JPH10504324A

JPH10504324A - 薬物の免疫原その他の接合体の製造

Info

Publication number: JPH10504324A
Application number: JP9502038A
Authority: JP
Inventors: ラウ，ホン・ペン，フィリップ
Original assignee: デイド、ケミストリー、システムズ、インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-04-28
Also published as: AU6167696A; WO1996040664A3; EP0775128A1; WO1996040664A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質性物質等のような担体化合物への、直接又は２官能性スペーサーを介した薬物の接合を効率化させるための、ジアルキルアミノ化合物特にジアルキルアミノ薬物の反応性誘導体を提供する。該誘導体は、式（ａ）を有し、式中Ｄは、薬物であり、ｎは１より大であり、好ましくは２に等しい。該薬物誘導体担体接合体は、該薬物に対して特異的な抗体の産生のための免疫原として使用することができる。加えて、該接合体は、該薬物に特異的なイムノアッセイにおいて粒子試薬として使用するために、ポリマー粒子等のような固体支持体に結合させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】薬物の免疫原その他の接合体の製造本発明の分野本発明は、ジアルキルアミノ基を有する薬物の免疫原その他の接合体を製造するためのピペラジン誘導体の使用に関する。発明の背景の記述薬物療法を受けている個人はしばしば、患者の血清又は他の体液中の薬物のレベルについて規則的にモニターされなければならない。ある種の薬物のレベルを検出するためのアッセイが利用可能である。例えば、リドカイン（抗不整脈薬）の血清レベルは、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は酵素イムノアッセイによって検出できる。高度に感受性のイムノアッセイが、米国特許第4,401,765及び4,480,042号に記述されている粒子増強比濁法阻害イムノアッセイ等のような、高い屈折率を有する粒子試薬を用いる光散乱イムノアッセイによって提供される。DuPont aca自動臨床分析器等のような、自動化された臨床分析器は、単一投与量の、包装済の試験パックからの試薬を、患者サンプルと自動的に混合し、サンプルと試薬とを所望の温度である37℃で所望の時間インキュベートし、次いで、結果を読み取って印刷する。そのような自動化された分析器は、それらの正確さ、結果の再現性及び使用の容易さのために、臨床試験室において必須のものとなっている。光散乱イムノアッセイ、不均質イムノアッセイ、アフィニティーカラム媒介イムノアッセイ、及びいくつかの酵素イムノアッセイは、何れも自動化された分析器によって行われる。これら敏感なアッセイにおいて使用するには、問題の分析対象の反応性誘導体に結合させた粒子試薬又は他の固形支持体と、該分析対象に特異的な抗体とが入手できる必要がある。これまでのところ、述べたような自動化された分析器において使用するのに適したリドカイン粒子試薬は、入手できない。検出のためのガスクロマトグラフィー及びＨＰＬＣ法は、そのような自動化された分析器には適合していない。リドカインは、構造中にジアルキルアミノ基を含む。自動化させた分析器において使用するのに適した粒子試薬はまた、ジアルキルアミノ基を有する他の多くの薬物のためには入手できない。プロカインアミドは、その構造中にジアルキル基を有する別の薬物である。ある既知の試薬においては、＊で示したメチル部位にタンパク質が結合し、別のものにおいては、上で＊＊で示した部位にタンパク質が結合する。何れも構造中にジアルキルアミノ基を有するものである薬物イミプラミン及びアミトリプチリンに対する抗体を生じさせるための方法が、文献に記述されている。何れの場合にも、これらの構造は、化合物の芳香環へのスペーサーアームの取付けによって修飾された。これらのスペーサーアームは、次いで牛血清アルブミンに取り付けられ、次いで抗体を産生させるのに使用される。Adamczyk，M．e t al.，J．Immunol．Methods，vol.，162(1)，pp.47-58（1993）及びvol．163(2 )，pp.187-97（1993）を参照のこと。より敏感な、迅速なそして信頼できる自動化された利用可能な分析技術において使用するため、免疫原及び粒子試薬を製造するためにタンパク質へのジアルキルアミノ薬物の接合を効率化する手段に対する需要がある。ヒト血清中のリドカインその他のジアルキルアミノ薬物の定量のために、市販の自動化された分析器おいて使用するのに適した免疫原及び抗原の製造のため、ジアルキルアミノ薬物の反応性誘導体に対する具体的需要がある。本発明の要約本発明の目的は、担体化合物への接合のための合成物によって満たされ、ここに該合成物は次の式を有する：式中、ｎは１以上の整数であり、Ｄは、その未だ誘導体化されていない構造中にジアルキルアミノ基を有する化合物、好ましくは薬物である。