JPH10330396A - 変性タンパク質の再生方法 - Google Patents
変性タンパク質の再生方法Info
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- JPH10330396A JPH10330396A JP10147255A JP14725598A JPH10330396A JP H10330396 A JPH10330396 A JP H10330396A JP 10147255 A JP10147255 A JP 10147255A JP 14725598 A JP14725598 A JP 14725598A JP H10330396 A JPH10330396 A JP H10330396A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 変性されたタンパク質を再生可能にする方法
を提供すること 【解決手段】 変性タンパク質を、ビシナル炭素原子に
１つのヒドロキシル基及び少なくとも１個のフッ素原子
を有する再生剤で処理することを特徴とする変性タンパ
ク質の再生方法
を提供すること 【解決手段】 変性タンパク質を、ビシナル炭素原子に
１つのヒドロキシル基及び少なくとも１個のフッ素原子
を有する再生剤で処理することを特徴とする変性タンパ
ク質の再生方法
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、再生剤で処理する
ことによる変性タンパク質の再生方法に関する。
ことによる変性タンパク質の再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】構造、機能及び細胞の物質交換に関して
多様な作用を有する多様な種類の植物及び動物由来のタ
ンパク質は、様々な影響下で、その天然の空間的な折畳
み模様、いわゆる二次構造を失い、かつ変性する傾向が
ある。この変性は分子内の相互作用の、特に水素架橋の
崩壊、ひいてはα−ヘリックス構造の消失が含まれ、こ
のα−ヘリックス構造はほとんど全ての天然のタンパク
質が少なくとも分子の一部で有しており、かつ二次構造
の一部としてタンパク質の活性に著しく関与している。
多様な作用を有する多様な種類の植物及び動物由来のタ
ンパク質は、様々な影響下で、その天然の空間的な折畳
み模様、いわゆる二次構造を失い、かつ変性する傾向が
ある。この変性は分子内の相互作用の、特に水素架橋の
崩壊、ひいてはα−ヘリックス構造の消失が含まれ、こ
のα−ヘリックス構造はほとんど全ての天然のタンパク
質が少なくとも分子の一部で有しており、かつ二次構造
の一部としてタンパク質の活性に著しく関与している。
【０００３】変性を引き起こす影響のひとつは、タンパ
ク質に応じて１５０℃までになる温度への加熱である。
この種の他の影響は、３より下又は９より上のｐＨ値の
変化、変性する試薬の添加、たとえば尿素溶液、グアニ
ジン溶液又はアミド溶液の添加、発泡する溶液中への導
入、表面積の拡大、ＵＶ線又はＸ線の照射又は湿潤剤の
適用である。
ク質に応じて１５０℃までになる温度への加熱である。
この種の他の影響は、３より下又は９より上のｐＨ値の
変化、変性する試薬の添加、たとえば尿素溶液、グアニ
ジン溶液又はアミド溶液の添加、発泡する溶液中への導
入、表面積の拡大、ＵＶ線又はＸ線の照射又は湿潤剤の
適用である。
【０００４】工業において、タンパク質は故意ではない
が必然的に変性されるのは稀ではない、それというのも
その環境は他の理由から変性が行われる条件にさらされ
るためである。この例は、生体材料の蒸気滅菌であり、
その際、その材料上に固定されたタンパク質は変性され
る。他の例は、表面特性を改質するモノマーをグラフト
させる準備のための吸着又は不動態化したタンパク質を
有するポリマー表面のＵＶ照射である。さらに、有用な
タンパク質、たとえば血液タンパク質は意図せずに、た
とえばｐＨ値が結合及び表面の改質の際に危険な範囲に
陥ることにより変性されることがある。
が必然的に変性されるのは稀ではない、それというのも
その環境は他の理由から変性が行われる条件にさらされ
るためである。この例は、生体材料の蒸気滅菌であり、
その際、その材料上に固定されたタンパク質は変性され
る。他の例は、表面特性を改質するモノマーをグラフト
させる準備のための吸着又は不動態化したタンパク質を
有するポリマー表面のＵＶ照射である。さらに、有用な
タンパク質、たとえば血液タンパク質は意図せずに、た
とえばｐＨ値が結合及び表面の改質の際に危険な範囲に
陥ることにより変性されることがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、変性タンパク
