JPH10504969A

JPH10504969A - 植物表皮に外来タンパク質の発現を指示するために有用な植物プロモーター

Info

Publication number: JPH10504969A
Application number: JP8509626A
Authority: JP
Inventors: マイケル・エスドブルズ，; セブヌルマンダチ，
Original assignee: ドレクセル・ユニバーシテイ
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1998-05-19
Also published as: EP0778727A1; US5646333A; EP0778727A4; AU3504495A; CA2198870A1; US5744334A; WO1996007313A1; MX9701598A

Abstract

(57)【要約】本発明は、配列番号１のBlec植物プロモーター配列を対象とする。Blec−プロモーター−遺伝子構築物を用いて植物を形質転換する方法も本発明の範囲内である。本発明はまた、Blec−プロモーター−遺伝子構築物を含んで成る細胞、Blec−プロモーター−遺伝子構築物を含んで成るプラスミドおよびベクターおよびBlec−プロモーター−遺伝子を含んで成る構築物自体も対象とする。Blecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る植物抽出物、およびBlecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下の遺伝子を有する抽出物を含んで成る核酸の転写法も、本発明の範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】植物表皮に外来タンパク質の発現を指示するために有用な植物プロモーター政府認可の参照本研究は、米国農務省からの奨励研究（受託番号第89-37262-4793号）により一部援助された。米国政府は本発明に一定の権利を有することができる。発明の背景植物の苗条の成長は、主に茎頂分裂組織の継続的な活性から起こる。茎頂成長に関連する生化学的および細胞学的な出来事は、植物の発生の解明に最も重要である。茎頂分裂組織の性質を分析するために、多くの研究(例えば、J.I.Medford ,Plant Cell 1992,4,1029-1039)が組織学的、外科的および遺伝的手法を利用した。茎頂分裂組織は、通常３つの発生上の組織層と言う用語で説明されている、 S.Satinaら、Am.J.Bot.1940,27,895-905。外層Ｌ１層は、茎頂分裂組織の面に対してアンチクリニカルな面で主に分裂し、そして苗条表皮を生じる。Ｌ２層の細胞は主にアンチクリニカル面で分割するが、原基形成中にペルクリニカリーに分裂する。Ｌ３層の細胞は、すべての面内で分裂し、そして植物の中芯を生じる。茎頂分裂組織中で生まれる細胞の運命は明らかであるが、細胞分化中に起こる調節的な出来事について学ぶべき事柄は沢山残っている。例えばどの過程が、細胞が茎頂分裂組織から発生した時に、Ｌ１、Ｌ２またはＬ３層からの分化を規定し、そしてゆっくりと完全に分化した苗条細胞へと分化を規定するのか、というようなことである。Ｌ１層の場合には、成熟した表皮細胞は茎頂分裂組織の前表皮からの連続的なアンチクリニカル分裂により生じることが知られているが、茎頂分裂組織から生じる細胞の分化に関与する特別な分子または細胞学的変化あるのか？。光学顕微鏡で判断すると、エンドウの前−表皮と表皮細胞の間に目で見ることができる明らかな境界はない、B.F.ThomsonおよびP.M.Miller,Am.J.Bot.1962.49,303-310。実際、エンドウでは表皮細胞は未分化のままであり、そして８日後の実生苗中の茎頂分裂組織から第５節に関するかぎり内部組織から区別できない、ThomsonおよびMiller、同上。植物表皮は第一のバリアーであり、そして環境との相互作用面である(Esau,K ，種子植物の解剖学(Anatomy of Seed Plants)、ジョンウィリーアンドサンズ社(John Wiley and Sons Inc.)、ニューヨーク、1960)。表皮中の分子および構造は、微生物または動物の攻撃を防衛し、有益な昆虫を色素または揮発性化学物質を合成することにより誘引し、機械的な支持および水分損失の防止に役立つと考えられている。植物および植物害虫は何百万年にわたって互いに進化してきたので、植物の自然な防衛は微生物または動物の攻撃から自らを保護するにはしばしば不十分である。遺伝子工学により植物、動物および／または微生物源からのクローン化された外来遺伝子の導入は、それを用いた植物の防御特性を増強させる方法を表す。このような方法の例には、³⁵Ｓ CaMV プロモーターの制御下で発現するバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)のエンドトキシンを使用して、昆虫の攻撃から保護されたトランスジェニックタバコ植物(Vaeck ら、Nature 1987,328,33-37)、およびCaMV プロモーターの制御下で発現したインゲンマメキチナーゼを使用して菌類の攻撃に対して保護されたタバコ植物(Br oglieら、Scienc e 1991,254 ,1194-1197)がある。最適効率のためには、遺伝子操作された防御分子は、ほとんどの場合で初めて害虫に出会う外側表皮中の植物組織に高度に発現させるべきである。 Maitiら(Maitiら、Planta 1993,190,241-246)は、レクチン-様タンパク質をコードするmRNA配列、およびエンドウ(Pisum sativum)の茎頂表皮に蓄積する対応するcDNAの特徴を報告した。他者(Sterkら、Plant Cell 1991,3,907-921)は、ニンジンの茎頂の表皮細胞に高度に発現する脂質輸送タンパク質遺伝子をコードするmRNA配列の特徴を報告した。Clarkら(Clarkら、Plant Cell 1992,4,1189-1198 )は、パキフィタム(Pachyphytum)の表皮中に発現する脂質輸送タンパク質遺伝子のmRNA配列の特徴を報告した。表皮に特異的な他のmRNAの例は、Schmelzerら(Schmelzerら、Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1988,85,2989-2993;Schmelzerら、Planta Cell 1989,1,993-1001)による報告を含み、彼は化学誘導に反応して表皮細胞中に蓄積するカルコンシンターゼ（CHS）およびフェニル−アラニンアンモニアリアーゼ（PAL）遺伝子族をコードするmRNAを同定した。誘導無しでは、PALおよびCHS mRNAは柔組織の葉肉組織にも蓄積する。 Goodrichら(Goodrichら、Cell 1992,68,955-964)は、キンギョソウの花の中でのアントシアニン生合成に関与する酵素をコードするmRNAが花芽発育中の限られた期間、特別化された表皮細胞中に発現することを報告した。Wyattら(Wyattら、Planta Cell 1992,4,99-110)は、ダイズプロリン−リッチ細胞壁タンパク質Sb PRP1、SbPRP2およびSbPRP2が、表皮中に特定の発育段階で蓄積するが、維管組織中にも異なる時期に発現することを報告した。遺伝子のどの部分が、上記のような組織特異的発現のパターンを支配するために必要であるのかを示すために、遺伝子の推定上の調節領域を単離し、そしてトランスジェニック植物中でレポーター遺伝子の発現を支配する能力を試験することが必要である。これには例えば、遺伝子のプロモーター（５’上流領域）をレポーター遺伝子のコーディング領域（例えば細菌遺伝子β−グルクロニダーゼ）と一緒に配置することが関与する。Jeffersonら、EMBO J.1987,6,3901-3907。β -グルクロニダーゼ活性はその場で発色性基質 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル -β-D-グルクロン酸を使用して容易にアッセイできる。組織特異的発現を支配することが示されたプロモーターには、葉の葉肉および柵状で活性であるもの(Broglieら、Science 1984,234,838-845)、分裂している苗条および根の分裂組織(Atanassovaら、Plant J.1992,2,291-300)、花粉(Guerr eroら、Mol.Gen.Genet.1990,224,161-168)、種子内胚乳(Stalbergら、Plant Mol ,Biol .1993,23,671-683)、根の表皮(Suzukiら、Plant Mol,Biol.1993,21,109-11 9)および根の分裂組織、維管組織および根粒(Boguszら、Plant Cell 1990,2,633 -641)を含む。文献には表皮で発現するプロモーターについて比較的少数の報告が含まれ、その中には花の表皮細胞中で活性なプロモーター(Koseら、Plant Cel l 1990,2,379-392)および創傷に反応して表皮中で発現するプロモーター(Liang ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,9284-9288)がある。成長している苗条先端部の表皮に発現を指示することができるプロモーターの報告は知られていない。発明の要約本発明は配列番号１のBlec 植物プロモーター配列を対象とする。植物をBlec プロモーター−遺伝子構築物で形質転換する方法も本発明の態様である。