JPH1014573A - 生体における導入された遺伝子発現の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、外来遺伝子の発現を生体において
検出する方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 エレクトロポレーションを用いて、ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をニワトリの初期胚に導入し
た。ホタルルシフェラーゼの発光をシングルフォトンイ
メージングシステムにて検出した。この結果、ホタルル
シフェラーゼの発光が卵のままで検出された。卵は、浸
透圧を調整することにより、その後も生存させることが
可能であった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学の分
野、特に導入された遺伝子の生体での検出方法に属す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヒトや他の動物のクローン化された遺伝
子が組み込まれ、その遺伝子が体内で発現している動
物、即ちトランスジェニック動物は、ヒトの遺伝子疾患
のモデルとして、またヒト等の遺伝子のDNAの機能を解
析する実験動物として、さらには家畜の改良や大型動物
による有用物質の大量生産などにおいて、非常に利用価
値の高い動物である。このトランスジェニック動物の作
出には、これまで、前核期卵の核に、微小ピペットで遺
伝子を直接導入するマイクロインジェクション法（Bioe
ssays 2,221-225(1985)）、レトロウイルスベクターに
遺伝子を組み込み、卵に感染させるレトロウイルスベク
ター法（VIROLOGY 157,236-240(1987)など）、主として
細胞膜の脂質成分で作製した人工的な小胞で遺伝子を包
み細胞膜と融合させて細胞へ遺伝子を注入するリポソー
ム法（Ann-N-Y-Acad-Sci.,716,144-153(1994)）等の方
法が用いられてきた。

【０００３】これらの方法により導入された外来遺伝子
が標的の細胞又は組織で発現していることを確認するた
めには、標的細胞などを固定した上で、レポーターとし
ての大腸菌β−ガラクトシターゼ遺伝子の発現をX-gal
（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド
/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside）染色
すること等によって検出されていた。このため外来遺伝
子の発現が確認されても、固定された時点で細胞などは
死滅しており、外来遺伝子の標的の細胞などでの直接の
発現を確認した後、遺伝子が標的細胞などに導入された
ものを選抜した上で、成体にまで成長させることは不可
能であった。

【０００４】また、近年、トランスジェニック動物の作
成法として、胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ICM）に
由来し、インビトロ（in vitro）で未分化状態を保持し
たまま培養維持可能な細胞であるES細胞（胚性幹細胞）
を利用する方法が用いられている（Nature 309:225-256
(1984)）。この方法は、遺伝子導入を行ったES細胞を胚
盤胞内に移植してキメラ個体を得るものであるため、細
胞の段階で形質転換された細胞を抗生物質抵抗性などの
マーカー遺伝子により選抜でき、その上で成体にまで成
長させることができるという利点がある。しかし、この
方法は、外来遺伝子の発現量や発現の局在性、さらには
様々な発生段階での発現を経時的に検討しながら選抜で
きるものではなく、利用の幅は限られていた。

【０００５】そこで、外来遺伝子の発現量などを経時的
に検討しながら選抜できるシステムの確立が望まれてい
た。

【０００６】なお、現時点では、このようなインサイチ
ュウ（in situ）での発現を検出する方法は、トランス
ジェニック動物の作成における遺伝子を導入された個体
の選抜法としてのみならず、一般的な発生工学的手法と
しても確立されていない。発生現象は多くの反応がから
み合い時間の経過と共に変化する複雑な過程であり、こ
れまで解析が非常に困難であるといわれてきた。しか
し、インサイチュウ（insitu）での発現を検出するシス
テムが確立されれば、例えば、動物の発生過程における
遺伝子の発現量や局在性の経時的な解析を行うことが可
能となり、発生・分化における諸現象の解明が格段に容
易になるといえる。それゆえに、発生工学分野における
貢献度は大きいものとなることは明白である。即ち、イ
ンサイチュウ（in situ）で遺伝子の発現を検出するシ
ステムの確立が、トランスジェニック動物の作成も含め
広く発生工学分野において、強く望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、外来遺伝子
の発現を生体において検出する方法を提供することを課
題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、まず遺伝
子を導入する対象として、発生段階に応じて導入された
遺伝子の発現が確認ができるように、ニワトリの発生段
階の初期にある胚を利用した。また、この遺伝子導入法
として、一般的に操作が簡単で、導入効率の高いなどの
理由から、エレクトロポレーション法を用いた。さら
に、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝
子を用いて、目的の遺伝子が初期胚において発現してい
るかを卵のままシングルフォトンイメージングシステム
（ARGUS-50、浜松ホトニクス）にて検出した。この結
果、遺伝子導入がされた卵における該遺伝子の発現が確
認され、これにより本発明を完成した。即ち、本発明
は、（１） 電圧を瞬間的に印加することによって、細
胞外部の遺伝子を生体の細胞内部に導入したのち、該遺
伝子の発現を生体中で観察することを特徴とする、生体
における導入された遺伝子発現の検出方法、（２） 導
入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現を生体中で観察す
ることを特徴とする、（１）記載の検出方法、に関す
る。

【０００９】なお、本発明においてエレクトロポレーシ
ョンとは「電圧を瞬間的に印加することによって、細胞
外部の核酸を細胞内部に導入すること」を指す。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明において、遺伝子が導入さ
れる細胞としては、特に制限はなく、培養細胞、動物の
初期胚の細胞、動物の成体における組織の細胞などが挙
げられ、目的に応じて様々な状態または分化ステージの
細胞を用いることが可能である。トランスジェニック動
物を作成する目的の場合には、動物の初期胚、ES細胞
（胚性幹細胞）、始原生殖細胞（PG細胞）など、特に未
分化の細胞を用いるのが好ましい。この遺伝子の導入を
行う動物の種類にも、特に制限はなく、鳥類、爬虫類、
哺乳類など様々な動物に適用が可能である。