質が再生可能である方法を提供することが望まれる。
質が再生可能である方法を提供することが望まれる。
【０００６】
【発明を解決するための手段】変性タンパク質を、ビシ
ナル関係にある炭素原子に１つのヒドロキシル基及び少
なくとも１個のフッ素原子を有する再生剤で処理した場
合、変性タンパク質を少なくとも部分的に再生すること
が見出された。
ナル関係にある炭素原子に１つのヒドロキシル基及び少
なくとも１個のフッ素原子を有する再生剤で処理した場
合、変性タンパク質を少なくとも部分的に再生すること
が見出された。
【０００７】図１及び図２は、天然の状態、変性された
状態及び本発明により再生された状態のヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）及びヒトフィブリノーゲン（ＨＦｂ）の
円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを表す。変性されたタ
ンパク質の曲線は、本来の天然のタンパク質の曲線と著
しく偏移するが、再生されたタンパク質の曲線は天然の
タンパク質の曲線と再び十分に対応している。
状態及び本発明により再生された状態のヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）及びヒトフィブリノーゲン（ＨＦｂ）の
円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを表す。変性されたタ
ンパク質の曲線は、本来の天然のタンパク質の曲線と著
しく偏移するが、再生されたタンパク質の曲線は天然の
タンパク質の曲線と再び十分に対応している。
【０００８】トリフルオロエタノールがタンパク質の二
次構造及び三次構造を保存し（F. D. Soennichsen et a
l., Biochemistry 1992, 31, 8790-8798; J. S. Albart
etal., Biochemistry 1995, 34, 984-990; A. Cammers
-Goodwin et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3082
-2890）及びさらに非特異的ヘリックス折畳みを誘導
し、その結果、他の支配的折畳み模様を有するタンパク
質が生じ、それにより変性される（A. J. Arunkumar et
al., Biochimica et Biophysica Acta 1997, 1338, 69
-79）ことは確かに公知である。しかしながら、意外に
も、変性されたタンパク質は前記の再生剤のひとつを用
いて処理した場合その天然の二次構造を再び形成し、そ
の結果、その生物学的機能を回復する。この場合、α−
ヘリックスは少なくとも部分的に回復する。どのような
メカニズムにより再生剤が言及した構造決定する分子内
の交互作用を再度もたらすのか、つまり水素架橋を新た
に結びつけるのかは判明していない。
次構造及び三次構造を保存し（F. D. Soennichsen et a
l., Biochemistry 1992, 31, 8790-8798; J. S. Albart
etal., Biochemistry 1995, 34, 984-990; A. Cammers
-Goodwin et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3082
-2890）及びさらに非特異的ヘリックス折畳みを誘導
し、その結果、他の支配的折畳み模様を有するタンパク
質が生じ、それにより変性される（A. J. Arunkumar et
al., Biochimica et Biophysica Acta 1997, 1338, 69
-79）ことは確かに公知である。しかしながら、意外に
も、変性されたタンパク質は前記の再生剤のひとつを用
いて処理した場合その天然の二次構造を再び形成し、そ
の結果、その生物学的機能を回復する。この場合、α−
ヘリックスは少なくとも部分的に回復する。どのような
メカニズムにより再生剤が言及した構造決定する分子内
の交互作用を再度もたらすのか、つまり水素架橋を新た
に結びつけるのかは判明していない。
【０００９】達成可能な再生の程度は、タンパク質によ
って異なる。有利な条件下で著しく十分な再生が達成さ
れる。
って異なる。有利な条件下で著しく十分な再生が達成さ
れる。
【００１０】本発明の範囲内で変性されたタンパク質と
は、（次に詳説する）ＣＤ分光分析により、α−ヘリッ
クス、β−折畳み（β−Faltblatt）及び他の特徴から
なるその本来の構造をもはや有していないようなタンパ
