JPH10503016A

JPH10503016A - 全血中のヘモグロビンと白血球のシアン化物を含まない測定方法および試薬

Info

Publication number: JPH10503016A
Application number: JP8505084A
Authority: JP
Inventors: ウオン，シヨー−チユ; コー，シルビア
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-03-17
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: AU3094695A; CA2191614A1; JP3529786B2; CA2191614C; US6740527B1; US5958781A; WO1996002841A1; EP0770216A1

Abstract

(57)【要約】血液試料中に存在するヘモグロビンおよび白血球測定用のシアン化物を含まない試薬は、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ベンゾアルコニウムからなるアルキルトリメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩またはアルキルピリジウム塩の群から好ましくは選択される少なくとも１種類の第四級アンモニウム塩、およびヒドロキシルアミン塩、特に塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩および他の酸の塩の水性溶液からなる。本方法は該試薬を希釈剤で希釈した血液試料と混合し、これを吸光度分光光度計に入れ、得られた光学密度をヘモグロビン濃度を示すものとして測定することによる。このシアン化物を含まない試薬はヘモグロビン測定のためだけに用いることもでき、または血液用装置を用いた白血球のカウンティングとサイジイングにも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】全血中のヘモグロビンと白血球のシアン化物を含まない測定方法および試薬技術分野本発明は全血試料中のヘモグロビンと白血球の測定に有用な方法および試薬に関する。より具体的には、本発明は、全血中に存在するヘモグロビンの量を慣用の方法により示す安定で検出可能な色原体の迅速な形成に使用される、シアン化物を含まない試薬に関する。さらに、本発明は白血球の測定ならびにヘモグロビンの測定に適する。本試薬と方法は自動化された血液用機器、特に、ヘモグロビンと白血球の測定に適合した溶解用試薬を用いて全血試料の同一のアリコートを利用する機器における利用に適する。発明の背景白血球（ＷＢＣ）の総数およびヘモグロビン（Ｈｂ）の測定値を決める参照または標準的な方法は通常はシアン化カリウム（ＫＣＮ）を含有する試薬または他のシアン化物を含有する化合物を利用する。これらのシアン化物化合物は毒性のあるシアン化水素（ＨＣＮ）を作り得るので使用するには危険がともなうことがある。これらの化合物は環境的に毒性のあるシアン化含有のために廃棄することも困難となることがある。したがって、研究者たちはシアン化物を含有しない代用試薬を開発するために研究を行なっている。しかし、これらの努力は多数の試料を処理する高処理量の自動化装置、手動により行なわれる遅い方法、または半自動化された装置での利用には一定の限界を有している。これら試薬の一部により作られる色原体化合物の形成はシアン化物が存在しない場合に非常に遅いことがあり、また作られる色原体は試験している間に不安定であるか、または整合しないこともある。さらに、これらの代わりとなる試薬は装置のハードウェアまたはソフトウェアに変更を行なうことなしに同じ全血試料を用いてＨｂおよびＷＢＣの測定を行なうことはできないこともある。したがって、現在利用可能な血液用装置により使用されるインビトロ分析のために、シアン化物を含まず、かつそれでも信頼性がある方法および試薬システムが必要とされる。現在の自動化された血液用装置の処理量は速い反応速度を示す方法と試薬の利用が必要である。例えば、アボットラボラトリーズのＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３０００装置のヘモグロビン試料ターンオーバー速度は約１２秒である。アボットラボラトリーズのＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００と３５００装置システムはヘモグロビン測定に約２４秒かかる。さらに、これらの装置のほとんどで血球サイズおよび血球総数測定の両方ならびに赤血球中のヘモグロビンの濃度について同一の血液細胞アリコート試薬システムの使用が必要とされている。現在の血液用分析装置は、ヘモグロビンの測定および白血球のカウンティング（総数測定）とサイジング（サイズ測定）の両方で、全血と試薬の同じ希釈と反応混合物が用いられる。