本発明はまた、Blec プロモーター−遺伝子構築物を含んで成る細胞、Blec プロモーター−遺伝子構築物を含んで成るプラスミドおよびベクター、ならびにBlecプロモーターおよび遺伝子を含んで成る構築物自体も対象とする。Blec プロモーター配列の全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る植物抽出物、ならびにBlec プロモーター配列の全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を有する抽出物を含んで成る核酸の転写法も、本発明の範囲内である。図面の簡単な説明図１は、栄養および花発育中に組織特異的RNAの蓄積を要約する。濃い黒線は表皮中の組織特異的な発現を表す。薄い黒線は、検出できるレベルのBlec 転写物を蓄積しない前表皮細胞を表す。Blec RNAは栄養および花の分裂組織の前表皮中に検出できない。Blecは最初に背軸または発育中の原基の外面で検出できるレベルまで蓄積する。Ａ、茎頂分裂組織；Ｂ、萼片原基に挟まれた未分化の花ドームを持つ１つの花原基；Ｃ、萼片、花弁、約および子房原基を表す花芽；Ｄ、子房の外側表皮上にBlec RNAの蓄積を表す、授粉後の未開の花芽。図２は、受精１−２日後の発育しているエンドウ子房を縦方向に通る切片のin situ ハイブリダイゼーションを示す。Blec RNAは主に外側表皮に蓄積し、そして好ましくは発育中の胚珠の表皮で発現する。ｏｙ、子房；ｏｖ、胚珠。ＡおよびＣ、子房の薄い切片。Ｂ、放射標識Blec アンチセンス RNAとハイブリダイズ後のＡのオートラジオグラム；Ｄ、放射標識ヒストンH1アンチセンス RNAとハイブリダイズ後のＣのオートラジオグラム。図３は、Blecとエンドウ種子レクチン（PSL）遺伝子の間の比較サザン分析であり、Blecについて多数のゲノムコピー、およびPSLについて１−２コピーが明らかである。同じブロットをBlec およびPSLプロービングに使用した。Ｈ、Hind III、Ｅ、EcoRI；Ｂ、BamHＩ。図４はBlec4ゲノムクローンの制限酵素地図である。Ｈ、HindIII、Ｘ、XbaI；Ｃ、ClaI；Ｂ、BamHＩ。太い棒、Blec4コーディング領域の位置。図５は、完全長のBlec cDNA挿入物で釣り上げたトランスジェニックアルファルファのサザンおよびノーザンブロットを表す、ｐ、エンドウゲノムＤＮＡ；ａ、アルファルファ変種 RegenSY ゲノムＤＮＡ；ａ＋Ｇ、pBI121で形質転換したアルファルファ変種 RegenSY；ａ＋Ｂ、Blec4 6.7kbゲノム断片で形質転換したアルファルファ変種 RegenSY；ｓａ、茎頂；１ｆ、開いた葉。矢印はノーザンブロットに使用したＲＮＡ供給源を示す。図６は、pBlec4-GUSの構築を表す。2.8kbのプロモーター断片をpB101のHindII I-BamHＩ部位に連結してpBlec4-GUSを生成した。図７は、トランスジェニックアルファルファの表皮に対するpBLec4-GUS活性の組織化学的局在を明らかにする。青色染色は、無色のXGluc基質がGus(β-グルクロニダーゼ)により青色のインドール沈殿物へ転換したことによる。Ａはアルファルファの茎頂を縦方向に通る切片である（４ｘ）；Ｂは、Ａで示した表皮の倍率が２０ｘ；Ｃは魚雷段階の体細胞胚を縦軸方向に通る切片（１０ｘ）である。図８は、トランスジェニックアルファルファの芽および葉（頂点の芽から５節下から取った）のタンパク質抽出物について行ったBlec4プロモーター活性アッセイの結果を表す。示した値は、各種類の組織について３回行った別個のアッセイの平均を表す。図９は、エンドウ茎頂の39kdタンパク質とエンドウ種子レクチン抗血清との交叉反応を示すゲルである。レーン１：エンドウ茎頂；レーン２：開いた葉、レーン３：種子。図１０は、フェチュインアフィニティクロマトグラフィーによるBlecの精製を表す。パネルＡ：クマシーブルー染色ゲル、レーン１：150mM溶出物；レーン２：10mM 洗浄、レーン3：30-80％硫酸アンモニウム沈殿、レーン４；全芽抽出物、レーン５：全種子抽出物、レーン６：分子量マーカー。パネルＢ：抗−エンドウ種子レクチンで釣り上げた同一ゲルのウエスタンブロット。レーン１−５：パネルＡと同じ。パネルＣ：抗体のプロービング前のパネルＢポンソーＣ染色。図１１は、Blecおよび他の豆果レクチン由来のアミノ酸配列と比較したエンドウの茎頂の全抽出物から精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の比較である。PEA エンドウ種子レクチン配列。図１２は、GST-Blec融合物の発現を表すゲルの結果を示す。レーン：１、GST-Blec (50kd)の誘導ペレット画分；２、非誘導GST-Blec可溶性画分；３、誘導GST ペレット(27kd)；４、非誘導GSTペレット；５、GST-Blec誘導可溶性画分；６、G ST-Blec非誘導可溶性画分；７、誘導GST可溶性画分；８、GST非誘導可溶性画分；および９、分子量マーカー。発明の詳細な説明本発明は、配列番号１の植物プロモーターの核酸を対象とする。このBlec プロモーターは、外来遺伝子を含む遺伝子を植物表皮に標的するために有用である。したがって、本発明は遺伝子および／または配列の表皮特異的発現を対象とする。プロモーターはBlecと命名され、芽レクチン(bud lectin) の頭字語であり、エンドウ種子レクチン(PSL)の栄養配列相同体である、Mandaci およびDobres、Plant Physiol.1993,103,663-664。４種のcDNAがBlec のコーディング領域用に存在する。Pakら、Plant Molecular Biology 1992,18:857-863。本発明で説明するプロモーターは、Blec4のコーディング領域の5'に位置する。B lecタンパク質のコーディング領域は、Blec1、Blec2およびBlec3と高度な配列同一性を共有する。同様に、このBlec遺伝子のプロモーター配列は、かなりの配列類似性を共有するものと期待される。 Blecプロモーターは3881ヌクレオチド長である。Blecプロモーターの全部または一部は、配列または遺伝子を植物の表皮に特異的に向けるために使用できる。Blec プロモーターの全部または一部を、配列または遺伝子のタンパク質生成物と融合し、そして植物表皮で発現できる。部分(portion)、一部(part)、断片等は、プロモーターに連結した遺伝子の表皮発現を制御するBlecプロモーター内の核酸の１つ以上の群を言う。Blecプロモーター配列の全部または一部は、他の配列を植物表皮細胞に向けるために使用できる。本目的のための、Blecプロモーターの核酸配列の全部、一部および実質的に同一な核酸配列は、好ましくは25％、好ましくは50％、より好ましくは75％、そして最も好ましくは100％、Blecプロモーターと同一である。Blecプロモーター配列の部分は、１つの連続的な配列、または１つより多くの連続的核酸の配列であってもよい。さらに、本発明は配列番号１もしくは２の配列に実質的に類似する配列、またはその部分を含む。本発明の目的に関して実質的な類似とは、好ましくは25％、好ましくは50％、より好ましくは75％、そして最も好ましくは100 ％、配列番号１と同一である配列である。配列番号１もしくは２のの全部または一部を、配列または遺伝子を表皮に特異的に向けるために使用できる。 Blec RNAは、組織分裂性の表皮細胞発育の特別な期間内で高度に発現し、これは栄養および花の器官の組織分裂性表皮細胞に特別に蓄積するが、栄養または花の分裂組織に結合した前表皮細胞中には検出できない。初期の栄養および花原基発育中に、Blecは主に背軸表皮に蓄積し、そしてそのような器官の背軸または内面には検出できない。これによりBlecの蓄積は表皮を限定するだけでなく、器官発育中の表皮組織の特別な時期および位置も限定する。これらの観察を、表皮分化に関与する調節的な出来事をさらに規定する観点から考察する。 Blecプロモーターは別の配列または遺伝子の５’末端に連結または融合するのに有用であり、これにより植物の表皮細胞に向かうBlecプロモーター−遺伝子構築物を生成する。Blecを発現する表皮細胞は限定するわけではないが、苗条、葉、花、茎、果実、栄養および再生器官の表皮細胞を含む。本発明により、表皮細胞は限定するわけではないが、細胞の外層、サブ−表皮（これは表皮直下の細胞の少なくとも１層である）および茎頂のＬ１層を含み、植物の部分は前述の文章で確認した。Blecを発現する植物中では種の変動性が存在し、それゆえにBlecおよびBlec−遺伝子構築物を発現すると判明した、または細胞学的に表皮に類似する層は、本発明の表皮の定義に含まれる。したがって、Blecプロモーターを表皮に発現する配列の上流のフレイムに連結する。発現する配列の下流または３’は、ポリアデニレーションシグナルまたは3'mRNA末端のプロセッシングに役立つと判明した他の配列を含む適当な転写終止シグナルであり得る。マーカー配列または遺伝子もBlecプロモーターの３’に連結できる。このマーカー配列は、Blecプロモーターの制御下で配列を発現している表皮細胞を容易に同定する手段を提供できる。本発明により、構築物は限定するわけではないがcDNAおよびゲノムDNAのようなDNA；mRNAおよびtRNAのようなRNA；配列番号１または２で説明する配列のような適当な核酸配列、ならびに付加、欠失、突然変異および相同体を含む核酸配列の保存的変化に限定されない核酸配列を含む。本発明の範囲の配列には、上記に確認したようなものを含む植物の特性を変化させることができるアンチセンス配列を含む。アンチセンス配列は、植物に有害な表皮中での配列の翻訳を防止できる。本明細書で確認される特性の原因であるような特定配列の発現阻害は、アンチセンス配列により達成される。