ク質である。本発明の方法により再生することができる
タンパク質には、たとえばアルブミン、フィブリノーゲ
ン、アポリポタンパク質、リゾチーム、スブチリシン、
リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、トリプシン、キモト
リプシン、チトクロームＣ、カルモジュリン、メリチ
ン、タンパク質Ｃ、グロブリン、ヒストン、プロラミ
ン、プロタミン、ケラチン及びコラーゲンが挙げられ
る。
は、（次に詳説する）ＣＤ分光分析により、α−ヘリッ
クス、β−折畳み（β−Faltblatt）及び他の特徴から
なるその本来の構造をもはや有していないようなタンパ
ク質である。本発明の方法により再生することができる
タンパク質には、たとえばアルブミン、フィブリノーゲ
ン、アポリポタンパク質、リゾチーム、スブチリシン、
リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、トリプシン、キモト
リプシン、チトクロームＣ、カルモジュリン、メリチ
ン、タンパク質Ｃ、グロブリン、ヒストン、プロラミ
ン、プロタミン、ケラチン及びコラーゲンが挙げられ
る。
【００１１】再生剤の中で、１個の炭素原子に３個のフ
ッ素原子を含有し、その炭素原子はヒドロキシル基を有
する炭素原子に隣接しているもの、つまりトリフルオロ
メチル基を有するものが最も効果的である。この再生剤
は前記の官能基を除いて炭化水素構造を有するか、又は
さらに使用目的に障害を与えない基又は原子を有する、
たとえばカルボンエステル基、エーテル架橋又はハロゲ
ン原子を有することができる。この再生は水性媒体中で
行うのが有利であるため、この再生剤は少なくともわず
かな程度で、たとえば２０℃で水中に１重量％まで水溶
性であるのが好ましい。場合により、この水溶性は（ビ
シナル炭素原子の前記のヒドロキシル基のほかに）付加
的親水基により高めることができる。この再生剤は、た
とえばさらにヒドロキシル基を含有することができる。
ッ素原子を含有し、その炭素原子はヒドロキシル基を有
する炭素原子に隣接しているもの、つまりトリフルオロ
メチル基を有するものが最も効果的である。この再生剤
は前記の官能基を除いて炭化水素構造を有するか、又は
さらに使用目的に障害を与えない基又は原子を有する、
たとえばカルボンエステル基、エーテル架橋又はハロゲ
ン原子を有することができる。この再生は水性媒体中で
行うのが有利であるため、この再生剤は少なくともわず
かな程度で、たとえば２０℃で水中に１重量％まで水溶
性であるのが好ましい。場合により、この水溶性は（ビ
シナル炭素原子の前記のヒドロキシル基のほかに）付加
的親水基により高めることができる。この再生剤は、た
とえばさらにヒドロキシル基を含有することができる。
【００１２】適当な再生剤の中で、次のものが挙げられ
る：モノフルオロエタノール、ジフルオロエタノール及
び特にトリフルオロエタノール；１−フルオロ−２−プ
ロパノール、１，１−ジフルオロ−２−プロパノール、
１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール、１，
１，１，３−テトラフルオロ−２−プロパノール、１−
トリフルオロメチル−１，１−ヘキサンジオール及びヘ
キサフルオロイソプロパノール。
る：モノフルオロエタノール、ジフルオロエタノール及
び特にトリフルオロエタノール；１−フルオロ−２−プ
ロパノール、１，１−ジフルオロ−２−プロパノール、
１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール、１，
１，１，３−テトラフルオロ−２−プロパノール、１−
トリフルオロメチル−１，１−ヘキサンジオール及びヘ
キサフルオロイソプロパノール。
【００１３】本発明による方法は、再生剤を水性媒体中
で、溶解した、懸濁した又は吸着した変性タンパク質
に、有利に０〜６０℃の温度で作用させる。再生剤の濃
度は、広い範囲内で変動することができる、たとえば変
性されたタンパク質及び再生剤を有する水性媒体からな
る再生混合物に対して０．５〜９５容量％である。この
再生は一般に５〜６０分必要である。再生についての示
唆は、円偏光二色性（ＣＤ）分光分析により得られ、そ
れによりキラル（又は光学活性）化合物の絶対配座を解
明し、配座の変化を追跡することができる。この場合、
一般に可視領域又はＵＶ領域での直線偏光を、たとえば
溶液中に存在する又は透明な媒体に吸着したキラル化合
物を通して照射する。入射した波長がキラル化合物の吸
光範囲内にある場合、電子的遷移が生じ、この遷移は当
初の直線偏光を楕円偏光にし、これは同じ振幅を有する
右偏光部分波及び左偏光部分波の遷移として解釈するこ
