JPH10151193A - 抗血栓性材料およびその製造方法 - Google Patents
抗血栓性材料およびその製造方法Info
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- JPH10151193A JPH10151193A JP9224746A JP22474697A JPH10151193A JP H10151193 A JPH10151193 A JP H10151193A JP 9224746 A JP9224746 A JP 9224746A JP 22474697 A JP22474697 A JP 22474697A JP H10151193 A JPH10151193 A JP H10151193A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 補因子を要さず血小板因子により中和され
ず、血子板を活性化せず、長期的な出血と関連しない抗
血栓材料及びその製法を提供する。 【解決手段】 ヒルジンまたはヒルジン誘導体が、得ら
れる材料がヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に有す
るように共有結合する、官能基を有する支持材料からな
る抗血栓性材料が提供される。支持材料は、膜、組織、
器官と同様な天然、合成的に生ずる重合体であり得る。
ヒルジンまたはヒルジン誘導体は、アミノ酸残基の官能
基を通じて支持材料の官能基に直接結合し得、あるいは
結合基を使用して直接結合し得る。
ず、血子板を活性化せず、長期的な出血と関連しない抗
血栓材料及びその製法を提供する。 【解決手段】 ヒルジンまたはヒルジン誘導体が、得ら
れる材料がヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に有す
るように共有結合する、官能基を有する支持材料からな
る抗血栓性材料が提供される。支持材料は、膜、組織、
器官と同様な天然、合成的に生ずる重合体であり得る。
ヒルジンまたはヒルジン誘導体は、アミノ酸残基の官能
基を通じて支持材料の官能基に直接結合し得、あるいは
結合基を使用して直接結合し得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗血栓性材料、特
にヒルジンまたはヒルジン誘導体が共有結合する重合性
材料に関する。本発明は更にこのような抗血栓性材料を
製造するための新規な方法に関する。
にヒルジンまたはヒルジン誘導体が共有結合する重合性
材料に関する。本発明は更にこのような抗血栓性材料を
製造するための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血栓症
は、血液採集および処理システムのような医療機器の開
発、使用における主なる問題である。血液が異質の表面
に接触するときに、体液および細胞の変化が起こる。そ
のような機器の使用のための材料の生体適合性を改善す
るために、研究は、抗凝固剤の固定化と、重合体表面上
に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化することに集
中した。抗凝固剤の一つであるヘパリンは、種々の血栓
症状を処置するために臨床実務で広範囲に使用されてき
たムコ多糖である。ヘパリンの治療上の使用では、しば
しば、出血時間の延長のような副作用により面倒にな
る。ヘパリンおよびその誘導体は、生体適合性表面を与
え、ヘパリンの体系的投与量を減少させる目的で、重合
体に結合されてきた。しかしながら、これらの生体適合
材料の長期間の効果は知られていない。
は、血液採集および処理システムのような医療機器の開
発、使用における主なる問題である。血液が異質の表面
に接触するときに、体液および細胞の変化が起こる。そ
のような機器の使用のための材料の生体適合性を改善す
るために、研究は、抗凝固剤の固定化と、重合体表面上
に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化することに集
中した。抗凝固剤の一つであるヘパリンは、種々の血栓
症状を処置するために臨床実務で広範囲に使用されてき
たムコ多糖である。ヘパリンの治療上の使用では、しば
しば、出血時間の延長のような副作用により面倒にな
る。ヘパリンおよびその誘導体は、生体適合性表面を与
え、ヘパリンの体系的投与量を減少させる目的で、重合
体に結合されてきた。しかしながら、これらの生体適合
材料の長期間の効果は知られていない。
【０００３】例えば、米国特許、番号３，５１１，６８
４、３，５８５，６４７、４，２５４，１８０、４，６
７６，９７５、４，６７８，６６０は、表面にヘパリン
を吸着、イオン結合する方法を開示する。米国特許、番
号４，５２６，７１４、４，６３４，７６２、４，６７
８，６７１は、表面にコーティング（被覆物）を作るた
めに蛋白質にヘパリンを共有結合する方法を開示する。
４、３，５８５，６４７、４，２５４，１８０、４，６
７６，９７５、４，６７８，６６０は、表面にヘパリン
を吸着、イオン結合する方法を開示する。米国特許、番
号４，５２６，７１４、４，６３４，７６２、４，６７
８，６７１は、表面にコーティング（被覆物）を作るた
めに蛋白質にヘパリンを共有結合する方法を開示する。
【０００４】米国特許、番号４，４１５，４９０は、重
合物質に共有したヘパリンからなる非凝血性材料を開示
する。米国特許、番号４，３２６，５３２は、抗血栓症
剤を付加されたキトサンでコート（被覆）された重合物
質からなる抗凝血性表面を有する医療材料を開示する。
米国特許、番号４，５２１，５６４、４，６００，６５
２、４，６４２，２４２は、抗凝血性材料が共有結合す
るポリウレタン材料からなる抗凝血性ポリウレタン重合
体を開示する。
合物質に共有したヘパリンからなる非凝血性材料を開示
する。米国特許、番号４，３２６，５３２は、抗血栓症
剤を付加されたキトサンでコート（被覆）された重合物
質からなる抗凝血性表面を有する医療材料を開示する。
米国特許、番号４，５２１，５６４、４，６００，６５
２、４，６４２，２４２は、抗凝血性材料が共有結合す
るポリウレタン材料からなる抗凝血性ポリウレタン重合
体を開示する。
【０００５】特開昭５６−１５０５４９は、ヒドロゲル
からなる抗凝血性医療材料を開示する。一の実施態様で
は、その材料は、非共有結合的に結合したヘパリンを含
むヒドロゲルからなる。また、ヒルジンは、抗凝固剤と
して参照されている。
からなる抗凝血性医療材料を開示する。一の実施態様で
は、その材料は、非共有結合的に結合したヘパリンを含
むヒドロゲルからなる。また、ヒルジンは、抗凝固剤と
して参照されている。
【０００６】欧州特許出願、番号０，２００，６５５
は、表面が、パラジウムまたはロジウム塩の湿潤溶液で
処理され、次いでイオン結合したコーティングを形成す
るペプチド水素イオン化を生起する条件の下でヘパリン
またはヒルジンのような抗凝固剤で処理される、医療機
器での使用のための材料を処理する方法を開示する。
は、表面が、パラジウムまたはロジウム塩の湿潤溶液で
処理され、次いでイオン結合したコーティングを形成す
るペプチド水素イオン化を生起する条件の下でヘパリン
またはヒルジンのような抗凝固剤で処理される、医療機
器での使用のための材料を処理する方法を開示する。
【０００７】ヘパリンに対する代替的抗凝固剤は、薬効
性蛭の唾液腺から元来分離される天然に生じる抗凝固剤
であるヒルジンである。ヒルジンは、約１０-11Ｍ／Ｌ
のＫdを有する効能ある特殊なトロンビン阻害剤であ
る。生化学的および薬学的に、ヒルジンは、ヘパリン以
上の実質的利点を表す。抗凝固活性のために、ヘパリン
は、補因子として抗トロンビンIIIまたはヘパリン補因
子IIの存在を要する。ヘパリンは、血小板因子４の存在
により中和され、血小板を活性化し、通常長期的な出血
と血小板減少症と関連する。他方、ヒルジンは、補因子
を要さず、血小板因子４により中和されず、血小板を活
性化せず、めったに長期的な出血と関連せずかつ血小板
減少症を引き起こさない。加えて、ヒルジンは、血栓症
を防止するのにヘパリンの５〜１０倍効果的であること
が知見されている。
性蛭の唾液腺から元来分離される天然に生じる抗凝固剤
であるヒルジンである。ヒルジンは、約１０-11Ｍ／Ｌ
のＫdを有する効能ある特殊なトロンビン阻害剤であ
る。生化学的および薬学的に、ヒルジンは、ヘパリン以
上の実質的利点を表す。抗凝固活性のために、ヘパリン
は、補因子として抗トロンビンIIIまたはヘパリン補因
子IIの存在を要する。ヘパリンは、血小板因子４の存在
により中和され、血小板を活性化し、通常長期的な出血
と血小板減少症と関連する。他方、ヒルジンは、補因子
を要さず、血小板因子４により中和されず、血小板を活
性化せず、めったに長期的な出血と関連せずかつ血小板
減少症を引き起こさない。加えて、ヒルジンは、血栓症
を防止するのにヘパリンの５〜１０倍効果的であること
が知見されている。
【０００８】抗凝血性、非凝血性、または抗血栓性の材
料の形成のためにヒルジンを使用する試みは、表面にヒ
ルジン分子をイオン結合することに現在まで限られてい
た。これらの工程は本質的に不利である。なぜなら、ヒ
ルジン分子は、材料の長期間の抗血栓性を減ずる比較的
短期間で表面から分離するからである。
料の形成のためにヒルジンを使用する試みは、表面にヒ
ルジン分子をイオン結合することに現在まで限られてい
た。これらの工程は本質的に不利である。なぜなら、ヒ
ルジン分子は、材料の長期間の抗血栓性を減ずる比較的
短期間で表面から分離するからである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明では、ヒルジンま
たはヒルジン誘導体が、得られる材料がヒルジンと同じ
生物学的活性を実質的に有するように共有結合する、官
能基を有する支持材料からなる抗血栓性材料が提供され
る。支持材料は、膜、組織、器官と同様な天然、合成的
に生ずる重合体であり得る。ヒルジンまたはヒルジン誘
導体は、アミノ酸残基の官能基を通じて支持材料の官能
基に直接結合し得、あるいは結合基を使用して直接結合
し得る。そのような結合基の例は、二重作用的試薬であ
ろう。
たはヒルジン誘導体が、得られる材料がヒルジンと同じ
生物学的活性を実質的に有するように共有結合する、官
能基を有する支持材料からなる抗血栓性材料が提供され
る。支持材料は、膜、組織、器官と同様な天然、合成的
に生ずる重合体であり得る。ヒルジンまたはヒルジン誘
導体は、アミノ酸残基の官能基を通じて支持材料の官能
基に直接結合し得、あるいは結合基を使用して直接結合
し得る。そのような結合基の例は、二重作用的試薬であ
ろう。