本発明の合成物の製造において、該化合物のジアルキルアミノ基は、残基、すなわちピペラジン様誘導体によって置き換えられ、担体化合物への接合のための反応性の末端窒素を加えつつ、実質的に化合物Ｄの構造を保持している。本発明の該反応性の誘導体化された合成物を担体化合物に連結させるために、所望により、２官能性のスペーサーを、末端窒素に結合させることができる。この２官能性のスペーサーは、環状無水物、ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体及びアルデヒド類よりなる群より選ぶことができる。該担体化合物は、（i）キーホールリンペット（keyhole limpet）・ヘモシアニン、卵白アルブミン又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のようなタンパク質性の物質、又は（ii）ポリエチレンポリアミン又はポリエチレングリコール等のような合成のポリマー性物質であってよい。該誘導体合成物−担体化合粒接合体は、化合物Ｄに特異的な抗体の製造のために免疫原として使用でき、又は、化合物Ｄのレベルを検出するためのイムノアッセイにおける試薬として使用するために、ポリマー粒子等とのような固体支持体に、該担体化合物を介して結合させることができる。本発明の好ましい粒子試薬は、内側コア及び外側シェルを有するポリマー粒子を含み、該内側コアはナトリウムＤ線の波長にて測定したとき1.54以上の屈折率を有するポリマーである。外側シェルは、（i）生物学的興味のある求核性化合物と反応性できる官能基を有するエチレン型の不飽和モノマー、(ii)所望により、水不溶性ポリマー粒子を製造するのに十分な量の他のエチレン型不飽和モノマーよりなるポリマーであり、そして（iii）内側コアのモノマーの10重量部以下の外側シェルであり、該外側シェルが該内側コアの存在下における重合により形成されており、上記の誘導体化した合成物−担体化合物接合体に共有結合により結合させてある。図面の簡単な記述本発明の方法論の成功は、図に説明されており、それは、サンプル中のリドカインの濃度に対する、１分当たり340ｎｍにおけるミニ吸収における変化によって測定される凝集の速度（ｍＡ／分）のグラフを示す。好ましい具体例の詳細な記述本発明は、ジアルキルアミノ基をピペラジンで置き換えることによる、化合物特にジアルキルアミノ基を有する薬物の、担体化合物への接合を効率化するための新規の方法を提供する。該担体化合物は、抗原又は酵素等のようなタンパク質性の物質であってよい。ピペラジンへ含有構造の誘導体化によって与えられる追加のアミノ基は、接合を効率化する。所望により、ピペラジンの末端アミノ基と担体との間にスペーサーを配置することができる。本発明は、次の構造を有するジアルキルアミノ薬物の反応性誘導体を提供する。ここに、Ｄは、未だ誘導体化されていない構造中に通常ジアルキルアミノ基を含む薬物であり、ｎは、１以上の整数であり、そして好ましくは１乃至３であり、最も好ましくは２である。本発明の該反応性誘導体の各ジアルキル鎖についてのｎ数は、等しい。タンパク質は、ジアルキル鎖には結合せず、結合は、該鎖の長さには影響を受けず、従って、該鎖の長さは、ピペラジン誘導体又はその接合体の機能にとっては重要でない。更には、ピペラジン様構造へのもとの薬物中のジアルキル鎖の長さの変化は、薬物に対する抗体の認識を変更しない。代わりとして、該合成物は、下の構造に示すように、該反応性の薬物ピペラジン誘導体をタンパク質性の担体化合物に結合させるための、２官能性のスペーサーを含むことができる。ここに、ｎ’は、０乃至６の整数である。他の２官能性のスペーサーもまた使用してよい。例えば、アミノ基に向けられた、環状無水物、ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体及びジアルデヒド類等のような２官能性基が、２官能性スペーサーとして働くことができる。他の多くの２官能性スペーサーを使用できる。例えば、S.S．Wong， CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING,（CRC Press 1991）の第152−167頁の表１に掲げたホモ２官能性スペーサーを参照。反応性薬物誘導体を抗原として使用するために、例えばタンパク質が、次のように末端の窒素に又は２官能性スペーサーの２官能性基に取り付けられる。代わりとして、薬物誘導体−タンパク質接合体が、スペーサーのと共に又はスペーサーを伴わずに、米国特許第4,401,765号及び4,480,042号（参照によりその開示をここに導入する。）に記述されている粒子試薬等のような固体支持体又は他の任意の適当な固体支持体表面に薬物を固定化するのに使用できる。本発明の薬物誘導体−担体接合体は、上述の慣用の自動化された臨床分析器においてイムノアッセイで使用するのに特に適している。結合に使用できるタンパク質は多数ある。選択は、薬物−タンパク質接合体の最終的適用に依存する。例えば、イムノアッセイにおける抗原として薬物を固体支持体又は粒子に取り付けるために接合体を使用するのならば、ポリエチレンポリアミン（ＰＥＰＡ）等のようなリンカー及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用できる。