JPH10168098A

JPH10168098A - 腫瘍リンパ節転移関連抗原エピトープ

Info

Publication number: JPH10168098A
Application number: JP8340522A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Takemoto; 雅一竹元; Tsutomu Shirahama; 勉白浜; Tetsushi Matsusako; 哲史松迫; Yoshitada Oi; 好忠大井; Takashi Muramatsu; 喬村松; Yukio Asami; 幸夫浅見; Akira Murasugi; 章村杉
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 1998-06-23

Abstract

(57)【要約】【課題】癌転移関連抗原および該抗原分子上のエピト
ープを同定することを課題とする。【解決手段】膀胱癌における血液型糖鎖マーカーであ
るLTA（ミヤコグサ凝集素）に結合性の糖タンパクに対
するモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用いてヒト
膀胱癌由来培養細胞株から構築されたcDNA発現ライブラ
リーをスクリーニングした。腫瘍転移関連糖タンパクを
コードするcDNAクローンを得、該クローンがコードする
タンパク質上のエピトープを同定することに成功した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医療及び診断の分
野、詳しくは癌転移の治療または予防に関する。

【０００２】

【従来の技術】膀胱癌患者の治療技術において最も重要
な問題は、リンパ節への癌の転移である。浸潤した癌細
胞が筋層を貫いていない場合（pT3a期）には患者の5年
生存率は50〜60％であるのに対し、さらに癌が進行した
場合（pT3b,pT4期）には生存率は15〜20％と著しく減少
する。このことは癌のリンパ節転移が、癌の悪化に大き
く影響することを示している(Pagano, F., et al., J.
Urol., 145, 45-50, 1991; Kakeshi, Y., et. al., Act
a Urol. Jpn., 38, 783-788, 1992; Wishnow, K., et a
l., J. Urol., 137, 408-409, 1987; Matsuda, M., et
al., Jpn. J. Urol., 77, 208-219, 1986; Noguchi,
S., et al., Acta Urol. Jpn., 39, 1131-1138, 1993;
Tsujihashi, H., et al., Jpn. J. Urol., 80, 1632-16
37, 1989)。従って、癌のリンパ節転移の機構を明らか
にすることは、癌の効果的な治療方法を開発する上で重
要である。

【０００３】悪性腫瘍における糖鎖抗原、特に血液型関
連抗原の発現について、多くの報告がなされている。こ
のうちのいくつかの糖鎖抗原については、癌の転移に重
要な役割を果たしていることが明らかにされている。(M
uramatsu, T., et al., Glycobiology, 3, 291-296, 19
93; Nakagoe, T., et al., Cancer, 92, 2323-2330,199
3; Narita, T., et al., Cancer, 71, 3044-3053, 199
3; Hoff, S. D., et al., Cancer Res., 49, 6883-688
8, 1989)。結腸癌の血行性転移に関しては、癌細胞表面
に発現しているシアリル Le^x抗原とシアリル Le^a抗原
（血液型関連糖鎖抗原）が、血管内皮細胞表面に発現し
ている接着分子Ｅ−セレクチンに対するリガンドとして
機能しており、癌転移を促進していると考えられている
(Hoff, S.D., et al., Cancer Res., 49, 6883-6888, 1
989; Takada, A., et al., CancerRes., 53, 354-361,
1993; Takada, A., et al., Biochem. Biophys. Res. C
omm., 179, 713-719, 1991)。生理学的に、この接着分
子は、血管内皮細胞に対する白血球の接着の開始期にお
いて、重要な役割を果たしていることが知られている(L
asky, L. A., et al., Science, 258: 964-969, 199
2)。

【０００４】以前本発明者らは、膀胱癌における血液型
糖鎖マーカー、すなわち、Le^x、シアリルLe^x、およびミ
ヤコグサ凝集素（Lotus tetragonolobus agglutinin：
以下LTAと記載する）に対する結合部位の発現を研究
し、これらのマーカーの強力な発現が、癌のリンパ節転
移の形成と相関し、その結果として、予後の悪さと相関
していることを報告した(Matsusako, T., et al., Bioc
hem. Biophys. Res. Commun., 181, 1218-1222; Shirah
ama, T., et al., J. Urol., 148, 1319-1322, 1992; S
hirahama, T., et al., Cancer, 72, 1329-1334, 1993;
Shirahama, T.,et al., J. Urol., 147, 1659-1664, 1
992; Yagi, S., J. Urol., 80, 682-690,1989)。

【０００５】さらに本発明者らは、膀胱癌細胞から単離
されたLTA結合性糖タンパク質に対するモノクローナル
抗体を作製した。そして、これらのモノクローナル抗体
のうちの一つである「MM4抗体」と反応する「MM4抗原」
の原発腫瘍部における発現と、癌のリンパ節転移の形成
とが相関していることを見いだした。「MM4抗原」はま
た、リンパ節の癌転移巣で強く発現していた(Matsusak
o, T., et al., Histochem. J., 24, 805-810, 1992)。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、悪性腫
瘍細胞においては、糖鎖抗原、特に血液型関連抗原の発
現が観察されることが多く、いくつかの糖鎖抗原につい
ては、癌の転移に重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている。従って、癌細胞において該抗原を単離
し、その分子構造を明らかにすることは、癌転移の機構
の解明、ひいては、癌の転移の治療または予防に関して
有益である。

【０００７】本発明は、癌転移関連抗原の同定と、該抗
原分子上のエピトープの同定を行うことを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト膀胱
癌由来培養細胞株から単離されたLTA結合性糖タンパク
に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いて、
ヒト膀胱癌由来培養細胞株から構築されたcDNA発現ライ
ブラリーをスクリーニングし、腫瘍転移関連糖タンパク
をコードするcDNAクローンを得、該クローンがコードす
るタンパク質上のエピトープを同定することに成功し、
本発明を完成した。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】本発明者らは、ヒト膀胱癌由来培養細胞株
である「BOY細胞」から単離されたLTA結合性糖タンパク
に対するモノクローナル抗体である「MM4抗体」を用い
て、該BOY細胞から構築された発現ライブラリーをスク
リーニングし、2つのクローン「ST-1」及び「ST-2」を
得た。該2つのクローンのインサートとβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を融合させたDNAの発現産物は、いずれも
「MM4抗体」と反応した。（なお、MM4抗体は、β−ガラ
クトシダーゼそのものとは反応しなかった。）また、こ
れらの2つのクローンのDNA配列から推定されるアミノ酸
配列はそれぞれ「Pro-Gly-Pro-Glyモチーフ」または「P
ro-Ala-Pro-Alaモチーフ」の2つの繰り返しを含んでい
た。

【００１０】さらに、上記のcDNAインサートをプローブ
として用いて前記ライブラリーを再スクリーニングし、
より長いcDNAを得た。この2つのクローンから由来したD
NA配列は重複部分を有しなかったので、それぞれ異なっ
たタンパクをコードするものと考えられた。「ST-1」の
延長されたインサートの長さは約1.3kbであり、「ST-
2」の延長されたインサートの長さは約1.0kbであった。
該「ST-1」の延長されたインサートについての塩基配列
を配列番号：1に、該「ST-2」の延長されたインサート
についての塩基配列を配列番号：2にそれぞれ示す。

【００１１】BOY細胞から得られたポリ(A)⁺RNAについ
てノーザンブロット解析を行ったところ、「ST-1」に対
応するmRNAは約5kbであり、一方「ST-2」に対応するmRN
Aは約3.5kbであった（図１）。従って、前記の延長され
たcDNAも、全長ではないことが判明した。

【００１２】「ST-1」及び「ST-2」の延長されたインサ
ートは、いずれもオープンリーディングフレームを含ん
でいた。これらの発現タンパク質の推定アミノ酸配列を
分析したところ、「ST-1」由来のタンパク（ST-1タンパ
ク）は「Pro-Gly-Pro-Glyモチーフ」の2つの繰り返し
（図5／配列番号：4に対応）を含み、「ST-2」由来のタ
ンパク（ST-2タンパク）は「Pro-Ala-Pro-Alaモチー
フ」の4つの繰り返し（図6／配列番号：5に対応）を含
んでいることが判明した。判明した「ST-1タンパク」と
「ST-2タンパク」のアミノ酸配列の間には、上記モチー
フを除いて同一性または相同性が全く存在しないので、
「Pro-Gly(又はAla)-Pro-Gly(又はAla)」の繰り返し
が、「MM4抗原」のエピトープであることが判明した。

