JPH10201500A - 環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法 - Google Patents
環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法Info
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- JPH10201500A JPH10201500A JP927397A JP927397A JPH10201500A JP H10201500 A JPH10201500 A JP H10201500A JP 927397 A JP927397 A JP 927397A JP 927397 A JP927397 A JP 927397A JP H10201500 A JPH10201500 A JP H10201500A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 無機塩または有機塩を含む弱酸性の水溶
液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗浄工程
と、粉乳の水溶液で洗浄する第二の洗浄工程と、溶菌工
程とを含む環境中の酵母または放線菌からのＤＮＡの直
接抽出法により直接抽出したＤＮＡを鋳型とし、酵母の
16Ｓ様rRNAまたは放線菌の16Ｓ様rRNA中に存在する保存
性の高い配列をコードする塩基配列をプライマーとして
ＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標として
環境中の酵母または放線菌を検出する、酵母または放線
菌の検出方法を提供する。 【効果】 環境中の酵母または放線菌のＤＮＡを直接抽
出することによって、高感度で簡便かつ迅速に、環境中
の酵母または放線菌を検出することができる。
液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗浄工程
と、粉乳の水溶液で洗浄する第二の洗浄工程と、溶菌工
程とを含む環境中の酵母または放線菌からのＤＮＡの直
接抽出法により直接抽出したＤＮＡを鋳型とし、酵母の
16Ｓ様rRNAまたは放線菌の16Ｓ様rRNA中に存在する保存
性の高い配列をコードする塩基配列をプライマーとして
ＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標として
環境中の酵母または放線菌を検出する、酵母または放線
菌の検出方法を提供する。 【効果】 環境中の酵母または放線菌のＤＮＡを直接抽
出することによって、高感度で簡便かつ迅速に、環境中
の酵母または放線菌を検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、自然ならびに人間
環境中での酵母または放線菌の検出方法に関する。
環境中での酵母または放線菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、自然または人間の環境中に棲息す
る酵母や放線菌などの検出方法として、このような環境
から得た試料を、液体培地または寒天培地で培養し、単
離した後に、顕微鏡による試験や各種生化学試験が行わ
れてきた。
る酵母や放線菌などの検出方法として、このような環境
から得た試料を、液体培地または寒天培地で培養し、単
離した後に、顕微鏡による試験や各種生化学試験が行わ
れてきた。
【０００３】近年では、こうした検出方法として、短期
間で結果が得られ、かつ遺伝子レベルでの検出が可能な
ＰＣＲ法や遺伝子プローブ法が用いられてきた。酵母や
放線菌などを検出、モニタリングするために使用する試
料は様々な環境から採集されるが、ＰＣＲ法や遺伝子プ
ローブ法で上記酵母や放線菌を検出するためには、これ
らの中からＤＮＡを抽出することが必須である。
間で結果が得られ、かつ遺伝子レベルでの検出が可能な
ＰＣＲ法や遺伝子プローブ法が用いられてきた。酵母や
放線菌などを検出、モニタリングするために使用する試
料は様々な環境から採集されるが、ＰＣＲ法や遺伝子プ
ローブ法で上記酵母や放線菌を検出するためには、これ
らの中からＤＮＡを抽出することが必須である。
【０００４】こうしたＤＮＡの抽出、特に、環境中の微
生物をモニタリングするために行われるＤＮＡの抽出に
は、試料中に棲息する微生物を培養せず、直接環境中の
微生物からＤＮＡを抽出する直接抽出法と、一度環境中
の微生物を培養してその後にＤＮＡを抽出する間接抽出
法とがある。直接抽出法は、間接抽出法に比べて一度微
生物を培養する必要がないため、操作が簡便であるとい
う利点がある。
生物をモニタリングするために行われるＤＮＡの抽出に
は、試料中に棲息する微生物を培養せず、直接環境中の
微生物からＤＮＡを抽出する直接抽出法と、一度環境中
の微生物を培養してその後にＤＮＡを抽出する間接抽出
法とがある。直接抽出法は、間接抽出法に比べて一度微
生物を培養する必要がないため、操作が簡便であるとい
う利点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
直接環境中の微生物からＤＮＡを抽出する方法において
は、対象である環境中に様々な有機物や無機物が含まれ
ているため、通常微生物を培養した後に行われるのと同
様なＤＮＡ抽出操作を行っても、ＤＮＡがうまく抽出さ
れないか、または抽出はされても十分に回収がされない
ため、ＤＮＡの回収率に再現性がないといった問題点が
あった。
直接環境中の微生物からＤＮＡを抽出する方法において
は、対象である環境中に様々な有機物や無機物が含まれ
ているため、通常微生物を培養した後に行われるのと同
様なＤＮＡ抽出操作を行っても、ＤＮＡがうまく抽出さ
れないか、または抽出はされても十分に回収がされない
ため、ＤＮＡの回収率に再現性がないといった問題点が
あった。
【０００６】一方、一度環境中の微生物を培養してその
後にＤＮＡを抽出する方法においては、液体培養された
微生物をリゾチームやラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で溶菌し、フェノール処理を行った後にエタノール
沈殿処理してＤＮＡが分離される。このような方法で
は、液体培地中で増殖した微生物から回収されるＤＮＡ
の純度や回収率は良いが、培養に使用する培地によって
増殖する微生物が限定され、かつ培養可能な微生物のみ
が検出されるにすぎないため、ＰＣＲから得られた結果
に対する信頼性の点で問題があった。
後にＤＮＡを抽出する方法においては、液体培養された
微生物をリゾチームやラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で溶菌し、フェノール処理を行った後にエタノール
沈殿処理してＤＮＡが分離される。このような方法で
は、液体培地中で増殖した微生物から回収されるＤＮＡ
の純度や回収率は良いが、培養に使用する培地によって
増殖する微生物が限定され、かつ培養可能な微生物のみ
が検出されるにすぎないため、ＰＣＲから得られた結果
に対する信頼性の点で問題があった。
【０００７】したがって、ＰＣＲによる検出結果の信頼
性を考慮に入れると、環境中に棲息する微生物から直接
にＤＮＡを抽出する直接抽出法が望ましいが、このよう
な方法で純度の高いＤＮＡを回収率良く抽出する方法
は、これまでのところ報告されていない。
性を考慮に入れると、環境中に棲息する微生物から直接
にＤＮＡを抽出する直接抽出法が望ましいが、このよう
な方法で純度の高いＤＮＡを回収率良く抽出する方法
は、これまでのところ報告されていない。
【０００８】本発明は、従来知られている方法よりも優
れたＤＮＡの抽出方法で環境中の微生物からのＤＮＡを
抽出し、ここで抽出されたＤＮＡを鋳型として、放線菌
または酵母を特異的に検出するためのプライマーを用い
て、環境中の酵母または放線菌を検出する方法を提供す
ることを目的とする。
れたＤＮＡの抽出方法で環境中の微生物からのＤＮＡを
抽出し、ここで抽出されたＤＮＡを鋳型として、放線菌
または酵母を特異的に検出するためのプライマーを用い
て、環境中の酵母または放線菌を検出する方法を提供す
ることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、環
境試料を洗浄処理して環境中の微生物から直接抽出した
ＤＮＡと、後述する塩基配列を有するプライマーとを用
いて、環境中の酵母、放線菌を検出できることを見出
し、本発明を完成した。
境試料を洗浄処理して環境中の微生物から直接抽出した
ＤＮＡと、後述する塩基配列を有するプライマーとを用
