JPH10502451A

JPH10502451A - 多数の試料を検定するための自動化システムに含まれているインキュベータモジュールの性能をモニタする方法およびこの方法で使用するのに適したキット

Info

Publication number: JPH10502451A
Application number: JP8503667A
Authority: JP
Inventors: フアン・デル・ウールト，ハンス; バリー，ローベルタス・ウイルヘルムス
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1998-03-03
Also published as: EP0769137A1; CA2194232A1; AU2925895A; WO1996001413A1; AU685301B2

Abstract

(57)【要約】たとえば、多数のマイクロタイタプレート内で多数の試料を検定するため、所望により多数の同時検定のために、自動化システムに含まれ、多数の試料を定められた温度でイキュベートする（たとえば、マイクロタイタプレートをイキュベートするため）ための適当なインキュベータモジュールの性能をモニタするための方法およびキット。

Description

【発明の詳細な説明】多数の試料を検定するための自動化システムに含まれているインキュベータモジュールの性能をモニタする方法およびこの方法で使用するのに適したキット多数の検定(assay)を行うための自動化システムは当技術分野において周知である。そのような自動化システムには検定、インキュベーション(incubation)、試薬付加、洗浄、吸光度測定、振とうおよび試料輸送を処理するためのいくつかの機能を組み込むことができる。後者は、自動化システムが、システムソフトウエアに存在する検定プロトコルに従って、オペレータが介在することなしに、完全な検定手順を基本的に完全に実行することを意味する。それらの検定プロトコルは、もちろん、試験キット梱包封入物における指示に基づいている。特にバイオテクノロジの分野においては、たとえば免疫技術(immunotechnology)の領域においては、多数の試料を処理しなければならない。一般にバイオテクノロジの分野においてはマイクロプレート(microplate)が反応を行わせるための好ましい容器である。「良好な研究所慣行(Good Loboratory Practice,ＧＬＰ)」の一つとして、研究所の計器類を適正に機能しているかどうか定期的に点検することがある。多数の検定を行うための自動化システムの機能の大部分については、それらの機能の性能を点検するのに適当な手段が存在する。その例外がインキュベータモジュール(incubator module)である。たとえばマイクロプレート中に存在する試料を定められた温度まで加熱し、その温度を定められた時間にわたって維持するためにそれらのインキュベータモジュールを使用する。現在まで利用できる手段はインキュベータモジュールの場所で試料の温度を間接的には、測定する必要がある。そのような間接測定には、たとえばインキュベータモジュールの加熱要素の温度を測定することが含まれる。これは明らかに実際の試料温度の非常に不完全な測定であり、モジュール、試料容器、および試料自体をインキュベータモジュールの設定温度まで加熱しなければならないことを考慮していない。また、これはマイクロプレートにおける温度分散の正確な分析を可能にするものでもない。他の方法は、マイクロプレートが存在する環境の温度を測定するものであるが、これもウォーミングアップと温度分散決定に関しては同じ欠点を有する。他の方法はインキュベートされている試料の温度を、試料中に浸された温度センサを用いて直接測定することである。しかしこれは、マイクロプレート上に存在する試料など試料の数が多い場合は、それと等しい多数の温度センサが必要となるために望ましくない。そうするとシステムの適応に費用がかさみ、システムのコストが受け入れることができないほど上昇する。バイオテクノロジ的な性質の検定でしばしば用いられるような小さい試料に温度センサを使用することが実際的でないことは、インキュベーション温度と、センサ自体の存在による検定自体との干渉からも生ずる。試料のサイズは非常に小さいため、金属センサ自体を通じての熱輸送が試料の温度に影響する。したがって、マイクロプレート中に存在する一つの試料内の温度の決定でさえも正確であると考えることはできない。小さい試料の検定に特に適した、定められた温度で多数の試料を同時に検定するための自動化システムに含まれているインキュベータの性能検査では、インキュベーションの場所におけるインキュベーション中の温度および特に温度分布の定量化を行えるようにする、マイクロプレートに適合する媒体および手段が必要である。システム中のインキュベータの不適切な性能を検出できるようにするために、この方法は１℃より高い確度と０．１℃より高い精度を持たなければならない。熱変色性(thermochromic property)を持つ液体が、ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００（ＭＰＰ）などの、検定を行うための自動化システムの光度計(photometer)を、吸光度を温度に結び付ける定量化の手段として使用できるようにするので、その液体は溶液として最も適当である。そのような液体の化学式を探すために文献調査では使用できるものはなんら見つからなかったので、代わりのものを調べた。それらは、温度（Ｔ）に依存する大きな酸性度（ｐＨ）を有する緩衝液および酸性度（ｐＨ）に依存する大きな吸光度（Ａ）を有する、酸をベースとする指示薬である。その結果は狙い通りであり、その吸収スペクトルが温度に依存する溶液が得られる。本発明は自動検定システム内のインキュベータ中の試料の実際の温度に関して、および同時にインキュベートされているいくつかの試料全体にわたる温度分散に関してさえも、希望の確度および精度を得るための方法を得ることに向けられている。特に、本発明はマイクロプレートの自動化処理に向けられたシステムにおけるこの情報を得ることに向けられる。本発明は、技術的な面に関しての従来の不適切さを克服するばかりでなく、解決策が簡単で比較的コストが低く、実行が簡単で、既存の自動化システムに対する調整をほとんど要しないという追加の利点を有する。本発明は多数の試料を同時に定められた温度でイキュベートするため（たとえば、マイクロタイタプレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅｐｌａｔｅｓ）をイキュベートするため）に適当であり、かつ希望により、たとえば、多数のマイクロタイタプレート内で、多数同時検定で多数の試料を検定する、ための自動化システムに含まれているインキュベータモジュールの性能をモニタする方法であって、１）少なくとも二つの異なる波長λ１およびλ２における温度依存溶液(tempe rature dependent solution)の吸光度を光度計（ｐｈｏｔ２）で測定し、温度依存溶液の吸光度をインキュベーションの場所とは異なる場所で、インキュベーションの後の時刻に決定し、前記温度依存溶液は温度に依存するｐＨを持つ緩衝剤と、ｐＨに結び付けられた吸光度スペクトルを持つ酸をベースとする指示薬とを含み、δＡ／δＴが、一つの波長に対して正で、他の波長に対して負であるように前記波長を選択し、前記測定により吸光度値Ａ_test,phot2, _λ1とＡ_test,phot2, _λ2が得られ、Ａ_test,phot2, _λ1 は、波長λ１における温度依存溶液（ｔｅｓｔ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_test,phot2, _λ2は、波長λ２における温度依存溶液（ｔｅｓｔ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示すステップと、２）ステップ１）におけるデータをデータファイルに保存するステップと、３）ステップ１）の二つの波長λ１およびλ２に対する温度独立の較正溶液(c alibration solution)の吸光度を光度計（ｐｈｏｔ２）で測定し、温度とは独立の前記較正溶液は定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルと同じ吸光度スペクトルを示し、前記測定により吸光度値Ａ_cal,phot2, _λ1とＡ_cal,p _hot2, _λ2 が得られ、Ａ_cal,phot2, _λ1は、波長λ１における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_ca _l,phot2, _λ2 は、波長λ２における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示すステップと、４）ステップ３）におけるデータをデータファイルに保存するステップと、５）保存したデータと式ｌｎ（Ａ_test,phot2, _λ1／Ａ_test,phot2, _λ2）＝α″＋ β′Ｔを用いて温度依存溶液の実際の温度Ｔを計算し、α″＝α′−ｌｎ（Ａ_cal,ph _ot1, _λ1 ／Ａ_cal,phot1, _λ2）＋ｌｎ（Ａ_cal,phot2, _λ1／Ａ_cal,phot2, _λ2）で、 α′−ｌｎ（Ａ_cal,phot1, _λ1／Ａ_cal,phot1, _λ2）の値は、ステップ１）の二つの波長λ１およびλ２に対して温度独立の較正溶液を他の光度計（ｐｈｏｔ１）で吸光度を測定することにより得ることができ、それによりＡ_cal,phot1, _λ1とＡ_cal,phot1, _λ2を得、Ａ_cal,phot1, _λ1は、波長λ１における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について他の光度計（ｐｈｏｔ１）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_cal,phot1, _λ2は、波長λ２における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について他の光度計（ｐｈｏｔ１）で決定した吸光度（Ａ）を示し、そのステップ５のデータをデータファイルに保存し、かつ、温度依存溶液についてステップ１）の異なる二つの波長λ１およびλ２に対して吸光度および温度を他の光度計（ｐｈｏｔ１）で測定することにより、既知の温度における吸光度値Ａ_test,phot1, _λ1とＡ_test,phot1, _λ2を得、それから、式ｌｎ（Ａ_λ1／Ａ_λ2）＝α′＋β′Ｔを用いて、α’とβ’が計算でき、そのデータをデータファイルに依存するステップと、６）モジュール内でインキュベートされている温度依存溶液の修正した温度および修正した温度分布を確かめるために、モジュールが設定されている定められた温度と比較するステップとを含む、インキュベータモジュールの性能をモニタする方法を対象とする。一つの波長における吸光度測定値を用いる代わりに二つの異なる波長における吸光度測定値の比を用いるといくつかの興味のある利点が得られる。信号と温度との間の関係を式２ｌｎ（Ａ_λ1／Ａ_λ2）＝（α_λ1−α_λ2）＋（β_λ1−β_λ2）Ｔ＝α′＋β′Ｔ（２）として表すことができる。 δＡ／δＴの値が正である範囲内に一つの波長があり、δＡ／δＴの値が負である範囲内に他の波長がある時は、二つの吸光度測定値の比を用いると下記の利点が得られる。 − 方法の感度が高くなる。 − 光度計（ｐｈｏｔ１）と（ｐｈｏｔ２）で検定される試料の異なる光路長により生じる誤差、したがって、マイクロプレートの場合における容量差によりひき起こされる誤差がなくされるためにこの方法の確度が高くなる。 − 発色団(chromophore)濃度の違いにより生じる誤差がなくなるためにシステムの確度が高くなる。ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３９／２、２５１〜２５６（１９９３）でＳｃｈｉｌｌｉｎｇ他が、多重セル光度計の温度決定におけるＴＲＩＳ／クレゾールレッド(CresolRed)などの熱変色指示薬とＨＥＰＥＳおよびリン酸塩の緩衝液へのクレゾールレッドの温度独立の溶液との組合せを、光路長の変化とウェル(well)のブランク透過率（ｂｌａｎｋｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ）とにより生じる光学測定誤差をなくすようにして使用することを記述している。しかし、彼等は加熱される試料の場所において吸光度を決定できないという主題とする問題に直面していない。彼等は温度測定場所において吸光度を測定した、すなわち、温度決定の場所で光度計により試料を測定した。彼等は、光度計を較正するために一つのウェルの中で電子プローブを使用している。更に、異なる光路長または発色団濃度に関する誤差をなくすための二つの波長の商(quotient)に加えて、異なるブランク透過率により発生される誤差をなくすために第三の波長が必要であった。この引用した文献においては、本方法のように較正の目的ではなくて、方法の確度と精度に対する光度計のノイズの影響について単に研究するために、温度独立の緩衝液を用いている。引用した方法は本発明の方法に類似するプロセスを対象とするために、冷却効果についての問題はその方法には存在しない。本発明の方法にＳｃｈｉｌｌｉｎｇ他の記述されている方法を単に実施するだけでは本発明の方法が解決する問題は解決しない。このシステムを本発明の方法でひとたび適正に較正すると、たとえば、マイクロプレートが、インキュベータモジュールを含んでいる自動化検定システムのインキュベータモジュール内にある間に、マイクロプレートのウェルの中の液体の温度を決定できるようにする。本発明の方法を実施できるシステムの適当な例がＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００である。文献調査に基づいて、塩酸（ＨＣｌ）に組み合わせたトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を、本発明の方法で使用する緩衝系の極めて適当な例として選択した。これは主に、そのδｐＨ／δＴ値が約−０.０３ｐＨ単位／℃と大きいためである。温度独立の溶液の緩衝系は大きいδｐＨ／δＴ、好ましくは、少なくとも０．０２ｐＨ単位／℃の絶対値を有することが好ましい。絶対値が大きくなると温度のどのように小さな変化も、測定される吸光度を変化させるｐＨの気付くことができる変化としてよりよく記録されることになり、それによりこの方法の感度を高くする。これと一致して大きいδＡ／δｐＨ値を示す温度依存溶液が好ましい。大きさは、少なくとも０．１℃の精度と、少なくとも０．５℃、好ましくは少なくとも０．３℃の確度になるのに十分な値として適当に定量化できる。ＴＲＩＳ以外のいくつかの緩衝剤も本発明の方法に使用するために適当である。適当な例がクエン酸塩、酒石酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳとしても知られている）、ホウ砂(Borax)および重炭酸ナトリウムから選択した水溶液を含む。この方法のために温度依存溶液と温度独立の溶液とに酸ベースとするいくつかの指示薬を使用できる。適切な指示薬の選択は、この説明を考慮して本発明を考察した後では当業者には明らかであろう。温度依存溶液と温度独立の較正溶液との酸をベースとする指示薬の溶解度は、測定可能で確実な吸光度値を得るためには十分でなければならない。一般に、現在の装置は０．５ＡＵより高い吸光度を測定できるから、定められた温度および波長λ１とλ２でそのような吸光度にする指示薬濃度を受け入れることができる。０．５ＡＵと１．５ＡＵの間の吸光度にする濃度を選択することが好ましい。ＴＲＩＳのｐＨ緩衝範囲のために適用できる、酸をベースとする指示薬から、クレゾールレッドを選択した。その理由は、主として、溶解して大きいδＡ／δｐＨ値になるその良い溶解度にある。ｐＨ指示薬としてフェノールフタレインを用いる初期の研究［１］は、ＴＲＩＳ緩衝液中へのフェノールフタレインの溶解度が低いためにたとえば不十分な結果を与えた。ある温度で温度依存溶液のスペクトルと同一である、温度独立のスペクトルを生ずる較正溶液により、ある興味ある可能性がもたらされる。まず、そのような較正溶液によりこの方法の精度を実験的に決定する可能性が得られる。第二に、そのような較正溶液によりこの方法を較正し（測定した温度と吸光度値を用いてのα′とβ′の決定）および実際の温度測定（既知のα′とβ′および測定した吸光度値でＴを計算する）のために種々の光度計を使用する可能性が得られる。光度計の間の違いを補償するために温度独立の較正溶液を用いることは下記のように作用する［４］。測定すべき温度はある予測される値を有する。そうすると、その予測した温度における温度依存溶液のスペクトルとほぼ同一のスペクトルを有する較正溶液を使用できなければならない。これで光度計（ｐｈｏｔ１）を用いて温度依存溶が較正された（α′とβ′が決定された）。また、対象とする二つの波長における温度独立の較正溶液の吸光度値が光度計１で測定された。（Ａ_cal,phot1, _λ1およびＡ_cal,phot1, _λ2）対象とする温度依存溶液と温度独立の較正溶液との、二つの波長における、吸光度値（Ａ_test,phot2, _λ1およびＡ_test,phot2, _λ2）および（Ａ_cal,phot2, _λ1 およびＡ_cal,phot2, _λ2）を測定するために第二の光度計を用いる。ここで光度計２からの、両方の波長に対する温度依存溶液の測定値を光度計１の吸光度単位、すなわち、修正した吸光度値で表すことができる。Ａ_corr＝（Ａ_cal,phot1／Ａ_cal,phot2）・Ａ_test,phot2 （３）修正した吸光度値を用いることにより実際の温度を今計算できる。式（２）と（３）を組み合わせると次式が得られる。ｌｎ（Ａ_test,phot2,_λ1／Ａ_test,phot2, _λ2）＝α″＋β′Ｔ（４）ここでである。したがって、実際に、α′はα″に再較正される。この方法は、 − ブランク媒体(blank media)、たとえば水対空気中の小さい差。 − 光路長の差。 − 光干渉フィルタにおける小さいスペクトル差（使用する波長におけるδβ／ δλの値に依存する）。を補償する。文献［２］に記載されているように、上記較正溶液が存在する。ＴＲＩＳ／クレゾールレッド温度依存溶液の場合には、ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液中のＴＲＩＳはＨＥＰＥＳとリン酸塩の混合物で置換される。較正溶液のｐＨを設定することにより、較正溶液のスペクトルを、対象とする範囲中の任意の温度でＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液のスペクトルにほぼ同一にでき、それにより温度独立の較正溶液の生産を可能にする。温度依存溶液を含んでいる容器、たとえば、ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液などの温度依存溶液が満たされているマイクロプレートはインキュベータモジュールから光度計（ｐｈｏｔ２）（以後の記載ではリーダーモジュールとも呼ぶ）への輸送中に冷却するから、得た吸光度値はマイクロプレートがインキュベータモジュール内に実際に静止していた時の温度を正確に表さない。したがって、本発明の方法では光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度を、インキュベーションの場所と吸光度測定場所の間で起きる冷却の影響に関して修正するために計算手段を用いる。不正確さを最小にする方法は光度計をインキュベータにできるだけ接近させ、雰囲気をインキュベータの温度にできるだけ近くすることが好ましい。輸送に起因する不正確さを克服する方法は、容器内部の試料の冷却曲線を、好ましくは、マイクロプレートを使用しているならば、マイクロプレートの各ウェルについて、記録すること、およびそれらがインキュベータモジュール中にある時の温度を見積もるためにそれらの曲線を使用することである。したがって、本発明は、温度独立の較正溶液を満たした第一のマイクロプレートを光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送し、二つの波長λ１とλ２で吸光度を読み出し、測定データをデータファイルに保存し、除去すべき出力モジュールにそのマイクロプレートを取り付け、温度依存溶液を含んでいる第二のマイクロプレートをインキュベータモジュールに取り付け、インキュベータモジュールの設定に従った定められた温度でインキュベートし、インキュベーションが終わったらそのマイクロプレートを光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送し、そこで二つの波長λ１と λ２において、好ましくはソフトウエアタイマにより制御される時間間隔で吸光度を何回も読み出し、全てのデータをデータファイルに保存する上記方法を目的ともするものである。そのような実施形態では、インキュベーションの終了と光度計（ｐｈｏｔ２）における最初の読出しとの間の時間間隔はできるだけ短くすることが好ましい。それはマイクロプレートをインキュベータモジュールから光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送するために要する時間により制限される。その時間間隔は４５秒より短い、２５〜３５秒が適当である。温度依存溶液を含む容器をインキュベータから除去した後で二つの波長で何回も吸光度を読み出す、この方法の好適な実施例は、光度計（ｐｈｏｔ２）における吸光度測定の間の時間間隔が、二つの波長λ１とλ２において吸光度を測定するために要する時間の長さと、データをファイルに保存するために要する時間の長さにより決定される。前記時間間隔は一般に２５秒より長く、好ましくは４５秒より長く、３０秒が適当である。本発明の方法では、０．９８に等しいか、それより大きい回帰係数(regressio n coefficient)Ｒ²を使用できるように、光度計（ｐｈｏｔ２）からの吸光度データに基づいて決定した温度を、インキュベータモジュールから前記光度計計算手段への輸送の間に起きる冷却に対して、冷却のパターンに適合する数学関数に基づいて、修正する。使用する計算手段は、たとえば、時間に対する吸光度関数を、光度計（ｐｈｏｔ２）で得た吸光度測定データに最小二乗的に適合可能にして、インキュベータモジュールから温度依存溶液を取る時すなわち時刻零にインキュベータモジュール内の実際の吸光度の計算を可能にし、それにより時刻零におけるインキュベータモジュール内の実際の温度の以後の計算を可能にできる。更に詳しくいえば、マイクロプレートを冷却するために下記のことを確認した。時間ｔの関数として一定温度Ｔ_envの環境内に置かれ、最初の温度がＴ_initである物体の温度Ｔは理論的に次式で与えられる。Ｔ（ｔ）＝Ｔ_env＋（Ｔ_init−Ｔ_env）・ｅ^-t/ ^τ （６）（τは時定数）しかし、冷却するマイクロプレートでは、環境は一定ではなく、ウェルごとに異なるために一層複雑である。実際に、これに対する理論的モデルを設けることはほとんど不可能である。実際に、温度の代わりに吸光度値を時間の関数として測定する。温度一時間関係に対するモデルを適用する代わりに、吸光度一時間関係に対するモデルとして二次多項式または三次多項式を使用することを決定した。これは、Ａ（ｔ）＝ａ＋ｂｔ＋ｃｔ²（＋ｄｔ³）（７）（ａ、ｂ、ｃおよびｄは定数）のような関数を用いて行った。このモデルを最小二乗的に測定データに適合することにより、ａは時刻零における吸光度値の計算値である。マイクロプレートの場合のように多数のサンプルを同時にイキュベートするとき、各ウェル中の試料の温度は隣接するウェルの影響を受ける。この影響はウェルの位置によって変わる。本発明による方法の確度を高めるため、計算中にデータフィルタリングを適用することができる。ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００などの自動検定システムのインキュベータモジュールは低周波特性を持つ、すなわち、マイクロプレート上の温度分布が温度勾配、冷たい領域、暖かい領域、または端部効果を示すことができる。ウェルごとに上昇したり低下したりする温度値（高周波挙動）は可能ではない。これはこの方法により得られる温度分布中のどのような高周波成分も、いわゆる「二次元ローパス」フィルタにより除去できる。一般に用いられる多くのデータフィルタリング技術は周波数領域内の適切な関数を乗ずること（信号のフーリエ変換で）、または適切な関数による信号のくりこみ(convolution)を行うことに基づいている。それらの技術は無限の信号または少なくとも比較的大きい領域にわたって定義された信号を要する。温度に対してはマイクロプレートの場合には限られた数（８×１２）の値を利用できるだけなので、マイクロプレートの縁部における温度についての、最も興味深い、信頼できるフィルタリングされた値は計算できないために、このフィルタリング方法は適用できない。すなわち、各ウェルの温度をウェル自体の温度と、そのウェルに最も近い８個のウェルの温度との関数として定義するために代わりのフィルタリング方法について調べた。たとえば、Ｔ_filtD6＝ｆ₁・Ｔ_C5＋ｆ₂・Ｔ_C6＋ｆ₃・Ｔ_C7＋ｆ₄・Ｔ_D5＋ｆ₅・Ｔ_D6＋ｆ₆・Ｔ_D7 ＋ｆ₇・Ｔ_E5＋ｆ₈・Ｔ_E6＋ｆ₉・Ｔ_E7 （８）ここでＴ_filtはフィルタリング後に計算した温度、ｆ₁からｆ₉は定数である。定数は、線形モデルを最小二乗法で９個のウェルの正方形ブロックの温度データにフィットさせることにより計算される。（二次元線形回帰）Ｍｏｄｅｌ：Ｔ_filt＝ａ・ｒｏｗｎｕｍｂｅｒ＋ｂ・ｃｏｌｕｍｎｎｕｍｂｅｒ＋ｃ（９）（ａ、ｂおよびｃは定数）結果を最小二乗法で最小にすると最小化関数Ｆが得られる：Ｆ＝Σ（Ｔ_filt（ｗｅｌｌ_i）−Ｔ（ｗｅｌｌ_i））²（ｉ＝１〜９）（１０）これはδＦ／δａ＝δＦ／δｂ＝δＦ／δｃ＝０であることを意味する。ここで、ａ、ｂ、ｃはＴ（ｗｅｌｌ_i）で表すことができ、係数ｆ₁からｆ₉を計算できる。（８）におけるように、マイクロプレートの縁部にないウェルについては、全ての係数ｆ_iは１／９に等しい。マイクロプレートの縁部にあるが、隅にないウェルについては、次式が有効である：たとえば、Ｔ_filtA6＝ｆ₁・Ｔ_A5＋ｆ₂・Ｔ_A6＋ｆ₃・Ｔ_A7＋ｆ₄・Ｔ_B5＋ｆ₅・Ｔ_B6＋ｆ₆・Ｔ_B7 ＋ｆ₇・Ｔ_C5＋ｆ₈・Ｔ_C6＋ｆ₉・Ｔ_C7 （１１）ここでｆ₁＝ｆ₂＝ｆ₃＝５／１８、ｆ₄＝ｆ₅＝ｆ₆＝２／１８およびｆ₇＝ｆ₈＝ｆ₉ ＝−１／１８である。Ｔ_filtA6を計算するために使用した線形回帰は、（１１）におけるように、Ｔ_filtB6 を計算するためにも用いられることに注目できる。マイクロプレートの隅にあるウエルについては、次式が有効である。たとえば、Ｔ_filtA1＝ｆ₁・Ｔ_A1＋ｆ₂・Ｔ_A2＋ｆ₃・Ｔ_B1＋ｆ₄・Ｔ_A3＋ｆ₅・Ｔ_B2＋ｆ₆・Ｔ_C1＋ｆ₇・Ｔ_B3＋ｆ₈・Ｔ_C2＋ｆ₉・Ｔ_C3 （１２）ここでｆ₁＝８／１８、ｆ₂＝ｆ₃＝５／１８、ｆ₄＝ｆ₅＝ｆ₆＝２／１８、ｆ₇＝ｆ₈＝−１／１８およびｆ₉＝−４／１８である。