【００１３】「ST-1タンパク」及び「ST-2タンパク」の
推定される部分配列は、これまで報告された他の如何な
るタンパクのアミノ酸配列とも類似性を有しなかった。
「ST-1タンパク」の配列は、プロリン、セリン及びスレ
オニンに富んでおり、ムチンもまたこれらのアミノ酸に
富むことが知られているので、「ST-1タンパク」は新規
なムチン型糖タンパクであると推定される。「ST-2タン
パク」の部分配列は、「SXXXNHGPAPA配列」の4つの繰り
返し構造を有している（アミノ酸一文字表記は「生化学
辞典（第2版）、東京化学同人、1990、第1468頁」の記
載に従う。なお、Xはいかなるアミノ酸であってもよ
い）。繰り返し構造の存在はムチンの特徴であり、「ST
-2タンパク」もまたムチン型糖タンパクであると考えら
れる。

【００１４】本発明者らは「ST-1タンパク」とマルトー
ス結合タンパク(MBP)との融合タンパク質(ST-1-MBP)に
対するウサギ抗体（抗ST-1-MBP抗体）を作製した。アフ
ィニティーカラムを用いて精製された「抗ST-1-MBP抗
体」は、BOY細胞抽出物由来の60kDaタンパクと強く反応
した（図2A）。「MM4抗体」もまた、BOY細胞から単離さ
れたLTA結合性糖タンパクのうちの60kDaのバンドとのみ
反応した。従って、本発明者らは、ST-1は60kDaタンパ
クの部分配列をコードすると結論づけた。（「ST-1」に
おける推定オープンリーディングフレームは、42kDaの
ポリペプチドをコードしており、これは「ST-1タンパ
ク」の部分配列であると考えられる。）なお、「抗ST-1
-MBP抗体」とわずかに反応する80kDaのバンドが検出さ
れたが、これは交差反応によるノイズであると考えられ
た。

【００１５】「抗ST-1-MBP抗体」は、正常膀胱粘膜とは
殆ど反応せず（図3A）、また膀胱の移行上皮癌の原発腫
瘍部に対する反応性は概して弱かった（図3B、表1）。
しかし、リンパ節転移巣に対しては、7例中6例におい
て、強い反応が見られた（図3CおよびD、表1）。

【００１６】

【表１】リンパ節転移で強力な陽性を示した6例中4例において
は、「抗ST-1-MBP抗体」は原発癌と反応しないか、また
は反応したとしてもその程度は弱いものであった。これ
らの結果は、「ST-1タンパク」はリンパ節の転移巣で発
現しているが、原発腫瘍ではその発現が概して弱いかま
たは全く発現していないことを示すものである。従っ
て、「ST-1タンパク」は原発腫瘍や正常膀胱粘膜に比較
して、リンパ節の転移巣で優先的に発現しているタンパ
ク質であると考えられる。本発明者らは、「ST-1タンパ
ク」がリンパ節における転移巣で優先的に発現している
ことから、該タンパク質を「ST-1メタネスチン（metane
stin）」と命名した。

【００１７】また、本発明者らは、「ST-2タンパク質」
に特徴的な「Pro-Ala-Pro-Ala」の繰り返しモチーフを
含むペプチドを合成し、これに対する抗体を作製した。
この抗体は、BOY細胞抽出物のウエスタンブロッティン
グにおいて、100kDaタンパクと反応した（図2B）。ま
た、この抗体は、表層の細胞とわずかに反応したが膀胱
粘膜の基底細胞とは反応しなかった（図4A）。さらにま
た、この抗体は、原発癌及びリンパ節転移の双方に反応
した（図4BおよびC）。しかし、リンパ節転移において
は、原発癌よりも高い頻度で強い反応が観察された（表
2）。

【００１８】

【表２】従って「Pro-Ala-Pro-Ala」モチーフを有する100kDaタ
ンパクもまた、リンパ節における転移巣で優先的に発現
していると考えられる。

【００１９】本発明者らはさらに、「ST-1」の塩基配列
をもとにPCRプライマーを作製し、BOY細胞から抽出した
全RNAを用いてRT-PCR法を実施し、プラークハイブリダ
イゼーション用のプローブを得、このプローブを用いて
「ST-1」cDNAの全長を得ることに成功した。全長「ST-
1」cDNAの塩基配列を配列番号：3に、該塩基配列から推
定されるアミノ酸配列を配列番号：6にそれぞれ示す。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質またはペプチ
ドのアミノ酸配列は、「Pro-Gly-Pro-Gly」または「Pro
-Ala-Pro-Ala」なるアミノ酸配列モチーフを含むもので
あり、例えば、配列番号：6に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質が含まれる。また、該アミノ酸配列モチ
ーフを含む限り、例えば、配列番号：6に記載のアミノ
酸配列を有するタンパク質の構成アミノ酸の1個または
複数個を、他のアミノ酸で置換したり、挿入付加した
り、または欠失させたものも本発明に含まれる。したが
って、本発明のタンパク質はこれらの改変タンパクを含
み、本発明のDNAは、これらの改変タンパク質をコード
する全てのDNAを含む。

【００２１】また、本発明は、DNAが「Pro-Gly-Pro-Gl
y」または「Pro-Ala-Pro-Ala」なるアミノ酸配列モチー
フ配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする限
り、配列番号：1〜3に示すDNA配列、該DNA配列と相補的
なDNA配列からなる一本鎖DNA若しくはこれらのDNAから
なる二本鎖DNA、またはそれらのDNAの一部を包含する。
それぞれのDNAは100bp以上であることが好ましく、より
好ましくは200bpの長さであり、その長さは、タンパク
質の発現、プローブ、プライマー、アンチセンス等の所
望の用途に依存する。また、本発明のcDNAを用いてゲノ
ムDNAを単離することは当業者にとって容易であるの
で、本発明にはこのようにして得られたゲノムDNAも含
まれる。

【００２２】さらにまた、本発明のタンパク質またはペ
プチドに対する抗体、または「Pro-Gly-Pro-Gly」また
は「Pro-Ala-Pro-Ala」を含むエピトープに対するモノ
クローナル抗体も、本発明に含まれる。抗体の製造方法
としては、タンパク質やペプチドを抗原として動物に免
疫し、この動物の血清より抗体を得る方法や、タンパク
質やペプチドを適当な担体と共にマウスに免疫し、この
マウスより採取したBリンパ球とミエローマ細胞を融合
させ、免疫した抗原又は目的とするエピトープを認識す
る抗体を産生するハイブリドーマを選択し増殖させモノ
クローナル抗体を得る方法等がある（Kohler,G.and C.M
ilstein,1975,Continuous cultures of fused cells se
creting antibody of predefined specificity,Nature
256:495-497）。

【００２３】本発明のDNAがコードするタンパクの発現
は、以下に示す方法またはベクターを用いて簡単に大腸
菌、酵母、哺乳類培養細胞で行うことが可能である。

【００２４】大腸菌の場合、推定されるATGコドンの直
上流、または分泌シグナル配列が切断されると思われる
アミノ酸の直上流に、「5'AGGAG(N)₈3'」なる配列を連
結し、しかる後適当なプロモーター（たとえばλP_Lプロ
モーター、lacプロモーター、T7プロモーターなど）の
下流に挿入することが好ましい。このDNAを大腸菌用ベ
クターに組み込み、大腸菌を形質転換後、プロモーター
の作動する環境下で、組換え大腸菌を培養することで発
現を行うことができる。

【００２５】酵母における発現は、リーディングフレー
ムを適当なプロモーター（例えばpHIL-D2（Invitrogen
社））の下流に挿入した酵母用発現ベクターを、適当な
酵母宿主（例えばピキア酵母）に導入し、形質転換体を
取得し、適当な培地で培養することで容易に行うことが
できる。

【００２６】哺乳動物細胞における発現は、リーディン
グフレームを適当なプロモーター（例えばpCDM8（Invit
rogen社）またはpcDNAIのサイトメガロウイルスプロモ
ーター）の下流に挿入した哺乳動物細胞用発現ベクター
を、適当な哺乳動物細胞宿主（例えばCOS細胞）に導入
し、形質転換体を取得し、適当な培地で培養することで
容易に行うことができる。

