JPH10504098A

JPH10504098A - イムノアッセイの特異性の改良に有用な方法及び試薬

Info

Publication number: JPH10504098A
Application number: JP7528911A
Authority: JP
Inventors: シヨーン，ロバート・シー; 裕三井上; 俊憲武井; 哲城村; スウイーニー，スーザン・イー; ニードバルスキー，ジヨーゼフ・エス
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ; ダイナボット株式会社
Priority date: 1994-05-09
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 1998-04-14
Also published as: EP0760099A4; EP0760099A1; AU6946394A; WO1995030902A1

Abstract

(57)【要約】改良型抗体検出法を開示する。この方法は、（ａ）検体と、スーパーオキシドジスムターゼを含む希釈液とを混合する段階、及び（ｂ）希釈された検体を、スーパーオキシドジスムターゼとの融合タンパク質として発現させた少なくとも１種の組換え抗原と接触させる段階を含む。

Description

【発明の詳細な説明】イムノアッセイの特異性の改良に有用な方法及び試薬発明の背景本発明は概してイムノアッセイの特異性を改良する方法、より具体的には、検体希釈液に変性及び／又は精製した細菌酵素を加えて、細菌酵素との融合タンパク質として発現させた組換え抗原を用いるイムノアッセイの特異性を高める方法に関する。イムノアッセイは歴史的に偽陽性反応を起こしがちであることが知られている。固体支持体上で用いられる典型的な抗原溶液を含むウイルス溶解物又は組換えタンパク調製物は他のタンパク質をも含み得る。これらの他のタンパク質は固体支持体に結合して患者試料中の抗体と反応し得る。あるいは、患者試料中の成分が固体支持体に結合してアッセイを妨害し得る。例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｅら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：７５４− ５７は、自己免疫慢性活動性肝炎（ＡＩ−ＣＡＨ）に罹患している患者が高レベルの抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体を有すると報告し、さらに、ＡＬ−ＣＡＨ患者の血清がアッセイの結果を偽陽性とする成分を含み得ることを示唆した。ＭｃＦａｒｌａｎｅらは、ＩｇＧレベルとＯＤ値との間に相関関係を認めたので、アッセイにより非特異的にＩｇＧが検出されたのではないか、あるいは、アッセイに用いられた抗原と交差反応する何か他の病原体に対する抗体又は固相に付着し且つＩｇＧと結合する成分のような患者血清中に含まれている因子が該結果に関与したのでないかと推測した。さらに、ある種の偽陽性結果は、患者血清と、アッセイに利用する組換え抗原の発現に用いられる融合タンパク質との交差反応性によるものである。本明細書に記載のような反応性は予測され得るものであるから、アッセイは、一般に組換えタンパク質の使用に係わる問題のいくつかを回避するように設計し得る。例えば、米国特許出願第０８／０５９，８６８号に対応するＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９２／１３２７５号（本明細書に参照として組込むものとする）を参照されたい。該刊行物には、スーパーオキシドジスムターゼを検体希釈液に添加することが、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）との融合タンパク質として発現させた組換えタンパク質を用いるアッセイの特異性を高めることに有用であることが教示されている。当業者は、この教示を基にすれば、組換えタンパク質を用いるアッセイの特異性を高めるために検体希釈液に細菌酵素を添加することを考えるであろう。しかし驚くべきことには、本出願人は、そのような細菌酵素を添加しただけでは、たとえ該酵素が同じ細菌宿主系で発現されたものであっても、全てのタイプの融合タンパク質において必ずしも特異性が向上されるわけではないことを見いだした。従って、アッセイにおいて捕獲及び／又は指示試薬として融合タンパク質を用いる場合に、イムノアッセイの特異性を高める方法及び試薬を提供するのが有利である。