JPH10505318A - ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド含有ホウ素クラスター - Google Patents

ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド含有ホウ素クラスター

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Abstract

(57)【要約】 ホウ素中性子捕獲療法(BNCT)及び他の治療上及び診断上の目的のためのカルボラニル含有ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドが提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド含有ホウ素クラスター 本発明は、合成有機化学の領域に属し、そして特にカルボラニル含有合成ヌク レオシド及びオリゴヌクレオチド、並びにそれらの製造方法及び使用の分野に属 する。 本発明の背景 少数の残存する悪性細胞でさえも再発、転移及び死をもたらしうることから、 癌治療のゴールは、正常細胞を除き全ての悪性細胞を破壊するという選択性の程 度を達成することである。単独では致死的でなくそして主に悪性細胞に閉じ込め られそして、合わさったとき新生細胞に対し致死的となりしかも正常細胞には無 害なものである成分よりなる、2成分の又は2元のシステムが理想的な様式の一 つである。このタイプの二元システムの一つの利点は、選択性を最大にするため に各々の成分を独立して操作できるということである。 ホウ素中性子捕獲療法(BNCT,図1を参照)は、2つの別個の非致死的な 成分、すなわち安定なホウ素−10(10B)を含有する放射線感受性化合物及び非 イオン化放射線を組み合わせる二元システムである。ホウ素−10が中性子で照射 されると、ヘリウム核(α−粒子)、リチウム核及び最初に照射されたエネルギ ーに比して約1億倍も大きいエネルギーを生み出す核反応が起こる。発生した放 射線は、ホウ素化合物を含有する悪性細胞を破壊する。悪性細胞に主として蓄積 する化合物の使用により及び/又はホウ素担体を含有 する腫瘍塊に中性視線の狙いを定めることによって、選択性が達成される。 BNCTにおける主たる障害は、(1)十分に高い細胞内ホウ素濃度の達成、 及び(2)腫瘍細胞への選択性である。腫瘍選択性を開発する試みは1969年代に 遡りそして広範な研究にもかかわらず、腫瘍細胞へのホウ素担体の選択的送達の 問題は残っている。 BNCTのために多くのクラスの化合物が合成されてきた。例えば、Barth,R .F.; Soloway,A.H.; Fairchild,R.G.; Brugger, R.M.Cancer 1992,70, 2995-3008; Fairchild,R.G.; Kahl,S.B.; Laster,B.H.; Kalef-Ezra,J.; Popenoe,E.A.Cancer Res.1990,50,4860-4865; 及びZamenhof,R.G.; K alend,A.M.; and Bloomer,W.D.J Natl Cancer Inst 1992,84,1290-1291 を参照。 最初のホウ素含有ヌクレオシド、5−ジヒドロキシボリル−2’−デオキシウ リジンは、Schinazi及びPrusoff によって1978年に合成された。Schinazi,R.F .,Prusoff,W.H.Tetrahedron Lett 1978,4981-4984; 及びSchazi,R.F.; P rusoff,W.H.J Org Chem 1985,50,841-847。Sood等は、2’−デオキシヌク レオシドのシアノボラン付加体、特に2’−デオキシグアノシン−N7−シアノ ボラン、2’−デオキシイノシン−N7−シアノボラン、2’−デオキシアデノ シン−N1−シアノボラン、及び2’−デオキシシチジン−N3−シアノボランよ りなる、一連のシアノボラン付加体の合成を報告している。Sood,A.; Spielvog el,B.F.; Shaw,B.R. J Am Chem Soc 1989,111,9234-9235. Sood等は、ボラノホスフェート類及びボラノホスフェートメチル エステル類の形の、ホウ素化されたヌクレオチド間骨格を備えたオリゴヌクレオ チドの合成をも報告している。これらのホウ素化オリゴヌクレオチド中のボラン (BH3)基は、通常のO−オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドメチル ホスホネートと等電子且つ同構造である。Sood,A.; Shaw,B.R.; Spielvogel ,B.F.J Am Chem Soc 1990,112,9000-9001. Soodの化合物は、一般にホウ 素含量が低くそして幾つかは所望よりも低い脂質親和性しか有しない。 Spielvogel等の米国特許第5,130,302 号は、抗新生物、抗炎症及び抗高血圧剤 としての新規クラスのホウ素化されたヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌ クレオチドを開示している。それらのヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌ クレオチドは、BH2CN、BH3又はBH2CO2R部分のいずれかに共有結合に より取り付けられており、ここにRはC1乃至C18アルキルである。 ホウ素中性子捕獲療法のために多くのカルボラニルピリミジン類が製造されて きた。カルボラニルピリミジン類の例には、5−(3−o−カルボラニルプロピ ル−6−メチル−2−チオウラシル(化合物A)(Wilson,J.G.Pigment Cell Res 1989,2,297-303)、2,4−ジクロロ−5−(1−o−カルボラニルメ チル)−6−メチルピリミジン;(化合物B)(Reynolds,R.C.; Trask,T.W .; Sedwick,W.D.J Org Chem 1991,56,2391-2395)及び5−カルボラニルウ ラシル(化合物C)(Goudgaon,N.M.; El-Kattan,Y.; Fulcrand,G.; Liotta ,D.C.; Schinazi,R.F.IMEBORON VIII,Knoxville,TN; p.72,1993). プリン及びピリミジンヌクレオシドで、プリン又はピリミジン塩 基に取り付けられたカルボラニル基を含んでいるものもまた報告されている。Ya mamoto,Y.; Seko,T.; Nakamura,H.Heteroatom Chem 1992,3,239-21414; 及びSchinazi,R.F.; Goudgaon,N.M.; Soria,J.; Liotta,D.C.5th Inter national Symposium on Neutron Capture Therapy,Columbus,Ohio,p11,1992 ; Shinazi,R.F.; Goudgaon,N.; Soria,J.; Liotta,D.C.Tenth Internati onal Roundtable: Nucleosides and Nucleotides,Park City,Utah; p28,1992 .これらの化合物は、脂質親和性であり幾つかは細胞のキナーゼによって容易に リン酸化され、そしてある種の細胞中においては、天然の2’−デオキシピリミ ジンヌクレオシドの類縁体としてDNAに組み込まれることができる。例として は、5−カルボラニル−2’−デオキシウリジン(化合物D,CDU)、5−カ ルボラニルウリジン(化合物E,CU)、5−(1−ヒドロキシメチル)カルボ ラニルウリジン、及び5−(1−ヒドロキシメチル)カルボラニルウリジン(化 合物F,HMCU)が挙げられる。 Raymond,F.Schinazi及びDennis C.Liottaによって提出されたPCT WO 93/17 028 は、プリン又はピリミジン塩基に共有結合によって取り付けられたカルボラ ニル部分を含有した多数の合成ヌクレオシド(ここに糖部分は所望により、環の 3’位に第2のヘテロ原子を含む)を開示している。好ましい化合物は、2−ヒ ドロキシメチル−5−(5−カルボラニルシトシン−1−イル)−1,3−オキ サチオラン(化合物G)及び2−ヒドロキシメチル−5−(5−カルボラニルウ リジン−1−イル)−1,3−オキサチオラン(化合物H)である。 Powell等は最近、3’,5’−ニド−o−カルボラニル−ホスホラミデート結 合を含んだオリゴヌクレオチド(化合物I)の合成を報告している。該オリゴヌ クレオチドは、報告によれば細胞核に局在し得るが、ホウ素部分は、アミドタイ プの結合を介してリン原子に連結していることから、酸に弱い。 オリゴヌクレオチドに関して、効率的なBNCTのための要件− 化学療法剤の生体内における安定性(細胞のヌクレアーゼによる消化に対する抵 抗性及び化学的安定性)、及び易輸送性(細胞膜を容 別の癌並びに他の疾病の療法であるアンチセンスオリゴヌクレオチド法(AOT )のための要件に非常に近似している。Uhlmann,“Antisense Oligonucleotide s: A New Therapeutic Approach”Chemical Review,90(4),June 1990. 該化 合物はまた比較的無毒である。アンチセンス法は、一般に、合成的オリゴヌクレ オチドが相補的核酸配列にハイブリダイズして転写又は複製を阻害(標的配列が D NAの場合)し、翻訳を阻害(標的配列がRNAの場合)し又はプロセシング( 標的配列がpre−RNAである場合)するという工程を通じて、遺伝子発現の 調節に依存する。広範な種々の細胞活動がこの技法を用いて調節できる。簡単な 例は、mRNAに結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドによるタンパク質合 成の阻害である。他の一具体例においては、合成オリゴヌクレオチドが二本鎖D NA中の特異的遺伝子配列にハイブリダイズされて、その遺伝子の発現を阻害す る三本鎖複合体(トリプレックス)を形成する。アンチセンスオリゴヌクレオチ ドはまた、天然のリプレッサーの生合成を抑制することによって間接的に、又は 転写の終了を遅らせることによって直接的に、遺伝子発現を活性化させるために も使用することができる。AOTは、病原遺伝子、例えば、ヒト免疫不全症ウイ ルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、及びヘルペスウイルスを含むウ イルスの複製を促進する遺伝子の発現を阻害し、及び癌、特に神経膠腫、乳癌及 び黒色種などのような固形癌を阻害するのに使用できる。 BNCT及びAOT双方の分野において前進がなされている一方で、これまで に製造された合成オリゴヌクレオチドのいずれも、細胞選択性、生体内安定性、 及び細胞膜を容易に通過する能力(易輸送性)の最適な結合を示していない。 従って、BNCT,AOT又はその双方に使用するための、細胞選択性、生体 内安定性及び細胞膜を容易に通過する能力の望ましいプロフィールを示す新しい クラスの合成オリゴヌクレオチドを提供することが、本発明の一目的である。 ホウ素含有ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの製造のための 新たな方法を提供することが、本発明の別の一目的である。 脂質親和性のそして高いホウ素原子含量を有するカルボラニル含有ヌクレオシ ド及びオリゴヌクレオチドが、ホウ素中性子捕獲療法(BNCT)で使用するた めに提供される。一具体例においては、天然に存在する3’,5’−O,O−ホ スホジエステル残基の代わりに少なくとも1つの無荷電の3’,5’−O,O− 〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕ヌクレオシド間結合を含む 、ジヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドが提供される。この(カルボラン−1 −イル−メチル)ホスホネート結合は、ヌクレアーゼによっては分解されず、従 って、3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート 〕ヌクレオシド間結合を含むジヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、生物学 的液体及び細胞中において安定である。オリゴヌクレオチドが主として3’−エ クソヌクレアーゼによって分解されるという事実に照らして、好ましい一具体例 においては、3’−末端の2個の末端ヌクレオシド又はこれらのヌクレオシドに 隣接したヌクレオシドが、ヌクレアーゼに安定な3’,5’−O,O−〔(o− カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕架橋を介して結合されているも のであるオリゴヌクレオチドが提供される。この3’,5’−O,O−〔(o− カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕架橋はまた、酸性環境において も安定であり且つ熱的に高度に安定である。 ここに記述される方法に従って、BNCTのために、標的癌細胞中の過剰発現 された又は特有のRNA若しくはDNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドが、 これらの細胞内にホウ素含有材料を選択的に蓄積させるための一手段として設計 できる。1つ又はより多く の3’,5’−結合−(カルボラン−1−イル)ホスホネート部分を含んだ特定 の遺伝子配列のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンス療法において遺伝子の 発現の選択的修正においても使用できる。 第2の具体例においては、3’及び/又は5’位置に(カルボラン−1−イル )ホスホネート部分を担持するヌクレオシドが提供される。これらの合成ヌクレ オチドは、ホウ素中性子捕獲療法において有用であり、そして選ばれた化合物が HIV及びHBVのようなウイルスに対抗する活性を示し得る。 別の一具体例においては、オリゴマーのヌクレオシドの少なくとも一つにおい てカルボラニル変性塩基を担持するオリゴヌクレオチドが提供される。好ましい 一具体例においては、このカルボラニル含有塩基は、3’末端に位置するヌクレ オシド中に、3’末端ヌクレオシドに隣接するヌクレオシド中に、5’末端ヌク レオシド中に、又は5’末端ヌクレオシドに隣接するヌクレオシド中に存在する 。3’末端ヌクレオシド中に又は3’末端ヌクレオシドに隣接するヌクレオシド 中にカルボラニル含有塩基を担持したオリゴヌクレオチドは、3’−エクソヌク レアーゼによる分解に対して一層抵抗性である。好ましい位置にカルボラン含有 塩基単位を担持するオリゴヌクレオチドは、他の位置にカルボラニル含有塩基を 担持したオリゴヌクレオチドに比して、相補的核酸配列に対し一層効果的にハイ ブリダイズするということが発見された。 更に別の一具体例においては、分子のホウ素密度及び脂質親和性を高めそして 、変性の位置に依存して、生物学的液体又は細胞中における生体内でのオリゴマ ーの安定性を高めるための手段として、 少なくとも1つの3’,5’−〔(O,O−カルボラン−1−イル)ホスホネー ト〕残基を担持したオリゴヌクレオチド、及びカルボラニル含有塩基を含有する 少なくとも1つのヌクレオシドが提供される。 本発明の別の一具体例においては、(カルボラン−1−イル)ホスホネート部 分の代わりに−O−〔(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート、S− 〔(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロチオエート、又はSe−〔(カ ルボラン−1−イル)アルキルホスホロセレノエートを担持したヌクレオシド又 はオリゴヌクレオチドが提供される。 BNCTにおけるここに記述したオリゴヌクレオチドの使用に加えて、ここに 開示されたオリゴマーは、相補的核酸配列との合成オリゴヌクレオチドのハイブ リダイゼーションのバルク許容性についてin vitroにおいて構造−活性関係を実 施するために、MRI造影において、又は種々の診断技法におけるプローブとし て使用することができる。 カルボラニル含有オリゴヌクレオチドはまた、in vitro又は生体内位置指定突 然変異導入法(SDM)を用いて、発現されるHIV−1逆転写酵素の突然変異 を起こすためにも使用することができる。 脂質親和性を高めるための手段として、ホウ素が10Bにおいては濃厚化されて いないがしかし代わりに11B同位体において濃厚化されているものであるホウ素 クラスターを含んだヌクレオシド、ヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドを製 造することができる。疾病にかかった細胞の破壊のための又は信号発生目的のた めの、中性子 照射崩壊に依存するBNCT又は他の診断法のために使用される本発明のヌクレ オシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、適当な量の10B、通常約90〜 100 %、そして典型的には92〜96%の10Bで濃厚化されている必要がある。 鍵となる出発原料、O−メチル(カルボラン−1−イル)メチルホスホネート を経由して、(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート部分を含んだヌク レオシド、ジヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドを製造するための新規の方 法が提供される。 図面の簡単な記述 図1は、BNCTのためのホウ素化されたオリゴヌクレオチドの仮説的作用機 序の概念的図解である。 図2は、鍵となる出発原料、O−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチル ホスホネートを用いた、チミジン−(3’,5’)−チミジン(o−カルボラン −1−イル)メチルホスホネートの製造のための方法の概念的図解である。 図3は、O−メチル−〔O−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフ ェートの製造のための方法の図解である。 図4は、5−(o−カルボラニル)−5’−O−ジメトキシトリチル−2’− O−デオキシウリジン−3’−(N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチル) ホスホラミダイトの製造のための方法の図解である。 図5は、Bx10カルボラン部分及びカルボランのアニオン性のo−ニド−7 ,8−C29(11 または12)及びo−クロソ−1,2−C21012形の化学構 造の図解である。 図6は、更に表1に記述されている、1つ又はより多くの5−( o−カルボラン−1−イル)ウラシル残基を担持したドデカチミジル酸類縁体の 自動的製造のための方法の図解である。 図7は、(dT)6CDU(dT)5(Tm =15.2),(dT)10CDU(dT )(Tm =20.5),CDU(dT)11(Tm=28.8),及び(dT)12(Tm =2 9.0)についての、摂氏で表した温度に対する吸光度の変化部分のグラフである 。 図8は、選択された一本鎖のCDU変性された及び変性されていないd(T)12 (化合物18)の光二色性スペクトルである。 図9は、CDU変性された及び変性されていないd(T)12及びd(A)12の 間に形成された複合体の円二色性スペクトルである。 本発明の詳細な記述 ここに用いるものとして、語「アルキル」は、別に特記しない限り、C1〜C1 0 の飽和した直鎖の、分枝した、又は環状の、第1級の、第2級の、又は第3級 の炭化水素をいい、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イ ソブチル、t−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチ ル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、3−メ チルペンチル、2,2−ジメチルブチル、及び2,3−ジメチルブチルを含む。 該アルキル基は、必要に応じて例えばGreene,et al.,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley and Sons,Second Edition,1991 中に教示 されているように、当業者に知られているようにして保護されていない又は保護 されたヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、 アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、サルフェート、ホス ホン酸、ホスフェート、又はホスホネートよりなる群より選ばれた1つ又はより 多くの部分で所望により置換されていてよい。