JPH10504529A

JPH10504529A - 肺細胞及び血管細胞への肺炎球菌粘着のモジュレーター並びに診断及び治療上の適用

Info

Publication number: JPH10504529A
Application number: JP8501290A
Authority: JP
Inventors: エレインアイテューマネン; ダイアナアールカンデル
Original assignee: ザロックフェラーユニヴァーシティ
Priority date: 1994-06-06
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1998-05-06
Also published as: MX9606167A; AU711947B2; AU2768395A; WO1995033467A2; EP0802794A1; US5665561A; WO1995033467A3; CA2191960A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、肺炎球菌感染症を予防するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、肺内皮及び血管内皮への肺炎球菌粘着の最小レセプター標的の同定及びかかる粘着を予防するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、粘着S.ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な１種又は複数種の次のモチーフ：二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフ、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフ及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを有する１種以上の糖質因子の能力に関する。特に、３種全てのモチーフを含む組成物は、肺上皮細胞及び静脈内皮細胞から約１００％の肺炎球菌を溶離することができる。具体的な実施態様においては、本発明の医薬組成物は、該宿主細胞が肺上皮細胞である肺炎球菌感染症の治療に用いられる。肺上皮細胞への粘着を阻止するか又は粘着細菌を肺上皮細胞から溶離するのに使用するための該医薬組成物はエアゾル剤である。本発明は、更に、静脈内皮細胞への結合を予防又は溶離することによる全身性血行性感染症の治療に非経口投与するための製剤を提供する。本発明は、更に、患者からの生物試料において肺炎球菌の存在を求めるための方法及びキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】肺細胞及び血管細胞への肺炎球菌粘着のモジュレーター並びに診断及び治療上の適用本発明に至る研究は、国立アレルギー及び感染症研究所から与えられた補助金第R01-A1-27913号によって一部支えられたものである。本発明のある一定の権利は政府が所有するものである。発明の分野本発明は、肺炎球菌感染症を予防するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、肺内皮及び血管内皮への肺炎球菌粘着標的の同定及びその粘着を予防するための組成物及び方法に関する。発明の背景ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)は、発展途上国の子供たちにおいて細菌性肺炎の最も高頻度の原因であり、成人においては７６％までの原因とみなされている(Pennington，1986，Am．Fam．Physician 3353 ; Johnston，1991，Revs．Infect．Dis．13(Suppl．6):S509; Musher，1992，Ｃ lin．Infect．Dis．14:801）。肺炎球菌は、一般に、そこで上皮細胞に付着する鼻咽腔を通って宿主に入り、ある場合には、数ヵ月間持続する(Andersonら，198 1，Infect．Immun．32:311)。実験モデルにおいては、肺炎への進行は、肺炎球菌のエアゾル化による拡散及び鼻咽腔から下部気道への輸送に起因する。肺炎の初期の病変は、肺炎球菌を含む液体の充満した肺胞が特徴であり、肺炎球菌は肺胞壁に並んでいるのがよく見られ、特定の相互作用を暗示する分布が肺胞間隙の保持を促進する(Wood，1941，J．Exp．Med．73:222)。肺炎球菌は、肺胞間隙から血液循環に接近しやすく、肺胞毛細血管の血管上皮細胞を交差する攻撃力を示している(Rake，1936，J．Exp．Med．63:191)。真核細胞への細菌粘着には、一般に、宿主細胞の複合糖質を認識する特定の細菌タンパク質（接着物）が必要である。肺炎球菌のヒトロ腔上皮への粘着は、二糖Ｎ−アセチル−グルコサミン−β１−３−ガラクトース（ＧｌｃＮＡｃβ１− ３Ｇａｌ）の存在下に阻止され、その糖質はおそらく鼻咽頭輸送に適切なレセプターとして働くことができることを示している（Andersonら，1983，J．Exp．Me d．158:559）。細胞の種類が肺胞間隙において肺炎球菌粘着を支持することは正確には依然として不明である。肺炎球菌は、末端又は内部ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌを含む精製複合糖質、肺分泌物及び肺組織において一般的な構造に結合することが報告された(Krivanら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6157)。その構造は、鼻咽頭レセプターとして提唱したものと立体化学が著しく異なっている。鼻咽腔及び肺への付着を仲介することができる肺炎球菌接着物の同定は不明である。実験菌血症を引き起こしやすい能力と一致して、血管内皮細胞への肺炎球菌粘着は、用量依存性であり、迅速でありかつ莢膜型に依存しないことが示された(Geelenら，1993，Infec．Immun．61:1538)。細胞壁成分とタンパク質成分の双方がほぼ等しくその会合に寄与するが、特定の肺炎球菌リガンドは依然として同定されていない(Tuomanenら，1985，J．Infect．Dis．151:859)。本明細書中の参考文献の引用は、本発明に対する従来技術であることを許容するものとして解釈されるべきではない。発明の要約最初の態様においては、本発明は、粘着ストレプトコッカス・ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質の用量を含む医薬組成物に関する。該二糖は、マンノースに結合される。本発明の医薬組成物の糖質成分は、肺炎球菌の宿主細胞、特に肺上皮細胞及び血管内皮細胞への結合を競合的に阻害することができる。本明細書中で“接着”と呼ばれる肺炎球菌結合の競合阻害は、感受性のある宿主細胞の肺炎球菌によるコロニー形成を防止することができ、宿主細胞から粘着肺炎球菌を溶離することもできる。従って、本発明の具体的な利点は、抗生物質に依存しない肺炎球菌の治療を提供することである。更に詳細には、本発明は、抗生物質耐性菌及び多抗生物質耐性菌の治療に有効であることができる。また、本発明の医薬組成物及び方法は、肺炎球菌感染の疑いがある感染又は肺炎球菌感染であることがわかった感染を治療するために抗生物質と共に用いることができる。好適実施態様においては、本医薬組成物は、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質の用量を含んでいる。この第２群もマンノースに結合される。本発明の発見は、更に、活性化した宿主細胞が肺炎球菌接着に対して別の糖質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を示すというものである。従って、他の好適実施態様においては、本医薬組成物は、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質の用量を含んでいる。最適実施態様においては、本発明の医薬組成物は、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な３種の糖質、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質の各々の用量を含んでいる。特に、本組成物は、肺炎球菌のほぼ１００％を肺上皮細胞及び静脈内皮細胞から溶離することができる。本発明者らは、追加の糖質群を本発明の組成物に含めることができることを見出した。例えば、本発明の組成物は、これらに限定されないが肺炎球菌の宿主細胞への結合を阻害するのに有効なマンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、マンノース−Ｄ−マンノース及びメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドの１種以上の用量を更に含むことができる。好適態様においては、本糖質は、多重の肺炎球菌結合モチーフを含む。即ち、本糖質は多価性である。１実施態様においては、糖質は１モチーフの多価性である。他の実施態様においては、糖質は１を超えるモチーフを含み、各々が多価性であることができる。多価性は、分枝複合オリゴ糖を用いて達成される。また、一価の糖質は、タンパク質、シクロデキストラン、ポリリシン、ポリアクリルアミド、アガロース、セファロース等の高分子担体に結合される。好ましくは、２０〜３０のかかるモチーフが各高分子に結合される。個々の実施態様においては、本発明の医薬組成物は、宿主細胞が肺上皮細胞である肺炎球菌感染症の治療に用いられる。肺上皮細胞への粘着を阻止するのに又は肺上皮細胞から粘着細菌を溶離するのに使用するための本医薬組成物は、分散媒を含有するエアゾル剤である。例えば、分散媒は界面活性剤とすることができる。個々の１実施態様においては、エアゾル剤は、乾燥粉末エアゾル剤であり、１種又は複数種の糖質は微細な粉末として存在している。他の実施態様においては、エアゾル剤は液体エアゾル剤であり、薬学的に許容しうる希釈剤を含んでいる。可能な希釈剤としては、滅菌水、食塩水、緩衝化食塩水及びデキストロース溶液が挙げられるがこれらに限定されない。本発明は、更に、宿主細胞が血管内皮細胞である血液中に拡散した肺炎球菌感染症を治療するために用いられる医薬組成物に関する。血液の肺炎球菌感染は、かなりの頻度で肺感染を伴い、敗血症、菌血症及び髄膜炎のようなこれらに限定されない致命的な合併症をまねくことがある。即ち、本発明は、血液中に拡散した肺炎球菌感染症を治療するために血液中に注入する、特に静脈内に注入するための医薬組成物に関する。従って、本発明は、S. ニューモニエによる感染症の予防又は治療方法であって、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ− アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む糖質をかかる治療を必要としていると思われる患者に投与することを特徴とする方法に関する。好適実施態様においては、本方法は、更に、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む第２糖質を投与することを特徴とする。他の好適実施態様においては、本発明は、更に、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む第３糖質の用量を投与することを特徴とする。