とができる。右円偏光もしくは左円偏光部分波について
のキラル化合物の吸光係数は必然的に同じではない。左
円偏光もしくは右円偏光部分波についてのモル吸光係数
のこの差異は円偏光二色性として表される。試料を通過
した後に、本来の部分波の吸収により残留した成分が重
なり合い、楕円偏光が生じる、それというのも、これは
一般にもはや同じ振幅を有していないためである。入射
光の波長を変えた場合、円偏光二色性を波長の関数とし
て示したスペクトルが得られる。
で、溶解した、懸濁した又は吸着した変性タンパク質
に、有利に０〜６０℃の温度で作用させる。再生剤の濃
度は、広い範囲内で変動することができる、たとえば変
性されたタンパク質及び再生剤を有する水性媒体からな
る再生混合物に対して０．５〜９５容量％である。この
再生は一般に５〜６０分必要である。再生についての示
唆は、円偏光二色性（ＣＤ）分光分析により得られ、そ
れによりキラル（又は光学活性）化合物の絶対配座を解
明し、配座の変化を追跡することができる。この場合、
一般に可視領域又はＵＶ領域での直線偏光を、たとえば
溶液中に存在する又は透明な媒体に吸着したキラル化合
物を通して照射する。入射した波長がキラル化合物の吸
光範囲内にある場合、電子的遷移が生じ、この遷移は当
初の直線偏光を楕円偏光にし、これは同じ振幅を有する
右偏光部分波及び左偏光部分波の遷移として解釈するこ
とができる。右円偏光もしくは左円偏光部分波について
のキラル化合物の吸光係数は必然的に同じではない。左
円偏光もしくは右円偏光部分波についてのモル吸光係数
のこの差異は円偏光二色性として表される。試料を通過
した後に、本来の部分波の吸収により残留した成分が重
なり合い、楕円偏光が生じる、それというのも、これは
一般にもはや同じ振幅を有していないためである。入射
光の波長を変えた場合、円偏光二色性を波長の関数とし
て示したスペクトルが得られる。
【００１４】同様に試料は順番に右もしくは左偏光を照
射することができ、その結果、差スペクトルが得られ、
キラル化合物の構造に関する、同様に絶対配座に関する
推測ができる。
射することができ、その結果、差スペクトルが得られ、
キラル化合物の構造に関する、同様に絶対配座に関する
推測ができる。
【００１５】ＣＤ分光器を用いて調査したキラル化合物
には多様なタンパク質（又はプロテイン）が所属する。
境界面でのタンパク質の配座変化もすでにＣＤ分光分析
により調査されていた（たとえば、Y. H. Chen et al.,
Biochemistry, Vol. 11, No. 22 (1972), 4120-4131;
C. R. MacMillin et al., Journal of Colloid and Int
erface Science 48, No. 2, (1974) 345-349; L. J. Sm
ith et al., Biochimica et Biophysica Acta. 1121 (1
992) 111-118; W. Norde et al., Journal ofColloid a
nd Interface Science, 112, No. 2, 447-456; W. Nord
e et al., Coloids and Surfaces 62 (1992), 87-93参
照）。
には多様なタンパク質（又はプロテイン）が所属する。
境界面でのタンパク質の配座変化もすでにＣＤ分光分析
により調査されていた（たとえば、Y. H. Chen et al.,
Biochemistry, Vol. 11, No. 22 (1972), 4120-4131;
C. R. MacMillin et al., Journal of Colloid and Int
erface Science 48, No. 2, (1974) 345-349; L. J. Sm
ith et al., Biochimica et Biophysica Acta. 1121 (1
992) 111-118; W. Norde et al., Journal ofColloid a
nd Interface Science, 112, No. 2, 447-456; W. Nord
e et al., Coloids and Surfaces 62 (1992), 87-93参
照）。
【００１６】タンパク質を溶解するか又は該当する波長
の光を透過する担体上に吸着させる場合、透過測定を実
施することができる。しかしながら、これは反射測定が
適している不透光性の担体上に吸着させた場合には不可
能である。しかしながら、このための前提条件は、十分
に強く反射する表面を有することであり、これは頻繁に
当てはまらない。反射測定による吸着したタンパク質
