JPH10191991A - 組換ヒト肝実質細胞増殖因子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコード
する塩基配列を含有するＤＮＡを単離し、これを発現し
うる組換発現ベクターに導入し、該組換発現ベクターで
形質転換した形質転換体を培養し、該培養物から組換ヒ
ト白血球由来肝実質細胞増殖因子を採取、製造する。 【効果】 この組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子
は、肝実質細胞培養試薬、肝再生促進剤、肝機能の基礎
的研究、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用
の研究、肝癌の発癌研究用、さらにこれに対する抗体を
用いる臨床診断試薬、肝疾患治療薬などへの利用に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は肝実質細胞増殖活性を有
するポリペプチド、さらに詳しくは、生体外（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）で肝実質細胞の維持、増殖を可能にする生理
活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を発現
し得る組換発現ベクター、形質転換体、および該ポリペ
プチドの製造法に関するものである。本発明により製造
されたポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促進
剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホル
モンや薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに該
ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝疾
患治療薬などへの利用が期待できる。

【０００２】

【従来技術】従来、細胞増殖活性を有するポリペプチド
として、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｅ
ＣＧＦ）などが知られている。これらの増殖因子の他
に、生体外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペ
プチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清
より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと
略す）と命名された。

【０００３】このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は各種の
株化細胞が活発に増殖する哺乳動物血清存在下でも該細
胞の増殖が全く認められず、通常約１週間で培養容器壁
からの脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であ
った。ところがこのＨＧＦの存在下において肝細胞は極
めて良好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１２２，１４５０，１９８４）。他の研究者によ
ってもこのＨＧＦ活性は、肝部分切除手術後の血中、劇
症肝炎患者の血中にも存在することが確認された。

【０００４】このような状況の下で、本発明者らは、先
にラット血小板からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、
このラット血小板由来のＨＧＦが２種のサブユニットか
らなることを見出し、かつＨＧＦに含有される一部のア
ミノ酸配列２７残基の同定に成功した（特願昭６３−３
１１８６６号明細書）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】生体内ＨＧＦは、肝組
織あるいは血小板などから極微量分泌されるポリペプチ
ドであるため、原材料組織の入手の困難さにより、安定
供給することはほとんど不可能に近い。特に、ヒトＨＧ
Ｆにおいては現在までに唯一活性が確認されているのは
劇症肝炎患者血清中のみである。このヒトＨＧＦを肝実
質細胞の培養や肝細胞の研究用、ひいては肝疾患治療薬
として利用するためには、ヒトＨＧＦと同様な活性を有
するポリペプチドを遺伝子組換技術を応用して大量に供
給することが望まれる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラット血小板由来Ｈ
ＧＦのアミノ配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとしてラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃ
ＤＮＡライブラリーよりラットＨＧＦポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを
見出した。さらにラット由来の該ｃＤＮＡをプローブと
してヒト肝臓ｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラ
リーよりヒトＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列
を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。（Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８９）。

【０００７】さらにヒト肝臓由来の該ｃＤＮＡの一部ま
たは全部をプローブとして肝臓を除いた種々のヒト組織
由来のｍＲＮＡとのノザーンハイブリダイゼイションを
行ったところ、胎盤及び白血球ｍＲＮＡにもＨＧＦ様転
写産物の存在が認められることを見出した。本発明者ら
は、このうち白血球由来のｍＲＮＡから作製したｃＤＮ
Ａライブラリーより、ヒトＨＧＦをコードする塩基配列
を含有するｃＤＮＡを単離しその塩基配列を明らかに
し、さらに該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターを作
製し、該組換発現ベクターによって形質転換された形質
転換体を得、該形質転換体を培養してヒト白血球由来Ｈ
ＧＦ遺伝子が発現することを見出し本発明を完成させる
に至った。

【０００８】即ち、本発明はヒト白血球由来肝実質細胞
増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを発現
しうる組換発現ベクター、該組換発現ベクターで形質転
換された形質転換体、該形質転換体を培養し、該培養物
から組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子を採取、製
造する方法及び組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子
に関するものである。

【０００９】本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコード
するＤＮＡ組換発現ベクター、及び形質転換体は例えば
次のようにして調製される。即ち、（１）ヒトの白血球
よりｍＲＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡライブラ
リーを作製し、（２）すでに単離されているヒト肝臓由
来ＨＧＦｃＤＮＡの全部または一部をプローブとして上
記ヒト白血球由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グを行い、単離されたクローンより目的とするｃＤＮＡ
を抽出する。（３）このヒト白血球由来ＨＧＦのｃＤＮ
ＡよりヒトＨＧＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素
を用いて切り出し発現用ベクターに組み込み、（４）得
られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して
形質転換体を得、（５）この形質転換体を培養して、そ
の培養上清からヒト白血球ＨＧＦを採取、製造すること
ができる。