最適実施態様においては、本方法は、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む糖質、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む第２糖質及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む第３糖質の３種の糖質の各々を投与することを特徴とする。上述したように、本発明は、特に、肺上皮細胞の感染を治療することに関する。従って、S. ニューモニエによる感染症の治療方法は、１種又は複数種の糖質を噴霧及び吸入させることを特徴とする。好ましくは、噴霧は、吸入されやすい音波処理煙霧を生じるネブライザーを用いる。本発明は、特にまた、血液の感染症の治療に関する。従って、S. ニューモニエによる血液感染症の治療方法は、１種又は複数種の糖質を静脈内に注入することを特徴とする。他の態様においては、本発明は、S. ニューモニエの存在を検出する方法であって、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む糖質の細菌への結合を検出することを特徴とする方法に関する。更に、実施態様においては、肺炎球菌の存在を検出する方法は、二糖Ｎ−アセチル− Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌ群に結合したマンノースを含む第２糖質の細菌への結合を検出することを特徴とする。別の実施態様においては、肺炎球菌の存在を検出する方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む第３糖質の細菌への結合を検出することを特徴とする。最適実施態様においては、S. ニューモニエの存在を検出する方法は、３種全ての糖質の細菌への結合を検出することを特徴とする。本発明によれば、１種又は複数種の糖質は、検出可能に標識される。また、１種又は複数種の糖質は、固相支持体に結合される。図面の簡単な説明図１肺炎球菌の初代ウサギ肺細胞への粘着。Ａ）莢膜をもつＡＩＩの混合肺細胞（○−○）及び精製ＩＩ型肺細胞（■−■）への粘着。Ｂ）莢膜をもつＡＩＩ（■−■）及び同質遺伝子の莢膜をもたないＲ６肺炎球菌（○−○）のＩＩ型肺細胞への結合の比較。両パネルについては、粘着細菌をｃｆｕとして播種しグラム染色で可視化することにより数えた。数値は、６回の実験の平均±ＳＤである。＊ｐ＜０.０５は混合肺細胞に対する。図２肺炎球菌のヒト培養ＩＩ型肺細胞への粘着に対する用量応答曲線（Ａ）及び時間の経過（Ｂ）。用量応答曲線については、ＩＩ型肺細胞を増加濃度のＡＩＩ（■−■）、Ｒ６（□−□）、Ｄ３９（○−○）、１８Ｃ（▲−▲）又は９Ｖ（△−△）と３０分間インキュベートした。時間の経過実験については、ＩＩ型肺細胞を１×１０⁷cfu/ml Ｒ６とインキュベートした。粘着細菌は、１００ＩＩ型肺細胞あたりの付着細菌数として求めた。結果は、少なくとも６回の独立した実験における２ウェルずつの平均±ＳＤである。図３ヒト培養肺細胞（Ａ）及び内皮細胞（Ｂ）への肺炎球菌粘着に関する配列ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ−３Ｇａｌを含む糖脂質の影響。Ｒ６をＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ含有糖脂質［アシアロ−ＧＭ２（・−・）又はアシアロ−ＧＨＭ１(○−○)]又はＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ含有糖脂質[フォルスマン糖脂質（□−□）又はグロボシド(■−■)]とインキュベートした。粘着細菌は、１００肺細胞又は内皮細胞あたりの付着細菌数として求めた。糖の非存在下の対照粘着は、水平線（−−−）で示されている。結果は、少なくとも６回の独立した実験における２ウェルずつの平均±ＳＤである。図４グロボシド、アシアロ−ＧＭ２及び精製肺炎球菌細胞壁の抗粘着作用。Ａ）Ｒ６をアルブミンバッファー（−−−）、グロボシド（■−■）又はアシアロ−ＧＭ２（・−・）或いはアシアロ−ＧＭ２＋グロボシドの組合わせ(◆−◆) ；表示した最終濃度は２種の糖から等しく構成された）とインキュベートし、ＩＩ型肺細胞単層に付着させた。＊ｐ＜０.０５はアシアロ−ＧＭ２又はグロボシド単独と比較した。Ｂ）単層を肺炎球菌細胞壁（５０μg/ml）或いはアルブミンバッファーとインキュベート（３０分、３７℃）した。Ｒ６をアルブミンバッファー（対照）、グロボシド（２mM）或いはアシアロ−ＧＭ２（２mM）とインキュベート（１５分、室温）し、その単層に３７℃で３０分間付着させた。粘着細菌は、１００内皮細胞あたりの付着細菌数として求めた。結果は、少なくとも６回の独立した実験における２ウェルずつの平均±ＳＤである。細胞壁は対照より顕著に少なかった。＊は、細胞壁より顕著に少なかった（ｐ＜０.０５）。図５培養ヒトＩＩ型肺細胞及び内皮細胞上の２種類の別個のレセプター（Ａ、Ｂ）への肺炎球菌粘着に関与した糖質レセプターの最小構造。太字でタイプした線で囲った領域は、肺炎球菌のＩＩ型肺細胞又は内皮細胞への粘着に要した活性な最小レセプター単位を表す。下線を引いた構造は、両方の種類の細胞に不活性である。略語は後記表１の通り。図６静止Ｒ６並びにサイトカイン刺激ヒト培養ＩＩ型肺細胞（Ａ）及び血管内皮細胞（Ｂ）の粘着に関する単糖の影響。Ｒ６(１０⁷cfu/ml)を種々の単糖に曝露（１５分間、室温）し、次に細胞の静止（白いバー）或いはサイトカイン剌激（黒いバー）単層と３０分間同時インキュベートした。指定した糖への肺炎球菌粘着は、糖の非存在下の１００宿主細胞への細菌粘着−糖の存在下の１００宿主細胞への細菌粘着として定義した。結果は、少なくとも６回の独立した実験における２ウェルずつの平均±ＳＤである。Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコース；Ｇａｌ＝Ｄ −ガラクトース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン；Ｍａｎ＝Ｄ− マンノース；ＮＡＮＡ＝シアル酸；Ｌａｃ＝ラクトース；及び２−ＡＤＧＧ＝２ −アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−ガラクトピラノース。図７サイトカイン刺激単層上の肺炎球菌複合糖質レセプター。ＧａｌＮＡｃ β１−４Ｇａｌ集団に粘着する肺炎球菌数は、アシアロ−ＧＭ２（□−□）で定義し、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ集団に粘着する肺炎球菌数は、グロボシド（ ◇−◇）で定義した。１種以上のレセプターにおいて糖質特異性が含まれるかを定義するために、ＧｌｃＮＡｃ（○−○）＋グロボシド（◆−◆）或いはアシアロ−ＧＭ２（■−■）の２成分混合物の各々の糖単独より大きい程度まで肺炎球菌粘着を減じる能力を評価した。試験組成物は、試験した単一糖又は同量の２種の糖を含有した。ＴＮＦα刺激単層への対照粘着は、綾目線（−−−−）で示されている。＊ｐ＜０.０５はアシアロ−ＧＭ２又はＧｌｃＮＡｃ単独と比較した。各々の指定した糖への肺炎球菌粘着は、糖の非存在下の１００宿主細胞への細菌粘着−糖存在下の1００宿主細胞への細菌粘着から求めた。結果は、少なくとも６回の独立した実験における２ウェルずつの平均±ＳＤである。発明の詳細な説明本発明は、S. ニューモニエによる感染症を治療又は予防するための組成物及び方法に関する。本発明は、肺炎球菌が少なくとも３種類の異なる糖質モチーフを認識及び結合するという発見に基づくものであり、それらのうちの２種類は本発明の以前には認識されていなかった。個々の実施態様においては、本発明は、肺上皮細胞から肺炎球菌の接着を阻止すること又は肺上皮細胞から粘着肺炎球菌を溶離することを提供する。本発明者らは、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ群を含む糖質モチーフが肺炎球菌に結合することを発見した。そのモチーフは、以前には肺炎球菌と相互作用することが不明であった。更に重要なことに、本発明者らは、肺炎球菌が１を超える糖質特異性を有しかつかかる特異性の１つだけの糖質への結合を阻害することが細菌を定量的に溶離することができないことを発見した。即ち、本発明の好ましい組成物及び方法を用いて定量的溶離（又は粘着の防止）が達成された。本発明をより理解するために、いくつかの語句の定義が下記に示される；本発明−−糖質の態様；治療用組成物及び方法；診断用組成物及び方法；及び実施例も示される。 “Ａ”(ここで“Ａ”は単一のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター等)を含む組成物は、組成物中少なくとも約７５重量％のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター（Ａ及びＢが属する種類のカテゴリーに左右される）が“Ａ”である場合、実質的に “Ｂ”(ここで“Ｂ”は１種以上の混入するタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター等)を含まない。好ましくは、“Ａ”は、組成物中Ａ＋Ｂの物質の少なくとも約９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９９重量％を含んでいる。また、実質的に混入を含まない組成物は、問題の物質の活性又は特性を有する単一の分子量物質のみを含むことが好ましい。 “薬学的に許容しうる”という語は、生理的に許容しかつヒトに投与した場合に典型的には胃の不調、めまい等のアレルギー又は同様の困った反応を生じない分子物質及び組成物を意味する。好ましくは、本明細書に用いられる“薬学的に許容しうる”という語は、連邦政府又は州政府の統制機関によって承認された又は米国薬局方又は動物、特にヒトに使用するための他の一般に認知された薬種に載っていることを意味する。“担体”という語は、化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又は伝達体を意味する。かかる医薬担体は、石油、動物、植物又は合成由来のものを含む落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の水及び油のような滅菌液体とすることができる。水又は水溶液、塩類溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射用溶液の担体として用いられることが好ましい。本明細書に用いられる“宿主細胞”という語は、肺炎球菌によってコロニーを形成することができる細胞、例えば、肺上皮細胞及び静脈内皮細胞を意味する。本明細書に用いられる“肺投与”という語は、本発明の製剤の吸入による肺への投与を意味する。本明細書に用いられる“吸入”という語は、空気の肺胞への吸い込みを意味する。個々の例においては、吸入しつつ本発明の製剤の自己投与又はレスピレーターを介して、例えば、レスピレーターによる患者への投与によって吸い込みが生じる。本発明の製剤について用いられる“吸入”という語は、“肺投与”と同義である。本明細書に用いられる“非経口”という語は、肺炎球菌に結合する糖質を腸以外、特に静脈内(i.p.)、動脈内(i.a.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、室内及び皮下(s.c.)経路によって身体に導入することを意味する。静脈内経路が好ましい。本明細書に用いられる“エアゾル”という語は、空気中の浮遊を意味する。