JPH10501682A

JPH10501682A - 細胞毒性ｔ細胞エピトープ

Info

Publication number: JPH10501682A
Application number: JP7523739A
Authority: JP
Inventors: デニスジェイムズモス，; スコットレントンバロウズ，; ラジヴカーナ，; ビヴァリーメイヴィスケア，; ジャクリンマーガレットバロウズ，; アンドレアススービエ，
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1994-03-16
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 1998-02-17
Also published as: AUPM446594A0; US5869453A; CA2185541C; GB2301591B; GB2301591A; WO1995024925A1; NZ282348A; CA2185541A1; CA2185540A1; GB9619232D0; WO1995024926A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープを提供する。このエピトープは、ＱＡＫＷＲＬＱＴＬ、ＲＹＳＩＦＦＤＹ、ＨＬＡＡＱＧＭＡＹ、ＹＰＬＨＥＱＨＧＭ、ＳＶＲＤＲＬＡＲＬ、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭ、ＶＳＦＩＥＦＶＧＷ、ＦＲＫＡＱＩＱＧＬ、ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ、ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ、ＰＧＤＱＬＰＧＦＳＤＧＲＡＣＰＶ、ＶＥＩＴＰＹＫＰＴＷ、及びそれらの変異型からなる群から選択される。さらに、本発明はこれらのエピトープを含有する患者にＣＬＴを誘発するために用いる組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞毒性Ｔ細胞エピトープ発明の属する分野本発明は、エプスティン-バーウィルスの細胞毒性Ｔ細胞エピトープ（ＣＴＬ）に関する。また本発明は、このエピトープの、サブユニットワクチンにおける使用にも関する。発明の背景エプステイン-バーウィルス（ＥＢＶ）は、西側社会の個体の約８０％に感染しているヘルペスウィルスである。初期感染に続いて、長く生存するＢ細胞の潜伏性のＥＢＶ感染が樹立される。西側社会では１０−２０％の個体で生ずることだが、初期感染が青年期まで遅延すると、約５０％の確率で感染性単核細胞症を発症する。ＥＢＶは、ヒトＢ細胞を「不朽化」または形質転換できるという非常に有用な特性を有する。これらの形質転換されたＢ細胞（ＬＣＬと呼称される）は、実験室において、実質的に無制限の成長をする能力を有している。これらのＣＬＣが樹立される２つの方法が存在する。第１に、ＬＣＬは、Ｂ９５．８と呼ばれるＥＢＶの共通株を用いることによって樹立される。樹立されたＬＣＬは、このウィルス株に感染している。第２に、ＬＣＬは、すべてのＥＢＶ免疫個体に形質転換ウィルス源として存在する潜伏的に感染されたＢ細胞によって生成される。この場合、考えられるＬＣＬは、任意の与えられた免疫個体に自然に存在するＥＢＶの株で形質転換される（自発的ＬＣＬと呼称される）。ＥＢＶには２つのタイプＡ及びＢが存在する。Ａタイプは、健常なセロポジティブな個体の大多数のリンパ感染において主に見られる。そのような個体では、潜伏的に感染したＢ細胞が、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡｓ）２−６及び潜在的膜抗原（ＬＭＰ）１−３（Moss，D.J．等，1992）を含む潜在的抗原に特異的なＣＤ８⁺細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって制御されることがわかる。最近の研究では、この感染の制御に、ＣＤ４⁺ＣＴＬも一部の役割を果たしていることが示唆されている。これらのＣＴＬは、適当な抗原表現細胞の表面にＭＨＣクラスＩ分子を有する抗原性決定基から誘導された短いペプチドエピトープを認識することが知られている。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ対立遺伝子を表現し、ＥＢＶ潜伏性抗原内のエピトープを表現するＣＴＬは、ＣＴＬクローンの特異性の決定のための標的細胞としてしばしば用いられる。