【００１０】以下、本発明の各工程について詳細に説明
する。 １）ｍＲＮＡの単離とノーザンハイブリダイゼーション ヒト白血球のｍＲＮＡは常法に従って得ることができ
る。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９
４（１９７９）に記載されているＪ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｖ
ｉｎらの方法によって、ヒトの白血球のグアニジンチオ
シアン酸溶液から得たＲＮＡをさらにオリゴｄＴセルロ
ースカラムを用いる液体クロマトグラフィーに、または
オリゴｄＴラテックスに付すことによって該ｍＲＮＡを
調製することが可能である。また、ヒト白血球ｍＲＮＡ
は市販品としてクロンテック社などから購入して利用す
ることもできる。このようにして得られたｍＲＮＡとヒ
ト肝臓由来のＨＧＦをコードするｃＤＮＡとのノーザン
ハイブリダイゼイションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０２（１９８
２）に記載されているＭａｎｉａｔｉｓらの方法によっ
て行うことができる。プローブとしてはヒト肝臓由来Ｈ
ＧＦｃＤＮＡの全部又は一部を^３２Ｐ標識して使用する
ことができる。

【００１１】２）ｃＤＮＡの調製 上記によりＨＧＦ転写産物の存在が確認されたヒト白血
球ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えば
Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，２．１６１，１９８２ 及びＭｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０，１９８３）あるいはＵ．
Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３，１９
８３）に従ってｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをプラ
スミドやファージに組み込むことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを調製することができる。ｃＤＮＡを組み込むプ
ラスミドベクターとしては、大腸菌由来のｐＢＲ３２２
（東洋紡績）、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９（東洋紡
績）、枯草菌由来のｐＵＢ１１０（シグマ社）などがあ
る。これらのベクターは、宿主細胞内に保存されていて
複製、増幅されるものであれば、ここに例示したものに
限定されるものではない。ｍＲＮＡを鋳型として合成さ
れたｃＤＮＡをプラスミドまたはファージに組み込んで
ｃＤＮＡライブラリーを調製する方法として、Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２３９，１９８２）または
Ｔ．Ｖ．Ｈｙｕｎｈらの方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，
４９，１９８５）を各々例示することができる。また、
ｍＲＮＡと同様にヒト白血球のｃＤＮＡライブラリーを
市販品としてクロンテック社などから購入して使うこと
も可能である。

【００１２】３）ｃＤＮＡライブラリースクリーニング ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファ
ージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な
宿主細胞に保持される。宿主となりうる大腸菌として
は、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５
１４，Ｃ６００（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２，Ｊ
Ｍ１０１（ファルマシア社）などを例示することができ
る。ｃＤＮＡのベクターがプラスミドの場合、塩化カル
シウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用
いて、またｃＤＮＡのベクターがファージの場合、イン
ビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増殖さ
せた宿主細胞に保持させることができる（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，２４９，１９８２）。このようにして得られた形質
転換体から、ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡを^３２Ｐ標識
したプローブを使用してコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（Ｇｅｎｅ，１０，６３，１９８０）、プラークハ
イブリダイゼーション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，１
８０，１９７７）などによってｃＤＮＡクローンを釣り
上げることができる。また、目的とするポリペプチドに
対する抗体を用いて、標識抗体法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
１，４９，１９８５）によって、ｃＤＮＡをクローニン
グすることも可能である。

【００１３】次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８
２）に従ってプラスミドやファージなどの組換ＤＮＡを
単離し、そのままあるいは制限酵素で消化してからｃＤ
ＮＡ塩基配列が決定される。塩基配列はマクサムとギル
バートの化学法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，７４，５６０，１９７７）やサンガーの
ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，７４，５４６３，１９７７）などによっ
て決定される。記述のｍＲＮＡと塩基配列の決定された
ｃＤＮＡの一部あるいはｃＤＮＡの一部の合成ＤＮＡを
プライマーにして、プライマーエクステンション法（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７
６，７３１，１９７９）によって新たにｃＤＮＡを合成
し、上記と同様にしてｃＤＮＡライブラリーから第１の
ｃＤＮＡに連絡した第２のｃＤＮＡを含有するプラスミ
ドやファージなどの組換ＤＮＡをクローニングすること
が可能である。このプライマーエクステンションとクロ
ーニングの工程は、必要により複数回繰り返される。