本発明に従い、本発明に使用する配列は外因性およびヘテロロガス配列であってよい。本明細書で使用するとき、外因性およびヘテロロガスとは、非形質転換状態で得られず、そして通常は形質転換される植物または細胞の遺伝的工作の一部を形成しない核酸配列を表す。外因性またはヘテロロガスなBlecの核酸配列（限定するわけではないが配列番号１の核酸配列のような）を含んで成る植物は、本発明の範囲内にある。表皮に発現する配列または遺伝子は、キメラ配列が植物に持ち込むまれるような外来性のものであってよい。本発明の目的のための外来遺伝子および配列は、それらが持ち込まれる植物中には天然に存在するものではない遺伝子および配列である。キメラ構築物は、場合によっては他の配列と一緒に、Blecプロモーターに連結された外来配列または遺伝子から生成する。 Blec−遺伝子構築物のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質配列も、本発明の範囲内である。付加、欠失、突然変異および相同体を含むアミノ酸配列中の保存的変化も、本発明の範囲内にある。また本発明は、植物の形質転換法も対象とし、少なくとも１つの植物細胞を利用可能とし、遺伝子と一緒にBl ec プロモーターの構築物を調製し、これによりプロモーター−遺伝子構築物を形成し、植物細胞をプロモーター−遺伝子構築物で形質転換し、これにより形質転換した植物を調製し、そしてBlecプロモーター−遺伝子構築物をコードする配列の発現を可能とすることを含んで成る。植物は培養で調製できる。プロモーター −遺伝子構築物は、植物配列中に組み込まれるか、または次に植物を形質転換するプラスミドまたはベクターの一部であることができる。Blecプロモーター−遺伝子構築物を含んで成るプラスミドおよび／またはベクター、ならびに培養物中の細胞を含む細胞（Blecプロモーター−遺伝子構築物を含んで成る）も、本発明の範囲内である。配列を植物に運ぶ方法は限定するわけではないが、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル、マイクロインジェクションを含む。本発明の使用に適する発現ベクター、宿主細胞および細胞培養は、Blecプロモーター−遺伝子構築物を合成できる発現系から選択される。 Blecプロモーターをコードする核酸およびBlecプロモーターを含んで成る構築物は、組換えタンパク質を生産するために植物細胞培養中または菌類細胞中で発現できる。植物細胞は、任意の種子または非種子植物に由来する細胞または細胞培養物を含み、そして本発明で説明する植物に限定されない。菌類細胞は制限するわけではないが、セルビシエ(cerviseae)およびカールスバーゲニシス(carlbergenisis)のようなサッカロミセス(Saccharomyces)、ポンベ(pombe)のようなシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ニダランスト(n idulanst )のようなアスペルギルス(Aspergillus)、クロッサ(crossa)のようなニューロスポーラ(Neurospora)を含む子嚢菌類の員；ならびに担子菌類、卵菌類および不完全菌類を含む。本明細書で使用するとき、発現ベクターとはプラスミド発現ベクターおよびウイルスベクターのような、Blecプロモーターおよび構築物をコードする核酸配列を含むように操作されることができる任意の種類のベクターを言う。発現ベクターの選択は、Blecプロモーターおよび構築物をコードする核酸の発現が生じるように、所望の宿主細胞との適合性に基づく。一般的にプラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複製および制御配列を含む。本発明の核酸配列を含むプラスミドの選択を容易にするために、プラスミドベクターは抗生物質耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカーを含むことができる。限定するわけではないが適当な例には、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含む。適当な発現ベクター、エンハンサーおよび他の発現制御要素は、当該技術分野で周知であり、そして植物分子生物学：実験法(Plant Molecular Biology:A Pra ctical Approach )、Shaw、C.H.編集、ＩＲＬ出版、オックスフォード、英国、19 88、第131-160頁およびSambrookら、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、NY、(1989)に見いだすことができ、その内容は全部、引用により本明細書に編入する。所望の宿主に適する発現系の構築に関する詳細は、当該技術分野で周知である。タンパク質の組換え生産に関して、それをコードするＤＮＡは選択した発現系に適当に連結され、そして系を適合性のある宿主細胞中で形質転換し、次にこれを培養し、そして外来遺伝子の発現が起こる条件下に維持する。次に本発明のペプチドは培養物から細胞を溶解することにより、または適切で当該技術分野で既知の培養培地から回収する。 Blecプロモーターおよび構築物をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、転写および翻訳制御要素を含んで成る。例えば上流の位置にリボゾーム結合部位および開始コドンを含んで成る翻訳開始シグナルがあり、そして下流の位置に転写終止シグナルがある。転写および翻訳制御要素を、任意の機能的組み合わせまたは順序で連結することができる。本発明の任意の特定な態様に使用される転写および翻訳制御要素は、発現系が作成されるように発現ベクターが導入される細胞の種類を参考にして選択される。Blecプロモーターおよび構築物をコードするＤＮＡ配列を含む形質転換した宿主細胞を、次に宿主に適当な培地中で成長させることができる。本発明はまた、Blec プロモーター配列の全部または一部および該プロモーター制御下の遺伝子を含んで成る植物抽出物も対象とする。抽出物は無細胞であり、そして合成または天然であってもよい。抽出物はまた、制限するわけではないが抽出物の使用に役立つと思われる核またはその部分、ポリメラーゼ、リボゾームのような細胞部分、アミノ酸、ヌクレオチド、種々の塩、緩衝液、および無機もしくは有機物質を含むことができる。 Blec プロモーター配列の全部または一部および該プロモーターの制御下に遺伝子を有する抽出物を含んで成る核酸の転写法も、本発明の範囲内にある。この方法を行うための条件は、当業者には周知である(Ariasら、Plant Cell 1993,5, 485-496、その内容は全部、引用により本明細書に編入する)。抽出物もＲＮＡを翻訳でき、これはタンパク質に転写された。本発明は、限定するわけではないが昆虫、ウイスルおよび／または疾患耐性の変化（増大または減少）；増大した香り、花弁着色、色の明度、成長速度、およびより長期の花の寿命を生じることを含む有利な特性を提供する遺伝子を用いて、植物を形質転換させることを含む。上記のものを含む特性の原因である外来遺伝子は、制限するわけではないが微生物病原に対する耐性、キチナーゼ、グルカナーゼおよび菌類細胞壁を加水分解できる他の酵素、創傷または微生物攻撃により誘導される酵素またはタンパク質のようなリボゾーム−不活化タンパク質（サリチル酸、ジャスモン酸、２、６、１、クロロイソニコチン酸により誘導されるものを含む）；限定するわけではないがＴ４リゾチーム、哺乳類リゾチームを含む非植物源のリゾチーム；フェニルアンモニアリアーゼまたはリグニン、フィトアレキシン、プテロカルポン、フラノクマリンのようなフェニルプロパン骨格に基づく広範な天然生成物の形成を触媒するフェニルプロパノイド経路の他の酵素、ならびにイソフラボン 2-ヒドロキシラーゼ；アニオン性ペルオキシダーゼのようなリグニン重合に関与する酵素；ベンゾフェナントリジン、アルカロイドおよびインドールアルカロイドを含むアルカロイドの生合成に関与する酵素；モノテルペンおよびセスキテルペンのようなテルペン生合成における酵素；バチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)エンドトキシン、グルカナーゼ、フィトヘマグルチニン、マツユキソウレクチン、小麦胚芽凝集素を含むレクチン、ならびにアルセリン、α-アミラーゼインヒビターを含む他のタンパク質；およびBlec タンパク質、これはレクチンと配列相同性を共有する；ササゲトリプシンインヒビターのようなプロテアーゼインヒビター；エキシレンシンのようなグリシンヒドロキシプロリンリッチタンパク質を含む細胞壁タンパク質；セルロース生合成、脂質生合成および輸送を含む植物クチクラ生合成に関与する酵素；RNaseおよびリボザイム等を含む。本発明による形質転換は、植物遺伝型、組織−特異的または生理的条件、トランスポゾン標識化に関する分化発現(differential expression)によりクローン化された耐性遺伝子；クローニングに基づく地図；種特異的エリシターについて結合部位の生化学的特性決定、および機能によるショットガンクローニングを含む。そのような特性を有する形質転換した植物も、本発明の範囲にある。配列を植物中に運ぶ方法は当該技術分野で周知であり、限定するわけではないがＴｉ−プラスミドベクター、in vitroプロトプラスト形質転換、植物−ウイルス媒介形質転換、およびリポソーム−媒介形質転換を含む。 