ここに用いるものとして、語「低 級アルキル」は、別に特記しない限り、C1〜C4の飽和した直鎖の又は分枝のあ るアルキル基をいう。 語「アルキルアミノ」又は「アリールアミノ」は、それぞれ1つ又は2つのア ルキル又はアリール置換基を有するアミノ基をいう。 ここに用いるものとして、語「保護された」は、別に定義しない限り、酸素、 窒素又は燐原子にその更なる反応を防止するため又は他の目的で加えられた基を いう。 有機合成の分野の当業者には、広範な種々の酸素及び窒素保護基が知られてい る。 ここに用いるものとして、語「アリール」は、別に特記しない限り、フェニル 、ビフェニル又はナフチルをいい、好ましくはフェニルをいう。アリール基は、 必要に応じて例えばGreene,et al.,“Protective Groups in Organic Synthesi s”,John Wiley and Sons, Second Edition,1991 中に教示されているように、 当業者に知られているようにして保護されていない又は保護されたヒドロキシル 、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニ トロ、シアノ、スルホン酸、サルフェート、ホスホン酸、ホスフェート又はホス ホネートよりなる群より選ばれた1つ又はより多くの部分によって所望により置 換されていてよい。 語「アルカリール」又は「アルキルアリールは、アリール置換基を有するアル キル基をいう。 語「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、アルキル置換基を有するアリ ール基をいう。 ここに用いるものとして、語「ハロ」は、クロロ、ブロモ、ヨード、及びフル オロを含む。 語「プリン又はピリミジン塩基」は、アデニン、N6−アルキルプリン、N6− アシルプリン(ここにアシルはC(O)(アルキル、アリール、アルキルアリー ル、又はアリールアルキルである))、N6−ベンジルプリン、N6−ハロプリン 、N6−ビニルプリン、N6−アセチレンプリン、N6−アシルプリン、N6−ヒド ロキシアルキルプリン、N6−チオアルキルプリン、N2−アルキルプリン、N2 −アルキル−6−チオプリン、チミン、シトシン、6−アザピリミジン、2−及 び/又は4−チオピリミジン、ウラシル、C5−アルキルピリミジン、C5−ベン ジルピリミジン、C5−ハロピリミジン、C5−ビニルピリミジン、C5−アセチ レンピリミジン、C5−アシルピリミジン、C5−ヒドロキシアルキルプリン、C5 −アミドピリミジン、C5−シアノピリミジン、C5−ニトロピリミジン、C5− アミノピリミジン、N2−アルキルプリン、N2−アルキル−6−チオプリン、5 −アザシチジニル、5−アザウラシリル、トリアゾロピリミジニル、イミダゾロ ピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニルを含むがしかしこれ らに限定されない。塩基上の官能性の酸素及び窒素基は、必要に応じ又は所望に より保護することができる。適当な保護基は当業者に周知であり、トリメチルシ リル、ジメチルヘキシルシリル、t−ブチルジメチルシリル、及びt−ブチルジ フェニルシリル、トリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニル等のような アシル基、メチルスルホニル、及びp−トルイルスルホニルを含む。 ここに使用するものとして、語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ 芳香族」は、少なくとも1つの硫黄、酸素、又は窒素を当該芳香環中に含んだ芳 香族部分をいう。限定的でない例は、フリール、ピリジル、ピリミジル、チエニ ル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニ ル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベン ゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プ リニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、1,2, 4−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、キナゾリニル、ピリダジニ ル、ピラジニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キサンチニル 、ヒポキサンチニル、及びプテリジニルである。ヘテロ環状塩基上の官能性の酸 素及び窒素は、必要に応じ又は所望により保護されることができる。適当な保護 基は当業者に周知であり、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、t−ブ チルジメチルシリル、及びt−ブチルジフェニルシリル、トリチル又は置換され たトリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニル等のようなアシル基、メチ ルスルホニル、及びp−トルイルスルホニルを含む。 ここにいう語「アルケニル」は、別に特記しない限り、少なくとも1つの二重 結合を有する直鎖の、分枝のある、C2〜C10の炭化水素である。 語「アシル」は、式C(O)R’(ここにR’はアルキル;メトキシメチルを 含むアルコキシアルキル;ベンジルを含むアリールアルキル;フェノキシメチル 等のアリールオキシアルキル;所望によりハロゲン、C1〜C4アルキル若しくは C1〜C4アルコキシ又はアミノ酸残基で置換されていてよいフェニルを含むアリ ールであ る)よりなる部分をいう。 ここに用いるものとして、語「鏡像体的に濃厚化された」は、一方の鏡像体が 混合物中に過剰に、好ましくは95%以上の程度まで、そしてより好ましくは98% 以上存在しているものである鏡像体の混合物たる化合物をいう。 語「オリゴヌクレオチド」は、3’及び5’−ヒドロキシル又は2’及び5’ −ヒドロキシル基を介して結合された35又はより少ないヌクレオチドよりなるオ リゴマーをいう。 語「アミノ酸」は、天然に存在する及び合成のアミノ酸を含み、そしてアラニ ル、バリニル、ロイシニル、イフロイシニル、プロリニル、フェニルアラニニル 、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、スレオニニル、シ ステイニル、チロシニル、アスパラギニル、クルタミニル、アスパルトイル、グ ルタオイル、リジニル、アルギニニル、及びヒスチジニルを含むがこれらに限ら れない。 語「(カルボラン−1−イル)ホスホネート」が本明細書において用いられる 場合、−O−(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート、S−(カルボ ラン−1−イル)アルキル〕ホスホロチオエート、又はSe−(カルボラン−1 −イル)アルキル〕ホスホロセレノエートが代わりに使用できるということが理 解されなければならない。 カルボラニル残基を担持した新規のクラスの変性された脂質親和性のヌクレオ チド及びオリゴヌクレオチドが、BNCT、AOTのにおいて使用するために及 び、MRIを含む診断目的のために及びプローブとして、提供される。該オリゴ ヌクレオチドは、一つ又は より多くのカルボラン−1−イル残基を担持しており、標的細胞へのホウ素の濃 縮された且つ選択的な投与を許容する。ホウ素変性されたオリゴヌクレオチドの 脂質親和性は、化合物中におけるカルボラン−1−イル残基の数及び位置の適当 な選択によって操作することができる。概して、燐原子に直接結合した、又は適 当なスペーサー(例えばアルキル、ペプチジル)を介して酸素、硫黄又はセレン に取り付けられたカルボラニル基は、それが親水性のそしてイオン化可能なヒド ロキシ基の代わりの置換基として働くため、カルボラニル基が別の位置例えば塩 基に取り付けられている場合に比して、化合物の脂質親和性に対して一層有意な 影響を及ぼす。 一具体例においては、カルボラニル含有オリゴヌクレオチドは、神経膠腫、黒 色種及び乳癌を含む腫瘍の臨床的進行とよく相関するある種の癌原遺伝子の過剰 発現を阻害するため又は腫瘍のサプレッサー遺伝子の発現を最適化するために、 癌細胞に特異的に狙いを定められる。 I.カルボラニルヌクレオシド及びヌクレオチド A.カルボラニル部分 カルボラン類(カルバボラン類とも呼ばれる)は、多面体ホウ素内に組み込ま れた炭素原子を含む化合物である。カルボラン化学の概説については、F.Cotto n and G.Wilkinson,Advanced Inorganic Chemistry,Fourth Edition,John W iley and Sons,1980,p.318-320を参照のこと。CH基は、BH基と等電子であ り、従ってBH基を置き換えることができる。多面体カルボランは、従って形式 的には、Bnn-2イオンから、一般式Bn-22nの分子に至る2つの炭素によ る置換によって誘導されると考えることができる 。中性の2炭素カルボランは、一般に、式Bn2n+2であり、ここにnは3〜1 0である。ここに記述された目的のためには、これらのカルボランを如何なる異 性体の形でも使用できるか、n=9又は10のカルボランが好ましい。 カルボラン骨格中においてこれら2つの炭素原子が互いに隣り合っている場合 、該カルボランは、1,2−又はオルトカルボラン(o−カルボラン)とよばれ る。例えば、B10212は通常1,2−異性体として製造され、それは加熱さ れたとき1,7−異性体へと配列変化する。 カルボランは、多数の異性体の形で存在し得る。「クロソ(closo)」カルボラ ンは、閉じたカゴ構造を有し、これに対して「ニド(nido)」カルボランは、開 いた巣状の構造を有する。例としては、アニオン性のo−ニド−7,8−C29 (11 または12)及び中性のo−クロソ−1,2−C21012がある。カルボラ ンはまた、4種のアラクノ(arachno)異性体のうちの一つとして又はハイフォ(hy pho)異性体として存在しうる。1,2−及び1,7−ジカルバドデカボラン及び それらのC置換された誘導体の双方は、強塩基によって処理したとき、ホウ素を 失って変性し異性体であるニド−カルボランアニオンB92(11 または12)を与 える。双方の異性体B92(11 または12)イオンは、酸無水物による処理に続く 加熱によって、クロソ−カルボランB9211に変換される。 カルバボランは、典型的には、アセチレン類とボラン又はボラン付加体との相 互作用によって製造される。最も普通のカルボランはB10212及びその炭素 置換された誘導体である。炭素置換されたカルボランは、当業者に知られている ようにして置換アセチレン によって、又は例えば、水素をリチウムで置き換えるためのカルボランと強塩基 との反応およびそれに続く所望の親電子試薬による処理によって製造することが できる。置換されたカルボラン部分を提供するために使用できるアセチレン誘導 体は、例えば、Heying,T.L.,et al.Inorganic Chemistry 2(6),1089-1092( 1963)に記述されている。 アニオン性カルボランは、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシ ウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリ ウム、ピリジニウム、第4級アンモニウム、プロトン付加エチレンジアミン、又 はプロトン付加したリジン及びプロトン付加したアルギニンを含むがこれに限ら ないプロトン付加したアミノ酸等を含むがこれらに限られない、一価の又は多価 の薬剤学的に許容し得るカチオンの薬剤学的に許容し得る塩として投与すること ができる。 B.カルボラニルヌクレオシド及びヌクレオチド i) 3’若しくは5’位又は両方に(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホ ネートを備えたヌクレオシド 一具体例においては、分子の3’若しくは5’位に(カルボラン−1−イル− メチル)ホスホネートを含んだヌクレオシドが提供される。限定的でない例とし ては、以下に示された式I,II,及びIII のヌクレオシドである。 〔式中、R1は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルコキシアルキル、 アリール、ヘテロアリール、トリフルオロメチル、アルキルアリール、アリール アルキル、又はハロゲンであり、 R2は、水素、アルキル、アシル(アセチルを含む);メタンスルホニルを 含むアルキル又はアリールアルキルスルホニルを含むスルホン酸エステル;モノ −、ジ−又はトリホスフェートエステル;トリチル又はモノメトキシトリチル; 上記のアリールの定義中に記述された1個又はより多くの置換基で所望によりフ ェニル基が置換されていてよいベンジル;トリアルキルシリル(例えば、t−ブ チルジメチルシリル)又はジフェニルメチルシリルを含むシリル;脂質;ペプチ ド;又はコレステロールであり、 R3は、ヒドロキシル、水素、ハロゲン、−CN,−N3,低級アルキル、ア ミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシであり、そしてR3基は リボシル(環を酸素が後ろにくるように配向したとき糖部分に対して「下側」) 又はアラビノシル(「上側」)型コンフォメーションをとることができる。 Bは、カルボラニル基のホウ素部分を表し、特にアニオン性のo−ニド−7 ,8−C29(11 または12)及び中性のo−クロソ−1,2−C21012を含 み、 Wは、O,S,又はSeであり、Zは、O又はSであり、 Xは、O,S,S(O),S(O)2,CH2,CHOH,CHN3又はNH であり、 Yは、OH,SH,SeH,又はハロゲン特にフッ素であり、 nは、1〜5であり、 mは、0又は1である。〕 塩基は、好ましくは、上に規定した通りプリン又はピリミジン塩基であり、 好ましくはチミン、ウラシル、5−フルオロウラシルを含む5−ハロウラシル、 シトシン、5−フルオロシトシンを含む5−ハロシトシン、アデニン、グアニン 、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、2−アミノプリン 、5−低級アルキルウラシル、又は5−低級アルキルシトシン、2−チオウラシ ル、2,4−チオウラシル、4−チオウラシル、6−クロロプリン、5−カルボ ラニルウラシル、5−カルボラニルシトシン並びに、下記のセクションiv)に 記述されているものを含む他のカルボラニルプリン及びカルボラニルピリミジン である。 ii)無荷電の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホ ネートヌクレオチド間結合を含んだジヌクレオチド 第2の具体例においては、2つのヌクレオシドが無荷電の3’,5’−O,O −〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕結合を介して結合された ものであるジヌクレオチドが提供される。限定的でない例には、式III 及びIVの 化合物がある。 〔式中、R1,R2,R3,B,W,X,Y,Z,m及びnは上記定義に同じであ る。〕 iii) 無荷電の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホス ホネート〕ヌクレオチド間結合を含んだオリゴヌクレオチド 第3の具体例においては、少なくとも1個の3’,5’−O,O−〔(カルボ ラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕ヌクレオチド間結合を含んだオリゴヌ クレオチド及びホスホチオエート又はジチオエートオリゴヌクレオチド、メチル ホスホネートオリゴヌクレオチド、及びデホスホオリゴヌクレオチド(例えば、 ペプチドオリゴヌクレオチド)が提供される。3’,5’−O,O−〔カルボラ ン−1−イル−メチル)ホスホネートは、オリゴヌクレオチドの3’末端にある 末端の2個のヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの5’末端にある末端の2個 のヌクレオチドを、又は代わりとして、隣接のヌクレオチドを含む、オリゴヌク レオチドの中間部分にある2個のオリゴヌクレオチドを、結合させることができ る。殆どのオリゴヌクレオチドが3’−エンドヌクレアーゼによって分解される という事実に照らし、好ましい一具体例においては、3’,5’−O,O−〔( カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート結合によって、少なくとも、3’ 末端にある2個の末端ヌクレオチド又はこれらに隣接するヌクレオシドが結合さ れているものであるオリゴヌクレオチドが提供される。 該オリゴヌクレオチドは、所望により、完全に変性されたオリゴヌクレオチド に至るまで、1個より多くの3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル− メチル)ホスホネート結合を含むことが できる。好ましい一具体例においては、該オリゴヌクレオチドは、典型的な13 マー(又はそれ未満)について約1乃至5個の変性された結合を有する。 以下に一層詳細に記述するように、上に定義したプリン又はピリミジンのいず れも、如何なる適当な配列中においても、該オリゴヌクレオチドにおいて使用す ることができる。一具体例においては、天然に存在するヌクレオシド例えばアデ ノシン、グアノシン、シチジン、チミジン又はウリジンが、該オリゴヌクレオチ ド中に存在する。 3’末端としてX基を含んだヌクレオチドが使用でき、ここにXは、O,S, S(O),S(O)2,CH2,又はNH、好ましくはO又はSである。 特異的配列の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホス ホネート〕結合を有する合成オリゴヌクレオチドが、転写又は複製を阻害する( 配列がDNAである場合)ため、翻訳を阻害する(配列がRNAであるばあい) ため、又はプロセシングを阻害(配列がpre−RNAである場合)するために 、相補的核酸配列に対するハイブリダイゼーションのために製造できる。例えば 、標的mRNAに対するハイブリダイゼーションによってタンパク質の生合成を 阻害する、そして本発明の背景において記述したような他の目的のための、アン チセンスカルボラニル変性オリゴヌクレオチドを製造することができる。 二本鎖NDA中の特異的遺伝子配列にハイブリダイズしてその遺伝子配列の発 現を阻害する三本鎖複合体(トリプレックス)を形成するカルボラニル含有オリ ゴヌクレオチドもまた製造できる。 既知の機能を有する広範な種々の核酸配列が報告されており、そしてこの領域 において現在広範な研究が行われていることからすれば、他の多くが将来報告さ れるであろう。この開示を与えられたことにより、当業者は、BNCT又はAO Tにおいて使用するための1個又はより多くの3’,5’−O,O−〔(カルボ ラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕結合によって所望により変性させた如 何なる核酸配列をも製造することができる。本発明が特定の核酸配列に向けられ たものでなく、代わりに、関係配列の安定性、脂質親和性、易輸送性及びホウ素 濃度を高めるための一般的技術であるということが理解されなければならない。 iv)塩基中にカルボラニル部分を有するオリゴヌクレオチド 第4の具体例においては、核酸のうちの1個の塩基単位中にカルボラニル部分 を含んだオリゴヌクレオチドが提供される。カルボラニル含有塩基の限定的でな い例が、式V乃至Xに示されている。 〔式中: Cは、B101024(ここにR4は−H,−OH,−CH2OH,− CH2X(ここにXはハロゲンである))又は−B92(11 または12)(ニド− カルボランアニオン)のようなカルボラニル基であり、 R5は低級アルキルであり、 GはN又はCHであり、 MはO又はSであり、そして Zは0乃至5である。〕 このカルボラン含有塩基は、3’又は5’末端ヌクレオチド中に、該3’又は 5’末端ヌクレオシドに隣接したヌクレオチド中に、又中間のヌクレオシド中に あることができる。3’又は5’末端ヌクレオチド中に又は3’又は5’末端ヌ クレオシドに隣接するヌクレオシド中にカルボラニル変性させた塩基を含んだオ リゴヌクレオチドが、中間のヌクレオチド中にカルボラニル含有塩基を担持する オリゴヌクレオチドに比して、相補的核酸配列に一層効果的にハイブリダイズす るということが発見された。3’−末端ヌクレオチド中に、3’−末端ヌクレオ シドに隣接したヌクレオチド中に、又は3’−末端及び5’−末端ヌクレオシド 中にカルボラニル変性させた塩基を含んだオリゴヌクレオチドが、他の方法で変 性させたものに比して、分解に対し一層抵抗性であることも発見された。 上のセクションI.B.iii)において論じたように、如何なる関係核酸配列も 、オリゴマーの塩基単位へのカルボラニル部分の追加によって変性させることが できる。本発明は特定の核酸配列に向けられてはおらず、代わりに一般的技術に 向けられたものである。 