【００１０】本発明の抗血栓性材料は、無水または水性
結合反応を使用して適当な支持材料の官能基にヒルジン
又はヒルジン誘導体を直接結合することにより製造され
る。また、抗血栓性材料は、まず支持材料またはヒルジ
ンもしくはヒルジン誘導体の何れかに結合基を付加し、
次いでヒルジンもしくはヒルジン誘導体または支持材料
に結合基を通じて修飾された材料または蛋白質を結合す
ることによっても製造され得る。ヒルジンもしくはヒル
ジン誘導体の活性部位は、得られる材料の活性の減少を
防止するように結合反応の間保護される。加えて、支持
材料の官能基、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体
の官能基、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体のア
ミノ酸の官能基は、結合反応の効率もしくは選択性を高
めるように修飾され得る。
結合反応を使用して適当な支持材料の官能基にヒルジン
又はヒルジン誘導体を直接結合することにより製造され
る。また、抗血栓性材料は、まず支持材料またはヒルジ
ンもしくはヒルジン誘導体の何れかに結合基を付加し、
次いでヒルジンもしくはヒルジン誘導体または支持材料
に結合基を通じて修飾された材料または蛋白質を結合す
ることによっても製造され得る。ヒルジンもしくはヒル
ジン誘導体の活性部位は、得られる材料の活性の減少を
防止するように結合反応の間保護される。加えて、支持
材料の官能基、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体
の官能基、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体のア
ミノ酸の官能基は、結合反応の効率もしくは選択性を高
めるように修飾され得る。
【００１１】本明細書の目的に対して、生物学的活性
は、抗凝血活性を意味するように定義されるであろう。
抗凝血活性は、トロンビンが触媒するフィブリンの凝固
形成を阻害する能力、トロンビンの結合によるトロンビ
ンのアミドール活性、または両方を含み得るが、それに
限定されない。ヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に
有する抗血栓性材料は、非結合性の天然ヒルジンの抗凝
血活性の少なくとも約１０％を示す何らかの材料を意味
する。
は、抗凝血活性を意味するように定義されるであろう。
抗凝血活性は、トロンビンが触媒するフィブリンの凝固
形成を阻害する能力、トロンビンの結合によるトロンビ
ンのアミドール活性、または両方を含み得るが、それに
限定されない。ヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に
有する抗血栓性材料は、非結合性の天然ヒルジンの抗凝
血活性の少なくとも約１０％を示す何らかの材料を意味
する。
【００１２】この論文は、ヒルジンおよび本発明で得ら
れる材料の抗凝血活性の言葉で主として言い表される
が、ヒルジンは、抗炎症的、抗生物質的、排尿促進的性
質も同様に有するように知見されていることが理解され
るべきである。また、本発明の抗血栓性材料は、抗炎症
的、抗生物質的でもあり得、排尿促進的性質も有し得、
それゆえ、そのような性質を通常利用する生体適合性材
料としての利用もまた可能である。
れる材料の抗凝血活性の言葉で主として言い表される
が、ヒルジンは、抗炎症的、抗生物質的、排尿促進的性
質も同様に有するように知見されていることが理解され
るべきである。また、本発明の抗血栓性材料は、抗炎症
的、抗生物質的でもあり得、排尿促進的性質も有し得、
それゆえ、そのような性質を通常利用する生体適合性材
料としての利用もまた可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の抗血栓性材料は、ヒルジ
ンもしくはヒルジン誘導体が、ヒルジンもしくはヒルジ
ン誘導体の生物学的活性を実質的に保つように共有結合
的に付加される表面を有する支持材料から成る。
ンもしくはヒルジン誘導体が、ヒルジンもしくはヒルジ
ン誘導体の生物学的活性を実質的に保つように共有結合
的に付加される表面を有する支持材料から成る。
【００１４】支持体として本発明で有用である材料は、
医療的な物質、システムおよび機器の製造および使用に
有用な材料を含む。支持材料は、ヒドロキシル基、カル
ボキシル基、アミノ基、アルデヒド、アミド、およびＳ
Ｈ基のような官能基を含む何れかの材料、またはこのよ
うな官能基を含むように修飾され得る何れかの材料、ま
たはこのような官能基が付加され得る何れかの材料を含
む。このような材料は、天然に生じる材料、遺伝学的に
誘導される材料、合成的な材料を含む。天然に生じる材
料は、組織、膜、器官および天然に生じる重合体を含み
得るが、それらに限定されるものではない。遺伝学的に
誘導された材料の一例は、ポリ−β−ハイドロキシブチ
レートである。合成的な材料は、重合体および共重合体
を含み得るが、それらに限定されるものではない。
医療的な物質、システムおよび機器の製造および使用に
有用な材料を含む。支持材料は、ヒドロキシル基、カル
ボキシル基、アミノ基、アルデヒド、アミド、およびＳ
Ｈ基のような官能基を含む何れかの材料、またはこのよ
うな官能基を含むように修飾され得る何れかの材料、ま
たはこのような官能基が付加され得る何れかの材料を含
む。このような材料は、天然に生じる材料、遺伝学的に
誘導される材料、合成的な材料を含む。天然に生じる材
料は、組織、膜、器官および天然に生じる重合体を含み
得るが、それらに限定されるものではない。遺伝学的に
誘導された材料の一例は、ポリ−β−ハイドロキシブチ
レートである。合成的な材料は、重合体および共重合体
を含み得るが、それらに限定されるものではない。
【００１５】天然に生じる重合体、遺伝学的に誘導され
る重合体、合成的な重合体は、論理的および適当な組合
せで次の中の１またはそれ以上から誘導される同種の重
合体および共重合体を含むが、それらに限定されない。
それらの重合体は、エチレン、プロピレン、４−メチル
−１−ペンテン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフル
オロプロピレン、ビニリデン ジフルオリド等のような
１−オレフィン類；塩化ビニル、酢酸ビニル、スチレ
ン、無水マレイン酸、メチルメタクリレート、スルホン
酸ビニル、アクリロニトリル、炭酸ビニレン、アクリル
アミド等のようなビニル単量体類；メチレン、エチレ
ン、プロピレン、テトラメチレン、２，６−ジメチル−
１，４−フェニレン等のエーテル類；エチレン−テレフ
タレート、ブチレン−テレフタレート、γ−カプロラク
トン、β−ブチロラクトン、エチレン−アジペート、ビ
スフェノールＡ−テレ／イソフタレート等のようなエス
テル類；ビスフェノールＡ、４，４−ジヒドロキシビフ
ェニレン等のような炭酸塩類；ナイロン、蛋白質等のよ
うなアミド類（尿素、ウレタンを含む）；グルコサミ
ン、グルクロン酸、プロテオグリカン、硫酸塩を含む糖
類等のような糖類；ジメチル シロキサン、ジフェニル
シロキサン、トリフルオロプロピル シロキサン、３
−アミノプロピル シロキサン、カルボキシプロピル
シロキサン、ポリエチレンイミノプロピル シロキサン
等のようなシロキサン類である。
る重合体、合成的な重合体は、論理的および適当な組合
せで次の中の１またはそれ以上から誘導される同種の重
合体および共重合体を含むが、それらに限定されない。
それらの重合体は、エチレン、プロピレン、４−メチル
−１−ペンテン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフル
オロプロピレン、ビニリデン ジフルオリド等のような
１−オレフィン類；塩化ビニル、酢酸ビニル、スチレ
ン、無水マレイン酸、メチルメタクリレート、スルホン
酸ビニル、アクリロニトリル、炭酸ビニレン、アクリル
アミド等のようなビニル単量体類；メチレン、エチレ
ン、プロピレン、テトラメチレン、２，６−ジメチル−
１，４−フェニレン等のエーテル類；エチレン−テレフ
タレート、ブチレン−テレフタレート、γ−カプロラク
トン、β−ブチロラクトン、エチレン−アジペート、ビ
スフェノールＡ−テレ／イソフタレート等のようなエス
テル類；ビスフェノールＡ、４，４−ジヒドロキシビフ
ェニレン等のような炭酸塩類；ナイロン、蛋白質等のよ
うなアミド類（尿素、ウレタンを含む）；グルコサミ
ン、グルクロン酸、プロテオグリカン、硫酸塩を含む糖
類等のような糖類；ジメチル シロキサン、ジフェニル
シロキサン、トリフルオロプロピル シロキサン、３
−アミノプロピル シロキサン、カルボキシプロピル
シロキサン、ポリエチレンイミノプロピル シロキサン
等のようなシロキサン類である。
【００１６】医療的な物質、システム、機器に利用され
る重合体は、次記のものを含むが、それらに限定されな
い。それらの重合体は、管、カテーテル、血液袋に使用
され、可塑剤（３０〜４０％エチル−ヘキシル フタレ
ート）を混合したポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）；カテーテ
ルに使用されるポリエチレン；使い捨て材料及びシリン
ジに使用されるポリプロピレン；血液透析に使用される
膜、中空繊維に使用されるポリアクリロニトリル（ＰＡ
Ｎ）；コンタクトレンズに使用されるポリ（ヒドロキシ
エチルメタクリレート）、血管プロテーゼ法に使用され
るポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチ
レンテレフタレートおよびポリアミド類；人工心臓およ
びカテーテルに使用されるポリウレタン；プロテーゼ
法、膜式酸素供給器、カテーテル、成形外科に使用され
るポリジメチルシロキサン；血液透析膜に使用されるセ
ルロースおよび酢酸セルロースのような多糖類である。
る重合体は、次記のものを含むが、それらに限定されな
い。それらの重合体は、管、カテーテル、血液袋に使用
され、可塑剤（３０〜４０％エチル−ヘキシル フタレ
ート）を混合したポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）；カテーテ
ルに使用されるポリエチレン；使い捨て材料及びシリン
ジに使用されるポリプロピレン；血液透析に使用される
膜、中空繊維に使用されるポリアクリロニトリル（ＰＡ
Ｎ）；コンタクトレンズに使用されるポリ（ヒドロキシ
エチルメタクリレート）、血管プロテーゼ法に使用され
るポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチ
レンテレフタレートおよびポリアミド類；人工心臓およ