Blec −遺伝子構築物は、観用植物および花、低木、芝草ならびに切り花（限定するわけではないが、被子植物、苔類(livereorts)および蘚類のような蘚苔類；シダ、トクサ、およびヒカゲノカズラのようなシダ植物；針葉樹、ソテツ、イチョウおよびグネツムのような裸子植物；ならびに緑藻類、褐藻類、紅藻類、綱藍藻類、黄緑藻類、珪藻類(Diatomas)およびコーグレナ藻綱を含む藻類を含む）のような園芸用に有用であり得る。本発明の範囲内の植物は、制限するわけではないが、バラを含むバラ科、シャクナゲおよびアザレアを含むツツジ科、ポインセチアおよびクロトンを含むトウダイグサ科、カーネーションを含むナデシコ科、ペチュニアを含むナス科、アフリカスミレを含むイワタバコ科、ホウケンカを含むツリフネソウ科、ランを含むラン科、グラジオラス、アヤメ、フリージアおよびクロッカスを含むアヤメ科、マリーゴールドを含むキク科、ゲンノウショウコを含むフウロソウ科、ドラセナを含むユリ科、イチジクを含むクワ科、フィロデンドロンを含むサトイモ科等を含む。さらに限定するわけではないが、エンドウ、アルファルファおよびダイズを含むマメ科；コメ、トウモロコシ、コムギを含むイネ科；タバコ等を含むナス科等；特にダウカス属(Daucus)(特にカロタ種(carota)、ニンジン）およびアピウム属(Apiu m )（特にグラベオーレンズダルス種(graveolens dulce)、セロリ）等；ナス科、特にリコパーシコン属(Lycopersicon)、特にエスクレンタム種(esculentum)（トマト）、ならびにソラナム属(Solanum)、特にチューベロサム種(tuberosum)およびメロンゲナ種(melongena)(ナス)等、ならびにカプシカム属(Capsicum)、特にアンナム種(annum)(トウガラシ)等；ならびにマメ科、特にグリシン属(Glycin e )、特にマックス種(max)(ダイズ)等；ならびにアブラナ科、特にブラッシカ属(Brassica )、特にカンペストリス種(campestris)(アブラナ)、オレラセア(olerac ea )の栽培変種Tastie(キャベツ)、オレラセア(oleracea)の栽培変種Snowball Y （カリフラワー）、オレラセア(oleracea)の栽培変種Emperor(ブロッコリー)、ならびにアラビドプシス属(Arabidopsis)、特にサリアナ種(thaliana)等；キク科、特にラクチュカ属(Lactuca )およびサスティバ種(Sativa)(レタス)等を含む花成植物を含む。本発明に従い、本発明の範囲内に含まれる本植物は、植物界の高等および下等小物のすべてである。成熟植物、実生および種子は、本発明の範囲内に含まれる。Blec プロモーター−遺伝子構築物は、植物、植物部分、種子および植物培養に有用である。成熟植物は実生を越えた任意の発育段階の植物を含む。実生は大変若い、発育の初期段階の未成熟植物である。一年生、多年生、単子葉および双子葉植物も、Blec プロモーターおよびBlec −遺伝子構築物で形質転換できる。本発明は、Blec プロモーターならびに表皮中の他のプロモーターの調節に関与するＤＮＡ結合タンパク質の単離にも役立つ。実施例 Blec4 ゲノムクローンの最初の単離 W.F.Thompsonら、Planta 1983,158,487-500(引用によりその全部を本明細書に編入する)の方法に従い、ＲＮＡを単離し、そしてプローブで調べた。ゲノムのサザンブロットは、Maniatisら、モレキュラークローニング．アラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning ．A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク、1982(引用によりその全部を本明細書に編入する)に記載されているように行った。ＤＮＡプローブを³²Ｐを用いて、アマシャム(Amersham)Multiprime(商標)キットを使用して、製造元の指示に従い標識した。ハイブリダイゼーションに使用したプローブは、J.H.Pakら、Plant.M ol.Biol.1992,18 ,857-863(引用によりその全部を本明細書に編入する) により単離したpBlec1由来のBamHＩ-SacIの900bpの完全長ｃＤＮＡ挿入物であった。 HindIII消化のサザン分析は、４−20kbの範囲の８つのゲノム断片を明らかにした。Blec 遺伝子の多ゲノムコピーの存在は、ｃＤＮＡ分析の結果と一致する：6.7kb HindIIIゲノム断片をλファージλ29（これはピサムサティバム(Pisum sativum)の栽培変種 Alaska(図３)のλ47.1ゲノムライブラリーから単離した)から単離した。これはのエンドウ種子レクチン(PSL)遺伝子(１つのゲノム断片により示される)と良い対照をなし、それゆえに単相体ゲノムあたり１つのコピー遺伝子によりコードされると考えられる（図３）。制限断片長多型分析では、２組の遺伝子、BlecおよびPSLが第７染色体上で互いに10CM以内に位置していることが明らかである。そのよう遺伝的関連は、２組の遺伝子が複製過程により共通の祖先の遺伝子から生じたという概念に一致する。この6.7kbの断片を、大腸菌ベクターpKSM13+(Stratagene(商標)、ラジョラ、カリフォルニア州)のHindIII部位に連結した。配列分析では、p29H6がBlec4 cDN Aクローンと同一の1つのコーディング領域を含むことが明らかとなった(S.Manda ciおよびM.Dobres，Plant Physiol.1993,93,663-664)。これはその同一性を示すだけでなく、これがBlec遺伝子一族の発現した員に相当することも示している。トランスジェニックアルファルファ中でのBlec４ゲノムクローンの発現 6.7kbのゲノム断片を、Bevan M.W..Nucleic Acids Res 1984,12,8711-8721(引用によりその全部を本明細書に編入する)の方法に従い調製したバイナリーベクターpBIN19にクローン化して、ベクターpBIN6Kを作成し、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA 4404株中にエレクトロポレーションし、そしてアルファルフの変種 Regen SY(Bi ngham,E.T．Crop Sci.1991,31,1098、この内容は全部、引用により本明細書に編入する)の葉の切片を形質転換するために使用した。Bevanらは、ベクター分子キメラノパリンシンターゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の生成を開示し、そしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼのコーディング領域を含むTn5からの制限断片を使用してpUC9-nonpeo△を作成する。この分子はpTiT37由来のT-DNAの左および右境界が集成できた時に、便利な骨格を提供する。右境界を含むHindIII制限断片も、完全なノパリンシンターゼ遺伝子を含み、これはノパリンが非形質転換植物組織には見いだされないので有用なスクリーニング可能なマーカーである。左および右境界のT-DNA配列および選択可能マーカーを、アグロバクテリウム(Agrobacterium)中で選択するために、I II型アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを含む広範な宿主範囲のプラスミドpRK252の誘導体中に連結した。プロトタイプのバイナリーベクターBin6(15k b)を得、これはT-DNAでSalIおよびEcoRIのための制限部位、効率的な選択マーカー遺伝子および推定の形質転換体を同定するためのスクリーン可能な遺伝子を含む。このプロトタイプを望ましくない配列の欠失により修飾した。ノパリンシンターゼ遺伝子を、SStII部分消化およびリライゲーションにより取り出し、そして左および右境界反復を挟む過剰なTiプラスミド配列(約1.5kb)を、Bal31エキソヌクレアーゼ部分処理により取り出した。このようにして得た短縮化Ｔ領域を、 pRK252誘導体(これはブドウ球菌由来のカナマイシン耐性遺伝子の挿入中に、2.5 kbが欠失した)にクローン化した。最後にベクターのT-領域に配列を挿入するために、m13mp119由来の440bp HaeII断片をT-DNAの左境界から80bpの1.6kb EcoRI断片の代わりに挿入して、独特なEcoRI、BamHＩ、HindIII、SStＩ、KpnＩ、SmaＩ、XbaＩおよびSal Ｉ部位をベクターDNA中に提供した。この配列の挿入物を持つプラスミドは、カナマイシンIPTGおよびX-galを含有するプレート上で都合よく同定できる。葉の切片を表面滅菌し、MurashigaおよびSkoog基本塩培地(MS：GibcoBRL、グランドアイランド、NY)中で、pBI121（Jefferson,R.A.ら、EMBO J.1987,6,3901-3907に従い調製した、この内容は全部、引用により本明細書に編入する）またはpBIN6K のいずれかを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tume faciens ）LBA4404とともに２日間、混合培養した。PB121の構築は、GUS(EC3.2.1 .31：大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼをコードするDNA配列、Jefferson、同上を参照にされたい）のコーディング領域（ノパリンシンターゼポリアデニレーション部位の５’末端に連結している）を、pBIN19のポリリンカー部位中に連結することにより作成した。Bevanら、Nucleic Acids Res.1983,11,369-385、この内容は全部、引用により本明細書に編入する。