しかしなから、免疫原性及び特異性の理由から、異なったタンパク質担体が好ましい。もしも接合体が免疫原として使用されるのならば、ＢＳＡ、卵白アルブミン又はキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。種々のタンパク質性の担体を、S.S．Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING，（CRC Press 1991）に記述されているような既知の技術によって反応性薬物ピペラジン誘導体に接合させることができる。本発明のピペラジン誘導体化によって利益を受けるジアルキルアミノ薬物の例が、下の表１に示されている。本発明の反応性薬物誘導体は、免疫原として使用するとき、ある種の薬物に対する抗体を産生させようとする先行技術の試みによって可能であったよりも、基本的薬物に対する一層の特異性を有する抗体を産生させる。ピペラジンの構造は、ジアルキルアミノ基の構造に非常に近いため、ピペラジン誘導体は、基となる薬物の構造を保存している。得られる化合物は、基の薬物構造とは、アミノの付加において異なっているのみであり、それは、結果的に、基の薬物構造に存在したジアルキルアミノ分枝を環化する。先行技術は、薬物構造中の、基の構造を変更する部位においてタンパク質を結合させた。ピペラジンのアミノは、免疫原を製造するための既知の技術（S.S．Wong,上記、を参照）によって薬物をタンパク質に結合させるのに使用される。こうして、薬物の構造は、有意な変更を伴うことなく保存され、そして取付けは薬物と干渉しない部位において行われる。本発明のジアルキルアミノ薬物のピペラジン誘導体の製造及び使用の例は次の通りである。次のリドカイン誘導体が、合成され特徴付けられた：Ｎ−リドカイン及びＮ −リドカインプロピオン酸免疫原及び粒子試薬合成のためのリドカイン誘導体以下の免疫原を製造した：Ｎ−リドカイン−ＢＳＡ、Ｎ−リドカイン−ＫＬＨ、Ｎ−リドカインプロピオン酸−ＢＳＡ及びＮ−リドカインプロピオン酸−ＫＬＨ。ＫＬＨは、より優れた免疫原として知られているが、その低い溶解性は、取扱及び特徴付けを困難にしている。こうして、ＢＳＡ接合体もまたバックアップとして製造された。これらの免疫原は、既知の技術によるリドカイン抗体産生に直ちに使用できる。免疫原及び粒子試薬製造のための正しい反応性リドカイン誘導体の選択は、さもなければ、免疫原がリドカインに特異的な抗体を産生せず粒子試薬が患者血清中のリドカインに特異的に結合しないことから、重要である。リドカイン粒子試薬が、Ｎ−リドカイン−ＨＳＡ、Ｎ−リドカイン−ＰＥＰＡ 1300（ポリエチレンポリアミン、平均分子量1300）、Ｎ−リドカインプロピオン酸−ＨＳＡ及びＮ−リドカインプロピオン酸−ＰＥＰＡ 200から製造された。Kallestad Laboratoriesのヤギ抗−リドカインで試験したとき、全ての粒子試薬が、Cary 19分光光度計において高い活性を示した。12μｌの粒子試薬及び８ μｌの抗リドカインを、アッセイ緩衝液としての0.15Ｍリン酸塩（ｐＨ7.8）中、2.5％ポリエチレングリコール800（ＰＥＧ）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕（ＳＤＳ）を用いてインキュベートした。粒子試薬が数種のロットの家兎抗リドカインによって試験されたとき、抗ＨＳＡ活性又は非活性の何れかが観察された。リドカイン粒子増強比濁法阻害イムノアッセイ曲線は、Ｎ−リドカイン−ＨＳＡ粒子試薬について実証され、結果は図に示してある。サンプルの薬物の濃度に対して、340ｎｍにてミニ吸収の変化によって測定された凝集の速度がプロットされている。サンプル中の薬物の存在は、凝集を抑制し、従って、薬物濃度が高い程凝集速度は遅い。このアッセイは最適化していないが、しかし治療範囲において良好な分離が達成された。この結果は、リドカイン粒子試薬及び免疫原が、リドカイン粒子増強比濁法阻害イムノアッセイに適していることを示した。更には、リドカインについての治療範囲（1. 〜12μｇ）は、この粒子増強比濁法阻害イムノアッセイの感受性の範囲（約0.5 μｇ／ｍｌ〜50μｇ／ｍｌ）に十分入っている。実施例実施例１：リドカイン誘導体の合成ａ．Ｎ−リドカインの製造１．Ｎ−クロロアセチル−２，６−キシリジン： 160ｍＬの氷酢酸中の24 ｍＬの２，６−キシリジン（0.2 mole）を、氷上10℃に冷却し、そして17.1ｍＬの塩化クロロアセチル（0.22mole）を一度に加えた。混合物を激しく10分間攪拌し、200ｍＬの半飽和酢酸ナトリウム溶液を一度に加えた。白色の沈殿が直ちに生じた。混合物を水で500ｍＬとし、室温にて30分間攪拌し、ついで４℃に１時間おいた。白色の粉末を濾過により収集し、水性メタノールから再結晶して白色の細かい針状晶を得た。融点145〜146℃。乾燥重量32.5ｇ（83％）２．Ｎ−リドカインの製造：ピペラジンのサンプル（17.2ｇ，0.2 mole）を150ｍＬの酢酸エチルに加熱して溶解させた。この熱溶液に、上のステップｂ．１からの、50ｍＬの酢酸エチル中の3.98ｇのＮ−クロロアセチル−２，６−キシリジン（0.02mole）を加え、混合物を30分間還流させた。氷上30分間冷却した後、溶液を濾過して形成した塩酸ピペラジンを除去した。