Ｔ_filtA1を計算するために使用した線形回帰は、（１２）におけるように、Ｔ_filtA2 、Ｔ_filtB1およびＴ_filtB2を計算するためにも用いられることに注目できる。この空間ローパスフィルタリング技術を第１図に示す。この図では温度分布を、ガウスノイズ(Ggaussian noise)が加えられている明確に定義された関数により表している。インキュベータモジュール内の温度の計算は、二次元線形モデルを最小二乗法で試料のマトリックスの温度データに適合することにより、確実に行われ、マイクロプレートについての上記９個のウェルの正方形は単なる例であることは当業者には理解できよう。本発明は上で例により説明した本発明を実施するために必要な部品を含む試験キット(test kit)をも対象とする。その試験キットは少なくとも、定められた温度で波長λ１およびλ２において０．５ＡＵより高い吸光度を少なくとも示し、かつ温度に依存するｐＨを持つ緩衝系とｐＨに結び付けられた吸光度スペクトルを有する酸をベースとする指示薬とを含む温度依存溶液を含んでいる容器と、定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルと同一の吸光度スペクトルを示し、かつ好ましくは温度依存溶液の組成にできるだけ近い組成を有する少なくとも一つの温度独立の較正溶液を含む容器とを備える。最も望ましくは、そのようなキットの溶液は、ａ）測定を行う、好ましくは２０〜６０℃の範囲内である希望の温度範囲内である定められた温度において温度依存溶液の緩衝系の動作範囲内において、ｂ）測定を行う定められた温度において酸をベースとする指示薬の指示範囲内で、ｃ）二つの波長λ１およびλ２における吸光度が、指定した範囲の中間において相互にできるだけ近いように、ｄ）ＣＯ₂の吸収をできるだけ少ないことが好ましい、ｐＨを有する。特に、いくつかの定められた温度をインキュベータ上で調べる時は、いくつかの定められた温度に対して多数の温度独立の較正溶液を含み、温度独立の溶液の吸光度スペクトルがその定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルに等しいように、各温度独立の較正溶液のｐＨを選択した、上記キットを使用する。この方法の説明から、温度依存緩衝剤はクエン酸塩、酒石酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ホウ砂（Borax）または重炭酸ナトリウムの水溶液、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水溶液を含むことができることが明らかであろう。また、酸をベースとする指示薬がクレゾールレッドであって、それが溶解できる形で存在しているキットが適当な実施形態であることが本発明の方法の説明から明らかであろう。そのようなキットでは、温度独立の較正溶液はＨＥＰＥＳ、リン酸塩およびクレゾールレッド溶液を含むことができ、かつそれがトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを緩衝剤として、およびクレゾールレッド溶液を酸をベースとする指示薬として含む温度依存溶液と更に同一であることが好ましい。微生物による劣化を防止するために、アジ化物などの、この技術で一般に用いられている微生物防止剤(anti microbial agents)をキット中の溶液に加えることが好ましい。特定の国における法規を考慮して、シンナムアルデヒド(cinnamaldehyd e)およびゲンタミシン(gentamicin)硫酸塩を用いることが好ましい。例はキット中に存在できる溶液の一層正確な詳細と、それらをどのようにして使用できるかの実施例を提供するものである。本発明のキットは光度計（ｐｈｏｔ１）を用いると求められる較正データを含み、それにより実際の応用を極めて簡単かつ使用者にとって都合の良いものにすることが好ましい。一般に、本発明の方法およびキットは、開示する種々の実施例において、いくつかの異なる定められた温度においてインキュベータモジュールの温度分散を調べるために使用でき、前記方法およびキットは異なる温度の数に等しい数の温度独立の較正溶液を要する。特に、本発明の方法を実施している間に自動化システムにおける自動検定を実行できる。実施例インキュベータを備えた自動検定システムとしてＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００を用いて本発明の方法を実施した。下記の試薬を使用した。１．トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）ＴＲＩＳ緩衝系の動作範囲はｐＨ７からｐＨ９である。文献[４、５]で報告されているように、温度 −ｐＨ関係はこの範囲ではほとんど直線的であって０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液ではｄｐＨ／ｄＴ＝−０．０３ｐＨ単位／℃である。ＴＲＩＳをＮＥＮ１級品質の水に溶解することにより０．１ｍｏｌ／Ｌ（１２．１１４ｇ／Ｌ）ＴＲＩＳ緩衝剤のストックを準備した。高濃度ＨＣｌ溶液（４〜１０ｍｏｌ／Ｌ）を少量加えることにより溶液のｐＨを設定した。温度依存性のために、調整した温度でこれを行わなければならず、または希望のｐＨを実際の温度に対して計算しなければならない。２．クレゾールレッドクレゾールレッドの指示範囲の一つが、黄色から赤色への色変化でｐＨ７．２からｐＨ８．８までであると報告されている［６］。これは、可視スペクトルの低い方の領域において酸性度が高くなる（ｐＨが小さくなる）につれて吸光度が高くなり、可視スペクトルの高い方の領域において酸性度が高くなるにつれて吸光度が低くなる。高濃度のエタノール溶液はクレゾールレッドのための最も便利な調剤の形であると考えられた。このために、クレゾールレッド（Ｋｏｄａｋ）をエタノール（Ｂａｋｅｒ、９６％）に１０．０ｇ／Ｌの濃度に溶解することによりストック溶液を準備した。３．ＨＥＰＥＳ／リン酸塩溶液この方法の正確さを実験的に確認するため、および較正のために、温度独立しているが、ある温度ではＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液の吸光度スペクトルと同一である吸光度スペクトルを持つ溶液を用意する必要が感じられた。文献［２］に記載されているように、ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液中のＴＲＩＳをＨＥＰＥＳとリン酸塩の混合物で置換することにより調製できる。ＨＥＰＥＳ（Ｏｒｇａｎｏｎ）とリン酸ナトリウム一塩基（Ｂａｋｅｒ）をＮＥＮ１級品質の水にそれぞれ２６ｍｍｏｌ／Ｌ（＝６．１９６ｇ／Ｌ）および７６．２ｍｍｏｌ／Ｌ（＝１１．２８９ｇ／Ｌ）の濃度で溶解することにより、ＨＥＰＥＳ／リン酸塩のストックを調製した。４．防腐剤この方法は商用の製品に使用することを意図するものなので、ＴＲＩＳ／クレゾールレッドおよび較正溶液は長期間にわたって安定でなければならない。そのために、微生物による劣化を阻止するために防腐剤を添加しなければならない。一般に使用されているものであるが、アジ化ナトリウムはある国では制限されているために、選択しなかった。その代わりに、最新のＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａＭｉｃｒｏｅｌｉｓａ検定のいくつかの成分に使用されているように、シンナムアルデヒドおよびゲンタミンリン酸塩を使用した。９６％のエタノール＋５％のメタノール（Ｂａｋｅｒ）中に２００ｍｌ／Ｌの濃度でシンナムアルデヒドを希釈することによりシンナムアルデヒドのストック溶液を調製した。シンナムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）およびゲンタミンリン酸塩（ＵＳＢＣ）を、最終濃度が０．２ｍｌ／Ｌおよび０．１ｇ／Ｌにそれぞれなるまで、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳ／リン酸塩溶液に加えた。ＴＲＩＳ／クレゾールレッド温度依存溶液および温度独立の較正溶液を下記のようにして調製した。ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液のクレゾールレッドの濃度設定およびｐＨ設定のために、下記事項を考慮した、 − ｐＨは対象とする温度範囲内のＴＲＩＳ緩衝剤の動作範囲内になければならない。 − ｐＨは対象とする温度範囲内のクレゾールレッドの指示範囲内になければならない。 − ＣＯ₂吸収を最小にするためにｐＨはできるだけ低くなければならない。 − ｐＨ設定は、対象とする温度範囲の中間（約３７℃）で、使用する二つの波長における吸光度がほぼ等しいようなものでなければならない。 − クレゾールレッドの濃度は、使用する二つの波長における吸光度値が、対象とする温度範囲内で０．５〜１．５ＡＵの範囲（ＭＰＰのリーダーモジュールの最適動作範囲）であるようなものでなければならない。