潜伏性タンパク質全長に基づく全ウィルスまたは組み換えワクチンは、潜在的に癌性と考えられ、潜伏性抗原から誘導されたＣＴＬエピトープに基づくＥＢＶワクチンが現在開発されている（Moss，D.J．等、1993）。Khanna等（1992）は、数種のＣＴＬエピトープを既に報告している。発明の要旨本発明の第１の態様は、エプステイン-バーウィルスからの細胞毒性Ｔ細胞エピトープからなる。より詳細には、ＱＡＫＷＲＬＱＴＬ、ＲＹＳＩＦＦＤＹ、ＨＬＡＡＱＧＭＡＹ、ＹＰＬＨＥＱＨＧＭ（ＹＰＬＨＫ０ＨＧＭ、ＹＲＬＨＥＱＨＧＭ、ＹＰＬＨＥＱＲＧＭ）、ＳＶＲＤＲＬＡＲＬ、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭ（ＴＶＬＬＨＥＥＳＭ、ＴＡＬＬＨＥＥＳＭ）、ＶＳＦＩＥＦＶＧＷ、ＦＲＫＡＱＩＱＧＬ、ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ、ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ、ＰＧＤＱＬＰＧＦＳＤＧＲＡＣＰＶ、ＶＥＩＴＰＹＫＰＴＷというアミノ酸配列を持つ、エプステイン-バーウィルス潜伏性抗原からの１２の細胞毒性Ｔ細胞エピトープが提供される。さらに、上記の括弧内に下線を施したアミノ酸配列は、上述した配列の変異型であり、エプステイン-バーウィルスの地理的（位置的）に異なるアイソレート（isolate）からの配列である。これらの変異型がＣＴＬエピトープであるか否かは、まだ確認されていなかった。本発明の第２の態様は、患者にＣＴＬを誘発させるための組成物であり、この組成物は、第１の態様の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープの少なくとも１つに、少なくとも１つの製薬的に許容されるアジュバント、キャリャ、希釈剤、または賦型剤を混合してなる。本発明の第３の態様は、患者にＣＴＬを誘発させるための組成物の製法であり、この方法は、第１の態様の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープに、少なくとも１つの製薬的に許容されるアジュバント、キャリヤ、希釈剤、または賦型剤を混合することからなる。ここで、「患者」なる用語は、ヒト及びヒト以外の動物を含むものとする。図面の簡単な説明図１は、ＰＨＡ細胞芽球上のＥＢＮＡ４のオーバーラップしたペプチドの反応性のスクリーニングを示す。図２は、ＥＢＶ潜伏性抗原をエンコードする組み換えワクシニアウィルスで感染した抗−μＢ細胞芽球パネルに対するクローンＣＳ３０の反応性を示す。図３は、ＶＴＡＶＬＬＨＥＥＳＭＱＧＶＱＶＨＧＳＭ内の活性エピトープ配列を決定するための最小化実験を示す。これにより、最小エピトープがＡＶＬＬＨＥＥＳＭであると決定することができた。発明を実施する最良の方法下記の実施例は、ＥＢＶ潜伏性抗原内の１２の新規なＣＴＬエピトープの局在化を、関連したＥＢＶ抗原に渡るオーバーラップしたペプチドを用いて例示するものである。このペプチドは、ＥＢＶのＢ９５．８株（Baer等、1990）の配列を用いて合成された。さらに、異なる地理的位置からの場のアイソレート（field isolates）は、ＹＬＰＨＥＱＨＧＭ、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭというＣＴＬエピトープの部位から配列され、これらのエピトープの変異型が決定された。略語：ＣＴＬ：細胞毒性Ｔ細胞リンパ球Ｅ：エフェクターＥＢＶ：エプステイン-バーウィルスＨＬＡ：ヒト白血球抗原ＩＬ−２：インターロイキン−２ＰＢＭＣ：末梢血液単核細胞ＰＨＡ：フィトヘマグルチンｒＩＬ−２：組み換えインターロイキン−２Ｔ：標的ＴＣＭ：Ｔ細胞媒質Ｕ／ｍｌ：１ミリリットル当たりの単位実施例１：細胞成長用の基礎培養媒質媒質は、１０％加熱非活性化したウシ胎児血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＭＰＩ１６４０（Commonwealth Serum Laboratories、ビクトリア）である。この媒質に、精製した組み換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（５００Ｕ／ｍｌ；Hoffman La-Roche）及び３０％（ｖ／ｖ）のＭＬＡ１４４Ｔ細胞系からの加熱不活性化（５６℃、３０分間）した上澄みを添加した。この添加された媒質をＴ細胞媒質（ＴＣＭ）と呼称し、フィトヘマグルチン芽球細胞（ＰＨＡ芽球）の培地において、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離と成長のために用いた。