このベクターpBI101は、独特の制限部位HindIII、SalＩ、XbaＩ、BamHＩおよびSmaIをGUSのAUGイニシエーターコドン上流に含み、ここにプロモーターＤＮＡ断片を都合よく連結できる。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35SプロモーターをHindIIIおよびBamHＩ部位に連結してpBI121を作成した。エクスプラントを次に滅菌水で洗浄し、そして100μg/mlのカナマイシンおよび500μg/mlのカルベニシリンを含有するGamborgのB-5(Gb5)プレートに移した。体細胞胚を６週間以内に観察し、その後それらをホルモンを含まない培地(Gb5)に移してさらに胚を成長させた。さらに４週間後、発根のために胚を1/2X MSに移した。さらに４−８週間後、植物を土壌に移した。形質転換したアルファルファ系のHindIII消化物のサザン分析では、この系が少なくとも１つの完全な6.7kb HindIII挿入物のコピーを含むことが明らかになった（図５）。非形質転換アルファルファ由来のゲノムＤＮＡおよび35S-GUS-NO S構築物を含むpBI121で形質転換したアルファルファ(Jefferson,R.A.同上)を含むレーンには、約７kbの弱いシグナルが見られた。７kb断片は内因性ゲノムＤＮＡに対して交叉ハイブリダイゼーションを表し得る。図５に示すノーザン分析では、トランスジェニックアルファルファ系がBlec4 ゲノムクローンを、頂点に特異的な様式で発現することが明らかである：そのＲＮＡは茎頂に蓄積するが、茎頂の下の葉には広がらない。非形質転換アルファルファおよび35S-GUS-NOS構築物を持つpBI121で形質転換したアルファルファを使用した陰性対照は、使用したハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（5X SSC、30％ホルムアミド、42℃）で、Blecと内因性アルファルファ転写物との間を区別できることを表す。同様な大きさの内因性の転写物は、大変低いストリンジェンシー（5X SSC、42℃）で見られるだけである。トランスジェニックアルファルファ中のBlec4シグナルの強度(図５、レーンａ＋ｂ）は、エンドウ（図５、レーンｐ）に見られる総Blecシグナルよりも低い。この差異はBlec4が多-遺伝子族の一員であるが、この低いBlec4プロモーターおよびコー−サプレッションの本質的活性の可能性は、Blec4遺伝子と内因性アルファルファ遺伝子との相互作用によると言う事実を反映しているのかもしれない(Napoliら、Plant Cell 1990,2,279 -289)。時期および位置依存的な表皮発現 Blecの発現がどのように茎頂の成長および発生と相関しているかをさらに研究するために、Blecおよびいくつかの対照プローブを使用して一連の広範囲なin s itu ハイブリダイゼーションを行った。Matiら、Planta 1993,190,241-246、この内容は全部、引用により本明細書に編入する。これらの実験結果を図１にまとめる。 in situハイブリダイゼーションはMaitiら、同上に従い行ったが、図２に示したデータはXAR5 X-線フィルムに暴露することにより視覚化した点は異なる。組織化学的な位置については以下のように行った。植物材料を90％アセトンに１時間、室温で固定し、そして50mMのリン酸ナトリウム、pH7で２時間洗浄した。植物材料を次にビブロトームで50μmの切片とした。切片を100mMのリン酸ナトリウム、10mMのEDTA、0.5mMのフェリシアン化カリウム、0.5mMのフェロシアン化カリウムおよび1mMの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル−β-D-グルクロニド中で３時間インキューベーションし、そして５％ホルムアミド、50％酢酸および20％エタノールを含む溶液中で10分間固定し、50％エタノールで２分間洗浄し、そして最後に95％エタノールで洗浄して、その後スライド上に置き、そして80％グリセロールをのせた。切片を×10および×40の対物レンズを使用してニコン(Nikon )Photomat顕微鏡で観察し、そしてEktachrome T160フィルムを使用して写真を取った。これらの実験では、Blec RNAが茎頂分裂組織を挟む表皮細胞中で高度に発現するが、茎頂分裂組織の前表皮細胞中には検出できないことを明らかにした。前表皮と誘導された表皮との間の転写レベルの差異は、一つの細胞種内で明らかな調節転移を表している。これは茎頂分裂組織の前表皮とそれから生じるそれを挟んでいる表皮細胞との間の遺伝子−調節の差異を初めて示したことを表す。Blec RNAの蓄積は、これまでに茎頂で特性決定された他のRNAからは区別される。他のRNAは検出できるレベルで前表皮および挟んでいる表皮細胞の両方に蓄積する；ニンジンの茎頂(P.Sterkら、Plant Cell 1991,3,907-921)、およびパキフィタム(Pachyphytum)由来の３つの表皮特異的ｃＤＮＡの場合のように(A.M.Cl arkら、Plant Cell 1992,4,1189-1198)。表皮に限定するわけではないが、茎頂分裂組織内で発現が減少する転写物の他の例は、茎頂全体に高いレベルで存在するナピンおよびRbcS転写物を含み、これらはトマトの栄養茎頂分裂組織内で大いに減少する、J.A.Flemingら、Plant Cell 1993,5,297-309)。表皮中にBlec RNAの特異な蓄積を支配する因子には、おそらく個体発生の、および位置的な要素の両方を含むのだろう。例えば前表皮は茎頂分裂組織の外層を形成するので、前表皮中のBlecレベルの減少は、茎頂分裂組織を規定するための拡散性因子の影響ゾーンに関連するかもしれない。あるいは、前表皮から表皮細胞への転移が、１つの組織層内の発生的進行を規定できる。すなわち、十分に成長した細胞のみが、そしてそれゆえに茎頂分裂組織から十分離れている細胞のみがBlecを発現できることが可能である。さらにBlec発現の調節に関与する因子の解明が、茎頂内の細胞型の分化に関与する過程の理解に、価値を示すはずである。 Blec転写物が最初に蓄積する正確な位置は、発現している葉表面の極性に関連するようである；これは特に、原基が約200-300μm長の時に顕著である。この段階で、転写物は葉原基の向軸表面には検出できないが、向軸表面上に有意なレベルまで蓄積する。この特徴を図１Ａに表す。花の頂点で、表皮内の同様な位置および時期特異的な発現が見られる。したがって、花ドーム（図１Ｂ）および成長している花芽で（図１Ｃ）、Blecは前表皮細胞中には検出できない。栄養原基でのように、Blecは花器官の外面または向軸表面に主に蓄積する。例えば、成長している萼片ではBlecは外表皮に特異的に蓄積し、これは栄養葉の向軸表面に等しい（図１Ｃ）。特に確信的な例は、受粉直後の成長している子房に見られる（図１Ｄおよび２Ｂ）。図２Ａは、受粉数日後の子房を縦軸方向に通る切片を表す。図２Ｂは図２Ａで示す切片のオートラジオグラムを表し、これはBlec RNAが子房の外表皮中に主に蓄積し、そして子房の内表皮にはかなり低いレベルで存在することを明らかにしている。ピサムサチバム(Pisum sativum)の単房からなる子房は、折り畳まれた葉であると考えることができ、外表皮は向軸葉表面に対応し、そして内面は向軸面に対応する。したがって、Blecは葉および萼片のような明らかな葉身形態を持つ構造の本来持つ器官極性だけでなく、子房のような非−葉身−様器官にも反応して蓄積するようである。極性軸は所定の分裂組織への近位性または外部の栄養の影響によるというよりは、器官の２つの面の間に引かれる線により規定される。この極性の性質は未知であるが、器官を通るホルモンまたは機械的勾配のいずれかを表すのかもしれない。子房内で、Blecは成長している胚珠（図２Ｂのｏｖ）中にも蓄積する。各胚珠は少なくとも30-50μM以上の直径である、図２Ｂを参照にされたい。Blecが胚珠表皮細胞中で優先的に発現するか否かを測定することは難しいが、M.S.DobresおよびW.F.Thompson、同上の方法に従い、ノーザン分析により測定される子房および種子成長の後期段階（開花から17-30日後)で、Blec R NAが検出できるレベルではないことは、そのような器官の成熟段階およびその発育段階で他のRNAによるBlec RNAの希釈の可能性を反映していると思われる。比較対照として図２Ｄは、S.GanttおよびJ.L.Key,Eur.J.Biochem,1987,166,11 9-125(引用によりその内容を全部、本明細書に編入する)の方法に従い調製したアンチセンスヒストンH1 RNAを用いてハイブリダイゼーションした後のオートラジオグラムを表し(図２Ｃ)これは発育中の高レベルヒストンH1 RNAおよび低レベルの子房全体を明らかにしている。組換えBlec4 プロモーター−ＧＵＳ構築物の構築５’上流配列が外来タンパク質の発現を植物中で支配できるのかを決定するために、以下の構築物を作成した：Blec4遺伝子の5'上流配列に対応する2.8kbの断片を、PCRプロトコール、方法および応用のガイド(PCR Protocols,A Guide to M ethods and Applications )、Innis,M.A.ら、編集、アカデミック出版(Academic Press)、サンディエゴ、カリフォルニア州、1990（引用によりその内容全部を、本明細書に編入する）に記載されている方法に従い、Taqポリメラーゼおよび２つのヌクレオチドプライマー、５′ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３′ および５′ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴＴＧ３′（それぞれ配列番号３および４で説明する）を使用して、ポリメラーゼ増幅によりp29H6からサブクローン化した。