防腐剤を添加した、ＴＲＩＳ緩衝剤のストック溶液のｐＨを３７℃で７．８０に設定した。このストック溶液の一部にクレゾールレッド（ストック溶液から）を、分光光度計で測定するための最終濃度３０ｍｇ／Ｌまで加えた。他の部分にクレゾールレッドを、ＭＰＰで測定するための最終濃度７５ｍｇ／Ｌまで加えた。クレゾールレッドを添加してもｐＨには測定可能な影響を及ぼさなかったことが確認された。二つの較正溶液を用意しなければならない。すなわち、一つは３７℃に設定されているインキュベータモジュールでの温度を測定するためのものであり、他のものは５０℃でのインキュベーションのためのものである。較正溶液を調製するために、ＨＥＰＥＳ／リン酸塩ストック溶液（防腐剤添加済み）から二つの部分を取った。それらの部分のｐＨをそれぞれ７．８０と７．４６に設定した。それらのｐＨ値は、それぞれ３７℃と５０℃におけるＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液のｐＨに対応する。二つの部分をおのおの二つの部分に分割した。それらの部分にクレゾールレッド（ストック溶液）をそれぞれ３０ｍｇ／Ｌおよび７５ｍｇ／Ｌの最終濃度まで加えた。クレゾールレッドを添加してもｐＨには測定可能な影響を及ぼさなかったことが確認された。測定手順は次の通りであった。１．較正手順ＰｙｅＵｎｉｃａｍＭｏｄｅｌＰＵ８７００分光光度計および内部幅が約１ｃｍのポリスチレン・キュベット(cuvettes)(光路長１ｃｍ) を用いて、可視領域、４００から７００ｎｍ、内のスペクトルを記録した。温度調節されている水浴にこの計器の二重壁セルホルダーを配管とポンプを介して連結する。キュベット内の温度を、分光光度計により発生される光ビームの真上に配置されている熱電対により測定する。熱電対を、８０ＴＫ熱電対モジュールを備えたＦｌｕｋｅＭｏｄｅｌ２７マルチメータに接続する。キュベト内の流体の量は、熱電対を浸す深さが約３ｍｍであるようなものである。較正溶液のスペクトルを室温で記録し、後での処理のためにデータファイルに保存した。毎測定の直前には、水を含んでいるキュベットに対して分光光度計をブランク(blanked)にした。ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液のスペクトルを室温から５２℃の範囲内で記録した。実際的な理由から、毎測定のためにキュベット内の温度を安定させる代わりに、キュベット内の液体の加温中または冷却中にスペクトルを記録した。キュベット内で６分間に約１℃の温度上昇が行われるようにして水浴の加熱を設定した。そうすることにより、スペクトルを記録するためにある時間を要する（約２０秒）ことに起因する測定温度誤差が０．１℃より小さい。熱電対システムの測定確度は０．１℃である。スペクトルを約２℃間隔で記録し、後での処理のためにデータファイルに保存した。記録した各スペクトルごとに、キュベット内部の流体温度を記載した。毎回の測定の直前に水を含んでいるキュベットに対して分光光度計をブランクにした。水浴の内部に配置されて、内部を（冷えた）水道水が流れるコイル状のチューブへの熱伝導により水浴は冷却される。６分間に約１℃の温度降下が行われるようにして水道水の流量を設定した。加熱中と同様のやり方でスペクトルを記録した。２．ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００における測定これらの測定を、１２個のウェル・ストリッププレート（well stripplate)を有し、縁部が湾曲している平底のＧｒｅｉｎｅｒ型マイクロプレートで行った。各ウェルに１００ｍｌの流体を、較正した１チャネルピペットで注いだ。ピペットで注ぐ前に全ての流体を室温になるようにし、注がれたプレートを気泡の有無について調べた。この体積およびこの種のプレートの光路長は約４ｍｍである。光路長が１ｃｍである分光光度計の吸光度値とほぼ同じ吸光度値を得るために、ＭＰＰのために使用する較正流体内およびＴＲＩＳ／クレゾールレッド流体内のクレゾールレッド濃度はクレゾールレッド濃度の２．５倍であった。上記のように信号は発色団濃度とは独立している。使用したＭＰＰはプロトタイプソフトウエアで設定した、すなわち、ＭＳ−ＤＯＳの下で動作するＴｕｒｂｏＣで作成された５つのプロトタイプのうちの一つである。実験のために、本質的にはインキュベーション温度が異なるだけである二つのプロトコル、すなわち、３７℃のインキュベーションのためのプロトコルと、５０℃のインキュベーションのためのプロトコルとをＭＰＰのためにプログラムした。３７℃と５０℃は、ＭＰＰのインキュベータモジュールを確度と、マイクロプレートにわたる温度分布とについて試験する二つのインキュベーション温度である。各プロトコルは下記の処理ステップを実行した。 − 較正流体を満たされた第一のマイクロプレートをリーダーモジュールへ輸送し、二つの波長で読み出す（端点読出し）。 − 測定データをデータファイルに保存し、除去するためにオペレータがマイクロプレートを出力モジュールに取り付ける。 − 第二のマイクロプレートをリーダーモジュールに取り付け、二つの波長でそれを読み出す（端点読出し）。それらの読み出しはＭＰＰの外部温度と計器の内部温度とに関連付けられる。 − その後でマイクロプレートをインキュベータモジュール＃３に取り付け、３７℃設定点で２０分間または５０℃設定点で４０分間イキュベートする。 − インキュベーションが終わった後で、マイクロプレートをリーダーモジュールに取り付け、そこでプレートを２つの波長で、ソフトウエアタイマにより制御される時間間隔をおいて１０回読み出した。時刻零を、輸送モジュールでマイクロプレートをインキュベータプレートキャリッジから取り上げた時刻と定義した。第一の波長の正確な測定時刻は３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０および３００秒である。第二の波長ではそれらの時刻は３５、６５、９５、１２５、１５５、１８５、２１５、２４５、２７５および３０５秒である。後での処理のために全てのデータをデータファイルに保存した。 − 全ての測定が終わった後で、除去するためにオペレータがマイクロプレートを出力モジュールに取り付ける。 − ３０秒の時間間隔を選択した理由は、マイクロプレートをインキュベータモジュールからリーダーモジュールへ輸送するためにほぼこれ位の時間を要するためである。二つの波長でリーダーモジュールにより読み出し、かつ測定データをデータファイルに保存するために必要な時間は同様に約３０秒かかる。ＬｏｔｕｓＳｙｍｐｈｏｎｙを用いてデータの処理および整理のために、データファイルをＲＳ−２３２接続およびＬＡＮを介してＰＣへ送った。下記の結果を得た。１．ＴＲＩＳ緩衝剤の温度−ｐｈ関係３７℃でｐＨ＝７．８０であるＴＲＩＳ緩衝剤０．１ｍｏｌ／Ｌを使用した。溶液のｐＨを約２０〜５３℃の温度範囲で測定した。その測定データに対して線形回帰を最小二乗法的に行った。その結果は次の通りであった。ｐＨ（Ｔ）＝８．８３−０．０２７７・Ｔ（Ｔは℃）（１３）Ｒ²＝０．９９９およびＳｔｅｒｒＹ_est＝０．００８７である。それはｐＨの測定確度より十分低い。値δｐＨ／δＴ＝−０．０２７７（標準誤差が０．０００１６）は文献［４，５］で報告されている値に従って良好である。結果を第２図に示す。２．温度の関数としてのＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液の吸光度スペクトル上記のようにして調製したＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液の吸光度スペクトルを２６〜５２℃の温度範囲で記録した。その結果を第３図に示す。図から分かることは、４００〜４７３ｎｍの範囲では、吸光度が温度上昇とともに高くなり（ βが正）、４７３〜６００ｎｍの範囲では、吸光度が温度上昇とともに低くなる（βが負）ことである。イソベスチック（ｉｓｏｂｅｓｔｉｃ）（温度独立の）点が４７３ｎｍに存在し、極大が５７６ｎｍと４３５ｎｍにある。波長の関数としての式（１）からαの値とβの値とのインプレッション(impre ssion)を得るために、２６℃と５２℃における吸光度スペクトルのみを用いてそれらの値を計算した。（そうすると各波長ごとに、αとβを計算できる二つの式を利用できる）。結果を第４図に示す。ＭＰＰのリーダーモジュールにおいて光干渉フィルタを利用できる対象である関連する波長を第４図に垂直線（４０５、４５０、４９２および５４０ｎｍ）として引いてある。それらの波長を使用できるだけであるという制約により、式（２）におけるβ′の最大絶対値に対応する最高の温度感度が４０５および５４０ｎｍを用いた時に得られることが明らかである。温度の関数としてのｌｎ（Ａ₅₄₀／Ａ₄₀₅）値を計算し、式（２）からのα′と β′を最小二乗法的に線形回帰で計算した。結果を第５図に示す。回帰データは下記の通りである。 α′＝１．４９３９（標準誤差は０．０１０８） β′＝−０．０３９５８（標準誤差は０．０００２６）Ｒ² ＝０．９９９ＳｔｅｒｒＹ_est＝０．００９３二つの較正溶液の吸光度値を分光光度計で５４０ｎｍと４０５ｎｍにおいて読み出した。