実施例２：単核白血球の調製及びＣＴＬの生成末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン化（１０Ｕ／ｍｌ）した血液からフィコール・パク（Ficoll-Paque）（Pharmacia，Uppsala，スウェーデン）上で分離した（４００ｇまたは１５００ｒｐｍ、２０分間）。分離したＰＢＭＣを、塩基性媒質で１回洗浄し、続いて、ＣＴＬ、ＰＨＡ芽球の刺激、またはＥＢＶ形質転換細胞系の樹立のいずれかに用いた。実施例３：ＨＬＡタイプ分けドナーのＨＬＡタイプ分けは、血清学によって行った。実施例４：細胞系の樹立４．１：外因性ウィルスの添加によるＥＢＶ形質転換ＬＣＬの樹立ＥＢＶ形質転換ＬＣＬは、ＰＢＭＣから以下のようにして樹立した。液体窒素に貯蔵していたＥＢＶウィルスストック（表１：特異的タイプ及びアイソレート）を選択し、即座に３７℃に暖めた。ウィルスストック１ミリリットルの半分（１０⁵形質転換単位）を、ＰＢＭＣ細胞ペレット（１−４×１０⁶細胞）に直接添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を媒質を用いて１０００ｒｐｍで５分間、２回洗浄した。さらに細胞を、ＰＨＡ（Sigma PHA-P）を有する媒質中に、２μｇ／ｍｌで混合し、２４ウェルのプレートに、２×１０⁶細胞／ゥェルとなるように分配した。増殖ＬＣＬを表現する細胞の凝塊（clump）は、細胞をフラスコに移した後１−３週間で生じた。４．２：ウィルスの場のアイソレートのサンプリング手段としての添加による自発的ＬＣＬの樹立オーストラリア（ブリスバン(Brisbane)）、パプアニューギニア（ゴロカ(Gor oka)及びマダング(Madang)）、またはケニヤからの健常者ＥＢＶ免疫個体からのＰＢＭＣを、２倍希釈して、０．１ｍｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ（Sandoz Ltd .，Basle，スイス）を含む培養媒質中、０．２ｍｌマイクロタイタープレートウェル当たり２×１０⁶から１．２５×１０⁵細胞で播種した。シクロスポリンＡは、培養媒質中に維持されるように、８週間まで規則的に再添加した。増殖開始が見られたウェルは、３７℃で継代培養して膨張させた。この方法は、ウイルスの場のアイソレートの生成に用いられた。４．３：ＰＨＡ芽球細胞系の樹立ＰＢＭＣ（２×１０⁶細胞／ウェル）を、ＰＨＡ−Ｐ（２μｇ／ｍｌ、最終濃度）（Sigma）で剌激し、その３日後にＴＣＭを添加した。培地をフラスコに膨張させ、２週に１回ＴＣＭを入れ換えながら６週間まで維持した（ＰＨＡは、これ以上添加しなかった）。４．４：抗−μＢ細胞芽球ＰＢＭＣは、フィコール・パク（Pharmacia，Uppsala，スウェーデン）上で分離し、Ｔ細胞をＥ−ロゼット形成を用いて涸渇させた。豊富化したＢリンパ球を、アクリルアミド・ビーズ（Bio-Rad，カリフォルニア，米国）に結合した抗− ＩｇＭ（μ−鎖特異的）、組み換えヒトインターロイキン−４（ｒＩＬ−４；５０Ｕ／ｍｌ；Genzyme,米国）、及び高度に精製したＥ．ｃｏｌｉからの組み換えヒトインターロイキン−２（ｒＩＬ−２；２０−４０Ｕ／ｍｌ）を含む成長媒質中で培養した（１７、１８）。４８−７２時間後、Ｂ細胞芽球をｒＩＬ−２（２０−４０Ｕ／ｍｌ）を添加した成長媒質に懸濁した（１４）。Ｂ細胞は、ｒＩＬ−２存在下で３週間の間に２−３回分化を続けた。これらの細胞を、抗−μＢ細胞芽球と呼称する。実施例５：ペプチドの合成５．１：製造ペプチド（Chiron Mimetopes，メルボルンから購入した）は、ポリエチレン製ピン上で複製してピンから剥離するというピン技術を用いて合成した。Ｃ−末端グリシンエステル結合を、Ｃ−末端に酸を持つペプチドの調製に使用した（Vale rio，R.M.，等，1991）。５．２毒性及び可溶化凍結乾燥したペプチドを、まず２０μｌのＤＭＳＯに溶解し、次いで、０．６ｍｌの蒸留水に溶解して、２ｍＭの濃度を得た。これらを使用前に２０℃で貯蔵した。使用に際して、ペプチドをＲＰＭＩ１６４０で希釈した。全てのペプチドの毒性試験は、⁵¹ＣｒでラベルしたＰＨＡ芽球２００μｌに、如何なるエフェクターも存在しない条件下で、最終濃度１００μＭから１０⁴でペプチドを添加することによるスクリーニングの前に行った。実施例６：ＣＴＬの生成６．１：ポリクローナルＣＴＬの生成ポリクローナルＣＴＬエフェクターは、健常でセロポジティブなドナーを、０及び７日に、オートロガスＡ−タイプＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）で剌激することによって生成した。