発明の要旨本発明は、イムノアッセイにおける特異性を高めるための改良法を提供し、該方法は、（ａ）検体と、細菌酵素との融合タンパク質として発現させた変性組換え細菌酵素を含む希釈液とを混合する段階、及び（ｂ）その希釈検体を、該変性細菌酵素との融合タンパク質として発現させた少なくとも１種の組換え抗原と接触させる段階を包含する。変性組換え細菌酵素は組換えタンパク質からなり、ＣＫＳであってもＳＯＤであってもよい。さらに、該変性組換え細菌酵素の濃度は、約０．００１〜約１．０ｇ／ｌ希釈液の範囲である。該変性組換え細菌酵素の濃度が約０．０１〜約０．１ｇ／ｌ希釈液の範囲であればなお好ましい。該組換え細菌酵素は約１００μｇ／ｍｌの濃度であるのが最も好ましい。本発明の方法は、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体や抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体を含む多くの分析物（ａｎａｌｙｔｅｓ）を検出し得る。変性は熱及び尿素を含む多様な方法で実施し得る。また、精製した組換え細菌酵素を用いてもよい。本発明はさらに、組換え細菌酵素との融合タンパク質として発現させた少なくとも１種の組換え抗原を用いるアッセイを実施する際に、テスト試料中の抗体の検出に有用な、変性組換え細菌酵素を含む希釈液を提供する。該変性組換え細菌酵素の濃度は約１００μｇ／ｍｌである。精製した組換え細菌酵素を用いてもよい。さらに本発明はイムノアッセイを実施するためのテストキットを提供し、該キットは、ＣＫＳ及びＳＯＤからなる群から選択される変性組換え細菌酵素を含有する容器を含む。発明の詳細な説明本発明は、個体由来の検体中の抗体の改良型検出法を提供し、該方法に用いられる組換え抗原は、ベクターにより融合タンパク質として発現し、ＣＫＳ又はＳＯＤのような細菌酵素の遺伝子によってコードされる。上記改良法は、検体と変性組換え細菌酵素（例えば、ＳＯＤ又はＣＫＳ）を含む希釈液とを混合する段階を含み、該酵素は、アニオン交換樹脂及びカチオン交換樹脂を含む、本明細書に記載のような当業界において公知の方法で精製し得る。アッセイ診断法において、特定タイプのアッセイ法に用いる血清試料を調製する際に、加熱又は化学的手段によりタンパク質を変性させることは公知である。タンパク質の変性はタンパク質の三次構造（ｔｅｒｔｉａｒｙｂｏｎｄｓ）が破壊されたときに起こり、それによってタンパク質の折り畳みは部分的又は全体的に損なわれる。しかし、通常、アッセイに用いるタンパク質溶液は変性しないように注意しなければならない。というのは、そのような変性が起こると、タンパク質の特性が変化し、アッセイの結果に悪影響を与えるからである。例えば、Ｎ．Ｗ．Ｔｉｅｔｚら，ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｊｓｔｒｙ，第２版，Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９７６），２７０ページを参照されたい。アッセイの特異性を改良するために、アッセイ希釈液に融合タンパク質に用いた組換え細菌酵素を添加することは公知であるが、そのような細菌酵素を希釈液に添加しただけでは、偽陽性反応の量を低減させることによりアッセイの特異性を高めるという所望効果が得られないかもしれない、ということはこれまで知られていなかった。本明細書において、偽陽性結果とは、試料が、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＰＨＡにおいては常に反応性であるが、分析物抗体の存在を測定する代替法では確認されない、として定義される。代替テスト法には、合成ペプチドＥＩＡ、抗体ブロッキング法及び組換えイムノブロットアッセイが含まれる。本出願人は、ある場合には、組換え又は精製組換え細菌酵素を添加しても、組換えタンパク質を用いるアッセイの特異性が向上されないことを見いだした。驚くべきことには、本出願人は、組換え細菌酵素を変性させることによりアッセイの特異性が高まることを知見した。本出願人はさらに、希釈検体中に精製した変性組換え細菌酵素を用いてアッセイの特異性を有利に向上させ得る場合があることを見いだした。希釈液（以後に定義する）に変性組換え細菌酵素を添加してアッセイの特異性を高めることにより分析物の検出を改良するのが特に有利であることが知見された。