実施例1 5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−O−デオ キシウリジンを含有するDNA配列 変性されたDNA配列(ここにXは、5−(o−カルボラン−1−イル)−2 ’−O−デオキシウリジンであり、CDUともよばれる)の実施例並びに対照配 列が以下に掲げられている。これらの実施例は、単に説明のためのものであり、 本発明の範囲を限定することを意図したものではない。 DNA配列 X=CDU〔5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−デオキシ ウリジン〕 生体内位置指定突然変異導入用: HIV−1に対する標的 癌化学療法のための標的 代わりの一具体例においては、Xは、セクションVにおいて説明した塩基を含 むヌクレオシドである。別の代わりの一具体例においては、Xは、チミジン、シ チジン、アデノシン、グアノシン又はウリジンなどのような未変性のヌクレオチ ドが、又はその対応する2’−デオキシヌクレオシドを表し、そして上に同定さ れた配列は、代わりに、塩基カルボラニル変性を伴い又は伴わずに、ホスホジエ ステル結合に代えて3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル) ホスホネート結合の置換よって変性される。 v) 3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル )ホスホネートヌクレオチド間結合及びカルボラニル含有 塩基の両方を備えたオリゴヌクレオチド 第5の具体例においては、3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル− メチル)ホスホネート〕ヌクレオチド間結合及びカルボラニル含有塩基の両方を 含んだオリゴヌクレオチドが提供される。カルボラニル含有塩基は、3’,5’ −O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕架橋を介して結 合しているヌクレオチドと同じでも異なっていてもよい。 B.立体化学及び対称性 ここに提示したヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの立体化学は、ヌクレオ シドの立体配置及び、化合物中に存在する場合には、キラルの(カルボラン−1 −イル−メチル)ホスホネート部分の立体配置によって影響を受ける。 ヌクレオシドの立体化学 一具体例においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’,5’−O,O− 〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕結合によって又は1個又は より多くの塩基へのカルボラニル部分の追加によって変性されている、天然に存 在するヌクレオシド、好ましくはアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン 及びウリジンよりなる。これら天然に存在するヌクレオシドは、天然に定められ た一つの立体配置を有する。しかしながら、天然には存在しないヌクレオシドが オリゴヌクレオチド中において又は単独で用いられるならば、立体化学問題が関 わってくる。合成オリゴヌクレオチドの糖部分又は変性された糖部分(以下総称 して「糖部分」という)の1’及び4’炭素はキラルであることから、それらの 水素でない置換基(それぞれ、CH2OR2及びピリミジン又はプリン塩基)は、 糖の環系に対してシス(同じ側)またはトランス(反対側)のいずれかであるこ とができる。従って、次の立体配置により、4つの光学異性体が存在する(「主 要な」酸素(C1’とC4’原子との間の酸素)が後ろになるように糖部分を水 平面に置いたとき):シス(両方の基が「上」。これは天然に存在するヌクレオ シドの立体配置に対応する)、シス(両方の基が「下」。これは天然にはない立 体配置である)、トランス(C1’置換基については「上」そし てC4’置換基については「下」)、及びトランス(C1’置換基については「 下」そしてC4’置換基については「上」)。 一般に、「D−ヌクレオシド」は天然の立体配置のシスヌクレオシドであり、 「L−ヌクレオシド」は天然にない立体配置のシスヌクレオシドである。 本発明によれば、合成ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中において又は単 独でこれらのいずれの立体配置においても使用できる。特定の合成ヌクレオシド が、一つの立体配置においては他の立体配置におけるよりも一層活性又は一層低 毒性又はその両方であり得ることが知られている。当業者は、この開示を与えら れて、望みの適用のための具体的な合成ヌクレオシドについて、最適の立体配置 を容易に決定することができる。代わりとして、該ヌクレオシドは、ラセミ混合 物として又は鏡像体的に濃厚化した組成物として使用することができる。 シス−ヌクレオシドのD及びL−鏡像体の分離のための酵素的方法は、例えば 、Nucleosides and Nucleotides,12(2),225-236(1993);Biochem Pharma,I nc.により出願された欧州特許出願第92304551.2及び92304552.0;及びEmory Uni versityにより出願されたPCT 公開番号WO 91/11186,WO 92/14729,及びWO 92/1 4743に開示されている。 アシルされた又はアルキル化されたシスヌクレオシドのD及びL鏡像体のラセ ミ混合物の分離はまた、PCT公開番号WO 92/14729に開示されているように、キラ ルな固定相を備えたHPLCによっても達成できる。 α及びβ−L−ヌクレオシドは、例えば次の刊行物中に開示され た方法または開示された方法の標準的修正によって製造することができる:Jeon g,et al.,J.of Med.Chem.,36,186-195,1993; 欧州特許出願公開番号0 28 5 884 ;Genu-Dellac,C.,G.Gosselin,A.-M.Aubertin,G.Obert,A.Kirn ,and J.-L.Imbach,3-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antiviral agents; synthesis and biological evaluation,Antivi ral Chem .Chemother. ,2:83-92(1991); Johansson,K.N.G.,B.G.Lindborg,an d R.Noreen,欧州特許出願352 248 ;Mansuri,M.M., V.Farina,J.E.Starre tt,D.A.Benigni,V.Brankovan,and J.C.Martin,Preparation of the geno metric isomers of DDC,DDA,D4C,and D4T as potential anti-HIV agents,B ioorg .Med.Chem.Lett. 1:65-68(1991); Fujimori,S.,N.Iwanami,Y.Hash imoto,and K.Shudo,A convenient and stereoselective synthesis of 2'-de oxy-β-L-ribonucleosides, Nucleosides & Nucleotides 11:341-349(1992); Ge nu-Dellac,C.,G.Gosselin,A.-M.Aubertin,G.Obert,A.Kirn,and J.-L .Imbach,3-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antivaral agents; synthesis and biological evaluation,Antiviral Chem Chemother. ,2:83-92(1991); Holy,A.,Synthesis of 2'-deoxy-L-uridine,Tet rahedron Lett .2:189-192(1972); Holy,A.,Nucleic acid components and th eir analogs.CLIII.Preparation of 2'-deoxy-L-ribonucleosides of the pyr imidine series.Collect Czech Chem Commun. 37:4072-14087(1992); Holy,A. ,2'-deoxy-L-uridine: Total synthesis of a uracil 2'-deoxynucleoside fro m a sugar 2-aminooxazoline through a 2.2'-anhydronucleoside intermediate.,Twonsent LB,Tipson RS,ed.Nucleic Acid Chem.New York: Wiley,347-353.Vol 1)(1992); Okabe,M.,R.-C.Sun,S.Tan,L.Todaro,and D.L.Coffen,Synthesis of the dideoxynucleosides ddC and CNT from glutam ic acid,ribonolactone,and pyrimidine bases.J Org Chem.53:4780-4786(1 988); Robins,M.J.,T.A.Khwja,and R.K.Robins.Purine nucleosides.XXI X.Synthesis of 2'-deoxy-L-adenosine and 2'-deoxy-L-guanosine and their alpha anomers.J Org Chem.35:363-369(1992); Genu-Dellac,C.,Gosselin, G.,Aubertin,A-M,Obert,G.,Kirn,A.,and Imbach,J-L.,3-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antivaral agents; synth esis and biological evaluation,Antiviral Chem .Chemother.,2:83-92(1991 ); Genu-Dellac,C.,Gosselin G.,Imbach J-L; Synthesis of new 2'-deoxy-3 '-substituted α-L-threo-pentofranonucleosides of thymine as a potential antiviral agents.Tet Lett 32(1):79-82(1991); Genu-Del1ac,C.,Gosselin G.,Imbach J-L,Preparation of new acylated derivatives of L-arabinofur anose and 2-deoxy-L-erythro-pentofuranose as precursors for the synthesi s of L-pentofuranosyl nucleosides.216:2140-255(1991); 及びGenu-Dellac, C.,Gosselin G.,Puech F.,et al.Systematic synthesisi and antiviral ev aluation of α-L-arabinofuranosyl and 2'-deoxy-α-L-erythro-pentofuranos y.nucleosides of the five naturally occurring nucleic acid bases.10(b) :1345-1376(1991). β−D−ヌクレオシド、及び合成ヌクレオシドのラセミ混合物は 、例えば次を含むがそれらに限られない非常に多数の参照文献中に記述されてい るようにして又は記述されている製造の日常的な修正又は延長によって、製造す ることができる:Chu 等の米国特許第4,916,122,欧州特許出願0 217 580,PCT 出願 WO 92/101497; Chu,C.K.,et al.,“A general synthetic method for 2' ,3'-dideoxynucleosides: total synthetic approach,“Nucleosides & Nucleot ides 8: 5&6,903-906(1989); Chu,C.K.,et al.,“Enantiomeric synthesis o f(+)-BCH-189 and(+)-1-β-D-5-(1,3-oxothiolanyl)cytosine from D-mannose a nd its anti-HIV activity”.J .Org.Chem.(1991); Chu,C.K.,et al.,“St ructure-activity relationships of pyrimidine nucleotides as antivaral ag ents for human immunodeficiency virus type 1 in peripheral blood mononuc lear cells,”J .Med.Chem. 32: 612(1989); Hurym,D.M.,et al.,“Synthesi s of iso-DDA,member of a novel class of anti-HIV agents,”Tetrahedron L ett .30:6259-6262(1989); Kreitsky, T.A.,“3'-Amino-2',3'-dideoxyribonucl eosides of some pyrimidines: synthesis and biological activities,”J .Me d.Chem. 26: 891-895(1983); Lin,T.,et al.,“Synthesis and biological a ctivity of various 3'-azido and 3'-amino analogues of 5-substituted pyri midine deoxyribonucleosides,”J .Med.Chem. 26: 1691-1696(1983); Mansuri ,M.M.,et al.,“Preparation of the geometric isomers of DDC,DDA,D4C a nd D4T as potentialanti-HIV agents,”Bioorg .Med.Chem.Lett. 1:65-68(19 91); Okabe,M.,et al.,“Synthesis of the dideoxynucleosides ddCand CNT from glutamic acid,ribonolactone,and pyrimidine ba ses,”J .Org.Chem.53: 4780-4786(1988); Peterson,M.L.,et al.,“Synth esis and biological evaluation of 4-purinylpyrrolidine nucleosides,”J Med.Chem. 34: 2787-2797(1991); Sterzycki,R.Z.,et al.,“Synthesis and anti-HIV activity of several 2'-fluoro-containing pyrimidine nucleosides ,”J .Med.Chem.33: 2150-2157(1990); Wilson,L.J.,et al.,“A general m ethod for controlling glycosylation stereochemistry in the synthesis of 2'-deoxyribose nujcleosides,”Tetrahedron Lett 1815(1990);及び Wilson, L.J.,et al.,“The synthesis and anti-HIV activity of pyrimidine dioxola nyl nucleosides,”Bioog.Med .Chem.Lett. 3:2 169-174(1993). リン原子における立体化学 リンのアニオン性のプロキラルな酸素原子のうちの一つを(カルボラン−1− イル)メチル部分で置き換えることは、リン原子の位置(例えば化合物8,図2 を参照)にそしてこの部分を担持するヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド(例 えば化合物11及び12,、図2を参照)にキラル中心を作りだす。この変性及 びここに記述する結合反応の立体非選択性のために、この(カルボラン−1−イ ル)メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、典型的には、ジアステレオ異性 体として得られる。 P−キラルのオリゴヌクレオチド類縁体の立体制御された合成のための方法に ついては、Lesnikowski,Bioorg.Chem.,1993,21,127-155.を参照のこと。要 するに、P−立体配置の規定された、P−キラルのオリゴヌクレオチドは、次の 方法を用いて製造することができる。 (i)酵素法。このアプローチは、ホスホロチオエート及びメチルホスホネー トオリゴヌクレオチド類縁体の立体配置制御された合成のために有用である。 (ii)ジアステレオ異性オリゴヌクレオチドの分離。この方法は、3個のP− キラルのヌクレオチド間結合(8種のジアステレオ異性体)を含んだオリゴヌク レオチドのために最も有用である。 (iii)ブロック合成:ジヌクレオチドが最初にジアステレオ異性体の混合物と して合成される。第2のステップにおいて、この混合物は個々のジアステレオ異 性体種へと分離される。このジアステレオ異性ジヌクレオチドは、次にリン酸化 又は亜リン酸されそして、より長いオリゴヌクレオチドの合成においてシンソン (synthons)として使用される。この方法は、天然の又は変性されているがしか し立体配置の規定されていないヌクレオチド間結合によって分離された立体配置 の規定された合成のヌクレオシド間結合を備えたオリゴヌクレオチドの合成のた めの方法を提供する。 (iv)立体特異的なヌクレオチド間結合形成:ジアステレオ異性体的に純粋な モノマーを最初に合成する。ジアステレオ異性体的に純粋なモノマー及び立体特 異的結合試薬を用いて、P−立体レギュラーオリゴマーを製造することができる 。 (v)ヌクレオシド間結合の立体特異的変性 P−キラルのアンチセンスオリゴヌクレオチドのリンにおける絶対的立体配置 の、それらの物理化学的及び生化学的性質に対する影響が研究された。リン原子 の位置における絶対的立体配置は、取り分け、可溶性、細胞膜を通る易輸送性、 標的核酸の相補的配列に対する親和性(融解温度)、及び核酸溶解性酵素に対す る抵抗性に影 響を与える(Uhlman,et al.,Chem.Rev.1990,90.544-584)。 II.カルボラニル含有ヌクレオシド及びヌクレオチドの製造のための方法 A.3’−O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホスホ ネート〕部分を含有するヌクレオシド及び3’,5’−O, O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート 〕結合を含有するジヌクレオチドの製造 3’−O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕部分を含 有するヌクレオシド及び3’,5’−O,O−〔(o−カルボラン−1−イル− メチル)ホスホネート〕結合を含有するジヌクレオチドの製造のための新規の方 法が提供される。該方法は、鍵となる出発材料、多能的なボロホスホニル化剤で あるO−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネートを使用する。 図2に図解されているように、O−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチ ルホスホネートは、3つのステップよりなる手順で製造することができる。第1 のステップにおいては、臭化プロパルギルが亜リン酸トリメチルとMichaelis-Ar buzuv タイプの反応においいて反応させられて、優れた収率でO,O−ジメチル プロパルギルホスホネートを与える。臭化プロパルギルは、Aldrich Chemical C ompanyからトルエン溶液として入手でき、そしてトルエンは反応溶媒として使用 できる。広範な他の溶媒もまたこのステップにおいて使用できる(例えば、Arbu zov,B.A.,Pure Appl.Chem.,1964,9,307-335 を参照)。この反応は、所望 の結果を達成する如何なる 温度においても又如何なる時間にわたっても行うことができる。この反応は、通 常、−20℃乃至溶媒の沸点の範囲の温度にて行われる。