これらの培地にＩＬ−２は添加しなかった、それが存在すると、非特異的Ｔ細胞の膨張が促進されるからである（データは示さず）。６．２：Ｔ細胞の寒天クローニング個々のドナーからのＴ細胞クローンは、以下のようにして生成した。ＰＢＭＣを分離して、２４ウェルプレート中、２×１０⁶細胞の濃度で媒質中に懸濁した（Coster，ケンブリッジ，Mass）。同一のドナーからのＬＣＬを、８，０００ｒａｄで照射し、これらの各ウェルに１０⁵または１０⁴細胞／ウェルのいずれかで添加した。３日後、細胞を分散し、３．５ｃｍ径の培養皿の、ＲＰＭＩ１６４０、２０％２×ＲＰＭＩ１６４０、２０％ＦＣＳ、１６％ＭＬＡ上澄み液及び５０Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２を含む０．３５寒天（Seaplaque，FMC Corp.，Rocklarld，M E）に播種した。５日後に寒天内にコロニーが現れた。これらは、反転顕微鏡（ ×２５倍）で、クラスター、鎖、または不連続な細胞であると同定された。これらのコロニーは、顕微鏡下、ギルソンピペット（Gilson pipette）を用いてラミナー・フロー・キャビネット（laminar flow cabinet）内で収集した。収集したコロニーは、Ｔ細胞成長媒質（ＲＰＭＩ１６４０、２０％ＦＣＳ、３０％ＭＬＡ上澄み液、２０Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２）中に分散し、同一ドナーからの照射したＬＣＬを含む９６ウェルのマイクロタイタートレーに移した（１０⁴細胞／ウェル）。これらのコロニーは、膨張を続けさせ、液体窒素中で保存した（約５×１０⁶ 細胞／アンプル）。実施例７：ワクシニアウィルスの組み換え異なるＥＢＶ潜伏性抗原の組み換えワクシニア構造体は、既に記載されている（Khanna等，1992）。全てのＥＢＶ配列は、ウィルスのＢ９５．８株から誘導された。全ての構造は、ＥＢＶタンパク質全長をエンコードする能力を有する。実施例８：クロム放出アッセイ８．１：ＥＢＶ潜在性抗原をエンコードする組み換えワクシニアに対するＳＴＬクローンの反応性のスクリーニング抗−μＢ細胞芽球を、１０：１の感染多重度で、３７℃において１時間、組み換えワクシニアウィルスで感染させた。１４−１６時間後、細胞を塩基性媒質で洗浄し、⁵¹Ｃｒとともに９０分間インキュベートした。３回洗浄し、下記の標準５時間⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおける標的として用いた。８．２：ペプチドスクリーン標準５から６時間クロム放出アッセイは、ポリクローナルＴ細胞エフェクターまたはＴ細胞クローンのいずれかで行い、ペプチドエピトープに対する特異性を評価した。簡単に言えば、洗浄したクロム（Amersham International，英国）でラベルした（６０分、３７℃）標的細胞（オートロガスＰＨＡ芽球）を、U-well 96プレート（Nunc，デンマーク）上の１０μｌのペプチド（最終濃度１００μ Ｍ）に添加した（１０⁴細胞／ウェル４０μｌ）。３７℃での３０分間のインキュベーションの後、１０⁴から５０×１０⁴のエフェクターＴ細胞（クローンまたはバルクＣＴＬ）を、１ウェル当たり１５０μｌを３回で添加して、最終的な標的（Ｔ）に対するエフェクター（Ｅ）の比率［Ｅ：Ｔ］を５０−１：１とした。２種の対照を追加した。（１）媒質と標的（バックグラウンド放出）、及び（２）５時間インキュベーション後の０．５ＳＤＳ１００μｌの添加に対する標的（全放出）である。次いで、プレートを５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３７℃ で５時間インキュベートした。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離に続いて、１００μｌの上澄みを取り出し、ガンマ線計数した。結果を、（実験ウェルの平均計数−対照（バックグラウンド）の平均計数）／（ＳＤＳ可溶化によって決定した全計数−対照（バックグラウンド）の平均計数）で計算したクロム放出％として表した。実施例９：オーストラリア、パプアニューギニア及びケニヤかた分離したＥＢＣのＰＣＲ配列ＣＴＬエピトープ領域のＹＰＬＨＥＱＨＧＭ及びＡＶＬＬＨＥＥＳＭにおける特異的ＥＢＶのＤＮＡ配列の増幅にポリメラーゼ連鎖反応を用いた。ＰＣＲに用いた精製ＤＮＡは、オーストラリア、パプアニューギニア及びケニヤの健常個体からの自発的ＬＣＬからのものである。各ＤＮＡサンプルに、２つの異なるＰＣＲ反応を施した。