イムノアッセイには、ベクターにより融合タンパク質として発現される組換え抗原を用いることができるが、該抗原はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子又はＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−ｍａｎｎｏ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ又はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ）遺伝子によりコードされるもの〔１９９２年６月２３日発行の米国特許第５，１２４，２５５号及び米国特許出願第０７／９０３，０４３号（両文献とも本明細書に参照として組込むものとする）を参照されたい〕である。従って、細菌酵素との融合タンパク質として発現させた組換え抗原を用いるアッセイは、患者試料中の抗ＳＯＤ又は抗ＣＫＳ抗体と干渉する反応を示し得る。この抗ＣＫＳ又は抗ＳＯＤの作用は、用いられる細菌酵素を検体希釈液に添加する前に変性させない限り、偽陽性反応として除去し得るものではない。好ましくは組換え工学的に得られた細菌酵素は、約０．００１〜約１ｇ／ｌ、より好ましくは約０．００５〜約０．５ｇ／ｌ、最も好ましくは約０．０１〜約０．１ｇ／ｌの範囲の濃度で希釈液に添加し得る。細菌酵素は細菌抽出物から精製又は部分精製されたタンパク質として添加し得る。しかし、細菌酵素は希釈液に添加する前又は希釈液中で使用する前に変性させなければならないことが知見された。変性は、約５０〜６０℃の温度で約２０〜６０分間の加熱、並びに化学物質、例えば、８Ｍ尿素、グアニジン及びある種の有機溶媒による細菌酵素の処理を含む、当業界において公知の方法により実施し得る。本発明によれば、本明細書において「希釈液」とは、当業界においては周知であり且つ上記に示されているような緩衝液及び塩の水溶液と定義される。好ましい緩衝液は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからＴｒｉｓという商標名で市販されているトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、又はリン酸緩衝液であり、適当な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２− ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス［２−エタンスルホン酸］）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス［２−エタンスルホン酸］）、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１− プロパンスルホン酸）及びＭＯＰＥＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）のような緩衝液が含まれるが、それらには限定されない。適当な塩には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）やリン酸塩及び硫酸塩のような塩が含まれる。さらに、種々の動物血清、界面活性剤、ブロッキング剤及び他の成分を加えて特異性を改良し得る。例えば、ウシ血清、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清及びヤギ血清のような動物血清タンパク質を、約０．５〜約５０として市販されているポリオキシエチレンソルビタン、シエチレンエーテル、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（オクチルフェノール−エチレンオキシド縮合物）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はＮ−ラウロイルサルコシン（Ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシン）のような生物界面活性剤を、約０．０１〜約５％ｖ／ｖの範囲の濃度で加えてもよい。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル） −Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）のようなキレート化剤を、約２〜約２０ｍＭの範囲の濃度で添加してもよい。固体支持体上で用いられる抗原溶液を含むウイルス溶解物又は組換えタンパク質に含まれる他のタンパク質による非特異的反応を中和するために、リンパ球溶解物溶液、例えば、ヒトＴ−リンパ球溶液又はＥ．ｃｏｌｉ溶菌液のような宿主細胞溶解物溶液を、典型的には約０．０１〜約１０％ｖ／ｖの範囲の濃度で添加し得る。アジ化ナトリウムのような保存剤を加えてもよい。検体希釈液を用いて種々のアッセイ法のテスト検体を希釈し得る。