「標準的な」溶解用／ヘモグロビン試薬は典型的には白血球を適当に溶解させて正確な白血球の計数を可能とさせる成分、ならびに赤血球中のヘモグロビン含量の正確な比色分析を可能とする安定な色原体（シアンメテモグロビン）を形成させるシアン化物含有化合物を含有する。したがって、新しい溶解用試薬が実用的であるためには、存在する自動化および半自動化血液用装置で用いる際にそれら装置または実施される方法のいずれにも変更を加えることなく容易に適合しなければならない。しがたって、シアン化物を含まない溶解用試薬が満足させさなければならない多くの重要な要件が存在する。これらの一部は以下の通りである。１．作られる色原体は、現在の自動化されたほとんどの方法のシアンメテモグロビン最適吸光度範囲の５３０ｎｍと５５０ｎｍの間に最大吸光度を有していなければならない。２．ヘモグロビンおよび白血球測定の自動化または半自動化方法に良好で再現性のある結果を提供するために、作られる色原体は形成が速いのみならず、少なくとも５分間はかなり安定でなければならない。３．溶解用試薬はヘモグロビン色原体の形成を妨害してはならず、白血球のサイズ測定および総数測定法中に白血球の安定性に悪い影響を与えることはできない。発明の要約全血試料を希釈剤で希釈し、この全血試料／希釈剤を、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゾアルコニウム、塩化セチルピリジウムからなる群から選択される少なくとも１種類の約０．１〜約２０重量％第四級アンモニウム塩および塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩からなる群から選択される約０．１〜約１５重量％ヒドロキシルアミン塩を含有する水性溶解用試薬と混合することを特徴とするＨｂとＷＢＣの測定を行なうための方法が提供される。色原体を形成し、検出し、測定することにより全血中試料中のＨｂ濃度、ならびにＷＢＣ集団細胞数および副集団細胞数の測定値が示される。さらに、多様な装置で利用するこのできるシアン化物を含まない多目的溶解用試薬の組成物が提供される。図面の簡単な説明図１は、本発明の試薬等の多様な色原体形成試薬で処理された正常な全血試料に関する吸光度カーブを示すスペクトルであり、本発明の溶解用試薬が有する吸光度範囲は現在利用可能な試薬が示す範囲（５３０〜５５０ｎｍ）と同じであることを示す。図２は時間に対してプロットされた一連の吸光度カーブであり、本発明の溶解用試薬等の多様な試薬に関する時間に対する色原体の形成および色原体の安定性を示す。図３は時間に対してプロットされた一連の多様なヘモグロビン濃度に関するもう一つの吸光度カーブであり、選択された現在の参照方法に関する反応速度と安定性を示す。図４は時間に対してプロットされた一連の吸光度カーブであり、本発明の方法を用いた場合のヘモグロビンの多様な濃度（図３と同じ）に関する反応速度および安定性を示す。図５Ａ〜図５Ｄは実施例１３で実施され論じられた試験結果を報告する表である。図６Ａ〜図６Ｄは実施例１４で実施され論じられた試験結果を報告する表である。図７Ａ〜図７Ｃは実施例１５で実施され論じられた試験結果を報告する表である。図８は実施例１９の安定性研究で得られた結果を示す表である。図９は実施例２０の安定性研究の結果を示す表である。図１０Ａ〜図１０Ｃは実施例２１の安定性研究の結果を示す表である。図１１は実施例２２で実施され論じられた試験結果を示す表である。図１２は正常な全血試料中の三段階分布および副集団細胞数をプロットしたグラフである。発明の詳細な説明本発明は異なる時間と反応方法を利用する多様な装置を用いてヘモグロビンと白血球を測定する際に用いられる理想的な多目的溶解用試薬を提供する。本方法の成果はＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）とＣｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ装置および市販の溶解用試薬により利用される現在の方法に匹敵する。本発明の多目的溶解用試薬は凍結および加熱に対して優れた安定性、および６０℃で１５ヵ月までの安定性を示した。また、速い反応時間（安定化するために５〜６秒）を示し、約５４５ｎｍで吸収を示す色原体を作る。唯一の必要な変更は特定の装置について試薬の濃度を最適化することである。本発明は溶媒と少なくとも１種類の希釈剤および溶解用試薬を必要とする。この希釈剤はヘモグロビンおよび白血球測定前に全血試料を希釈するために用いられる。前記の溶媒は、この希釈された全血試験試料中で溶解用試薬が赤血球と接触する前に溶解用試薬を水性溶液とするために用いられる。前記の希釈液は典型的には無機または有機の塩溶液である。前記の溶媒は典型的には脱イオン水である。明確化の目的ために、以下に用いられる希釈液という用語は他に記載のない限り塩溶液を意味する。本発明の溶解用試薬は１種類以上の第四級アンモニウム塩およびヒドロキシアミンの水性溶液からなる。この溶解用試薬は典型的には希釈剤と組み合わせて用いる。