【００２７】また、本発明のタンパク質またはペプチド
は、化学合成によって製造することも可能である。合成
法の一例としては、アミノ基を保護したアミノ酸のカル
ボキシル基とカルボキシル基を保護したアミノ酸のアミ
ノ基とを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を
用いて縮合させてペプチドを合成する方法がある。その
他、アミノ酸の遊離のアミノ基に反応させようとするア
ミノ酸をN-カルボキシルアミノ酸無水物（NCA）として
結合させる方法や、カルボキシル基をp-ニトロフェノー
ル、ペンタクロロフェノールなどでエステル化し、いわ
ゆる活性エステルとしてペプチドを合成する方法がある
（新実験化学講座、19-I巻、253頁）。

【００２８】本発明のタンパク質またはペプチドは、癌
細胞、特に転移癌細胞に選択的に発現しているので、該
タンパク質またはペプチドに対する本発明の抗体を用い
て、癌、特に転移した癌を検出することが可能であり、
また、癌の転移を抑制できることが期待されるる。ま
た、本発明には、メタネスチンの部分構造を有するペプ
チドも含まれるが、該ペプチドによっても、癌の転移が
抑制されることが期待される。

【００２９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を記載するが、本発
明はこれらの実施例に限定されない。

【００３０】［実施例１］ cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリーの作製やその他の解析に使用するBOY
細胞は、転移性の悪性膀胱癌から樹立された細胞である
（Kayajima, et al., J. Urol. Surg, 2, 577-580, 198
9）。BOY細胞を、10％牛胎児血清を加えたダルベッコ変
法イーグル最小必須培地にて5％CO₂存在下37℃で培養し
た。培養されたBOY細胞より、全細胞RNAをグアニジンイ
ソチオシアネート／セシウムクロリド法(Maniatis, T.,
et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd
Ed., Cold Springs harbor Laboratory, Cold Springs
Harbor, NY, 1989, 7.18-7.25)により抽出した。次に、
全細胞RNAから、ポリ(A)⁺RNAをオリゴ(dT)セルロース
カラムクロマトグラフィー(Maniatis, T., et al, Mole
cular Cloning 2nd Ed., 7.26-7.29)により調製した。
ポリ(A)⁺RNAからのcDNAの合成には、cDNA合成キット
（アマシャム社）を用いた。まず第1鎖をオリゴ(dT)とN
6ランダムプライマーを用いて合成し、DNAポリメラーゼ
で第2鎖を合成した後、T4 DNAポリメラーゼによりcDNA
両端の平滑化を行った。この後、cDNAラピッドクローニ
ングシステム（アマシャム社）を用い、cDNAの両端にEc
oRIアダプターをライゲーションし、セファロース4Bに
よるカラムクロマトグラフィーで余分なEcoRIアダプタ
ーを除去した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより両
末端をリン酸化した。EcoRIで消化し、牛腸由来アルカ
リホスファターゼ(CIP)で脱リン酸化したλgt11と該二
本鎖cDNAをライゲーションした後、λ粒子中にパッケー
ジングした。

【００３１】［実施例２］ cDNAライブラリーのスクリ
ーニング「MM4モノクローナル抗体」(Matsusako, T. et al.: Hi
stochem. J.: 805-810, 1992)を用いて、YoungとDavis
の方法(Young, K. A. and Davis, R. W., Proc.Natl. A
cad. Sci. USA, 80, 1194-1198, 1983)をSchuhらが修飾
した方法(Schuh, R., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 83, 1364-1368, 1986)により、cDNAライブラリー
のスクリーニングを行った。この結果、500,000個のフ
ァージプラークから2個の陽性クローンを得た。これら
の陽性クローンから、ファージDNAをプレートライセー
ト法(Maniatis, T., et al.,Molecular Cloning 2nd E
d.)に従って調製した。該ファージDNAより、cDNA断片を
制限酵素EcoRIで切り出し、Bluescript SK(-)ベクター
（STRATAGENE社）のEcoRI部位にサブクローニングし
た。

【００３２】cDNAの塩基配列をダイデオキシ法(Sanger,
F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-
5467, 1977)を用いて決定した結果、2個の陽性クローン
はそれぞれ352塩基と65塩基の長さであった。両者の塩
基配列に一致する領域はなかった。λgt11ファージベク
ター中のβーガラクトシダーゼのリーディングフレーム
より推定される2つのcDNAのリーディングフレーム、お
よびそこから予想されるアミノ酸配列を比較し、MM4抗
体に共通なエピトープとなるようなアミノ酸配列を検討
したところ、Pro(Gly/Ala)Pro(Gly/Ala)なる配列が両者
に共通するアミノ酸配列であった。

【００３３】これらの2つのクローンをそれぞれプロー
ブとして、前記のcDNAライブラリーからさらに長いcDNA
をプラークハイブリダイゼーション法(Maniatis, T., e
t al.,Molecular Cloning 2nd Ed.)を用いてスクリーニ
ングした。約2,000,000個のプラークをスクリーニング
した結果、約1.3kbのcDNA断片と約1.0kbのcDNA断片が得
られた。これら2つのcDNA断片の全塩基配列を決定し
た。前者のcDNA断片は全長1258塩基で、予想されるリー
ディングフレーム中に終止コドンは存在しない（配列番
号：1）。後者のcDNA断片は957塩基で、予想されるリー
ディングフレーム中に終止コドンが存在する（配列番
号：2）。また、3'末端にはポリ(A)付加シグナルおよび
ポリ(A)鎖が見出された。

【００３４】［実施例３］ cDNA断片の発現［実施例２］で最初に得られた2つのファージクローン
を大腸菌BNN103に感染させ、各ファージクローンに対す
る溶原菌(Maniatis, T., et al.,Molecular Cloning 2n
d Ed.)を得た。各溶原菌は、LB培地中30℃でOD₆₀₀=0.45
まで培養した後、42℃で20分処理した。ここに、イソプ
ロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)を10mMで添加し、
37℃で2時間振とう培養した後、小型遠心機にて12,000
x g、4℃で、30秒遠心集菌した。細胞をSDS-PAGE用試料
緩衝液（Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-685, 197
0）に懸濁し、100℃で5分処理した後、SDS-8％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離した。分離後のタンパク
をゲルからニトロセルロースフィルターに電気的に転写
し（Towbin,, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA,
76, 4350-4354, 1979参照）、「MM4モノクローナル抗
体」を用いたウエスタンブロッティング解析を行った(M
aniatis, T., et al.,Molecular Cloning 2nd Ed.)。こ
の結果、352塩基の断片を有するλgt11溶原菌では、「M
M4抗体」と反応する分子量約128kDのタンパクが検出さ
れた。これは、分子量116kDaのβ−ガラクトシダーゼ
に、352塩基のDNA断片がコードするアミノ酸が加わった
分子量と一致する。また、65塩基の断片が挿入されたλ
gt11溶原菌では、「MM4抗体」と反応する分子量約118kD
のタンパクが発現されており、これはβ−ガラクトシダ
ーゼに、65塩基のDNA断片がコードするアミノ酸が加わ
った分子量と一致する。したがって、両DNA断片から翻
訳されるタンパクはいずれも、「MM4抗体」と反応し、
そのリーディングフレームはβ−ガラクトシダーゼのリ
ーディングフレームから推定されるものであると考えら
れる。

【００３５】［実施例４］「ST-2合成ペプチド」に対
するウサギ抗血清の調製配列番号：2の塩基配列にコードされるアミノ酸配列の
うち、「GPAPASAGGDHSPAPAS（配列番号：7）」（アミノ
酸一文字表記は「生化学辞典（第2版）、東京化学同
人、1990、第1468頁」の記載に従う）の部分を合成し
（「ST-2合成ペプチド」と呼ぶ）、分枝状ポリリジンオ
リゴマーに結合させた。該ペプチド複合体1mgをフロイ
ント完全アジュバンドと混合し、ニュージーランド白ウ
サギを免疫した。免疫は2週間おきに3回行った。最後の
免疫をした日より10日後に抗血清を採取した。

【００３６】5mgの前記合成ペプチドを1mlのCNBr活性化
セファロース4B（ファルマシア社）に、添付された手順
書に従って結合させ、抗体精製用のアフィニティーカラ
ムリガンドとした。適当な容積のカラムに該リガンドを
充填し、20mM Tris-HCl(pH7.0)緩衝液にて平衡化した。
2mlの抗血清を20mM Tris-HCl(pH7.0)緩衝液中にて透析
し、上記のアフィニティーカラムに通した。カラムをカ
ラムベッド体積の10〜20倍容の20mM Tris-HCl(pH7.0)緩
衝液にて洗浄した後、抗体を0.1Mグリシン-HCl(pH2.5)
緩衝液で溶出し、即座に1.5M Tris-HCl(pH8.8)緩衝液を
添加して中和した。抗体溶液は、1mg/ml終濃度の牛血清
アルブミンを加え、-80℃で使用時まで保存した。