特に、エアゾルは、本発明の製剤の粒子化及び空気中の浮遊を意味する。本発明によれば、エアゾル剤は、吸入又は肺投与のためにエアゾル化、即ち、噴霧して空気に浮遊させる糖質を含む製剤である。本明細書に用いられる“全身性”という語は、疾病もしくは障害又は肺から離れた又は生物体の全身に関係する最初の損傷部位を意味する。従って、“局所” という語は、本明細書では肺に関して用いられる。即ち、全身感染は、S. ニューモニエが血液中に見られるものであり、菌血症及び髄膜炎をまねくことがある。局所感染は、肺炎球菌が肺まで移動するだけのものであり、肺炎をまねくことがある。本発明の組成物又は組成物の投与は、動物の患者をS. ニューモニエ感染から防御又は治療するために用いられる。即ち、本発明の組成物は、ニワトリ、シチメンチョウ及びペットのような鳥類；本発明の組成物は哺乳動物種以外にも使用が企図されるが、愛がん動物（イヌ及びネコ）；家畜（ウシ、メンヨウ、ウマ、ヤマヒツジ、ブタ等）；げっ歯類；及び野生動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物、好ましくはヒトに用いられる。肺炎球菌に結合する糖質モチーフ基本的な態様においては、本発明は、肺炎球菌の宿主細胞、特に肺上皮細胞（ＩＩ型肺細胞）及び静脈内皮細胞への粘着を仲介する糖質モチーフの同定に関する。従って、本明細書に用いられる“肺炎球菌結合モチーフ”という語は、肺炎球菌接着複合体によって認識される糖質の構造を意味する。糖タンパク質についての糖質（オリゴ糖及びサッカリドとも呼ばれる）が種々の結合で配置される一組の単糖（糖）サブユニットによって形成される非常に複雑な構造にすることができることは周知である（例えば、Darnell ら，細胞分子生物学，Scientific Ame rican Books，1986，pp．957-964参照）。本発明のモチーフは、化合物について見出される“修飾”(追加のサッカリドサブユニット)と無関係の最小レセプター単位、即ち、肺炎球菌と結合することができる最小構造である。即ち、肺炎球菌が結合する糖質モチーフは、複雑なオリゴ糖に位置されているか又はモチーフ構造を有する可能な最も簡単なオリゴ糖であることができる。更に、モチーフは、本明細書で肺炎球菌結合を仲介することが示された特定のサッカリド群の誘導体とすることができる。本発明のモチーフの機能上の定義は、実施例に記載されるように肺炎球菌結合及び溶離特性を示すことができることである。本明細書に用いられる“糖質”という語は、サッカリドサブユニットを含む化合物及び本明細書に記載された高分子と会合又は複合した化合物の双方を意味する。最初の態様においては、本発明は、以前には肺炎球菌結合を仲介することが不明であった肺炎球菌が結合する糖質モチーフの同定に関する。本モチーフは、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌ群（ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ）を含む。本モチーフは、マンノースに結合されるが必要なものではない。本モチーフを含む糖質の例は、フォルスマン糖脂質、グロボシド等が挙げられるが、これらに限定されない。更に態様においては、本発明者らは、粘着肺炎球菌の宿主細胞からの定量的又はほぼ定量的溶離が、細菌と以前には肺炎球菌が付着することが不明であったＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌモチーフ及び第２モチーフとを接触させることにより達成されることを発見した。本第２モチーフは、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌ群（ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ）を含む糖質である。本モチーフは、マンノースに結合されるが必要なものではない。本第２モチーフを含む糖質の例としては、アシアロ−ＧＭ１、アシアロ−ＧＭ２等が挙げられるがこれらに限定されない。後記の個々の実施例に示されるように、肺炎球菌の非剌激肺上皮細胞（ＩＩ型肺細胞）及び静脈内皮細胞からの定量的溶離は、これらの細胞と両モチーフを有する糖質を含む組成物とを接触させることにより達成される。更に実施態様においては、本発明者らは、肺炎球菌が腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、インターロイキン−１（ＩＬ−１）等の炎症性サイトカインと結合する宿主細胞の刺激が以前には不明の第３糖質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を誘導することを発見した。この糖特異性は、ＧａｌＮＡｃβ１− ３Ｇａｌレセプター集団と結合される。即ち、ＧａｌＮＡｃβ１−３ＧａｌモチーフとＧｌｃＮＡｃモチーフを有する糖質を含む組成物（両モチーフは同一オリゴ糖又は２種類の異なるオリゴ糖に見られる）は、肺炎球菌の宿主細胞への粘着を防止するために又は粘着肺炎球菌を宿主細胞から溶離するために用いられる。最適実施態様においては、３種全てのモチーフを表す糖質を含む組成物が用いられる。かかる組成物は、免疫系が活性化されかつ炎症性伝達因子が放出された初期の段階、進行中の感染を治療するのに特に望ましい。本発明は、肺炎球菌と宿主細胞との結合又は粘着を妨害することが判明した追加の糖質部分を含むことを企図する。かかる糖質の例としては、マンノース、Ｎ −アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、マンノース−Ｄ−マンノース及びメチル−α −Ｄ−マンノピラノシドが挙げられるがこれらに限定されない。本発明は、更に、薬剤の効力を増強するために多価糖質又は多価糖質含有構造の使用を企図する。１実施態様においては、１モチーフは、本発明に有用な化合物に多コピーで見られる。他の実施態様においては、１を超えるモチーフは、本発明に有用な化合物に単一又は多コピーで見られる。多価糖質は、概念的に樹木又はブラシに似ているその各分枝又は毛が肺炎球菌結合モチーフを含む分枝複合糖質を調製することにより製造される。また、一価の糖質は、共有結合又は非共有結合で高分子と結合される（例えば、Langerら，1994年２月17日公開の国際特許公報第94/03184号を参考として特に本明細書に引用する）。適切な高分子としては、タンパク質、ポリリシン、デキストラン、グリコサミノグリカン、シクロデキストリン、アガロース、セファロース及びポリアクリルアミドが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の肺炎球菌結合モチーフを有する糖質は、いかなる供給源からも入手することができる。例えば、かかる糖質は、市販されているものから入手することができる。また、該糖質は、既知の化学又は酵素プロセスを用いて合成で製造することもできる。肺炎球菌結合モチーフを含む糖質（即ち、サッカリド）の合成のためのグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、国際特許公報第93/13198号（19 93年７月８日公開）に記載されているように調製され、この特許を参考として本明細書に引用する。サッカリド組成物の調製装置があるように（Rothら，1994年２月22日発行の米国特許第 5,288,637号）、かかる組成物のグリコシルトランスフェラーゼ触媒調製も記載された(Roth，1993 年１月19日発行の米国特許第 5,1 80,674号及び1991年10月31日公開の国際特許公報第91/16449号)(これらの文献の各々を参考として特に本明細書に全て引用する)。治療用組成物及び方法本発明は、肺炎球菌感染及び結果として生じる菌血症、髄膜炎及び肺炎を含むがこれらに限定されない病態を予防及び治療するために肺又は非経口、特にi.v. 投与するための上記の肺炎球菌結合モチーフを含む糖質を含む製剤を企図する。以後、便宜上、単数又は複数形の“糖質”という語は、他の意味が特に示されない限り肺炎球菌結合モチーフを含む糖質を意味するように解釈されなければならない。従って、本発明は、肺炎球菌結合モチーフを含む１種以上の糖質及び上記で定義された薬学的に許容しうる担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。初期の肺炎球菌感染又は全身感染の治療については、本発明の治療用組成物は、感染をまねく肺上皮細胞のコロニー形成を予防するために又は粘着細菌を肺上皮細胞から溶離するために吸入により投与される。肺投与は、薬剤が肺胞から毛細血管に容易に進むので血流に対する有効な投与方法でもある。更に、肺炎球菌全身感染が一般に肺上皮細胞のコロニー形成で始まるので、肺を通る治療剤の投与はその感染を治療するために合理的な経路である。同様に、薬剤は、毛細血管から肺胞に交差する非経口、例えば、i.v.で投与することも可能である。従って、本発明は、全身及び肺（局所）の双方の肺炎球菌感染を治療するために１種又は複数種の糖質を非経口投与、特にi.v.投与することを企図する。従って、医薬組成物及び治療用製剤の気道への送達又は非経口送達に設計される種々の装置が本発明のこの態様において用いられる。本発明の肺投与の好ましい経路は、エアゾル又は吸入方式である。分散剤又は分散媒と混合した本発明の１種又は複数種の糖質は、乾燥粉末として又は希釈剤による溶液又は懸濁液としてエアゾル剤で投与される。しかしながら、上記のように、本発明の組成物は、非経口的にも投与される。本明細書に用いられる“分散媒”という語は、糖質のエアゾル化又は肺組織における糖質の吸収又はその双方を援助する物質を意味する。分散媒は、薬学的に許容しうることが好ましい。例えば、液体エアゾルを形成する溶液の噴霧化による糖質の凝集を生じた表面を減じるために当該技術において一般に用いられる界面活性剤が用いられる。かかる界面活性剤の限定されない例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような界面活性剤である。界面活性剤の使用量は変動し、通常はその範囲又は製剤の０.００１〜４重量％の範囲内である。適切な界面活性剤は、当該技術において周知であり、所望の特性に基づいて選ばれ、個々の製剤、１種又は複数種の糖質の濃度、希釈剤（液体製剤において）又は粉末の形（乾燥粉末製剤において）等に左右される。更に、１種又は複数種の糖質（例えば、二糖又は複合オリゴ糖）の使用、所望の治療効果、肺組織の性状（例えば、疾患のある肺又は健康な肺）及び他の多くの要因によって、液体又は乾燥製剤は下記に述べられるように追加成分を含むことができる。液体エアゾル剤は、生理的に許容しうる希釈剤中に１種又は複数種の糖質及び分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアゾル剤は、１種又は複数種の糖質及び分散剤の微細固体形態からなる。非経口製剤は、注射に適切な担体中に１種又は複数種の糖質を含有する。液体或いは乾燥粉末エアゾル剤においては、製剤はエアゾル化されなければならない。即ち、エアゾル化された用量が実際に肺胞に達することを行わせるために液体又は固体粒子に分解されなければならない。一般に、マスメジアン動的直径は、薬剤粒子が肺胞に達することを行わせるために５マイクロメートル以下とする(Wearley，L.L.，1991，Crit．Rev．Ther．Drug Carrier Systems 8:333)。 “エアゾル粒子”という語は、肺投与に適切な、即ち肺胞に達する液体又は固体粒子を記載するために本明細書において用いられる。