溶解用試薬と希釈剤のこの組合せは、試薬システムがヘモグロビンと白血球の測定の特定の要件を満足させるために重要なことが示されている。選択される緩衝液および他の成分は、試薬システムの最適な全体の溶液ｐＨと浸透モル濃度を保持するために、希釈剤に添加し溶解用試薬と組み合わせて用いるのが望ましいであろう。例えば、ヘモグロビン測定の手動または半手動の方法のために重要な要件を満足させる非常に安定な色原体反応時間を得るために、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）溶解用試薬と等張化用リン酸希釈物の組合せを用いることができる。本発明に有用な第四級アンモニウム塩は、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゾアルコニウム、塩化セチルピリジウムおよび他の第四級アンモニウム塩からなるアルキルトリエチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩およびアルキルピリジウム塩からなる群から選択される。第四級アンモニウム塩は好ましくは０．１〜２０重量％の全濃度範囲で溶解用試薬中に存在させる必要がある。具体的な濃度は特定の血液用システムの特性および試薬システムが用いられる操作方法に依存する。ヒドロキシルアミン塩は好ましくはその濃度が約０．１〜１５重量％に保たれるように溶解用試薬に添加しなければならない。ヒドロキシルアミン塩は赤血球溶解の際に形成する色原体の安定化を加速するために添加される。具体的な濃度は、溶解用試薬を用いようとする血液用システムにより決定されることを再度注意されたい。緩衝液は希釈物中に用いてもよい。特に好ましい緩衝液は希釈物が用いられる特定の血液用システムと該装置の性能要件に依存する。通常、緩衝液はｐＫａ６．２〜８．０、濃度５〜２５ミリモル（ｍＭ）、ｐＨ６．５〜７．５であり、緩衝剤用の希釈液は浸透モル濃度２５０〜３５０ミリ浸透モル／キログラム（ｍＯｓＭ／ｋｇ）である。本発明の試薬システムに用いられる生物学的緩衝液の一部として、Ｎ−［２−アセトアミド］ ‐２‐イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、３‐［Ｎ‐モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ‐ビス［２‐ヒドロキシエチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ‐［２‐ヒドロキシエチル］ピペラジン‐Ｎ’‐［２‐エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン‐Ｎ，Ｎ’‐ビス［２‐エタンスルホン酸］（ＰＩＰＥＳ）、ビス［２‐ヒドロキシエチル］イミノ‐トリス［ヒドロキシメチル］‐メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、トリエタノールアミン、イミダゾール、ホウ酸塩およびリン酸塩が挙げられる。最も好ましい緩衝液はＡＤＡとイミダゾールである。本発明の方法は容易である。全血試料は希釈剤で処理する。溶解用試薬は特定量の第四級アンモニウム塩とヒドロキシルアミン塩を溶媒に溶解して調製する。この溶解用試薬は前記の希釈された全血試料と混合し、次にこの混合試料をヘモグロビン・フロー・セル（吸光度分光光度計）に入れて、５４０〜５５０ナノメーター（ｎｍ）の光学密度を測定する。次に、この光学密度測定値をヘモグロビン濃度に関連付ける。この結果を全血の単位容量あたりの測定重量として報告する。前記の溶解用試薬は特定量の第四級アンモニウム塩とヒドロキシルアミン塩を溶媒に溶解して調製する。通常、これらの塩を溶解するために用いられるこの溶媒は脱イオン水である。先行技術のシアン化物を含有する試薬の代わりとなることのできるシアン化物を含まない本発明の試薬の特徴の一つはシアン化物を含まない試薬により作られる色原体の吸光度である。多様な試薬に関する吸光度カーブを図１に示す。カーブ１はシアン化物を含有する参照試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ、アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州６００６４）に対応する。カーブ２は本発明の溶解試薬に対応する。カーブ３はＯｓｈｉｒｏらの溶解用試薬（ドデシル硫酸ナトリウム）のデータを示す。カーブ４は米国特許第４，１８５，９６４号に記載の溶解用試薬（第四級アンモニウム塩）を用いたポリカルボン酸のデータを用いて作ったものである。カーブ５はＴＴＡＢ（第四級臭化アンモニウム）のみを有する試薬のデータを表す。カーブ６は米国特許第５，２５０，４３７号に記載のように０．５％亜硝酸ナトリウムを用いた試薬を用いて作ったものである。図１は、本発明の溶解用試薬が５３０〜５５０ｎｍで所望の吸光度特性を作ることを示している。