（及び他のキラル化合物）のＣＤスペクトルを獲得する
洗練された方法は、ドイツ国特許出願第１９７１７４３
１．０号明細書に記載されている。
の光を透過する担体上に吸着させる場合、透過測定を実
施することができる。しかしながら、これは反射測定が
適している不透光性の担体上に吸着させた場合には不可
能である。しかしながら、このための前提条件は、十分
に強く反射する表面を有することであり、これは頻繁に
当てはまらない。反射測定による吸着したタンパク質
（及び他のキラル化合物）のＣＤスペクトルを獲得する
洗練された方法は、ドイツ国特許出願第１９７１７４３
１．０号明細書に記載されている。
【００１７】再生の示唆のために損傷していない二次構
造を有する天然のタンパク質を溶解させるか又は担体上
に吸着させ、そのＣＤスペクトルを測定する。次いでこ
のタンパク質を、たとえば加熱により変性させ、この変
性されたタンパク質のＣＤスペクトルを測定し、これは
天然のタンパク質のＣＤスペクトルとは異なっている。
これに再生剤を添加する。ＣＤスペクトルの測定は、本
来の二次構造が回復された場合に変性の前に測定したス
ペクトルと一致する。
造を有する天然のタンパク質を溶解させるか又は担体上
に吸着させ、そのＣＤスペクトルを測定する。次いでこ
のタンパク質を、たとえば加熱により変性させ、この変
性されたタンパク質のＣＤスペクトルを測定し、これは
天然のタンパク質のＣＤスペクトルとは異なっている。
これに再生剤を添加する。ＣＤスペクトルの測定は、本
来の二次構造が回復された場合に変性の前に測定したス
ペクトルと一致する。
【００１８】タンパク質の再生及び再生の程度を検出す
るための方法は、いわゆるＥＬＩＳＡ試験法（Enzyme L
inked Immuno Sorbent Assay）である。この試験の基本
は、抗体の抗原との特異的反応であり、これは血液タン
パク質であることができる。このような抗原−抗体−結
合の特異性もしくは結合親和性は、この場合、大いに抗
原の構造に依存する。この関係において鍵−鍵穴原理と
いう。特定の抗体部位（鍵穴）の分子構造と抗原（鍵）
の特定の構造、たとえばドメインに適合している場合、
抗体と抗原との間に高い親和性が生じる。天然のタンパ
ク質に対して特異的に結合する部位が変性により破壊さ
れている場合、抗体の結合はもはや不可能である。タン
パク質の再生は、ＥＬＩＳＡ試験において前もって行わ
れない抗体との反応が検出可能になることにより証明さ
れる。
るための方法は、いわゆるＥＬＩＳＡ試験法（Enzyme L
inked Immuno Sorbent Assay）である。この試験の基本
は、抗体の抗原との特異的反応であり、これは血液タン
パク質であることができる。このような抗原−抗体−結
合の特異性もしくは結合親和性は、この場合、大いに抗
原の構造に依存する。この関係において鍵−鍵穴原理と
いう。特定の抗体部位（鍵穴）の分子構造と抗原（鍵）
の特定の構造、たとえばドメインに適合している場合、
抗体と抗原との間に高い親和性が生じる。天然のタンパ
ク質に対して特異的に結合する部位が変性により破壊さ
れている場合、抗体の結合はもはや不可能である。タン
パク質の再生は、ＥＬＩＳＡ試験において前もって行わ
れない抗体との反応が検出可能になることにより証明さ
れる。
【００１９】この証明の変法は、間接的ＥＬＩＳＡ試験
の実施である。この場合、最初の工程で抗原を固相に吸
着させる。第２の工程で第１の抗体を吸着した抗原と結
合させる。第３の工程でさらに、この場合に抗原として
機能する第１の抗体についての特異的結合個所を有する
いわゆる第２の抗体を添加する。この第２の抗体は酵素
と結合している。第４の工程において、抗原−抗体−複
合体を担体溶液と反応させる。結合した酵素と溶液中に
含まれる担体との反応により発色反応が開始され、この
反応の光学密度が結合した抗体の量に比例する。光学密
度の測定及びそれにより存在するタンパク質複合体の測
定は、分光光度計、いわゆる微量滴定板読取装置を用い
て行われる。このような検出に必要な相応する抗体は、
通常のタンパク質については市販されている。あらかじ
め起こらなかった発色反応が、本発明による再生剤を用
いて処理した後に発色反応が生じた場合に、第１の工程
で吸着された抗原の再生はが証明される。
の実施である。この場合、最初の工程で抗原を固相に吸
着させる。第２の工程で第１の抗体を吸着した抗原と結
合させる。第３の工程でさらに、この場合に抗原として
機能する第１の抗体についての特異的結合個所を有する
いわゆる第２の抗体を添加する。この第２の抗体は酵素
と結合している。第４の工程において、抗原−抗体−複
合体を担体溶液と反応させる。結合した酵素と溶液中に