【００３７】［実施例５］「抗ST-2合成ペプチド抗
体」によるST-2タンパクの検出 BOY細胞をレムリ（Laemmli）試料緩衝液にて溶解し、細
胞抽出物をSDS-8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離した。分離後のタンパクは電気的にニトロセルロー
スメンブランフィルターに転写した。該メンブランフィ
ルターを、1次抗体として［実施例4］で得られた「抗ST
-2合成ペプチド抗体」で処理した後、2次抗体としてペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗体と反応させ
た。検出は、0.1M Tris-HCl(pH7.6)緩衝液（0.05％ 4-
クロロナフトール、0.05％過酸化水素）にニトロセル
ロースメンブランフィルターを浸して行った。この結
果、「抗ST-2合成ペプチド抗体」は、分子量約100kDの
タンパクと反応した（図2B）。従って、このcDNAがコー
ドするタンパクは、「MM4抗体」が反応する主要な分子
量60kDのタンパクとは異なるものであった。

【００３８】［実施例６］「ST-1-MBP」に対するウサ
ギ抗血清の作製配列番号：1のヌクレオチド462-813位のcDNA断片を、λ
gt11から制限酵素EcoRIで切り出した。該断片を、マル
トース結合タンパク(MBP)との融合タンパク作製用ベク
ターである「pMAL-c2」（New England Bio Labs社より
購入）のEcoRI部位にMBPとリーディングフレームが合う
ように挿入した。得られた複合プラスミドで大腸菌TR-1
株を形質転換した。その組換え体をIPTG存在下で培養す
ることで融合タンパク（「ST-1-MBP」と呼ぶ）の発現を
誘導し、遠心集菌後、カラム緩衝液（20mM Tris-HCl(pH
7.4)、0.2M NaCl、1mM EDTA、10mM 2-メルカプトエタノ
ール、1mM NaN₃）に懸濁した。次に、懸濁した細胞を超
音波破砕機で破砕処理後、14,000 x gで20分間遠心して
上清を回収し、30mlのアミロースレジンカラム（NewEng
land Bio Labs社）に通した。カラムをベッド体積の10
倍容のカラム緩衝液で洗浄した後、「ST-1-MBP」を10mM
マルトース溶液で溶出させた。溶出した「ST-1-MBP」1
00μgをフロイント完全アジュバンドと混合し、前記と
同様の方法によりウサギを免疫することにより、「抗ST
-1-MBP抗体」が得られた。

【００３９】また、該「抗ST-1-MBP抗体」をさらに精製
するためのアフィニティクロマトグラフィーカラムを調
製するため、別のcDNA断片（配列番号：1／611-1255
位）を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タン
パク作製用ベクターpGEX-5X-3（ファルマシア社）のマ
ルチクローニング部位に、リーディングフレームが合う
ように挿入した。該複合プラスミドで大腸菌JM109株を
形質転換し、組換え体を取得した。組換え体細胞はIPTG
存在下で培養して、融合タンパクを発現させ、その後、
遠心して細胞を集めた。集めた細胞を、ダルベッコ変法
リン酸緩衝液［PBS(-)］に懸濁し、超音波破砕機で破砕
し、破砕液を14,000 x gで20分間遠心し、上清を回収し
た。あらかじめカラムベッド体積の10倍量のPBS(-)で平
衡化したグルタチオンセファロース（ファルマシア社）
カラム（10ml）に、前記の細胞破砕液を通した。カラム
をカラムベッド体積の30倍のPBS(-)で洗浄した後、10mM
グルタチオンを含む50mM Tris-HCl(pH8.0)で融合タン
パクを溶出させた。溶出液を0.5M NaCl、0.1M NaHCO₃(p
H8.3)を含む水溶液中で透析し、得られた融合タンパク
を、CNBr活性化セファロース（ファルマシア社）に、添
付の手順書に従って結合させ、アフィニティークロマト
グラフィー用担体とした。これを用いて上記の「抗ST-1
-MBP抗体」を精製した。

【００４０】［実施例７］「抗ST-1-MBP抗体」による
「ST-1タンパク」の検出［実施例5］と同様に、［実施例6］で得られた「抗ST-1
-MBP抗体」を用いて、BOY細胞抽出タンパクに対するウ
エスタンブロッティング解析によって「ST-1タンパク」
を検出した。この結果検出されたタンパクの分子量は約
60kDであり（図2A）、「MM4抗体」が認識する主要なタ
ンパクの分子量と一致した。したがって、「MM4抗体」
が認識する主要なタンパクをコードしているのは、配列
番号：1のcDNAであると考えられる。

【００４１】［実施例８］癌組織片の免疫組織化学染
色膀胱癌移行上皮癌（原発巣およびリンパ節転移巣）から
採取した癌組織片をPBS(-)-ホルムアミド溶液で固定
し、さらにパラフィンで包埋した。包埋した組織片を4
μmの厚さで切断していった。組織由来のペルオキシダ
ーゼを失活させるため、0.3％過酸化水素−メタノール
溶液中で30分間処理した。その後、切片をPBS(-)で洗浄
し、正常ヤギ血清（ニチレイ社製）で室温で15分間処理
し、アフィニティー精製した抗体（［実施例4］の「抗S
T-2合成ペプチド抗体」または［実施例6］の「抗ST-2-M
BP抗体」）を7〜10μg/ml加え、さらに室温で１時間反
応させた。PBS(-)で洗浄後、切片をビオチン化ヤギ抗ウ
サギIgG抗体（ニチレイ社製）で室温で10分間処理し、
次いでアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体
（ニチレイ社製）で室温で5分間処理をした。発色は、
0.05％ 3,3-ジアミノベンジジンと0.008％過酸化水素を
加えた0.61M Tris-HCl緩衝液(pH7.4)で室温で5分間処理
することにより行った。この後、滅菌水での洗浄、ヘマ
トキシリンでの副染色、脱水処理、キシレンでの洗浄の
順で操作を行い、パーマウントで表装した。比較対照と
して、抗体を加えない正常ウサギ血清で切片を処理し
た。上記の方法を用いて、24例の原発巣組織と10例の転
移巣組織について解析した。

【００４２】「抗ST-1-MBP抗体」を用いた場合、正常の
尿路上皮ではほとんど反応がなく（図3A）、膀胱癌原発
巣では弱い反応しか認められなかったが（図3B）、リン
パ行性転移を起こしている膀胱癌の転移巣では強い反応
があった（図3CおよびD）。さらに、リンパ行性転移が
認められ抗ST-1-MBP抗体で強く染まる6症例中、4症例の
原発巣組織において抗60kD抗体が示した反応は弱かっ
た。

【００４３】「抗ST-2合成ペプチド抗体」を用いた場合
にもほぼ同様の結果が得られたが、「ST-1タンパク」ほ
ど原発巣と転移巣の差は見られなかった（図4）。

【００４４】以上より、「ST-1タンパク」および「ST-2
タンパク」は膀胱癌の転移と関連していることが予想さ
れる。

【００４５】［実施例９］全長「ST-1タンパク」をコ
ードするcDNAのクローニング（１） cDNAライブラリーの作製全細胞RNAを、「ST-1タンパク」を発現しているヒト悪
性膀胱癌細胞であるBOY細胞より抽出した(Kaufmann and
Sharp, Mol. Cell. Biol.,1304, 1982参照)。抽出した
全細胞RNAより、mRNA精製キット（ファルマシア社製／M
aniatis, et al., Molecular Cloning 2nd. Ed., 1989,
7.26-29に記載されているようなオリゴ（dT）-セルロ
ースカラムクロマトグラフィーによる）でポリ(A)⁺ RNA
を精製した。精製されたポリ(A)⁺ RNAより、タイムセ
ーバーcDNA合成キット（ファルマシア社製）を用いてcD
NAを合成した。この際、同量のポリ(A)⁺RNAを用いて、
オリゴdTプライマーまたはN₆ランダムプライマーにより
cDNAを合成し、両者を混合した。上記のcDNAを、「λZA
P Express^TMベクター」（制限酵素EcoRIで切断されCIP
処理されたものをSTRATAGENE社より購入）に、ライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いてライゲーションし
た後、「Gigapack GoldII」（STRATAGENE社製）を用い
てλファージ粒子中にパッケージングしcDNAライブラリ
ーとした。