びカテーテルに使用されるポリウレタン；プロテーゼ
法、膜式酸素供給器、カテーテル、成形外科に使用され
るポリジメチルシロキサン；血液透析膜に使用されるセ
ルロースおよび酢酸セルロースのような多糖類である。
【００１７】本発明に有用な重合体は、微生分解可能な
重合体、部分的に微生物分解可能な重合体、および微生
物分解可能でない重合体を含み得る。支持材料は、酸化
され、次いでジエチレントリアミン 無水五酢酸のよう
な試薬を用いて官能化される金属をも含むことができ
る。支持材料として利用され得る他の材料は、セラミッ
ク、ガラスを含むがそれらに限定されない。
重合体、部分的に微生物分解可能な重合体、および微生
物分解可能でない重合体を含み得る。支持材料は、酸化
され、次いでジエチレントリアミン 無水五酢酸のよう
な試薬を用いて官能化される金属をも含むことができ
る。支持材料として利用され得る他の材料は、セラミッ
ク、ガラスを含むがそれらに限定されない。
【００１８】使用されるべき材料の選択は、通常、製造
される医療機器または物質の機能に主として依存する。
合成重合体が利用される場合、重合体の選択は、ヒルジ
ンの好適な結合部位、結合方法、および重合体の官能基
にも影響される。例えば、水酸基を含む重合体は、ポリ
ビニルアルコール共重合体、ガラス、シリカ、およびポ
リヒドロキシエチレン メタクリレートを含むが、それ
らに限定されない。カルボキシル基を含む重合体は、無
水マレイン酸共重合体およびカルボキシメチルセルロー
スを含むが、それらに限定されない。アミノ基を含む重
合体は、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、
ポリエチレンイミン、および直線状で交差結合（ｃｒｏ
ｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）し高度に分岐した重合体を含む
が、それらに限定されない。アルデヒド基を含む重合体
は、グルタルアルデヒドで処理した重合体、および過沃
素酸塩で処理した多糖類を含むが、それらに限定されな
い。ＳＨ基を含む重合体は、アセチルメルカプトコハク
酸で修飾した重合体を含むが、それらに限定されない。
他の有用な重合体は、フルオロ重合体、ポリアクリロニ
トリル、およびシランのような修飾された重合体を含む
が、それらに限定されない。
される医療機器または物質の機能に主として依存する。
合成重合体が利用される場合、重合体の選択は、ヒルジ
ンの好適な結合部位、結合方法、および重合体の官能基
にも影響される。例えば、水酸基を含む重合体は、ポリ
ビニルアルコール共重合体、ガラス、シリカ、およびポ
リヒドロキシエチレン メタクリレートを含むが、それ
らに限定されない。カルボキシル基を含む重合体は、無
水マレイン酸共重合体およびカルボキシメチルセルロー
スを含むが、それらに限定されない。アミノ基を含む重
合体は、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、
ポリエチレンイミン、および直線状で交差結合（ｃｒｏ
ｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）し高度に分岐した重合体を含む
が、それらに限定されない。アルデヒド基を含む重合体
は、グルタルアルデヒドで処理した重合体、および過沃
素酸塩で処理した多糖類を含むが、それらに限定されな
い。ＳＨ基を含む重合体は、アセチルメルカプトコハク
酸で修飾した重合体を含むが、それらに限定されない。
他の有用な重合体は、フルオロ重合体、ポリアクリロニ
トリル、およびシランのような修飾された重合体を含む
が、それらに限定されない。
【００１９】本発明で使用されるヒルジンは、天然に生
じるヒルジン、合成的に製造したヒルジン、および組み
換え技術を利用して製造されたヒルジンを含む。本発明
で有用なヒルジン誘導体は、実質的にヒルジンと同一の
抗凝血的生物学的活性を示す何れかの蛋白質またはポリ
ペプチドを含む。このような誘導体は、安定性を増加
し、抗凝血活性を増加し、トロンビン結合活性を増加
し、または得られる材料の抗凝血性を高めるように化学
修飾されたヒルジン蛋白質を含むことができる。ヒルジ
ン誘導体は、ヒルジン分子、および本発明にとって便利
な結合部位を与えるように更に修飾されたような誘導体
をも含み得る。ヒルジンの構造に対するそのような化学
修飾は、好適には、分子の生物学的活性を実質的に減少
させないようになされ、下記に述べるように分子のＮ−
末端領域内またはＣ−末端でなされる。そのような誘導
体は、天然に生ずるヒルジンから誘導され、合成的に製
造され、組み換え技術を使用して製造され、または生物
学的および化学的製造方法の組合せを使用して製造され
得る。
じるヒルジン、合成的に製造したヒルジン、および組み
換え技術を利用して製造されたヒルジンを含む。本発明
で有用なヒルジン誘導体は、実質的にヒルジンと同一の
抗凝血的生物学的活性を示す何れかの蛋白質またはポリ
ペプチドを含む。このような誘導体は、安定性を増加
し、抗凝血活性を増加し、トロンビン結合活性を増加
し、または得られる材料の抗凝血性を高めるように化学
修飾されたヒルジン蛋白質を含むことができる。ヒルジ
ン誘導体は、ヒルジン分子、および本発明にとって便利
な結合部位を与えるように更に修飾されたような誘導体
をも含み得る。ヒルジンの構造に対するそのような化学
修飾は、好適には、分子の生物学的活性を実質的に減少
させないようになされ、下記に述べるように分子のＮ−
末端領域内またはＣ−末端でなされる。そのような誘導
体は、天然に生ずるヒルジンから誘導され、合成的に製
造され、組み換え技術を使用して製造され、または生物
学的および化学的製造方法の組合せを使用して製造され
得る。
【００２０】本発明では、ヒルジンまたはヒルジン誘導
体は、ヒルジンの生物学的活性が実質的に減少しない方
法で材料の表面に共有結合的に付加される。
体は、ヒルジンの生物学的活性が実質的に減少しない方
法で材料の表面に共有結合的に付加される。
【００２１】天然ヒルジンは、６５のアミノ酸を含み、
次のアミノ酸連鎖を有する蛋白質である。
次のアミノ酸連鎖を有する蛋白質である。
【００２２】 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 10 11 12 13 14 15 16 17 NH2-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 -Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly- 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 -Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-COOH 蛭から抽出された天然ヒルジンは、６３位のチロシン残
基に付加された硫酸塩基を有する。ヒルジンの構造研究
で、３つの主たる作用領域があることが知見されてい
る。第１の領域は、４０位のアミノ酸からＣ−末端まで
の付近の高度に陰イオン性の領域であり、ヒルジンとト
ロンビン間のイオン相互作用を許容する分子の本質的部
分である。第２の領域は、６〜４０位のアミノ酸残基を
含む分子の高度に交差結合した領域であり、トロンビン
に対するヒルジンの増加した結合親和力の一因となるも
のと信じられる。第３の領域は、Ｎ−末端の５つのアミ
ノ酸であり、ヒルジンの生物学的活性にとって重要でな
いかもしれない。これは、ヒルジンの材料に対する結合
のための好適な領域である。ヒルジン誘導体の類似の領
域は、好適な結合領域を与える。
基に付加された硫酸塩基を有する。ヒルジンの構造研究
で、３つの主たる作用領域があることが知見されてい
る。第１の領域は、４０位のアミノ酸からＣ−末端まで
の付近の高度に陰イオン性の領域であり、ヒルジンとト
ロンビン間のイオン相互作用を許容する分子の本質的部
分である。第２の領域は、６〜４０位のアミノ酸残基を
含む分子の高度に交差結合した領域であり、トロンビン
に対するヒルジンの増加した結合親和力の一因となるも
のと信じられる。第３の領域は、Ｎ−末端の５つのアミ
ノ酸であり、ヒルジンの生物学的活性にとって重要でな
いかもしれない。これは、ヒルジンの材料に対する結合
のための好適な領域である。ヒルジン誘導体の類似の領
域は、好適な結合領域を与える。
【００２３】材料に蛋白質を結合するのに使用される最
も一般的なアミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、ヒ
ドロキシル基、およびＳＨ基を含む。カルボキシル基結
合は、本発明では比較的好適ではないであろう。なぜな
ら、Ｃ−末端領域が、ヒルジン分子の活性部位と関連し
ているからである。アミノ基は、Ｎ−末端バリンおよび
２７、３６、４７位の３つのリジンに存在する。４７位
のリジンは、主たる活性中心であると報告されている。
幾つかの結合反応では、リジン残基は結合の間保護され
ることが好ましい。ヒルジンの好適な結合部位は、Ｎ−
末端バリンである。５１位のヒスチジン残基及び３、６
３位のチロシンは、可能性のある結合部位でもある。ヒ
スチジンの使用は、活性中心のリジンに近接しているた
め、比較的好適ではない。４つのセリンおよび４つのト
レオニンにおける８つのヒドロキシル基は、官能基への
結合にも利用される。これらの８つのアミノ酸は分子中
に散在しているため、そのような結合では、結合の特異
性および生物学的活性の大きな変化が少ない。
も一般的なアミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、ヒ
ドロキシル基、およびＳＨ基を含む。カルボキシル基結
合は、本発明では比較的好適ではないであろう。なぜな
ら、Ｃ−末端領域が、ヒルジン分子の活性部位と関連し
ているからである。アミノ基は、Ｎ−末端バリンおよび
２７、３６、４７位の３つのリジンに存在する。４７位
のリジンは、主たる活性中心であると報告されている。
幾つかの結合反応では、リジン残基は結合の間保護され
ることが好ましい。ヒルジンの好適な結合部位は、Ｎ−
末端バリンである。５１位のヒスチジン残基及び３、６
３位のチロシンは、可能性のある結合部位でもある。ヒ
スチジンの使用は、活性中心のリジンに近接しているた
め、比較的好適ではない。４つのセリンおよび４つのト
レオニンにおける８つのヒドロキシル基は、官能基への
結合にも利用される。これらの８つのアミノ酸は分子中
に散在しているため、そのような結合では、結合の特異
性および生物学的活性の大きな変化が少ない。
【００２４】上述したように、分子の生物学的活性を傷