湿気及び酸素のアクセス を制限することが好ましい。反応時間は、使用される基質の構造、溶媒、及び反 応温度に依存し、そして一般に1乃至24時間である。 臭化プロパルギル以外のアルキニル出発材料をこの工程において使用すること ができる。ヨウ化プロパルギル又は塩化プロパルギルを、臭化プロパルギルの代 わりに置き換えることができる。この開示を与えられた当業者には容易に推測で きるように、3’−ブチン−1−ブロマイドは、カルボラニル−エチルホスホネ ートを、及び4−ペンチン−1−ブロマイドはカルボラニルプロピルホスホネー トを与えるであろう。一般に、適切に選択された臭化プロパルギルの同族体は、 関係のいかなるカルボラニル(CH2nP異性体を製造するのにも使用できる。 第2のステップにおいては、O,O−ジメチルプロパルギルホスホネートが、 Heying et al.,Inor.Chem.1963,1089-1092による一般の反応スキームに従っ て、良好な収率でO,O−ジメチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホ ネートを得るために、アセトニトリル中でデカボランと反応させられる。この反 応は、典型的にはルイス塩基溶媒例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ア ミン、ジアルキルスルフィド、環状又は非環状エーテル(テトラヒドロフラン、 ジオキサン及びジイソプロピルエーテル)、又はベンゼン等のような芳香族溶媒 中で行われる。反応は、望みの結果を達成する如何なる温度においてまた如何な る期間行ってもよい。反応の温度は、一般に室温乃至溶媒の沸点の範囲であり、 そして反応の 期間は、基質の構造及び反応条件に依存するが、一般に1乃至24時間である。 目的の、鍵となる出発物質であるO−メチル(o−カルボラン−1−イル)メ チルホスホネートは、ジオキサン中においてチオフェノール及びトリエチルアミ ンを用いるO,O−ジメチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネート の脱メチル化により、トリエチルアミン塩として得られる。チオフェノール又は チオクレゾールと、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン又は1,8−ジア ザビシクロ〔5.4〕ウンデス−7−エン(DBU塩基)又は他の有機塩基との 、ジオキサン又は他の化学的に不活性な溶媒中における混合物を、代わりに使用 できる。別の一具体例においては、2−メルカプトベンゾチアゾールがジイソプ ロピルアミンと組み合わせて使用される(Tetrahedron Lett.,1988,29,5479- 5482を参照)。一般に、使用する有機溶媒に可溶性のO−メチル(o−カルボラ ン−1−イル)メチルホスホネートの塩を形成する塩基を用いる必要がある。有 機塩基が好ましいが、幾つかの無機のカウンターイオン例えばセシウム(水酸化 セシウムから得られる)を用いてもよい。 この方法は、O−メチル基によって保護されたヌクレオチド間結合を脱ブロッ クするためのオリゴヌクレオチド化学において使用される。対照的に、t−ブチ ルアミンを用いる選択的な脱メチル化は、数種の特定できない副生成物が得られ るため、部分的に成功するのみである。これは、部分的なクロソからニド−カル ボラニルへの変形によるものであろう。 鍵となる出発物質、O,O−ジメチル(o−カルボラン−1−イ ル)メチルホスホネート(トリエチルアンモニウム塩)は、5’−(及び2’− 又は、適切な場合には、塩基−)保護されたヌクレオシドと、活性化剤としての トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド、及び2,4,6−コリジン及 び1−メチルイミダゾールの存在下に反応させられる。トリイソプロピルベンゼ ンスルホニルクロライドは、ボロホスホニル化剤を活性化させる活性化剤である 。2,4,6−コリジンは、反応中に産生される塩酸のスカベンジャーである。 1−メチルイミダゾールは、ボロホスホニル化剤を追加的に活性化させる求核触 媒である。塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニルの代わりに他の塩化アリー ルスルホニル又はアリールスルホニルアゾリドを使用することができる。2,4 ,6−コリジンの代わりに、他の有機塩基、例えばジ(イソプロピル)エチルア ミン等を使用することができる。1−メチルイミダゾールは、5−クロロ−1− エチル−2−メチルイミダゾール及び5−ニトロ−1−メチル−イミダゾール等 のような他の求核触媒によって置き換えることができる。この反応は、典型的に は、テトラヒドロフランのような環状エーテル、アセトニトリル等のようなニト リル、またはジメチルクロライドなどのようなクロロカーボン等のような不活性 有機溶媒中において、−10℃乃至溶媒の沸点の範囲の温度にて、5分乃至24時間 の範囲の時間にわたって、無水条件下に行われる。 反応生成物である3’−O−〔(O−メチル−(o−カルボラン−1−イル− メチル)ホスホン化〕ヌクレオシドは、上述のようにして脱メチルかされて3’ −O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホスホン化〕ヌクレオシドのト リエチルアミン塩を与える。 代わりの一具体例において、5’−O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチ ル)ホスホネート〕ヌクレオシドを所望する場合には、3’−(及び2’−又は 、適切な場合には、塩基−)保護されたヌクレオシドを用いて上記のステップを 行うことができる。しかしながら、5’−ヒドロキシ基の高い化学的活性のため 、反応条件を調節する必要がある。加えて、一般に、遊離の5’−ヒドロキシル 基を担持したヌクレオシドの可溶性は、その5’−ヒドロキシルが保護されてい る場合には、遊離の3’−ヒドロキシル基を備えたものに比して低く、従って溶 媒の調節が必要である。 3’−O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホスホン化〕ヌクレオシ ドのトリエチルアミン塩は、次いで、3’,5’−O,O−〔(o−カルボラン −1−イル−メチル)ホスホネート〕結合を備えたジヌクレオチドを与えるため に、無水条件下に3’−(2’−及び、適切な場合には、塩基)保護されたヌク レオシドと反応させることができる。代わりの一具体例においては、5’−エス テルを第2のヌクレオシドの3’−ヒドロキシ基と反応させることができる。 図2は、鍵となる出発材料であるO−メチル(o−カルボラン−1−イル)メ チルホスホネートを用いた、チミジン−(3’,5’)−チミジン(o−カルボ ラン−1−イル)メチルホスホネートの製造のための方法の概念的図解である。 この工程は、実施例2に詳細に記述されている。Aldrich(Milwaukee,ウィスコ ンシン州)より入手したシリカゲル60、230 〜400 メッシュによるカラムクロ マトグラフィーを実施した。薄層クロマトグラフィーは、Sigma(St.Louis,ミ ズリー州)より入手したシリカゲルF254プレート 上で実施した。溶媒は入手可能な最も高い品質のものを調達しそして乾燥させる ことなく使用した。質量スペクトルは、VG 70−S又はPerkin-Elmer Sciex API-3 スペクトロメーターによって記録した。31P−NMRスペクトルは、Br uker WP-200 スペクトロメーターにより、外部標準として85%H3PO4を用いて 81.0MHzにて作動させることにより記録した。1H及び13C−NMRスペクト ルは、GE QE Plus スペクトロメーターにより、外部標準としてテトラメチルシ ランを用いそれぞれ300.15MHz及び75.48MHzにて作動させることにより記 録した。標準から下方へのシフトを、陽性とした。UVスペクトルは、Beckman DU-65 分光光度計により記録した。逆相HPLC(RP−HPLC)は、Hewlet t-Packard 1050システムにより、Whatman Partisphere C18,5μm,4.7 ×235 mmカラムを用いて実施した。 実施例2 チミジン−(3’,5’)−チミジン(o−カルボラ ン−1−イル)メチルホスホネートの製造 O,O−ジメチルプロパルギルホスホネート(3) 臭化プロパルギル(2,図2)〔0.15mol,トルエン中80%溶液の22.3g〕 及び亜リン酸トリメチル(1)〔0.19 mol,23.6,25%モル過剰)を、還流 下に5時間攪拌し、次いで蒸留した。低沸点画分は、主として未反応の2及び主 たる副生成物としてのO,O−ジメチルメチルホスホネートであった。50〜67℃ /0.5 mmHgにおいて沸騰する画分を収集しそして再蒸留して3を得た。沸点 69〜91℃/1mmHg(95g,45%)。31P−NMR(CDCl3):δ 21.0 ,1H−NMR(CDCl3):δ 2.8(dd,2H,J H),3.9(d,6H,JPH=13.8 Hz,CH3 OP), 13C−NMR(CDCl3):δ 16 .0(d,JPC=145.8 Hz,PCH2),53.0(d,JPC=6.8 Hz,CH3OP).71.2(d,J PC=10.6 ,CH),73.4(d,JPC=14.3,CH2 C ). O,O−ジメチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネート(5) 方法A デカボラン(4)(0.01 mol,1.2 g)を乾燥CH3CN(20ml)中に溶解 させ、得られた溶液を還流下に加熱した。15分後、3(0.02 mol,2.8 g)をこ の沸騰溶液に加えて加熱を8時間持続した。反応混合物を室温にて終夜放置し、 そして濾過した。減圧下に溶媒を蒸発させ、油性残渣をCH2Cl2(25ml)に 再溶解させた。得られた溶液を水で(3×20ml)洗浄し、有機層をMgSO4 上で乾燥させ、蒸発させた。油性残渣をCH2Cl2(20ml)に再溶解させ、次 いでヘキサン(250 ml)で再沈殿させた。この沈殿を濾取し、減圧下ヘキサン を蒸発させて、自発的に結晶化する油性残渣を得た。この結晶をヘキサンで洗浄 しそして減圧下に乾燥させた。分析のために、得られた生成物をヘキサンから再 結晶させた(収量1.1 g,40%)。 方法B。 デカボラン(4)(0.02 mol,2.4 g)を乾燥トルエン(350 ml)中に溶解 させ、次いでプロピオニトリル(0.34 mol,18.7g)を加えた。得られた溶液を 還流下に15分間加熱し、次いで3(0.017 mol,4.5 g)を加えた。溶液を還流 下に5分間加熱し、次いで反応混合物を室温にて終夜放置した。方法Aに記述し たようにして 生成物5を単離した。収量1.6 g,36%,微細な白色鱗片状晶,融点68〜70℃。 元素分析:C519PO310として;理論値:C,22.55 ;H,7.19;実測値; C,22.74 ;H,7.21 ; 31P−NMR(CDCl4)δ 20.7; 1H−NMR (CDCl3)δ 0.8-3.4(b シグナル,10H,CCHB10H10),2.8(d,2H,JPH=20. 3 Hz,PCH2),3.7(d,6H,JPH=10.2 Hz,CH3OP),4.4(b s,1H,CH);13C− NMR(CDCl3)δ 33.2(d,JPC=144.2 Hz,PCH2),53.0(d,JPC=6.8 Hz, CH3OP),59.814及び67.3(s 及び s,CCHB10H10). O−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネート,トリエチルア ミン塩(6) 化合物5(0.66g,2.5 mmol)をジオキサン(5ml)に溶解させ、チオフェ ノール(10ml)及びトリエチルアミン(10ml)を加えた。室温にて2時間後 、反応混合物を蒸発させて油性の残渣をCH2Cl2に溶解させ、そしてヘキサン で粉砕し、次いで不溶性不純物を除去するために遠心した。ヘキサンを蒸発させ て、油性物として6を得、これは冷却により結晶化した。粗生成物6(これは痕 跡量のチオフェノールを含有していた)の収量は、0.7 g(70%)であった。粗 6は、8の合成に直接使用することができる。分析目的のためには、CH2Cl2 中の0〜50%CH3OHを溶離液として用いて、6をシリカゲルクロマトグラフ ィーによって精製した。31P−NMR(CDCl3)δ 14.8: 1H−NMR( CDCl3);δ 1.3(t,9H,JHH=7.4 Hz,CH3),1.0-3.1(b シグナル,10H,C CHB10H10),2.6(d,2H,JPH=18.4Hz,PCH2),3.0-3.1(m,6H,NCH2),3.6(d,6H,J P H =9.2 Hz,CH3OP),4.7(b s,1 H,CH);13C−NMR(CDCl3)δ 8.52(s,CH3CH2N),34.20(d,JPC=133. 0 Hz,PCH2),45.77(s,CH3CH2N),52.00(d,JPC=5.9 Hz,CH3OP),60.38及び7 0.00(s及びs,CCHB10H10). 5’−O−モノメトキシトリチルチミジン 3’−O−〔O−メチル(o−カ ルボラン−1−イル)メチルホスホネート〕(8) 化合物6(0.2 g,約0.6 mmol)及び塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニ ル(0.3 g,1.0 mmol)を乾燥THF(1.0 ml)中に溶解させ、次いで2,4 ,6−コリジン(0.13ml,1.0 mmol)を攪拌しつつ加えた。室温にて15分後、 乾燥THF(0.3 ml)に溶解させた5’−O−モノメトキシトリチルチミジン 7(0.15g,0.3 mmol)を加え、1−メチルイミダゾール(0.1 ml,2.0 mmol )を加えた。室温にて2時間の後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣をCH2 Cl2に溶解させた。得られた溶液を水(3×5ml)で洗浄した。有機画分M gSO4上で乾燥させそして蒸発乾固させた。粗生成物を、溶離液としてCH2C l2中のCH3OHの0〜2%の段階的勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグ ラフィーによって精製した。8を含有する画分を収集し、有機溶媒を蒸発乾固さ せた。残渣をCH2Cl2中に溶解させ、そしてヘキサンで沈殿させた。沈殿を真 空乾燥させ、8を2種のジアステレオ異性体の混合物として得た(0.1 g,44% )。TLC Rf 0.30及び0.37(94:6 CH2Cl2−CH3OH);UV(95 %C25OH)λ 265.7 nm,λmin,250.0nm,λ230.0 nm:31P(CD Cl3)δ 33.0:1H−NMR(CDCl3)δ1.2 〔s,3H,CH3(5)〕 ,0.9-3.1(bシグナル,10H,CCHB10H10),2.3-2.6(m 及びm,2H,H2’),2.7及 び2.8(d及びd,2 H,JPH=18.14 Hz,PCH2),3.4及び4.2(d及びd,2H,JHH=9.0,H5'),3.6 及び3. 7(d及びd,3H,JPH=9.0 Hz,CH3OP),3.5-3.6(m,1H,H4'),3.8(s,3H,CH3OPh ),4.3及び4.4(b s及びs,1H,CH),5.1(b m,1H,H3'),6.4(t,1H,JHH=4.5 H z,H1'),7.8-7.9及び7.2-7.4(m及びm,14H,arom),7.5及び7.6(s及びs,1H,H 6),8.5及び8.6(s及びs,1H,H3); 13C−NMR(CDCl3)δ 11.71[s,CH3 (5)],35.03(s,C2'),39.25(d,PCH2,JPC=34.6),53.26(d,CH3OP,JPC=5.1 Hz),55.17(s,CH3OPh),59.714(S,C5'),63.06(C3'),62.86及び66.56(s及び s,CCHB10H10),84.25及び84.59(s及びs,C1'),87.46及び87.53(s及びs,C4') ,113.29 及び113.32(s及びs,C5),127.40,128.03,128.18,128.23,130.214 ,136.77,1143.34,158.88(singlets,arom),134.32及び134.38(s及びs,C6) ,150.14及び150.77(s及びs,C2),163.28(s,C4). 5’−O−モノメトキシトリチルチミジン−3’−O−(o−カルボラン−1 −イル)メチルホスホネート、トリエチルアミン塩(9) 化合物8(40mg,0.05 mmol)をジオキサン(0.1 ml)中に溶解させ、そ してチオフェノール(0.2 ml)及びトリエチルアミン(0.2 ml)を加えた。 室温にて5分後、反応混合物をジエチルエーテルにより沈殿させ、そして不溶性 不純物を除去するために遠心した。生成物を含有するエーテル上澄を蒸発乾固さ せ、そして残渣をCH2Cl2に溶解させそしてヘキサンで2度沈殿させた。クロ マトグラフィー的に均質である9の収量は29mg(70%)であった。TLC R f 0.08(9:1 CH2Cl2−CH3OH), 0.514(9:1 CH3CN−H2O);UV(95% C25OH)λmax267.0 n m,λmin244.2 nm;31P−NMR(CDC3)δ 12.85 ; 1H−NMR(C DCl3)δ 1.3(t,9H,JHH=7.3 Hz,CH3),1.4[s,3H,CH3(5)],0.6-3.2(b シグナル,10H,CCHB10H10),2.5(d,2H,JPH=18.4 Hz,PCH2,2.9-3.1(m,6H, NCH2),3.3 及び3.5(d及びd,2H,JHH=9.0,H5'),3.8(s,3H,CH3OPh),4.1(b s,1H,H4'),4.8(b t,1H,H3'),4.9(b s,1H,CH),6.4(m,1H,1H'),6.9 及び7.1-7.4(d及びm,14H,arom.),7.6(s,1H,H6),9.3(s,1H,H3); 13C− NMR(CDCl3)δ 8.54 (s,CH3CH2N),11.70[s,CH3(5)],36.50(d,JPC =102.0 Hz,PCH2),40.05(s,C2'),45.66(s,CH3CH2N),55.23(s,CH3OPh), 60.34(s,C5'),76.24(C3'),70.05 及び75.65(s及びs,CCHB10H10),84.55(s, C1'),87.23(s,C4'),113.31(s,C5),127.10,127.31,127.83,128.00,128. 35,128.41,129.20,134.00,135.50,144.45,157.25(シングレット,芳香族) , 130.38(s,C6),151.05(s,C2),1614.05(s,C4). 5’−O−モノメトキシトリチルチミジン(3’,5’)3’−O−アセチル チミジン(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネート(11) 化合物9(16mg,0.02 mmol)及び塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニ ル(8mg,0.025 mmol)を乾燥CH3CN(0.2ml)中に溶解させ、そして2 ,4,6−コリジン(5μl、0.035 mmol)を攪拌しつつ加えた。室温にて15分 の後、混合物に乾燥CH3CN(0.05ml)中の3’−O−アセチルチミジン(1 0)(10mg,0.035 mmol)の溶液、続いて1−メチルイミダゾール( 2μl,0.025 mmol)を加えた。混合物を室温にて終夜放置し、次いでCH2C l2(1ml)を加えた。得られた溶液を水で(4×0.5 ml)洗浄し、そして 有機層を分離し、MgSO4上で乾燥させ、そして蒸発乾固させた。粗生成物を 、溶離液としてCH2Cl2中のCH3OHの0〜3%勾配を用いてシリカゲルカ ラムクロマトグラフィーにより精製した。11を含有する画分を収集し、有機層 を蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタンに溶解させそしてヘキサンから沈殿さ せた。得られた沈殿を真空乾燥し11を得た。収量6mg,30%。TLC Rf 0.56(9:1 CH2Cl2−CH3OH),UV(95% C25OH)λmax, 265.0 λmin245.0 nm,λsh 229.0nm;MS/LSI(FAB+)1016〔M+ 2Li〕;31P−MNR(CDCl3)δ 21.16及び22.95;1H−NMR(CD Cl3)δ 1.23〔d,3H,JHH6=3 Hz,CH3(5)],1.414[s,3H,CH3(5)],1.50- 1.72及び2.214-2.48(b m及びb m,2H 及び2H,H2'),0.6-3.2(bシグナル,10H ,CCHB10H10),1.88(d,J PH=8.5 Hz,2H,PCH2),2.07(s,3H,CH3CO),3.35- 3.58(m,2H,H5'),3.78(s,3H,CH3OPh),3.85-4.4(mm,4H,H5’及びH4'),5 .0(b s,1H,CH),5.10-5.25(b m,1H,H3'),6.0-6.4(b mm,3H,H3',H1'),6 .70-6.85及び7.10-7.50(14H,arom.). チミジン(3’,5’)チミジン(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホ ネート(12) 化合物11(4.5 mg,4.5 μmol)をCH3OH(0.15ml)中に溶解させ、濃 NH4OH(25%,NH3)を加え(0.15ml)、反応混合物を室温にて30分間維持 した(TLCモニタリング。