【００１４】４）ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築 クローン化されたヒト白血球ＨＧＦのアミノ酸配列の全
部あるいはその一部をコードするｃＤＮＡを含有する数
種のプラスミドやファージなどの組換ベクターから制限
酵素によってｃＤＮＡを切り出し、ヒト白血球由来ＨＧ
Ｆの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限
酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベク
ターを作製することができる。より詳しくは、ヒト白血
球由来ＨＧＦを効率良く発現させるために組換発現ベク
ターは転写の下流方向に順番に必要により（１）プロモ
ーター、（２）リボゾーム結合部位、（３）開始コド
ン、（４）ヒト白血球由来ＨＧＦをコードする塩基配列
を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン、（６）ターミネ
ーターを含むように構築される。本発明で用いることが
できるＤＮＡのベクターとして大腸菌由来のプラスミド
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８（東洋紡績）、枯草菌由来の
プラスミドｐＵＢ１１０（シグマ社）、酵母由来のプラ
スミドｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ ３７０６２）、バクテリ
オファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン
社）、ウィルスＳＶ４０（ＢＲＬ社）、ＢＰＶ（ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−７０３）、レトロウィルスの遺伝子由来のベ
クターなどが列挙出来るが、宿主内で複製、増幅可能な
ベクターであれば特に限定はない。特に、ヒト白血球由
来ＨＧＦを簡便に発現させるには、ＳＶ４０のようなウ
ィルスの遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。
例えば、前述のクローン化されたヒト白血球由来ＨＧＦ
をコードするＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領域に結
合した組換発現ベクターは、ＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，２
３，１７５，１９８１）と呼ばれるサル細胞株に導入し
て発現させることが可能である。プロモーター及びター
ミネーターに関しても、目的とするヒト白血球由来ＨＧ
Ｆをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応
したものであれば特に限定はない。例えば、プロモータ
ーとして宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーターなどを、宿主が枯草菌である場
合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなど
を、宿主が酵母である場合、ＧＡＰプロモーター、ＰＧ
Ｋプロモーターなどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャ
イニーズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、
ウィルス由来のＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ１ＴＫプ
ロモーターなどを例示することができる。また、ターミ
ネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミ
ネーター、１ｐｐターミネーターなどを、宿主が枯草菌
の場合ａｍｙＦターミネーターなどを、宿主が酵母の場
合ＣＹＣ１ターミネーターなどを、宿主が動物細胞の場
合、ＳＶ４０ターミネーター、ＨＳＶ１ＴＫターミネー
ターなどを例示することができる。これらのプロモータ
ーとターミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合
わされる。本発明においてヒト白血球由来ＨＧＦをコー
ドする塩基配列を含有するＤＮＡは、そのＤＮＡが発現
されるポリペプチドが、肝実質細胞増殖活性を有するな
らば特に制限はなく、例えば後述する配列表・配列番号
１に示した塩基配列が例示され、さらには上記塩基配列
の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わ
された塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。ヒト白
血球由来ＨＧＦをコードする塩基配列を含有する該ＤＮ
Ａの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終止コドンとし
てＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを有してもよい。ま
た、必要に応じて開始コドン、あるいは終止コドンを１
つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合わせて配列
してもよく、これらに特に限定はない。さらにこの組換
発現ベクターで形質転換した宿主の選択マーカーとなり
得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種または２種以上が該ベクタ
ーの適切な位置に含有されていることが好ましい。

【００１５】５）宿主細胞の形質転換とその培養 このようにして構築されたヒトＨＧＦ白血球組換発現ベ
クターは、コンピテント細胞法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５４，１９７０）、プロトプラスト法
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
５，１９２９，１９７８）リン酸カルシウム法（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２２１，５５１，１９８３）ＤＥＡＥデキス
トラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，１９８
３）、電気パルス法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
ＵＳＡ，８１，７１６１，１９８４）、インビトロパッ
ケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ．ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，１９７５）、ウイルスベク
ター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，１９８４）、また
はマイクロインジェクション法（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒ
ｅｓ．，１５３，３４７，１９８４）などによって宿主
に導入され、形質転換体が作製される。このとき、宿主
として既述の大腸菌の他に枯草菌、酵母、動物細胞など
が用いられる。特にマウス線維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．，２６，２９１，１９７８）やチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，１９２９，１９７８）な
どの哺乳動物由来の宿主細胞を用いるのが好適である。
得られた形質転換体は、目的とする組換ヒト白血球ＨＧ
Ｆを産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で
培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭
素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤など
が含有される。培地の１例としては、形質転換体の宿主
が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）Ｍ９培地（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１９７２，ｐ．４３１）などを、宿主が酵母の
場合、ＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９，ｐ．１１７）などを、宿主
が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有す
るＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地
（日水製薬）などを挙げることができる。形質転換体の
培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行
われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。また、宿主
が接着性の動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラ
ーゲンビーズ、あるいはアセチルセルロースフォローフ
ァイバーなどの担体が用いられる。これら以外の培地組
成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施
でき、これらに限定されるものではない。

【００１６】６）ヒトＨＧＦの精製 このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した組換ヒト白血球ＨＧＦは、公知の塩析
法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動
法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換ク
ロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティ
クロマトグラフィなどを組み合わせて分離精製すること
ができる。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−
セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファ
ロースアフィニテイクロマトグラフィおよびフェニルセ
ファロース逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるい
は硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイ
オンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロー
スアフィニティクロマトクラフィの組み合わせなどが好
ましく有効な精製法である。以上に述べた方法によって
得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦは、ラット肝、ラッ
ト血小板及び組換ヒト肝由来ＨＧＦと同様にラット肝実
質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