つけずに結合部位を与えるヒルジン誘導体が調製され
る。例えば、もしＮ−末端付近のジスルフィド結合の変
化が実質的に活性に影響を及ぼさなければ、システイン
残基は、修飾され材料に結合しえる。
つけずに結合部位を与えるヒルジン誘導体が調製され
る。例えば、もしＮ−末端付近のジスルフィド結合の変
化が実質的に活性に影響を及ぼさなければ、システイン
残基は、修飾され材料に結合しえる。
【００２５】ヒルジンまたはヒルジン誘導体は、支持材
料の官能基に直接か、または結合基により結合し得る。
そのような結合基は、例えば、二重作用的な試薬のよう
な化学的基、ポリ−リジン、蛋白質および蛋白質切片の
ようなポリペプチド、ならびに支持材料およびヒルジン
またはヒルジン誘導体に共有結合する他の分子を含む。
料の官能基に直接か、または結合基により結合し得る。
そのような結合基は、例えば、二重作用的な試薬のよう
な化学的基、ポリ−リジン、蛋白質および蛋白質切片の
ようなポリペプチド、ならびに支持材料およびヒルジン
またはヒルジン誘導体に共有結合する他の分子を含む。
【００２６】本発明の抗血栓性材料を製造する方法は、
通常、支持材料の活性な官能基に対してアミノ酸残基の
官能基によりヒルジンまたはヒルジン誘導体を結合する
ことから構成される。結合の方法は、支持材料の有用な
官能基、蛋白質の結合部位、得られる材料の生物学的活
性、および結合反応の選択性と効率を含む幾つかの要因
に依存する。
通常、支持材料の活性な官能基に対してアミノ酸残基の
官能基によりヒルジンまたはヒルジン誘導体を結合する
ことから構成される。結合の方法は、支持材料の有用な
官能基、蛋白質の結合部位、得られる材料の生物学的活
性、および結合反応の選択性と効率を含む幾つかの要因
に依存する。
【００２７】例えば、もし蛋白質の結合部位、即ちアミ
ノ酸残基が、蛋白質の活性部位、即ちトロンビン結合領
域にきわめて接近し、支持材料が適当な活性官能基を含
むならば、蛋白質は、当業者に知られた反応を利用して
支持材料に直接結合し得るかもしれない。そのような結
合の例は、官能基としてＮ−スクシンイミドエステルを
含む寒天ゲルに対するＮ−末端残基のアミノ基の結合で
ある。結合反応は、無水または水性の条件の下でなされ
得る。
ノ酸残基が、蛋白質の活性部位、即ちトロンビン結合領
域にきわめて接近し、支持材料が適当な活性官能基を含
むならば、蛋白質は、当業者に知られた反応を利用して
支持材料に直接結合し得るかもしれない。そのような結
合の例は、官能基としてＮ−スクシンイミドエステルを
含む寒天ゲルに対するＮ−末端残基のアミノ基の結合で
ある。結合反応は、無水または水性の条件の下でなされ
得る。
【００２８】選択的に、蛋白質は、結合基により支持材
料に結合され得る。本発明で使用できる結合基の例は、
二重作用的な蛋白質交差結合試薬のような二重作用的な
試薬、ポリペプチド、蛋白質、蛋白質切片、およびポリ
エチレンイミンまたは樹枝状重合体のような多機能重合
体。結合基の選択は、結合部位、支持材料の官能基、得
られる材料の生物学的活性、および結合反応の選択性と
効率に依存し得る。例えば、チロシンのフェノール基
は、活性なアミノ基を有する支持材料との結合のための
ＳＨ基を付加するために、Ｎ−スクシニミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の
ような二重作用的な試薬を使用して修飾することができ
る。ＳＰＤＰに加えて、アセチルメルカプト無水コハク
酸が、アミノ基を含む表面にＳＨ基を導入するために使
用され得る（Ｋｌｏｔｚ Ｉ．Ｍ．，Ｓｔｒｙｋｅｒ
Ｖ．Ｈ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ，第１巻、１１９〜１２３頁、１９５９年）。
料に結合され得る。本発明で使用できる結合基の例は、
二重作用的な蛋白質交差結合試薬のような二重作用的な
試薬、ポリペプチド、蛋白質、蛋白質切片、およびポリ
エチレンイミンまたは樹枝状重合体のような多機能重合
体。結合基の選択は、結合部位、支持材料の官能基、得
られる材料の生物学的活性、および結合反応の選択性と
効率に依存し得る。例えば、チロシンのフェノール基
は、活性なアミノ基を有する支持材料との結合のための
ＳＨ基を付加するために、Ｎ−スクシニミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の
ような二重作用的な試薬を使用して修飾することができ
る。ＳＰＤＰに加えて、アセチルメルカプト無水コハク
酸が、アミノ基を含む表面にＳＨ基を導入するために使
用され得る（Ｋｌｏｔｚ Ｉ．Ｍ．，Ｓｔｒｙｋｅｒ
Ｖ．Ｈ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ，第１巻、１１９〜１２３頁、１９５９年）。
【００２９】ヒルジンと支持材料の結合は、様々な二重
作用的な蛋白質交差結合試薬を使用してなされ得る。そ
のような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ジメチルアジピミデー
トおよびジメチルスベリミデートのようなイミドエステ
ルの二重作用的な誘導体、スベリン酸ジスクシニミジル
のような活性エステル類、グルタルアルデヒドおよびグ
リコールアルデヒドのようなアルデヒド類、ビス−（Ｐ
−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのようなビス
−アジド化合物、ビス−（Ｐ−ジアゾニウムベンゾイ
ル）−エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム誘
導体、トリレン−２，６−ジイソシアネートおよびトリ
レン２，４−ジイソシアネートのようなジイソシアネー
ト類、ならびに、１，５−フルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼンのようなビス−活性フルオロリン化合物および
エチレングリコール／ビス−［スクシンイミジルスクシ
ネート］、ｍ−マレイミド ベンゾイル スルファスク
シンイミド、ジエチレン トリアミン 無水五酢酸のよ
うな他の試薬を含む。
作用的な蛋白質交差結合試薬を使用してなされ得る。そ
のような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ジメチルアジピミデー
トおよびジメチルスベリミデートのようなイミドエステ
ルの二重作用的な誘導体、スベリン酸ジスクシニミジル
のような活性エステル類、グルタルアルデヒドおよびグ
リコールアルデヒドのようなアルデヒド類、ビス−（Ｐ
−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのようなビス
−アジド化合物、ビス−（Ｐ−ジアゾニウムベンゾイ
ル）−エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム誘
導体、トリレン−２，６−ジイソシアネートおよびトリ
レン２，４−ジイソシアネートのようなジイソシアネー
ト類、ならびに、１，５−フルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼンのようなビス−活性フルオロリン化合物および
エチレングリコール／ビス−［スクシンイミジルスクシ
ネート］、ｍ−マレイミド ベンゾイル スルファスク
シンイミド、ジエチレン トリアミン 無水五酢酸のよ
うな他の試薬を含む。
【００３０】蛋白質の生物学的活性が、Ｃ−末端残基で
の結合または支持材料にたいする蛋白質の付着のような
立体障害のために直接結合により極めて減少する場合、
支持材料から蛋白質を隔てるように機能する結合基を使
用することが望ましい。そのような結合基の例は、ポリ
ペプチド、蛋白質および多機能性重合体を含むが、それ
らに限定されない。そのような結合基は、結合効率を増
加させるためにヒルジンまたはヒルジン誘導体の付加の
ための多数の部位を提供することも可能である。
の結合または支持材料にたいする蛋白質の付着のような
立体障害のために直接結合により極めて減少する場合、
支持材料から蛋白質を隔てるように機能する結合基を使
用することが望ましい。そのような結合基の例は、ポリ
ペプチド、蛋白質および多機能性重合体を含むが、それ
らに限定されない。そのような結合基は、結合効率を増
加させるためにヒルジンまたはヒルジン誘導体の付加の
ための多数の部位を提供することも可能である。
【００３１】結合工程の間、該領域のアミノ酸残基の活
性な官能基を保護することにより、蛋白質の活性領域、
即ちトロンビン結合領域を保護することも可能である。
例えば、４７位のリジン残基がヒルジンの生物学的活性
を伴う可能性が提案される。それゆえ、この残基は、ｐ
Ｈを調製することによりアミノ基に陽子を付加するか、
無水シトラコン酸、３，４，５，６テトラヒドロ無水フ
タル酸、もしくは当業者に知られた他の試薬のような試
薬で逆にアミノ基をブロック（封鎖）することの何れか
により保護し得る。
性な官能基を保護することにより、蛋白質の活性領域、
即ちトロンビン結合領域を保護することも可能である。
例えば、４７位のリジン残基がヒルジンの生物学的活性
を伴う可能性が提案される。それゆえ、この残基は、ｐ
Ｈを調製することによりアミノ基に陽子を付加するか、
無水シトラコン酸、３，４，５，６テトラヒドロ無水フ
タル酸、もしくは当業者に知られた他の試薬のような試
薬で逆にアミノ基をブロック（封鎖）することの何れか
により保護し得る。
【００３２】［例１］天然ヒルジン（約７００ＡＴＵ／
ｍｇ、英国Ｂｉｏｐｈａｒｍ社）が、８〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ（約６０００ＡＴＵ／ｍｌ）を含む溶液を形成するよ
うにＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタン−スルホン酸、０．１Ｍ，ｐ
Ｈ７．２）に溶解された。ヒルジン溶液は使用するまで
４℃に保たれた。
ｍｇ、英国Ｂｉｏｐｈａｒｍ社）が、８〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ（約６０００ＡＴＵ／ｍｌ）を含む溶液を形成するよ
うにＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタン−スルホン酸、０．１Ｍ，ｐ
Ｈ７．２）に溶解された。ヒルジン溶液は使用するまで
４℃に保たれた。
【００３３】誘導、交差結合された寒天ゲルビーズ支持
体（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に対
するヒルジンの水性結合は、所望量の寒天ゲルスラリー