この断片をHindIIIおよびBamHＩで消化し、そしてHindIIIおよびBamHＩで消化した植物バイナリーベクターpB101(Jeffersonら、同上)に連結して、ベクターpBlec4-GUSを作成した。クローニング法は図６に表す。Blec ４プロモーターがトランスジェニック植物中で細菌タンパク質の表皮特異的発現を支配できる証明構築物pBlec4-GUSを、上記の形質転換法を使用してアルファルファRegenSYを形質転換するために使用した。トランスジェニックアルファルファ中のpBlec4-G US活性の組織化学的位置は、Blec4プロモーターがβ-グルクロニダーゼ、外来タンパク質、の発現をトランスジェニックアルファルファの表皮に向けることを明らかにしている。組織化学的な位置付けは以下のように行った。植物材料を90％アセトンで１時間、室温で固定し、そして50mMリン酸ナトリウム、pH７で２時間洗浄した。植物材料をビブロトームで50μM厚の切片にした。次に切片を100mMリン酸ナトリウム、10mM EDTA、0.5mM フェリシアン化カリウム、0.5mM フェロシアン化カリウムおよび1mM 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドで３時間インキューベーションし、そして５％ホルムアルデヒド、５％酢酸および20％エタノールを含む溶液中で10分間固定し、50％エタノールで２分間洗浄し、そして最後に95％エタノールで洗浄した後、スライド上に置き、そして80％グリセロールをのせた。切片を×10およひ×40の対物レンズを用いてニコンPhotom at 顕微鏡で観察し、そしてEktachrome T160フィルムを使用して写真をとった。図７ＡおよびＢに示すように、染色はトランスジェニックアルファルファの表皮中で優先的に観察された。幾つかの異なる発育段階で発現レベルを調査した。染色は体細胞胚中で観察され(図７Ｃ)、これは接合子の胚発生中の発育している種子に外来タンパク質を標的させるためのBl ec4プロモーターの利用性を実証している。優先的な活性も若い苗木および古い植物の苗条先端で観察され、これは成長している苗条先端に外来遺伝子を標的するためのBlec4プロモーターの利用性を実証している。この組織化学的法を使用して、β-グルクロニダーゼ活性は開いた葉または成熟した幹材料からは検出されなかった。Blec4 プロモーターが茎頂へ高レベル発現を向けることを証明トランスジェニックアルファルファ中でのBlec4プロモーター−GUS構築物の発現を定量するために、基質4-メチルウンベリフェリル-B-D-クルクロニド(MUG)を使用した。GUSはMUGを蛍光発光誘導体4-メチルウンベリフェロン(MU)に加水分解する。このように、Blec4プロモーター−GUS構築物の活性は蛍光的に定量できる。定量 GUS活性アッセイ：蛍光測定アッセイ用に、約100mgの植物組織を滅菌ガラスビーズの存在下で、100μlのGUS抽出緩衝液(500nM NHPO₄、pH7.0、10mM B-メルカプトエタノール、10mM Na₂EDTA、0.1％サルコシル、0.1％ Triton X-100)で摩砕し、そして10,000r.p.m.で10分間、マイクロ遠心機中で遠心した。上清を新しい試験管に取り出した。上清を-80℃に保存した。反応は20μgの全タンパク質抽出物、20％メタノール、1mM 4-メチルウンベリフェリル-B-D-グルクロニド(MUG) を含む全200μl容量をGUS抽出緩衝液中で、37℃にて２時間行った。反応を800μ lの0.2M Na₂CO₃で停止した。MU蛍光は355nmの励起波長および455nmの放出波長で測定した。蛍光の読み取りは、既知濃度の一連のMU標準の蛍光を測定することによりピコモルに換算した。図８は、トランスジェニックアルファルファの芽および葉（頂点の芽から第５節下から取った）のタンパク質抽出物について行ったアッセイ結果を表す。示した値は、各種類の組織について行った３回の別個のアッセイの平均を示す。Blec4プロモーターは、茎頂から第５節下の成熟した開いた葉の中よりも、トランスジェニックアルファルファの芽の頂点中に約８倍高いレベルで発現することが分かる。種子レクチンとの相同性エンドウ種子レクチン(PSL)は、種子発育中に高度に発現する(Higgins,T.J.V. ら、J.Biol.Chem.1983,258,9544-9549)。BlecとPSLとの間に相同性があると仮定すれば、両遺伝子の相対的発現パターンを確立することだけでなく、Blecおよび PSLプローブがそれら各々の転写物に特異的であるかどうかを確立することも重要である。このためにM.S.DobresおよびW.F.Thompsonの方法に従い、茎頂および発育している種子に由来するRNA試料のノーザンブロットを、BlecおよびPSL cDN Aで別個に釣り上げた。この結果は明らかに、ノーザン分析で測定したように（ａ）Blecは発育している種子中で検出できるレベルまで蓄積せず、そして（ｂ）種子レクチン転写物は茎頂で検出できる種子レベルまで蓄積しないことを示す。さらにいずれのプローブも他の遺伝子の転写物と交叉ハイブリダイズしなかった。この結果はまたエンドウの薄い茎頂切片に対してハイブリダイズするとき、in situハイブリダイゼーションのレベルで、任意の検出できるシグナルで確認された。 Blecの発現パターンは、組織および器官発育中に特異的な発生の出来事に関与する難解な発生の合図に反応していることを示唆している。Blec遺伝子は、植物表皮の発育中に起こる調節過程を理解するために必須な道具として有用であることが示されるだろう。上記に説明したPSLとの相同性に基づき、PSLに対して生成された抗体はBlecタンパク質を認識すると予想された。さらに上記に説明した相同性に基づき、植物中に存在するBlecタンパク質は糖および他の炭化水素と結合すると予想された。この予想を以下の精製法の基礎として使用した。エンドウ茎頂からBlecの精製エンドウ種子レクチンの栄養相同体を検出するために、抗−エンドウ種子レクチンを使用して頂点の芽、開いた葉および種子由来の抽出物を釣り上げた。抽出物はSDS-PAGE電気泳動により分離し、そしてニトロセルロース上に固定した。オーストラリア、キャンベラのCSIROのT.J.Higginsから得たエンドウ種子レクチン抗血清の1:500希釈物を、膜と反応させた。交叉反応タンパク質をアルカリ−ホスファターゼ結合第２抗体で視覚化した。図９は発色後の膜を表す。レーン１の芽の抽出物は、39kdバンドおよび幾つかの14-18kdの低分子量バンドを表す。この39kdバンドはBlecのグリコシル化状態を表すと考えられる(25kdに2-3のグリコシル化部位が加わった)。14-18kdバンドは、完全長タンパク質の分解生成物を表すと考えられる（この14-18kdバンドはタンパク質がフェチュインカラムで精製されるときには見られない、したがってBlec分子の完全なものの一部、または正しく折り畳まれた状態を形成しているとは考えられない。開いた葉の抽出物は、 39kdバンドについてより弱いシグナルを表す、図９、レーン２を参照にされたい。図９のレーン３において、種子の抽出物は26kdバンド（種子-レクチン前駆体）および17kdバンド(エンドウ種子レクチンのベータサブユニット)を表した。種子レクチンは一本のポリペプチドとして合成され、これはそれぞれ17kdおよび6kdのベータおよびアルファサブユニットにプロセッシングされる(Higginsら、1983)。この6kd サブユニットについては、抗血清は6kd配列が内面にある天然のエンドウ種子レクチンに対して作成されているので、エンドウ種子レクチン抗血清とは交叉反応しない。種子レクチン抗体により認識される芽の抽出物中のエピトープは、Blec の領域を形成している保存されたベータ鎖を表しているのだろう。 39kdタンパク質を精製し、そして同一性を確認するために、エンドウの茎頂抽出物をフェチュインアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。フェチュインは、広範なＮ−結合またはＯ−結合グリカンを有する糖タンパク質であり、レクチンの広い範囲のアフィニティカラムとして作用するので選択した。30-80 ％の硫酸アンモニウム画分を5mlのフェチュインカラムに添加し、カラムを10mM リン酸 10mM 塩化ナトリウムを用いてカラム容量で数回、素通りの吸収がゼロ付近になるまで洗浄した。次に結合したタンパク質を150mM NaClを使用して溶出した。溶出したタンパク質をSDS-page電気泳動で分析した、図１０Ａ。図１０Ａで、レーン１は150mMの溶出画分が約39kdの主要バンドを含むことを示す。同一ゲルのウエスタンブロットを、抗−エンドウ種子レクチン抗血清を用いて釣り上げた。エンドウ種子シレクチン抗血清は、全抽出物、30-80％ＡＳ画分、10mM NaCl 素通り、および150mM溶出物中の39kdタンパク質に対して強く反応した。図１０Ｃ、レーン１の抗体プロービング前にブロットのポンソーＳ染色により証明されるように、図９、レーン１の39kdバンドのシグナルの減少は、このレーンへの不注意の添加によるものである。より高塩洗浄（0.5M NaCl、およびグルコース、ガラクトースまたはＥＤＴＡの添加）では、さらに検出し得るタンパク質をフェチュインカラムから溶出できなかった。全抽出物(10μg)由来のフェチュイン精製タンパク質の同一性を決定するために、ペンシルバニア大学のタンパク質化学研究室によるN-末端配列分析に供した。