【００１７】７）ＨＧＦ活性の測定 ＨＧＦ活性は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８０，７２２９（１９８３）に記載の方法
に準じて次のように測定した。ウイスター系ラットから
コラーゲナーゼ還流法によって肝実質細胞を分離精製し
た。得られたラット肝実質細胞を５％ウシ血清、２×１
０^−９Ｍインスリンおよび２×１０^−９Ｍデキサメサゾ
ンを添加したウイリアムスＥ培地（フローラボラトリー
社）に懸濁し、２４ウエルマルチプレートに１．２５×
１０^５個／ウエルの濃度で播いた。５％ＣＯ_２および３
０％Ｏ_２および６５％Ｎ_２の存在下、３７℃で２０時間
培養後、０．１μｇ／ｍｌのアプロチニンを添加したウ
イリアムスＥ培地に交換すると同時に所定量の被験試料
を添加した。１５時間後、１５μＣｉ／ｍｌの^１２５Ｉ
デオキシウリジン１０μｌ／ウエルを添加した。コント
ロール群には、^１２５Ｉデオキシウリジン添加の１５分
前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリンを添加した。さら
に４時間培養して^１２５Ｉでラベルした。細胞をｐＨ
７．４のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ酢酸
水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウエル当たり
０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、
その放射能をガンマカウンターにより測定した。また放
射能測定後の試料の１部をとってローリー法（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５，１９５１）に従い
蛋白量を測定した。被験試料を添加したとき肝実質細胞
に取り込まれた^１２５Ｉの量をコントロールとのカウン
トの差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白質１ｍ
ｇ当たりに換算して、ＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／ｍｇ蛋
白質）とした。被験試料のＨＧＦ活性は同一試験におい
て上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌを用いた
時の肝実質細胞のＤＮＡ合成活性の５０％に相当する活
性を１単位と定義して表示した。

【００１８】

【発明の効果】本発明により肝実質細胞の生体外での増
殖を可能とする新規な生理活性ペプチドの大量供給が可
能となる。本発明により供給される組換ヒト白血球由来
ＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有用であ
る。さらに、本発明によりつくられる組換ヒト白血球由
来ＨＧＦの作用により増殖維持される肝実質細胞は、例
えば肝機能の基礎的研究用肝実質細胞に対する各種ホル
モンや薬剤の作用の研究用、肝癌の発癌研究用あるいは
肝炎ウィルスの生体外培養のための宿主細胞として極め
て有用である。

【００１９】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００２０】実施例１ １）ヒト組織ｍＲＮＡとヒト肝由来ＨＧＦｃＤＮＡのノ
ーザンハイブリダイゼーション ヒト脳、胎盤、白血球、肺、及び肝臓ｍＲＮＡ（クロン
テック社）それぞれ２μｇをＭａｎｉａｔｉｓらの方法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，２０２，１９８２）に準じて０．６６Ｍホルムアル
デヒド含有アガロース電気泳動に供した後、ナイロンフ
ィルター・ジーンスクリーンプラス（デュポン社）上に
固定した。ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−
ＫｐｎＩ ２．２ｋｂ断片をアガロース電気泳動により
分離、精製し、マルチプライムＤＮＡ標識システム（ア
マシャム社）を用いて〔α^３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識する
ことにより調製したプローブ、５×ＳＳＰＥ緩衝液（１
×ＳＳＰＥ：１８０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）、５×デンハ
ート溶液、１０％デキストラン硫酸、４０％ホルムアル
デヒド、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ大腸菌ＤＮ
Ａからなるハイブリダイゼーション溶液に上記ナイロン
フィルターを浸し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼー
ション反応した。反応後、ナイロンフィルターは６０℃
で０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ緩衝液によって３回
洗浄してから風乾した。このナイロンフィルターを増感
スクリーン・ライトニングプラス（デュポン社）とＸ線
フィルム、ＲＸ（富士写真フィルム）に密着させ、−８
０℃で１６時間露光した。現像の結果、肝臓ｍＲＮＡと
同様に胎盤及び白血球ｍＲＮＡにもＨＧＦ様転写産物の
存在が認められた。

【００２１】２）ヒト白血球由来のｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 ヒト白血球ｍＲＮＡ３μｇを鋳型にし、ヒト肝臓由来Ｈ
ＧＦｃＤＮＡの３’非翻訳領域に含有する^５’ＡＣＡＴ
ＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴ^３’の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｃＤＮＡ
合成システムプラス（アマシャム社）を用いてＧｕｂｌ
ｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３，１９８３）に
準じてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡはフェノール／ク
ロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）抽出とエタノール沈澱に
よって精製した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＳＴＥ緩衝液
と略す）に溶解し、０．７μｇ／２０μｌとした。この
ｃＤＮＡをｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０
（アマシャム社）を用いてＨｕｙｎｈらの方法（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｉ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，１，４９，１９８２）に準じ、次のよう
にλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲ
Ｉアダプターを付加した。ＳＴＥ緩衝液で平衡化したｃ
ＤＮＡ精製用ゲル濾過カラムに反応液をアプライし、同
緩衝液で溶出してｃＤＮＡ画分５００μｌを集めた。常
法によってエタノール沈澱を２回繰り返した後、減圧乾
燥してリンカー付加ｃＤＮＡを得た。再びＳＴＥ緩衝液
に５０ｎｇ／μｌの濃度で溶解したのち、あらかじめ準
備されたλｇｔ１０アーム１μｇにアダプター付加ｃＤ
ＮＡ０．１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。この反応液は冷エタノール処理した後、軽く乾燥し
て得られた組換ＤＮＡの全量を５μｌの１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５（ＴＥ緩
衝液と略す）に溶解した。この組換ＤＮＡをインビトロ
パッケージング反応に供し、λｇｔ１０組換ファージを
得た。ファージプレーティング用大腸菌を用いたタイト
レーションにより測定したｃＤＮＡ１μｇから得られた
組換ファージ数は５．０×１０^６個であった。このよう
にして作製したｃＤＮＡライブラリーは使用するまで少
量のクロロホルムを加えたＳＥ緩衝液（１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４，０．０１％ゼラチン含
有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）中、４℃で
保存した。