【００４６】前記の「ST-1」cDNA部分配列をもとに合成
された「STI-5」（5' CAGACAACTGGAAGAGGAGGAAGG 3'／
配列番号：8）および「STI-3」（5' AGGCACTATGATAGGTG
CTGACTG 3'／配列番号：9）をプライマーとして、BOY細
胞から抽出した全細胞RNAを用いてRT-PCR法（宝酒造社
製RNA PCR KIT Ver.2を用い、添付された手順書に従っ
た）を行うことによって、437塩基対のDNA断片を得た。
この断片をECLラベリングシステム（アマシャム社）に
よりペルオキシダーゼ標識し、ライブラリースクリーニ
ング用のプローブとして用いた。

【００４７】（２）プラークハイブリダイゼーション
法による陽性クローンのスクリーニング直径15cmのNZYM寒天平板培地（Molecular Cloning 2nd
Ed.: A.1, A.4頁、前記）に１枚あたり50,000個のファ
ージを蒔き、37℃で一夜培養しプラークを形成させた。
4℃で2時間静置した後、ナイロンメンブレンフィルター
HATF（ミリポア社／カタログ番号HATF132 50）をプレー
ト表面に乗せ、１分間静置後、0.5M NaOH-1.5M NaCl溶
液で飽和した濾紙（アドバンテック社／514A）上に移
し、5分間処理し、次に0.5 M Tris-HCl（pH7.2）-1.5M
NaCl溶液で飽和した前記濾紙上に移して10分間静置させ
た。この後、フィルターを濾紙上室温で乾燥させ、さら
に、80℃でおよそ3時間保温した。16枚のフィルターは
0.5M NaCl-5％ブロッキングリージェント（アマシャム
社製ECL DNA/RNAラベリング検出キット）含有50mlハイ
ブリダイゼーション緩衝液（アマシャム社製ECL DNA/RN
Aラベリング検出キット）に浸し、42℃でおよそ2時間処
理した。次いで、ここにペルオキシダーゼ標識したプロ
ーブDNAを10μg/mlの濃度で加え、42℃で一夜ハイブリ
ダイゼーションを行った。フィルターは6M 尿素-0.4％S
DS-0.5xSSCにて42℃で20分間2回洗浄し、次いで2xSSCで
室温で5分間、2回洗浄した。洗浄後のフィルターは、1
分間濾紙上で風乾後、ECLシステム検出試薬（アマシャ
ム社製）で1分間処理し、オートラジオグラフィーと同
様な操作によりＸ線フィルムに感光させた。以上により
800,000個のファージプラークの中から3個の陽性クロー
ンを得た。

【００４８】（３）塩基配列の決定陽性クローンの塩基配列分析をダイターミネーターサイ
クルシーケンシングFSキット（パーキンエルマーアプラ
イドバイオシステムズ社製／Sanger, et al.,Proc. Na
t. Acad. Soc. USA, 74, 5463-5467 (1977)のジデオキ
シ法を応用）及びオートシークエンサー（パーキンエル
マーアプライドバイオシステムズ社製／モデル377）を
用いて行った。決定された塩基配列を配列番号：3に示
す。

【００４９】このcDNAには、332-445位の114塩基に渡る
部分の欠失が存在するものとそうでないものの２種類が
存在していた。

【００５０】タンパク翻訳の開始コドンと推定されるの
は302-304位のATG、560-562位のATG、563-565位のATGで
あり、終止コドンは1925-1927位のTGAである。このうち
302-304位のATGから翻訳が開始されるタンパクは、前記
のDNAの欠失によりリーディングフレームの変化なしに3
8アミノ酸が欠失するタンパクが翻訳されるため、計４
種類のタンパクが翻訳される可能性が考えられる。

【００５１】（４）オープンリーディングフレームの
推定配列番号：3に示すcDNAの全長および配列番号：3の556-
2075位の1520塩基断片をそれぞれ、発現ベクタ− pBK-C
MV（STRATAGENE社）のマルチクロ−ニング部位にサイト
メガロウイルスプロモ−タ−に対して正方向（メタネス
チンが翻訳されるような向き）に挿入した。該複合プラ
スミドをCOS7細胞にトランスフェクションした。トラン
スフェクションは、哺乳類細胞トランスフェクション・
キット（STRATAGENE社製）を用い、添付の方法書に従っ
てDEAE-デキストラン法によって行った。トランスフェ
クション操作後の細胞は、DMEM-10％牛胎児血清培地に
て37℃、5％CO₂で１日培養し、その後200μg/ml濃度でG
418（和光純薬工業社）を添加した同培地で10日間培養
した。それぞれの培養細胞を培養用ディッシュから剥離
し、ダルベッコ変法PBS緩衝液中に懸濁させた。超音波
破砕機（BRANSON社SONIFIFER Cell dispuptor 200）で3
分間処理した後、1000xgで5分間遠心分離し、上清を回
収し、全細胞抽出液とした。各10μgの全細胞抽出液をS
DS-PAGEで分離後「抗ST-1抗体」を用いたウエスタンブ
ロット解析に供した。またこの際対象としてBOY細胞とC
OS7細胞を用いた。

【００５２】どちらのcDNAを発現させた場合もCOS7にお
いて検出される約63kDのメタネスチン蛋白の明確な発現
量の増加が検出された。組換え体において検出されるメ
タネスチンの分子量が、BOY細胞において検出される分
子量60kDより若干大きいのは、細胞の種の違いに起因し
たタンパクの糖鎖修飾の違いによるものと思われる。い
ずれにしてもこの結果から、メタネスチンの翻訳開始点
は配列番号：3の556位から下流に存在することが言え
る。またエピト−プである「Pro-Gly-Pro-Gly配列」を
コードする配列（配列番号：3、683-694位）より上流側
に開始点がなければならないこと、ATG前後の塩基配列
と翻訳開始との関係に関する法則（Kozak,M., Cell, 4
4, 283-292, 1986）から考えて、560-562位のATGから翻
訳が開始される可能性が非常に高い。従って、メタネス
チンのオープンリーディングフレームは、配列番号：3
の560-1927位であると推定される。該オープンリーディ
ングフレームに対応するアミノ酸配列を配列番号：6に
示す。

【００５３】［実施例１０］種々の細胞におけるST-1
タンパク発現のウエスタンブロッティングによる解析 3種の細胞（マウス由来Ltk^-細胞、チャイニーズハムス
ター由来CHO細胞、サル由来COS7細胞）を、10％ウシ胎
児血清含有DMEM培地（日水製薬社製）にて、37℃、5％C
O₂条件下で培養した。それぞれの培養細胞を培養用ディ
ッシュから剥離し、ダルベッコ変法PBS緩衝液中に懸濁
させた。超音波破砕機（BRANSON社SONIFIFER Cell disp
uptor 200）で3分間処理した後、1000 x gで5分間遠心
分離し、上清を回収し、全細胞抽出液とした。DCタンパ
クアッセイキット（バイオ・ラッド社製）によりタンパ
クの定量を行った。該抽出液は等容の試料用緩衝液（0.
2M Tris-HCl(pH6.8)、2％SDS、10％ 2-メルカプトエタ
ノール、30％グリセロール、0.02％ブロモフェノール
ブルー）と混合後、100℃で5分処理し、第一化学薬品社
マルチゲル10〜20％アクリルアミド濃度勾配ゲルで分離
した（Laemmli, U. K.,Nature, 227, 680-685, 1970参
照）。さらに、分離されたタンパクをイモビロンPVDFメ
ンブランフィルター（ミリポア社製）に電気的に転写し
た（Towbin, H, et al.,Proc. Nat. Acad. USA, Soc.7
6, 4350-4354, 1979参照）。メンブランを、ブロッキン
グ液（4％スキムミルク、0.05％アジ化ナトリウム含
有ダルベッコ変法PBS緩衝液）中で室温で30分間処理
し、0.05％ Tween20含有ダルベッコ変法PBS緩衝液で室
温で10分洗浄した。次に、前記のブロッキング液で200
倍に希釈したウサギ抗ST-1抗体で室温で60分処理し、0.
05％Tween20含有ダルベッコ変法PBS緩衝液で室温で5
分、3回洗浄した。さらに、ブロッキング液で1000倍希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（アマシ
ャム社）で室温で60分処理後、ダルベッコ変法PBSで室
温で5分、5回洗浄した。その後、メンブランをECLシス
テム検出液（アマシャム社）で処理し、Ｘ線フィルムに
感光させて「ST-1タンパク」を検出した。この結果、
「ST-1タンパク」は、マウス由来Ltk^-細胞、チャイニー
ズハムスター由来CHO細胞、サル由来COS7細胞いずれに
も若干の分子量の違いはあるが検出された。したがっ
て、「ST-1タンパク」はマウスからヒトまで広い範囲の
生物種で保存されていると考えられる。