現在使用されているシアン化物含有試薬の代用するものとしての本発明の望ましさを示すためには、本発明の溶解剤は、それが置き換えようとする試薬に匹敵する性能特性を有したことを示すことが必要である。図２は、多様な先行技術の試薬および本発明の溶解用試薬の５４０ｎｍでの反応時間（ピーク性能でのヘモグロビンの変換速度）と安定性を評価するために行なった実験をまとめたものである。反応時間は、血液用装置、特に手動および半自動化装置で用いられる本試薬の性能にとって重要である。そうした装置の読みとり時機は結果に影響を与え得る。したがって、速く反応する溶解用試薬および速く形成して安定な色原体は読みとり時機の問題の軽減に役立つ。同様に、形成後の色原体の安定性は自動化および半自動化装置で用いられる本試薬の使用に重要である。図２は本発明の溶解用試薬が速い色原体形成を経た後に非常に安定な吸光度特性を有することを示している。これらの特性のいずれも、先行技術のシアン化物を含まない試薬（カーブ３、４、５および６）よりも本発明の溶解用試薬の方が顕著に良好であった。シアン化物を用いる参照方法は高い吸光度値を有していたが、本発明の方法でのシアン化物を含まない試薬は速い反応時間と高い色原体安定性を示している。図３は、シアン化物を含有する参照溶解用試薬を使用した場合で多様なヘモグロビン濃度（下から上へ、７．７グラム／デシリットル（ｇ／ｄＬ）、１２．３ｇ／ｄＬ、１６．５ｇ／ｄＬおよび２１．５ｇ／ｄＬ）を有する血液試料に関する色原体形成時間と経時的な色原体の安定性を示す。図４はこれらの同じヘモグロビン濃度の血液試料に関する色原体の形成時間と経時な安定性を示しているが、ここでは代わりに本発明の溶解用試薬が用いられている。これらの二つの図を比較すると、本発明の試薬が全血試料中のヘモグロビン濃度の全臨床的範囲にわたり、さらに速くさらに安定な色原体形成を示すことが示唆される。以下、本発明を実施例により説明するが、これら実施例の目的は本発明の範囲と現在の標準的な方法と装置に対する本発明の適合性を示すことにある。これらの実施例は本発明の範囲の限定を意図するものではない。本発明の希釈物の組成物成分は以下の通りである。希釈物Ｎｏ．１：リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、フッ化ナトリウム、塩化カリウム、エチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、およびフェノキシエタノール希釈物Ｎｏ．２：硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、イミダゾール、およびトリアジン−１０希釈物Ｎｏ．３：硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、イミダゾール、トリアジン−１０、およびポリエチレングリコール本発明の溶解用試薬の組成物の実例は以下の通りである。組成Ｎｏ．１：アルキルメチルアンモニウム塩、１０〜２０％（重量）アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩またはアルキルピリジウム塩［臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ベンズアルコニウム］ヒドロキシルアミン塩酸塩２〜１５％（重量）脱イオン水６５〜８８％（重量）組成Ｎｏ．２：塩化ベンズアルコニウム２〜１０％（重量）塩化ドデシルトリメチルアンモニウム２〜１０％（重量）ヒドロキルアミン塩酸塩１〜５％（重量）脱イオン水７５〜９５％（重量）組成Ｎｏ．３：臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）０〜１％（重量）塩化ドデシルトリメチルアンモニウム２〜１０％（重量）ヒドロキルアミン塩酸塩０．１〜１％（重量）脱イオン水８８〜９７．９％（重量）組成Ｎｏ．４：塩化ベンズアルコニウム０．１〜５％（重量）塩化ドデシルトリメチルアンモニウム０．１〜５％（重量）ヒドロキルアミン塩酸塩０．１〜１％（重量）脱イオン水８９〜９９．７％（重量）実施例１〜１８および実施例２０に用いられた希釈剤は希釈剤Ｎｏ．２であった。実施例１９に用いられた希釈剤は希釈剤Ｎｏ．１であった。実施例２１は希釈剤Ｎｏ．３を用いた。特に記載のない限りすべての実施例で、３０マイクロリットル（μＬ）の全血は前もって７．５ミリリットル（ｍＬ）の希釈剤で希釈して１：２５０希釈物を得た。１ｍＬの多目的溶解用試薬をこの希釈された全血試料に添加した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）等の塩を加えて、装置に用いられる液体試薬の電導度を高めてもよい。高められた電導度は試薬容器中の低い液体レベルのセンサー検出に用いることができる。実施例１２０グラム（ｇ）のヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズリー州、６３１７８）、３７．５ｇの塩化ベンゾアルコニウム（Ａｍｒｅｓｃｏ）ソロン、オハイオ州、４４１３９）および３７．