アッセイに用いられる希釈液試薬は、１個以上の容器例えばバイアル又はビンを含むキットの形態で供給され得、各容器は、アッセイに用いられる希釈液、モノクローナル抗体若しくはその組合わせ又は組換えタンパク質のような別個の試薬を含む。アッセイ法に用い得る「固相」（「固体支持体」）は当業者には公知であり、反応トレイのウエル壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子のような微粒子などが含まれる。「固相」の種類は重要ではないが、当業者が選択し得る。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁性又は非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウエルの壁、ガラス又はシリコンチップ及び赤血球はいずれも適当な例である。固相上にペプチドを固定させる適当な方法には、イオン相互作用、疎水的相互作用、共有結合相互作用などが含まれる。本発明は、特異的結合メンバーを用いるイムノアッセイの特異性を高めるための希釈液、テストキット及び方法を提供する。本明細書に用いられている「特異的結合メンバー」とは、特異的結合ペアのメンバー、即ち、一方の分子が化学的又は物理学的手段により他方の分子に特異的に結合する２つの異なる分子である。従って、一般的なイムノアッセイの抗原抗体特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアには、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などが含まれ得る。さらに、特異的結合ペアには、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、分析物類似体が含まれ得る。免疫反応性特異的結合メンバーには、組換えＤＮＡ分子により形成されたものを含む、抗原及び抗原断片、モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体及び該抗体の断片、並びにその複合体が含まれる。本明細書に用いられている「ハプテン」という用語は、担体タンパク質に結合しない限り抗体の形成を誘発し得ないものであって、抗体に結合し得る不完全抗原（ｐａｒｔｉａｌａｎｔｉｇｅｎ）又は非タンパク性結合メンバーを指す。本明細書に用いられている「分析物」とは、テスト試料中に存在し得る検出すべき物質を指す。分析物は、天然の特異的結合メンバー（例えば、抗体）が存在する物質であるか、又はその特異的結合メンバーを形成し得る任意の物質であってよい。従って、分析物は、アッセイにおいて１つ以上の特異的結合メンバーに結合し得る物質である。「分析物」には、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体及びその組合わせも含まれる。分析物は、特異的結合ペアのメンバーとして、ビタミンＢ₁₂を定量するための特異的結合ペアのメンバーとして固有のタンパク性因子を使用するか、又は葉酸を定量するために葉酸結合タンパク質を使用するか、又は炭水化物を定量するために特異的結合ペアのメンバーとしてレクチンを使用する、というように天然の特異的結合パートナー（ペア）を用いて検出し得る。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与されるもの又は違法な目的で投与されるものを含む薬剤、細菌、ウイルス、及び上記物質のいずれかの代謝物又は該物質に対する抗体を含み得る。そのような抗体の調製及び特異的結合メンバーとしての使用適格についての詳細は当業者には周知である。テストし得るウイルス類には、肝炎の原因ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎及びＥ型肝炎ウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−IIウイルスなどが含まれる。本明細書に記載の種々のアッセイ法に「指示試薬」を用いてもよい。「指示試薬」は、分析物に特異的な結合メンバーに結合（付着）した外部手段により検出し得る測定可能シグナルを生成し得る「シグナル生成化合物」（標識）を含む。本明細書に用いられている「特異的結合メンバー」とは、特異的結合ペアのメンバー、即ち、一方の分子が化学的又は物理学的手段により他方の分子に特異的に結合する２つの異なる分子を意味する。指示試薬は、分析物に特異的な結合ペアの抗体メンバーであることに加えて、ハプテン−抗ハプテン系、例えば、ビオチン又は抗ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子又はレセプター分子、酵素補因子又は酵素、酵素阻害剤又は酵素などを含む任意の特異的結合ペアのメンバーでもあり得る。