【００５４】［実施例１１］「ST-1タンパク」の他組
織での発現ヒト脳由来ポリ(A)⁺RNA（クロンテック社）を用いたRT
-PCR法（宝酒造社製RNA PCR Kit Ver.2を用い、添付の
手順書に従い行った）、ヒト乳腺細胞由来cDNAライブラ
リー（クロンテック社）を鋳型としたPCR法（Molecular
Cloning, 2ndEd., 14.2-14.21）を、合成DNAプライマ
ー「ST1-56」（5' TCAGCACCTATCATAGTGGCC 3'／配列番
号：10）および「ST1-33」（5' TTCTTATGCTCTCGTTCCTCC
3'／配列番号：11）を用いて行った。

【００５５】この結果、両者で配列から予想される約1k
bのDNA断片が増幅され、「ST-1」遺伝子がヒトの正常組
織においても発現していることが判明した。しかしなが
らPCR法による増幅の程度や、抗体を用いた癌部と非癌
部の組織染色の結果から、正常組織において発現してい
る「ST-1タンパク」の量は非常に少なく、また一部に構
造の違いがある可能性も考えられることが示された。

【００５６】さらに、ヒトの血球系の癌細胞であるMOLT
-4（急性Ｔ細胞白血病）細胞やK-562（慢性骨髄性白血
病）細胞から前記の方法で抽出したRNAを用いたRT-PCR
法において、「ST-1」遺伝子がこれらの細胞においても
BOY細胞と同程度に発現していることが確認された。

【００５７】以上から、「ST-1」遺伝子は、広い生物種
で保存されており、正常組織においても広範に発現され
ているが、その発現量は低いことが示された。また、多
種類の癌細胞において正常組織と比較して有意に多く発
現されていることも明らかとなった。さらに、癌化によ
って遺伝子の一部に変化が生じている可能性が考えられ
る。したがって、該遺伝子は細胞を構成する非常に基本
的な成分の一つと予想され、非常に多くの種類の細胞の
癌化、特に転移等の悪性化にともなって、発現量が増大
し、または遺伝子の一部に変化が生じていると考えら
れ、このため、細胞癌化の基本的な部分に関係している
可能性が予想される。

【００５８】

【発明の効果】本発明によって、腫瘍、特に移行上皮癌
における転移関連抗原、該抗原をコードするDNA、該抗
原のエピトープ、該抗原を認識するモノクローナル抗体
等が提供された。