一方は、知られたＹＰＬＨＥＱＨＧＭ領域に隣接するプライマー：Ｅ３ＹＰＬ５（ＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧ）Ｅ３ＹＰＬ３（ＧＡＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧ）を用い、他方は、周知のＡＶＬＬＨＥＥＳＭ領域に隣接するプライマー：Ｅ４１ＶＴ５（ＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧ）Ｅ４１ＶＴ３（ＣＡＧＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＡＡＣ）を用いた。各ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲバッファー（Boehringer）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、精製ＤＮＡ、各プライマー、及び１．５Ｕのタック（Taq）ポリメラーゼを含み、次いで、９５℃で５分間、さらに、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１５秒（３５サイクル）において、Perkin Elmer 9600 PCR mach ineを用いて変性を施した。ＰＣＲ生成物は、配列させるために、QiagenのQIAqu ick spinカラムを用いて精製し、ＰＣＲ反応からの対応するプライマーを用いて両方向に配列させた。配列反応を起こすために、PRISM^TMレディ・リアクション（Ready Reaction）DyeDeoxy^TMターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット（Terminator Cycle sequencing kit）を用いた。次いで、反応サンプルは、ABIサイクル・シークエンサー（Cycle Sequencer）上を走らせた。実施例１０：ＥＢＶ潜伏性抗原内のＣＴＬエピトープの決定表１に記載したエピトープに対し、例えば、ＣＴＬエピトープＡＶＬＬＨＥＥＳＭの決定に以下の方法を用いた。他のエピトープの決定に用いた方法も同じである。１０−１１日に、オーロガスＰＨＡ芽球上のＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３、ＥＢＮＡ４及びＬＭＰ２Ａからのオーバーラップしたペプチドに対する反応性のスクリーニングにポリクローナルＣＴＬを用いた。図１に見られるように、ドナーＣＳからのポリクローナルＣＴＬを持つＥＢＮＡ４からの全てのペプチドのスクリーニングの後、ペプチド５２と呼ばれる１つのペプチド（ＶＴＡＶＬＬＨＥＥＳＭＱＶＱＶＨＧＳＭ）のみが、⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて強い反応性を示した。この配列が活性ＣＴＬエピトープであることを確認するために、ドナーＣＳからのＣＴＬクローンを樹立し、組み換えワクシニア感染標的に対する反応性をスクリーニングした（図２）。図からも明らかなように、ＣＳ３０クローンは、ＥＢＮＡ４をエンコードする組み換えワクシニアで感染させたＢ細胞芽球を認識した。この２０メル（mer）配列を持つエピトープを最小化するために、９メルのペプチドがオーバーラップしたペプチドを合成し、２０メルのペプチドの中で、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭが最小エピトープであるころがわかった。この最小オーバーラップ配列を示すのに用いたＥＢＮＡ４からのオーバーラップペプチドを図３に示す。Ａ／ＢＥＢＶタイプの特異性、及びＨＬＡ制限は、標準的な実験計画を用いて決定され、エピトープがＨＬＡＢ３５を介して制限され、タイプＡ特異的であることが示された（Khanna等，1992）。既に述べたように、これらのオーバーラップしたペプチドは、Ｂ９５．８ウィルスのＥＢＶ配列に基づくものである。異なる地理的位置からのウィルスの場のアイソレートもこの配列を含むか否かを決定することは重要である。オーストラリア（ブリスバン）、パプアニューギニア（ゴロカ及びマダング）、及びケニヤの健常個体から誘導された自発的細胞系に存在するＥＢＶ配列のＰＣＲ配列を用いて、２つの変異型を決定した。Ｂ９５．８配列の２つの変異型は、ＴＶＬＬＨＥＥＳＭ及びＴＡＬＬＨＥＥＳＭであると決定された（表２）。実施例１１：サブユニットワクチン１１．１：ワクチン調製種々の疾患、特に、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が重要な防御機能を果たすようなウィルス性感染に抗する新規なワクチンの開発は、従来のワクチン製剤が防御ＣＴＬの誘発ができないために妨げられていた。