溶媒系,9:1 CH2Cl2−CH3OH)。溶媒 を蒸発乾固させ て、5’−O−モノメトキシトリチルチミジン−(3’,5’)チミジン(o− カルボラン−1−イル)メチルホスホネートを白色固体として得た〔TLC R f 0.44(9:1 CH2Cl2−CH3OH)〕。粗5’−O−モノメトキシト リチルチミジン(3’,5’)チミジンカルボラン−1−イル)メチルホスホネ ート(≒4.5 μmol)を80%の酢酸(0.5 ml)中に溶解させ、60℃に加熱した 。約30分後(TLCモニタリング,9:1 CH2Cl2:CH3OH)酢酸をn −ブチルアルコールと同時蒸発させた。粗生成物をピリジン−CH2Cl2中に溶 解させ、ヘキサンによる沈殿の後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによっ て、溶離液としてCH2Cl2中のCH3OHの0〜10%の段階的勾配を用いて精 製した。化合物12(2種のジアステレオ異性体の混合物として単離された)を 、次いで水に溶解させ凍結乾燥した。収量は2.1 mg(70%)であった。TLC Rf 0.14(9:1 CH2Cl2−CH3OH),0.32及び0.38(85:15 CH2 Cl2−CH3OH);UV(95%C25OH)λmax、266.0nm,λmin235.0 nm,HPLC(40分間の、0.05M酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)中 の5〜50%CH3CNによる勾配、1.0 ml/分);12−速いRt=20.5分及 び21.5分、12−遅いRt=33.9分及び35.5分。質量スペクトル(FAB-)1 2−速 676.7〔M−B〕、質量スペクトル(FAB+)12−遅 725.6〔M+ K〕。 B.3’,5’−〔O−(o−カルボラン−1−イル)アルキル 〕ホスフェート、〔S−(o−カルボラン−1−イル)アルキ ルホスホロチオエート又は〔Se−(o−カルボラン−1− イル)アルキル〕ホスホロセレノエートヌクレオチド間結合 3’,5’−〔(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート,〔S −(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロチオエート又は〔Se−(カル ボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロセレノエートヌクレオチド間結合を担持 したオリゴヌクレオチドは、図3に図解されているように3’,5’−〔(o− カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホネートヌクレオチド間結合を含んだオ リゴヌクレオチドについて先に記述したように、5’−O−モノメトキシトリチ ルヌクレオシド 3’-〔O−(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェー ト、〔S−(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロチオエート又は〔Se −(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロセレノエートのような適当なモ ノマーを用いて慣用的に合成することができる。当業者に知られているように、 5’位を保護するために多くの他の基、例えばジメトキシトリチル等を使用する ことができる。語「(カルボラン−1−イル)アルキル」は、(o−カルボラン −1−イル)(低級アルキル)及び特に(o−カルボラン−1−イル)(低級直 鎖アルキル)をいう。 モノマーの製造は、〔O−メチル−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕 ホスホネートの合成について先に記述したのと同様に、適当に保護されたヌクレ オシドをO−メチル−〔O−(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート (31)、O−メチル−〔S−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホ ロチオエート(36)、及びO−メチル−〔Se−(o−カルボラン−1−イル )アルキル〕ホスホロセレノエート(41)のタイプの一連の新しいボロホスホ リル化剤と反応させ、続いて、完全に保護された中間体、それぞれ30,35及 び40を脱メチル化することによって行 うことができる。 ボロホスホリル化反応(個々のモノマーの合成)は、5’−O−モノメトキシ トリチルヌクレオシド 3’−O−メチル−〔O−(o−カルボラン−1−イル )アルキル〕ホスホネートについて記述した条件下に進行するが、しかし反応条 件(活性化剤、求核触媒、溶媒、温度及び反応時間)は使用される物質に照らし て調整される。 O−メチル−〔O−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート( 31)、O−メチル−〔S−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロ チオエート(36)、及びO−メチル−〔Se−(o−カルボラン−1−イル) アルキル〕ホスホロセレノエート(41)のタイプのボロホスホリル化剤は、次 のようにして製造される。 O−メチル−〔O−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート( 31) O,O−ジメチルホスフェート(25)を、適当な活性化剤の存在下、適当な 式(n−1)−アルキン−1−オール(26)(式中、n=線状の炭化水素鎖中 の炭素原子の数であり、分枝のあるアルキンもまた使用できる)のアルコールと 反応させてO,O−ジメチル−(O−アルキニル)ホスフェート(28)を得る 。中間体28への別のアプローチは、ピリジン又は他の適当な溶媒中における、 O,O−ジメチルクロロホスフェート(27)とアルコール(26)との反応に 基づく。両反応は、リン酸化の周知の方法〔Methoden der Organische Chemie, Organische Phosphor-Verbindungen(Houben-Weyl),Band XII/1 及び XII/2,G eorge Thieme Verlag,St uttgart,1964;また同様にBand E1 及び E2,1982〕に従って実施される。28 とデカボラン(29)との反応、及び、(31)へ至る中間体O,O−ジメチル −〔O−(カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスフェート(30)の選択的脱 メチル化(メチル基のうちの一個の除去)は、O−メチル−〔(o−カルボラン −1−イル)アルキル〕ホスホネートの合成について記述したのと同様に実施す ることができる。(30)への別のアプローチは、上述のようにO,O−ジメチ ルホスフェート(25)又はO,O−ジメチルクロロホスフェート(27)と( o−カルボラン−1−イル)アルキロール(32)との反応に基づくものである 。(o−カルボラン−1−イル)アルキロール(32)は、ヒドロキシの保護さ れたアルキノールとドデカボランとの反応及びこれに続くヒドロキシ官能基の脱 保護によって製造することができる。 O−メチル−〔S−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロチオエ ート(36) 標記化合物を製造するために数種のアプローチを用いることができる。最も単 純なものは、O,O−ジメチルホスホロチオエート(33)と適当な(n−1) −アルキン−1−ブロマイド(34)(n=炭化水素鎖中の原子数;直鎖の並び に分枝したアルキンを使用でき、並びにクロライド又はヨーダイド誘導体)との 間のアルキル化反応及びこれに続くドデカボランとの反応及びメチル基の選択的 除去である〔Methoden der Organische Chemie,Organische Phosphor-Verbindu ngen(Houben-Weyl),Band XII/1 及び XII/2,George Thieme Verlag,Stuttgart ,19614;また上記と同様にBand E1 及び E2,1982〕。 O−メチル−〔Se−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホロセレ ノエート(41) 標記化合物は、O,O−ジメチルホスホロセレノエート(38)を使用するこ とを除き、O−メチル−〔S−(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ホスホ ロチオエート(36)について記述したようにして製造することができる。別の 一方法は、O,O−Se−トリメチルホスホロセレノエート(39)の、適当な (n−1)アルキン−1−ブロマイド(34)との反応及びこれに続くドデカボ ラン(29)との反応、又は〔(o−カルボラン−1−イル)アルキル〕ブロマ イド(37)との直接の反応、そしてこれらに続くメチル基の選択的除去に基づ くものである。第2の方法は36の合成にも使用することができる。 C.3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル) ホスホネート〕結合を含んだオリゴヌクレオチドの製造 3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕結 合を含んだジヌクレオチドは、選択的な脱保護及び2−シアノエチル−N,N− ジイソプロピルクロロホスホラミダイトによるその3’末端の亜リン酸化の後、 1個又はより多くの変性(カルボラン−1−イル)メチルホスホネート結合を担 持した一層長いオリゴヌクレオチドを固体支持体上での自動的合成によって合成 するための構築ブロックとして使用することができる。例えば、Applied Biosys tems User Bulletin No.43 1987,Applied Biosystems,Foster City,CA.を参 照のこと。1個又はより多くの3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル −メチル)ホスホネート〕結合を含んだオリゴヌクレオチドはまた、当業者に既 知の溶液法を 用いても製造することができる。 天然のオリゴヌクレオチドは、酵素により小規模に日常的に製造されている。 変性オリゴヌクレオチドもまた、酵素を用いて製造することができる(Lesnikow ski,Z.J.,Bioorganic Chem,1993,21,127-155.を参照)。(カルボラニル− 1−メチル)ホスホネートオリゴヌクレオチドの酵素的合成は、メチルホスホネ ートオリゴヌクレオチド類縁体の酵素的合成(Lesnikowski,上記)の変法として 実施することができる。 D.カルボラニル含有塩基単位を含んだオリゴヌクレオチドの製造 本発明の背景において記述したように、塩基単ににカルボラニル部分を備えた ヌクレオシドは、先に報告されている。しかしながら、本出願は、選択された塩 基単位中にカルボラニル部分を備えた1個又はより多くのヌクレオシドを含んだ オリゴヌクレオチドについての最初の開示であると信じられる。驚くべきことに 、カルボラニル含有の塩基を当該ヌクレオシドの何れにでも含んだ有用なオリゴ ヌクレオチドが製造できる一方で、カルボラニル含有の塩基が3’又は5’末端 に、又はこれら3’又は5’末端ヌクレオシドに隣接したヌクレオシド中に、又 はこれらの組み合わせにおいて含むことが好ましいということが発見された。 オリゴヌクレオチドの自動化された製造のための方法が上に記述されている。 この開示を与えられれば、当業者は、多様な範囲の適用のための、カルボラニル 含有の塩基単位を備えた広範な種々のオリゴヌクレオチドを如何にして製造する かを知るであろうが、それらは本発明の範囲内に入ることが意図されている。1 個又はより多 くのカルボラニル含有の塩基を含んだオリゴヌクレオチドはまた、当業者に知ら れた溶液法を用いても製造することができる。 実施例3は、12個のチミン残基を含んだオリゴヌクレオチドの製造のための 詳細な記述を提供するか、ここに1個又はより多くのチミジン塩基が5位にカル ボラニル部分を含んでいる。実施例4は、実施例3において製造されたオリゴヌ クレオチドの詳細な物理的特徴を提供する。これらの実施例は単に説明用であり 、本発明の範囲を制限することを意図したものでない。 実施例3 5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−O−デオ キシウリジンを含んだドデカチミジレートの製造 5’−O−ジメトキシトリチルチミジン 3’−(N,N−ジイソプロピル− 2−シアノエチル)ホスホラミダイトをChem-Impex International(Wood Dale ,イリノイ州,ロット番号105198)より入手した。チミジンを付加した1μM CPG(ポアサイズ500 Å)カラムをApplied Biosystems(Foster City,カリフ ォルニアナ州より調達した。 5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−O−デオキシウリジン(CDU) (13,図4を参照) 5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−O−デオキシウリジン(CDU) (化合物13,図4)は、5−ヨード−2’−O−デオキシウリジンより、Yama moto,Y.,Seko,T.,Rong,F.G.,Nemoto,H.,Tetrahedron Lett.,1989,30 ,7191-71914によって詳細に記述されているようにして、5段階の手順で得た。 5−(o−カルボラン−1−イル)−5’−O−ジメトキシトリチル−2’− O−デオキシウリジン(14) 3を無水ピリジンと共に同時蒸発させた後、CDU(400 mg,1.08 mmol) をアルゴン雰囲気下に無水ピリジン(10ml)中に溶解させた。攪拌中の溶液に 、4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(457 mg,1.35 mmol,1.25当量 )を加えた。アルゴン下に室温にて6時間攪拌の後、反応を1mlのメタノール で停止させ、次いでCH2Cl2(30ml)で希釈した。混合物をNaHCO3の 飽和溶液(25ml)で次いで水(2×25ml)で洗浄した。有機層をとり、Na SO4上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧乾燥し、そしてトルエンと共に蒸発さ せた。残った泡状物をCH2Cl2に溶解させ、シリカゲルカラムに適用した。溶 離液としてCH2Cl2中のCH3OHの0%から5%までの勾配を用いた。目的 の生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を減圧下に蒸発させ、次いで残渣をn− ヘキサン中で沈殿させて5’−O−ジメトキシトリチル−CDUを白色粉末とし て得た(497 mg,68%収率)。1H NMR(CDCl3)δ7.81(s,1H,NH); 7.51-7.319(m,10H 及び9H- arom.); 6.96(m,4H,OCH3のαにあるH); 6.23(t ,1H,H-1'); 5.78(bs,1H,H-カルボラニル); 4.50(m,1H,H-3'); 4.21(m,1H ,H-4'); 3.90(s,6H,2xOCH3 ); 3.60(m,1H,H-5'')); 3.35(dd,1H,H-5“(H -5'); 3.12(d,1H exch,OH-3'); 3.2-1.2(bm,10H,B10H10のH); 2.61(m,1H, H-2'(H-2“)); 2.15(m,1H,H-2''(H-2'). 5−(o−カルボラン−1−イル)−5’−O−ジメトキシトリチル−2’− O−デオキシウリジン−3’−〔N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホ スホラミダイト〕(15,図4を参照) 化合物14(200 mg,0.297 mmol)を、新たに蒸留した無水CH2Cl2(1. 2 ml)中に溶解させた。アルゴン雰囲気下に5分間攪拌した後、ジイソプロピ ルエチルアミン(DIEA,207 μl,1.19 mmol ,4当量)をアルゴン下に滴 下し、続いて亜リン酸化剤である2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルアミ ノクロロホスフィン(100 μl,0.445 mmol,1.5 当量)を加えた。反応を、n −ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン(50:49:1)をもちいてTLCに よってモニターした。アルゴン下に室温にて1時間攪拌した後、過剰の亜リン酸 化剤を加え(20μl,0.089 mmol)そして反応を30分間続けた。混合物を次いで 、新しくAl23を通過させた酢酸エチル(10ml)で希釈し、そして食塩溶液 (6ml)中に注いだ。有機層を食塩水で更に2回洗浄(2×6ml)した後、 Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして真空下に蒸発乾固させた。後に残った 油状物をついで高真空下に乾燥させて過剰のジイソプロピルエチルアミンを除去 し、白色の泡状物を得た。粗生成物の精製は、溶離液としてn−ヘキサン−酢酸 エチル−トリエチルアミンを比率90:9:1乃至20:79:1で用いてシリカゲル カラムクロマトグラフィーによって行った。3’−ホスホラミダイトCDUをジ アステレオ異性体混合物として含有する適当な画分を合わせ、真空下に蒸発させ た。目的の化合物15を、次いで、−20℃に冷却したn−ヘキサン中において沈 殿させ、ペレットを高真空下に20時間更に乾燥させた(217.7 mg,84%収率) 。31P−NMR(CDCl3)δ 149.90及び149.61 ppm.1H−NMR(CDC l3)δ 7.99(s,1H,NH); 7.74-7.17(m,10H,H-6及びH-arom.); 6.81(m,4H; OCH3のαにあるH); 6.11(m,1H,H-1'); 5.65 (bs,1H,H-カルボラニル); 4.48(m,1H,H-3'); 4.22(m,1H,H-4'); 4.13(m, 1H,H-5'(H-5“); 3.77(2s,6H,2 OCH3); 3.74-3.19(m,5H,H-5',H-2'及びH- 2“,NCH 2(CH3)の2個のH); 2.72(t,1H,POCH 2CH2CNのH); 2.58(t,2H,POCH2 C H 2 CN のH); 2.42(t,1H,POCH 2CH2CNのH); 3.2-1(bm,10H,B10H10のH); 1.2(se v d,12H,NCH(CH 3)2のH). CDU含有ドデカチミジレート(19〜24)及び未変性d(T)12(18) 、及びd(A)12(19)の自動的合成 1個又は2個の5−(o−カルボラン−1−イル)ウラシル残基を、12マー 18(表1を参照)の第1の(化合物19)、第2の(化合物20)、第7の( 化合物21)、第11の(化合物22)、及び第10及び第11の(化合物23 )、並びに第1及び第11両方の(化合物24)位置に担持したドデカチミジル 酸類縁体が、標準的β−シアノエチルサイクル(例えば、Applied Biosystems U SER Bulletin No.43,1987,Applied Biosystems,Foster City,カリフォルニ ア州、を参照のこと。図6に図解)を用いて固相自動合成によって得られた。5 ’−O−ジメトキシトリチルチミジン(1μM)で官能化された制御された多孔 質ガラスを充填したカラムを利用した。全ての5’−ジメトキシトリチル3’ホ スホラミダイト誘導体を、無水CH3CN中の0.09M溶液として調製した。オリ ゴヌクレオチドの延長は、濃縮時間を変更することなく標準的なβ−シアノエチ ル 1μM DNA合成サイクルを用いて実施された。5’−ジメトキシトリチ ル基の自動的除去の後、濃アンモニア中における室温での1時間のインキュベー ションによりオリゴヌクレオチドを支持体から切り離した。脱保護されたオリゴ ヌクレオチド は、HPLCにより精製されそして、選ばれた場合については、ニド−〔ニド− 7,8−C29(11 または12)〕及びクロソ形〔クロソ−1,2−C21012 〕へと分離された(図6及び表1を参照)。