いて、環境中の酵母、放線菌を検出できることを見出
し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、無機塩または有機塩を
含む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄す
る第一の洗浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第
二の洗浄工程とを含むＤＮＡの直接抽出法によって環境
中の微生物からＤＮＡを抽出して鋳型とし、一方が配列
表の配列番号１に記載の塩基配列である5'-GCAAYAACAGG
TCTGTGATGC-3' （塩基配列１）、他方が配列表の配列番
号２に記載の塩基配列である5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-
3' （塩基配列２）で表される塩基配列をプライマーと
してＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標と
して酵母を検出することを特徴とする環境中の酵母の検
出方法である。
含む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄す
る第一の洗浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第
二の洗浄工程とを含むＤＮＡの直接抽出法によって環境
中の微生物からＤＮＡを抽出して鋳型とし、一方が配列
表の配列番号１に記載の塩基配列である5'-GCAAYAACAGG
TCTGTGATGC-3' （塩基配列１）、他方が配列表の配列番
号２に記載の塩基配列である5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-
3' （塩基配列２）で表される塩基配列をプライマーと
してＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標と
して酵母を検出することを特徴とする環境中の酵母の検
出方法である。
【００１１】ここで、塩基配列１中ＹはＣまたはＴを表
し、塩基配列２中ＲはＡまたはＧを表す（図１）。ここ
で、上記のように増幅されたＤＮＡを鋳型とし、配列表
の配列番号３に記載の塩基配列３である5'-CGAGGAATTCC
TAGTAAGCGC-3' （塩基配列３）で表される塩基配列（図
２）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行う
と、環境中の酵母が高感度に検出される。
し、塩基配列２中ＲはＡまたはＧを表す（図１）。ここ
で、上記のように増幅されたＤＮＡを鋳型とし、配列表
の配列番号３に記載の塩基配列３である5'-CGAGGAATTCC
TAGTAAGCGC-3' （塩基配列３）で表される塩基配列（図
２）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行う
と、環境中の酵母が高感度に検出される。
【００１２】また、本発明は、無機塩または有機塩を含
む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄する
第一の洗浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二
の洗浄工程とを含むＤＮＡの直接抽出法によって環境中
の微生物からＤＮＡを抽出して鋳型とし、一方が配列表
の配列番号４に記載の塩基配列である5'-GCGCASATATCAG
GARGAAC-3'（塩基配列４）、他方が配列表の配列番号５
に記載の塩基配列である5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'
（塩基配列５）で表される塩基配列をプライマーとして
ＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標として
放線菌を検出することを特徴とする環境中の放線菌の検
出方法である。
む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄する
第一の洗浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二
の洗浄工程とを含むＤＮＡの直接抽出法によって環境中
の微生物からＤＮＡを抽出して鋳型とし、一方が配列表
の配列番号４に記載の塩基配列である5'-GCGCASATATCAG
GARGAAC-3'（塩基配列４）、他方が配列表の配列番号５
に記載の塩基配列である5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'
（塩基配列５）で表される塩基配列をプライマーとして
ＰＣＲを行い、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標として
放線菌を検出することを特徴とする環境中の放線菌の検
出方法である。
【００１３】ここで、塩基配列４中ＳはＧまたはＣを表
し、ＲはＡまたはＧを表す。塩基配列５中、ＲはＡまた
はＧを表す（図３）。ここで、上記のように増幅された
ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号６に記載の塩基配
列である5'-CTCGTGTCGTGAGATGTTGG-3'（塩基配列６）で
表される塩基配列（図４）をプローブとしてハイブリダ
イゼーションを行うと、放線菌が高感度に検出される。
し、ＲはＡまたはＧを表す。塩基配列５中、ＲはＡまた
はＧを表す（図３）。ここで、上記のように増幅された
ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号６に記載の塩基配
列である5'-CTCGTGTCGTGAGATGTTGG-3'（塩基配列６）で
表される塩基配列（図４）をプローブとしてハイブリダ
イゼーションを行うと、放線菌が高感度に検出される。
【００１４】上述した無機塩または有機塩を含む弱酸性
の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗
浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二の洗浄工
程とを含むＤＮＡの直接抽出法において、上記第一の洗
浄工程において用いられる無機塩としては、例えば、硝
酸ナトリウム、塩化アンモニウムなどを挙げることがで
き、有機塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸
カリウム、酢酸ナトリウムなどを挙げることができる。
の水溶液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗
浄工程と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二の洗浄工
程とを含むＤＮＡの直接抽出法において、上記第一の洗
浄工程において用いられる無機塩としては、例えば、硝
酸ナトリウム、塩化アンモニウムなどを挙げることがで
き、有機塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸
カリウム、酢酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【００１５】これらの塩は、水溶液としたときに弱酸性
となるように、塩酸または水酸化ナトリウムなどを用い
てｐＨを弱酸性に調整するとよい。ここで、弱酸性と
は、ｐＨ6.5 以上7.0 未満の範囲をいい、より好ましく
はｐＨ6.7 〜6.9 であり、さらに好ましくはｐＨ6.8 付
近である。また、上記弱酸性の水溶液中の無機または有
機塩の濃度は、0.05Ｍ〜５Ｍであることが好ましい。
となるように、塩酸または水酸化ナトリウムなどを用い
てｐＨを弱酸性に調整するとよい。ここで、弱酸性と
は、ｐＨ6.5 以上7.0 未満の範囲をいい、より好ましく
はｐＨ6.7 〜6.9 であり、さらに好ましくはｐＨ6.8 付
近である。また、上記弱酸性の水溶液中の無機または有
機塩の濃度は、0.05Ｍ〜５Ｍであることが好ましい。
【００１６】上記の尿素水溶液中の尿素濃度は、0.5 〜
２％であることが好ましく、より好ましくは、0.5 〜1.
5 ％である。さらに、上記第二の洗浄工程における粉乳
としては、スキムミルクまたは育児用粉ミルクなどを挙
げることができる。
２％であることが好ましく、より好ましくは、0.5 〜1.