【００２２】３）ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子ｃＤＮＡ
の単離と塩基配列の決定 マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を
用いて〔α^３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したヒト肝臓由来Ｈ
ＧＦｃＤＮＡの一部であるＨＡＣ６９の０．２ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ断片をプローブとし、上記ｃＤＮＡライブラリ
ーからヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子のクローニングを行
った。ハイブリダイゼーション反応温度及び洗浄温度を
６０℃、洗浄液は０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝
液とし、スクリーニングを行い、陽性クローンＨＬＣ２
及びＨＬＣ３を得た。それぞれのファージから常法によ
り単離、精製したＨＬＣ２及びＨＬＣ３ｃＤＮＡを塩基
配列解析及び制限酵素切断解析に供した。図１にＨＬＣ
３の制限酵素地図、配列表・配列番号１に塩基配列の一
部及び演繹されるアミノ酸配列を示す。ヒト白血球由来
ＨＧＦクローン、ＨＬＣ３は以前に決定されたヒト肝臓
由来ＨＧＦ（Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８
９）と同様の特徴を有しているが、コード領域内の塩基
配列に３８ヶ所差異があり、その結果演繹されるアミノ
酸配列に１４ヶ所の差異を生じた。また、ＨＬＣ２ｃＤ
ＮＡはＨＬＣ３ｃＤＮＡとほぼ同一の塩基配列を有して
いるが、ＨＬＣ３ｃＤＮＡの４８４番目から４９８番目
までの塩基が欠失していた（配列表・配列番号２）。

【００２３】４）サルＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧ
Ｆ発現ベクターの構築 サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターＣＤＭ〔ｄＬ
ｅＨＧＦ〕およびＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕の構築図を図２
に示す。上記３）で得られたＨＬＣ２及びＨＬＣ３ファ
ージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、
２．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離、精製した。ＨＬＣ２及
びＨＬＣ３のＫｐｎＩ切断部位、その３’側に含有する
配列及びＨｐａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ切断部位から成
るオリゴヌクレオチド^５’ＣＡＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴ
ＧＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧ^３’、^５’ＴＣＧＡＣＣＣＧＧ
ＧＴＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣ^３’
を合成し、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプターとした。上記
ＨＬＣ２及びＨＬＣ３のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ ＤＮＡ
断片、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプター及びあらかじめ制
限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したブルースクリプ
トＫＳＭ１３＋（ストラタジーン社）を混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合して２種類のプラスミドｐＢＳ〔ｄ
ＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を得た。得られ
たｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を
制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化しＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで平滑末端とした後、あらかじめ制限酵素Ｂｓ
ｔＸＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし
たＣＯＳ細胞用発現ベクターＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，
３２９，８４０，１９８７）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合してヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターＣＤ
Ｍ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕を得た。

【００２４】５）サルＣＯＳ細胞の形質転換とヒト白血
球由来ＨＧＦ遺伝子の発現 得られたＣＤＭ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びＣＤＭ〔ＬｅＨＧ
Ｆ〕プラスミドをエタノール沈澱した後、１０ｍＭＰＢ
Ｓ緩衝液に溶解し、２μｇ／ｍｌに調製した。次に１０
％ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日水
製薬）中で飽和細胞密度まで増殖させたＣＯＳ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）を１０ｍＭＰＢＳ緩衝
液で２回洗浄した後、トリプシン処理した。同緩衝液で
３回洗浄後、細胞密度２×１０^７個／ｍｌになるように
再び同緩衝液に浮遊化した。先に調製したプラスミド溶
液２５０μｌと細胞浮遊液２５０μｌを混合し、氷冷下
で１０分間放置した。この氷冷したプラスミド細胞混液
高電圧パルス遺伝子導入装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ
社）を用いて、印加電圧４ＫＶ／１ｃｍパルス時間２０
ミリ秒の条件下で高電圧パルスをかけた。得られた細胞
を上記の培地で希釈し、３７℃５％ＣＯ_２存在下にて３
日間培養した。培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を
測定したところ、それぞれ２０単位／ｍｌ及び５単位／
ｍｌであった。一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していない
発現ベクターＣＤＭ８を同じ方法によりＣＯＳ−１細胞
に導入して培養したが、その培養上清中にはＨＧＦ活性
を認めなかった。

【００２５】実施例２ １）マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベ
クターの構築 マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクタ
ーｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７
号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２
８９８号）の構築を図３に示す。実施例１で得られたプ
ラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧ
Ｆ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで消化し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、あらかじ
め制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣ１２７細胞用発現ベ
クターｐＢＰＭＴと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
してヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕
（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨ
ＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）を得た。得られたヒ
ト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターは、ＭＴ−１プロモー
ターとＳＶ４０初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの
間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有し、この発現ベク
ターによるマウスＣ１２７細胞の形質転換はウシパピロ
ーマウィルス（ＢＰＶ）により行われる。また、形質転
換された細胞の選択は、トランスポゾンＴｎ５のｎｅｏ
遺伝子（Ｇｅｎｅ，１９，３２９，１９８２）にヘルペ
スシンプレックスウィルスタイプ１のチミジンキナーゼ
（ＨＳＶ１ ＴＫ）遺伝子由来のプロモーターとポリ
（Ａ）付加シグナルを連結したｎｅｏキメラ遺伝子によ
って可能となる。