濾液を水の各20ｍＬ部分３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレーターで70℃にて１時間溜去した。油状残渣を冷却して固化させた。これを集め、真空下に乾燥させた。乾燥させた沈殿は次の性質を有した：融点109〜114℃、重量3.82ｇ（ 77％）、ＮＭＲ（重水素化クロロホルム）：テトラメチルシランから下領域のpp m ：δ2.2（６Ｈ，シングレット），δ2.6（４Ｈ，トリプレット），δ2.9（４Ｈ，トリプレット），δ3.1（２Ｈ，シングレット），及びδ7.0（３Ｈ，シングレット）。ｂ．Ｎ−リドカインプロピオン酸の製造： 20ｍＬのアセトニトリル中で、上のステップｂ．２からの1.23ｇのＮ−リドカイン（５mole）及び1.25ｇのヨードプロピオン酸（6.25 mmole）を70℃に１時間加熱した。混合物に1.25ｍＬのトリエチルアミンを加え、更に30分間加熱を続けた。混合物を氷上30分間冷却した。沈殿を濾過により集め、冷アセトニトリルで洗浄し、乾燥させた。乾燥したプロピオン酸塩は、次の性質を有した：融点250〜252℃、重量1.5ｇ（94％）、ＮＭＲ（重水素トリフルオロ酢酸）：テトラメチルシランから下領域のppm：δ2 .2（６Ｈ，シングレット）、δ3.2トリプレット、δ3.85（２Ｈ，トリプレット）、δ4.2（８Ｈ，ブロードシングレット）、δ4.7（２Ｈ，シングレット）、及びδ7.1（３Ｈ，シングレット）。実施例２．リドカイン接合体の合成ａ．Ｎ−リドカインタンパク質接合体の製造１． 17mＬの水中の300ｍｇのＨＳＡ（第５番目の画分まで精製、即ち画分５）に、300ｍｇの塩酸エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＰＣ）を加えた。ｐＨを６に（0.1 Ｍの塩酸の添加により）調節し、３ｍＬのエチルアルコール中の150ｍｇのＮ− リドカインを加えた。ｐＨを６に再調節した。混合物を室温にて90分間攪拌し、更に150ｍｇのＥＤＰＣを加えた。混合物を次いで４℃にて終夜攪拌し、そして1 5ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ7.8）に対して徹底的に透析した。２．Ｎ−リドカイン−ＢＳＡ及びＮ−リドカイン−ＫＬＨ接合体の製造にも同じ手順を用いた。ｂ．Ｎ−リドカインプロピオン酸接合体の製造１． 10ｍＬのジメチルホルムアミド（モレキュラーシーブ上で乾燥）中の 160ｍｇのＮ−リドカインプロピオン酸（0.5 mmole）の溶液を氷上で冷却し、13 9μＬのトリエチルアミン（0.5 mmole）を加え、続いて130μＬのクロロ蟻酸イソブチル(0.5 mmole)を加えた。混合物を４℃にて20分間攪拌し、300ｍｇのＰＥＰＡ−200を含んだ15ｍＬの水を加えた。混合物を４℃にて30分おき、次いで室温にて５時間おいた。生成物を透析せず用いた。２．生成物を15ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ7.8）に対して透析したことを除いて、ＰＥＰＡ−200接合体の製造と同じ手順を用いた。実施例３：リドカイン粒子試薬（ＰＲ）の製造ａ．Ｎ−リドカイン−ＨＳＡ−ＰＲ：１ｍｇ／ｍＬのＮ−リドカイン− ＨＳＡの溶液、0.4％の粒子原材料及び34ｍＬの15ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）中の0.18％のＧＡＦＡＣを、70℃にて45分間加熱した。混合物を氷上で冷却し、 Sorvall RC-5B遠心機で19k rpmで90分間遠心した。上澄を傾斜し、ペレットを15 ｍＬの15 ｍＭリン酸緩衝液中に再懸濁させた。この粒子試薬を再び遠心し、そしてペレットを５ｍＬの15ｍＭグリシン（ｐＨ9.0）及び0.01％のチメロサール中に、超音波処理により再懸濁させた。ｂ．Ｎ−リドカイン−ＰＥＰＡ−ＰＲ、Ｎ−リドカインプロピオン酸−ＨＳＡ−ＰＲ及びＮ−リドカインプロピオン酸−ＰＥＰＡ−ＰＲ：ＰＥＰＡ粒子試薬の合成にｐＨ9.5を用いたことを除き、他のリドカイン粒子試薬の製造に同じ手順を用いた。実施例４：粒子増強比濁法阻害イムノアッセイ（ＰＥＴＩＮＩＡ）反応性リドカイン粒子試薬のＰＥＴＩＮＩＡ反応性を、2.5％ＰＥＧ及び0.1％ＳＤＳ、８μＬの抗リドカイン、10μＬの較正標準及び12μＬの粒子試薬を含んだ150 ｍＭのリン酸緩衝液の１ｍＬ溶液中で測定した。Cary 19分光光度計により室温にて反応速度を340ｎｍで追跡した。Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）又はプロカインアミドの誘導体化のための経路プロカインアミド及びＮＡＰＡのためのピペラジン誘導体を作るプロセスのキーステップは、ビス（アミノエチル）ピペラジン（ＢＡＰ）を作ることである。上記反応経路に示したように、ピペラジンは、ビス（シアノメチル）ピペラジン（ＢＣＰ）を与えるためにクロロアセチルニトリルと反応させ、そしてＢＣＰは、加圧下の接触水素添加により還元されてビス（アミノエチル）ピペラジン（ＢＡＰ）を生じる。ＢＡＰは、ＮＨＳ−エステル（II）と結合させて、アセチルプロカインアミドピペラジン誘導体（ＡＰＰ、ＮＡＰＡピペラジン誘導体）を形成させる。