５ｇの塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａ）を１リットルの脱イオン水に溶解して多目的溶解用試薬を調製した。もしくは、４２．５ｇの塩化ベンゾアルコニウムおよび４２．５ｇの塩化ドデシルトリメチルアンモニウムを用いることができる。表１に示される結果は水性溶解用試薬に３７．５ｇの両方の第四級アンモニウム塩を利用している。この溶解用試薬はＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１３００、１６００および３５００装置に用いることができる。シアン化物を含有する参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて得られた結果と本発明の多目的（シアン化物を含まない）溶解用試薬を用いて得られた結果との相関を調べるために、ＡｂｂｏｔＫｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）モデル１６００を用いて標準操作法により一連の濃度の全血のヘモグロビン含量を分析した。データを表１に示す。報告されたヘモグロビン値は調製された新鮮な血液について二回のアッセイの平均である。このデータの相関パラメーターは、ｎ＝１５、ｒ＝０．９９９、ｙ＝０．２９７＋０．９９０×、Ｘ＝１５、Ｙ＝１５．１５であり、参照試薬と実験試薬とのデータの高い相関を示している。実施例２実施例１で調製された実験溶解用試薬を用いて、一連の濃度の調製された全血を、参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）および実験溶解用試薬を用いてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００装置で白血球総数（ＷＢＣ）について分析した。血液試料は６６６Ｋ／μＬ（Ｋ＝１０００ ×）未満の血小板と１８．６ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンを含有していた。ＷＢＣの結果を表２に示す。報告されたヘモグロビン値は調製された新しい血液の二回のアッセイの平均である。このデータの相関パラメーターは、ｎ＝１０、ｒ＝０．９９９、ｙ＝０．１７８＋１．０１４×、Ｘ＝３６．２４、Ｙ＝３６．５^-であり、２種類の試薬のデータ間の高い相関を示している。実施例３実施例１に記載の組成にしたがって調製された実験溶解用試薬を用いて、参照溶解用試薬として用いられたＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅに対する実験溶解用試薬の再現性を比較した。３種類の新しい血液試料をこれらの２種類の溶解用試薬を用いてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００装置で分析した。結果を以下の表３と表４に示す。表５はＨｂ測定とＷＢＣ測定の溶解用試薬間の良好な相関を示す。全体的に、観察された二つのパラメーターに関する両群のデータに良好な相関があった。実施例４実施例１で調製された実験溶解用試薬を用いて、全血のヘモグロビンを参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）および実験溶解用試薬を用いてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００装置で分析した。ヘモグロビンの結果を表６に示す。このデータの相関パラメーターは、ｎ＝６２、ｒ＝０．９９９、ｙ＝０．１０６＋０．９９６×、Ｘ＝１４．７３、Ｙ＝１４．７８であり、２種類の試薬のデータ間の高い相関を示している。実施例５実施例１で調製された実験溶解用試薬を用いて、全血のＷＢＣ総数を参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）および実験溶解用試薬を用いてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００装置で分析した。ＷＢＣの結果を表７に示す。このデータの相関パラメーターは、ｎ＝６２、ｒ＝０．９９９、ｙ＝０．０８１＋１．０１３×、Ｘ＝１１．６８、Ｙ＝１１．７５であり、２種類の試薬のデータ間の高い相関を示している。実施例６実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビン含量を、一連のＷＢＣ濃度の存在下でＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００で定量した。この研究の目的は、高いＷＢＣ総数を有する血液試料を分析するときにヘモグロビン値に対する顕著な干渉が存在するかどうかを決定することであった。ヘモグロビンとＷＢＣに関して許容される品質管理限界は±０．３ユニットまたは３％どちらか高い方である。