5 ％である。さらに、上記第二の洗浄工程における粉乳
としては、スキムミルクまたは育児用粉ミルクなどを挙
げることができる。
【００１７】また、上記のＤＮＡの直接抽出方法は、上
記第一および第二の洗浄工程に加えて、環境中の微生物
を溶菌させる溶菌工程と、タンパク質を変性し除去する
変性除去工程と、ＤＮＡを沈殿させる沈殿工程とをさら
に含むものである。
記第一および第二の洗浄工程に加えて、環境中の微生物
を溶菌させる溶菌工程と、タンパク質を変性し除去する
変性除去工程と、ＤＮＡを沈殿させる沈殿工程とをさら
に含むものである。
【００１８】ここで、上記環境中の微生物を溶菌させる
溶菌工程は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）を用いて行われるものであり、上記タンパク質を変
性し除去する変性除去工程は、例えば、フェノールを用
いて行われるものであり、そして前記ＤＮＡを沈殿させ
る沈殿工程がエタノールを用いて行われるものである。
溶菌工程は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）を用いて行われるものであり、上記タンパク質を変
性し除去する変性除去工程は、例えば、フェノールを用
いて行われるものであり、そして前記ＤＮＡを沈殿させ
る沈殿工程がエタノールを用いて行われるものである。
【００１９】本発明においては、上述した方法により環
境中の微生物からＤＮＡを直接抽出して鋳型とし、一方
が5'-GCAAYAACAGGTCTGTGATGC-3' （塩基配列１）、他方
が5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-3' （塩基配列２）で表され
る塩基配列を有するＤＮＡ（図１）をプライマーとして
ＰＣＲを行うと、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標とし
て環境中の酵母が検出される。または、プライマーとし
て、一方が5'-GCGCASATATCAGGARGAAC-3'（塩基配列
４）、他方が5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'（塩基配列
５）で表される塩基配列を有するＤＮＡ（図３）をプラ
イマーとしてＰＣＲを行うと、ここで増幅されたＤＮＡ
量を指標として環境中の放線菌が検出される。
境中の微生物からＤＮＡを直接抽出して鋳型とし、一方
が5'-GCAAYAACAGGTCTGTGATGC-3' （塩基配列１）、他方
が5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-3' （塩基配列２）で表され
る塩基配列を有するＤＮＡ（図１）をプライマーとして
ＰＣＲを行うと、ここで増幅されたＤＮＡ量を指標とし
て環境中の酵母が検出される。または、プライマーとし
て、一方が5'-GCGCASATATCAGGARGAAC-3'（塩基配列
４）、他方が5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'（塩基配列
５）で表される塩基配列を有するＤＮＡ（図３）をプラ
イマーとしてＰＣＲを行うと、ここで増幅されたＤＮＡ
量を指標として環境中の放線菌が検出される。
【００２０】また、上記塩基配列１と２との間に存在す
る塩基配列の一部に対応する5'-CGAGGAATTCCTAGTAAGCGC
-3' （塩基配列３）で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（図２）をプローブとして、上述のように増幅されたＤ
ＮＡ断片と通常の条件でハイブリダイゼーションを行う
と、高感度で短時間のうちに酵母を検出することができ
る。上記の塩基配列３に代えて5'-CTCGTGTCGTGAGATGTTG
G-3'（塩基配列６、図４）を用いると、放線菌を同様に
検出することができる。
る塩基配列の一部に対応する5'-CGAGGAATTCCTAGTAAGCGC
-3' （塩基配列３）で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（図２）をプローブとして、上述のように増幅されたＤ
ＮＡ断片と通常の条件でハイブリダイゼーションを行う
と、高感度で短時間のうちに酵母を検出することができ
る。上記の塩基配列３に代えて5'-CTCGTGTCGTGAGATGTTG
G-3'（塩基配列６、図４）を用いると、放線菌を同様に
検出することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明において、環境とは、微生物が棲息する自然
環境または人間の環境をいう。したがって、本発明で使
用する試料としては、通常の土壌の他、陸水・ 海水等に
含まれる土壌粒子、さらに陸水、海水などを使用するこ
とができる。
る。本発明において、環境とは、微生物が棲息する自然
環境または人間の環境をいう。したがって、本発明で使
用する試料としては、通常の土壌の他、陸水・ 海水等に
含まれる土壌粒子、さらに陸水、海水などを使用するこ
とができる。
【００２２】また、本発明においては、石油等の化学物
質で汚染されていない非汚染土壌ばかりでなく、これら
化学物質で汚染された土壌をサンプルとして使用するこ
ともできる。こうした汚染土壌をサンプルとして用いる
と、化学物質で汚染された土壌中に存在する種々の突然
変異菌を検出することができる。
質で汚染されていない非汚染土壌ばかりでなく、これら
化学物質で汚染された土壌をサンプルとして使用するこ
ともできる。こうした汚染土壌をサンプルとして用いる
と、化学物質で汚染された土壌中に存在する種々の突然
変異菌を検出することができる。
【００２３】また、本発明においては、上記の土壌サン
プルの他、活性汚泥、ヘドロその他の各種の環境から採
取したサンプル、種々の動物の糞などもサンプルとして
使用することができ、陸水、海水などの液体をもサンプ
ルとして使用することができる。ここで陸水とは、地球
上に分布する水のうち、海水を除いたものの総称であ
り、湖沼、河川、地下水、温泉、雪氷などを含む。
プルの他、活性汚泥、ヘドロその他の各種の環境から採
取したサンプル、種々の動物の糞などもサンプルとして
使用することができ、陸水、海水などの液体をもサンプ
ルとして使用することができる。ここで陸水とは、地球
上に分布する水のうち、海水を除いたものの総称であ
り、湖沼、河川、地下水、温泉、雪氷などを含む。
【００２４】以下に、各種土壌をサンプルとして使用す
る場合を例に挙げて説明する。土壌サンプルには、フミ
ン物質が多量に存在しているため、以下のように処理を
行う。ここで、フミン物質とは、土壌または石灰質中の
褐色〜黒色の無定形有機物であり、フミン酸とともに土
壌中の有機質および石灰質の大部分を形成している物質
をいう。この物質は土壌中の微生物から直接にＤＮＡの
抽出を行う際にＤＮＡの抽出効率を低下させるため、除
去することが必要である。
る場合を例に挙げて説明する。土壌サンプルには、フミ
ン物質が多量に存在しているため、以下のように処理を
行う。ここで、フミン物質とは、土壌または石灰質中の
褐色〜黒色の無定形有機物であり、フミン酸とともに土
壌中の有機質および石灰質の大部分を形成している物質
をいう。この物質は土壌中の微生物から直接にＤＮＡの
抽出を行う際にＤＮＡの抽出効率を低下させるため、除
去することが必要である。
【００２５】フミン物質の除去は、無機塩または有機塩
を含む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液を土壌サンプ
ルに添加して洗浄する第一の洗浄工程において行われ
る。土壌サンプルの洗浄に使用する上記弱酸性の水溶液
に含まれる塩としては、無機塩としては硝酸ナトリウ
ム、塩化アンモニウムなどを挙げることができ、有機塩
としては酢酸アンモニウム、酢酸カリウムおよび酢酸ナ
トリウムなどを挙げることができる。酢酸アンモニウム
溶液を使用することが、土壌中の微生物からＤＮＡを検
出する感度が高くなるために最も好ましい。
を含む弱酸性の水溶液、または尿素水溶液を土壌サンプ
ルに添加して洗浄する第一の洗浄工程において行われ
る。土壌サンプルの洗浄に使用する上記弱酸性の水溶液
に含まれる塩としては、無機塩としては硝酸ナトリウ
ム、塩化アンモニウムなどを挙げることができ、有機塩
としては酢酸アンモニウム、酢酸カリウムおよび酢酸ナ
トリウムなどを挙げることができる。酢酸アンモニウム
溶液を使用することが、土壌中の微生物からＤＮＡを検
出する感度が高くなるために最も好ましい。
【００２６】上記弱酸性の水溶液のｐＨは6.5 以上7.0
未満であることが好ましく、より好ましくはｐＨ6.7 〜
6.9 、さらに好ましくは6.8 付近である。上記の無機塩
または有機塩を水に溶解させたときに水溶液が弱酸性に
ならない場合は、適当な濃度の塩酸または水酸化ナトリ
ウムなどを用いてｐＨを弱酸性に調整するとよい。
未満であることが好ましく、より好ましくはｐＨ6.7 〜
6.9 、さらに好ましくは6.8 付近である。上記の無機塩
または有機塩を水に溶解させたときに水溶液が弱酸性に
ならない場合は、適当な濃度の塩酸または水酸化ナトリ
ウムなどを用いてｐＨを弱酸性に調整するとよい。
【００２７】上記弱酸性の水溶液中の化合物の濃度は、
0.05〜５Ｍであることが好ましく、0.05〜１Ｍであるこ
とがさらに好ましい。0.5 Ｍの酢酸アンモニウム水溶液
を用いると、土壌中の微生物のＤＮＡの検出感度が最も
高くなる。尿素水溶液を用いる場合には、尿素濃度を0.