送達装置の構成、製剤中の追加成分及び粒子特性のような他の検討も重要である。薬剤の肺投与のこれらの態様は、当該技術において周知であり、製剤の取り扱い、エアゾル化手段及び送達装置の構成には、当業者による通常の実験が必要なだけである。送達装置の構成に関しては、液体製剤の微粒化(nebulization)、煙霧化(atomi zation)又はポンプエアゾル化及び乾燥粉末製剤のエアゾル化を含むがこれらに限定されない当該技術において既知のエアゾル化の形が本発明の実施において用いられる。たいてい、液体又は乾燥粉末製剤のエアゾル化には噴射剤が必要となる。噴射剤は、当該技術において通常用いられる噴射剤であってもよい。かかる有効な噴射剤の個々の限定されない例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン又はトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び1,1,1,2−テトラフルオロエタンを含む炭化水素又はその組合わせである。本発明の具体的な態様においては、エアゾル化の装置は、定量投与吸入器である。定量投与吸入器は、投与に左右される可変の用量というより投与される際に特定の用量を与える。かかる定量投与吸入器は、液体或いは乾燥粉末エアゾル剤で用いられる。定量投与吸入器は、当該技術において周知である。１種又は複数種の糖質が吸入により肺に達すると、多くの製剤依存性因子が結合活性を与える。肺炎球菌全身感染を治療するにあたり、１種又は複数種の糖質の循環レベル、エアゾル粒径、エアゾル粒子の形、糖質の吸収に影響することができる肺疾患又は塞栓の有無、肺のｐＨ又は医薬担体のような要因等が必要であることは理解されるであろう。本明細書に記載される製剤の各々については、ある種の滑沢剤、吸収増強剤、安定剤又は懸濁剤が適するものである。これらの追加物質の使用は、目標によって変動する。１種又は複数種の糖質の局所送達が所望又は探索される場合には、吸収増強のような可変物質が重要というほどでないことは理解されるであろう。更に、実施態様においては、本発明のエアゾル剤又は非経口製剤は、１種又は複数種の糖質のほかに他の有効成分を含むことができる。好適実施態様においては、かかる有効成分は、肺疾患の治療に用いられるものである。例えば、かかる追加の有効成分としては、肺の状態の治療に有効な気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、エピネフリン等が挙げられるがこれらに限定されない。好適実施態様においては、追加の有効成分は、例えば、肺炎の治療には抗生物質とすることができる。好適実施態様においては、抗生物質はペンタミジンである。好適態様において本発明の組成物は抗生物質と共に投与されるが、抗生物質耐性肺炎球菌の治療方法を与えることが本発明の具体的な利点である。これは、ビルレント細菌の間の抗生物質耐性の最近の増大、容易でない公衆衛生に係わる現象を考えると重要な問題である。一般に、本発明の１種又は複数種の糖質は、哺乳動物の体重１kgあたり０.０１〜約１００mgでエアゾル又は非経口で患者に導入される。個々の実施態様においては、投薬は１日あたりの用量である。当業者は、本発明のエアゾル剤又は非経口製剤中の１種又は複数種の糖質の濃度に基づいてその用量に対応するエアゾルの容量又は重量を容易に求めることができる；また、当業者によって容易に理解されるように、投与されるべき容量中１種又は複数種の糖質の適量を含むエアゾル剤を調製することができる。用量は、また、肺における１種又は複数種の糖質の局所濃度が肺投与と共に非常に高くなるので、肺炎球菌全身感染の吸入治療の場合には大きくなり、肺のみの感染を治療する場合には小さくてよいことは明らかである。１種又は複数種の糖質を肺に直接投与すると標的にした薬剤送達が可能であり、コスト及び望まない副作用の両面が抑えられる。本製剤は、感染の程度又は予防の必要性によって１回の投与量又は多回投与量で投与される。例えば、レスピレーターにより肺炎球菌感染に対する防御（レスピレーターによる長期治療の共通の結果）として患者に投与される場合、少量の組成物で有効である。感染が始まる場合には、粘着細菌の溶離を促進するために並びに在住細菌による接着及びコロニー形成を防止するために多量の組成物が与えられる。当業者は、用いられるべき予防又は治療剤の正確な量が、疾患の段階及び程度、患者の身体の状態及び医師によって容易に求められる他の多くの要因に左右されることは理解されるであろう（例えば、Langerら，1994年２月17日公開の国際特許公報第 9403184号参照、この特許を参考として本明細書に特に引用する）。加圧定量投与吸入器及び乾燥粉末吸入器のようなエアゾル送達装置は、Newman ，S.P.，エアゾル剤と肺，Clarke，S.W．& Davia，D．edit.，pp.197-22 に開示されており、本発明に関連して用いられる。液体エアゾル剤本発明は、肺炎球菌感染に罹っている患者又は肺炎球菌感染に罹る危険のある患者を治療するのに有用な液体エアゾル剤及び剤形を提供する。一般に、かかる剤形は、薬学的に許容しうる希釈剤中に１種以上の糖質を含有する。薬学的に許容しうる希釈剤としては、滅菌水、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース溶液等が挙げられるがこれらに限定されない。個々の実施態様においては、本発明又は本発明の医薬製剤に用いられる希釈剤は、リン酸塩緩衝化食塩水又は通常ｐＨ７.０〜８.０の緩衝化塩類溶液又は水である。本発明の液体エアゾル剤は、任意成分として、薬学的に許容しうる担体、希釈剤、可溶化又は乳化剤、界面活性剤及び賦形剤を含めることができる。本発明の液体エアゾル剤は、典型的にはネブライザーで用いられる。ネブライザーは、圧縮空気式或いは超音波ネブライザーとすることができる。本発明と共にウルトラベント，Mallinckrodt社(ミズーリ州、セントルイス);アコーンIIネブライザー(Marquest Medical Products，コロラド州、エングルウッド)のようなこれらに限定されない当該技術において既知のネブライザーが用いられる。本発明と共に有効な他のネブライザーは、1986年11月25日発行の米国特許第 4,624,251 号; 1972年11月21日発行の同第 3,703,173号; 1971年２月９日発行の同第 3,561,444号及び1987年１月13日発行の同第 4,635,627号に記載されている。本製剤は、担体を含めることができる。担体は、循環系に可溶でありかつ生理的に許容しる高分子であり、ここで生理的許容とは当業者が前記担体を治療法の一部として患者に注入することを許容することを意味する。担体は、クリアランスの許容しうる血漿半減期で循環系において相対的に安定であることが好ましい。かかる高分子としては、大豆レシチン、オレイン酸及びソルビタントリオレエートが挙げられるがこれらに限定されず、ソルビタントリオレエートが好ましい。本実施態様の製剤は、安定化又は浸透圧の制御に有効な他の物質を含めることもできる。その物質の例としては、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような塩及びグルコース、ガラクトース又はマンノースのような炭水化物等が挙げられるがこれらに限定されない。乾燥粉末エアゾル剤本医薬製剤を、微細な粉末状の１種又は複数種の糖質及び分散媒を含む乾燥粉末吸入剤として用いることも企図される。その形の糖質は、通常、凍結乾燥粉末とする。凍結乾燥形の糖質は、標準手法で得られる。他の実施態様においては、乾燥粉末製剤は、１種以上の糖質、分散剤、更に充填剤を含有する微細な乾燥粉末を含む。該粉末の装置からの分散を容易にする量で本製剤と共に有効な充填剤としては、ラクトース、ソルビトール、スクロース又はマンニトールのような物質が挙げられる。肺炎球菌感染の診断肺炎球菌に結合するものとして本明細書で同定された糖質は、S. ニューモニエによる感染の診断に有効な試薬である。現在、肺炎球菌を含むグラム陽性菌による感染の診断は容易ではない。通常、診断は、症候、肺炎と一致したＸ線像及び肺炎球菌感染の疑いがある患者から得られた生物試料の試験管内培養の組合わせに基づいている。かかる試料は、典型的には、喀痰、気管支洗浄、穿刺による肺水の抽出及び血液（血液に感染した肺炎球菌の存在を検出する）から得られる。本発明によれば、S. ニューモニエによる感染の疑いがある患者からの試料中のS. ニューモニエの存在は、上記の糖質の試料中又は試料からの細菌への結合を検出することにより検出される。上記のように、本発明は、肺炎球菌が二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌ群に結合したマンノースを含有する糖質に付着するという予期しない発見を提供する。従って、本糖質モチーフの細菌への結合を検出することは、細菌が肺炎球菌であることを示している。更に、細菌によるＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ１−４ＧａｌとＧｌｃＮＡｃ群のいずれか或いは双方への結合の検出は、肺炎球菌としての細菌の同一性について更に決定的な情報を与えることができる。本発明によれば、１種以上の上記糖質モチーフの結合の検出は、独立して検出される。即ち、各糖質モチーフへの結合が別個に検出される。別個の検出は、各種類の糖質を別個に分析することによって又は結合が分析される各糖質について異なる標識を用いることによって達成される。また、２種全て又は３種全てのモチーフへの結合を同時に検出することもできる。本発明による糖質と細菌との結合の検出は、免疫分析と類似の方法で分析される。本発明の場合には、糖質は１つの結合パートナーとして作用し、細菌はもう１つの結合パートナーとして作用する。１実施態様においては、肺炎球菌と結合するある分量の１種以上の糖質が調製され、酵素、蛍光を発する化合物及び／又は放射性元素でのように任意に標識されてもよく、次に、肺炎球菌に感染されると思われる哺乳動物の組織又は液体試料に導入される。標識物質が組織内の部位と反応させる機会があった後、得られた物質が結合標識の種類で異なってもよい既知の手法で試験される。かかる生体内検出が所望される場合には、放射能標識はテクネチウム９９（⁹⁹Ｔｃ）であるか又はガドリニウム又はマンガンのような磁気シフト試薬標識が標識として用いられることが好ましい。動物における肺炎球菌の存在は、通常は免疫学的方法によって確認され、１つの成分が検出可能な標識で標識されている肺炎球菌に対して１種以上の糖質結合パートナーを使用する。好適態様においては、肺炎球菌の存在は、検出可能な標識で標識された糖質を含む分析で確認される。個々の態様においては、検出可能な標識は、他の試薬、例えば、ビオチン（アビジン又はストレプトアビジンと結合する）の結合パートナー又は抗体に対する抗原とすることができる。この方法は、下記式によって纏められ、＊は分子化合物が標識され、この場合の“Ｃ”は１種又は複数種の糖質を表し、“Ｂ”は細菌を表すことを意味する。Ａ．Ｃ^*＋Ｂ＋Ｃ＝Ｃ^*ＢＢ．Ｃ₁＋Ｃ₂ ^*＋Ｂ＝Ｃ₁ＢＣ₂ ^* それらの一般法及び応用は、全て当業者によく知られており、本発明の範囲内で用いられる方法の具体的な説明として及び限定されないものとして本明細書に示される。“競合的”方法と類似の免疫分析法、方法Ａは、米国特許第3,654,09 0 号及び同第 3,850,752号に記載されている。方法Ｂと類似の免疫分析、“サンドイッチ”法は、米国特許第 RE 31,006号及び同第 4,016,043号に記載されている。更に、他の診断法は、同時放射能分析用単一溶液中の多重標識化合物を使用する。