ＣＴＬは、弱毒化したウィルスを用いて容易に誘発することができるが、弱毒化が困難な場合が多く、不適当及び／または信頼性に欠けるものであった。従来の殺傷したウィルスまたは組み換えタンパク質製剤は、通常は抗原表現細胞（ＡＰＣ）の細胞質への接近を促進せず、従って、クラスＩＭＨＣ上で適当にプロセシング及び表現されなかった。ＡＰＣの細胞質に対する抗原を誘導するために、様々なワクチン化手法が開発された（例えば、免疫剌激性複合体(immunostimulatory complex)［ＩＳＣＯＭ］、ＤＮＡ、フュージョゲニック・プロテオリソソーム(fusiogenic proteo lysosome)、ウィルス様粒子）。これらの試みは、標準化が困難な複雑な製剤化を含むことが多く、不安定な生成物及び／または特定の性質を持つ抗原にのみ作用するといった結果をもたらしていた。それに代わる手法としては、免疫源として合成ペプチドＣＤ８＋ＣＴＬエピトープを用いることである。この試みは、いくつかの一般的な利点を有する。ペプチドが安定なこと、良好に同定されていること、製造が容易なこと、製造に感染した材料を必要としないこと、及び、潜在的に病原性の組み替えタンパク質が排除できることである。通常はＣＤ４＋ヘルパーエピトープの存在下で、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）にて調製したＣＴＬエピトープは、多くの動物系においてＣＴＬｎ誘発に用いられてきた。残念なことに、ＩＦＡは毒性を有するため不適当であり、ヒトでの使用は認可されていない。Scalzo等（印刷中）は、ヒトへの使用が現在認可され、あるいは近く認可される数種のアジュバントについて、合成ペプチド免疫源で防御ＣＴＬを誘発することができるか否かを確認している。防御は、Ｂａｌｂ／ｃマウスのシトメガロウィルス（ＭＣＭＶ）もでるを用いて試験されたが、主要な防御反応が、即時型初期抗原１（ＩＥ−１）から誘導されたエピトープＹＰＨＦＭＰＴＮＬに抗して配向したＣＤ８＋ＣＴＬによって示された。活性ＣＴＬの存在は、インビトロのＣＴＬアッセイを用いて確認した。Scaizo，T. 等は、Montanide ISA 720/tetanus toxoid/peptidoという製剤のみが防御ＣＴＬを効果的に誘発することを発見した。当業者は、広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱しないで、上記の特別な実施態様で示した本発明に、種々の変形及び／または変更を加えることができるであろう。従って、これらの実施態様は、本発明の単なる例示に過ぎず、何ら制限するものではない。変異型配列の存在及び使用：表１に示したエピトープは、エプステイン-バーウィルスのＢ９５．８配列に基づいている。我々は、パプアニューギニア、オーストラリア、及びケニヤからのウィルスの場のアイソレートを試験し、これらを、２つのＣＴＬエピトープの部位に配列した。これらのエピトープは、ＡＶＬＬＨＥＥＣＭ及びＹＰＬＨＥＱＨＧＭである。結果を表１及び２に示したが、場のアイソレートにおけるこれらのエピトープの部位に変異型が存在することを示している。この段階で、これらの変異型配列がＣＴＬエピトープであることは知られていなかった。さらなる試験によって、これらが活性エピトープであることが示されれば、これらをペプチドベースのワクチンに含めることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガニゼーションオーストラリア国オーストラリアンキャピタルテリトリー 2601 キャンベルライムストンアヴェニュー（番地なし) (71)出願人ザユニバーシティオブメルボルンオーストラリア国ヴィクトリア 3052 パークヴィルロイヤルパレイド（番地なし) (71)出願人ザウォルターアンドエリザホールインスティテュートオブメディカルリサーチオーストラリア国ヴィクトリア 3052 パークヴィルロイヤルパレイドロイヤルメルボルンホスピタル（番地なし) (71)出願人バイオテックオーストラリアピーティワイ．リミテッドオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2069 ローズヴィルバークーストリート 28 (71)出願人シーエスエルリミテッドオーストラリア国ヴィクトリア 3052 パークヴィルポプラーロード 45 (72)発明者モス，デニスジェイムズオーストラリア国クィーンズランド 4054 アラナヒルズミッチェルストリート 29 (72)発明者バロウズ，スコットレントンオーストラリア国クィーンズランド 4036 ボールドヒルズスモンコート４ (72)発明者カーナ，ラジヴオーストラリア国クィーンズランド 4006 ハーストンアバリーロード 59 (72)発明者ケア，ビヴァリーメイヴィスオーストラリア国クィーンズランド 4152 キャリンデイルウォルマーコート５ (72)発明者バロウズ，ジャクリンマーガレットオーストラリア国クィーンズランド 4036 ボールドヒルズスモンコート４ (72)発明者スービエ，アンドレアスオーストラリア国クィーンズランド 4051 ニューマーケットマークストリート９