タンパク質接合体リンカーは、ＡＰＰを無水コハク酸と反応させることによって導入され、次いでそれをタンパク質と結合させてＮＡＰＡタンパク質接合体を与える。プロカインアミドタンパク質接合体の合成は、ＮＡＰＡの合成に比して、もう１つの保護及び脱保護スペーサーを伴う。下の反応経路IIに示されるように、ｔ−ブトキシカルバミル安息香酸（ＢＯＣ −ＢＡ）を形成して保護するためにｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基を使用し、次いでＢＯＣ−ＢＡを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液中において炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）と反応させ、ＮＨＳ−エステルII’、ｔ−ブトキシカルバミルスクシンイミジルベンゾエート（ＢＯＣ−ＳＢ）を得た。反応経路IIIに示したように、プロカインアミドをタンパク質に接合させた後、ＢＯＣ保護基は、有機溶媒（ジクロロメタン）中においてトリフルオロ酢酸により除去された。上述のＢＡＰ誘導体アプローチを用いて、２つのＮＡＰＡ及び２つのプロカインアミドタンパク質接合体（卵白アルブミン及びＫＬＨ）を合成した。このアプローチの制約は、ＢＣＰの高圧の水素添加であり、それはＢＡＰの収率を低め、約15〜20％にする。ＮＡＰＡピペラジン誘導体及びそのタンパク質接合体の合成実施例５：ＢＣＰ及びＢＡＰの合成 21.535ｇのピペラジン（0.25mole）、77ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）（ 0.55mole）及び300ｍＬのジクロロメタンを1000ｍＬのフラスコに入れた。34.81 ｍＬクロロアセトニトリル（0.55mole）を100ｍＬのジクロロメタンと混合し、次いでピペラジン溶液に攪拌しつつ加えた。反応溶液を室温にて16時間攪拌し、固体の多い沈殿を生じた。生成物を抽出するために100ｍＬのＨＣｌ（１Ｎ）溶液を加えた（この反応溶液は、少なくとも３回抽出された、100ｍＬ×３）。水性ＨＣｌ溶液を50ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した。水酸化ナトリウム溶液（３Ｎ）で溶液のｐＨを11〜12に調節した。固体を濾過により収集し、水で洗浄し、真空下に乾燥させ、20ｇのＢＣＰを約50％の収率で得た。該化合物の構造決定に核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用い、次の結果を得た：¹ＨＮＭＲ（400 Ｍｈｚ，ＣＤＣｌ₃）δppm2.67(8H，S,)，3.55(4H，s)．非常に高い圧力に耐えるために通常使用されている金属容器構造の高圧ボンベに、20ｇのビス（シアノメチル）ピペラジン（ＢＣＰ）（0.122 mole）を充填し、次いで約２〜３ｇのラネーニッケル触媒を25ｍＬの95％エタノールに懸濁させた。触媒を濯ぐのに追加の25ｍＬのエタノールを用いた。ボンベを閉じ、約15ｇ（0.822 mole）の液体アンモニアをシリンダーから導入した。次いで水素をタンク圧（150 lb）にて入れ、そして温度を90℃へと高めた。約２〜３時間後水素がもはや吸収されなくなったとき、ヒーターを止めボンベを放冷した。水素及びアンモニアを逃がし、ボンベの内容物を２回の95％エタノールの50ｍＬ部分で濯ぎ出した。触媒を濾過し、次いで溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。得られた褐色の油を、真空蒸留（70〜80℃／５ｍｍＨｇ）により更に精製して、約4.2ｇのＢＡＰを約21％の収率で得た。ピペラジンからのＢＡＰの全体収率は約10％であった。ＮＭＲの結果は次の通り： ¹ＨＮＭＲ（400 Ｍｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ）δ ppm 1.87(2H，s)，2.23-2.25(2H，m)，2.37(2H，m)，2.58-2. 71(6H，m)，3.66(H₂O，s).実施例６：スクシンイミジルｐ−アセタミジルベンゾエートの合成（ＮＨＳ− エステル、上記の経路IIIを参照） 5.375ｇのｐ−アセタミジル安息香酸（0.03 mmol）、8.453ｇのＤＳＣ（0.033 mole）及び150 ＴＨＦをフラスコに入れた。混合物を室温にて30分間にわたって攪拌した。５ｍＬのトリエチルアミンを加え、次いで反応物を室温にて16時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。副生成物を除去するために、得られた固体を水で３回洗浄した（真空濾過の下）。固体を真空下に乾燥させて、約6.0のｐ−アセタミジルベンゾエート（ＮＨＳ−エステル、I I）を72％の収率で得た。ＮＭＲは次の通り：¹ＨＮＭＲ（400 Ｍｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ）δ ppm 2.12（3H，s）,2.89(4H，s)，3.36(H₂O，s)，7.84(2H，m)，8. 05(2H，m).