免疫反応性特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおいては分析物に、競合アッセイにおいては捕獲試薬に、又は間接アッセイにおいては補助的特異的結結合メンバーに結合し得る、抗体、抗原又は抗体／抗原複合体であってよい。考えられる種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、色素原、酵素のような触媒、フルオレセイン及びローダミンのような発光化合物、化学発光化合物、放射性元素、並びに直視標識（ｄｉｒｅｃｔｖｉｓｕａｌｌａｂｅｌｓ）が含まれる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は重要ではないが、標識は、単独で又は１種以上の追加物質と結合してシグナルを生成し得る。「テスト試料」という用語には、本明細書に記載の本発明方法によりテストし得る生物学的試料が含まれ、該試料には、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液のようなヒト及び動物の体液、呼吸器、腸管及び尿生殖器管の種々の外分泌液、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫等、細胞培養上清、固定した組織標本及び固定した細胞標本のような生物液が含まれる。組換えタンパク質を用い本発明に記載のアッセイ法により希釈及びテストし得る物質はいずれも本発明の範囲内に包含されるものとする。選択されるアッセイ法の如何に拘わらず、希釈されたテスト試料を用いるものとする。当業界では多くのアッセイ法が公知であり、捕獲又は指示試薬として組換え抗原を用いるアッセイ法は全て本発明の範囲内に包含されるものとする。従って、１段階及び２段階サンドイッチイムノアッセイ、血球凝集反応アッセイ、競合アッセイ、中和アッセイ、イムノドットアッセイは全て本発明の範囲内に包含されるものとする。ハプテンの使用は当業界において公知である。アッセイの性能を高めるために、融合タンパク質を用いるアッセイにハプテンを用い得ることも考慮に含まれる。以下の実施例は本発明の思想及び範囲を説明することを目的とし、本発明を限定するものではない。実施例実施例１．ＨＩＶアッセイ用の組換えＣＫＳ−ｒｐ３６の作製Ａ．アニオン交換樹脂の調製ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。６Ｍグアニジン−塩酸中のＣＫＳ−ｒｐ３６抗原溶液を該カラム及び８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で処理して、８Ｍ尿素中のＣＫＳ−ｒｐ３６抗原溶液を得た。この溶液交換法の代わりに透析法を用いてもよいことが知見された。そのような処理により、精製・変性細菌酵素調製物を得た。次いで、ＤＥＡＥイオン交換樹脂又はＱＡＥイオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ −５ＰＷ（Ｔｏｓｏから入手可能）、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）、をカラムに充填し、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。次いで、８Ｍ尿素中のＣＫＳ−ｒｐ３６溶液を上記アニオン交換樹脂カラム上に流した。この段階では、１ｍｌ／分の流速でＣＫＳ −ｒｐ３６抗原を流した。以下のように、得られたＣＫＳ− ｒｐ３６抗原を受動的血球凝集反応アッセイ（ＰＨＡ）の抗原として用いた。変性ＣＫＳ−ｒｐ３６抗原をヒトＯ型赤血球上にコーティングし、ＰＨＡアッセイキット（Ｄａｉｎａｂｏｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に用いた。テスト血清を記載の種々の濃度に希釈したこのＰＨＡテストキットを用い、３千人のボランティア血清ドナーをテストした。得られた結果を以下の表１に要約する。Ｂ．カチオン交換樹脂の調製ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。６Ｍグアニジン−塩酸中のＣＫＳ−ｒｐ３６抗原溶液を、該カラム及び８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で処理して、８Ｍ尿素中のＣＫＳ−ｒｐ３６抗原溶液を得た。溶液交換法の代わりに透析法を用い得ることも知見された。