含まれる担体との反応により発色反応が開始され、この
反応の光学密度が結合した抗体の量に比例する。光学密
度の測定及びそれにより存在するタンパク質複合体の測
定は、分光光度計、いわゆる微量滴定板読取装置を用い
て行われる。このような検出に必要な相応する抗体は、
通常のタンパク質については市販されている。あらかじ
め起こらなかった発色反応が、本発明による再生剤を用
いて処理した後に発色反応が生じた場合に、第１の工程
で吸着された抗原の再生はが証明される。
【００２０】
【実施例】本発明による方法を、次の実施例により詳説
するが、この実施例は本発明の適用範囲を制限するもの
ではない。
するが、この実施例は本発明の適用範囲を制限するもの
ではない。
【００２１】例１ ７．４のｐＨ値のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Fa. SI
GMA社）のリン酸塩緩衝液（Fa. SIGMA社）の１０-6Ｍ溶
液を製造し、天然のヒト血清アルブミンの図１に示した
ＣＤスペクトルが測定された。次にこの溶液を８５℃で
３０分間加熱し、それによりタンパク質を変性させた。
引き続き、溶液中の変性されたタンパク質のＣＤスペク
トルを記録し（同様に図１）、この曲線の経過は、天然
のタンパク質のスペクトルとは著しく異なっていた。次
いで、水性媒体中で２３容量％の濃度であるような量の
トリフルオロエタノールを添加した。１０分後更にＣＤ
スペクトルを記録し（同様に図１）、この曲線の経過
は、変性されたＨＳＡのスペクトルよりも著しく当初の
スペクトルに類似し、これは再生されたことを示す。
GMA社）のリン酸塩緩衝液（Fa. SIGMA社）の１０-6Ｍ溶
液を製造し、天然のヒト血清アルブミンの図１に示した
ＣＤスペクトルが測定された。次にこの溶液を８５℃で
３０分間加熱し、それによりタンパク質を変性させた。
引き続き、溶液中の変性されたタンパク質のＣＤスペク
トルを記録し（同様に図１）、この曲線の経過は、天然
のタンパク質のスペクトルとは著しく異なっていた。次
いで、水性媒体中で２３容量％の濃度であるような量の
トリフルオロエタノールを添加した。１０分後更にＣＤ
スペクトルを記録し（同様に図１）、この曲線の経過
は、変性されたＨＳＡのスペクトルよりも著しく当初の
スペクトルに類似し、これは再生されたことを示す。
【００２２】トリフルオロエタノールの添加によるアル
ブミンの生物学的機能の再生の確認は、ＥＬＩＳＡ試験
を用いて得られた。このため、メチル末端のシラン皮膜
（Fa. Aldrich社のオクチルトリクロロシラン）で被覆
した担体を使用した。このような３つの担体を、タンパ
ク質の吸着のために、７．４のｐＨ値を有し、かつ３０
μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するヒト血清アルブミ
ン（Fa. SIGMA社）のリン酸塩緩衝溶液（Fa. SIGMA社）
中に３０分間浸漬した。ＨＳＡ被覆された担体の２つを
タンパク質の変性のためにリン酸塩緩衝液中で８５℃で
３０分加熱した。この試料の１つを引き続きリン酸塩緩
衝液中のトリフルオロエタノールの２０％溶液を用いて
５分間後処理した。全ての３つの試料にＥＬＩＳＡ測定
を実施し、そのため多クローン性抗体を使用した。この
場合に得られた信号の強度を次の表に記載し、この場合
天然のタンパク質の信号に関して校正した。
ブミンの生物学的機能の再生の確認は、ＥＬＩＳＡ試験
を用いて得られた。このため、メチル末端のシラン皮膜
（Fa. Aldrich社のオクチルトリクロロシラン）で被覆
した担体を使用した。このような３つの担体を、タンパ
ク質の吸着のために、７．４のｐＨ値を有し、かつ３０
μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するヒト血清アルブミ
ン（Fa. SIGMA社）のリン酸塩緩衝溶液（Fa. SIGMA社）
中に３０分間浸漬した。ＨＳＡ被覆された担体の２つを
タンパク質の変性のためにリン酸塩緩衝液中で８５℃で
３０分加熱した。この試料の１つを引き続きリン酸塩緩
衝液中のトリフルオロエタノールの２０％溶液を用いて
５分間後処理した。全ての３つの試料にＥＬＩＳＡ測定
を実施し、そのため多クローン性抗体を使用した。この
場合に得られた信号の強度を次の表に記載し、この場合
天然のタンパク質の信号に関して校正した。
【００２３】担体の被覆 ＥＬＩＳＡ信号［％］ 吸着したアルブミン（天然） １００ 吸着したアルブミン（変性した） ７３ 吸着したアルブミン（変性し、 トリフルオロエタノールで処理した） ７７ 例２ ７．４のｐＨ値のヒトフィブリノーゲン（ＨＦｂ；Fa.