求めた値を用い、式（２）とα′およびβ′について計算した値とを使用して実際の温度を計算した。驚いたことに、計算した実際の温度は予測した温度より数度高かった、すなわち、３７．０℃を予測した場合は４０．４℃で、５０．０℃を予測した場合は５６．６℃であった。較正溶液について見積もった δｐＨ／δＴ値に基づいて、（７．８０−７．４６）（４０．４−５６．６）＝ −０．０２１である。ｐＨ設定をそれぞれ７．８７および７．６０にした新しい溶液を調製した。それらの新しい溶液についての分光光度計による吸光度測定により次の値が得られた。５０℃の較正溶液に対してＡ₅₄₀＝０．６９５ＡＵおよびＡ₄₀₅＝１．１３８ＡＵ。３７℃の較正溶液に対してＡ₅₄₀＝０．９９７ＡＵおよびＡ₄₀₅＝０．９４３ＡＵ。式（２）とα′およびβ′について計算した値とを用いてそれらの溶液の実際の温度を計算すると、値５０．２℃と３６．３℃がそれぞれ得られた。溶液のスペクトルはそれらの温度におけるＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液のスペクトルに非常に良く一致した。明らかに、吸光度スペクトルも、ｐＨ以外に、溶液がＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳ／リン酸塩を含んでいるかどうかによって僅かに影響を受ける。３．ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＰＲＯＣＥＳＳＯＲ３０００における測定３．１冷却挙動３７℃でのインキュベーションのために設定したＭＰＰのインキュベータモジュールで実験を４回行い、５０℃でのインキュベーションのために設定したインキュベータモジュールで実験を一回行った。測定データに対して二次多項式を最小二乗法的に適用することにより、ＭＰＰのインキュベータモジュール内にマイクロプレートが静止している時の吸光度値を見積もった。回帰データは二次多項式が冷却挙動のための良いモデルであることを極めて良く示した。三次多項式を用いても改善は示されなかった。回帰解析におけるＳｔｅｒｒＹ_est値はＭＰＰのリーダーモジュールの測定確度より十分下である。全ての実験に対する回帰データを表１に見ることができ、吸光度値のいくつかの典型的な例を時間の関数として（測定およびモデル）第６図と第７図に示す。３．２確度および精度この方法の確度を、インキュベータモジュール内のマイクロプレートのウェル中の流体の計算した平均温度対実際の平均温度における誤差として定義する。精度は温度の引き続く決定において得た変化量として定義される。確度は下記のことに主として依存する。 − α′とβ′を決定する確度。 − ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液および較正溶液の劣化。 − 吸光度−時間曲線（冷却）の記録のための時刻零の定義。式（４）から温度Ｔを計算する時は、計算した温度の分散をＶａｒ（Ｔ）＝［Ｖａｒ（ｌｎ（Ａ₅₄₀／Ａ₄₀₅））＋Ｖａｒ（α″）＋Ｔ²・Ｖａｒ（β′）＋２・Ｔ−Ｃｏｖ（α″，β′）］／β′² （１４）に従って計算できる。確度は多数の絶対値の平均値に基づいているから、式（１４）中のＶａｒ（ｌｎ（Ａ₅₄₀／Ａ₄₀₅））は無視できる。分光光度計での較正流体の絶対値測定の不正確さを無視できると更に仮定すると、Ｖａｒ（α″）はＶａｒ（α′）に等しく、Ｃｏｖ（α″，β′）はＣｏｖ（α′，β′）に等しい。そうすると式（１４）はＶａｒ（Ｔ）＝［Ｖａｒ（α′）＋Ｔ²・Ｖａｒ（β′）＋２Ｔ・Ｃｏｖ（α ′，β′）］／β′² （１５）になる。この方法の確度を決定するために式（１５）を用いると、温度に依存する０．３〜０．４℃の範囲内の標準誤差が与えられる。標準誤差は２０℃で０．３１℃、３７℃で０．３７ ℃、５０℃で０．４３℃である。溶液の劣化については調べなかった。明らかな劣化による影響が二カ月の期間にわたるＭＰＰ実験において観察されなかったことを述べることができるだけである。冷却曲線の時刻零の決定の不正確さにより、系統誤差が生ずることになる。その誤差は別の実施例においては、何回かの実験に基づいて時刻零を再び定めることにより修正できる。温度独立の、較正溶液用の、精度が非常に良く決定できる二つの較正溶液の１：１混合液を用意し、二つのマイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ満たした。各プレートをＭＰＰのリーダーモジュール内で５４０ｎｍおよび４０５ｎｍで読み出した。他のプレートを較正プレートとして用いて１枚のプレートのウェルの実際の温度を計算した。この実験を二回行った。最初の実験では、較正プレートの全部で９６個のウェルの吸光度値の平均を用いてα″を計算した。結果に満足しなかったので、１２個のウェルの行ごとにα″を計算する効果について調べ、かつ計算した実際の温度に空間ローパスフィルタを適用する効果について調べた。その結果を表２に示す。表２の結果から、全部で９６個のウェルの平均吸光度に基づいて、および１２個のウエルの各行の平均吸光度に基づいて計算されるα″の精度（標準誤差）に劇的な差が存在することが明らかである。空間ローパスフィルタリングを適用することの最大の相対的な効果は、個々の各ウェルの吸光度値に基づいて計算されるα″に見られる。これは意味を持つ。その理由はその場合に各ウェルについて計算した温度が四つの個々の吸光度値に基づいており、その結果としてＭＰＰのリーダーモジュールからの光電ノイズおよび電子的ノイズの相対的な最大の影響が加えられることになるからである。それぞれ０．０３℃および０．０６℃の精度（標準誤差）にローパスフィルタリングを行うことに対して得られる。 α″の計算方法に基づいた精度が違う理由が、ＭＰＰのリーダーモジュール内にあることが見出された。種々の実験において用いた較正プレートの吸光度値について調べると、ウェルの場所に関連が存在することがわかる。１２個のウェルの行の平均吸光度値は行ごとに異なり、８個のウェルの列の平均吸光度値は列ごとに異なるが、全ての違いはリーダーモジュールの測定確度内にあるようである。しかしより重要なことは行依存性は波長に依存するようであるのに、列依存性は波長とは独立しているらしいことである。温度計算のために行われているように、二つの波長における吸光度値の比をとると、列依存性が自動的に補償されるが、行依存性は理論的には一層悪化することさえある。表３はこの効果を示すデータを与える。１２個のウェルの行ごとに、または個々のウェルごとにα″を計算する時のみ、行依存性が同様に補償される。３．３温度決定３７℃でのインキュベーションのために設定したＭＰＰのインキュベータモジュールで実験を四回行い、５０℃でのインキュベーションのために設定したインキュベータモジュールで実験を１回行った。全部で五回の実験において、較正マイクロプレートの４８のウェル（列１から列６）を３７℃の較正流体で満たし、他の４８のウェル（列７から列１２）を５０℃の較正流体で満たした。残念ながら、個々のウェルごとに計算したα″での温度計算は、実験設定のために４８のウェルについて行うことができるだけである。しかし、実験を行った時にα″の計算方法は重要な役割を演ずることは予測されていなかった。その理由は、精度を決定するための実験が後の段階で行われたためである。結果を表４から表８に見ることができる。第８図から第１３図に、五回の実験におけるプレート上の温度分布を示す。それらの図は行ごとに計算されているα ″に対応する。表４から表８におけるデータからは空間ローパスフィルタリングの効果は明らかではない。第８図（空間ローパスフィルタリングなしの実験１）と第９図（空間ローパスフィルタリングを含む同じ実験）を比較することにより効果は明らかである。第９図から第１３図は空間ローパスフィルタリングを加えた結果を示す。表６から表８における結果から、個々のウェルごとにα″を計算し、空間ローパスフィルタリングを適用することにより最良の結果が得られることが明らかである。それはこの方法の精度を決定する実験に従ったものである。これは各較正溶液のために十分なマイクロプレートを必要とすることを意味する。４．考察全ての温度決定実験はＡ１ウェル領域における平均よりいくらか温度が低いことを示している。その理由は加熱要素の機械的な構造によって非常に良く説明できる。また、５０℃実験において縁部効果を特に見ることができる。またこれは加熱要素の機械的な構造によってひき起こされるようである。この方法の確度を考慮に入れると、全部で五回の実験において計算した平均温度は、インキュベータモジュールの設定したインキュベーション温度に非常に良く従っていると述べることができる。４回の３７℃実験における計算した平均温度のばらつきはこの方法の確度に従ったものである。温度分布に関する限りは、この方法の精度を考慮すると、３７℃インキュベーションについてのどのような不十分な性能も疑う理由は存在しない。５０℃インキュベーションについては、特にかなり低い温度がＡ１ウェル領域に見られるために、性能は疑問があると考えることができる。したがって、本発明の方法の使用の効果を示す。