この方法においては、 Olsonの米国特許第 4,762,028号に開示された方法と同じように、組成物は式：放射性同位元素−キレート剤−糖質分子を有する配位化合物中２種以上の糖質分子で調製される。これらの実験に最も共通して用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に露光した場合に蛍光を発する化学薬品等である。適切な放射性元素は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸ Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ及び¹⁸⁶Ｒｅからなる群より選ばれる。上に示した同位元素の１つのような放射性標識が用いられる場合には、標識の量、もって、物質の結合量を検出又は定量するために既知の現在用いうる計数方法が用いられる。標識が酵素である場合には、当該技術において既知の現在使用されている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、温度法、電流滴定法又は気体定量法のいずれによっても検出が達成される。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等の架橋分子との反応により糖質に結合される。これらの方法に用いられる多数の酵素が既知であり使用される。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ＋ＧＤＰａｓｅ、ＲＮＡｓｅ、グルコースオキシダーゼ＋アルカリホスファターゼ、ＮＡＤオキシドレダクターゼ＋ルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ＋ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ＋ホスホェノールピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルカリホスファターゼが好ましい。米国特許第 3,654,090号；同第 3,850,752号；及び同第 4,016,043 号には、代替的標識材料及び方法の開示の例として言及されている。多数の蛍光材料が既知であり、標識として用いられる。これらは、例えば、フルオレセイン、ローダミン及びオーラミンが含まれる。本発明は、また、試料中の肺炎球菌の存在、所望される場合には、量を検出する種々の分析方式も企図する。例えば、直接“サンドイッチ”型ＥＬＩＳＡが行われ、１種の糖質が固相支持体に結合され、標識糖質（最初のものと同じモチーフを共有することができ、他のモチーフの１種を有することもできる）が細菌の固相糖質への結合を検出するために用いられる。本発明は、肺炎球菌の存在の程度の定量的分析の試験キットの形で調製される分析システムが含まれる。システム又は試験キットは、標識成分、例えば、標識を肺炎球菌の糖質結合パートナーにカップリングする本明細書で述べた放射性及び／又は酵素法の１つによって調製されたものを含むことができる。また、本発明の試験キットは、マイクロタイタープレート、クロマトグラフィービーズ（セファロース等）及び細胞（ロゼット形成実験用）を含むがこれらに限定されない固相支持体と結合した又は結合することができる糖質を含むことができる。本発明の実施態様においては、更に、医師が使用するのに適する市販の試験キットが肺炎球菌の有無を求めるために調製される。かかるキットは、試料中の肺炎球菌の量を求めるためにも用いられる。上述した試験法によれば、かかるキットの１種は、本明細書に記載された糖質と肺炎球菌の結合を検出するための手段で含み、使用される方法によっては説明書を含めることができる。本キットは、また、バッファー、安定剤等の周辺的試薬を含むことができる。例えば、最初の分析方式は、肺炎球菌を含む疑いがある生物試料、次に標識糖質（又は抗肺炎球菌抗体）が添加される結合糖質を企図する。次に、得られた基質を洗浄し、その後、固相上に特異的に保持された標識量の測定によって検出が進行する。本明細書に開示されたプロトコールの全てが肺炎球菌の定性的及び定量的分析並びにS. ニューモニエ感染症の付随する診断及び監視に用いられる。本発明は、その展開及び確認で実施した構成及び手順の詳細を示す下記の具体的な説明の検討から更によく理解されるであろう。実施例：ストレプトコッカス・ニューモニエの粘着のレセプター特異性 S. ニューモニエのヒトＩＩ型肺細胞及び上皮細胞への粘着は、肺炎球菌肺炎及び菌血症の発病に重要である。本実施例は、肺炎球菌が肺において付着する好ましい標的細胞がＩＩ型肺細胞であることを証明し、その相互作用の分子の詳細を求める試験管内粘着分析を報告するものである。培養ヒト肺細胞（ＬＣ）及び上皮細胞（ＥＣ）上の肺炎球菌レセプターは、単層をツニカマイシン（グリコシル化の阻害剤）で処理すると細菌の粘着を著しく減じるので糖タンパク質であることがわかった。ＧａｌＮＡｃ、マンノース並びにＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ含有複合糖質を含む数種の糖質とインキュベートした後、ＬＣ及びＥＣへの粘着阻止が生じた。肺炎球菌はこれらの固定化糖質に直接結合することができ、粘着肺炎球菌への付加は細菌をＬＣ及びＥＣから溶離することができた。複合糖質の組合わせは、２種類の独立した肺炎球菌レセプターが両方の種類の細胞上に存在することを示した。これらは、各々肺炎球菌細胞壁及び粘着のタンパク質依存性機序に関与する最小レセプター単位ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌによって定義された。材料及び方法細菌株及び培養条件血清型２（ＡＩＩ及びＤ３９）及び血清型１８Ｃ、９ＶのS. ニューモニエ株及び莢膜のないＲ６株（Ｄ３９及びＡＩＩと同質遺伝子）を、３％ヒツジ血(Micropure Medical社、ミシガン州、スチルウォーター）を含有する大豆寒天(Difco，ミシガン州、デトロイト）上で３７℃で１８時間増殖した。細菌を３７℃で増殖した。細菌をプレートから１mlのダルベッコのリン酸塩緩衝化食塩水（ＤＰＢＳ；Whittaker Bioproducts,メリーランド州、ウォーターズビル）に取り出し、以前に記載された(Geelenら，1993，Infect．Immun．61:153 8)０.０５M 炭酸ナトリウム及び０.１M 塩化ナトリウムを含有するバッファーに溶解したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ１ mg/ml; Sigma Chemical社、ミズーリ州、セントルイス）で標識した。その細菌を遠心分離（３,０００ rp m、３分）で２回洗浄し、１mlのアルブミンバッファー（上記、Geelenら）に懸濁し、１０⁵〜１０¹⁰cfu/mlまで希釈した。ある実験については、Ｒ６肺炎球菌をアミノアルコールとしてコリン或いはエタノールアミンを含む特定培地で増殖した(Tuomanenら，1985，J．Infect．Dis．151:859)。肺炎球菌細胞壁標品Ｒ６からの精製した全細胞壁を以前に記載されたように調製した（上記、Geelenら）。概要では、対数増殖肺炎球菌を加熱死滅させ、粗細胞壁を５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；１００℃、３０分）で抽出した。ＳＤＳを洗浄して除去し、細胞壁をＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ及びトリプシンで処理した。沸騰ＳＤＳに再沈降させた後、細胞壁を洗浄し、凍結乾燥し、室温で貯蔵した。バイオアッセイに使用する場合には、肺炎球菌細胞壁浮遊液をブランソン振動器（2200型，Branson Ultrasonic社、コネチカット州、ダンバリー）で超音波処理してホモジェナイズし、アルブミンバッファー中５０〜１００ mg/ml の最終濃度まで再懸濁した。ヒト上皮細胞に対する肺炎球菌粘着の最大阻止を生じることが以前に示されたそれらの濃度を使用した（上記、Geelenら）。ウサギ混合及びＩＩ型肺細胞標品ウサギ混合及びＩＩ型肺細胞を以前に記載されているように調製した(Dobbs & Mason，1979，J．Clin．Invest．63:378)。概要では、肺を細かくし、コラゲナーゼ、エラスターゼ及びＤＮａｓｅで３７℃ で６０分間消化した。大きな細片をガーゼフィルターを用いて除去し、細胞を沈降させ、２回洗浄した。得られた混合肺細胞を０.５％アルブミンを有する２０m lのカルシウム含有バッファーに１０⁴/mlの密度まで再懸濁した。混合肺細胞浮遊液からの肺胞ＩＩ型細胞を精製するために、混合液を１０ml１６.５ｇ％から１０ml３５ｇ％を超えるアルブミン勾配で加層し、１２００ rpm、４℃で２０分間遠心した。勾配の上の方の２６mlを捨て、次の１２mlの細胞を取り出し、洗浄し、１０⁴/mlの濃度に調整した。トリパンブルー排除で算定した細胞生存度は、＞９０％であり、細胞の＞８０％は、電子顕微鏡で調べた場合ＩＩ型肺細胞に典型的な好オスミウム性層状体を含んでいた。ヒトＩＩ型肺細胞及び血管内皮細胞ヒトＩＩ型肺細胞系Ａ５４９（ＬＣ；アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション）を、ゼラチン（０.２％）で被覆した組織培養フラスコに加え、１０％ウシ胎児血清(Sigma)で補足した栄養混合物Ｆ１２Ｈａｍ培地(Sigma)中で培養した。ヒト臍静脈内皮細胞の初代培養物（ＥＣ；継代１、Clonetics 社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を、フィブロネクチン（５０μg/ml）で被覆した組織培養フラスコに加え、以前に記載されたように補足した培地１９９(Sigma)中で増殖した（Krivanら，1988，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 85:6157）。ＬＣ及びＥＣへの肺炎球菌粘着についてタンパク質のグリコシル化の影響を求めるために、単層を、ツニカマイシン(０.５５μ g/ml; Sigma)の存在下に３７℃で９６時間増殖した細胞から調製した(Dobbs &Ma son 1979，J．Clin．Invest．63:378)。集密的の細胞をトリプシン−０.０５％ＥＤＴＡ(Sigma)を用いて継代培養用の細胞を調製した。粘着分析のために、細胞をフィブロネクチン（５０ mg/ml）で被覆したテラサキ６０ウェル培養皿(Rob bins Scientific,カリフォルニア州、サニーベイル)に移し、更に２４〜４８時間培養して集密的単層を形成した。粘着分析の前に、その単層を培地１９９(Sigma)で２回洗浄することにより培養液を除去した。細菌の初代ウサギ混合肺細胞への粘着肺炎球菌の初代ウサギ混合肺細胞及びＩＩ型肺細胞への粘着を試験するために、ＡＩＩ又はＲ６(１０³〜１０⁹cfu/ml) を１０⁴肺細胞に１ml容量で加え、３７℃で３０分間旋回下でインキュベートした。次に、肺細胞を遠心分離（２７０ｇ、５分）で６回洗浄し培地１９９に再懸濁することにより、肺細胞を非粘着細菌から分離した。次に、最終細胞沈降物に粘着する細菌を播種及びグラム染色による可視化の双方によって数え、６回の独立した実験からベースラインを決定した。検出標識で誘導化された細菌表面を潜在的に複雑にすることなく粘着が生存可能な細菌をもたらすことを行わせるためにこれらの定量法を使用した。引き続き、死滅した細菌及びフルオレセイン標識細菌の粘着を生存可能細胞の粘着と比べると、顕著な差異がないことを示した（下記参照）。