SIGMA社）のリン酸塩緩衝液（Fa. SIGMA社）の１０-6Ｍ
溶液を製造し、天然のＨＦｂの図２に示したＣＤスペク
トルが測定された。次にこの溶液を８５℃で３０分間加
熱し、それによりタンパク質を変性させた。引き続き、
溶液中の変性されたタンパク質のＣＤスペクトルを記録
し（同様に図２）、この曲線の経過は、天然のタンパク
質のスペクトルとは著しく異なっていた。次いで、水性
媒体中で６１容量％の濃度であるような量のトリフルオ
ロエタノールを添加した。１０分後更にＣＤスペクトル
を記録し（同様に図２）、この曲線の経過は、変性され
たＨＦｂのスペクトルよりも著しく当初のスペクトルに
類似し、これは再生されたことを示す。
SIGMA社）のリン酸塩緩衝液（Fa. SIGMA社）の１０-6Ｍ
溶液を製造し、天然のＨＦｂの図２に示したＣＤスペク
トルが測定された。次にこの溶液を８５℃で３０分間加
熱し、それによりタンパク質を変性させた。引き続き、
溶液中の変性されたタンパク質のＣＤスペクトルを記録
し（同様に図２）、この曲線の経過は、天然のタンパク
質のスペクトルとは著しく異なっていた。次いで、水性
媒体中で６１容量％の濃度であるような量のトリフルオ
ロエタノールを添加した。１０分後更にＣＤスペクトル
を記録し（同様に図２）、この曲線の経過は、変性され
たＨＦｂのスペクトルよりも著しく当初のスペクトルに
類似し、これは再生されたことを示す。
【００２４】トリフルオロエタノールの添加によるフィ
ブリノーゲンの生物学的機能の再生の確認は、ＥＬＩＳ
Ａ試験を用いて得られた。このため、メチル末端のシラ
ン皮膜（Fa. Aldrich社のオクチルトリクロロシラン）
で被覆した担体を使用した。このような３つの担体を、
タンパク質の吸着のために、７．４のｐＨ値を有し、か
つ３０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するヒトフィブ
リノーゲン（Fa. SIGMA社）のリン酸塩緩衝溶液（Fa. S
IGMA社）中に３０分間浸漬した。ＨＦｂ被覆された担体
の２つをタンパク質の変性のためにリン酸塩緩衝液中で
８５℃で３０分加熱した。この試料の１つを引き続きリ
ン酸塩緩衝液中でトリフルオロエタノールの６１％溶液
を用いて５分間後処理した。全ての試料にＥＬＩＳＡ測
定を実施し、そのため多クローン性抗体を使用した。こ
の場合に得られた信号の強度を次の表に記載し、この場
合天然のタンパク質の信号に関して校正した。担体の被覆 ＥＬＩＳＡ信号［％］ 吸着したフィブリノーゲン（天然） １００ 吸着したフィブリノーゲン（変性した） ６４．４ 吸着したフィブリノーゲン（変性し、 トリフルオロエタノールで処理した） ７９．２
ブリノーゲンの生物学的機能の再生の確認は、ＥＬＩＳ
Ａ試験を用いて得られた。このため、メチル末端のシラ
ン皮膜（Fa. Aldrich社のオクチルトリクロロシラン）
で被覆した担体を使用した。このような３つの担体を、
タンパク質の吸着のために、７．４のｐＨ値を有し、か
つ３０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するヒトフィブ
リノーゲン（Fa. SIGMA社）のリン酸塩緩衝溶液（Fa. S
IGMA社）中に３０分間浸漬した。ＨＦｂ被覆された担体
の２つをタンパク質の変性のためにリン酸塩緩衝液中で
８５℃で３０分加熱した。この試料の１つを引き続きリ
ン酸塩緩衝液中でトリフルオロエタノールの６１％溶液
を用いて５分間後処理した。全ての試料にＥＬＩＳＡ測
定を実施し、そのため多クローン性抗体を使用した。こ
の場合に得られた信号の強度を次の表に記載し、この場
合天然のタンパク質の信号に関して校正した。担体の被覆 ＥＬＩＳＡ信号［％］ 吸着したフィブリノーゲン（天然） １００ 吸着したフィブリノーゲン（変性した） ６４．４ 吸着したフィブリノーゲン（変性し、 トリフルオロエタノールで処理した） ７９．２
【図１】ヒト血清アルブミンのＣＤスペクトルをグラフ
で示す図。
で示す図。
【図２】ヒトフィブリノーゲンのＣＤスペクトルをグラ
フで示す図。
フで示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フーベルト モッチュマン ドイツ連邦共和国 ベルリン ニーメッツ シュトラーセ 13 (72)発明者 マルティーナ ブレー ドイツ連邦共和国 ベルリン パウルスボ ルナー シュトラーセ 91 (72)発明者 エウリディス ヴィエイラ ポルトガル国 ギマラーエス ルーア ラ ウル ブランダオ 170 (72)発明者 アレクサンダー ヴェレ ドイツ連邦共和国 ラーデンブルク フリ ートリヒ エーベルト シュトラーセ 12
Claims (5)
- 【請求項１】 変性タンパク質を、ビシナル関係にある
炭素原子に１つのヒドロキシル基及び少なくとも１個の
フッ素原子を有する再生剤で処理することを特徴とする
変性タンパク質の再生方法。 - 【請求項２】 再生剤がトリフルオロメチル基を有す