5 〜２％とすることが好ましく、１％前後の濃度とする
ことがさらに好ましい。
0.05〜５Ｍであることが好ましく、0.05〜１Ｍであるこ
とがさらに好ましい。0.5 Ｍの酢酸アンモニウム水溶液
を用いると、土壌中の微生物のＤＮＡの検出感度が最も
高くなる。尿素水溶液を用いる場合には、尿素濃度を0.
5 〜２％とすることが好ましく、１％前後の濃度とする
ことがさらに好ましい。
【００２８】上記弱酸性の水溶液または尿素水溶液の添
加量は、土壌サンプル100mg に対して、200 〜500 μL
であることが好ましい。添加量が200 μL 未満では土壌
サンプルの洗浄が不十分になる。また、500 μL を越え
ると１回に処理する容量が大きくなるため操作上不便に
なり、さらに土壌中の微生物からのＤＮＡの回収率も低
下する。300 μL の酢酸アンモニウム水溶液を添加して
洗浄すると、土壌中の微生物のＤＮＡの検出感度が最も
高くなる。
加量は、土壌サンプル100mg に対して、200 〜500 μL
であることが好ましい。添加量が200 μL 未満では土壌
サンプルの洗浄が不十分になる。また、500 μL を越え
ると１回に処理する容量が大きくなるため操作上不便に
なり、さらに土壌中の微生物からのＤＮＡの回収率も低
下する。300 μL の酢酸アンモニウム水溶液を添加して
洗浄すると、土壌中の微生物のＤＮＡの検出感度が最も
高くなる。
【００２９】土壌サンプルは、上記第一の洗浄工程にお
いて、上記の量の弱酸性の水溶液または尿素水溶液を添
加した後、室温でボルテクスミキサーにより激しく混合
して洗浄する。ボルテクスミキサーによる混合は、通常
３〜10分程度、好ましくは10分程度行う。混合時間が３
分以下のようにあまりに短いとフミン物質を十分に除去
することができず、逆に10分以上にわたって混合しても
フミン物質をそれ以上除去することができないためであ
る。
いて、上記の量の弱酸性の水溶液または尿素水溶液を添
加した後、室温でボルテクスミキサーにより激しく混合
して洗浄する。ボルテクスミキサーによる混合は、通常
３〜10分程度、好ましくは10分程度行う。混合時間が３
分以下のようにあまりに短いとフミン物質を十分に除去
することができず、逆に10分以上にわたって混合しても
フミン物質をそれ以上除去することができないためであ
る。
【００３０】第一の洗浄工程において上記弱酸性の水溶
液または尿素水溶液で洗浄したサンプル土壌を、第二の
洗浄工程において粉乳の水溶液を添加してさらに洗浄す
る。上記粉乳の水溶液で洗浄することにより、土壌粒子
に吸着している土壌微生物、すなわち菌を遊離状態にす
ることができるため、土壌中の微生物からＤＮＡを直接
抽出する場合にＤＮＡの回収率を著しく向上させること
ができる。
液または尿素水溶液で洗浄したサンプル土壌を、第二の
洗浄工程において粉乳の水溶液を添加してさらに洗浄す
る。上記粉乳の水溶液で洗浄することにより、土壌粒子
に吸着している土壌微生物、すなわち菌を遊離状態にす
ることができるため、土壌中の微生物からＤＮＡを直接
抽出する場合にＤＮＡの回収率を著しく向上させること
ができる。
【００３１】以下の実施例においては、第二の洗浄工程
において使用する粉乳の濃度は、従来法を参考に0.4 ％
(w/v) とした。上記粉乳としては、例えば、粉乳または
育児用粉ミルクを使用することができる。
において使用する粉乳の濃度は、従来法を参考に0.4 ％
(w/v) とした。上記粉乳としては、例えば、粉乳または
育児用粉ミルクを使用することができる。
【００３２】上記の0.4 ％粉乳の水溶液の添加量は、サ
ンプル土壌100mg に対して200 〜500 μL である。添加
量が200 μL 未満では土壌サンプルの洗浄が不十分にな
る。また、500 μL を越えると１回に処理する容量が大
きくなるため操作上不便になり、さらに土壌中の微生物
からのＤＮＡの回収率も低下する。より好ましくは、20
0 μL である。
ンプル土壌100mg に対して200 〜500 μL である。添加
量が200 μL 未満では土壌サンプルの洗浄が不十分にな
る。また、500 μL を越えると１回に処理する容量が大
きくなるため操作上不便になり、さらに土壌中の微生物
からのＤＮＡの回収率も低下する。より好ましくは、20
0 μL である。
【００３３】第二の洗浄工程においては、粉乳の水溶液
を上述のように添加し室温でボルテクスミキサーにより
激しく混合して洗浄する。ボルテクスミキサーによる混
合は、通常３〜10分程度、好ましくは10分程度行う。混
合時間が３分以下のようにあまりに短いと不純物に吸着
した微生物を十分に遊離させることができず、逆に10分
以上にわたって混合しても遊離される微生物の量がそれ
以上増加しないためである。ボルテクスミキサーによる
混合の終了後、サンプル土壌を冷却遠心し上清を得る。
を上述のように添加し室温でボルテクスミキサーにより
激しく混合して洗浄する。ボルテクスミキサーによる混
合は、通常３〜10分程度、好ましくは10分程度行う。混
合時間が３分以下のようにあまりに短いと不純物に吸着
した微生物を十分に遊離させることができず、逆に10分
以上にわたって混合しても遊離される微生物の量がそれ
以上増加しないためである。ボルテクスミキサーによる
混合の終了後、サンプル土壌を冷却遠心し上清を得る。
【００３４】上記第一の洗浄工程および第二の洗浄工程
を行う順序は特に限定されず、上述の弱酸性の水溶液ま
たは尿素水溶液と粉乳の水溶液とを同時に添加して、一
の洗浄工程として行ってもよい。しかし、土壌中の微生
物からＤＮＡを検出する検出感度の面から、第一の洗浄
工程で洗浄処理した土壌サンプルを第二の洗浄工程で洗
浄処理することが好ましい。
を行う順序は特に限定されず、上述の弱酸性の水溶液ま
たは尿素水溶液と粉乳の水溶液とを同時に添加して、一
の洗浄工程として行ってもよい。しかし、土壌中の微生
物からＤＮＡを検出する検出感度の面から、第一の洗浄
工程で洗浄処理した土壌サンプルを第二の洗浄工程で洗
浄処理することが好ましい。
【００３５】ついで、得られた上清に、例えば、所定の
濃度のＳＤＳを添加し、室温でボルテクスミキサーを用
いて一定時間激しく混合して、微生物を溶菌させる（溶
菌工程）。添加するＳＤＳの終濃度は、0.2 〜0.5 ％が
適当である。0.2 ％未満では溶菌が不十分でＤＮＡを十
分回収することができず、逆に0.5 ％を越える終濃度で
は溶菌しすぎるため最終的なＤＮＡの回収率が低下する
ことによる。
濃度のＳＤＳを添加し、室温でボルテクスミキサーを用
いて一定時間激しく混合して、微生物を溶菌させる（溶
菌工程）。添加するＳＤＳの終濃度は、0.2 〜0.5 ％が
適当である。0.2 ％未満では溶菌が不十分でＤＮＡを十
分回収することができず、逆に0.5 ％を越える終濃度で
は溶菌しすぎるため最終的なＤＮＡの回収率が低下する
ことによる。
【００３６】ＳＤＳを上述のように添加し、室温でボル
テクスミキサーにより激しく混合して洗浄する。ボルテ
クスミキサーによる混合は、通常３〜10分程度、好まし
くは、10分程度行う。混合時間が３分以下のようにあま
りに短いと微生物を十分に溶菌させることができず、逆
に10分程度混合すれば十分に微生物が溶菌されるためで
ある。
テクスミキサーにより激しく混合して洗浄する。ボルテ
クスミキサーによる混合は、通常３〜10分程度、好まし
くは、10分程度行う。混合時間が３分以下のようにあま
りに短いと微生物を十分に溶菌させることができず、逆
に10分程度混合すれば十分に微生物が溶菌されるためで
ある。
【００３７】上述のように処理した土壌サンプルを、例
えば、通常用いられるフェノール処理法によって処理
し、サンプル中に含まれるタンパク質を変性させ除去す
る（変性除去工程）。通常用いられる方法に従い、フェ
ノールは、水相として用いた溶液中の塩等の成分が抽出
操作中に失われ過ぎないように、これらの成分を含む溶
液で予め飽和させておく。転倒混和した後、冷却遠心し
て上清を集め、ここに、例えば、２〜2.5 倍容の100 ％
冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる（沈殿工
程）。この溶液を冷却遠心して、抽出されたＤＮＡを沈
殿として得る。以上のようにして土壌中の微生物のＤＮ
Ａを得る。
えば、通常用いられるフェノール処理法によって処理
し、サンプル中に含まれるタンパク質を変性させ除去す