Kane,R.R.,Pak,R.H.,Hawthorne ,M.F.,J.Org.Chem.,1993,58,991-992. トリチルの遊離によれば、CDU−含有オリゴヌクレオチド(化合物19−2 4)の合成全体についての収率は、未変性の(dT)12(化合物18)と同程度 であった。従って、ウラシルの5位における嵩だかいカルボラニル置換基の存在 は、カップリング反応に影響を及ぼさないように思われる。 実施例4 5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−O−デオキ シウリジン含有ドデカチミジレートの特徴付け 実験手順 Crotalus durissus terrificus蛇毒(lot 119f0730)からのホスホジエスレラ ーゼI(EC 3.1.4.1)タイプVIII をSigma(St.Louis,ミズリー州)から入手 した。ポリアクリルアミドは、International Biotechnologies Inc.(New Hav en,コネチカット州)より調 達した。ビスポリアクリルアミド及び尿素は、Fischer Scientific(Fair Lawn, ニュージャージー州)より購入した。オリゴマーについての熱融解曲線は、Dell マイクロコンピューターにインターフェースしたVarian Cary 4 分光光度計によ って測定した。LSIMS質量スペクトルは、Finnigan MAT 95 により13keV で作動するCs+ガンで(グリセリンマトリックス)又はVS 70−Sスペク トロメーターで記録した。円二色性スペクトルは、IBMコンピューターにイン タフェースしたJasco,J-600分光偏光計によって記録した。ポリアクリルアミド ゲル電気泳動は、BRL装置(Gaithershburg,メリーランド州)を用いて行った 。 カルボラニル変性ドデカチミジレート(19〜24)のHPLC分析は、What man Partisphere C18 5μm,4.7 ×235 mmカラムを取り付けたHewlett-Pack ard 1050システムによって行った。全ての分析は室温にて行った。典型的には、 溶離液として0.05M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(TEAA)(pH7.0 )中のCH3CNの0%から50%までの勾配が、流速1.0 ml/分で用いられた 。個々のオリゴヌクレオチドについて用いられた保持時間(Rt)の値及び条件 は、表1に示されている。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE) 変性オリゴヌクレオチド(19〜24)の標識された又は標識されていないサ ンプル及び、上記に従って製造したドデカ(チミジンホスフェート)(18)を 、7M尿素を含んだ20%ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて、45分間50mAに て電気泳動により分離した。サンプルを、標準のオートラジオグラフィーを用い てX-Omat ARフィルム(Eastman Kodak,Rochester,ニューヨーク州)上に又は 、無標識のオリゴヌクレオチドの場合には紫外線シャドーイングによって視覚化 した。 CDU含有ドデカ(チミジンホスホネート)(19〜24) 変性されたオリゴヌクレオチド19〜24及び無変性のドデカ(チミジンホス フェート)(18)(各20 pmole)を、0.5 μlのT4ポリヌクレオチドキナー ゼ及び10μCi〔32P−γ〕ATP(5000Ci/mmol)の存在下、10mMのMg Cl2及び5mMのジチオスレイトールを含んだ70mMトリス塩酸緩衝液(pH7 .6)中、37℃にてインキュベートした。反応混合物の最終液量は10μlであった 。30分後、酵素を熱不活性化させるため反応混合物を92℃にて2分間インキュベ ートした。その後、10X 追跡染料(水(5μl)中の0.5 %ブロモフェノールブ ルー,0.5 %キシレンシアノールFF,30%グリセロールを反応混合物に加えそ して5μlの部分量PAGEにより分析した。 融解温度(Tm)測定 Tm 測定のためのサンプルは、濃縮されたd(T)12(18)又はCDU変性 d(T)12(19〜24)及びd(A)12原液を、1.0 mlの100 mMのNaC l及び1mMのEDTAを含有する10mMの1,4−ピペラジン−ビス(エタン スルホン酸)(PIPES)緩衝液(pH7.0)に、1:1の比になる量で加え ることによって調製した。各鎖は、40μMで存在した。分子吸光係数ε260(塩 基当たり)は、次の通りに算出された:18:8,150 ;d(A)12:12,280;1 9〜24:8,200 。サンプルを85℃まで加熱し、そして徐々に融解前の室温まで 冷却した。紫外線分光光度計の隔離された細胞コンパートメントを、毎分0.5 ℃ の速度で0℃から85℃まで 連続的に加温した。サンプルは、テフロンの蓋を嵌めてある水晶のキュベット( 光路長1cm)中において加熱された。260 nmにおける吸光度の変化を、温度 の関数として追跡し、そして、視覚化及び解析のため、データがMacintosh コン ピューターに移転された後、Tm 値を第1導関数プロットより得た。 円二色性(CD)測定 CDスペクトルは、10℃にて、凝縮を防止するために窒素ガスを流したジャケ ット付きのセル中において得られた。サンプルは、0.5 mMのEDTA及び100 mMのNaClを含有する2.7 mlの3.75mMリン酸緩衝液(pH7.0)へのオ リゴマー19〜24の濃縮された原液の添加によって調製した。天然の又は変性 されたd(T)1219〜24を含んだキュベットに、d(A)12溶液を1:1の 比を与えるのに適当な量で加えた。二本鎖の形成のためには、サンプルは85℃に 加熱され、そして室温まで徐々に冷却された。CDスペクトルは、一本鎖及び二 本鎖について320乃至200 nmにおいて得られた。 分子モデル化 カルボランのかごが配列の種々の部位において変性されたDNAの安定性に及 ぼす相対的影響を評価するために、AMBER全原子力場及び方程式による分子 機構法を使用した。カルボランは、固定した構造的凝集体として処理した。局部 的DNA情報に対するカルボラニル含有塩基単位の効果が評価された。 ホスホジエステラーゼI(EC 3.1.4.1)に対するドデカ(チミジンホスフェー ト)含有CDU(19〜24)の抵抗性: 20mMのMgCl2を含有する100 mMのトリス塩酸緩衝液(p H8.9)(90μl)に、0.1 A260 ODUのオリゴヌクレオチド19〜24(5 μl)、1.5 ×10-3単位(5μl)のホスホジエステラーゼを加えた。酵素不含 のブランク及び、d(T)12との対照反応を同時にアッセイした。反応を37℃に て10分間維持し、次いで50μlの部分量をHPLCによって上記の条件下に分析 した。 結果: カルボラニル変性オリゴヌクレオチド合成における一つの困難は、中性のクロ ソ−形のホウ素かごの、1価の負の電荷を担持したニド形かごへの比較的容易な 変形であり、それはある場合には、純粋なクロソ化合物を合成することを困難に している。比色アッセイ(ニド−及びクロソ−カルボラニル化合物の検出のため のTLC噴霧:1%HClの0.5 l中30mgのPdCl2)及びHPLC分析を 用いて、用いたCDUサンプルが5%までのニド化合物によって汚染されていた ということが決定された。ニド異性体の形成は、塩基性条件下におけるCDUの ベンゾイル化されたヒドロキシ基の脱保護の間に起こり得る。ニド形のホウ素ク ラスターを担持する、CDU変性されたオリゴヌクレオチドは、逆相HPLCカ ラム上への一層短い保持時間によって特徴付けられる(表1)。これはこれら2 つの成分の容易な分離を許容する。分離されたニド及びクロソ−CDUオリゴヌ クレオチドの融解温度測定は、両方の形のCDU変性についてのTm において、 何ら有意な差を示さなかった(表1)。 5’−末端〔32P〕標識オリゴヌクレオチド18〜24は、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動(PAGE)により分析したところでは均質であり、同一の電気 泳動性を示した。クロソ−カルボラン誘 導体は、ピロリジン処理により容易に純粋なニド形に変換することができる。Ka ne,R.R.,Lee,C.S.,Drechsel,K.,Hawthorne,M.F.,J.Org.Chem.,1933 ,58,3227-3228. この方法が、CDU及びCDU(dT)11を純粋なニド構 造に変形させるために用いられた。 CDU変性ドデカチミジル酸及びd(A)12の間に形成された二本鎖の融解温 度は、オリゴヌクレオチド鎖中のCDUの位置に強く依存しそしてカルボラニル 残基のクロソ/ニド状態には影響を受けない(図7及び表1)。従って、1位( 19)、7位(21)及び11位(22)においてCDUによって変性されたC DUオリゴヌクレオチドが、クロソ及びニド誘導体へとHPLCによって分離さ れ、そしてそれらの融解温度が独立に測定された。クロソ及びニド形についての Tm は、同一タイプのオリゴヌクレオチド変性(3’−,5’−末端又は中間位 置)内においては、殆ど同一であることが発見された。しかしながら、CDUの 位置の影響は顕著であった。5’−変性、並びに1位(19)及び2位(20) は、無変性の(dT)12に比して二本鎖の安定性に目立った影響を及ぼさなかっ た。すなわちそれぞれのTm は、28.0,27.2及び29.0°であった。対照的に、オ リゴヌクレオチド鎖の中央部位(7位、21)の変性は、最も低いTm 値である 15.2℃によって認識されるように、二本鎖の安定性を顕著に低下させた。11位 におけるCDUの存在による効果はより目立たないものであった。3’末端変性 オリゴヌクレオチド10によって形成された二本鎖のTm は20.5℃まで低下した 。第2のCDUヌクレオシドを3’末端に挿入すること(23)は、二本鎖の更 なる不安定化及び15.3℃までのTm 値の低下を引き起 こした。二本鎖の安定性に対する3’及び5’末端変性の多様な結果は、上記デ ータから明らかである。3’末端におけるCDUヌクレオシドの挿入は、5’末 端における挿入に比して一層好ましくない効果を有するように思われる。このこ とは、CDUヌクレオチドがそれぞれ5’末端及び3’末端から第2の位置にあ る、オリゴヌクレオチド20及び22のTm 値を比較することによってよく説明 される。Tm における差は7〜8℃でありこれは有意であり、そして隣接する塩 基とのカルボラニルクラスターの相互作用の重要性を明らかにした。 これらの結果は、CDU変性オリゴマーとポリ(rA)との間に形成された二 本鎖のTm 測定値と一致した。オリゴヌクレオチド鎖中におけるCDUヌクレオ シドの位置は、より大きい不安定化効果を誘導し、それは変性が3’末端により 近いときに一層顕著であった。 類似の条件下に記録された一本鎖(dT)12(18)及びCDU変性(dT)12 (19〜24)の円二色性(CD)スペクトルは、それらの形及び分子楕円率 の値において殆ど同一であった(図8を参照)。このことは、カルボラニルオリ ゴマーについて、(dT)12(18)標準と較べて、溶液中での同一のコンフォ メーションを示唆している。CDU変性されたオリゴチミジレート(20〜24 )と無変性の(dT)12(18)及び(dA)12との間に形成された二本鎖のC Dスペクトルは、246 nmにおける分子楕円率の大きさの減少を示し、それは二 本鎖の熱的安定性の増大と相関した(図9)。 ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性は、生体内適 用のための重要な要素である。3’−エクソヌクレアーゼ活性が、血清中におけ る無変性アンチセンスオリゴヌクレオチド分解の殆どを担っていることが知られ ている。Vlassov,V.V.,Yakubov,L.A.,Prospects for Antisense Nucleic Ac id Therapy of Cancers and AIDS,1991,243-266,Wiley-Liss,Inc.,New Yor k; Nucleic Acids Res.,1993,21,145. オリゴヌクレオチド鎖中の全ての天然のホスホジエステル結合のメチルホスホ ネート結合による置換は、エクソ−及びエンドヌクレアーゼに対するオリゴヌク レオチドの完全な安定性を保証する変性の一例である。3’−エクソ核酸溶解活 性(3’末端からのオリゴヌクレオチドの加水分解)に対するCDUオリゴヌク レオチドの抵抗性を試験するために、Crotalus durissus terrificusからの蛇毒 ホスホジエステラーゼ(SVPD)を使用した。もしもCDU残基が3’末端に 又3’及び5’末端の両方に導入されているならば、3’−エクソヌクレアーゼ に対してこれらのオリゴヌクレオチドが顕著に安定であることが見出された。3 ’及び5’変性を担持したオリゴヌクレオチド(24)はまた、SVPD及び子 牛脾臓ホスホジエステラーゼに対しても抵抗性であった。 カルボラニル含有塩基を有する変性オリゴヌクレオチドはまた、ヒト免疫不全 症逆転写酵素を含む種々のポリメラーゼのためのプライマーとしても働きうる。 種々の位置において変性された二本鎖DNAの安定性に対するカルボランかご の相対的効果を評価するために、分子機構法を適用した。この目的のためには、 AMBER全原子力場法(Singh,U.C., Weiner,P.K.,Caldwell,J.,Lollman,P.A.AMBER 3.0,University of Cali fornia: San Francisco,カリフォルニア州,1986).を参照。カルボラン置換基 と隣接塩基との間には有意な不利的相互作用があり、その相互作用は、DNAの 右手方向捩れのために配向において非対称であった(図10を参照)。このこと は、5’及び3’−CDU変性(dT)12(19〜24)の間における二本鎖の 熱的安定性について観察された顕著な差と一致する。例えば、オリゴヌクレオチ ド5’−CDUd(T)11(19.1)は、5’d(T)6CDUd(T)5(2 1.1)についての15.2℃というTm に比して、28.0℃というTm によって特徴 付けられる(表1)。(dT)12(dA)12についてのエネルギー最小化結果は 、(dT)12鎖の5’末端の置換が、(dT)12の3’側の置換された二本鎖に 比して、有意に低い全体の螺旋のエネルギーを与えることを示した。二本鎖の内 部塩基の置換は、なお一層大きな螺旋の不安定化を引き起こす。 5’置換二本鎖については、カルボランの塩基との相互作用は殆どなくそして 螺旋の全体的幾何学形状は無置換の二本鎖と同様である。二本鎖の3’末端にお いては、末端効果及び二本鎖の末端における塩基対の運動の自由のために、立体 的衝突から来る緊張の幾らかを解放するために塩基は歪みうる。螺旋の中央にあ るCDU置換された塩基は、同様な立体的衝突を有するが、それらは螺旋の3’ 末端にある塩基対の柔軟性を有しない。 実施例5 SVPDの3’−エクソヌクレア−ゼに対するCDUオ リゴヌクレオチド安定性の動力学的研究 3’−CDU−,3’,5’−CDU−及び3’CDU2−オリ ステラーゼ)によるそれらの分解の動力学的研究によって決定された。酵素反応 の部分(0,5,10,20,40,80,及び240 分)をHPLCにより分析した。半 減期の計算は、12マー(又は、CDU変性オリゴの場合には11マー)の消失に基 づいて、内部標準として使用した2’−デオキシシチジンと標準化した後に行っ た。結果は表2に与えられている。 III.変性オリゴヌクレオチドの他の性質の決定 ここに記述された化合物の水中及び血清中安定性、細胞取込み、細胞洗い出し 、及び分配係数の評価のための方法が以下に与えられる。好ましい(しかし必要 ではない)一具体例においては、生体内目的で選択された化合物は、以下に記述 された条件下において少なくとも1時間の水中安定性、少なくとも1時間の血清 中安定性、少なくとも投与量の1%の細胞取込み、少なくとも1時間の細胞洗い 出し、及び適当な脂質親和性を示す分配係数を呈する。 オリゴヌクレオチド安定性試験 (a)緩衝液中:100 μfの適当な0.2 Mリン酸緩衝液(KHPO4/KOH /H3PO4)中に10ODUのオリゴヌクレオチドを溶解させることによって、5 種のサンプル(pH3〜7)を調製し、そして4℃、22℃及び37℃に維持した。 指定された時間間隔で、各溶液の10μlの部分量をHPLCで分析した。混合物 成分の濃度は、オリゴヌクレオチド及び仮定された分解生成物についての曲線下 の全面積に対するパーセントとして計算した。 (b)ヒト、マウス、及びラット血清中におけるオリゴヌクレオチドの安定性 。 オリゴマーの安定性は、ヌクレオチドを37℃にて所望の時間インキュベートし 、タンパク質を冷60%MeOH/H2Oにて沈殿させそして上澄を凍結乾燥した 後、サンプルを緩衝液中に再懸濁させ、部分液をHPLCによって分析すること によって決定した。オリゴヌクレオチドの安定性を決定するために逆相Merck RP -18,5 mm×25cmカラムを使用した。移動相は、酢酸トリエチルアンモニウム 中のアセトニトリル(又は類似の系)である。等積の1ml/分の 流れが使用され、そしてピークは260 nmに設定されたUV検出器を用いてモニ ターされた。 細胞取込み試験 薬物の細胞内プロフィールを追跡するために、無標識の又は放射性標識したオ リゴヌクレオチドを用いて3重の試験を行った。例えば、ヒト神経膠腫細胞U25 1(2×106個)が、10%の胎仔牛血清アルブミン及び抗生物質を含有する培地中 に懸濁され、そして37℃にて5%CO2中でインキュベートされた。実験は、2 〜10μM〔3H〕−オリゴマー(特異的活性は、約1,000 −2,000 DPM/pmole )の添加によって開始し、そして細胞を1,2,4,6,12,及び24時間薬物に 曝す。培地を除去しそして細胞を冷Hank's平衡塩類溶液で3回洗浄する。抽出は 1mlの60%冷メタノール/水の添加及びこれに続く−70℃における終夜貯蔵に よって行う。懸濁液を次いで遠心し、そして上澄を凍結乾燥する。残渣を250μ lの水に再懸濁させ、そして50〜100 μlを含有す部分量をHPLCにより分析 する。細胞内オリゴマーの定量は、我々の研究室において開発したHPLC法に よって行われる。必要なら、生理学的pHに近い緩衝系が使用される。 細胞洗い出し試験 パルス後の種々の時間において薬物の除去後に細胞内に検出されるオリゴマー の細胞内プロフィールを追跡するために、無標識の又は放射線標識した薬剤を用 いて試験を行った。細胞(2×106個)を血清を補充した適当な培地中に懸濁さ せ、そして37℃にて5%CO2のインキュベーター中でインキュベートした。利 用した放射性標識した薬物の濃度は2及び10μMである。細胞をこの標識した化 合物で所望の時間パルスした後、細胞を徹底的に洗浄しそして薬物を含有しない 新鮮な培地を補給する(0時間)。0,2,4,6,24,及び48時間(第2のイ ンキュベーション時間)において、細胞を除去し直ちに60%冷エタノール/水で 抽出する。抽出液は、遠心及び細胞ペレットを除去することによって得られる。 抽出液を凍結乾燥し、そして−70℃にて貯蔵する。この材料は200 μlのHPL C緩衝液中に再懸濁され、そして直ちに分析される。細胞内オリゴマーの定量は 上記の通りに行われる。 分配係数決定 オリゴヌクレオチド(1mg/ml)を水に溶解させ、次いで1mlのオクタ ノールを加える。2時間震盪させることによって化合物をこの2種の溶媒の間で 分配させる。薬物の濃度はHPLCにより異なった相中に定量される。 IV.カルボラニル含有ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの使用の方法 A.ホウ素中性子捕獲療法における使用 ここに記述したカルボラニル含有のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドは、 ホウ素中性子捕獲療法ににおいて種々の疾患を、特に、癌、例えば脳神経膠腫、 黒色種、及び乳癌等を治療するために使用できる。BNCT法は、当業者に周知 であり、例えば、Hatanaka et alZ .Neurol.,vol.204,pp.309-332(1973); Tolpin et al.,Oncology, vol.32,pp.223-246(1975);米国特許第5,130,302 ; 5,066,479; 5,021,572; 4,959,356及び4,855,1493;並びにBarth et al, Cance r Res. ,Vol.50,pp.1061-1070(1990).に詳細に記述されている。一例として 、その必要のある患者が、開示された 本化合物の1種又はより多くものの有効量で処置され、次いで中性子、好ましく は熱外中性子に曝されるが、5×1012n/cm2(合計線量)を超えてはならな い。カルボラニル含有ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド又はこれらの組み合 わせの、この目的に好ましい投与量は、一回投与量0.01乃至100 mg/kg体重 であり、そして好ましくは静脈内に投与される一回投与量0.1 乃至20mg/kg 体重である。