肺炎球菌の培養ヒトＬＣ及びＥＣへの粘着ヒト静脈内皮細胞の培養物について以前に記載されたプロトコールを用いて、肺炎球菌のＬＣ及びＥＣへの粘着を調べた（Geelenら，1993，Infect．Immun．61:1538）。ＦＩＴＣ標識細菌（１０⁵ 〜１０⁸cfu/ml；１０μl/ウェル）を細胞単層と３７℃で１５０分までの間インキュベートした。肺炎球菌粘着を４℃で算定した。単層を培地１９９で５回洗浄することにより非粘着細菌を除去し、次に、細胞を２.５％グルタルアルデヒドに固定した。蛍光用にＩＦＤＭ−５１０フィルターを備えた倒立顕微鏡（ジアホト−ＴＭＤ；ニコン社、ニューヨーク州、メルビル）で粘着肺炎球菌を肉眼で計数した。粘着は、４０×の視野で計数した１００真核細胞あたりの付着細菌数として示した。２ウェルの数値を平均し、各実験を少なくとも６回の別個の実験で行った。粘着分析の相互及び内部分析変動係数は、各々１８％及び１５％であることがわかった。肺炎球菌細胞壁の粘着阻止能を試験するために、培養ＬＣ及びＥＣを細胞壁（５μl;５０又は１００μg/ml）と３７℃で３０分間インキュベートした後、標識細菌を添加した。炭水化物の粘着阻止能を定義する実験については、ＦＩＴＣ標識Ｒ６(２×１０⁷cfu/ml)を室温で１５分間（Tuomanenら，1988，J．Exp．Med． 168:267）表１に示された最終濃度の次のものの１種と前インキュベートした：１〜５０mMの単糖、０.００２〜２mMの複合糖質(Sigma)又はグルコースを含まないアルブミンバッファー（対照）。細菌を遠心（３,０００ rpm、３分）して糖質を除去し、アルブミンバッファーに１×１０⁷cfu/mlまで再懸濁し、粘着分析に加えた。３７℃で３０分間Ｒ６及びＬＣ又はＥＣ単層を同時インキュベートした後、粘着を算定した。結果は、指定した糖に付着している細菌数として示した。この数値は、糖の非存在下の粘着（対照ウェル）と糖の存在下の粘着間の差から得られる。例えば、１００細菌が対照ウェルで付着し糖Ａを加えると６０細菌が付着する場合には、糖Ａによる方法で４０細菌（４０％）が細胞に付着することが計算される。肺炎球菌の固定化複合糖質への粘着 Lee らに従って固相結合分析を行った(L eeら，1994，Mol．Microbiol．11:705)。単糖（１００mM）及び複合糖質（２mM ）の貯蔵液をメタノール中１０％クロロホルム(v/v)で調製した。単糖（１２〜５０mM）及び複合糖質（０.００４〜０.４mM）の希釈は、メタノールで行った。テラサキ６０ウェル培養皿(Robbins Scientific,カリフォルニア州、サニーベイル）を、メタノール中１０μl/ウェルの単糖或いは複合糖質又は対照としてメタノールで被覆し、４℃で蒸発乾固した。次に、リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７.４中５％(w/v)ウシ血清アルブミン(ＰＢＳ; Sigma)とインキュベートすることにより、マイクロタイタープレートのウェルを阻止した。過剰のＢＳＡを捨て、ウェルをＰＢＳ中０.０５％ＢＳＡで１回洗浄した。フルオレセイン標識肺炎球菌(１０⁷cfu/ml)をプレートに３７℃で３０分間付着させ、倒立蛍光顕微鏡を用いて肉眼で粘着を定量した。統計学グループ間の差は、ウィルコキソン符号ランク試験で試験した。結果は全て、少なくとも６回の実験の平均と標準偏差として示す。結果肺炎球菌と肺細胞との相互作用肺炎球菌の初代肺細胞への粘着莢膜のあるＡＩＩ肺炎球菌の混合ウサギ肺細胞への粘着は、濃度依存性及び飽和性であった（図１Ａ）。精製ＩＩ型肺細胞への粘着は、各接種物が混合肺細胞の１０〜１００倍であることが一致し、ＩＩ型肺細胞が好ましい標的であることを示した。最大レベルの粘着において、１０⁵c fu は１０⁴ＩＩ型細胞と結合し、１細胞あたり〜１０肺炎球菌の粘着指数を示した。精製ＩＩ型細胞への粘着は、莢膜のあるＡＩＩと莢膜のない同質遺伝子Ｒ６については等価であり、莢膜が肺炎球菌付着に影響しないことを示した（図１Ｂ）。Ｒ６、ＡＩＩ、Ｄ３９、９Ｖ及び１８ＣのヒトＩＩ型肺細胞系への粘着ＩＩ型肺細胞への肺炎球菌粘着のモデルを、Ａ５４９ＩＩ型ＬＣ系を用いて発育した。莢膜のあるＡＩＩ、Ｄ３９、９Ｖ及び１８Ｃ株及び莢膜のないＲ６は、用量依存方式で付着した（図２Ａ）。付着を検出するために約１０⁶cfu/mlが必要であった。濃度が高くなるにつれて、初代ＩＩ型細胞については最大値と同じである細胞あたり≧１０細菌まで粘着が直線的に増大した。肺炎球菌のＬＣへの付着は、４５分以内でプラトーに達した（図２Ｂ）。粘着に活性代謝が必要であるかを調べるために、生存力のあるＲ６と加熱死滅したＲ６（１０分、６０℃）を粘着分析において比較した。１０⁷cfu/mlの供給濃度において、１００ＬＣあたりの付着細菌数は生存力のあるＲ６と加熱死滅したＲ６について各々２９６±１０及び２７３±１４（ｐ＞０.０５）であった。Ｒ６のヒトＬＣへの粘着における肺炎球菌細胞壁の役割ＩＩ型ＬＣ単層を精製肺炎球菌細胞壁（５０μg/ml）で処理すると（３０分、３７℃）、Ｒ６の１０⁵ 、１０⁶及び１０⁷cfu/mlのＬＣへの粘着が各々３９±１２％、４７±１７％及び５７±７％だけ著しく（ｐ＜０.０５）低下した。１００μg/mlの肺炎球菌細胞壁を用いて同様の結果が得られた（データは図示せず）。粘着における細胞壁テイコ酸内に存在するホスホリルコリン部分の役割を直接算定するために、テイコ酸中のアミノアルコールを生合成で置換するエタノールアミンを含む培地で肺炎球菌を培養した。１０⁷cfu/mlの供給濃度において、１００ＬＣに粘着するＲ６数は、コリン及びエタノールアミンと増殖した肺炎球菌について各々２７３± １４及び２９４±１４（ｐ＞０.０５）であった。ＬＣ及びＥＣに関する肺炎球菌に対するレセプター特異性肺炎球菌粘着に関するツニカマイシンの影響ツニカマイシンは、アスパラギン結合高マンノース型及び複合型糖タンパク質の生合成経路の最初の段階を遮断することにより細胞表面の７糖タンパク質のグリコシル化を阻止する(Hranitzky ら，1985，Infect．Immun．49:336)。肺炎球菌のツニカマイシンで処理した単層への粘着は、未処理単層と比べて著しく（ｐ＜０.０５）減少した。Ｒ６の１０⁷ cfu/mlの供給濃度において、１００細胞に粘着する肺炎球菌数はツニカマイシンの存在下及び非存在下に培養したＥＣについて６７±９及び２４０±１５であった。同様の結果がＬＣについても得られた。ヒトＬＣ及びＥＣに関する肺炎球菌のレセプターの糖質特異性ヒトＬＣ及びＥＣへのS. ニューモニエＲ６株粘着を妨害するために単糖及び複合糖質を用いる競合分析を用いて、最小レセプター単位を定義した。単糖の粘着阻止能の比較は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びＤ−マンノースがＥＣ及びＬＣへの肺炎球菌粘着の＞４０％に役割を果たすこと示した；Ｄ−ガラクトースはＥＣについてのみ追加の特異性があった（表１）。単糖による競合阻害パターンがレセプターの構造を必ずしも予想しないので(Leeら，1994，Mol，Micro biol．11:705)、マンノース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを含有する複合糖質のライブラリーの粘着阻止能を試験した。２つのマンノース二糖マンノース−Ｄ−マンノース及びメチルＤ−マンノシドは、ＬＣ及びＥＣ双方へのＲ６粘着に対して有効なレセプター類縁体であった（表１）。末端Ｄ−マンノシドをＤ−ガラクトシドで置換すると、分子の完全な活性消失がもたらされた（表１）。試験した複合ＧａｌＮＡｃ含有糖質のうちの２種類がＬＣ及びＥＣの双方について粘着の非常に有効な標的であることがわかった：アシアロ−ＧＭ２及びグロボシド（表１）。これらの複合糖質双方の共通のコアを表すラクトシルセラミド（ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇｌｃ１−１Ｃｅｒ）群は、調べた全ての濃度で不活性であった（０.００３〜２mM）。これにより、レセプター活性はβ１,４結合（アシアロ−ＧＭ２）或いはβ１,３結合（グロボシド）がＧａｌに結合したＧａｌＮＡｃの存在と関連があることが示された。二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（２−ＡＤＧＧ）のようにＧａｌＮＡｃとＧａｌの位置が逆転すると、糖質は不活性であった。アシアロ−ＧＭ２において活性なβ１,４結合の効力に置換がどのように影響するかを求めるために種々のＧａｌＮＡｃβ１,４−Ｇａｌ含有糖質を比較した。アシアロ−ＧＭ１を生じる末端Ｇａｌの付加は、レセプターとして作用する能力をＬＣついては１／１０まで低下させ（１／２の最大阻止はアシアロ−ＧＭ２については１０²μM 及びアシアロ−ＧＭ１については１０³μM で生じた）及びＥＣについては１／１００より小さく低下させた(１／２の最大阻止はアシアロ −ＧＭ１については＞１０³μM で達しなかった)(図３Ａ及び３Ｂ)。ＬＣについてアシアロ−ＧＭ１の小さな効果は、シアル酸で置換することによりほとんど消失した(モノアシアロ−ＧＭ１)(表１)。 β１−３結合の活性について置換の影響に対する同様の分析により、ＬＣ及びＥＣに対して異なる結果が生じた。末端ＧａｌＮＡｃのグロボシドへの付加（フォルスマン糖脂質）は、ＥＣについてのレセプター活性を１／２５に低下させた（図３Ｂ）。対照的に、フォルスマン糖脂質は、同じＲ６粘着の最大阻止が生じる（〜５２％）がＲ６粘着の低下が検出される濃度範囲が大きい点でＬＣについてのグロボシドより実質的な活性増大を示した（図３Ａ）。表１及び図３で同定された糖質特異性が１つ又は多レセプターに含まれるかを調べるために、糖質の組合わせを試験して２つの独立したレセプター特異性を示す加成的効果を求めた。Ｒ６粘着について最大阻止効果を別個に生じる濃度を含む２成分混合物を調製した。これらの実験の結果を表２に示す。マンノースは、各種類のレセプターの成分であることを示す他の糖質又は複合糖質と加成的であることは見出されなかった。アシアロ−ＧＭ１＋アシアロ−ＧＭ２又はフォルスマン糖脂質＋グロボシドの組合わせは、いずれの種類の細胞でも加成的でなかった。肺炎球菌粘着をほとんど消失する著しい加成的効果は、ＥＣ及びＬＣの双方についてアシアロ−ＧＭ２とグロボシドの組合わせで見られた（図４）。これらの結果は、β１,４及びβ１,３結合ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌが異なるレセプターであることを示した。これは、アシアロ−ＧＭ２に対して明白な加成的効果を呈しないがグロボシドの存在下に粘着を対照値の〜５０％から２０％に低下させる精製肺炎球菌細胞壁の能力によって支持された（図４Ｂ）。十分な結合親和性を有するレセプター類縁体は、細菌を溶離させるために宿主細胞レセプターと効果的に競合させることができる。ＧａｌＮＡｃ又はＤ−マンノース（５０mM）は、ＬＣ上の粘着細菌を６０分以内に各々６５±１０％及び６４±８％を溶離した。ＧａｌＮＡｃ（５８±９％）及びＤ−マンノース（６８± ７％）の同様の結果がＥＣについて得られた。ＬＣ又はＥＣをアシアロ−ＧＭ２（８０μM;各々７５±８％及び７０±７％）又はグロボシド（８０μM;各々７９ ±１０％及び６３±５％）とインキュベートした後、粘着肺炎球菌の更に効果的な溶離が生じた。各々８０μM のグロボシドとアシアロ−ＧＭ２の組合わせによっていずれの種類の細胞からもほとんど全ての細菌（＞９５％）が溶離した。