHO/HER4 21-2。 36．サンプル中のHER4リガンドの存在を検出するためのアッセイであって、 (a)HER4を過剰に発現するように操作されている細胞に、該サンプルを適用す る工程と、 (b)該リガンドの、HER4によって媒介される活性に影響を与える能力を検出す る工程と、 を含むことを特徴とする、上記アッセイ。 37．該細胞がATCCに寄託されているCHO/HER4 21-2 細胞である、請求の範囲第36 項に記載のアッセイ。 38．該検出された活性が、HER4チロシンホスホリル化である、請求の範囲第36項 に記載のアッセイ。 39．該検出された活性が、形態的な分化である、請求の範囲第36項に記載のアッ セイ。 40．HER4に結合し、HER4のチロシンホスホリル化を刺激し、かつHER4により媒介 される生物学的活性に影響を与える、ポリペプチドを含むことを特徴とする、HE R4に対するリガンド。 41．培養されたMDA-MB-453細胞に添加した場合に、形態的分化を誘発できる、請 求の範囲第40項に記載のリガンド。 42．培養したHepG2 細胞により状態調節された培地から得た、請求の範囲第40項 に記載のリガンド。 43．(a)請求の範囲第23または26項に記載の抗体を準備し、 (b)生物学的サンプルを、該抗体と共に、該抗体のHER4に対する結合を可能と する条件下で、インキュベートし、および (c)HER4−抗体複合体として存在する抗体の量を測定する、 諸工程を含むことを特徴とする、HER4を検出するためのイムノアッセイ。 44．HER4を発現する細胞に薬物または毒素をインビボで伝達する方法であって、 請求の範囲第23または26項に記載の抗体またはその活性フラグメントと、該薬物 または毒素とを複合化し、得られた複合体を、該複合体がHER4と結合するような 処方、投与量および投与経路を利用して、個体に伝達することを特徴とする、上 記方法。 45．HER4に結合でき、かつタンパクキナーゼ活性を活性化することのできるポリ ペプチドを含む、HER4リガンド。 46．ヒレグリンである、請求の範囲第40または45項に記載のリガンド。 47．p45である、請求の範囲第45項に記載のリガンド。 48．SDS-PAGE分析により測定された分子量45 kDaをもち、N-末端アミノ酸配列： Ser-Gly-X-Lys-Pro-X-X-Ala-Ala を有し、MDA-MB-453細胞中で発現されるような HER4に結合することのできる、単離されたポリペプチド。 49．細胞毒素と融合されたHER4リガンドを含む、キメラポリペプチド。 50．該HER4リガンドが、HER4と結合し、かつこれを活性化する、ヒレグリン、ヒ レグリンの機能性誘導体、またはヒレグリン同族体である、請求の範囲第49項に 記載のキメラポリペプチド。 51．該ヒレグリンがヒレグリン−α(HRG−α)である、請求の範囲第49または50 項に記載のキメラポリペプチド。 52．該ヒレグリンがヒレグリン−β１(HRG−β1)である、請求の範囲第49または 50項に記載のキメラポリペプチド。 53．該ヒレグリンがヒレグリン−β２(HRG−β2)である、請求の範囲第49または 50項に記載のキメラポリペプチド。 54．更に該アミノ末端にアンヒレグリンリーダーペプチドを含む、請求の範囲第 53項に記載のキメラポリペプチド。 55．該ヒレグリンがヒレグリン−β３(HRG−β3)である、請求の範囲第49または 50項に記載のキメラポリペプチド。 56．該細胞毒素がPE40または機能的に等価なシュードモナスアラビノーサ(Pseud omonas arabinosa)外毒素誘導体である、請求の範囲第49、50または54項に記載 のキメラポリペプチド。 57．SEQ ID NO:42に記載のアミノ酸配列をもつHAR-TXβ２。 58．請求の範囲第49項に従うキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 を含む、組み換えポリヌクレオチド。 59．HAR-TXβ２をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換えポリヌクレオチ ド。 60．IPTG−誘発性のT7−プロモータの制御下にある、請求の範囲第59項に記載の ポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター。 61．ATCCに寄託されているハイブリドーマ細胞系6-4-11により製造されるモノク ローナル抗体の、そのエピトープに対する免疫特異的結合を競合的に阻害する、 モノクローナル抗体。 62．ATCCに寄託されているハイブリドーマ細胞系7-142 により製造されるモノク ローナル抗体の、そのエピトープに対する免疫特異的結合を競合的に阻害する、 モノクローナル抗体。 63．ATCCに寄託されており、かつ承認番号HB11715 が付与された、ハイブリドー マ細胞系6-4-11。 64．ATCCに寄託されており、かつ承認番号HB11716 が付与された、ハイブリドー マ細胞系7-142。 65．HER4を発現する細胞に分子を伝達する方法であって、 (a)該分子とHER4リガンドとの複合体または融合体を生成する工程と、 (b)該細胞と該複合体または融合体とを、後者がHER4に結合して、該細胞内に インターナリゼーションされるように接触させる工程、 とを含むことを特徴とする上記方法。 66．HER4を発現する細胞に分子を伝達する方法であって、該細胞を、HER4リガン ドと該分子との複合体または融合体と接触させる工程を含む、上記方法。 67．該分子がポリペプチドである、請求の範囲第65または66項に記載の方法。 68．上記分子がポリヌクレオチドである、請求の範囲第65または66項に記載の方 法。 69．該分子が放射性核種である、請求の範囲第65または66項に記載の方法。 70．該分子が画像形成標識である、請求の範囲第65または66項に記載の方法。 71．HER4を発現する細胞の細胞質に、細胞毒素を伝達する方法であって、該細胞 と、該細胞毒素とHER4リガンドとの複合体とを、該複合体がHER4に結合し、これ を活性化し、かつこれを介してインターナリゼーションされるように、接触させ る工程を含む、上記方法。 72．HER4を発現する細胞の細胞質に、細胞毒素を伝達する方法であって、該細胞 と、該細胞毒素と融合したHER4リガンドを含むキメラポリペプチドとを、該キメ ラポリペプチドがHER4に結合し、これを活性化し、かつこれを介してインターナ リゼーションされるように、接触させる工程を含む、上記方法。 73．該キメラポリペプチドが、HAR-TXβ２である、請求の範囲第72項に記載の方 法。
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