実施例７：アセチルプロカインアミドピペラジン誘導体（ＡＰＰ）及びＡＰＰ酸の合成 1.69ｇの精製ＢＡＰ及び10ｍＬのＴＨＦを25ｍＬのフラスコに入れた。0.687 ｇのスクシンイミジルｐ−アセタミジルベンゾエートを29ｍＬのＴＨＦに溶解させた。この第２の溶液を、攪拌しつつＢＡＰ溶液にゆっくりと加えた。反応物を攪拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＴＬＣ溶媒としては100％酢酸エチル）によりスクシンイミジルｐ−アセタミジルベンゾエートが検出できなくなるまでモニターした。多くの固体が生じた。溶媒を次いでピペットで除去した。過剰のＢＡＰを除去するため、固体をエチルエーテルで３回（10ｍＬ×３）洗浄した。固体を真空下に乾燥させて66％の生成物を得た（ＡＰＰ，550ｍｇ）。 166.5ｍｇのＡＰＰ及び５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を50ｍＬのフラスコに入れ、次いで69.56μＬのトリエチルアミンを加えた。50ｍｇの無水コハク酸を２ｍＬのＤＭＦに溶解させ、ＡＰＰ溶液に攪拌しつつゆっくりと加えた。反応物を室温にて１時間攪拌した。20ｍＬのエーテル（Ｅｔ₂Ｏ）を加え、そして反応混合物をフリーザー中に終夜おいて生成物（ＡＰＰ酸）を沈殿させた。溶媒をピペットで除去し、Ｅｔ₂Ｏで２回洗浄した（５ｍＬ×２）。残りの固体を真空下に乾燥させて、100ｍｇのＡＰＰ酸を46％の収率で得た。実施例８：ＮＡＰＡタンパク質接合体の合成ａ．ＡＰＰ−ＯＢｔエステルの合成１． 60.00ｍｇ（0.138 mmole）のＡＰＰ酸及び16.54ｍｇ（0.152 mmole）のＨＯＢｔを秤量し、２ｍＬのバイアル中に入れた。マグネティックスターラー・バーを加えた。600μＬの乾燥ＤＭＦをバイアルに加えてＡＰＰ酸及びヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）溶解させた。２． 28.54ｍｇ（0.0.138 mmole）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）を秤量して上記溶液に攪拌しつつ加えた。３．反応物を室温にて２〜３時間攪拌した。活性化された酸は、タンパク質と結合の準備ができている。ｂ．ＡＰＰタンパク質接合体の合成タンパク質溶液Ａ． 0.15 ＭのＮａＨＣＯ₃中の卵白アルブミン１． 0．315ｇの重炭酸ナトリウムを25.0ｍＬのメスフラスコ内へ秤取し、次いで脱イオン水に溶解させ正確に25.0ｍＬとした。２．マグネティックスターラー・バーを含んだ16ｍＬのスクリューキャップつきバイアル中において、50ｍｇの卵白アルブミンを８ｍＬの0.15ＭのＮａＨＣＯ₃（重炭酸ナトリウム）に溶解させた。Ｂ．ＫＬＨ水溶液 16ｍＬの遠心管中において、低温室（４℃）内で終夜穏やかに攪拌することによって50ｍｇのＫＬＨを８ｍＬの脱イオン水に溶解させた。管を遠心した。上澄溶液を16ｍＬのスクリューキャップつき瓶（接合体合成のための反応容器として使用される）内へ注ぎ、冷蔵庫内に貯蔵した。Ｃ．ＡＰＰ接合体１．上記ステップからの上記ＡＰＰ−ＯＢｔのＤＭＦ溶液の各々の300 μＬをＫＬＨ水（２．Ｂ）及び卵白アルブミン緩衝剤溶液（２．Ａ）内にそれぞれ加えた。反応物を室温にて10分間穏やかに攪拌し、次いで４℃の低温室に終夜おいた。２．上記のこれら２つのＡＰＰ接合体タンパク質溶液を脱イオン水を３回交換して透析し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した（卵白アルブミンについては６〜8,000 ＭＷカットオフ範囲の透析チューブを用いた）。プロカインアミドピペラジン誘導体及びそのタンパク質接合体の合成実施例９：ＢＯＣ−ＢＡ及びＢＯＣ−ＳＢの合成ａ．ＢＯＣ−ＢＡの製造１． 3.425 ｇのアミノ安息香酸（ＡＢＡ）及び1.5 ｇの水酸化ナトリウム 100 ｍＬのフラスコ内へ秤取した。２． 25ｍＬの水を攪拌しつつ加えた。３． 5.995 ｇのジ−ｔ−ブトキシジカルボネート（ＤＢＤＣ）を加えた。４．反応物を室温にて終夜攪拌した。５．１ＮのＨＣ１で溶液をｐＨ４〜５へと酸性化した（約37.5ｍＬの１ＮのＨＣ１を要する）。６．生成物を酢酸エチルで３回抽出した（３×25ｍＬ）。７．酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）溶液を水で３回洗浄した（３ ×25ｍＬ）。８．ＥｔＯＡｃ溶液をＭｇＳＯ₄で乾燥させた。９．溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。 10．生成物を秤量し（Ｗ）、収率を次の式を用いて計算した。Ｙ＝（Ｗ／5.01）×100 ％ｂ．ＢＯＣ−ＳＢの合成１． 3.555 ｇのＢＯＣ−ＢＡ（0.015 mole）を秤量し、50ｍＬのアセトニトリルに溶解させた。２． 4.224 ｇのＤＳＣ（0.015×1.1 mole）及び5.22ｍＬのＴＥＡ（0.015 ×2.5 mole）をその混合物に加えた。３．反応物を室温にて２〜３時間攪拌した（反応を50％ＥｔＯＡｃ及び50 ％ヘキサンでチェックした）。４．溶媒を除去した。５．