（約２ｍｇ）を小さな焼結ガラス漏斗を通すことにより
行われた。過剰の上澄み液は除去され、ゲルは３倍量の
冷たい（４℃）脱イオン水で洗浄された。湿潤ゲル０．
５ｍｌが、約０．４ｍｌゲル対１ｍｌヒルジン溶液の
比、即ちゲル１ｍｌ当たり約２０−２５ｍｇヒルジンの
冷ヒルジン溶液１ｍｌを含む試験管内に移された。この
ゲル−ヒルジン混合物は、４℃で静かに撹拌し一晩培養
された。培養後、ゲル−ヒルジン錯体は、５分間６００
０回転での遠心分離により採取された。ゲル−ヒルジン
錯体は、１０倍量のｐＨ７．０±０．１、０．１Ｍ燐酸
塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄された。残存する活性なエス
テルは、ｐＨ７．８、１Ｍのグリシンエチルエステルで
処理することによりブロックされた。室温での１時間培
養の後、過剰のグリシンエチルエステルは除去され、ゲ
ルは１０倍量のＰＢＳで３回洗浄された。最後に、ゲル
は５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され、
生物学的アッセイに供されるまで４℃で貯蔵された。
体（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に対
するヒルジンの水性結合は、所望量の寒天ゲルスラリー
（約２ｍｇ）を小さな焼結ガラス漏斗を通すことにより
行われた。過剰の上澄み液は除去され、ゲルは３倍量の
冷たい（４℃）脱イオン水で洗浄された。湿潤ゲル０．
５ｍｌが、約０．４ｍｌゲル対１ｍｌヒルジン溶液の
比、即ちゲル１ｍｌ当たり約２０−２５ｍｇヒルジンの
冷ヒルジン溶液１ｍｌを含む試験管内に移された。この
ゲル−ヒルジン混合物は、４℃で静かに撹拌し一晩培養
された。培養後、ゲル−ヒルジン錯体は、５分間６００
０回転での遠心分離により採取された。ゲル−ヒルジン
錯体は、１０倍量のｐＨ７．０±０．１、０．１Ｍ燐酸
塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄された。残存する活性なエス
テルは、ｐＨ７．８、１Ｍのグリシンエチルエステルで
処理することによりブロックされた。室温での１時間培
養の後、過剰のグリシンエチルエステルは除去され、ゲ
ルは１０倍量のＰＢＳで３回洗浄された。最後に、ゲル
は５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され、
生物学的アッセイに供されるまで４℃で貯蔵された。
【００３４】［例２］無水結合は、１ｍｌヒルジン溶液
対約０．５ｍｌゲルの比で、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフ
ォキサイド）中の例１のヒルジン溶液（８−１０ｍｇ／
ｍｌ）の所望量を、寒天ゲルＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １５に
混合することにより行われた。ゲル−ヒルジン混合物
は、静かに撹拌し４℃で４時間培養された。反応終了
後、過剰のヒルジンは除去され、残存する活性なエステ
ルは例１で述べられたようにグリシンエチルエステルに
よりブロックされた。最後に、ゲルは洗浄され、５０％
Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され、４℃で貯
蔵された。 ［例３］チロシンのフェノール基によりアミノ基を含む
表面にヒルジンを固定化するために、ヒルジンは３段階
の手順で二重作用する試薬を使用してポリマーに結合さ
れた。
対約０．５ｍｌゲルの比で、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフ
ォキサイド）中の例１のヒルジン溶液（８−１０ｍｇ／
ｍｌ）の所望量を、寒天ゲルＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １５に
混合することにより行われた。ゲル−ヒルジン混合物
は、静かに撹拌し４℃で４時間培養された。反応終了
後、過剰のヒルジンは除去され、残存する活性なエステ
ルは例１で述べられたようにグリシンエチルエステルに
よりブロックされた。最後に、ゲルは洗浄され、５０％
Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され、４℃で貯
蔵された。 ［例３］チロシンのフェノール基によりアミノ基を含む
表面にヒルジンを固定化するために、ヒルジンは３段階
の手順で二重作用する試薬を使用してポリマーに結合さ
れた。
【００３５】第一に、ＳＨ基が、アミノ基を含むポリス
チレン表面に導入された。アミノ基は、異なる二重作用
の試薬ＳＰＤＰを使用して化学修飾された。二硫化２−
ピリジル構造が該試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルとポリマーのアミノ基の反応によりポリスチレ
ンのアミノ基に導入された。特に、ポリスチレン−ＮＨ
2 微粒子（１ｍｌ、５％ｗ／ｖ）は、ＰＢＳで洗浄さ
れ、５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され
た。ＳＰＤＰ（８ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌが、懸濁液に
加えられた。該混合物は、室温で２時間培養された。反
応は、３０分間３０００回転の円心分離により粒子を採
集することにより終了し、引き続き、２０％エタノール
で２回、ｐＨ５．０，０．１Ｍ酢酸塩緩衝液で１回該粒
子を洗浄した。化学修飾された粒子は、５％ｗ／ｖ溶液
として酢酸塩緩衝液中に再懸濁された。反応完了後、ポ
リスチレン−二硫化ピリジル構造は、５０ｍＭジチオト
レイトール（ＤＤＴ）（Ｃａｒｌｓｏｎ Ｊ．等、バイ
オケミカル・ジャーナル１７３巻、７２３−７３７頁
（１９７８））で還元された。
チレン表面に導入された。アミノ基は、異なる二重作用
の試薬ＳＰＤＰを使用して化学修飾された。二硫化２−
ピリジル構造が該試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルとポリマーのアミノ基の反応によりポリスチレ
ンのアミノ基に導入された。特に、ポリスチレン−ＮＨ
2 微粒子（１ｍｌ、５％ｗ／ｖ）は、ＰＢＳで洗浄さ
れ、５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁され
た。ＳＰＤＰ（８ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌが、懸濁液に
加えられた。該混合物は、室温で２時間培養された。反
応は、３０分間３０００回転の円心分離により粒子を採
集することにより終了し、引き続き、２０％エタノール
で２回、ｐＨ５．０，０．１Ｍ酢酸塩緩衝液で１回該粒
子を洗浄した。化学修飾された粒子は、５％ｗ／ｖ溶液
として酢酸塩緩衝液中に再懸濁された。反応完了後、ポ
リスチレン−二硫化ピリジル構造は、５０ｍＭジチオト
レイトール（ＤＤＴ）（Ｃａｒｌｓｏｎ Ｊ．等、バイ
オケミカル・ジャーナル１７３巻、７２３−７３７頁
（１９７８））で還元された。
【００３６】第２の段階では、ヒルジンは、チロシンの
フェノール環にマレイミド基を導入するために、Ｎ−
（４−ジアゾベンゾイル）−Ｎ′−（３−マレイミドプ
ロピオニル）−ヒドラジン−テトラフルオロボレート
（ＤＭＨＴ）を使用して化学修飾された。この化学修飾
は、第１段階で調製されたＳＨ基をもつポリスチレンへ
のヒルジンの結合を許容した。この結合は、Ｄｕｎｃａ
ｎ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、８０巻、１３７−１４０頁
（１９８５年））により達成された。要約すればＤＭＨ
ＴはＤＭＳＯ中に溶解された。得られたＤＭＨＴ溶液
（３０ｍｇ／ｍｌ）は、次いで、ヒルジン溶液１ｍｌ当
たりＤＭＨＴ１０μｌの比で、４℃、ｐＨ７．８，５０
ｍＭ燐酸塩緩衝液１ｍｌ当たりヒルジン８−１０ｍｇの
溶液に加えられた。４℃、１時間の培養後、化学修飾さ
れたヒルジンは、ゲル濾過、即ちｐＨ６．５、燐酸塩緩
衝液５０ｍＭで平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５により、反応混合物から分離され
た。化学修飾されたヒルジンを含む分画は、プールさ
れ、凍結乾燥により濃縮された。
フェノール環にマレイミド基を導入するために、Ｎ−
（４−ジアゾベンゾイル）−Ｎ′−（３−マレイミドプ
ロピオニル）−ヒドラジン−テトラフルオロボレート
（ＤＭＨＴ）を使用して化学修飾された。この化学修飾
は、第１段階で調製されたＳＨ基をもつポリスチレンへ
のヒルジンの結合を許容した。この結合は、Ｄｕｎｃａ
ｎ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、８０巻、１３７−１４０頁
（１９８５年））により達成された。要約すればＤＭＨ
ＴはＤＭＳＯ中に溶解された。得られたＤＭＨＴ溶液
（３０ｍｇ／ｍｌ）は、次いで、ヒルジン溶液１ｍｌ当
たりＤＭＨＴ１０μｌの比で、４℃、ｐＨ７．８，５０
ｍＭ燐酸塩緩衝液１ｍｌ当たりヒルジン８−１０ｍｇの
溶液に加えられた。４℃、１時間の培養後、化学修飾さ
れたヒルジンは、ゲル濾過、即ちｐＨ６．５、燐酸塩緩
衝液５０ｍＭで平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５により、反応混合物から分離され
た。化学修飾されたヒルジンを含む分画は、プールさ
れ、凍結乾燥により濃縮された。
【００３７】最後の段階では、化学修飾されたヒルジン
は、ＳＨ基を含むポリスチレン表面に結合された。凍結
乾燥されたヒルジン３ｍｇは、脱イオン水０．５ｍｌで
再生された。燐酸塩緩衝液（０．５〜１．０ｍｌ）中の
ＤＭＨＴ修飾されたヒルジンとポリスチレン−ＳＨ ビ
ーズ（０．１〜０．２ｍｌ，５％Ｗ／Ｖ）を含む混合物
はは、一晩室温で静かに撹拌された。洗浄後、ヒルジン
がコートされたポリスチレンは、１％Ｗ／Ｖ懸濁液とし
て燐酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．８）中で貯蔵され
た。
は、ＳＨ基を含むポリスチレン表面に結合された。凍結
乾燥されたヒルジン３ｍｇは、脱イオン水０．５ｍｌで
再生された。燐酸塩緩衝液（０．５〜１．０ｍｌ）中の
ＤＭＨＴ修飾されたヒルジンとポリスチレン−ＳＨ ビ
ーズ（０．１〜０．２ｍｌ，５％Ｗ／Ｖ）を含む混合物
はは、一晩室温で静かに撹拌された。洗浄後、ヒルジン
がコートされたポリスチレンは、１％Ｗ／Ｖ懸濁液とし