肺炎球菌の固定化糖質への直接粘着真核細胞を用いる粘着分析において証明されたレセプター類縁体活性と一致して、肺炎球菌は固定化Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、アシアロ−ＧＭ１、アシアロ−ＧＭ２、フォルスマン糖脂質及びグロボシドに直接付着することができた（表３）。肺炎球菌粘着は、アシアロ−ＧＭ２及びアシアロ−ＧＭ１に対して最も大きく、続いてフォスマン糖脂質又はグロボシドに対して１／１０少なかった。単糖への粘着は、複合糖質の約１／１００であった。検討肺炎球菌の肺炎は、肺胞上皮に密接に並んでいる細菌の出現を特徴とする。肺炎球菌の混合肺細胞（主にＩ型肺胞細胞）及び精製ＩＩ型細胞への付着能に基づいて、S. ニューモニエがＩＩ型肺細胞（ＬＣ）に優先的に付着すると考えられる。これにより、Ａ５４９ＩＩ型ＬＣ系が罹患した肺における肺炎球菌付着の有効なモデルとして役に立つことが示された。ＩＩ型ＬＣ系への試験管内粘着分析を用いて、本相互作用の機序の数種の態様が解明された。ＬＣの培養物への肺炎球菌結合は用量依存性であり、迅速であり、細菌が代謝的に活性であることを必要とせずかつ数種類の莢膜の存在によって影響されなかった。これらの知見は、全てヒト静脈内皮細胞への肺炎球菌付着の以前の実験と一致しており（Geelenら， 1993，Infect．Immun．61:1538）、２種類の細胞への粘着方法における類似性を示している。肺炎球菌と内皮細胞間の相互作用は、２つの別個の機序を含むことを示した：〜６０％の細菌粘着は細胞壁依存性機序によって仲介され、残りの４０％はタンパク質仲介である（Geelenら，1993，Infect，Immun．61:1538）。本実験は、ＥCのように、ＬＣへの肺炎球菌付着の約１／２が細胞壁依存性機序を含むことを示す。いずれの場合にも粘着に重要な肺炎球菌テイコ酸についてホスホリルコリン決定因子がない。多くの古典的な粘膜病原体のように、肺炎球菌は、複合糖質を認識及び付着することができる(Anderssonら，1983，J．Exp．Med．158:559; Krivanら，1988， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6157)。ツニカマイシンによるＬＣ及びＥＣ細胞表面グリコシル化の阻害が肺炎球菌粘着を著しく低下させるという知見は、真核細胞の組合わせにおいて糖質結合の潜在的適切さを示している。本実施例は、肺炎球菌と相互作用する培養ＬＣ及びＥＣ上の複合糖質レセプターの糖質特異性を開示している。ＬＣ及びＥＣの双方は、最小単位が二糖ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌに結合したマンノースからなる２種類の別個の複合糖質含有レセプターを有することを数種の証明系統が示している。レセプターに似せた糖質（肺炎球菌と前インキュベートした場合に粘着阻止能によって示されるように）としては、マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ；ＥＣのみ）、アシアロ−ＧＭ１、アシアロ−ＧＭ２、フォルスマン糖脂質及びグロボシドが挙げられる。肺炎球菌は、また、マイクロタイタープレート上に固定化された場合にこれらの糖質に非常に少しであるが全くしないのではなく及び試験した糖質に直接結合することができた。最も重要なことには、粘着細菌をもった培養ＬＣ及びＥＣをＧａｌＮＡｃ、マンノース、アシアロ−ＧＭ２又はグロボシドとインキュベートすると、粘着肺炎球菌の溶離を生じた。アシアロ−ＧＭ２とグロボシドの組合わせは、いずれかの複合糖質を単独で用いた場合よりＬＣ及びＥＣの双方に対して顕著に大きな抗粘着作用を生じた。これにより、これらの複合糖質が独立したレセプターを定義したことが示された。更に、精製肺炎球菌細胞壁の抗粘着作用は、両方の種類の細胞においてアシアロ−ＧＭ２と加成的でないがブロボシドと加成的であった。ＥＣ及びＬＣへの肺炎球菌粘着は、細菌細胞壁依存性及び非依存性（タンパク質）機序を含んでいる。本実験の結果から、アシアロ−ＧＭ２特異性が細胞壁成分及びグロボシド、タンパク質成分を特異的に認識することが示される。２つの肺炎球菌レセプター特異性は、明白に異なる立体化学的構造で結合した同一のサッカリド置換基からなるものであった：Ｇａｌにβ１−４又はβ１−３結合のいずれかで結合したＧａｌＮＡｃ（図５）。２つのβ１−４ＧａｌＮＡｃ −Ｇａｌ結合糖質の組合わせ、アシアロ−ＧＭ１とアシアロ−ＧＭ２は、いずれかを単独で用いたものより抗粘着活性が大きくなかった。これは、２つのβ１− ３ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ結合糖質、フォルスマン糖脂質とグロボシドについても言えた。しかしながら、この２種類を交差して組合わせると、粘着が消失した。従って、これらの２組の複合糖質は、２種類の別個のレセプターを定義すると考えられる（図５、Ａ及びＢ）。各々のバックボーンの最小レセプター単位は、抗粘着作用のコア構造及び置換変異形を試験することにより更に定義された。コアラクトシルセラミド（Ｇａｌ４Ｇｌｃ−１−１Ｃｅｒ）及び逆方向二糖２−ＡＤＧＧ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）は両方の種類の細胞に不活性であり、ＧａｌはＥＣでは最小限でのみ活性であった。アシアロ−ＧＭ１の許容置換は見出されなかった（末端Ｇａｌ又は内部シアル酸の付加は活性を低下させた）ので、このレセプターの最小活性単位はＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌとして定義された（図５Ａ）。同様の分析から、ＬＣについてＥＣに比べて許容置換パターンの多い第２最小レセプター単位としてのＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造が示された（図５Ｂ）。末端ＧａｌＮＡｃ8,１ａl,４結合のＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌへの付加は、ＬＣのレセプター活性を増大したが、ＥＣにおいてはその効能を低下させた。これにより、これら２種類の細胞についてレセプター構造間に微妙な差が存在することが示される。細菌の内部及び末端糖配列双方の認識能は以前に記載されている（Krivanら， 1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6157; Karlssen，1989，Annu．Rev．Bio chem．58:309)。マンノースは、糖タンパク質のＮ結合サッカリドのコアによく存在し、その知見から本実験で同定された各レセプターにおけるマンノースの予想された存在が説明される。マンノースは、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ１− ４Ｇａｌ−或いはＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ含有糖質と組合わせて用いた場合に加成的でなく、ＬＣ及びＥＣ上の肺炎球菌レセプターの双方に存在することが示された。多数のマンノース結合細菌は、(Gbarahら，1993，Infect．Immun．61 :1687)に記載されている。マンノースが高等動物の糖脂質に検出されなかったので、マンノースを結合する細菌が糖タンパク質を選択的に認識することができることが示された(Karlssen，1989，Annu．Rev．Biochem．58:309)。 Krivanら（Krivanら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6157）と一致して、本実験から、肺炎球菌がアシアロ−ＧＭ１及びアシアロ−ＧＭ２のような配列ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌを含む固定化複合糖質に特異的に付着することができかつその配列のシアリル化が結合を減じることが証明される。本実験は、更に、本構造が肺炎球菌細胞壁決定因子のＬＣ及びＥＣ上の最小レセプターとして機能することを示している。これらの糖脂質のうちのアシアロ−ＧＭ１は、ヒト肺上皮細胞上に存在することが示された（上記、Krivanら）。ＧａｌＮＡｃβ１ −４Ｇａｌ配列を含むシアリル化糖タンパク質もまた、多くの分泌物に存在し、シアル酸が切断される場合に細菌を結合することができる（上記、Krivanら）。インフルエンザウイルスと関連があるノイラミニダーゼ活性は、試験管内で肺炎球菌の気道への粘着を増進させることができることが示された(Plotowski，1986 ，Am．Rev．Respir．Dis．134:1040)。Anderssonら(Anderssonら，1983，J．Exp ． Med．158:559）による実験は、ヒト鼻咽腔細胞を用いて最小配列のＧｌｃＮＡｃ β１−３Ｇａｌを有する肺炎球菌レセプターを同定した。その構造は、血液型抗原を含む多数の糖脂質及び糖タンパク質のサッカリド鎖に存在する(Hakamori，1981，Semin．Hematol．18:39)。我々の実験においては、単糖ＧｌｃＮＡｃはＥＣ及びＬＣに対する抗粘着活性をもたないが、肺炎球菌はマイクロタイタープレート上に固定化されたＧｌｃＮＡｃに直接結合することができた。即ち、そのレセプター特異性は、鼻咽腔において役割を果たすことができ肺におけるものと異なる。本実験は、肺炎球菌粘着に対する新規なレセプター特異性を同定した:#ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌは、ＬＣ及びＥＣ双方への〜５０％の粘着に関与し、肺炎球菌表面上の細胞壁と独立した構造と相互作用すると思われた。Krivanら(Kriva n ら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6157)は、肺炎球菌のフォルスマン糖脂質又はグロボシドを含むβ１−３糖質で被覆した表面への結合を検出できなかった。その不一致は、結合を検出するアシアロ−ＧＭ２より１０倍大きいグロボシド濃度を必要とすることから生じるものであった。肺炎球菌をＬＣ及びＥＣから溶離するためにＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌの双方を含有する複合糖質を必要としたので、両レセプターは生理的に適切であると考えられる。これにより、細菌粘着に対する宿主複合糖質レセプターの相対する寄与を求めるために生細胞を使用するという重要性が強調される。更に、肺炎球菌の下部気道からのクリアランスを促進するためにサッカリドを治療上適用すると、β１−４及びβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌレセプター双方との相互作用が中断される。実施例：活性化細胞への粘着の特異性上述したように、肺炎球菌感染の過程で、肺炎球菌は鼻咽腔細胞、次に、肺上皮細胞（肺炎をまねく）又は内皮細胞（菌血症、敗血症及び髄膜炎をまねく）と連続的に相互作用する。静止上皮細胞及び内皮細胞は、肺炎球菌を結合するのに特異的なサッカリド群を有する２種類の糖タンパク質を有する：ＧａｌＮＡｃβ １−３Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ。肺炎球菌感染は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターロイキン−１（ＩＬ− １）を含む炎症性サイトカインの放出と関連がある。ヒト静脈内皮細胞及びＩＩ型肺細胞のサイトカイン活性化は、肺炎球菌粘着の著しい促進をもたらした。