表８に示される結果は、実験溶解用試薬は参照溶解用試薬にかなり匹敵し、高いＷＢＣ総数により２種類の試薬間に有意な違いのないことを示している。実施例７実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンと血小板のカウントを、一連の血小板（ＰＬＴ）濃度の存在下でＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。この研究の目的は、多数の血小板を有する血液試料を分析するときに顕著な干渉が存在するかどうかを決定することであった。ヘモグロビンに関して許容される品質管理限界は±０．３ユニットまたは３％どちらか高い方である。表９に示される結果は、高い血小板数による２種類の試薬間に有意な違いのないことを明らかにしている。実施例８実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントを、一連の脂質／リポタンパク質濃度の存在下でＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。この研究の目的は、ヘモグロビンおよびＷＢＣ測定に対する脂質／リポタンパク質（Ｓｉｇｍａ／Ｌ−５４０１）により高められた試料濁度の効果を決定することであった。表１０に示される結果は２種類の試薬間に有意な違いのないことを示している。実施例９実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントを、一連の脂質／リポタンパク質濃度の存在下でＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。これらの試料はＣｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｓ −ＰｌｕｓＳＴＫＲＳｙｓｔｅｍ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ヒアレアー、フロリダ州、３３０１２）でも分析した。この研究の目的は、ヘモグロビンおよびＷＢＣ測定に対するＩｎｔｒａｐｌｉｐｏｓ（ミドリ十字、日本）の異なるソースの脂質／リポタンパク質により高められた試料濁度の効果を決定することであった。表１１に示される結果は３種類の試薬間に有意な違いのないことを明らかにしている。実施例１０実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。異なる量のビリルビン（０．２５％ＤＭＳＯ溶液）を血液試料に添加した。この研究の目的はヘモグロビンとＷＢＣ測定に対するビリルビンの効果を決定することであった。表１２に示された結果は２種類の試薬間に有意な違いのないことを明らかにしている。実施例１１実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。異なる量のメトヘモグロビンが、異なる濃度の亜硝酸ナトリウム溶液を血液試料に添加することにより得られた。メトヘモグロビンはヘモグロビン測定の一部の方法に影響を与えることのあることが知られている。この研究の目的はシアン化物を含まない試薬を用いるヘモグロビンとＷＢＣの測定に対するメトヘモグロビンの効果を決定することにあった。表１３に示された結果は２種類の試薬間に有意な違いのないことを示している。実施例１２実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。カルボキシヘモグロビンも一部のヘモグロビン法の実施に影響を与えることが知られている。異なる量のカルボキシヘモグロビンを、ＤａｄｅＱｕａｎｔｒａＰｌｕｓ全血ガスコントロール（ＢａｘｔｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、デアフィールド、イリノイ州、６００１５）およびＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６血液用全血コントロール（低、正常、高）を用いて調べ、Ｃｅｌｌ− Ｄｙｎ（登録商標）１６００における２種類の試薬による比較研究を行なった。ＩＬ−２８２ＣｏＯｘｉｍｅｔｅｒの結果はコントロールインサートシートに記載された。この研究の目的はシアン化物を含有しない試薬によるヘモグロビンの測定に対するカルボキシヘモグロビンの効果を決定することにあった。表１４に挙げた結果は２種類の試薬間に有意な違いのないことを明らかにしている。（Ａ）、ＱＩ＝レベル（Ｉ）アシドーシス（ロット＃ＢＧ０１−２６８）。（Ａ）、ＱＩＩ＝レベル（１１）正常（ロット＃ＢＧ０２−２７６）。（Ａ）、ＱＩＩＩ＝レベル（ＩＩＩ）アルカローシス（ロット＃ＢＧ０３−２８５）。（Ｂ）、ＱＩ＝レベル（Ｉ）アシドーシス（ロット＃ＢＧ０１−２７６）。（Ｂ）、ＱＩＩ＝レベル（ＩＩ）正常（ロット＃ＢＧ０２−２８４）。（Ｂ）、ＱＩＩＩ＝レベル（ＩＩＩ）アルカローシス（ロット＃ＢＧ０３−２９３）。実施例１３実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。