て燐酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．８）中で貯蔵され
た。
【００３８】［例４］ヒルジンは、サクシニミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（ＳＭＣＣ）という試薬により、ＳＨ基
を含むポリマーに、該アミノ基を通じて固定化された。
２，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ １ｍｌ当たりヒルジン１ｍ
ｌのヒルジン溶液を、室温で１時間、ヒルジン対ＳＭＣ
Ｃが１対１０のモル比で、ＳＭＣＣ（１μｇ／ＤＭＳＯ
１ｍｌ）と反応させた。ＳＭＣＣの残存する活性部位
は、ｐＨ７．８のグリシジンエチルエステル０．１Ｍで
処理してブロックされた。ヒルジンに結合していないＳ
ＭＣＣは、ゲル濾過（ＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化された
セファデックスＧ−２５）により除去され、化学修飾さ
れたヒルジンは、０．５ｍｌ中約８００ＡＴＵに濃縮さ
れた。ＳＭＣＣ活性化ヒルジン０．５ｍｌは、ＳＨ末端
の交差結合した寒天ゲル、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１
Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｇｅｌ，０．３ｍｌのマトリッ
クスに固定化された。この結合反応は、４℃で一晩ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液中で行われた。該試薬は、例３で既に述べ
たように、緩衝液で３回洗浄することにより除去され
た。
−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（ＳＭＣＣ）という試薬により、ＳＨ基
を含むポリマーに、該アミノ基を通じて固定化された。
２，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ １ｍｌ当たりヒルジン１ｍ
ｌのヒルジン溶液を、室温で１時間、ヒルジン対ＳＭＣ
Ｃが１対１０のモル比で、ＳＭＣＣ（１μｇ／ＤＭＳＯ
１ｍｌ）と反応させた。ＳＭＣＣの残存する活性部位
は、ｐＨ７．８のグリシジンエチルエステル０．１Ｍで
処理してブロックされた。ヒルジンに結合していないＳ
ＭＣＣは、ゲル濾過（ＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化された
セファデックスＧ−２５）により除去され、化学修飾さ
れたヒルジンは、０．５ｍｌ中約８００ＡＴＵに濃縮さ
れた。ＳＭＣＣ活性化ヒルジン０．５ｍｌは、ＳＨ末端
の交差結合した寒天ゲル、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１
Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｇｅｌ，０．３ｍｌのマトリッ
クスに固定化された。この結合反応は、４℃で一晩ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液中で行われた。該試薬は、例３で既に述べ
たように、緩衝液で３回洗浄することにより除去され
た。
【００３９】例１から例４で調製した４つの物質は、共
有結合したヒルジンの生物学的活性試験により、抗血栓
性を試験された。
有結合したヒルジンの生物学的活性試験により、抗血栓
性を試験された。
【００４０】表面結合したヒルジンによるトロンビンの
アミドール活性阻害性が、発色アッセイにより測定され
た。このアッセイでは、ヒルジンがコートされた種々の
量の粒子が、所定量のヒトα−トロンビン（１ＮＩＨ単
位）と反応することを許容された。残余のトロンビン
は、発色反応における合成ペプチド基質を結合する能力
により定量される。逆に、ヒルジンがコートされた粒子
の量は、この反応で生成した強度に相関される。
アミドール活性阻害性が、発色アッセイにより測定され
た。このアッセイでは、ヒルジンがコートされた種々の
量の粒子が、所定量のヒトα−トロンビン（１ＮＩＨ単
位）と反応することを許容された。残余のトロンビン
は、発色反応における合成ペプチド基質を結合する能力
により定量される。逆に、ヒルジンがコートされた粒子
の量は、この反応で生成した強度に相関される。
【００４１】表面結合ヒルジンの生物学的活性を決定す
るために、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子（２
〜５０μｌ）が９６ウェル（ｗｅｌｌ）のミクロ滴定プ
レートのウェル中に置かれた。ウェルは、５０ｍＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％ヒト
血清アルブミンを含む緩衝液で５０μｌに満たされた。
ヒルジンがコートされた粒子は、室温で１時間、ヒトα
−トロンビン（２ＮＩＨ単位）５０μｌで培養された。
一連のヒトα−トロンビン標準（０〜２ＮＩＨ単位／ｍ
ｌ）が、コントロールとしてアッセイに含まれた。過剰
のトロンビンは、発色基質（１〜２ｍＭ／水１ｌ）２５
μｌを加えることにより測定された。該反応は、室温
（或いは３７℃）で１０分間行われた。該反応は、氷酢
酸２５μｌを加えることにより停止された。各ウェルの
上澄み液が採集され、色強度がＯ．Ｄ．４０５ｎｍで測
定された。各試料の残余のトロンビン活性は、標準曲線
から計算された。
るために、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子（２
〜５０μｌ）が９６ウェル（ｗｅｌｌ）のミクロ滴定プ
レートのウェル中に置かれた。ウェルは、５０ｍＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％ヒト
血清アルブミンを含む緩衝液で５０μｌに満たされた。
ヒルジンがコートされた粒子は、室温で１時間、ヒトα
−トロンビン（２ＮＩＨ単位）５０μｌで培養された。
一連のヒトα−トロンビン標準（０〜２ＮＩＨ単位／ｍ
ｌ）が、コントロールとしてアッセイに含まれた。過剰
のトロンビンは、発色基質（１〜２ｍＭ／水１ｌ）２５
μｌを加えることにより測定された。該反応は、室温
（或いは３７℃）で１０分間行われた。該反応は、氷酢
酸２５μｌを加えることにより停止された。各ウェルの
上澄み液が採集され、色強度がＯ．Ｄ．４０５ｎｍで測
定された。各試料の残余のトロンビン活性は、標準曲線
から計算された。
【００４２】表面結合ヒルジンによるトロンビン誘導の
フィブリノゲン血液凝固活性の阻害性は、トロンビン血
液凝固時間により評価された。トロンビン血液凝固時間
は、トロンビンによるフィブリノゲンのフィブリンへの
直接変換を測定する。ヒト標準化通常血漿（Ｂａｘｔｅ
ｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
社、Ｄａｄｅ部門）０．１ｍｌが、５０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液０．１
５ｍｌで、２分間３７℃まで予め加温された。２分間の
培養後、ヒトα−トロンビン（１２ＭＩＨ単位／ｍｌ）
５０μｌが加えられ、血液凝固時間が、フィブロメータ
（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定された。試験
試料のために、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子
が、室温で１０分間、ヒトα−トロンビン（１２ＮＩＨ
単位／ｍｌ）５０μｌで予め培養された。培養後、ヒル
ジン／トロンビン混合物は、ヒト標準化通常血漿０．１
ｍｌを含む予め加温された血漿溶液に加えられた。トリ
ス／ＮａＣｌ緩衝液が、最終体積０．３ｍｌになるよう
に加えられた。トロンビン血液凝固時間が、フィブロメ
ータにより記録された。
フィブリノゲン血液凝固活性の阻害性は、トロンビン血
液凝固時間により評価された。トロンビン血液凝固時間
は、トロンビンによるフィブリノゲンのフィブリンへの
直接変換を測定する。ヒト標準化通常血漿（Ｂａｘｔｅ
ｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
社、Ｄａｄｅ部門）０．１ｍｌが、５０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液０．１
５ｍｌで、２分間３７℃まで予め加温された。２分間の
培養後、ヒトα−トロンビン（１２ＭＩＨ単位／ｍｌ）
５０μｌが加えられ、血液凝固時間が、フィブロメータ
（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定された。試験
試料のために、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子
が、室温で１０分間、ヒトα−トロンビン（１２ＮＩＨ
単位／ｍｌ）５０μｌで予め培養された。培養後、ヒル
ジン／トロンビン混合物は、ヒト標準化通常血漿０．１
ｍｌを含む予め加温された血漿溶液に加えられた。トリ
ス／ＮａＣｌ緩衝液が、最終体積０．３ｍｌになるよう
に加えられた。トロンビン血液凝固時間が、フィブロメ
ータにより記録された。
【００４３】最後に、トロンビンがヒルジンと１対１の
極めて安定な錯体を形成するという事実に基づいて、直
接結合アッセイが、表面結合ヒルジンを検出するために
採用された。ヒトα−トロンビンは、Ｍａｒｋｗｃｌｌ
ｋの手順（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１２５巻，４２７〜４３２頁，１９８２年）に
よるヨー素−ビーズ法を使用してヨウ化された。ヒルジ
ンがコートされた粒子の懸濁液（５０μｌ）が、ｐＨ
７．２の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
燐酸緩衝液中の 125Ｉ−トロンビン（特有活性：２．６
×１０6 ｃｐｍ／μｇ）の所望量で培養された。４℃で
の少なくとも４時間の培養後、遊離の 125Ｉ−トロンビ
ンが除去され、ヒルジンがコートされた粒子は、同じ緩
衝液で大量に洗浄された。表面結合 125Ｉ−トロンビン
が測定された。適当なコントロールが、 125Ｉ−トロン
ビンの非特定吸着を訂正するために各アッセイに含めら
れた。これらのコントロールは、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １
５−ＢＳＡ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロックされた
もの、即ち利用可能な反応性基が無いもの）、Ａｆｆｉ
−Ｇｅｌ １５（ブロックされていないもの、即ち反応
性基をもつもの）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１−ＳＭＣ
Ｃ−ＢＳＡ、ＮＨ2 −ポリスチレン−ＢＳＡ、およびＮ
Ｈ2 −ポリスチレン−ヒルジン、である。
極めて安定な錯体を形成するという事実に基づいて、直
接結合アッセイが、表面結合ヒルジンを検出するために
採用された。ヒトα−トロンビンは、Ｍａｒｋｗｃｌｌ
ｋの手順（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１２５巻，４２７〜４３２頁，１９８２年）に
よるヨー素−ビーズ法を使用してヨウ化された。ヒルジ
ンがコートされた粒子の懸濁液（５０μｌ）が、ｐＨ
７．２の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
燐酸緩衝液中の 125Ｉ−トロンビン（特有活性：２．６
×１０6 ｃｐｍ／μｇ）の所望量で培養された。４℃で
の少なくとも４時間の培養後、遊離の 125Ｉ−トロンビ
ンが除去され、ヒルジンがコートされた粒子は、同じ緩
衝液で大量に洗浄された。表面結合 125Ｉ−トロンビン
が測定された。適当なコントロールが、 125Ｉ−トロン
ビンの非特定吸着を訂正するために各アッセイに含めら
れた。これらのコントロールは、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １
５−ＢＳＡ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロックされた
もの、即ち利用可能な反応性基が無いもの）、Ａｆｆｉ
−Ｇｅｌ １５（ブロックされていないもの、即ち反応
性基をもつもの）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１−ＳＭＣ
Ｃ−ＢＳＡ、ＮＨ2 −ポリスチレン−ＢＳＡ、およびＮ
Ｈ2 −ポリスチレン−ヒルジン、である。
【００４４】第１の試験の結果は、例１から４の抗血栓
性物質の表面結合ヒルジンが、トロンビンとの錯体を形
成し、それによりトロンビン触媒フィブリンの凝固形成
を阻害する能力を維持することを示す（表１）。コント
ロールと比較して、表面結合ヒルジンは、トロンビンが
触媒するフィブリノゲンからフィブリンへの変換を阻害
する。少なくとも二倍に延長されたトロンビン凝固時間
が、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５ヒルジン（５０％Ｗ／Ｖの２
０μｌ）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１ＳＭＣＣヒルジン
（３０％Ｗ／Ｖの１０μｌ）およびポリスチレンＤＭＨ
Ｔヒルジン（１％Ｗ／Ｖの２．５μｌ）がヒトα−トロ
ンビンの所定量と予め培養されたときに、観察された。
同様に、表面結合ヒルジンは、図１に示されるように発
色アッセイにより評価されるようなアミドール活性を阻
害した。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ヒルジン（５０％Ｗ／
Ｖ）またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１ヒルジン（３０％
Ｗ／Ｖ）の１０μｌがトロンビン活性を中和するように
使用されたとき、約９０％の阻害性が観察された。ポリ
スチレンＤＭＨＴヒルジン（１％Ｗ／Ｖ）の１０μｌが
使用されたとき、５０％の阻害性が観察された。この試
験で観察されたポリスチレンＤＭＨＴヒルジンの低い阻
害活性は、アッセイに使用された懸濁液中の物質の低い
濃度に起因するものということができるであろう。表面
結合ヒルジンは、表２に示されるように、 125Ｉ−トロ
ンビンにより直接結合することによりモニターされる。
コントロールと比較して、約２倍、３倍の 125Ｉ放射能
の増加が、各々、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ヒルジン（無
水結合による）、他の表面結合ヒルジンから得られた。
これらの試験の結果は、表面結合ヒルジンがその生物学
的活性を保持したことを示す。
性物質の表面結合ヒルジンが、トロンビンとの錯体を形
成し、それによりトロンビン触媒フィブリンの凝固形成
を阻害する能力を維持することを示す（表１）。コント
ロールと比較して、表面結合ヒルジンは、トロンビンが
触媒するフィブリノゲンからフィブリンへの変換を阻害
する。少なくとも二倍に延長されたトロンビン凝固時間
が、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５ヒルジン（５０％Ｗ／Ｖの２
０μｌ）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１ＳＭＣＣヒルジン
（３０％Ｗ／Ｖの１０μｌ）およびポリスチレンＤＭＨ
Ｔヒルジン（１％Ｗ／Ｖの２．５μｌ）がヒトα−トロ
ンビンの所定量と予め培養されたときに、観察された。
同様に、表面結合ヒルジンは、図１に示されるように発
色アッセイにより評価されるようなアミドール活性を阻
害した。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ヒルジン（５０％Ｗ／
Ｖ）またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ４０１ヒルジン（３０％
Ｗ／Ｖ）の１０μｌがトロンビン活性を中和するように
使用されたとき、約９０％の阻害性が観察された。ポリ
スチレンＤＭＨＴヒルジン（１％Ｗ／Ｖ）の１０μｌが
使用されたとき、５０％の阻害性が観察された。この試
験で観察されたポリスチレンＤＭＨＴヒルジンの低い阻
害活性は、アッセイに使用された懸濁液中の物質の低い
濃度に起因するものということができるであろう。表面
結合ヒルジンは、表２に示されるように、 125Ｉ−トロ
ンビンにより直接結合することによりモニターされる。
コントロールと比較して、約２倍、３倍の 125Ｉ放射能
の増加が、各々、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ヒルジン（無
水結合による）、他の表面結合ヒルジンから得られた。
これらの試験の結果は、表面結合ヒルジンがその生物学
的活性を保持したことを示す。
【００４５】
【表１】
【表２】 ［例５］ヒルジン分子のジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉ
ｄｅ）域の潜在的な結合部位（例えば６〜１４、１６〜
２２、２８〜３９の残基）の可能性を調査するために、
ヒルジンは、種々の濃度のＤＴＴで還元された。ヒルジ
ン溶液４５μｌ（５０ＡＴＵ）が、３７℃で５時間、０
〜１５ｍＭの範囲の種々の量のＤＴＴで培養された。培
養の終点で、１０倍過剰量のヨード酢酸が各試料に加え
られた。整数倍の試料が、凝固および発色アッセイによ
りヒルジンに対して試験された。
ｄｅ）域の潜在的な結合部位（例えば６〜１４、１６〜
２２、２８〜３９の残基）の可能性を調査するために、
ヒルジンは、種々の濃度のＤＴＴで還元された。ヒルジ
ン溶液４５μｌ（５０ＡＴＵ）が、３７℃で５時間、０
〜１５ｍＭの範囲の種々の量のＤＴＴで培養された。培
養の終点で、１０倍過剰量のヨード酢酸が各試料に加え
られた。整数倍の試料が、凝固および発色アッセイによ
りヒルジンに対して試験された。
【００４６】ヒルジン活性に係る還元の効果は、図２に
示された。ヒルジンの抗トロンビン活性は、３つのジス
ルフィド結合の内、１以上の構造的な無欠さに少なくと
も部分的には依存することが明らかである。それにもか
かわらず、ジスルフィド結合の部分的な還元、即ち３つ
のジスルフィド結合全部より少ない結合の還元は、ヒル
ジン分子上の潜在的な結合部位を作り出す可能性があ
る。
示された。ヒルジンの抗トロンビン活性は、３つのジス
ルフィド結合の内、１以上の構造的な無欠さに少なくと
も部分的には依存することが明らかである。それにもか
かわらず、ジスルフィド結合の部分的な還元、即ち３つ
のジスルフィド結合全部より少ない結合の還元は、ヒル
ジン分子上の潜在的な結合部位を作り出す可能性があ
る。
【００４７】［例６］４７位の活性なリジン残基を保護
するために、ヒルジンは、無水シトラコン酸で修飾され
た。ｐＨ８．５，１０ｍＭ燐酸塩で構成される緩衝液
０．２ｍｌ中にヒルジン０．１４ｍＭを含むヒルジン溶
液が調製された。無水シトラコン酸１１μＭが、室温で
一定時間に渡りヒルジン溶液に滴下的に加えられた。反
応混合物のｐＨは、１Ｍ ＮａＯＨの添加により維持さ
れた。反応は、室温で２時間以内に完了した。過剰の無
水シトラコン酸は、ゲル濾過により除去された。修飾さ
れたヒルジンからシトラコニル基を除去するために、無
水シトラコン酸で修飾されたヒルジン溶液のｐＨが、ｐ
Ｈ４．２の１０ｍＭ酢酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
緩衝液１．９ｍｌで２０μｌを希釈することによりｐＨ
４．２に調節され、反応混合物が、４５℃で５時間培養
された。
するために、ヒルジンは、無水シトラコン酸で修飾され
た。ｐＨ８．５，１０ｍＭ燐酸塩で構成される緩衝液
０．２ｍｌ中にヒルジン０．１４ｍＭを含むヒルジン溶
液が調製された。無水シトラコン酸１１μＭが、室温で
一定時間に渡りヒルジン溶液に滴下的に加えられた。反
応混合物のｐＨは、１Ｍ ＮａＯＨの添加により維持さ
れた。反応は、室温で２時間以内に完了した。過剰の無
水シトラコン酸は、ゲル濾過により除去された。修飾さ
れたヒルジンからシトラコニル基を除去するために、無
水シトラコン酸で修飾されたヒルジン溶液のｐＨが、ｐ
Ｈ４．２の１０ｍＭ酢酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
緩衝液１．９ｍｌで２０μｌを希釈することによりｐＨ
４．２に調節され、反応混合物が、４５℃で５時間培養
された。
【００４８】Ｎ−末端バリンおよびリジン基のアセチル
化による無水シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾
は、コントロール（ｐＨ４．２のヒルジン、ｐＨ４．２
のヒルジン／無水シトラコン酸）と比較して、ヒルジン
の生物化学的活性を可逆的にブロックした（図３）。無
水シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、図３に