る（変性除去工程）。通常用いられる方法に従い、フェ
ノールは、水相として用いた溶液中の塩等の成分が抽出
操作中に失われ過ぎないように、これらの成分を含む溶
液で予め飽和させておく。転倒混和した後、冷却遠心し
て上清を集め、ここに、例えば、２〜2.5 倍容の100 ％
冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる（沈殿工
程）。この溶液を冷却遠心して、抽出されたＤＮＡを沈
殿として得る。以上のようにして土壌中の微生物のＤＮ
Ａを得る。
【００３８】ついで、環境中の酵母または放線菌を検出
するために使用するプライマーを調製する。ここで使用
するＲＮＡは酵素または放線菌のリボゾームから調整す
る。一般的に、リボゾームは２種の大きなrRNA分子と１
種の小さなrRNA分子とからなり、これらの大きさは生物
種によって異なる。２種の大きなＲＮＡは、それぞれ、
16Ｓ様rRNAおよび23Ｓ様rRNAと呼ばれている。
するために使用するプライマーを調製する。ここで使用
するＲＮＡは酵素または放線菌のリボゾームから調整す
る。一般的に、リボゾームは２種の大きなrRNA分子と１
種の小さなrRNA分子とからなり、これらの大きさは生物
種によって異なる。２種の大きなＲＮＡは、それぞれ、
16Ｓ様rRNAおよび23Ｓ様rRNAと呼ばれている。
【００３９】酵母は、40の属に分けられ、いずれの種も
リボゾーム中に16Ｓ様rRNAを有する。この16Ｓ様rRNAの
遺伝子配列を解析して調べたところ、酵母に対して保存
性を有する塩基配列（以下、16Ｓ様rRNA保存性配列とい
う）が含まれていることが明らかになった。したがっ
て、16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在するこれら
の16Ｓ様rRNA保存性配列を、ＰＣＲにおいて酵母の検出
のためのプライマーとして使用する。
リボゾーム中に16Ｓ様rRNAを有する。この16Ｓ様rRNAの
遺伝子配列を解析して調べたところ、酵母に対して保存
性を有する塩基配列（以下、16Ｓ様rRNA保存性配列とい
う）が含まれていることが明らかになった。したがっ
て、16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在するこれら
の16Ｓ様rRNA保存性配列を、ＰＣＲにおいて酵母の検出
のためのプライマーとして使用する。
【００４０】酵母検出のためのプライマーとして使用す
る塩基配列は、一方が5'-GCAAYAACAGGTCTGTGATGC-3'
（塩基配列１）、他方が5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-3'
（塩基配列２）で表されるものであり、これらは酵母の
16Ｓ様rRNAのユニバーサルプライマーである（図１）。
る塩基配列は、一方が5'-GCAAYAACAGGTCTGTGATGC-3'
（塩基配列１）、他方が5'-ATCCTTCCGCAGGTTCRCC-3'
（塩基配列２）で表されるものであり、これらは酵母の
16Ｓ様rRNAのユニバーサルプライマーである（図１）。
【００４１】塩基配列１は塩基配列２よりも酵母の16Ｓ
様rRNAの塩基配列上で上流側に位置するため、上記塩基
配列１をセンスプライマーとして、また、上記塩基配列
２をアンチセンスプライマーとして使用する。
様rRNAの塩基配列上で上流側に位置するため、上記塩基
配列１をセンスプライマーとして、また、上記塩基配列
２をアンチセンスプライマーとして使用する。
【００４２】上記の塩基配列１および２をプライマーと
し、上述のように抽出した環境中の微生物からのＤＮＡ
を鋳型として使用して、通常の条件でＰＣＲを行い、こ
れらのプライマーの間に挟まれる塩基配列をＤＮＡ断片
として増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片を、その後電
気泳動により検出する。
し、上述のように抽出した環境中の微生物からのＤＮＡ
を鋳型として使用して、通常の条件でＰＣＲを行い、こ
れらのプライマーの間に挟まれる塩基配列をＤＮＡ断片
として増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片を、その後電
気泳動により検出する。
【００４３】上述のように増幅したＤＮＡ断片を、さら
に塩基配列３を含むＤＮＡをプローブとして用いて、通
常のハイブリダイゼーションを行う。塩基配列３は、酵
母が有する16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在する
保存性を有する塩基配列であって、上述の塩基配列１と
２との間に存在する塩基配列であり、5'-CGAGGAATTCCTA
GTAAGCGC-3' で表される（図２）。この塩基配列３をプ
ローブとして用いることにより、環境中の酵母を高感度
で短時間に検出することができる。
に塩基配列３を含むＤＮＡをプローブとして用いて、通
常のハイブリダイゼーションを行う。塩基配列３は、酵
母が有する16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在する
保存性を有する塩基配列であって、上述の塩基配列１と
２との間に存在する塩基配列であり、5'-CGAGGAATTCCTA
GTAAGCGC-3' で表される（図２）。この塩基配列３をプ
ローブとして用いることにより、環境中の酵母を高感度
で短時間に検出することができる。
【００４４】放線菌の検出のためのプライマーとして使
用する塩基配列は、一方が5'-GCGCASATATCAGGARGAAC-3'
（塩基配列４）、他方が5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'
（塩基配列５）で表されるものであり、これらの塩基配
列は、放線菌の16Ｓ様ｒＲＮＡのユニバーサルプライマ
ーである（図３）。
用する塩基配列は、一方が5'-GCGCASATATCAGGARGAAC-3'
（塩基配列４）、他方が5'-CTGCGATTACTAGCRACTCC-3'
（塩基配列５）で表されるものであり、これらの塩基配
列は、放線菌の16Ｓ様ｒＲＮＡのユニバーサルプライマ
ーである（図３）。
【００４５】上記塩基配列４および５は、放線菌が有す
る16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在する、放線菌
に対して保存性を有する塩基配列である。塩基配列４は
塩基配列５よりも放線菌の16Ｓ様rRNAの塩基配列上で上
流側に位置するため、上記塩基配列４をセンスプライマ
ーとして、また、上記塩基配列５をアンチセンスプライ
マーとして使用する。
る16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在する、放線菌
に対して保存性を有する塩基配列である。塩基配列４は
塩基配列５よりも放線菌の16Ｓ様rRNAの塩基配列上で上
流側に位置するため、上記塩基配列４をセンスプライマ
ーとして、また、上記塩基配列５をアンチセンスプライ
マーとして使用する。
【００４６】上記塩基配列１および２に代えて塩基配列
４および５を使用し、同様にＰＣＲを行うことにより、
環境中の放線菌を検出することができる。上記２つの塩
基配列４と５とをプライマーとし、上述のように抽出し
た環境中の微生物からのＤＮＡを鋳型としてそれぞれ用
いて、これらのプライマーの間に挟まれる塩基配列をＤ
ＮＡ断片として増幅させる。その後、電気泳動により増
幅されたＤＮＡ断片を検出する。
４および５を使用し、同様にＰＣＲを行うことにより、
環境中の放線菌を検出することができる。上記２つの塩
基配列４と５とをプライマーとし、上述のように抽出し
た環境中の微生物からのＤＮＡを鋳型としてそれぞれ用
いて、これらのプライマーの間に挟まれる塩基配列をＤ
ＮＡ断片として増幅させる。その後、電気泳動により増
幅されたＤＮＡ断片を検出する。
【００４７】上述のように増幅したＤＮＡ断片を、さら
に塩基配列６を含むＤＮＡをプローブとして用いて、通
常のハイブリダイゼーションを行う。塩基配列６は、放
線菌が有する16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在す
る保存性を有する塩基配列であって、上述の塩基配列４