この研究の目的は実験溶解用試薬の実時間の安定性を評価することにあった。図５Ａ〜図５Ｄに示した結果は実験溶解用試薬が室温で全時間にわたって安定であることを示している。実施例１４実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００を用いて行なった。この研究の目的は異なる温度条件下で実験溶解用試薬の安定性を評価することにあった。図６ａ〜図６Ｄに示した結果は、６０℃および室温の両方の温度で１５ヵ月間置かれた実験溶解用試薬は参照溶解用試薬に匹敵する効能を尚も維持することを示している。実施例１５実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００およびＨｅｍａｔｒｏｎｉｃｓＨＭＡコントロール血液試料（低コントロールＬ−１６３２１、正常コントロールＮ−１６３２１および高コントロールＨ−１６３２１）（Ｈｅｍａｔｒｏｎｉｃｓ）サンタクレア、カリフォルニア州）を用いて行なった。この研究の目的は実験溶解用試薬の経時的安定性と異なる温度条件下での安定性を評価することにあった。図７Ａ〜図７Ｃに示された結果は、６０℃に１３ヵ月間および室温に２０ヵ月置かれた実験溶解用試薬は参照溶解用試薬に匹敵する性能を尚も維持することを示している。実施例１６実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００およびＨＭＡコントロール血液試料（低コントロールＬ−１６３１１、正常コントロールＮ−１６３１１および高コントロールＨ−１６３１１）を用いて行なった。この研究の目的は８ヵ月間冷蔵保存（２〜５℃）した後に実験溶解用試薬の経時的安定性を評価することにあった。溶解用試薬は使用前に室温に温めた。図１５に示された結果は、２〜５℃ で８ヵ月間までの間保存した実験溶解用試薬は参照溶解用試薬に匹敵する性能を尚も維持することを示している。実施例１７実施例１で調製された実験溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００およびＨＭＡコントロール血液試料（低コントロールＬ−１６３１１、正常コントロールＮ−１６３１１および高コントロールＨ−１６３１１）を用いて行なった。この研究の目的は凍結を２回および解凍の後での実験溶解用試薬の経時的安定性を評価することにあった。図１６に示された結果は、−５から−８℃で保存し、次に８ヵ月間２回室温に温めた実験溶解用試薬は参照溶解用試薬に匹敵する性能を尚も維持することを示している。実施例１８実施例１で調製された多目的溶解用試薬および参照溶解用試薬（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）ＲａｐｉｄＬｙｓｅ）を用いて、ヘモグロビンとＷＢＣのカウントをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）１６００Ｓ／ＰＤｉｆｆ−Ｔｒｏｌ（Ｂａｘｔｅｒ）血液用コントロール血液試料（異常低ＳＶ３１Ｌ、正常コントロールＳＶ３１Ｎおよび異常高コントロールＳＶ３１Ｈ）；Ｐａｒａ１２Ｐｌｕｓ（Ｓｔｒｅｃｋ）血液用コントロール血液試料（異常低２５１２ＰＬ、正常２５１２ＰＮおよび高異常２５１２ＰＮ）；および参照として新鮮な血液を用いて行なった。この研究の目的は他の製造業者の血液用コントロールを用いた場合の実験溶解用試薬の性能を比較することにあった。図１７に示された結果から、試験されたコントロールに関して実験溶解用試薬は参照溶解用試薬に匹敵する性能を示すことが分かる。実施例１９希釈剤Ｎｏ．１を用いて全血試料を希釈した。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）９００装置に使用される溶解用試薬は１０ｍＬの脱イオン水に添加することにより作った。組成を表１８に挙げる。溶解用試薬組成＃４を参照溶解用試薬に比較した場合の安定性の結果を図８に示す。本発明の実験多目的溶解用試薬の結果は参照溶解用試薬に匹敵するものであった。実施例２０Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）６１０、１４００、１５００、１６００および２０００のそれぞれの装置に使用される溶解用試薬組成物を表１９に挙げた成分を１０００ｍＬの脱イオン水に添加して作った。溶解用試薬組成＃７を参照溶解用試薬に比較した場合の安定性の結果を図９に示す。さらに、表１９の溶解用試薬＃７の組成から図１２のシアン化物を含まない示差プロットグラフが作られた。実施例２１１０ｇの塩化ベンゾアルコニウム（５０％）、１０ｇの塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（５０％）、２．３５ｇのヒドロキシルアミン塩酸塩および４．５ｇのＮａＣｌ* を１０００ｍＬの脱イオン水に加えてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３０００装置に用いられる溶解用試薬を作った。