次いで、ＣＭイオン交換樹脂又はＳＰイオン交換樹脂、例えばＣＭ−３ＷＳ（Ｔｏｓｏから入手可能）、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）、をカラムに充填し、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。次いで、ＣＫＳ−ｒｐ３６抗原を上記カチオン交換樹脂カラム上に流した。次いで、該カラムを徹底的に洗浄し、１ｍｌ／分の流速で塩を用いた段階的溶離によりＣＫＳ−ｒｐ３６抗原を溶出した。次いで、変性させたＣＫＳ融合タンパク質をヒトＯ型赤血球上にコーティングし、上記ＰＨＡアッセイの抗原として用いた。テスト血清を種々の濃度に希釈した上記ＰＨＡキットを用い、３千人のボランティア血清ドナーをテストした。得られた結果を以下の表２に要約する。Ｃ．アニオン及びカチオン交換樹脂の調製上記の処理それぞれから得られたＣＫＳ−ｒｐ３６抗原をヒトＯ型赤血球上にコーティングし、上記ＰＨＡアッセイによりテストした。本実施例の（Ａ）及び（Ｂ）項に記載の方法によりテストして偽陽性とされた８種のテスト検体を種々の濃度に希釈して、本実施例に記載の抗原を用いて再テストした。得られた結果を表３に要約する。実施例２．ＨＩＶ関連抗体アッセイキットの作製先ず、ヒトＯ型赤血球を生理食塩水（ｐＨ７．０）で洗浄し、次いで、ＤＥＡＥ−ＣＭ処理ＨＩＶＣＫＳ−ｒｐ３６抗原を含む溶液と共にインキュベートした。細胞を該抗原溶液中２時間室温でインキュベートし、リン酸緩衝塩水で洗浄した。抗原をコートした細胞の溶液は、生理食塩水溶液中１．０％（ｖ／ｖ）の抗原コーティング細胞からなるものであった。３，０００人のボランティア血清ドナーをテストする際には、本明細書に記載のＰＨＡアッセイに、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−１溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３溶解物、Ｅ．ｃｏｌｉｐＴＢ２１０／ＸＬ−１溶解物、２０μｇ／ｍｌ組換えＣＫＳ溶解物及び２０μｇ／ｍｌ精製組換えＣＫＳを用いた。結果を以下の表４に要約する。これらのデータは、ＤＥＡＥ及び／又はＣＭ処理したＣＫＳ−ｒｐ３６ＨＩＶ抗原を用い、該ＣＫＳ材料を本実施例及び実施例１のように８Ｍ尿素で変性させると、Ｅ．ｃｏｌｉにより引き起こされる偽陽性反応の数を減少させ得ることを示している。実施例３．組換えＣＫＳの作製米国特許第５，１２４，２５５号に記載の方法を用い、ＤＮＡの合成配列を作製した。実施例４．検体希釈液０．１５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌ以下の組換えＣＫＳ細菌酵素（実施例３に記載のように調製した）を含む２０ｍＭＴｒｉｓリン酸緩衝液中１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清及び２０％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を含む試料希釈液を調製し、組換えＣＫＳ細菌酵素を５０ ℃で約３０分変性させてから該希釈液に加えた。実施例５．ＨＩＶアッセイの特異性パネルテストＣＫＳによる偽反応を評価するために実験を行い、組換え細菌酵素の熱処理により偽陽性反応が減少するかどうかを測定した。過去のデータは、第２世代ＨＩＶアッセイ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）にＣＫＳ溶解物を添加しても、発生すると思われる偽陽性反応の数を減少させることによる第２世代ＨＩＶアッセイの特異性の向上が得られないことを示していた。従って、組換えＣＫＳ細菌酵素を変性させると特異性が改良されるかどうかを測定するための実験を設計した。テストには、陽性及び陰性対照と共に、１０メンバーからなる特異性パネルを選択した。該実験にはＡｂｂｏｔｔの第２世代ＨＩＶアッセイ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）を用いた。検体は２回テストし、対照はそれぞれ５回テストした。標準アッセイ試薬として利用し得る希釈液と実施例４に記載のような（５０℃で３０分間変性させた）ＣＫＳ組換え細菌酵素を含む希釈液との比較を行った。用いたアッセイプロトコルは、アッセイの製造業者に推奨されたものであり、得られた読取り値は光学密度読取り値（Ｏ．Ｄ．）として記録した。結果を以下の表５に要約する。これらのデータから、１０メンバー特異性パネル中のメンバー１、４、５、７、８及び９を含む数メンバーに有意な改良（＞５０％Ｏ．