ＴＮＦ又はＩＬ−１活性化細胞において、新規なサッカリド特異性はＮ−アセチル −Ｄ−グルコサミン（ＧｌｎＮＡｃ）と考えられる（図６参照）。ＧｌｎＮＡｃ結合活性は、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ糖タンパク質細胞集団と関連がある（図７参照）。単糖類（１〜５０mM）又は複合糖質（０.００３〜２mM）存在下に行われた競合分析を用いて、サイトカイン刺激ＥＣ及びＬＣへの肺炎球菌粘着に対する糖質認識の寄与を試験した。細菌を、最終濃度の記述した糖質と室温で１５分間前インキュベートし、遠心（３,０００ rpm、３分）して非結合糖質を除去し、アルブミンバッファーに１×１０⁷cfu/mlまで再懸濁し、粘着分析に加えた。単一糖質(Tuomanenら，J．Exp．Med．168:267)の粘着阻止能と比較すると、ＧａｌＮＡｃ及びＤ−マンノースは静止細胞で有効であり、ＧｌｎＮＡｃは活性化細胞で有効になったことが示された（図４）。静止ＥＣ及びＬＣは、マンノースコア上にＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌを含む２種類の肺炎球菌レセプターを発現する。これら２つのレセプター特異性は、β１−４レセプターについては複合糖質アシアロ −ＧＭ２及びβ１−３レセプターについてはグロボシドの阻止活性によって最もよく定義される。ＥＣ及びＬＣのサイトカイン刺激は、多数のこれらの双方の静止細胞レセプター及び新規なＧｌｎＮＡｃ特異性の出現をもたらした。その後者の特異性は、インヒビターが加成的であるのでＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌと独立しており、ＧｌｎＮＡｃは、インヒビターが加成的でないのでＧａｌＮＡｃβ １−３Ｇａｌレセプター集団に関係した（図５）。糖質の作用が加成的でない場合には、同じレセプターか又は結合したレセプターを占有すると考えられた；加成的である場合には、別個のレセプターに存在すると解釈された。本発明は、その真意又は本質的な特徴から逸脱することなく他の形で具体化され、他の方法でも行われる。従って、本開示は全ての点で例示であり限定するものとしてみなされるべきでなく、本発明の範囲は下記の請求の範囲によって示され、等価の意味及び範囲内に入る変化は全てその中に包含されるものである。種々の参考文献が本明細書全体に引用されており、各々を参考として本明細書に全て引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 13/06 Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｅ 15/04 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/569 Ｆ 33/569 Ａ６１Ｋ 9/14 Ｕ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＫ，ＴＭ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カンデルダイアナアールアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021 ニューヨークイーストシックスティサードストリート 430 アパートメント５ケイ

Claims

【特許請求の範囲】１．粘着ストレプトコッカス・ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。２．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ −アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質を更に含む請求項１記載の医薬組成物。３．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンモチーフを含む第３糖質を更に含む請求項１記載の医薬組成物。４．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質を更に含む請求項２記載の医薬組成物。５．該糖質が、フォルスマン糖脂質及びグロボシドからなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。６．該第２糖質が、アシアロ−ＧＭ１及びアシアロ−ＧＭ２からなる群より選ばれる請求項２又は４記載の医薬組成物。７．該第３糖質がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである請求項３又は４記載の医薬組成物。８．S. ニューモニエの宿主細胞への結合を阻害するのに有効な量のマンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトース、マンノース−Ｄ−マンノース及びメチル−α−Ｄ −マンノピラノシドからなる群より選ばれた糖質を更に含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。９．１種又は複数種の該糖質が多価性である請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 10．該医薬組成物が、分散媒を含むエアゾル剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 11．該分散媒が界面活性剤である請求項10記載の医薬組成物。 12．１種又は複数種の該糖質が微細な粉末で存在する乾燥粉末エアゾル剤である請求項10記載の医薬組成物。 13．充填剤を更に含む請求項12記載の医薬組成物。 14．薬学的に許容しうる希釈剤を更に含む液体エアゾル剤である請求項10記載の医薬組成物。 15．該希釈剤が、滅菌水、食塩水、緩衝化食塩水及びデキストロース溶液からなる群より選ばれる請求項14記載の医薬組成物。 16．該宿主細胞が、肺上皮細胞及び血管内皮細胞からなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 17．S. ニューモニエによる感染症の予防又は治療方法であって、粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質をかかる治療を必要としていると思われる患者に投与することを特徴とする方法。 18．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量の二糖Ｎ −アセチル-Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質を更に投与することを特徴とする請求項17記載の方法。 19．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンモチーフを含む第３糖質を更に投与することを特徴とする請求項17記載の方法。 20．粘着S. ニューモニエの宿主細胞からの溶離を誘導するのに有効な量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質を更に投与することを特徴とする請求項17記載の方法。 21．該糖質が、フォルスマン糖脂質及びグロボシドからなる群より選ばれる請求項17〜20のいずれか１項に記載の方法。 22．該第２糖質が、アシアロ−ＧＭ１及びアシアロ−ＧＭ２からなる群より選ばれる請求項18又は20記載の方法。 23．該第３糖質がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである請求項19又は20記載の方法。 24．S. ニューモニエの宿主細胞への結合を阻害するのに有効な量のマンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトース、マンノース−Ｄ−マンノース及びメチル−α− Ｄ−マンノピラノシドからなる群より選ばれた糖質を更に投与することを特徴とする請求項17〜20のいずれか１項に記載の方法。 25．１種又は複数種の該糖質が多価性である請求項17〜20のいずれか１項に記載の方法。 26．該投与が１種又は複数種の糖質を噴霧及び吸入することを特徴とする請求項 17〜20のいずれか１項に記載の方法。 27．該噴霧が微粒化することである請求項26記載の方法。 28．該投与が１種又は複数種の糖質を静脈内に注入することを特徴とする請求項 17〜20のいずれか１項に記載の方法。 29．患者からの試料においてS. ニューモニエの存在を検出する方法であって、二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質の細菌への結合を検出することを特徴とする方法。 30．二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質の細菌への結合を更に検出することを特徴とする請求項29記載の方法。 31．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質の細菌への結合を更に検出することを特徴とする請求項29記載の方法。 32．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質の細菌への結合を更に検出することを特徴とする請求項30記載の方法。 33．該糖質が、フォルスマン糖脂質及びグロボシドからなる群より選ばれる請求項29〜32のいずれか１項に記載の方法。 34．該第２糖質が、アシアロ−ＧＭ１及びアシアロ−ＧＭ２からなる群より選ばれる請求項30又は32記載の方法。 35．第３糖質がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである請求項31又は32記載の方法。 36．１種又は複数種の該糖質が多価性である請求項29〜32のいずれか１項に記載の方法。 37．少なくとも１種の糖質が検出可能に標識される請求項29〜32のいずれか１項に記載の方法。 38．少なくとも１種の糖質が固相支持体に結合される請求項29〜32のいずれか１項に記載の方法。 39．下記の成分を含む患者からの試料においてS. ニューモニエの存在を検出するためのキット。（ａ）二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−３Ｇａｌモチーフを含む糖質；及び（ｂ）該患者からの試料において該糖質の細菌への結合を検出するための手段。 40．下記の成分を更に含む請求項39記載のキット。（ｃ）二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｇａｌモチーフを含む第２糖質；及び（ｄ）第２糖質の該細菌への結合を検出するための手段。 41．下記の成分を更に含む請求項39記載のキット。（ｅ）二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質；及び（ｆ）第３糖質の該細菌への結合を検出するための手段。 42．下記の成分を更に含む請求項40記載のキット。（ｅ）二糖Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフを含む第３糖質；及び（ｆ）該第３糖質の該細菌への結合を検出するための手段。 43．少なくとも１種の糖質が検出可能に標識される請求項39〜42記載のいずれか１項に記載のキット。 44．少なくとも１種の糖質が固相支持体に結合される請求項39〜42記載のいずれか１項に記載のキット。