【００２６】２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒト
ＨＧＦ遺伝子の発現 ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨ
ＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄ
ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）はＷｉｇｌｅ
ｒらの方法（Ｃｅｌｌ，１１，２２３，１９７７）によ
りマウスＣ１２７細胞へ導入した。上記（１）で得られ
た２９μｇのｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第
２８９７号）プラスミドおよびｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧ
Ｆ〕（微工研条寄第２８９８号）をそれぞれ２４０μｌ
の０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ，２８０ｍＭ ＮａＣｌ及び１．５ｍＭリン酸ナト
リウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）、
２４０μｌを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を
続け、プラスミドとリン酸カルシウムの共沈澱を形成さ
せた。あらかじめ、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）及
び１０ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地（日水製
薬）を用いて５×１０^５個のＣ１２７細胞を５％ＣＯ_２
の存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した
後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈澱を加え、室温
で２０分間放置した。さらに３７℃で４時間インキュベ
ートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加し
た１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、室温で５分間放置し
た。培地で細胞を洗浄した後、培地交換し、さらに３７
℃で２日間インキュベートした。細胞を１０倍に希釈し
て１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社）を含む同培地を
用いて５％ＣＯ_２の存在下で３７℃、７日間培養して形
質転換細胞を得た。得られた細胞株から培養上清中のＨ
ＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニングし、
ヒト白血球由来ＨＧＦ高生産株ＢＰＩ−１４株（ｐＢＰ
ＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号））及び
ＢＰＤ−２７株（ｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研
条寄第２８９８号））を得た。これらの細胞の培養上清
中のＨＧＦ生産能はそれぞれ１２万単位／１／日、１５
万単位／１／日であった。

【００２７】実施例３ １）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由
来ＨＧＦ発現ベクターの構築 チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由来Ｈ
ＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研
条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕
（微工研条寄第２９００号）の構築図を図４に示す。実
施例１で得られたプラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及び
ｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩと
ＳａｌＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
とした後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣ
ＨＯ細胞用発現ベクターｐＥＶＳＳＶと混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合してヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベク
ターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９
９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄
第２９００号）を得た。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ
発現ベクターはＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）
付加シグナルの間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有す
る。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にＳＶ４０初期プロ
モーターとポリ（Ａ）付加シグナルで連結したＤＨＦＲ
キメラ遺伝子により可能となる。

【００２８】２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の
形質転換とヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子の発現 ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔Ｌｅ
ＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ
〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号）は実施例
２と同様にしてチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞に導入した。得られた
細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
を含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と
１％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むα−
ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて、培養上
清中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニ
ングした。発生したコロニーは、安定なヒト白血球由来
ＨＧＦ高生産株を得るために、同培地において９世代ま
で増殖させた。この細胞株は１００ｎＭ、２５０ｎＭ、
５００ｎＭ、７５０ｎＭ、及び１０００ｎＭとメソトレ
キセートの濃度を順次増加させながら同培地で生育さ
せ、さらに安定なヒト白血球由来ＨＧＦ高産生株ＥＶＩ
−６５株（ｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第
２８９９号））及びＥＶＤ−１０４株（ｐＥＶＳＳＶ
〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号））を得
た。これらの細胞のヒト白血球由来ＨＧＦ産生能はそれ
ぞれ９万単位／１／日、１３万単位／１／日であった。

【００２９】実施例４ 形質転換Ｃ１２７細胞培養上清からの組換ヒト白血球由
来ＨＧＦの精製 実施例２で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生マウスＣ
１２７組換細胞株ＢＰＤ−２７（１５塩基欠失型ＨＧＦ
産生株）の培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦ
を精製した。 １）陽イオン交換クロマトグラフィー ＢＰＤ−２７株の培養液５００ｍｌに終濃度０．０１％
となるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベクスＨ
Ｖフィルター（日本ミリポア・リミテッド）により濾過
した。この濾液に１／２０容の１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ，１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
８０、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．６ｃｍ、高
さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄
後、０．１５Ｍから１．０ＭのＮａＣｌによる直線濃度
勾配（全量１００ｍｌ）で吸着物を溶出した。クロマト
パターンを図５に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、
Ｓ−セファロース溶出液とした。

【００３０】２）アフィニティークロマトグラフィー Ｓ−セファロース溶出液を１Ｎ酢酸でｐＨ７．５に調整
後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で
希釈し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．
３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．
５）で平衡化した。ヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ）高さ３
ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３
Ｍから２．０ＭのＮａＣｌによる直線濃度勾配（全量３
０ｍｌ）により溶出した。そのクロマトパターンを図６
に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、ヘパリン溶出液
とした。