示されるように、ヒルジンの生物化学的活性を破壊し
た。緩衝液のｐＨをｐＨ４．２まで低下させることによ
りシトラコニル基を除去した場合、４５℃で５時間の培
養の後、約８０％の活性が回復した。この手順は、固定
化工程の間、ヒルジンの活性アミノ基を保護するのに使
用され得る。
化による無水シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾
は、コントロール（ｐＨ４．２のヒルジン、ｐＨ４．２
のヒルジン／無水シトラコン酸）と比較して、ヒルジン
の生物化学的活性を可逆的にブロックした（図３）。無
水シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、図３に
示されるように、ヒルジンの生物化学的活性を破壊し
た。緩衝液のｐＨをｐＨ４．２まで低下させることによ
りシトラコニル基を除去した場合、４５℃で５時間の培
養の後、約８０％の活性が回復した。この手順は、固定
化工程の間、ヒルジンの活性アミノ基を保護するのに使
用され得る。
【００４９】本発明は以上の如く述べられたが、同一の
発明が多くの態様に変形し得ることは明らかであろう。
そのような変形例は、本発明の思想、範囲から逸脱する
ものとみなされるべきではなく、且つそのような変形は
すべて特許請求の範囲内に含まれるように意図されてい
る。
発明が多くの態様に変形し得ることは明らかであろう。
そのような変形例は、本発明の思想、範囲から逸脱する
ものとみなされるべきではなく、且つそのような変形は
すべて特許請求の範囲内に含まれるように意図されてい
る。
【図１】表面結合ヒルジンによるトロンビンのアミドー
ル活性の阻害性を示すグラフである。
ル活性の阻害性を示すグラフである。
【図２】ヒルジンの生物学的活性に関する還元の効果を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図３】無水シトラコン酸の処理を用いるヒルジンの抗
凝血活性の可逆的なブロックの効果を示すグラフであ
る。
凝血活性の可逆的なブロックの効果を示すグラフであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年９月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 17/14 Ｃ０７Ｋ 17/14 // Ａ６１Ｋ 38/55 Ａ６１Ｋ 37/64
Claims (37)
- 【請求項１】 支持材料に共有結合したヒルジンと実質
的に同一の生物学的活性を有する蛋白質から構成される
実質的にヒルジンと同一の生物学的活性を有する抗血栓
性材料。 - 【請求項２】 蛋白質が、天然ヒルジンまたは天然ヒル
ジンの誘導体である請求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項３】 蛋白質が、合成ヒルジンまたは合成ヒル
ジンの誘導体である請求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項４】 蛋白質が、ＤＮＡ組み換え技術を使用し
て誘導される請求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項５】 支持材料が、重合体である請求項１記載
の抗血栓性材料。 - 【請求項６】 重合体が、天然に生じる重合体、遺伝学
的に誘導される重合体、または合成重合体もしくは合成
共重合体である請求項５記載の抗血栓性材料。 - 【請求項７】 重合体が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ（ヒ
ドロキシエチル、メタクリレート）、ポリテトラフルオ
ロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド
類、ポリウレタン類、ポリメトキシシロキサン、多糖類
から成る群から選択される請求項５記載の抗血栓性材
料。 - 【請求項８】 重合体が、ポリビニルアルコール共重合
体、ガラス、シリカ、ポリヒドロキシエチレン メタク
リレート、無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチル
セルロース、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレ
ン、ポリエチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理し
た重合体、過沃素酸塩で処理した多糖類、アセチルメル
カプトコハク酸で修飾した重合体、フルオロ重合体、ポ
リアクリロニトリル、およびシランから成る群から選択
される請求項５記載の抗血栓性材料。 - 【請求項９】 重合体が、微生物分解可能であるもの、
部分的に微生物分解可能であるもの、微生物分解可能で
ないものである請求項５記載の抗血栓性材料。 - 【請求項１０】 支持材料が、膜、組織、器官である請
求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項１１】 支持材料が、金属である請求項１記載
の抗血栓性材料。 - 【請求項１２】 支持材料が、セラミックである請求項
１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項１３】 支持材料が、ガラスである請求項１記
載の抗血栓性材料。 - 【請求項１４】 蛋白質が、結合基により支持材料に結
合される請求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項１５】 結合基が、二重機能的な蛋白質交差結
合試薬、ポリペプチド、蛋白質、蛋白質切片、および多
機能性の重合体からなる群から選択される請求項１４記
載の抗血栓性材料。 - 【請求項１６】 蛋白質が、Ｎ−末端領域のアミノ酸残
基により支持材料に結合する請求項１記載の抗血栓性材
料。 - 【請求項１７】 蛋白質が、Ｃ−末端残基により支持材
料に結合する請求項１記載の抗血栓性材料。 - 【請求項１８】 活性な官能基を有する支持材料に、ヒ
ルジンと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質を
結合することから構成されるヒルジンと実質的に同一の
生物学的活性を有する抗血栓性材料の製造方法。 - 【請求項１９】 蛋白質が、天然ヒルジンまたは天然ヒ
ルジンの誘導体である請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項２０】 蛋白質が、合成ヒルジンまたは合成ヒ
ルジンの誘導体である請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項２１】 蛋白質が、ＤＮＡ組み換え技術を使用
して誘導される請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項２２】 支持材料が、重合体である請求項１８
記載の製造方法。 - 【請求項２３】 重合体が、天然に生じる重合体、遺伝
学的に誘導される重合体または合成の重合体もしくは共
重合体である請求項２２記載の製造方法。 - 【請求項２４】 重合体が、ポリ塩化ビニル、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ
（ヒドロキシエチル、メタクリレート）、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリア
ミド類、ポリウレタン類、ポリメトキシシロキサン、多
糖類から成る群から選択される請求項２２記載の製造方
法。 - 【請求項２５】 重合体が、ポリビニルアルコール共重
合体、ガラス、シリカ、ポリヒドロキシエチレン メタ
クリレート、無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチ
ルセルロース、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチ
レン、ポリエチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理
した重合体、過沃素酸塩で処理した多糖類、アセチルメ
ルカプトコハク酸で修飾した重合体、フルオロ重合体、
ポリアクリロニトリル、およびシランから成る群から選
択される請求項２２記載の製造方法。 - 【請求項２６】 重合体が、微生物分解可能であるも
の、部分的に微生物分解可能であるもの、微生物分解可
能でないものである請求項２２記載の製造方法。 - 【請求項２７】 支持材料が、膜、組織、器官である請
求項１８記載の製造方法。 - 【請求項２８】 支持材料が、金属である請求項１８記
載の製造方法。 - 【請求項２９】 支持材料が、セラミックである請求項
１８記載の製造方法。 - 【請求項３０】 支持材料が、ガラスである請求項１８
記載の製造方法。 - 【請求項３１】 蛋白質が、結合基により支持材料に結
合される請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項３２】 結合基が、先ず蛋白質に共有結合し、
次いで得られた蛋白質−結合基が、支持材料の官能基に
対して、蛋白質−結合基の結合基末端の官能基により共
有結合する請求項３１記載の製造方法。 - 【請求項３３】 結合基が、先ず支持材料の官能基に共
有結合し、次いで得られた支持材料−結合基が、蛋白質
に対して、支持材料−結合基の結合末端基の官能基によ
り共有結合する請求項３１記載の製造方法。 - 【請求項３４】 結合基が、二重機能的な蛋白質交差結
合試薬、ポリペプチド、蛋白質、蛋白質切片、および多
機能性の重合体からなる群から選択される請求項３１記
載の製造方法。 - 【請求項３５】 蛋白質が、Ｎ−末端領域のアミノ酸残
基により支持材料に結合される請求項１８記載の製造方
法。 - 【請求項３６】 蛋白質が、Ｃ−末端残基により支持材
料に結合される請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項３７】 更に、支持材料に結合する前に、蛋白
質のトロンビン結合領域の活性部位を保護することから
構成される請求項１８記載の製造方法。
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1997
- 1997-08-21 JP JP9224746A patent/JPH10151193A/ja active Pending
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