化合物を神経膠腫細胞等のような特定の細胞内に蓄積させるために 、投与量をパルスすることは有利でありうる。本化合物は如何なる適切な時に投 与してもよく、そして典型的には中性子照射の30分乃至1時間前に投与される。 B.抗ウイルス活性 ここに開示された多くのカルボラニル含有化合物が、抗HIV又は抗HBV活 性を含む抗ウイルス活性を示す。本化合物は、種々の方法、例えば、Biochem Ph arma,Inc.によって出願された欧州特許出願92304551.2及び92304552.0; Emory Universityによって出願されたPCT 公開 WO 92/14729及びWO 92/14743、及びSch inazi,et al.,Antimicrobial Agents Chemother.,34,p.1061(1990)に開 示されているもののような方法を用いて、抗HIV活性につき容易に評価するこ とができる。 HBVを阻害するホウ素クラスターヌクレオシドの能力はまた、実験的技術を 用いて測定することができる。HBVの複製を阻害する開示された本化合物の能 力を評価するのに使用される通常のアッセイは、Korba and Gerin, Antiviral R es 19: 55-70(1992)に詳細に記述されている。 C.ホウ素クラスターオリゴヌクレオチドの位置指定突然変異導入 法を行う能力 位置指定突然変異導入法(SDM)は、タンパク質をコードする核酸配列中に 突然変異をおこさせる既知の技術である。一般に合成オリゴヌクレオチドが、標 準の条件下に生体内又はin vitroで最初に標的核酸配列にハイブリダイズされる (Baumgart,P.M.,Kliem, H-C.,Gottfried-Akacker,J.,Wiessler,M.Schmei ser,H.H.,1993,Nucl.Acids Res.,21,3755-3760)。核酸配列の転写又は翻 訳に際して、それぞれ偽の核酸又はアミノ酸配列が産生される。ここに開示した 合成のホウ素クラスター含有オリゴヌクレオチドは、生体内又はin vitroで位置 指定突然変異導入を行うことができることが発見された。カルボラニル含有オリ ゴヌクレオチドを細胞内に挿入することによって、特に、ウイルスの、真核細胞 の、又は原核細胞のゲノムを突然変異させることができ、細胞内ではオリゴヌク レオチドが核酸配列に、転写又は細胞分裂に際して突然変異を引き起こす仕方で ハイブリダイズする。突然変異させることのできるウイルス核酸の例としては、 HIV及びHBVを含む肝炎ウイルスがある。 一例として、変異原性オリゴヌクレオチド及びDNA修復機構を欠いた突然変 異E.coli株(またはネステッド(nested)PCRを、発現したHIV−1 逆転写酵素の突然変異を起こさせるのに用いることができる。突然変異修復- D NAポリメラーゼ及び逆転写酵素は同じように機能するから、完全なウイルスゲ ノムの発現を次に行わせるために、生体内でHIV−1のRNA逆転写に際して 、位置指定突然変異導入を実施することが可能である。ウイルス複製サイクルの 更なる段階における突然変異した逆転写酵素遺伝子の 発現は、機能しない酵素の産生をもたらし、それが今度はウイルスの複製を阻害 することができる。HIVの他の標的領域における突然変異もまた、所望により 、適当な配列を用いておこさせることができる。 実施例6は、E.coli細胞中の適当なベクター内に導入された、YMDD モチーフ(motif)内の逆転写酵素の生体内突然変異を記述している。この変異原 性オリゴヌクレオチドDNA標的領域は、HIV−1逆転写酵素の保存されたY MDDモチーフ(ヌクレオチド5’2678乃至3’2689)である。使用した変異原 性オリゴヌクレオチドは、5’−AATACATGGA(CDU)GATTTG TAT−3’及び5’−AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTG TAT−3’であった。オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホラミダ イト化学及び自動化されたDNA合成装置を用いて合成した。各々1個又は2個 の変性ヌクレオシド〔(5−(o−カルボラン−1−イル)−2’−デオキシウ リジン(CDU)〕を含んでいる。 実施例6 HIV−1逆転写酵素の位置指定突然変異導入 HIVクローニング 分子感染性クローン、pBRU、の制限マップを、システム7DNASTAR プログ ラム(DNASTAR Inc.,Madison,ウィスコンシンナ州)を用いて産生した。逆転写 酵素(RT)遺伝子のクローニングに用いた制限酵素は、RTの活性部位を含有 するように且つ突然変異株のクローニングのための特有の制限部位がpBRU内 へ戻るのを保証するように選択された。望みのフラグメントをファージミドpA LTER−1内に配置するために、制限酵素Sac 1(塩基228) 及びSal 1(塩基5367)を使用した。このプラスミドは、Altered Sites i n vitro Mutagenesis System(Promega Corp.,Madison,ウィスコンシン州,53 711-5399)と共に供給された。pALTER−1のRT挿入について陽性のクロ ーンが、T7プライマー部位(5’−AACAGCTATGACCATG−3’ )(GIBCO BRL.,Gaithersburg,メリーランド州)からの配列決定により選択さ れた。配列決定は、Sequenase version 2.0キット(United States Biochemical Corp.,Cleveland,オハイオ州)を用いて行った。構造は、記述されているよ うに、CaCl2形質転換の方法を用いてJM109(endA1,recA1,g yrA96,thi,hsdR17(kr-,mk +),relA1,supE44,λ- ,Δ(lac−proAB),〔F’,traD36,proA++,lacIq ZΔM15〕へと変形された(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,1989 ,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,(Nolan,C.,Ed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。 一本鎖DNAの調製 JM109(pHIVALT−1)構造の終夜培養物を15μg/mlのテトラサ イクリン(tet)を含有する2mlのTYPブロス(16gBactone-トリプシン −16gBacto−イースト抽出物−5 gNaCl/l)中において、200 rpmで3 7℃にて震盪させなから増殖させた。翌朝、15μg/mlのtet及び2.5 g/ lのK2HPO4を含有するTYPブロスの5mlに、終夜培養物の100 μlを接 種した。50mlフラスコ中において培養物を37℃にて30分間激しく震盪した。培 養物を、次いで、R408及びM13K07(ヘルパーファージ)に、感染多重度(m .o.i)10で感染させた。次いで培 養物を37℃にて200 rpmで終夜震盪した。翌朝、12,000rpmにて15分間遠心 することにより培養物を収穫し、そして上澄を新たな試験管へ除去した。次いで 、如何なる残存の細胞や残滓をも除去するために、この上澄を、12,000rpmに て15分間遠心した。次いで、0.25体積のポリエチレングリコール(PEG)溶液 (3.75M酢酸アンモニウム−20%ポリエチレングリコール;MW8,000)を加え ることによってファージを沈殿させた。次いでサンプルを氷上に30分間置き、続 いて12,000×gにて15分間遠心した。試験管をペーパータオル上に2〜3分間逆 さにすることにより、ペレットを徹底的に水切りした。ファージを含んだこのペ レットを、次いで、400μlのTE緩衝液〔10mMトリス塩酸(pH8.0,1mM のEDTA)〕を用いて再懸濁させた。粒子を溶解させ且つ如何なる過剰のPE G溶液をも除去するために、再懸濁させたファージに等しい体積のクロロホルム :イソアミルアルコール(24:1)を直接に加えた。混合物を数回逆さにし、そ して12,000×gにて5分間遠心した。上側の水相を新たな試験管へ除去し、そし て等しい量のTE飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(24: 24:1)を加えた。次いで溶液を数回逆さにし、そして12,000×gにて5分間遠 心した。目視し得る界面が検出できなくなるまでこのステップを繰り返した。最 終のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール抽出から、水相を新たな 清浄なエッペンドルフ試験管へ除去した。最後に、0.5体積の7.5M酢酸アンモニ ウム及び2体積の氷冷95%エタノールをこの溶液に加えた。溶液を−70℃に静置 した。1時間後、サンプルを14,000×gにて30分間遠心し、70%エタノールにて 2回、各14,000×g、15分にて洗浄した。次いで、サンプルを 、室温にて急速真空で10分間乾燥させた。次いでサンプルを、20μlのdH2中 に再懸濁させ、スポットを、45Vにて約1.5 時間作動させたエチジウム染色0.8 %アガロースゲル上でチェックした。 オリゴヌクレオチド調製 5’−AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT−3’及び5’−A ATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT−3’の自動化され た合成 変性されたオリゴヌクレオチドを、Applied Bisystems 391 DNA合成装置を用 いて合成した。5’−O−ジメトキシトリチルチミジン(1mM)で官能化した 制御された多孔質ガラスを充填したカラムを、固体支持体として利用した。5’ −ジメトキシトリチル3’−ホスホラミダイト誘導体は全て、無水CH3CN中 の0.09M溶液として調製した。オリゴヌクレオチドの延長は、凝縮時間を何ら変 更することなく標準のβ−シアノエチル1mM DNA合成サイクル(Applied Biosystems USER Bulletin No.43,1987,Applied Biosysytems,Foster City, カリフォルニア州)を用いて実施した。次いでオリゴヌクレオチドを脱保護し、 濃NH4OH中における室温での終夜インキュベーションによって支持体から切 り離した。次いでオリゴヌクレオチドを、OPCTMカートリッジ(Applied Bios ystems,Foster City,カリフォルニア州)を用いて精製し、そしてそれらの純度 を、下記のようにHPLCによってチェックした。 5’−AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT−3’及び5’−A ATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT−3’のHPLC分 析。 HPLC分析は、Whatman Partisphere C185μm,4.7 ×235 mmカラムを用いたHewlet-Packard 1050 システムを用いて実施した。分析は全 て室温にて行った。典型的には、溶離液として0.05M酢酸トリエチルアンモニウ ム緩衝液(TEAA)(pH7.0)中のCH3CNの5%から30%までの勾配を、 1.0ml/分の速度で用いた。5’−AATACATGGA(CDU)GATT TGTAT−3’,Rt14.83 分;5’−AATACATGG(CDU)(CDU )GATTTGTAT−3’,R,14.64分。 in vitro位置指定突然変異導入 本実験において用いられたin vitro位置指定突然変異導入のため .,Madison,ウィスコンシン州)において使用されているものの修正であった。 要するに、HIV−RTの推定触媒活性部位(5’−2676乃至3’−2696)に位 置するオリゴヌクレオチド、5’−AATACATGGA(CDU)GATTT GTAT−3’、5’−AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTG TAT−3’、及び対照を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し た。反応は、70℃に10分間加熱することにより停止させた。突然変異導入アニー リング反応は、0.05 pmolecのpHIVALT−1 ssDNA、0.25 pmoleの アンピシリン修復オリゴヌクレオチド(キット中に供給されている)、1.25 pmo leの5’−リン酸化された変異原性オリゴ、及びキット中に供給されているアニ ーリング緩衝液を、最終液量20μlになるように加えることによって実施した。 この実験のための対照オリゴヌクレオチド反応は、アンピシリン修復オリゴ及び 無変性対照を含むが変異原性オリゴ5’−AATACATGGA(CDU)GA TTTGTAT−3’及び5’−AATA CATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT−3’を含まない追加の反 応と共に別個に行った。反応物は次いで70℃に5分間加熱されそして室温まで15 〜20分かけて放冷した:アニーリング反応物を氷上に置きそして次の試薬を加え た。3μlの10×合成緩衝液(キット中に供給されている)、1μlのT4 D NAポリメラーゼ(10U/μl)、1μlのT4 DNAリガーゼ(2U/μl )、及び5μlの滅菌dH2O。第2の鎖の合成及びライゲーションを実施する ために、30μlの反応液を37℃にて90分間インキュベートした。 突然変異導入 突然変異導入に対するCDU変性されたオリゴヌクレオチドの効果を観察する ために、in vitro突然変異導入ステップ(上記)から得られた反応混合物全量( 30μl)をコンピテントなBMH71−18 mut S(thi,supE,Δ( lac−proAB),〔mutS:Tn10〕〔F’,proA+-,laqIq ZΔM15〕修復マイナス株及びDH5δ修復陽性株に加えた。反応混合物を次 いで、Maniatis等によって記述されているようにCaCl2により形質転換した 。BMH71−18 mut S形質転換体のみから突然変異体を選択するために、 形質転換体の一部をLennox L アガー(LB agar)(Gibco-BRL,Madison,ウ ィスコンシン州.カタログ μg/mlのアンピシリンを含有する5mlLBブロス中に播種した。 配列決定のための突然変異体選択 対照及び実験反応からの形質転換されたBMH71−18 mut Sを、100 μg/mlのアンピシリンを含有する5mlのLBブロス中において 終夜、250rpmで震盪し37℃にて増殖させた。終夜培養物を遠心して沈殿させ 、そしてプラスミド抽出のためにQiage ォルニア州,91311)を用いて溶解した。プラスミド抽出の手順は、メーカーの説 明書に従って特に変更せずに行った。翌朝、上記のように培養物全量を遠心し、 そして溶解させた。BMH71−18 mut SからのプラスミドDNAの回収の 後、精製したプラスミドDNAを20μlの滅菌dH2O中に再懸濁させ、上述の ようにしてコンピテントなJM109 内へ形質転換させ、100μg/mlのアンピ シリンを補充したLBアガープレート上に播種した。 配列決定 配列決定は、AmpliTaq Sequencing Kit(Perkin Elmer Cetus Corp.,Norwalk ,コネチカット州)からのサイクル配列決定法によって実施した。突然変異体の 配列決定に用いたプライマーは、HIVBRUの5’−2539乃至3’−2554に位 置するRT−MT4(5’−CAATGAGACACCAGGG−3’)、及び 、反対側の鎖5’−3899乃至3’−2879に位置するRT−MT7RC(5’−G TCATTGACAGTCCAGCTGTC−3’)であった。これらのプライ マーは、RTの活性部位の反対側に位置し、プラスミドの両鎖についての配列検 証を与えるであろう。結果 突然変異導入 CDU変性したオリゴマー〔5’−AATACATGGA(CDU)GATT TGTAT−3’及び5’−AATACATGG(C DU)(CDU)GATTTGTAT−3’〕を含むin vitro突然変異導入反応 物及び対照反応物を、E.coliの修復陽性及び修復マイナス株中に入れた。 アンピシリン(amp)修復オリゴ+中性オリゴ(CDU変性を除外)を含有す る反応物は、E.coliの修復陽性株(DH5δ)中において、ampプレー ト上にコロニーを形成することができなかったが、しかし、テトラサイクリン( tet)プレート上にはコロニーを形成した。修復マイナス株(BMH71−18 mut S)内へ形質転換された対照反応物は、アンピシリン及びtetプレー ト上にコロニーを形成した。修復陽性株内への実験的変異原性CDU変性形質転 換は、amp又はtetプレート上でのコロニー形成の能力を欠いていることが 実証された。しかしながら、修復マイナス株におけるCDU変性in vitro突然変 異導入からの反応物は、ampプレート上で増殖する能力を実証し、最後にJM 109 内への形質転換の後、amp及びtet抵抗性を実証した。 配列決定 5’−AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT−3’及び5’− AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT−3’を用いた位 置指定in vitro突然変異導入からえられた突然変異体及び対照オリゴヌクレオチ ドの配列決定を行った。クローンの60%において(RL−1を用いて)、突然変 異は、相補鎖のCDUに向かい合った塩基の隣に起こり(例えば5’−AATA CATGGTGATTTGTAT)、YMDDからYMVDへのアミノ酸変化 をもたらした。YMDDからYMGDへのアミノ酸変化もまたこの場合に観察さ れた。 第2の配列(RL−2)は、クローンのその割合にYMDDからYRVDへの 変化を引き起こした。 D. プローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用 本発明のオリゴヌクレオチドは、核磁気共鳴イメージング(MRI)を含む種 々の診断技術においてプローブとして使用することができる。MRIは、患者内 の腫瘍の存在及び位置を検出するために使用される非侵襲的技術である。例えば 、癌細胞特異的ホウ素化化合物が患者に投与され、癌組織中に濃縮する。MRI 機器は、ホウ素の以上蓄積している領域を検出することができる。高い相対濃度 のホウ素を有する領域を指し示すことによって、MRIは腫瘍の存在及び位置を 確立する。 本発明のオリゴヌクレオチドの別の診断適用は、分子プローブとしてのそれら の使用である。オリゴヌクレオチドは、標準の技術に従ったハイブリダイゼーシ ョンによりサンプル中のDNA又はRNAの相補的配列の存在を検出するのに使 用される。例えば、プローブは、ササンブロット及びノーザンブロットアッセイ において使用することができ、それらの詳細は既知である。例えば、R.Old and S.Promrose,Priciples of Gene Manipulation,8-10(3rd Ed.1985)を参照 のこと。プローブとして使用される場合、ホウ素原子は、中性子放射に曝露され る迄はそれ自身は放射性でないが、放射性標識として働く。中性子に曝露される と、10Bは中性子を吸収して不安定な11Bを形成し、これは速やかに崩壊してα 粒子及びγ線を放出し、こうして検出可能な信号を提供する。α線の発生を伴う この技術は既知である。例えば、A.Soloway,Borax Rev.3,7-9(1988)を参照 のこと。 オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの核酸配列へのハイブリダイゼー ションの反応条件は、オリゴヌクレオチドの長さ、G及びCヌクレオチドの数及 びハイブリダイゼーション反応において用いられる緩衝液の組成などのような因 子に依存して、オリゴヌクレオチドによって様々に変化する。中等度に厳格なハ イブリダイゼーション条件が、完全に塩基対を形成した二本鎖DNAの融解温度 より下方約25℃として当業者に一般に理解されている。より高い温度、換言すれ ばより厳格な条件を用いるインキュベーションによれば、一層高い特異性が一般 に達成される。周知の実験室マニュアルであるSambrook等のMOLECUAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,second edidtion,Cold Spring Habor Laboratory Press ,New York(1990)(参照によりここに導入する)の第月章は、関与する因子及 び特異性を備えたハイブリダイゼーションを保証するために必要な厳格さのレベ ルの記述を含む、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーについてのハイブ リダイゼーション条件を非常に詳細に記述している。 