【００３１】３）逆相ＨＰＬＣ ０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ｖ／ｖ％）を含む
蒸留水で平衡化したフェニル５ＰＷ ＲＰカラム（トー
ソー社製、内径０．７５ｃｍ、高さ７．５ｃｍ）にヘパ
リン溶出液を添加し、０．１％ＴＦＡを含む０％から９
０％へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行っ
た。組換ヒト白血球由来ＨＧＦは約４０％のアセトニト
リル濃度にて溶出された。そのクロマトグラムを図７に
示す。精製された組換ヒトＨＧＦの収量は約２０μｇで
あり、培養上清液からの活性回収率は１８％であった。

【００３２】４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 前記３段のクロマトグラフィーで精製された１５塩基欠
失型ヒト組換白血球由来ＨＧＦを２−メルカプトエタノ
ール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動にかけた。結果を図８に示す。精製組換ＨＧＦ
は非還元条件（２−ＭＥ（−））では分子量７万〜９万
の単一バンドを示し、還元条件下（２−ＭＥ（＋））で
は、分子量６万〜７．５万のα鎖と分子量３万〜４万の
β鎖に分かれた。即ち組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなる
ヘテロダイマーであることが示された。

【００３３】５）組換ヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基
欠失型）の肝細胞増殖活性 ラット初代培養肝実質細胞は、現在知られているｉｎ
ｖｉｔｒｏの系の中では最もｉｎ ｖｉｖｏに近い肝機
能を持つ系である。「ＨＧＦ活性の測定法」に記述した
方法に従って得たラット肝実質細胞に対し、精製した１
５塩基欠失型組換ヒト白血球由来ＨＧＦを添加したとこ
ろ、１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で強い細胞増殖を誘起し
た。この培養系に増殖活性を示す因子としては他にもイ
ンスリンやＥＧＦがあるが、該組換ＨＧＦは単独で両者
よりも強い活性を有し、かつこれら３者の共存下では相
加的な作用を示した。

【００３４】実施例５ ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子によるチャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞の形質転換とその発現 ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ（ｄＬ
ｅＨＧＦ）（微工研条寄第２９００号）はＷｉｇｌｅｒ
らの方法（Ｃｅｌｌ，１１，２３３，１９７７）により
チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞
に導入した。約３０μｇのｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧ
Ｆ）プラスミドをそれぞれ２４０μｌの０．５Ｍ塩化カ
ルシウムに溶解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ
塩化ナトリウムおよび１．５ｍＭリン酸ナトリウムから
なる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）、２４０μｌ
を攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続けプラス
ミドとリン酸カルシウムの共沈殿を形成させた。続い
て、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミン
とを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用
いて５×１０^５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ_２存在下で３
７℃、２４時間培養した。培地交換した後プラスミドと
リン酸カルシウム共沈殿を加え室温で２０分間放置し
た。さらに３７℃で４時間インキュベートしたのち、培
地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗
浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形
質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシド
とデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％
ウシ胎児血清（ギブコ社）、２％グルタミンを含むα−
ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて安定なＨ
ＧＦ高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５
００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセ
ート濃度を順次増加させながら同培地で継代培養を繰り
返した。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生組換細胞を
クローン選別を行い、安定なヒト白血球由来ＨＧＦ産生
株５１５Ｃを得た。これらの細胞のＨＧＦ産生能は約８
０万単位／１／日であった。

【００３５】実施例６ 形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からの組換ヒト白血球由来
ＨＧＦの精製 実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生チャイニ
ーズハムスターＣＨＯ組換細胞株５１５Ｃ（１５塩基欠
失型ＨＧＦ産生株）をリボヌクレオシドとデオキシリボ
ヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎児血清（ギブコ
社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含む
α−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、そ
の培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦを精製し
た。 １）陽イオン交換クロマトグラフィー ５１５Ｃ株の培養液５００ｍｌに最終濃度０．０１％と
なるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベックスＨ
Ｖフィルター（日本ミリポア・リミテッドにより濾過し
た。この濾液に１／２０容の１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）緩衝液を加え、１５０ｍＭ ＮａＣｌを
含む緩衝液Ｃ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セフ
ァロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径
１．６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｃカラム
を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃおよび４００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ（図９で矢印Ａで印した）
で洗浄後１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ（図９で矢印Ｂ
で印した）で溶出した。クロマトパターンを図９に示
す。１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出したピーク部
分（図９で←→と印した）を集め、Ｓ−セファロース溶
出液とした。

【００３６】２）アフィニティークロマトグラフィー Ｓ−セファロース溶出液を１Ｎ塩酸でｐＨ７．５に調製
後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で
希釈し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．
３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ
７．５）で平衡化した、ヘパリン・セファロースＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ、高
さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、
０．３Ｍから２．０Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度
勾配（全量４０ｍｌ）により吸着物を溶出した。そのク
ロマトパターンを図１０に示す。ＨＧＦ活性を持つ画分
を集め、ヘパリン溶出液とした。

【００３７】３）疎水性クロマトグラフィー ４Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したフェニル５ＰＷカラム（トーソー製、
内径０．７５ｃｍ、高さ７．５ｃｍ）にヘパリン溶出液
を添加し、溶媒Ａ：４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）から溶媒Ｂ：５０％エチレ
ングリコールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）への濃度勾配により溶出を行った。ＨＧＦ活性は２
Ｍ ＮａＣｌ、２５％エチレングリコール濃度で溶出さ
れた。そのクロマトグラムを図１１に示す。精製された
組換ヒト白血球由来ＨＧＦの収量は約５００μｇであ
り、培養上清液からの活性回収率は２５％であった。