図１１はN-末端配列(図１１の39kd)がBlec cDNA配列由来の予想されたN-末端と合うことを示す。このマメレクチンのＮ末端は、高度な可変領域を表し、Blec およびエンドウ種子レクチン(PEA)、ならびに今日までのすべての他のレクチン配列とを識別するために使用できる。上記のタンパク質データは、Blec（39kdのタンパク質により表されるような）が頂点に特異的なタンパク質として蓄積し、そしてフェチュイン−アガロースカラムに結合するその能力により判断されるように、糖結合物に結合することができることを示すが、Blecのフェチュインカラムへの結合はまた、イオンまたは疎水性相互作用のような他の化学的または物理的相互作用によっても媒介されることも可能であることを示している。 39kdタンパク質のフェチュインへの糖依存性を調査し、そして39kdタンパク質のフェチュインカラムからの溶出は、10mM リン酸塩および10mM NaClに溶解した 0.2Mのガラクトースでは成功しなかった。10mM リン酸塩および10mM NaClに溶解したそれぞれ0.2Mのグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびラノミースの別個の溶出も成功しなかった。これらの単糖および二糖がBlecをカラムから溶出できないことは、Blecが植物の糖タンパク質または細胞壁に存在するようなオリゴサッカライドまたは複合糖に結合し、そしてBlecが単糖に対して低い親和性を有し、かつ／またはBlecのフェチュインへの結合がフェチュインとBlecの保存された疎水性ポケットとの間の疎水性相互作用により媒介されることを示しているのかもしれない。いずれの場合でも、Blecはフェチュイン−アガロースカラムに選択的に留まっている。この相互作用はBlecが植物細胞の糖タンパク質および／または多糖成分に結合する能力を反映している。大腸菌中でのGST-Blec融合タンパク質の過剰発現長い間、Blecの構造−機能研究には豊富な組換えタンパク質供給源、およびBl ec 特異的抗体の定められた組が必要であった。Blecは大腸菌でGST-融合タンパク質として成功裏に発現した。予想される成熟Blecタンパク質に対応するDNA断片を、Pfuポリメラーゼを使用してBlec1 cDNAからポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。プライマーは断片が枠内でpGEX2T(ファルマシア:Pharmacia)のBamHＩおよびEcoRIクローニング部位中にクローン化できるように設計した。クローニング部位は、taqプロモーター、部分的グルタチオンS-トランスフェラーゼ配列、およびトロンビン開裂部位の下流にある。このtaqプロモーターは枠内でそれに結合しているGST配列発現のIPTG誘導を可能にする。GST配列はグルタチオン−Se pharoseカラムで融合タンパク質の精製を可能にする。トロンビン開裂部位はBle c からGST配列の除去を可能にする。この系は抗体生産用の抗原を発現するために使用された。図１２は、大腸菌溶解物のペレットおよび可溶性画分の、誘導と非誘導培養物との間の比較を表す。GST−Blec1融合タンパク質は誘導された培養物中で高度に発現し、そして主に50kdタンパク質としてペレット画分に蓄積する（ 27kdのGSTおよび25kdのBlec、図１２、レーン１を参照にされたい）。GST−Blec 1 融合タンパク質はグルタチオン−Sepharoseを使用して精製でき、そしてBlec抗血清の生産に有用である。このタンパク質は植物の殺カビ剤、殺菌剤、殺虫剤および／または抗菌剤として有用であり；または特定のヒト、動物、菌類または植物細胞の種類を精製または同定するための手段として有用である。本明細書に表し、そして記載したものに加えて、種々の変更が前述の記載から当業者には明らかであろう。そのような変更も、添付の請求の範囲内にあるものと考える。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９６年２月２日【補正内容】請求の範囲１．Blecプロモーター配列の全部または一部に実質的に類似する配列および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る核酸構築物。２．遺伝子が、キチナーゼ；グルカナーゼ；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン；α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカノイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の構築物。３．上記エンドトキシンがバチルズツリンギエンシス(Bacillus thuringiensi s )のエンドトキシンである請求の範囲第２項に記載の構築物。４．上記遺伝子が、昆虫、ウイルス、細菌、菌類および疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。５．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。６．ａ．植物を提供し、ｂ．Blecプロモーターの全部または一部および遺伝子の構築物を調製し、これによりプロモーター−遺伝子構築物を生成し、そしてｃ．該植物を該プロモーター−遺伝子構築物を用いて形質転換させ、これにより形質転換植物を生成する、ことを含んで成る植物を形質転換する方法。７．上記植物が培養物中で形質転換される、請求の範囲第６項に記載の方法。８．上記植物が、バラ科、トウダイグサ科、ナデシコ科、ナス科、イワタバコ科、ツリフネソウ科、ラン科、キク科、フウロソウ科、ユリ科、クワ科、サトイモ科、マメ科、イネ科、セリ科から成る群から選択される科に由来する、請求の範囲第６項に記載の方法。９．Blecプロモーターの全部または一部、およびキチナーゼ；グルカナーゼ；アレセリン；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン、α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカロイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含んで成るベクター。１０．上記エンドトキシンがバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringien sis )のエンドトキシンである請求の範囲第９項に記載のベクター。１１．上記遺伝子が、昆虫、ウイルスおよび疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１２．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１３．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物細胞。１４．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物細胞培養物。１５．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物、植物種子または植物培養物。１６．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る少なくとも１つの細胞を有する植物。１７．Blecプロモーターの全部または一部およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る植物細胞。１８．Blecプロモーターの全部または一部およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る少なくとも１つの植物細胞を有する植物。１９．ａ．植物を提供し、ｂ．Blecプロモーターの全部または一部および遺伝子の構築物を調製し、これによりプロモーター−遺伝子構築物を生成し、そしてｃ．該植物を該プロモーター−遺伝子構築物を用いて形質転換させ、これにより形質転換植物を生成する、ことを含んで成る植物の形質転換法により調製される植物。２０．配列番号１の全部または一部から本質的に成る単離プロモーター。２１．配列番号１の全部または一部に実質的に類似する配列から本質的に成る単離プロモーター。２２．上記プロモーターが表皮細胞特異的である、請求の範囲第２０または２１項に記載のプロモーター。２３．Blecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物抽出物。２４．Blecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下の遺伝子を有する抽出物を含んで成る核酸の転写法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月２４日【補正内容】請求の範囲１．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片、および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る核酸構築物。２．遺伝子が、キチナーゼ；グルカナーゼ；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン；α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカノイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の構築物。