【００５９】本発明は、癌転移の機構の解明に供するも
のであると同時に、癌、特に転移した癌の検出、癌の転
移の抑制などに応用することが可能である。

【００６０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1258 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CAGGGCCCTC CAGACTCAGG CGCCCCAACA AATTCCTAGA GGACCTGTGC AACAACCTCT 60 TGAGGATCGA ATCTTCACTC CCGCTGTCTC AGCAGTCTAC AGCACGGTAA CACAAGTGGC 120 AAGACAGCCG GGAACCCCTA CCCCATCCCC TTATTCAGCA CATGAAATAA ACAAGGGGCA 180 TCCAAATCTT GCGGCAACGC CCCCGGGACA TGCATCGTCC CCTGGACTCT CTCAAACCCC 240 TTATCCCTCT GGACAGAATG CAGGTCCAAC CACGCTGGTA TACCCTCAAA CCCCTCAGAC 300 AATGAATTCA CAACCTCAAA CCCGTTCTCC GCCCAGCAGA ACAGTGCCAA TACATTGCAC 360 AGACAACTGG AAGAGGAGGA AGGTTTTGGA ACAGACTCCC GTTTACAGGT CCTTGGCTGG 420 AAGAGGCTGG ATAAAATACT GCATTTTTTT CCAGAGGCCT CAAATACAGC CTCCTAGAGC 480 TACCATCCCG AACAGCAGTC CTTCCATTCG TCCTGGTGCA CAGACACCCA CTGCAGTGTA 540 CCAGGCTAAT CAGCACATCA TGATGGTTAA CCATCTGCCC ATGCCGTACC CAGTGCCCCA 600 GGGGCCTCAG TACTGTATAC CACAGTACCG TCATAGTGGC CCTCCTTATG TTGGGCCCCC 660 CCAACAATAT CCAGTTCAAC CACCGGGGCC AGGTCCTTTT TATCCTGGAC CAGGACCTGG 720 GGACTTCCCC AATGCTTATG GAACGCCTTT TTACCCAAGT CAGCCGGTGT ATCAGTCAGC 780 ACCTATCATA GTGCCTACGC AGCAACAGCC GCCTCCAGCC AAGAGAGAGA AAAAAACTAT 840 AAGAATTCGG GATCCAAACC AGGGAGGTAA AGACATAACA GAGGAGATTA TGTCTGGAGG 900 TGGCAGCAGA AATCCTACTC CACCCATAGG AAGACCCACG TCCACACCTA CTCCTCCTCA 960 GCTGCCCAGC CAGGTCCCCG AGCACAGCCC TGTGGTTTAT GGGACTGTGG AGAGCGCTCA 1020 TCTTGCTGCC AGCACCCCTG TCACTGCAGC TAGCGACCAG AAGCAAGAGG AGAAGCCAAA 1080 ACCAGATCCA GTGTTAAAGT CTCCTTCCCC AGTCCTTAGG CTAGTCCTCA GTGGAGAGAA 1140 GAAAGAACAA GAAGGCCAGA CATCTGAAAC TACTGCAATA GTATCCATAG CAGAGCTTCC 1200 TCTGCCTCCA TCACCTACCA CTGTTTCTTC TGTTGCTCGA AGTACAATTG CAGCCCCC 1258 配列番号：2 配列の長さ：957 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CTTCAAGGGG TGCAGGGAGC GGCCAGCGCT GGGGCCAGCG GGACAGGGCA GAGCCTCATC 60 GTTCTGCAGA ATGTGGGGGG TGGGGAGGCA GGGCCACAGG AAATGAGTGG GGTGCAGCTC 120 CAGCCCCTCC GACCAGCCCC AGAAGTAACC ACGGTCCAGC TCCAGCCAGC GCAGGAGGTG 180 ACCACAGTCC AGCTCCAGCC AGCACAGGAA GTAACCACGG TCCAGCTCCA GCCAGCACAG 240 GAGGTGACCA CGGTCCAGCT CCAGCCCGTG GCCGGCCAGC TCTCCAATTC CAGTGGGGGA 300 GCTGTGGCTA CTGAGGCACC CAACCTGCTG GTTGTTCAGA GCGGGGCAGC TGAGGAGTTG 360 CTCACTGGGC CCGGGGAGGC GGGGGATGGC GAGGCCAGCA CTGGTGTGGT CCAGGATGTC 420 CTCTTTGAGA CACTCCAGAC GGACGAGGGC TTGCAGAGCG TGCTGGTGCT GAGCGGGGCC 480 GATGGCGAAC AGACTCGACT CTGCGTACAG GAGGTAGAAA CACTTCCTCC TGGGCTGACG 540 GAGCCGCCTG CCACCGGCCC ACCCGGACAG AAACTCCTCA TCATCCGCAG CGCCCCAGCC 600 ACTGAGCTGC TGGACAGCAG CAACACTGGA GGAGGCACCG CCACGCTGCA GCTCCTGGCC 660 CCACCGCCGT CAGGCCCAGC CTCGGGCCCC GCGGGGCTCC CCGGGGCTCC AGCCTCCCAA 720 ATGGTGCAAG TGGTCCCCGC AGAGCTGGGC CTGGTGTAAT AACCCCTCAG GGCCTGCCCT 780 CCATCCAGAT TGTCCAGACT CTACCCGCAG TCCAGCTGGT GCACACGTTT TGAGGAGAGG 840 CAGTGATTCC CCTCCCGCCC CGCACAGAGA CCCCGACTCA CTGCCAGCCG GGGCGGGGCA 900 GGGTGCCGCA GTGGGCTTGC TAATAAAGAC CCGAGTCTCC CCAAAAAAAA AAAAAAA 957 配列番号：3 配列の長さ：2075 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：560-1927 特徴を決定した方法：E 配列 CAGGGCCCTC CAGACTCAGG CGCCCCAACA AATTCCTAGA GGACCTGTGC AACAACCTCT 60 TGAGGATCGA ATCTTCACTC CCGCTGTCTC AGCAGTCTAC AGCACGGTAA CACAAGTGGC 120 AAGACAGCCG GGAACCCCTA CCCCATCCCC TTATTCAGCA CATGAAATAA ACAAGGGGCA 180 TCCAAATCTT GCGGCAACGC CCCCGGGACA TGCATCGTCC CCTGGACTCT CTCAAACCCC 240 TTATCCCTCT GGACAGAATG CAGGTCCAAC CACGCTGGTA TACCCTCAAA CCCCTCAGAC 300 AATGAATTCA CAACCTCAAA CCCGTTCTCC GCCCAGCAGA ACAGTGCCAA TACATTGCAC 360 AGACAACTGG AAGAGGAGGA AGGTTTTGGA ACAGACTCCC GTTTACAGGT CCTTGGCTGG 420 AAGAGGCTGG ATAAAATACT GCATTTTTTT CCAGAGGCCT CAAATACAGC CTCCTAGAGC 480 TACCATCCCG AACAGCAGTC CTTCCATTCG TCCTGGTGCA CAGACACCCA CTGCAGTGTA 540 CCAGGCTAAT CAGCACATCA TGATGGTTAA CCATCTGCCC ATGCCGTACC CAGTGCCCCA 600 GGGGCCTCAG TACTGTATAC CACAGTACCG TCATAGTGGC CCTCCTTATG TTGGGCCCCC 660 CCAACAATAT CCAGTTCAAC CACCGGGGCC AGGTCCTTTT TATCCTGGAC CAGGACCTGG 720 GGACTTCCCC AATGCTTATG GAACGCCTTT TTACCCAAGT CAGCCGGTGT ATCAGTCAGC 780 ACCTATCATA GTGCCTACGC AGCAACAGCC GCCTCCAGCC AAGAGAGAGA AAAAAACTAT 840 AAGAATTCGG GATCCAAACC AGGGAGGTAA AGACATAACA GAGGAGATTA TGTCTGGAGG 900 TGGCAGCAGA AATCCTACTC CACCCATAGG AAGACCCACG TCCACACCTA CTCCTCCTCA 960 GCTGCCCAGC CAGGTCCCCG AGCACAGCCC TGTGGTTTAT GGGACTGTGG AGAGCGCTCA 1020 TCTTGCTGCC AGCACCCCTG TCACTGCAGC TAGCGACCAG AAGCAAGAGG AGAAGCCAAA 1080 ACCAGATCCA GTGTTAAAGT CTCCTTCCCC AGTCCTTAGG CTAGTCCTCA GTGGAGAGAA 1140 GAAAGAACAA GAAGGCCAGA CATCTGAAAC TACTGCAATA GTATCCATAG CAGAGCTTCC 1200 TCTGCCTCCA TCACCTACCA CTGTTTCTTC TGTTGCTCGA AGTACAATTG CAGCCCCCAC 1260 CTCTTCTGCT CTTAGTAGCC AACCAATATT CACCACTGCT ATAGATGACA GATGTGAACT 1320 CTCATCCCCA AGAGAAGACA CAATTCCTAT ACCCAGCCTC ACATCTTGCA CAGAAACATC 1380 AGACCCTTTA CCAACAAATG AAAATGATGA TGATATATGC AAGAAACCCT GTAGTGTAGC 1440 ACCTAATGAT ATTCCACTGG TTTCTAGTAC TAACCTAATT AATGAAATAA ATGGAGTTAG 1500 CGAAAAATTA TCAGCCACGG AGAGCATTGT GGAAATAGTA AAACAGGAAG TATTGCCATT 1560 GACTCTTGAA TTGGAGATTC TCGAAAATCC CCCAGAAGAA ATGAAACTGG AGTGTATCCC 1620 AGCTCCCATC ACCCCTTCCA CAGTTCCTTC CTTTCCTCCA ACTCCTCCAA CTCCTCCAGC 1680 TTCTCCTCCT CACACTCCAG TCATTGTTCC TGCTGCTGCC ACTACTGTTA GTTCTCCGAG 1740 TGCTGCCATC ACAGTCCAGA GAGTCCTAGA GGAGGACGAG AGCATAAGAA CTTGCCTTAG 1800 TGAAGATGCA AAAGAGATTC AGAACAAAAT AGAGGTAGAA GCAGATGGGC AAACAGAAGA 1860 GATTTTGGAT TCTCAAAACT TAAATTCAAG AAGGAGCCCT GTCCCAGAAA CATCGAATGA 1920 ATGCTGAAAT TCCTAGTCTG GTTTCTTTCA GTGGTGTGTT TGTGTTTTAG TACAACCTGC 1980 AAAAGAGTTA CTCCATTGTC TAAAAATGCA AATGAGAATT TCCAAATATA CAAAATGCCT 2040 CCAAGGTATA TGTCACGAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2075 配列番号：4 配列の長さ：233 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Met Val Asn His Leu Pro Met Pro Tyr Pro Val Pro Gln Gly Pro 5 10 15 Gln Tyr Cys Ile Pro Gln Tyr Arg His Ser Gly Pro Pro Tyr Val Gly 20 25 30 Pro Pro Gln Gln Tyr Pro Val Gln Pro Pro Gly Pro Gly Pro Phe Tyr 35 40 45 Pro Gly Pro Gly Pro Gly Asp Phe Pro Asn Ala Tyr Gly Thr Pro Phe 50 55 60 Tyr Pro Ser Gln Pro Val Tyr Gln Ser Ala Pro Ile Ile Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Lys Arg Glu Lys Lys Thr Ile Arg Ile 85 90 95 Arg Asp Pro Asn Gln Gly Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Ile Met Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Arg Asn Pro Thr Pro Pro Ile Gly Arg Pro Thr Ser 115 120 125 Thr Pro Thr Pro Pro Gln Leu Pro Ser Gln Val Pro Glu His Ser Pro 130 135 140 Val Val Tyr Gly Thr Val Glu Ser Ala His Leu Ala Ala Ser Thr Pro 145 150 155 160 Val Thr Ala Ala Ser Asp Gln Lys Gln Glu Glu Lys Pro Lys Pro Asp 165 170 175 Pro Val Leu Lys Ser Pro Ser Pro Val Leu Arg Leu Val Leu Ser Gly 180 185 190 Glu Lys Lys Glu Gln Glu Gly Gln Thr Ser Glu Thr Thr Ala Ile Val 195 200 205 Ser Ile Ala Glu Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Thr Thr Val Ser Ser 210 215 220 Val Ala Arg Ser Thr Ile Ala Ala Pro 225 230 配列番号：5 配列の長さ：103 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ser Arg Gly Ala Gly Ser Gly Gln Arg Trp Gly Gln Arg Asp Arg Ala 5 10 15 Glu Pro His Arg Ser Ala Glu Cys Gly Gly Trp Gly Gly Arg Ala Thr 20 25 30 Gly Asn Glu Trp Gly Ala Ala Pro Ala Pro Pro Thr Ser Pro Arg Ser 35 40 45 Asn His Gly Pro Ala Pro Ala Ser Ala Gly Gly Asp His Ser Pro Ala 50 55 60 Pro Ala Ser Thr Gly Ser Asn His Gly Pro Ala Pro Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80 Gly Asp His Gly Pro Ala Pro Ala Arg Gly Arg Pro Ala Leu Gln Phe 85 90 95 Gln Trp Gly Ser Cys Gly Tyr 100 配列番号：6 配列の長さ：455 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Met Val Asn His Leu Pro Met Pro Tyr Pro Val Pro Gln Gly Pro 5 10 15 Gln Tyr Cys Ile Pro Gln Tyr Arg His Ser Gly Pro Pro Tyr Val Gly 20 25 30 Pro Pro Gln Gln Tyr Pro Val Gln Pro Pro Gly Pro Gly Pro Phe Tyr 35 40 45 Pro Gly Pro Gly Pro Gly Asp Phe Pro Asn Ala Tyr Gly Thr Pro Phe 50 55 60 Tyr Pro Ser Gln Pro Val Tyr Gln Ser Ala Pro Ile Ile Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Lys Arg Glu Lys Lys Thr Ile Arg Ile 85 90 95 Arg Asp Pro Asn Gln Gly Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Ile Met Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Arg Asn Pro Thr Pro Pro Ile Gly Arg Pro Thr Ser 115 120 125 Thr Pro Thr Pro Pro Gln Leu Pro Ser Gln Val Pro Glu His Ser Pro 130 135 140 Val Val Tyr Gly Thr Val Glu Ser Ala His Leu Ala Ala Ser Thr Pro 145 150 155 160 Val Thr Ala Ala Ser Asp Gln Lys Gln Glu Glu Lys Pro Lys Pro Asp 165 170 175 Pro Val Leu Lys Ser Pro Ser Pro Val Leu Arg Leu Val Leu Ser Gly 180 185 190 Glu Lys Lys Glu Gln Glu Gly Gln Thr Ser Glu Thr Thr Ala Ile Val 195 200 205 Ser Ile Ala Glu Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Thr Thr Val Ser Ser 210 215 220 Val Ala Arg Ser Thr Ile Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Leu Ser Ser 225 230 235 240 Gln Pro Ile Phe Thr Thr Ala Ile Asp Asp Arg Cys Glu Leu Ser Ser 245 250 255 Pro Arg Glu Asp Thr Ile Pro Ile Pro Ser Leu Thr Ser Cys Thr Glu 260 265 270 Thr Ser Asp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Asn Asp Asp Asp Ile Cys Lys 275 280 285 Lys Pro Cys Ser Val Ala Pro Asn Asp Ile Pro Leu Val Ser Ser Thr 290 295 300 Asn Leu Ile Asn Glu Ile Asn Gly Val Ser Glu Lys Leu Ser Ala Thr 305 310 315 320 Glu Ser Ile Val Glu Ile Val Lys Gln Glu Val Leu Pro Leu Thr Leu 325 330 335 Glu Leu Glu Ile Leu Glu Asn Pro Pro Glu Glu Met Lys Leu Glu Cys 340 345 350 Ile Pro Ala Pro Ile Thr Pro Ser Thr Val Pro Ser Phe Pro Pro Thr 355 360 365 Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro His Thr Pro Val Ile Val Pro 370 375 380 Ala Ala Ala Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ile Thr Val Gln 385 390 395 400 Arg Val Leu Glu Glu Asp Glu Ser Ile Arg Thr Cys Leu Ser Glu Asp 405 410 415 Ala Lys Glu Ile Gln Asn Lys Ile Glu Val Glu Ala Asp Gly Gln Thr 420 425 430 Glu Glu Ile Leu Asp Ser Gln Asn Leu Asn Ser Arg Arg Ser Pro Val 435 440 445 Pro Glu Thr Ser Asn Glu Cys 450 455 配列番号：7 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Ala Pro Ala Ser Ala Gly Gly Asp His Ser Pro Ala Pro Ala 5 10 15 Ser 配列番号：8 配列の長さ：24 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CAGACAACTG GAAGAGGAGG AAGG 24 配列番号：9 配列の長さ：24 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGGCACTATG ATAGGTGCTG ACTG 24 配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCAGCACCTA TCATAGTGGC C 21 配列番号：11 配列の長さ：21 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCTTATGCT CTCGTTCCTC C 21