【００３８】４）精製組換ヒト白血球由来ＨＧＦの特性 ３）項で得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦの生物学
的、化学的および物理化学的特性について測定した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 組換ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下および非
還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た。泳動後ゲルは銀染色法により染色したその結果を図
１２に示す。組換ＨＧＦは非還元下で分子量７万〜９万
ダルトン、還元下では分子量６万〜７．５万のα鎖と分
子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。またβ鎖は２本のバ
ンドに分かれたが、これはβ鎖における結合糖鎖本数の
差異を示している。

【００３９】糖組成、分析（中性糖およびアミノ糖） 精製組換ＨＧＦを蒸発乾固後、２．５Ｎのトリフロロ酢
酸存在下で１１０℃、６時間加水分解した。加水分解物
を蒸発乾固後、水に再溶解し、試料とした。試料をアニ
オン交換樹脂を用いるＨＰＬＣにより糖組成、分析を実
施した。その結果フコース、ガラクトース、マンノー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミンが検出され、組換ＨＧＦ
が糖タンパクであることが確認された。

【００４０】生物活性 精製組換ＨＧＦの肝細胞増殖活性を「ＨＧＦ活性の測
定」の項に記載の方法に従って活性を測定した。その結
果、精製組換ＨＧＦの比活性は２０〜５０万ｕｎｉｔ／
ｍｇと測定された。

【００４１】実施例７ 一本鎖型組換ヒト白血球由来ＨＧＦの製造 実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基欠
失型ＨＧＦ）産生ＣＨＯ５１５Ｃ株を１０％ウシ胎児血
清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセ
ートを添加した。リボヌクレオシドとデオキシヌクレオ
シドを含有しないα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー
社）で、３７℃、５％ＣＯ_２下培養し、細胞をコンフル
エントになるまで培養した。培養後、培養液を抜き取
り、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。次で１％グルタミン
と５００μＭメソトレキセートとプロテアーゼ阻害剤で
ある４００ｕｎｉｔ／ｍｌアプロチニンを加えたα−Ｍ
ＥＭ培地（リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシド不
含）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２下培養した。約１日培
養後、培養上清液を採取し、実施例６に示す方法とほぼ
同様のクロマト操作により組換ＨＧＦを精製した。培養
上清液からの活性回収率は約１５％であった。

【００４２】精製した１５塩基欠失型組換ヒト白血球由
来ＨＧＦをＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動にかけた。
その結果を図１３に示す。精製された組換ＨＧＦは非還
元条件下で分子量７万〜９万ダルトンのバンドを示し、
更にメルカプトエタノール還元条件下でも、分子量８万
〜９万５千ダルトンの単一バンドを示した。

【００４３】この結果、得られた組換ＨＧＦは一本鎖型
のものであることが示された。更に精製されたこの一本
鎖型組換ＨＧＦの生物活性を測定した。即ち「ＨＧＦ活
性の測定」の項に記載の初代培養ラット肝細胞に対する
増殖活性を測定した。その結果一本鎖型組換ＨＧＦは肝
細胞増殖活性を示し、その比活性は実施例６の４）の項
で得られた活性とほぼ等しく、２０〜５０万ｕｎｉｔ／
ｍｇであると測定された。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２２１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−９３ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−２１８４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列

【００４５】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２１９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−９３ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−２１６９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＬＣ３の制限酵素地図である。

【図２】ＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクタ
ーの構築図である。

【図３】マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発
現ベクターの構築図である。

【図４】チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血
球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築図である。

【図５】Ｓ−セファロース溶出液のフラクションと溶出
成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を
示す線図である。

【図６】ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸
光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図
である。

【図７】逆相ＨＰＬＣにおいて、通液したアセトニトリ
ル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係を示す線図で
ある。

【図８】精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示
す。

【図９】Ｓ−セファロース溶出液のクロマトパターンを
示す線図である。

【図１０】ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の
吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線
図である。

【図１１】フェニル５ＰＷカラムクロマトグラフィーに
おける溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度および
それらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。

【図１２】精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下
でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示
す。

【図１３】精製一本鎖型組換ヒトＨＧＦの還元下および
非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パタ
ーンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 下西 学 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内 (72)発明者 清水 伸 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内 (72)発明者 猪原 泉 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内 (72)発明者 坂口 磨理子 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内 (72)発明者 浅見 修 愛知県江南市東野塔後８番１号

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコ
   ードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコ
   ードする塩基配列を発現しうる組換発現ベクター。
3. 【請求項３】 ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコ
   ードする塩基配列を発現し得る組換発現ベクターにより
   形質転換された形質転換体。
4. 【請求項４】 ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコ
   ードする塩基配列を発現しうる組換発現ベクターにより
   形質転換された形質転換体を培養し、該培養液から組換
   ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子を採取することを特
   徴とする組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子の製造
   法。
5. 【請求項５】 請求項４記載の方法にて得られた組換ヒ
   ト白血球由来肝実質細胞増殖因子。
6. 【請求項６】 請求項４記載の方法にて得られた組換一
   本鎖型ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子。