と５との間に存在する塩基配列であり、配列６は、5'-C
TCGTGTCGTGAGATGTTGG-3'で表されるものである（図
４）。
に塩基配列６を含むＤＮＡをプローブとして用いて、通
常のハイブリダイゼーションを行う。塩基配列６は、放
線菌が有する16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子中に存在す
る保存性を有する塩基配列であって、上述の塩基配列４
と５との間に存在する塩基配列であり、配列６は、5'-C
TCGTGTCGTGAGATGTTGG-3'で表されるものである（図
４）。
【００４８】上述のように行ったＰＣＲとハイブリダイ
ゼーションとの結果より、増幅されたＤＮＡ量またはハ
イブリダーゼーションしたＤＮＡ量を指標として、検出
しようとしている酵母または放線菌がどの程度サンプル
中に存在しているのかを知ることができる。また、上記
のプライマーとプローブとを使い分けることによって、
酵母と放線菌の双方を検出することもでき、個別に検出
することもできる。
ゼーションとの結果より、増幅されたＤＮＡ量またはハ
イブリダーゼーションしたＤＮＡ量を指標として、検出
しようとしている酵母または放線菌がどの程度サンプル
中に存在しているのかを知ることができる。また、上記
のプライマーとプローブとを使い分けることによって、
酵母と放線菌の双方を検出することもでき、個別に検出
することもできる。
【００４９】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】（実施例１） （１）ＰＣＲ法で使用したプライマーおよびＰＣＲ条件 環境中の微生物から得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に
示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５１】（ａ）ＰＣＲ法で使用した酵母のプライマ
ー 21mer のセンスプライマーおよび19mer のアンチセンス
プライマーを調製した。これらのプライマーは、以下の
ようにして設計し調製した。まず、酵母９種の16Ｓ様rR
NAをコードする遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene
Worksのソフトウェアを用いてアライメントをとった。
ここで明らかになった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性
を有するＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列
を図１に示す。
ー 21mer のセンスプライマーおよび19mer のアンチセンス
プライマーを調製した。これらのプライマーは、以下の
ようにして設計し調製した。まず、酵母９種の16Ｓ様rR
NAをコードする遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene
Worksのソフトウェアを用いてアライメントをとった。
ここで明らかになった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性
を有するＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列
を図１に示す。
【００５２】（ｂ）ＰＣＲ法で使用した放線菌のプライ
マー 20mer のセンスプライマーと20mer のアンチセンスプラ
イマーとを調製した。これらのプライマーは、以下のよ
うにして設計し調製した。まず、放線菌13種の16Ｓ様rR
NAをコードする遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene
Worksのソフトウェアを用いてアライメントをとった。
ここで明らかになった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性
を有するＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列
を図３に示す。
マー 20mer のセンスプライマーと20mer のアンチセンスプラ
イマーとを調製した。これらのプライマーは、以下のよ
うにして設計し調製した。まず、放線菌13種の16Ｓ様rR
NAをコードする遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene
Worksのソフトウェアを用いてアライメントをとった。
ここで明らかになった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性
を有するＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列
を図３に示す。
【００５３】（ｃ）ＰＣＲ法で使用した試薬 2.5 μL の10×ＰＣＲバッファー（100mM Tris-HCl(pH
8.3）、500mM KCl 、15mM MgCl2、0.01％ゲラチン(w/v)
を含む） 0.5 μL のセンスプライマー（100pmol ） 0.5 μL のアンチセンスプライマー（100pmol ） 2.5 μL のdTNPs （２mM） 1 ユニットのTaq ポリメラーゼ 250ng の鋳型ＤＮＡ 上記の試薬に滅菌水を加え、溶液の全体量を25μL にし
て、以下の反応条件により、ＰＣＲを行った。
8.3）、500mM KCl 、15mM MgCl2、0.01％ゲラチン(w/v)
を含む） 0.5 μL のセンスプライマー（100pmol ） 0.5 μL のアンチセンスプライマー（100pmol ） 2.5 μL のdTNPs （２mM） 1 ユニットのTaq ポリメラーゼ 250ng の鋳型ＤＮＡ 上記の試薬に滅菌水を加え、溶液の全体量を25μL にし
て、以下の反応条件により、ＰＣＲを行った。
【００５４】（ｄ）反応条件 94℃１分でプレインキュベーション後、94℃30秒、60℃
１分、72℃１分を１サイクルとして35サイクルを行い、
引き続き72℃で２分間伸張反応を行った。
１分、72℃１分を１サイクルとして35サイクルを行い、
引き続き72℃で２分間伸張反応を行った。
【００５５】（２）ハイブリダイゼーション法で使用し
たプローブおよびハイブリダイゼーション条件 環境中から得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に示すプロ
ーブを用いてハイブリダイゼーションを行った。
たプローブおよびハイブリダイゼーション条件 環境中から得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に示すプロ
ーブを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【００５６】（ａ）ハイブリダイゼーション法で使用し
た酵母のプローブ 21mer のオリゴヌクレオチドプローブを調製した。この
プローブは、以下のようにして設計し調製した。
た酵母のプローブ 21mer のオリゴヌクレオチドプローブを調製した。この
プローブは、以下のようにして設計し調製した。
【００５７】まず、酵母９種の16Ｓ様rRNAをコードする
遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene Worksのソフト
ウェアを用いてアライメントをとった。ここで明らかに
なった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性を有するＤＮＡ
配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列を図２に示す。
遺伝子の塩基配列をEMBLで検索後、Gene Worksのソフト
ウェアを用いてアライメントをとった。ここで明らかに
なった16Ｓ様rRNAの塩基配列上に保存性を有するＤＮＡ
配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列を図２に示す。
【００５８】（ｂ）ハイブリダイゼーション法で使用し
た放線菌のプローブ 20mer のオリゴヌクレオチドプローブを調製した。この
プローブは、以下のようにして設計し調製した。まず、