【図面の簡単な説明】

【図１】ST-1およびST-2に反応するmRNAのノーザンブロ
ット解析を示す写真である。AはBOY細胞から得られたST
-1 mRNA（5μg）、BはBOY細胞から得られたST-2 mRNA
（20μg）に対する写真である。

【図２】BOY細胞における抗原タンパクを検出するため
のウエスタンブロット解析を示す写真である。8％ポリ
アクリルアミドゲルの各ウエルに細胞抽出物を注入し、
SDS-PAGE後、特異的抗体によって染色したものを撮影し
た。Aは「ST-1タンパク」、Bは「ST-2タンパク」に対す
る写真である。

【図３】臨床検体におけるメタネスチン発現を、抗メタ
ネスチン抗体を用いた免疫組織化学により分析した写真
である。Aは正常膀胱膜(x100)、Bは原発腫瘍(x200)、C
は転移リンパ節(x40)に関するものである。殆ど全ての
転移腫瘍が染色された。Dは転移したリンパ節(x200)を
示す。全ての検体は１患者から得られた。抗体の濃度は
7μg/mlであった。

【図４】臨床検体における100kDa(ST-2タンパク)の抗原
エピトープを、抗PAPA抗体を用いた免疫組織化学により
分析した写真である。Aは正常膀胱膜(x200)、Bは原発腫
瘍(x200)、Cは転移したリンパ節(x200)に関するもので
ある。正常細胞においては表層の細胞のみが染色され
た。全ての検体は１患者から得られた。抗体の濃度は10
μg/mlであった。

【図５】「ST-1タンパク」のアミノ酸配列および「Pro-
Gly-Pro-Glyモチーフ」の位置を示す図である。

【図６】「ST-2タンパク」のアミノ酸配列および「Pro-
Ala-Pro-Alaモチーフ」の位置を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成９年２月１２日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】ＳＴ−１およびＳＴ−２に反応するｍＲＮＡの
ノーザンブロット解析を示す電気泳動像である。ＡはＢ
ＯＹ細胞から得られたＳＴ−１ｍＲＮＡ（５μｇ）、
ＢはＢＯＹ細胞から得られたＳＴ−２ｍＲＮＡ（２０μ
ｇ）に対する電気泳動像である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】ＢＯＹ細胞における抗原タンパクを検出するた
めのウエスタンブロット解析を示す電気泳動像である。
８％ポリアクリルアミドゲルの各ウエルに細胞抽出物を
注入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、特異的抗体によって染色
したものを撮影した。Ａは「ＳＴ−１タンパク」、Ｂは
「ＳＴ−２タンパク」に対する電気泳動像である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】臨床検体におけるメタネスチン発現を、抗メタ
ネスチン抗体を用いた免疫組織化学により分析した顕微
鏡写真である。Ａは正常膀胱膜（ｘ１００）、Ｂは原発
腫瘍（ｘ２００）、Ｃは転移リンパ節（ｘ４０）に関す
るものである。殆ど全ての転移腫瘍が染色された。Ｄは
転移したリンパ節（ｘ２００）を示す。全ての検体は１
患者から得られた。抗体の濃度は７μｇ／ｍｌであっ
た。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】臨床検体における１００ｋＤａ（ＳＴ−２タン
パク）の抗原エピトープを、抗ＰＡＰＡ抗体を用いた免
疫組織化学により分析した顕微鏡写真である。Ａは正常
膀胱膜（ｘ２００）、Ｂは原発腫瘍（ｘ２００）、Ｃは
転移したリンパ節（ｘ２００）に関するものである。正
常細胞においては表層の細胞のみが染色された。全ての
検体は１患者から得られた。抗体の濃度は１０μｇ／ｍ
ｌであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵＴＧ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 33/577 Ｂ 39/395 ＡＤＵＣ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者白浜勉鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘８丁目35番１号鹿児島大学医学部泌尿器科学内 (72)発明者松迫哲史鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘８丁目35番１号鹿児島大学医学部泌尿器科学内 (72)発明者大井好忠鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘８丁目35番１号鹿児島大学医学部泌尿器科学内 (72)発明者村松喬愛知県名古屋市天白区天白町大字平針字黒石2845−161 (72)発明者浅見幸夫神奈川県小田原市成田540番地明治乳業株式会社細胞工学センター内 (72)発明者村杉章神奈川県小田原市成田540番地明治乳業株式会社細胞工学センター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】「Pro-Gly-Pro-Gly」または「Pro-Ala-P
ro-Ala」を含むアミノ酸配列を有する、癌転移に関連す
るタンパク質またはペプチド。
【請求項２】複数の「Pro-Gly-Pro-Gly」または「Pro
-Ala-Pro-Ala」を含むアミノ酸配列を有する、請求項１
記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項３】配列番号：６に示すアミノ酸配列の全部
またはその一部を有する、請求項１記載のタンパク質ま
たはペプチド。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
ク質をコードするDNA。
【請求項５】請求項４記載のDNAを含むベクター。
【請求項６】請求項５記載のベクターを保持する形質
転換体。
【請求項７】請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
ク質またはペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項８】「Pro-Gly-Pro-Gly」または「Pro-Ala-P
ro-Ala」を含むエピトープに対するモノクローナル抗
体。