３．上記エンドトキシンがバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringiensi s )のエンドトキシンである請求の範囲第２項に記載の構築物。４．上記遺伝子が、昆虫、ウイルス、細菌、菌類および疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。５．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。６．ａ．植物を提供し、ｂ．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片、およびヘテロロガス遺伝子の核酸構築物を調製し、これによりプロモーター− 遺伝子構築物を生成し、そしてｃ．該植物を該プロモーター−遺伝子構築物を用いて形質転換させ、これにより形質転換植物を生成する、ことを含んで成る植物を形質転換する方法。７．上記植物が培養物中で形質転換される、請求の範囲第６項に記載の方法。８．上記植物が、バラ科、トウダイグサ科、ナデシコ科、ナス科、イワタバコ科、ツリフネソウ科、ラン科、キク科、フウロソウ科、ユリ科、クワ科、サトイモ科、マメ科、イネ科、セリ科から成る群から選択される科に由来する、請求の範囲第６項に記載の方法。９．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片、およびキチナーゼ；グルカナーゼ；アレセリン；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン、α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカロイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含んで成るベクター。１０．上記エンドトキシンがバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringien sis )のエンドトキシンである請求の範囲第９項に記載のベクター。１１．上記遺伝子が、昆虫、ウィルスおよび疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１２．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１３．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物細胞。１４．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物細胞培養物。１５．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る植物、植物種子または植物培養物。１６．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る少なくとも１つの細胞を有する植物。１７．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る植物細胞。１８．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る少なくとも１つの植物細胞を有する植物。１９．ａ．植物を提供し、ｂ．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片およびヘテロロガス遺伝子の構築物を調製し、これによりプロモーター−遺伝子構築物を生成し、そしてｃ．該植物を該プロモーター−遺伝子構築物を用いて形質転換させ、これにより形質転換植物を生成する、ことを含んで成る植物の形質転換法により調製される植物。２０．配列番号１から成る単離プロモーター。２１．配列番号１または表皮特異的活性を有するその断片の単離プロモーター。２２．上記プロモーターが表皮細胞特異的である、請求の範囲第２０項に記載のプロモーター。２３．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片、および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んて成る植物抽出物。２４．ａ．植物に由来する無細胞抽出物を提供し、ｂ．配列番号１のBlecプロモーター配列または表皮特異的活性を有するその断片および該プロモーターの制御下のヘテロロガス遺伝子を含んで成る構築物を調製し、そしてｃ．ａの抽出物をｂの構築物とインビトロ転写に適する条件下で混合することを含んで成る、インビトロ核酸転写法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．Blecプロモーター配列の全部または一部に実質的に類似する配列および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る核酸構築物。２．遺伝子が、キチナーゼ；グルカナーゼ；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン；α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカノイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の構築物。３．上記エンドトキシンがバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringiensi s )のエンドトキシンである請求の範囲第２項に記載の構築物。４．上記遺伝子が、昆虫、ウイルス、細菌、菌類および疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。５．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の構築物。６．ａ．植物を提供し、ｂ．Blecプロモーターの全部または一部および遺伝子の構築物を調製し、これによりプロモーター−遺伝子構築物を生成し、そしてｃ．該植物を該プロモーター−遺伝子構築物を用いて形質転換させ、これにより形質転換植物を生成する、ことを含んで成る植物を形質転換する方法。７．上記植物が培養物中で形質転換される、請求の範囲第６項に記載の方法。８．上記植物が、バラ科、トウダイグサ科、ナデシコ科、ナス科、イワタバコ科、ツリフネソウ科、ラン科、キク科、フウロソウ科、ユリ科、クワ科、サトイモ科、マメ科、イネ科、セリ科から成る群から選択される科に由来する、請求の範囲第６項に記載の方法。９．Blecプロモーターの全部または一部、およびキチナーゼ；グルカナーゼ；アレセリン；エンドトキシン；レクチン；フェニルアンモニアリアーゼ；リゾチーム；リボゾーム−不活化タンパク質；細胞壁タンパク質；ＲＮアーゼ；リボザイム；アルセリン、α-アミラーゼインヒビター；Blec；プロテアーゼインヒビター；フェニルプロパノイド経路、リグニン重合、アルカロイド生合成、テルペン生合成、セルロース生合成、植物クチクラ生合成および脂質生合成に関与する酵素から成る群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含んで成るベクター。１０．上記エンドトキシンがバチルスツリンギエンシス(Bacillus thuringien sis )のエンドトキシンである請求の範囲第９項に記載のベクター。１１．上記遺伝子が、昆虫、ウイルスおよび疾患に対する耐性の変化をコードする配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１２．上記遺伝子が、増大した香、花弁色素、色の明るさ、成長速度およびより長い花の寿命に関する配列から成る群から選択される配列をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクター。１３．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る植物細胞。１４．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る植物細胞培養物。１５．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んて成る植物、植物種子または植物培養物。１６．Blecプロモーターの全部または一部および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る少なくとも１つの細胞を有する植物。１７．Blecプロモーターの全部または一部およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列を含んで成る植物細胞。１８．Blecプロモーターの全部または一部およびBlecプロモーターの制御下に外来タンパク質のアミノ酸配列を含んで成る少なくとも１つの植物細胞を有する植物。１９．請求の範囲第６項に記載の方法により調製された植物。２０．配列番号１の全部または一部から本質的に成るプロモーター。２１．配列番号１の全部または一部に実質的に類似する配列から本質的に成るプロモーター。２２．上記プロモーターが表皮細胞特異的である、請求の範囲第２０または２１項に記載のプロモーター。２３．Blecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下の遺伝子を含んで成る植物抽出物。２４．Blecプロモーター配列の全部または一部、および該プロモーターの制御下の遺伝子を有する抽出物を含んで成る核酸の転写法。