放線菌13種の16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子の塩基配列
をEMBLで検索後、Gene Worksのソフトウェアを用いてア
ライメントをとった。ここで明らかになった16Ｓ様rRNA
の塩基配列上に保存性を有するＤＮＡ配列を決定した。
決定されたＤＮＡ配列を図４に示す。
た放線菌のプローブ 20mer のオリゴヌクレオチドプローブを調製した。この
プローブは、以下のようにして設計し調製した。まず、
放線菌13種の16Ｓ様rRNAをコードする遺伝子の塩基配列
をEMBLで検索後、Gene Worksのソフトウェアを用いてア
ライメントをとった。ここで明らかになった16Ｓ様rRNA
の塩基配列上に保存性を有するＤＮＡ配列を決定した。
決定されたＤＮＡ配列を図４に示す。
【００５９】（ｃ）ハイブリダイゼーション法に使用し
た試薬 ハイブリダイゼーション溶液は、アマシャム社のECL 3'
- オリゴラベリングアンド ディテクションシステムズ
（ECL 3'-oligolabelling and detection systems ）の
キットに添付された説明書に記載の方法に従って調製し
た。
た試薬 ハイブリダイゼーション溶液は、アマシャム社のECL 3'
- オリゴラベリングアンド ディテクションシステムズ
（ECL 3'-oligolabelling and detection systems ）の
キットに添付された説明書に記載の方法に従って調製し
た。
【００６０】［プレハイブリダイゼーションおよびハイ
ブリダイゼーション溶液］ ５×ＳＳＣ 0.1 ％(w/v) ハイブリダイゼーションバッファーコンポ
ーネント（Hybridization buffer component* ） 0.02％(w/v) ＳＤＳ 20倍希釈のリキッドブロック（20 fold dilution of li
quid block* ） * を付した２つの試薬は、 ECL 3'-oligolabelling and
detection systemsのキットに含まれている。 上記の溶液はメンブレン１cm2 あたり0.125mL を使用し
た。また、プローブはハイブリダイゼーション溶液１mL
あたり５〜10ng使用した。
ブリダイゼーション溶液］ ５×ＳＳＣ 0.1 ％(w/v) ハイブリダイゼーションバッファーコンポ
ーネント（Hybridization buffer component* ） 0.02％(w/v) ＳＤＳ 20倍希釈のリキッドブロック（20 fold dilution of li
quid block* ） * を付した２つの試薬は、 ECL 3'-oligolabelling and
detection systemsのキットに含まれている。 上記の溶液はメンブレン１cm2 あたり0.125mL を使用し
た。また、プローブはハイブリダイゼーション溶液１mL
あたり５〜10ng使用した。
【００６１】（ｄ）ハイブリダイゼーション反応条件 ハイブリダイゼーションの反応条件は、上記ECL 3'-oli
golabelling and detection systems の方法に従って行
った。
golabelling and detection systems の方法に従って行
った。
【００６２】［ハイブリダイゼーション］メンブレンを
ハイブリダイゼーション溶液で42℃にて、少なくとも30
分インキュベートした。その後、この溶液にプローブを
加え、同じ条件でさらに２〜17時間インキュベートし
た。
ハイブリダイゼーション溶液で42℃にて、少なくとも30
分インキュベートした。その後、この溶液にプローブを
加え、同じ条件でさらに２〜17時間インキュベートし
た。
【００６３】［洗浄］バッファー１（５×SSC 、0.1 ％
(w/v)SDS）で室温にて５分間インキュベートした。新し
いバッファー１に交換してさらに室温で５分間インキュ
ベートした。その後、バッファー２（１×SSC 、0.1 ％
(w/v)SDS）で、50℃にて15分間の条件で２回インキュベ
ートした。
(w/v)SDS）で室温にて５分間インキュベートした。新し
いバッファー１に交換してさらに室温で５分間インキュ
ベートした。その後、バッファー２（１×SSC 、0.1 ％
(w/v)SDS）で、50℃にて15分間の条件で２回インキュベ
ートした。
【００６４】（実施例２）環境中からのＤＮＡの抽出 （１）使用したサンプル 表１に示すように、ウサギの糞、カニの糞、ヘドロ、活
性汚泥、陸水１（川より採集）、陸水２（温泉１：川治
温泉より採取）、陸水３（温泉２：日光湯元より採
取）、海水を採集して使用した。
性汚泥、陸水１（川より採集）、陸水２（温泉１：川治
温泉より採取）、陸水３（温泉２：日光湯元より採
取）、海水を採集して使用した。
【００６５】（２）環境中からのＤＮＡの抽出 表１に示したサンプル各100mg に対して、0.5Mの酢酸ア
ンモニウム溶液（pH6.8 ）を300 μL 加え、ボルテクス
ミキサーで、室温にて10分間激しく攪拌した。その後、
これらの混合物にさらに0.4 ％(w/v) のスキムミルク溶
液200 μL を加え、再度ボルテクスミキサーで10分間、
室温で激しく攪拌した。
ンモニウム溶液（pH6.8 ）を300 μL 加え、ボルテクス
ミキサーで、室温にて10分間激しく攪拌した。その後、
これらの混合物にさらに0.4 ％(w/v) のスキムミルク溶
液200 μL を加え、再度ボルテクスミキサーで10分間、
室温で激しく攪拌した。
【００６６】洗浄が終了したサンプルを、４℃、12,000
×ｇの条件で、10分間遠心して上清を集めた。ここで得
られた上清にＳＤＳを終濃度0.5 ％となるように加え、
室温で10分間、ボルテクスミキサーで激しく混合して微
生物を溶菌させた。
×ｇの条件で、10分間遠心して上清を集めた。ここで得
られた上清にＳＤＳを終濃度0.5 ％となるように加え、
室温で10分間、ボルテクスミキサーで激しく混合して微
生物を溶菌させた。
【００６７】ついで、通常使用されるフェノール処理法
に従い、上記処理を行った上清中に含まれるタンパク質
を変性させた。ここに、２〜2.5 倍容の100 ％の冷エタ
ノールを加えて沈殿させ、４℃、12,000×ｇの条件で遠
心してＤＮＡを得た。
に従い、上記処理を行った上清中に含まれるタンパク質
を変性させた。ここに、２〜2.5 倍容の100 ％の冷エタ
ノールを加えて沈殿させ、４℃、12,000×ｇの条件で遠
心してＤＮＡを得た。
【００６８】以上のようにして得たＤＮＡを鋳型とし
て、上述した条件でＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片
を鋳型として、さらにハイブリダイゼーションを行っ
た。結果を表１、図５および図６に示す。
て、上述した条件でＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片
を鋳型として、さらにハイブリダイゼーションを行っ
た。結果を表１、図５および図６に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】表１中、バンドが検出されなかった場合を
−、非常に薄いバンドが検出された場合を±、また濃い
バンドが検出された場合を＋と表示した。
−、非常に薄いバンドが検出された場合を±、また濃い
バンドが検出された場合を＋と表示した。
【００７１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、環境中から、直
接に効率よく、かつ簡便に微生物のＤＮＡを抽出し、酵
母または放線菌のプライマーやプローブを使用したＰＣ
Ｒ法や遺伝子プローブ法を行うことによって、酵母や放
線菌を短期間に高感度で検出することができる。
接に効率よく、かつ簡便に微生物のＤＮＡを抽出し、酵
母または放線菌のプライマーやプローブを使用したＰＣ
Ｒ法や遺伝子プローブ法を行うことによって、酵母や放
線菌を短期間に高感度で検出することができる。
【００７２】また、本発明の方法によれば、サンプルを
培養する必要がないため、培養によって検出される菌が
限定されることなく、各種環境中の酵母や放線菌を検出
することができる。
培養する必要がないため、培養によって検出される菌が
限定されることなく、各種環境中の酵母や放線菌を検出
することができる。