Claims

【特許請求の範囲】１．ＱＡＫＷＲＬＱＴＬ、ＲＹＳＩＦＦＤＹ、ＨＬＡＡＱＧＭＡＹ、ＹＰＬＨＥＱＨＧＭ、ＳＶＲＤＲＬＡＲＬ、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭ、ＶＳＦＩＥＦＶＧＷ、ＦＲＫＡＱＩＱＧＬ、ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ、ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ、ＰＧＤＱＬＰＧＦＳＤＧＲＡＣＰＶ、ＶＥＩＴＰＹＫＰＴＷ、及びそれらの変異型からなる群から選択されるエピトープであることを特徴とする細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。２．前記エピトープが、ＱＡＫＷＲＬＱＴＬであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。３．前記エピトープが、ＲＹＳＩＦＦＤＹであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。４．前記エピトープが、ＨＬＡＡＱＧＭＡＹであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。５．前記エピトープが、ＹＰＬＨＥＱＨＧＭであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。６．前記エピトープが、ＳＶＲＤＲＬＡＲＬであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。７．前記エピトープが、ＡＶＬＬＨＥＥＳＭであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。８．前記エピトープが、ＶＳＦＩＥＦＶＧＷであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。９．前記エピトープが、ＦＲＫＡＱＩＱＧＬであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１０．前記エピトープが、ＰＹＬＦＷＬＡＡＩであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１１．前記エピトープが、ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１２．前記エピトープが、ＰＧＤＱＬＰＧＦＳＤＧＲＡＣＰＶであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１３．前記エピトープが、ＶＥＩＴＰＹＫＰＴＷであることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１４．前記エピトープが、ＹＰＬＨＫＯＨＧＭ、ＹＲＬＨＥＱＨＧＭ、及びＹＰＬＨＥＱＲＧＭからなる群から選択されるＹＰＬＨＥＱＨＧＭの変異型であることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１５．前記エピトープが、ＴＶＬＬＨＥＥＳＭ及びＴＡＬＬＨＥＥＳＭからなる群から選択されるＡＶＬＬＨＥＥＳＭの変異型であることを特徴とする請求項１記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープ。１６．請求項１から１５のいずれかに記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープに、少なくとも１つの製薬的に許容されるアジュバント、キャリヤ、希釈剤、または賦型剤を混合してなることを特徴とする患者にＣＴＬを誘発させるための組成物。１７．請求項１から１５のいずれかに記載の細胞毒性エプステイン-バーウィルスＴ細胞エピトープに、少なくとも１つの製薬的に許容されるアジュバント、キャリヤ、希釈剤、または賦型剤を混合することからなることを特徴とする患者にＣＴＬを誘発させるための組成物の製法。