Ｄ．減少）が示されたことがわかる。メンバー７及び９のテスト結果は陽性から陰性に転じ、パネルメンバー９は最も有意な効果を示した。実施例６．ＨＩＶ１／ＨＩＶ２ＴｅｓｔＰａｃｋアッセイの特異性パネルテストＣＫＳによる偽反応を評価するために実験を行い、組換え細菌酵素を熱処理すると、ＡｂｂｏｔｔＴｅｓｔｐａｃｋＨＩＶ１／ＨＩＶ２アッセイにおける偽陽性反応が減少するかどうかを測定した。過去のデータは、ＨＩＶ１／ＨＩＶ２ＴｅｓｔＰａｃｋＡｓｓａｙ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬから入手可能）にＣＫＳ溶解物を添加しても、発生すると思われる偽陽性反応の数を減少させることによるＨＩＶアッセイの特異性の向上が得られないことを示していた。従って、組換えＣＫＳ細菌酵素を変性させると特異性が改良されるかどうかを測定するための実験を設計した。テストには、陽性及び陰性対照と共に、実施例７に記載のものと同じ１０メンバーからなる特異性パネルを選択した。該実験には、ＡｂｂｏｔｔＨＩＶ１／ＨＩＶ２Ｔｅｓｔｐａｃｋアッセイ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬから入手可能）を用いた。陽性及び陰性対照を含む標本は２回テストし、種々の濃度（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ及び１００ μｇ／ｍｌ）の熱処理ＣＫＳ組換え細菌酵素をテストした。ＣＫＳ細菌酵素を変性させるための熱処理は全て５０℃で３０分間実施した。用いたアッセイプロトコルは、アッセイの製造業者が推奨したものであり、得られた読取り値は、陽性、陰性又は陽性／陰性として記録した。この実験から得られたデータは実施例５で得られたデータに類似しており、変性させたＣＫＳ組換え細菌酵素を用いた場合に、ＨＩＶ１／ＨＩＶ２ＴｅｓｔＰａｃｋアッセイに特異性の改良が示された。殆どの場合、特異性の向上に十分な濃度は１２μｇ／ｍｌであったが、変性ＣＫＳ組換え細菌酵素の好ましい濃度は、１００μｇ／ｍｌであることが知見された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者武井俊憲東京都杉並区阿佐ヶ谷北３−36−３ (72)発明者城村哲千葉県野田市谷津626−１ (72)発明者スウイーニー，スーザン・イーアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデイライン、クレセント・ドライブ・78 (72)発明者ニードバルスキー，ジヨーゼフ・エスアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、ウエスト・マウント・バーノン・コート・6894

Claims

【特許請求の範囲】１．検体中の抗体を検出する方法であって、（ａ）該検体と、変性した組換え細菌酵素を含む希釈液とを混合する段階、及び（ｂ）該希釈検体を、前記変性細菌酵素との融合タンパク質として発現させた少なくとも１種の組換え抗原と接触させる段階、を包含する前記方法。２．前記変性組換え細菌酵素が組換えタンパク質からなる、請求項１に記載の方法。３．前記変性組換え細菌酵素がＣＫＳである、請求項１に記載の方法。４．前記変性組換え細菌酵素が交換カラムに通して精製したものである、請求項１に記載の方法。５．前記変性組換え細菌酵素の濃度が、約０．００１〜１．０ｇ／ｌ希釈液である、請求項１に記載の方法。６．前記変性組換え細菌酵素の濃度が、約０．０１〜約０．１ｇ／ｌ希釈液である、請求項５に記載の方法。７．前記組換え細菌酵素が約１００μｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の方法。８．抗ＨＣＶ抗体を検出する、請求項１に記載の方法。９．抗ＨＩＶ抗体を検出する、請求項１に記載の方法。１０．前記組換え細菌酵素を熱により変性させる、請求項１に記載の方法。１１．前記組換え細菌酵素を尿素により変性させる、請求項１に記載の方法。１２．組換え細菌酵素との融合タンパク質として発現させた少なくとも１種の組換え抗原を用いるアッセイを実施する際に、テスト試料中の抗体の検出に有用な、変性組換え細菌酵素を含む希釈液。１３．前記変性組換え細菌酵素の濃度が約１００μｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の希釈液。１４．変性組換え細菌酵素を含有する容器を含む、イムノアッセイの実施に有用なテストキット。１５．前記変性組換え細菌酵素をＣＫＳ及びＳＯＤからなる群から選択する、請求項１４に記載のテストキット。