【００７３】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：No 起源 生物名：酵母 配列 GCAAYAACAGGTCTGTGATGC 21
【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Yes 起源 生物名：酵母 配列 ＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＲＣＣ １９
【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：No 起源 生物名：酵母 配列 CGAGGAATTCCTAGTAAGCGC 21
【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：No 起源 生物名：放線菌 配列 GCGCASATATCAGGARGAAC 20
【００７７】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Yes 起源 生物名：放線菌 配列 CTGCGATTACTAGCRACTCC 20
【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：放線菌 配列 CTCGTGTCGTGAGATGTTGG 20
【図１】ＰＣＲ法で使用した酵母のセンスプライマー
（塩基配列１）とアンチセンスプライマー（塩基配列
２）とを示す図である。
（塩基配列１）とアンチセンスプライマー（塩基配列
２）とを示す図である。
【図２】ハイブリダイゼーション法で使用した酵母のプ
ローブ（塩基配列３）を示す図である。
ローブ（塩基配列３）を示す図である。
【図３】ＰＣＲ法で使用した放線菌のセンスプライマー
（塩基配列４）とアンチセンスプライマー（塩基配列
５）とを示す図である。
（塩基配列４）とアンチセンスプライマー（塩基配列
５）とを示す図である。
【図４】ハイブリダイゼーション法で使用した放線菌の
プローブ（塩基配列６）を示す図である。
プローブ（塩基配列６）を示す図である。
【図５】微生物の形態を示すゲル電気泳動の写真であっ
て、各サンプルからＤＮＡを直接抽出してこれを鋳型と
し、酵母のプライマーを使用したＰＣＲのゲル電気泳動
の結果（Ａ）およびこれを鋳型としてハイブリダイゼー
ションを行った結果（Ｂ）を示す図面代用写真である。
て、各サンプルからＤＮＡを直接抽出してこれを鋳型と
し、酵母のプライマーを使用したＰＣＲのゲル電気泳動
の結果（Ａ）およびこれを鋳型としてハイブリダイゼー
ションを行った結果（Ｂ）を示す図面代用写真である。
【図６】微生物の形態を示すゲル電気泳動の写真であっ
て、各サンプルからＤＮＡを直接抽出してこれを鋳型と
し、放線菌のプライマーを使用したＰＣＲのゲル電気泳
動の結果（Ａ）およびこれを鋳型としてハイブリダイゼ
ーションを行った結果（Ｂ）を示す図面代用写真であ
る。
て、各サンプルからＤＮＡを直接抽出してこれを鋳型と
し、放線菌のプライマーを使用したＰＣＲのゲル電気泳
動の結果（Ａ）およびこれを鋳型としてハイブリダイゼ
ーションを行った結果（Ｂ）を示す図面代用写真であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年１月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
Claims (4)
- 【請求項１】 無機塩または有機塩を含む弱酸性の水溶
液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗浄工程
と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二の洗浄工程とを
含むＤＮＡの直接抽出法によって環境中の微生物からＤ
ＮＡを抽出して鋳型とし、一方が5'-GCAAYAACAGGTCTGTG
ATGC-3' （配列表の配列番号１）、他方が5'-ATCCTTCCG
CAGGTTCRCC-3' （配列表の配列番号２）で表される塩基
配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ここで増幅され
たＤＮＡ量を指標として酵母を検出することを特徴とす
る環境中の酵母の検出方法。 - 【請求項２】 請求項１で増幅されたＤＮＡを鋳型と
し、5'-CGAGGAATTCCTAGTAAGCGC-3' （配列表の配列番号
３）で表される塩基配列をプローブとしてハイブリダイ
ゼーションを行うことを特徴とする環境中の酵母の検出
方法。 - 【請求項３】 無機塩または有機塩を含む弱酸性の水溶
液、または尿素水溶液で試料を洗浄する第一の洗浄工程
と、粉乳の水溶液で試料を洗浄する第二の洗浄工程とを
含むＤＮＡの直接抽出方法によって環境中の微生物から
ＤＮＡを抽出して鋳型とし、一方が5'-GCGCASATATCAGGA
RGAAC-3'（配列表の配列番号４）、他方が5'-CTGCGATTA
CTAGCRACTCC-3'（配列表の配列番号５）で表される塩基
配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ここで増幅され
たＤＮＡ量を指標として放線菌を検出することを特徴と
する環境中の放線菌の検出方法。 - 【請求項４】 請求項３で増幅されたＤＮＡを鋳型と
し、5'-CTCGTGTCGTGAGATGTTGG-3'（配列表の配列番号
６）で表される塩基配列をプローブとしてハイブリダイ
ゼーションを行い、放線菌を検出することを特徴とする
環境中の放線菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00927397A JP3770986B2 (ja) | 1997-01-22 | 1997-01-22 | 環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00927397A JP3770986B2 (ja) | 1997-01-22 | 1997-01-22 | 環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10201500A true JPH10201500A (ja) | 1998-08-04 |
| JP3770986B2 JP3770986B2 (ja) | 2006-04-26 |
Family
ID=11715863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00927397A Expired - Fee Related JP3770986B2 (ja) | 1997-01-22 | 1997-01-22 | 環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3770986B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9140691B2 (en) | 2006-12-01 | 2015-09-22 | Statens Serum Institut | Diagnostic blood test using adsorption on filter paper |
| JP2019033704A (ja) * | 2017-08-18 | 2019-03-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キット |
-
1997
- 1997-01-22 JP JP00927397A patent/JP3770986B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9140691B2 (en) | 2006-12-01 | 2015-09-22 | Statens Serum Institut | Diagnostic blood test using adsorption on filter paper |
| JP2019033704A (ja) * | 2017-08-18 | 2019-03-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3770986B2 (ja) | 2006-04-26 |
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