水が満たされているキュベットに対して分光光度計がブランクにされ、かつＭＰＰのリーダーモジュールが空気に対してブランクにされているので、マイクロプレート自体の吸光度のためにこの方法に誤差が生ずる。第三の（基準）波長での吸光度測定でＭＰＰのリーダーモジュールにおけるすべての吸光度測定を修正することは、十分に正確な操作方法である。しかし、使用している吸光度レベルでは効果は不十分なだけであり、追加の測定を行ってもこの方法の精度は悪影響を受けることになる。その他に、温度計算でα′の代わりにα″を用いることにより、誤差は既に部分的に修正されている。５．結論１℃より高い確度および０．１℃より高い精度という目的は達成された。この方法の確度および精度は、インキュベータモジュールをその技術的仕様について試験するために十分高いばかりでなく、全ての手段によってインキュベータの重大な欠陥を検出するためには十分である。この方法は実施が簡単である。特に、ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００における処理ルーチンおよび計算ルーチンの利用可能性を含めて、商用製品に組み込まれると、インキュベータモジュールの性能検査のための実施が容易で独特の方法を顧客は入手できるであろう。参考文献表および図面表１冷却中の吸光度値に対する回帰データ。表２較正プレートの実際の温度決定。表３較正プレートで測定したリーダーモジュールの行・列依存性。表４プレートごとにa"を計算したプレートの全数についての温度決定。表５行ごとにa"を計算したプレートの全数についての温度決定。表６プレートごとにa"を計算したプレートの半数についての温度決定。表７行ごとにa"を計算したプレートの半数についての温度決定。表８ウェルごとにa"を計算したプレートの半数についての温度決定。第１図Ａ二次元線形回帰による空間ローパスフスルタリング。第１図Ｂ二次元線形回帰による空間ローパスフスルタリング。第２図０．１ｍｏｌ／ＬＴＲＩＳ緩衝剤のｐＨ−温度関係。第３図種々の温度におけるＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液の吸光度スペクトル。第４図 αおよびβの波長依存性。第５図ＴＲＩＳ／クレゾールレッド溶液についての温度の関数としてのＩｎ（Ａ₅₄₀／Ａ₄₀₅）。第６図３７℃インキュベーションについての時間の関数としての吸光度。第７図５０℃インキュベーションについての時間の関数としての吸光度。第８図空間ローパスフィルタリングなしの実験１の温度分布。第９図空間ローパスフィルタリングを含む実験１の温度分布。第１０図空間ローパスフィルタリングを含む実験２の温度分布。第１１図空間ローパスフィルタリングを含む実験３の温度分布。第１２図空間ローパスフィルタリングを含む実験４の温度分布。第１３図空間ローパスフィルタリングを含む実験５の温度分布。略字Ａ吸光度ＡＵ吸光度単位Ｃｏｖ（）共変数 δＡ／δＴ感度、温度による吸光度の変化ＧＬＰ良好な研究所の慣行ＨＣｌ塩酸 λ 波長ＬＡＮローカル・エリア・ネットワークＭＰＰＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ３０００ＮＥＮＮｅｄｅｒｌａｎｄｓｅＥｅｎｈｅｉｄｓＮｏｒｍ（ＤｕｔｃｈＳｔａｎｄａｒｄＮｏｒｍ）ＰＣパーソナルコンピュータｐＨ酸度、Ｌｏｇ（Ｈ₃Ｏ⁺活動度）Ｒ² 相関係数ＲＳ−２３２直列通信規格ｓｅｃ秒Ｓｔｅｒｒ標準誤差ＳｔｅｒｒＹ_est Ｙの想定標準誤差Ｔ温度℃ ＴＲＩＳトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＶａｒ０（）分散

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．多数の試料をある定められた温度で同時にイキュベートするため（たとえば、マイクロタイタプレートをイキュベートするため）に適当であり、かつ希望により、たとえば、多数のマイクロタイタプレート内で、多数の同時検定で多数の試料を検定するための自動化システムに含まれているインキュベータモジュールの性能をモニタする方法であって、１）少なくとも二つの異なる波長λ１およびλ２における温度依存溶液の吸光度を光度計（ｐｈｏｔ２）で測定し、温度依存溶液の吸光度をインキュベーションの場所とは異なる場所で、インキュベーションの後の時刻に決定し、前記温度依存溶液は温度に依存するｐＨを持つ緩衝剤とｐＨに結び付けられた吸光度スペクトルを持つ酸をベースとする指示薬とを含み、δＡ／δＴが、一つの波長に対して正で、他の波長に対して負であるように前記波長を選択し、前記測定により吸光度値Ａ_test,phot2, _λ1とＡ_test,phot2, _λ2が得られ、Ａ_test,phot2, _λ1は、波長λ１における温度依存溶液（ｔｅｓｔ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_test,phot2, _λ2は、波長λ２における温度依存溶液（ｔｅｓｔ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示すステップと、２）ステップ１）におけるデータをデータファイルに保存するステップと、３）ステップ１）の二つの波長λ１およびλ２に対する温度独立の較正溶液の吸光度を光度計（ｐｈｏｔ２）で測定し、温度独立の前記較正溶液は定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルと同じ吸光度スペクトルを示し、前記測定により吸光度値Ａ_cal,phot2, _λ1とＡ_cal,phot2, _λ2が得られ、Ａ_cal,phot _2, _λ1 は、波長λ１における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_cal,phot2, _λ2は、波長λ２における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度（Ａ）を示すステップと、４）ステップ３）におけるデータをデータファイルに保存するステップと、５）保存したデータと式ｌｎ（Ａ_test,phot2, _λ1／Ａ_test,phot2, _λ2）＝α″ ＋ β′Ｔを用いて温度依存溶液の実際の温度Ｔを計算し、α″＝α′−ｌｎ（Ａ_cal,ph _ot1, _λ1 ／Ａ_cal,phot1, _λ2）＋α′ｌｎ（Ａ_cal,phot2, _λ1／Ａ_cal,phot2, _λ2）で、α′-ｌｎ（Ａ_cal,photl, _λ1／Ａ_cal,phot1, _λ2）の値は、あらかじめ決めおくか、あるいはステップ１）の、二つの波長λ１およびλ２に対して温度独立の較正溶液を他の光度計（ｐｈｏｔ１）で吸光度を測定することにより得ることができ、それによりＡ_cal,phot1, _λ1とＡ_cal,phot1, _λ2を得、Ａ_cal,phot1, _λ1 は、波長λ１における温度独立の較正溶液（ｃａ１）について他の光度計（ｐｈｏｔ１）で決定した吸光度（Ａ）を示し、Ａ_cal,phot1, _λ2は、波長λ２における温度独立の較正溶液（ｃａｌ）について他の光度計（ｐｈｏｔ１）で決定した吸光度（Ａ）を示し、そのステップ５）データをデータファイルに保存し、かつ、温度依存溶液についてステップ１）の異なる二つの波長λ１およびλ２に対して吸光度および温度を他の光度計（ｐｈｏｔ１）で測定することにより、既知の温度における吸光度値Ａ_test,phot1, _λ1とＡ_test,photl, _λ2を式Ｉｎ（Ａ_λ1／Ａ_λ2）＝α′＋β′Ｔを用いて、α′と β′を計算することにより得て、このデータをデータファイルに保持するステップと、６）モジュール内でインキュベートされている温度依存溶液の修正した温度および修正した温度分布を確かめるために、モジュールが設定されている定められた温度と比較するステップを備えるインキュベータモジュールの性能をモニタする方法。２．計算手段を用いて、光度計（ｐｈｏｔ２）で決定した吸光度をインキュベーションおよび吸光度測定の場所間に起こる冷却作用について修正する請求の範囲第１項に記載の方法。３．温度独立の較正溶液が満たされている第一のマイクロプレートを光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送し、二つの波長λ１とλ２で吸光度を読み出し、測定データをデータファイルに保存し、除去するために出力モジュールにそのマイクロプレートを取り付け、温度依存溶液を含んでいる第二のマイクロプレートをインキュベータモジュールに取り付け、インキュベータモジュールの設定に従った定められた温度でインキュベートし、インキュベーションが終わったらそのマイクロプレートを光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送し、そこで二つの波長λ１とλ２で、好ましくはソフトウエア・タイマにより制御される時間間隔で吸光度を何回も読み出し、全てのデータをデータファイルに保存する請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。４．