生成物の純度をＴＬＣによりチェックした（生成物を精製するため時折カラムクロマトグラフィーを使用した）。６．生成物（Ｗ）を秤量し、次の式を用いて収率を計算した。Ｙ＝（Ｗ／5.925）×100 ％ＮＭＲの結果は次の通り： ¹ＨＮＭＲ（400 ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ）δ ppm 1.50(9H，s)，2.88(4H，s)，3.34(H₂O，s)，7.71(2H，m)，8.00(2H，m)実施例１０：ＢＯＣ−ＰＰ及びＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳエステルの合成ａ．ＢＯＣ−ＰＰ（ｔ−ブトキシカルバミルプロカインアミドピペラジン誘導体）の合成１． 0.688 ｍｇのＢＡＰを10ｍＬのＴＨＦに溶解させた。２． 334 ｍｇのＢＯＣ−ＳＢを15mＬのＴＨＦに溶解させた。３．ステップ２の溶液（ＢＯＣ−ＳＢ）をステップ１の溶液（ＢＡＰ）中へと攪拌しつつゆっくりと加えた。幾らかの固体が５〜10分後に沈殿した。４．反応物を室温にて30分間攪拌した。５．溶媒をピペットで除去した。固体をエチルエーテルで３回洗浄し（10 ｍＬ×３）て過剰のＢＡＰを除去した。６．固体を真空下に乾燥させて87％で生成物を得た（ＢＯＣ−ＰＰ、340 ｍｇ）。ＢＯＣ−ＰＰは非常に吸湿性であり、デシケーター内に貯蔵しなければならない。ｂ．ＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳエステルの合成１． 107.92ｍｇ（0.276 mmole）のＢＯＣ−ＰＰを４ｍＬのバイアル中に秤取した。マグネティックスターラー・バーを加えた。500 μＬの乾燥ＤＭＦ及び40μＬのＴＥＡをピペットでバイアル内へ加えてＢＯＣ−ＰＰを溶解させた。２． 27.6ｍｇ（0.276 mmole）の無水コハク酸を100 μＬのＤＭＦに溶解させ、ステップ１の溶液中に攪拌しつつ加えた。定量的移し替えを保証するために、バイアルを100 μＬのＤＭＦ溶媒で濯いで該溶液に加えた。３．反応物を室温にて１時間攪拌した。４． 77.78ｍｇのＤＳＣ（0.152 mmole）を秤量し、上記の反応溶液中に加え、続いて、56.0μＬのＴＥＡを攪拌しつつ加えた。５．反応物を室温にて２時間攪拌した。実施例１１：プロカインアミドタンパク質接合体の合成ａ．タンパク質溶液Ａ． 0.15 ＭのＮａＨＣＯ₃中の卵白アルブミン１． 0.630 ｇの重炭酸ナトリウム秤量し、50.0ｍＬのメスフラスコに加え、次いで脱イオン水で溶解させて正確に50.0ｍＬとした。２．マグネティックスターラー・バーを含んだ40ｍＬのスクリューキャップつきバイアル中において、100 ｍｇの卵白アルブミンを16ｍＬの0.15ＭのＮａＨＣＯ₃（重炭酸ナトリウム）に溶解させた。Ｂ．ＫＬＨ水溶液４℃の低温室中で穏やかに攪拌することによって、遠心管内において100 ｍｇのＫＬＨを16ｍＬの脱イオン水に溶解させた。管を遠心し、上澄溶液を40ｍＬのスクリューキャップつき瓶（接合体合成のための容器として使用される）内に注ぎ、そして冷蔵庫内に貯蔵した。ｂ．ＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳとタンパク質との接合実施例６ｂ．５からの140 μＬの上記ＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳのＤＭＦ溶液（0. 138 mmole のＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳ）をＫＬＨ水内へピペットで加え、卵白アルブミン緩衝剤溶液を攪拌しつつ加えた。反応物を室温にて10分間穏やかに攪拌し、次いで低温室（４℃）内に終夜貯蔵した。 c．ＢＯＣ−基の脱保護及び接合体の精製１．２つのＢＯＣ−ＰＰ−ＮＨＳ接合体タンパク質溶液を、脱イオン水を３回交換して透析した。２．これら２つのタンパク質溶液を真空下に凍結乾燥（フリーズドライ）させてタンパク質固体を得た。各タンパク質に５ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂を加え、続いて５ｍＬのトリフルオロ酢酸を加えた。５分間の攪拌の後、溶媒を真空下に濃縮し、残渣を16ｍＬのＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させた。得られた混濁した溶液を脱イオン水を３回交換して、次いでＰＢＳ緩衝剤溶液を３回交換して透析した（６〜8,000 のＭＷカットオフ範囲を有する透析チューブを使用した）。本発明の反応性の誘導体は、ジアルキルアミノ基を有する薬物その他の化合物をタンパク質その他の担体化合物へ接合させるための新規の化合物を提供する。ジアルキルアミノ基を有する種々の薬物が、本発明の誘導体化により利益を受けることができる。本発明の反応性誘導体を製造するために２つの異なったタイプの薬物を誘導体とするための手順は記述されている。当業者は、他のジアルキルアミノ化合物を誘導体にするための他の方法が使用でき、異なった化合物のために変更できることを認識するであろうが、正確な誘導体化の技術は当業者の技能の範囲内である。反応性のピペラジン様誘導体の末端のＮ又は２官能性スペーサーの官能基を担体化合物に接合させるための手順は、異なった薬物及び担体化合物の組み合わせについて異なるであろうが、やはりまた当業者の技能の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ

Claims

【特許請求の範囲】１．担体化合物に接合させるための〔式中、Ｄは、その未だ導体化されていない構造においてジアルキルアミノ基を有する化合物であり、該ジアルキルアミノ基は、残基、によって置き換えられており、そしてｎは１以上の整数である。〕を含む合成物。２．Ｄが、リドカイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ジスピラミド、クロロキン、ジフェンヒドラミン、メサドン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノキシプチリン及びノルトリプチリンよりなる群より選ばれる薬物である、請求項１の合成物。３．該末端窒素が担体化合物に結合しているものである、請求項１の合成物。４．該担体化合物がタンパク質性の物質である、請求項３の合成物。５．該担体化合物が固体支持体に結合しているものである、請求項３の合成物。６．該固体支持体がポリマー粒子である、請求項５の合成物。７．該末端窒素に結合した２官能性のスペーサーを更に含むものである、請求項１の合成物。８．該２官能性のスペーサーが、該ピペラジン様誘導体の該末端窒素に結合した第１の官能性末端と担体化合靴に結合した第２の官能性末端とを有するものである、請求項７の合成物。９．該２官能性のスペーサーが、環状無水物、ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体及びジアルデヒド類よりなる群より選ばれるものである、請求項８の合成物。１０．該担体化合物がタンパク質性の物質である、請求項８の合成物。１１．該担体化合物が固体支持体に結合しているものである、請求項８の合成物。１２．該固体支持体がポリマー粒子である、請求項１１の合成物。１３．免疫原であって、〔式中、Ｄは、その未だ誘導体化されていない構造においてジアルキルアミノ基を有する薬物であり、該ジアルキルアミノ基は、該合成物の誘導体によって置き換えられており、ｎは１以上の整数であり、そしてＸは２官能性のスペーサーである。〕よりなる群より選ばれる合成物を含むものである、免疫原。１４．該薬物が、リドカイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ジスピラミド、クロロキン、ジフェンヒドラミン、メサドン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノキシプチリン及びノルトリプチリンよりなる群より選ばれるものである、請求項１３の免疫原。１５．該２官能性のスペーサーが、環状無水物、ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体及びジアルデヒド類よりなる群より選ばれるものである、請求項１３の免疫原。１６．該整数が１乃至３である、請求項１３の免疫原。１７．該タンパク質が、卵白アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン及び牛血清アルブミンよりなる群より選ばれるものである、請求項１３の免疫原。１８．粒子試薬であって、（ａ）内側コア及び外側シェルを有するポリマー粒子であって、該内側コアはナトリウムＤ線の波長で測定したとき1.54以上の屈折率を有するポリマーであり、そして該外側シェルは、（ｉ）生物学的興味のある求核性化合物と反応することのできる官能基を有するエチレン型不飽和モノマー、（ii）所望により、水不溶性ポリマー粒子を製造するのに十分な量の他のエチレン型不飽和モノマーよりなるポリマーであり、そして（iii）内側コアのモノマーの10重量部以下の外側シェルであり、該外側シェルが該内側コアの存在下における重合により形成されており、（ｂ）〔式中、Ｄは、その未だ誘導体化されていない構造においてジアルキルアミノ基を有する薬物であり、該ジアルキルアミノ基は、該合成物の誘導体によって置き換えられており、ｎは１以上の整数であり、そしてＸは２官能性のスペーサーである。〕よりなる群より選ばれる合成物に共有結合によって結合させてある、粒子試薬。１９．該薬物が、リドカイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ジスピラミド、クロロキン、ジフェンヒドラミン、メサドン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノキシプチリン及びノルトリプチリンよりなる群より選ばれるものである、請求抗１８の粒子試薬。２０．該２官能性スペーサーが、環状無水物、ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体及びジアルデヒド類よりなる群より選ばれるものである、請求項１８の粒子試薬。２１．ｎが１乃至３の整数である、請求項１８の粒子試薬。２２．該担体化合物が、牛血清アルブミン、ポリエチレンポリアミド及びヒト血清アルブミンよりなる群より選ばれる、請求項１８の粒子試薬。