参照溶解用試薬と比較した場合の溶解用試薬組成の安定性の結果を図１０Ａ〜１０Ｃに示す。本発明の実験多目的溶解用試薬の結果は、ここで示されているように、参照溶解用試薬に匹敵する性能を有している。別法では、２０ｇの塩化ベンゾアルコニウム（５０％）、２０ｇの塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（５０％）、４．７ｇのヒドロキシルアミン塩酸塩および９．０ｇのＮａＣｌを用いることができる。＊このＮａＣｌは装置に用いられる液体試薬の電導度を高めるために添加した。実施例２２４種類の新しい血液試料を最初に標準Ｃｏｕｌｔｅｒ試薬を用いてＣｏｕｌｔｅｒＳ−ＰｌｕｓＩＶ（登録商標）血液用分析器で分析した。次に、多目的溶解用試薬をＣｏｕｌｔｅｒ溶解用試薬の代わりに用い、同じ全血試料をＣｏｕｌｔｅｒ分析器にかけた。本発明のシアン化物を含有しない多目的溶解用試薬の結果は標準Ｃｏｕｌｔｅｒ試薬に匹敵するものであった。用いられた組成は表１９の組成＃７であった。結果を図１１に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゾアルコニウム、塩化セチルピリジウムからなる群から選択される少なくとも１種類の第四級アンモニウム塩からなる水性の多目的溶解用試薬、および（ｂ）ヒドロキシルアミンの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩の少くとも１種類、を組み合わせてなり、５３０と５５０ｎｍの間に検出可能な吸光度特性を有する、ヘモグロビン（Ｈｂ）および白血球（ＷＢＣ）の測定を行なうためのシアン化物を含まない多目的溶解用試薬。２．（ａ）臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゾアルコニウム、塩化セチルピリジウムからなる群から選択される少なくとも１種類の１０〜２０％（重量）第四級アンモニウム塩、および（ｂ）塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩からなる群から選択される２〜１５％（重量）のヒドロキシルアミン塩、を組み合わせてなり、５３０と５５０ｎｍの間に検出可能な吸光度特性を有する、ヘモグロビン（Ｈｂ）および白血球（ＷＢＣ）の測定を行なうための水性でシアン化物を含まない多目的溶解用試薬。３．（ａ）２〜１０％（重量）の塩化ベンゾアルコニウムおよび２〜１０％（重量）の塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、および（ｂ）塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩からなる群から選択される１〜５％（重量）のヒドロキシルアミン塩、を組み合わせてなり、５３０と５５０ｎｍの間に検出可能な吸光度特性を有する、ヘモグロビン（Ｈｂ）および白血球（ＷＢＣ）の測定を行なうための水性でシアン化物を含まない多目的溶解用試薬。４．（ａ）０〜１％（重量）の臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）および２〜１０％（重量）の塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、および（ｂ）塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩からなる群から選択される０．１〜１％（重量）のヒドロキシルアミン塩、を組み合わせてなり、５３０と５５０ｎｍの間に検出可能な吸光度特性を有する、ヘモグロビン（Ｈｂ）および白血球（ＷＢＣ）の測定を行なうための水性でシアン化物を含まない多目的溶解用試薬。５．（ａ）０．１〜５％（重量）の塩化ベンゾアルコニウムおよび０．１〜５％（重量）の塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、および（ｂ）塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および他の酸の塩からなる群から選択される０．１〜１％（重量）のヒドロキシルアミン塩、を組み合わせてなり、５３０と５５０ｎｍの間に検出可能な吸光度特性を有する、ヘモグロビン（Ｈｂ）および白血球（ＷＢＣ）の測定を行なうための水性でシアン化物を含まない多目的溶解用試薬。６．シアン化物を含まない溶解用試薬が約５〜約６秒の色原体形成時間を示す請求項１記載の溶解用試薬。７．シアン化物を含まない溶解用試薬が約５〜約６秒の色原体形成時間を示す請求項２記載の溶解用試薬。８．シアン化物を含まない溶解用試薬が約５〜約６秒の色原体形成時間を示す請求項３記載の溶解用試薬。９．シアン化物を含まない溶解用試薬が約５〜約６秒の色原体形成時間を示す請求項４記載の溶解用試薬。１０．シアン化物を含まない溶解用試薬が約５〜約６秒の色原体形成時間を示す請求項５記載の溶解用試薬。