インキュベーションの終了と光度計（ｐｈｏｔ２）における最初の読出しとの間の時間間隔ができるだけ短く、それはマイクロプレートをインキュベータモジュールから光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送するために要する時間により制限され、前記時間間隔は４５秒より短いことが好ましく、２５〜３５秒が適当である請求の範囲第３項に記載の方法。５．光度計（ｐｈｏｔ２）における吸光度測定の間の時間間隔が、二つの波長 λ１とλ２において吸光度を測定するために要する時間の長さと、データをファイルに保存するために要する時間の長さとにより決定され、前記時間間隔は一般に２５秒より長く、好ましくは４５秒より短く、３０秒が適当である請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。６．回帰係数Ｒ²が０．９８に等しいか、それより大きいように、冷却のパターンに適合する数学関数に基づいて、光度計（ｐｈｏｔ２）からの吸光度データに基づいて決定した温度を、インキュベータモジュールから前記光度計への輸送の間に起きる冷却に対して計算手段を用いて修正する請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の方法。７．時間に対する吸光度についての関数を、光度計（ｐｈｏｔ２）で得た吸光度測定データに最小二乗的に適合可能にして、インキュベータモジュールから温度依存溶液を取る時すなわち時刻零にインキュベータモジュール内の実際の吸光度の計算を可能にし、それにより時刻零におけるインキュベータモジュール内の実際の温度の以後の計算を可能にする計算手段を用いる請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の方法。８．関数がｎ次であって、時間に対する吸光度の関係について、Ａ（ｔ）＝ａ＋ｂｔ＋ｃｔ²に類似の二次多項式が適当であり、この式でａ、ｂ、およびｃは定数であり、ａはｔ＝０、すなわち、光度計（ｐｈｏｔ２）まで輸送するために除去すべきインキュベータモジュールから温度依存溶液が取り出された時刻における吸光度である請求の範囲第７項に記載の方法。９．光度計（ｐｈｏｔ２）の不正確さに起因する温度分布中の高周波成分を除去するために計算手段をまた用いる請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の方法。１０．二次元ローパスフィルタを用いてフィルタリングを行う請求の範囲９に記載の方法。１１．インキュベータモジュールの温度の計算で、二次元線形モデルを、試料のマトリックスの一部分の温度データに最小二乗法でフィットさせることにより、すなわち、たとえばマイクロプレートについての９個のウェルの正方形ブロックにおける二次線形回帰により、たとえばマイクロタイタプレートの多数の試料の間の相互作用の影響をインキュベータモジュールの温度の計算において考慮に入れる請求の範囲第１項から第１０項のいずれか一項に記載の方法。１２．線形モデルを最小二乗法でフィットさせることによる、すなわち、たとえばマイクロプレートについての９個のウェルの正方形ブロックにおける二次線形回帰による、インキュベータモジュールの温度の計算が、フィルタリング後の温度を、たとえば、Ｔ_filtD6＝ｆ₁・Ｔ_C5＋ｆ₂・Ｔ_C6＋ｆ₃・Ｔ_C7＋ｆ₄・Ｔ_D5＋ｆ₅・Ｔ_D6＋ｆ₆・Ｔ_D7 ＋ｆ₇・Ｔ_E5＋ｆ₈・Ｔ_E6＋ｆ₉・Ｔ_E7 （８）として表すことを含み、ここで、Ｃ，Ｄ，Ｅは正方形ブロックの行の名称を表し、５、６および７は正方形ブロックの行の名称を表し、ｆ１からｆ９は計算できる定数である請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．計算にモデル：Ｔ_filt＝ａ・ｒｏｗｎｕｍｂｅｒ＋ｂ・ｃｏｌｕｍｎｎｕｍｂｅｒ＋ｃ（９）（ａ、ｂおよびｃは定数）を使用し、最小二乗法で最小にすると最小化関数Ｆ、Ｆ＝Σ（Ｔ_filt（Ｗｅｌｌ_i）−Ｔ（ｗｅｌｌ_i））²（ｉ＝１〜９）（１０）が得られ、 − マイクロプレートの縁部にないウェルについてはｆ_i＝１／９、 − マイクロプレートの縁部にあるが、隅にないウェルについてはｆ₄＝ｆ₅＝ｆ₆ ＝２／１８およびｆ₇＝ｆ₈＝ｆ₉＝−１／１８で、Ｔ_filtA6＝ｆ₁・Ｔ_A5＋ｆ₂・Ｔ_A6＋ｆ₃・Ｔ_A7＋ｆ₄・Ｔ_B5＋ｆ₅・Ｔ_B6＋ｆ₆・Ｔ_B7 ＋ｆ₇・Ｔ_C5＋ｆ₈・Ｔ_C6＋ｆ₉・Ｔ_C7 （１１） − 隅にあるウェルについてはｆ₁＝８／１８、ｆ₂＝ｆ₃＝５／１８、ｆ₄＝ｆ₅ ＝ｆ₆＝２／１８、ｆ₇＝−１／１８、ｆ₈ ＝−１／１８およびｆ₉＝−４／１８で、Ｔ_filtA1＝ｆ₁・Ｔ_A1＋ｆ₂・Ｔ_A2＋ｆ₃・Ｔ_B1＋ｆ₄・Ｔ_A3＋ｆ₅・Ｔ_B2＋ｆ₆・Ｔ_C1＋ｆ₇・Ｔ_B3＋ｆ₈・Ｔ_C2＋ｆ₉・T_C3 （１２）が成立する請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．温度依存溶液の緩衝系が、好ましくは少なくとも絶対値０．０２ｐＨ単位／℃である大きいδｐＨ／δＴを持つ請求の範囲第１項から第１３項のいずれか一項に記載の方法。１５．温度依存溶液が大きいδＡ／δｐＨ値を示し、大きさは少なくとも精度が０．１℃で、確度が少なくとも０．５℃、好ましくは０．３℃となるのに十分である請求の範囲第１項から第１４項のいずれか一項に記載の方法。１６．温度依存溶液と、温度独立の較正溶液とへの指示薬の溶解度が、測定可能で信頼できる吸光度値、好ましくは、定められた温度および波長λ１およびλ ２において０．５〜１．５ＡＵの間の吸光度値を確保できるために十分である請求の範囲第１項から第１５項のいずれか一項に記載の方法。１７．光度計（ｐｈｏｔ１）と光度計（ｐｈｏｔ２）で使用する温度依存溶液中および温度独立の較正溶液中の酸をベースとする指示薬の濃度が、二つの光度計内部の試料を通る光路の長さの比が濃度比と同一である請求の範囲第１項から第１６項のいずれか一項に記載の方法。１８．少なくとも、定められた温度で波長λ１およびλ２において０．５ＡＵより高い吸光度を少なくとも示し、かつ温度に依存するｐＨを持つ緩衝系とｐＨに結び付けられた吸光度スペクトルを有する酸をベースとする指示薬とを含む温度依存溶液を含んでいる容器と、定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルと同一の吸光度スペクトルを示し、かつ温度依存溶液の組成にできるだけ近い組成を有することが好ましい少なくとも一つの、前記温度独立の較正溶液を含む容器とを備える請求の範囲第１項から第１７項のいずれか一項に記載の方法を実施するのに適したキット。１９．溶液のｐＨが、ａ）測定を行う、好ましくは２０〜６０℃の範囲内である所望の温度範囲内である定められた温度において、温度依存溶液の緩衝系の動作範囲内にあり、ｂ）測定を行う定められた温度において、酸をベースとする指示薬の指示範囲内にあり、ｃ）その結果、二つの波長λ１およびλ２における吸光度が、指定した範囲の中間の温度において相互にできるだけ近くなり、ｄ）好ましくはＣＯ₂吸収を阻止するためにできるだけ低くなる、請求の範囲第１８項に記載のキット。２０．いくつかの定められた温度について、多数の温度独立の較正溶液を備え、温度独立の較正溶液の吸光度スペクトルが定められた温度における温度依存溶液の吸光度スペクトルに等しくなるように、各温度独立の較正溶液のｐＨが選択される請求の範囲第１９項に記載のキット。２１．温度依存緩衝剤がクエン酸、酒石酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン、ホウ砂および重炭酸ナトリウム、好ましくはトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタンの水溶液を含む請求の範囲第１８項から第２０項のいずれか一項に記載のキット。２２．酸をベースとする指示薬がクレゾールレッドであって、溶解可能な形で存在する請求の範囲第１８項から第２１項のいずれか一項に記載のキット。２３．温度独立の較正溶液がＨＥＰＥＳ、リン酸塩、およびクレゾールレッド溶液を含み、かつ好ましくは更に、緩衝剤としてトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタンを含み、酸をベースとする指示薬としてクレゾールレッド溶液を含む、温度依存溶液と同一である請求の範囲第１８項から第２２項のいずれか一項に記載のキット。２４．前記容器が、アジ化物および好ましくはシンナムアルデヒドおよび硫化ゲンタミシンなどの、微生物による劣化に対する薬剤を更に含む請求の範囲第１８項から第２３項のいずれか一項に記載のキット。２５．いくつかの異なる定められた温度でインキュベータモジュールの温度分散を決定するために、前記方法または前記キットが異なる温度の数に等しい数の温度独立の較正溶液を要する請求の範囲第１項から第２４項のいずれか一項に記載の方法またはキットの使用。２６．自動化した多数試料システムが正常に動作している時にそのシステムのインキュベータモジュールの温度分散を決定するための請求の範囲第１項から第２４項のいずれか一項に記載の方法またはキットの使用。