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 再生剤がトリフルオロエタノールであ
る、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 再生を水性媒体中で０〜６０℃の温度で
実施する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項５】 再生混合物中での再生剤の濃度が１〜９
５容量％である、請求項１から４までのいずれか１項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722950A DE19722950A1 (de) | 1997-05-31 | 1997-05-31 | Renaturierung von Eiweißstoffen |
| DE19722950.6 | 1997-05-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10330396A true JPH10330396A (ja) | 1998-12-15 |
Family
ID=7831108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10147255A Pending JPH10330396A (ja) | 1997-05-31 | 1998-05-28 | 変性タンパク質の再生方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6022722A (ja) |
| EP (1) | EP0884323A1 (ja) |
| JP (1) | JPH10330396A (ja) |
| CA (1) | CA2239131A1 (ja) |
| DE (1) | DE19722950A1 (ja) |
| NO (1) | NO982487L (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2696438C (en) | 2007-08-16 | 2015-12-08 | The University Of Chicago | The use of azelaic acid for priming a plant to induce a resistance response against a pathogen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3064888D1 (en) * | 1979-04-30 | 1983-10-27 | Hoechst Ag | Aqueous solutions of proteins stable against denaturization, process for their manufacture, and their utilization |
| DE19717431C2 (de) * | 1997-04-25 | 1999-05-20 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Circulardichroismusspektroskopie von chiralen Verbindungen auf festen Trägern |
-
1997
- 1997-05-31 DE DE19722950A patent/DE19722950A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-05-12 EP EP98108564A patent/EP0884323A1/de not_active Withdrawn
- 1998-05-28 JP JP10147255A patent/JPH10330396A/ja active Pending
- 1998-05-29 CA CA002239131A patent/CA2239131A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-29 NO NO982487A patent/NO982487L/no not_active Application Discontinuation
- 1998-06-01 US US09/088,058 patent/US6022722A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2239131A1 (en) | 1998-11-30 |
| NO982487L (no) | 1998-12-01 |
| NO982487D0 (no) | 1998-05-29 |
| EP0884323A1 (de) | 1998-12-16 |
| US6022722A (en) | 2000-02-08 |
| DE19722950A1 (de) | 1998-12-03 |
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