E.組織サンプル中のホウ素の検出 Gambelらによって開発された技術(Gabel,D.,Hocke,I.,and Elsen,W.,De termination of sub-ppm amounts of boron-10 solutions by means of solid s tate track detectors. Phys.Med.Biol.28:11453-1457,1983; Fairchild,R .G.,Gabel,D.,Laster,B.,and Kiszenick,W.B-10 Analysis is Tissue by Prompt-gamma and Track Etching Techniques.Proc.the First Internationa l Symposium on Neutron Capture Therapy,October 12-14,1983. BNL Report No.51730,pp.106-13,1984)が使用され、そこでは 、0.5mgの液滴中のng量の天然のホウ素を検出するためにニトロセルロース フィルムが使用される(1.2)。既知量又は未知量のホウ素を含む少量(0.5μl )の液滴が、ニトロセルロースフィルム(Kodak Pathe type LR115)上におかれ 、乾燥され、そして約6×1012n/cm2で照射される。生じるα軌跡がNaO Hでエッチングされ、次いでオプトエレクトロニクス的にカウントされる。106 個の細胞(組織又はサンプルの約1mg)中のホウ素含量は、分析すべき細胞を 溶解し次いで上記のように進めることにより得ることができる。この手順は、ホ ウ素含有プローブのために当業者に容易に適合させられる。 F.アンチセンス療法 ポリリボ核酸又はポリデオキシリボ核酸に結合する能力を有する本発明のオリ ゴヌクレオチドは、慣用のアンチセンス療法と同じ仕方でアンチセンス剤として 有用である。一般的には、Antisense Molecular Biology and S-oligos,Synthe sis 1 (Oct.1988)(Synthecell Corp.,Rockville,メリーランド州);2 Disc overies in Antisense Nucleic Acids(C.Brakel and R.Fraley eds.1989); U hlmann,et al.,“Antisense Oligonucleotides: A new Therapeutic Techniqu e,”Chem.Rev.90(4),1990; 及びMilligan,J.F.,Matteucci,M.D.,Martin ,J.C.,J.Med.Chem.,1993,36,1923-1937.を参照。本発明のアンチセンス 剤は、所定のポリデオキシリボ核酸配列又はリボ核酸配列、そのような配列を含 んだ細胞に選択的に結合する能力(例えば該アンチセンス剤を細胞を含んだ培養 中に加えることにより)を有し、それにより細胞内に取り込まれ、所定の配列に 結合し、そしてそれらの転写、翻訳又は複製を阻害する 能力を有するアンチセンス剤を構築することによって使用できる。アンチセンス 剤の選択的結合のための要件は既知である(例えば、ヒトゲノムにおける選択的 結合のためには17塩基の長さ)。 V.カルボラニル含有ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの薬剤 学的組成物と放出 該カルボラニル変性ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド並びにそれらのあら ゆる組み合わせが、ここに記述した如何なる目的のためにも有効量でヒトに投与 できる。活性材料は、所望により薬剤学的に許容し得る誘導体又は塩として、又 は薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤と組み合わせて投与することができる。 活性材料は、如何なる適当な経路、例えば経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、 又は局所などの経路で、液体又は固体の形で投与することができる。 活性化合物は薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤中に、治療を受ける患者に 所望の治療結果を重大な毒性作用を起こすことなく達成するために放出するに十 分な量に含められる。癌又はウイルス等のような疾病の治療のためには、一般に 、少なくとも2、そして好ましくは少なくとも5又は10の治療係数を有する化合 物が許容される。治療係数は、IC50/EC50と定義され、ここにEC50は疾病 細胞の50%まで増殖を阻害する化合物濃度であり、そしてIC50はたの点では健 康な標的細胞の50%までに毒性である化合物濃度である。細胞毒性は、直接的細 胞カウント、トリパンブルー排除、又は3H−チミジン取込み等のような当業者 に知られた種々の代謝活性研究によって測定することができる。 上記の全ての状態に対する活性化合物の好ましい投与量は、1日 当たり1回の投与量として、0.01乃至1000mg/kg体重、及び好ましくは0.1 乃至20mg/kg体重であろう。薬剤学的に許容し得る誘導体の有効投与量範囲 は、放出される親化合物の重量に基づいて計算することができる。もしも誘導体 がそれ自身活性を示すならば、有効投与量は、誘導体の重量を用いて上記のよう にして、又は当業者に既知の他の手段で推定できる。 該化合物は、単位投与形態あたり5乃至3000mg、好ましくは70乃至1400mg の活性成分を含有する形態を含むがこれらに限られない如何なる適当な単位投与 形態の形でも便利に投与される。50〜1000mgという経口投与量が、通常便利で ある。 理想的には、活性成分は、活性化合物のピーク血漿濃度約0.01乃至100 μM, 好ましくは約0.1 乃至40μMを達成するように投与されるべきである。これは、 例えば、活性成分の、所望により食塩水中の、又は活性成分のボーラスとしての 0.1乃至2%溶液の静脈内注射によって達成できる。 BNCTのための好ましい具体例においては、活性化合物は、静脈内溶液の形 で投与量範囲1mg/kg乃至20mg/kgで投与される。アンチセンス療法の 好ましい一具体例においては、活性化合物は、胃の酸性環境から化合物を保護す る経口放出のための薬剤組成物の形、例えば腸溶性コーティングの形で投与され る。 薬物組成物中における活性化合物の濃度は、薬物の吸収、不活性化、及び排泄 速度並びに当業者に既知の他の因子に依存する。疾病を治療するために該化合物 を使用するときには、投与量値は、改善すべき状態の重症度に非常に依存すると いうことを認識しなければならない。更に、如何なる特定の患者についても、特 定の投与療法 は、個人の必要及び該組成物を投与する又はその投与を監督する者の専門的判断 に従って経時的に調節されるべきであるということ、及び個々に示した投与量範 囲が典型例に過ぎず、請求に係る組成物実施の範囲を限定することを意図したも のでないということを理解しなければならない。活性化合物は一時に投与されて もよく、又は種々の時間間隔で投与されるべき一層少ない多数の投与量へと分割 されてもよい。 経口組成物は、通常、不活性の希釈剤又は食べられる担体を含んでいる。それ らは、ゼラチンカプセル中に包まれていても、また錠剤の形に圧縮されていても よい。経口治療の投与目的のためには、活性化合物は賦形剤と組み込まれ、そし て錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形で使用される。薬剤学的に適合性のある 結合剤、及び/又は補助材料を組成物の一部として含めることができる。 錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤その他は、以下の如何なる成分又は類似 の性質の化合物を含むこともできる:微結晶セルロース、トラガントゴム、ゼラ チン等のような結合剤、スターチ又は乳糖等のような賦形剤、アルギン酸、Prim ogel又はコーンスターチ等のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム又はSter otes等のような潤滑剤、コロイド性二酸化ケイ素等のような滑沢剤、ショ糖又は サッカリン等のような甘味剤、又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレ ンジ香料等のような香味剤。投与量単位形態がカプセルである場合には、上記の タイプの材料に加えて、脂肪油等のような液体担体を含むことができる。加えて 、単位投与量形態は、投与量単位の物理的形態を修正する種々の他の材料、例え ば糖衣、シェラック(shellac)又は他の腸溶剤等を含むことができる。 活性化合物又は薬剤学的に許容し得るそれらの塩は、エリキシル剤、懸濁剤、 シロップ剤、ウエファー、チューインガムその他の成分として投与することがで きる。シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてのショ糖及びある種の 保存剤、染料および着色剤及び香料を含むことができる。 活性化合物及び薬剤学的に許容し得るそれらの誘導体又は塩はまた、所望の作 用を損なうことのない他の活性材料と、又は、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、 又は他の、別のヌクレオシド抗HIV化合物を含む抗ウイルス剤等のような所望 の作用を補う材料と混合することもできる。 非経口、皮内、皮下又は局所適用のために使用される溶液又は懸濁液は、次の 成分を含有することができる:注射用水、食塩水、不揮発油、ポリエチレングリ コール類、グリセリン、プロピレングリコールその他の合成溶媒等のような滅菌 希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベン等のような抗菌剤、アスコルビ ン酸又は十亜硫酸ナトリウム等のような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸等の ようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等のような緩衝剤、及び塩 化ナトリウム又はブドウ糖等のような浸透圧調節剤。非経口製剤は、アンプル、 使い捨てシリンジ又はガラス又はプラスチック製の多回投与バイアル。 静脈内に投与される場合には、好ましい担体は生理的食塩水又はリン酸緩衝食 塩水(PBS)である。 好ましい一具体例においては、活性化合物は、化合物を身体からの急速な排除 から保護する担体、例えば、埋め込み物及びマイクロカプセル封入放出系等のよ うな徐放性調製物と共に調製される。エ チレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオ ルトエステル、及びポリ乳酸等のような生分解性の、生体適合性のポリマーを使 用することができる。そのような調製物の調製のための方法は、当業者に明らか であろう。それらの材料はまた、Alza Corporation及びScios-Nova Pharmaceuti cals,Inc.から商業的に入手することもできる。 リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細 胞に狙いを定めたリポソームを含む)がまた、薬剤学的に許容し得る担体として 好ましい。これらは当業者に既知の方法、例えば米国特許第4,522,811 号(これ を参照によりここに導入する)に従って調製できる。例えば、リポソーム調製物 は、適当な脂質(ステアリン酸ホスファチジルエタノールアミン、ステアリン酸 ホスファチジルコリン、アラキドン酸ホスファチジルコリン、及びコレステロー ル等のような)を無機溶媒に溶解させ次いで蒸発させ、後に乾燥した脂質の薄い フィルムを容器の表面に残すことによって製造できる。活性化合物又はその1リ ン酸、2リン酸及び/又は3リン酸誘導体の水溶液が、次いで容器中に導入され る。脂質材料を容器側壁から遊離させて脂質凝縮物を分散させるために、容器が 次いで手で回され、それによりリポソーム懸濁液が形成される。 本発明はその好ましい具体例を参照してここに記述された。本発明の変更及び 修正は、本発明についての以上の詳細な記述から当業者に明らかであろう。これ らの変更及び修正の全てが添付の請求の範囲に包含されることが意図されている 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61N 5/00 A61N 5/00 (72)発明者 レスニコウスキー,ツビニュー,ジェイ アメリカ合衆国30030ジョージア、デカチ ャー、クレアモントロード 1135シー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 少なくとも1個の無荷電の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イ ル−メチル)ホスホネート〕ヌクレオチド間結合を含んだ、オリゴヌクレオチド 。 2. 1個の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホ ネート〕ヌクレオチド間結合が、該オリゴヌクレオチドの3’末端にある2個の ヌクレオチドの間に位置しているものである、請求項1のオリゴヌクレオチド。 3. 1個の3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホ ネート〕ヌクレオチド間結合が、該オリゴヌクレオチドの5’末端にある2個の ヌクレオチドの間に位置しているものである、請求項1のオリゴヌクレオチド。 4. 1個の3’,5’−O,O−〔(o−カルボラン−1−イル−メチル)ホ スホネート〕ヌクレオチド間結合が、該オリゴヌクレオチドの中間部にある2個 のヌクレオチドの間に位置しているものである、請求項1のオリゴヌクレオチド 。 5. 1個より多くの3’,5’−O,O−〔(カルボラン−1−イル−メチル )ホスホネート〕結合を含んだ、請求項1のオリゴヌクレオチド。 6. 相補的DNA核酸配列に生体内でハイブリダイズすることのできる、請求 項1のオリゴヌクレオチド。 7. 相補的RNA核酸配列に生体内でハイブリダイズすることのできる、請求 項1のオリゴヌクレオチド。 8. 二本鎖DNA中の特定の遺伝子配列にハイブリダイズして三 本鎖複合体(トリプレックス)を形成することのできる、請求項1のオリゴヌク レオチド。 9. 式、 〔式中、Cは、B101024等のカルボラニル基であり、ここにR4は、−H 、−OH、−CH2OH、−CH2X(ここにXはハロゲンである)又は−B92 (11 または12)(ニド−カルボランアニオン)であり、 R5は低級アルキル基であり、 GはN又はCHであり、 MはO又はSであり、そして Zは0乃至5である。〕の少なくとも1個のカルボラニル含有塩基を含んだ オリゴヌクレオチド。 10. カルボラニル含有塩基が3’末端ヌクレオチド中に位置しているもので ある、請求項9のオリゴヌクレオチド。 11. カルボラニル含有塩基が5’末端ヌクレオシド中に位置しているもので ある、請求項9のオリゴヌクレオチド。 12. カルボラニルが含有塩基か3’末端ヌクレオシドに隣接したヌクレオシ ド中に位置しているものである、請求項9のオリゴヌクレオチド。 13. カルボラニルが含有塩基が5’末端ヌクレオシドに隣接したヌクレオシ ド中に位置しているものである、請求項9のオリゴヌクレオチド。 14. 〔式中、R1は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルコキシアルキル、 アリール、ヘテロアリール、トリフルオロメチル、アルキルアリール、アリール アルキル又はハロゲンであり、 R2は、水素、アルキル、アリール、アシル(アセチルを含む);メタンス ルホニルを含むアルキルスルホニル又はアリールアルキルスルホニルを含むスル ホン酸エステル;モノ−、ジ−又はトリ−リン酸エステル;トリチル又はモノメ トキシトリチル;上記アリールの定義に記述した1個又はより多くの置換基でフ ェニル基が置換されていてよいベンジル;トリアルキルシリル(例えばジメチル −t−ブチルシリル)又はジフェニルメチルシリルを含むシリル;脂質;ペプチ ド;又はコレステロールであり、 R3は、ヒドロキシル、水素、ハロゲン、−CN、−N3、低級アルキル、アミ ノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキ シであり、そしてR3基はリボシル型コンフォメーション(酸素が後ろに来るよ うに該環を配向させたとき該糖部分に対して「下側」)又はアラビノシル(「上 側」)コンフォメーションであることができ、 Bは、カルボラニル基のホウ素部分を表し、特にアニオン性のo−ニド−7 ,8−C29(11 または12)及び中性のo−クロソ−1,2−C21012を含 み、 Wは、O,S,又はSeであり、 Xは、O,S,S(O),S(O)2,CH2,CHOH,CHN3,又はN Hであり、 Yは、OH,SH,SeH,又はハロゲン、特にフッ素であり、 nは、1〜5であり、そして mは、0又は1である。〕よりなる群より選ばれる化合物。 15. 該塩基が、チミジン、ウラシル、5−ハロウラシル、シトシン、5−ハ ロシトシン、アデノシン、グアノシン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ− 6−クロロプリン、2−アミノプリン、5−低級アルキルウラシル、及び5−低 級アルキルシトシン、2−チオウラシル、2,4−ジチオウラシル、及び4−チ オウラシルよりなる群より選ばれるものである、請求項4の化合物。 16. Xが、O又はSである、請求項1の化合物。 17. R2が水素である、請求項1の化合物。 18. 〔式中、R1,R2,R3,B,W,X,Y,Z,m及びnは、請求項14におけ る定義に同じである。〕よりなる群より選ばれる化合物。 19. 薬剤学的に許容し得る担体中に請求項1のオリゴヌクレオチドを含んだ 組成物。 20. 薬剤学的に許容し得る担体中に請求項9のオリゴヌクレオチドを含んだ 組成物。 21. 薬剤学的に許容し得る担体中に請求項14の化合物を含んだ組成物。 22. 薬剤学的に許容し得る担体中に請求項18の化合物を含ん だ組成物。 23. 該担体が静脈内放出に適したものである、請求項19、20、21又は 22の組成物。 24. 該担体が該オリゴヌクレオチド又は化合物を酸性環境中において分解か ら保護するものである、請求項19、20、21又は22の組成物。 25. ホウ素中性子捕獲療法を実施するための、それを必要とする患者に請求 項1のオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを含む方法。 26. ホウ素中性子捕獲療法を実施するための、それを必要とする患者に請求 項9のオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを含む方法。 27. ホウ素中性子捕獲療法を実施するための、それを必要とする患者に請求 項14の化合物の有効量を投与することを含む方法。 28. ホウ素中性子捕獲療法を実施するための、それを必要とする患者に請求 項18の化合物の有効量を投与することを含む方法。 29. 3’−O−〔(カルボラン−1−イル−メチル)ホスホネート〕部分を 含んだヌクレオシドの製造のための方法であって、(i)ヒドロキシル基及び所 望により他のホスホネート化すべきでない官能基を保護し、そして(ii)保護さ れたヌクレオシドをO−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネー トと反応させることを含む方法。 30. O−メチル(o−カルボラン−1−イル)メチルホスホネ ート。 31. ウイルス、真核細胞、又は原核細胞のゲノム中に突然変異を誘発させる ための方法であって、転写又は細胞分裂に際して突然変異を引き起こす仕方で核 酸配列にオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするものである、カルボラニルを 含んだオリゴヌクレオチドを細胞内に挿入するステップを含む方法。 32. 該突然変異がウイルスゲノム中に誘発されるものである、請求項31の 方法。 33. 該突然変異が真核細胞ゲノム中に誘発されるものである、請求項31の 方法。 34. 該ウイルスがHIVである、請求項32の方法。 35. 該ウイルスがHBVである、請求項32の方法。 36. 核磁気共鳴イメージング(MRI)を用いて患者内の腫瘍の存在又は位 置を検出するための方法であって、該腫瘍組織中に選択的に蓄積する有効量の請 求項1,9,14又は18のカルボラニル含有ヌクレオシド又はオリゴヌクレオ チドを投与することを含む方法。 37. 請求項1又は9のカルボラニル含有オリゴヌクレオチドを標的配列にハ イブリダイズさせそしてハイブリッドを検出することを含む、標的核酸配列を検 出するための方法。
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