【００１１】導入することが可能な遺伝子には、特に制
限はなく、目的に応じて様々な遺伝子を用いることが可
能である。例えば、形質転換を目的とする場合には、与
えたい形質に関与している遺伝子を導入することが考え
られる。また、特定の遺伝子の機能を解析する場合に
は、該遺伝子のアンチセンスなど遺伝子の機能を阻害す
る遺伝子または特定の遺伝子のコードするタンパク質の
機能を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を導入す
ることが考えられる。さらに、特定の遺伝子の発現を経
時的に観測する場合には、上流域も含めた形で特定の遺
伝子を導入することが考えられる。これら遺伝子を検出
するためには、遺伝子を適当な検出用遺伝子と共に、ま
たは検出用遺伝子に結合して導入することが必要であ
る。なお、上記した遺伝子の発現を経時的に観測する場
合には、遺伝子の上流域のみをレポーター遺伝子と結合
して導入し、検出することも可能である。

【００１２】遺伝子の導入の条件は、細胞の種類に応じ
て異なるが、培養細胞の場合には、一般的に高電圧パル
スで短印加時間であり、生体に導入する場合には、一般
的に低電圧パルスで長印加時間である。また、動物の胚
に導入する場合には、特に低電圧パルスとする必要があ
る。具体的には、培養細胞の場合は、等張液となるよう
に浸透圧を調製したDNA溶液に細胞を浮遊させ、数100〜
1000Ｖ程度の高電圧パルスを印加時間50〜100μsec程度
で3〜8回程度かけて行うことが好適である。また、動物
の胚を用いる場合には、等張液となるように浸透圧を調
製したDNA溶液を胚に注入し、電極の端が胚の両側を挟
み込むように電極を設置して、15〜25Ｖ程度の低電圧パ
ルスを印加時間50〜100msec程度で3〜8回程度かけて行
うことが好適である。なお、鳥類を用いる場合には、電
圧の印加後は少量の卵白を胚にかぶせた上で卵殻の穴を
テープなどでしっかりとふさぐことが重要である。動物
の組織を用いる場合には、等張液となるように浸透圧を
調製したDNA溶液を動脈などに注入し、電極の端が目的
の組織の両端になるように設置して、15〜25Ｖ程度の低
電圧パルスを印加時間50〜100msec程度で3〜8回程度か
けて行うことが好適である。

【００１３】導入された遺伝子の発現を検出する方法と
しては、検出用遺伝子の種類により異なるが、例えば、
ルシフェラーゼ遺伝子などをレポーターとした場合に
は、その発光をシングルフォトンイメージングシステム
（ARGUS-50、浜松ホトニクス）により検出することの
他、蛍光顕微鏡によって検出することなどが考えられ
る。

【００１４】なお、本発明の応用例として効率的なトラ
ンスジェニック動物の作成が考えられる。例えば、遺伝
子の導入を行った動物の初期胚を成長させてトランスジ
ェニック動物を得る場合に、初期胚における該遺伝子の
発現を本発明の検出法によって確認し、個体を選抜した
上で成体にまで成長させることができる。また、遺伝子
導入を行ったES細胞を胚盤胞内に移植し、成長させて、
トランスジェニック動物を得る場合に、胚盤胞内への移
植後に、導入した遺伝子の発現を本発明の検出法にて確
認し、将来生殖細胞に分化する領域に遺伝子が導入され
ている個体を選抜した上で成体にまで成長させることが
できる。

【００１５】さらに、本発明は、発生工学における基本
技術として用いることも可能であり、遺伝子の発現量や
発現の局在性を発生過程を追って経時的に観測すること
ができる

【００１６】

【実施例】

[実施例１] 孵卵中のニワトリ胚における外来遺伝子の
発現の生体での検出 ニワトリ受精卵の鈍端を70％エタノールで消毒後、卵殻
にドリルを用いて直径1cmの窓を開け、卵殻膜とニワト
リ胚を覆う漿膜及び卵白を除去した。次いで、暴露され
たニワトリ胚に検出用遺伝子を含むベクターである「pS
Vsecluc」の溶液（胚１個当り1.5μgのDNAを、5mM 塩化
カルシウム（CaCl₂）、274mM 塩化ナトリウム（NaCl）
の溶液10μlに溶かしたもの）を先を研磨した微細ガラ
ス管によってニワトリ胚にすばやく注入した。なお、
「pSVsecluc」は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流
にウシαラクトアルブミンの分泌シグナルペプチドをコ
ードする塩基を結合した構造遺伝子とSV40 初期（earl
y） エンハンサー・プロモーターを有する発現ベクター
である（図１）。注入後エレクトロポレーターの電極棒
を用いてニワトリ胚を挟み込むようにして25V、99msec
の電気パルスを3回かけた。電気パルス処理後のニワト
リ胚を卵白で覆ってセロテープで窓を密封した。その
後、3時間おきに90度の角度で転卵しながら孵卵を続
け、遺伝子導入から48時間経過した時点で、卵のままて
ホタルルシフェラーゼの発光をシングルフォトンイメー
ジングシステム（ARGUS-50、浜松ホトニクス）にて検出
した。なお、本実験のコントロールとして、大腸菌lacZ
遺伝子の上流にSV40 初期（early） エンハンサー・プ
ロモーターを連結したpSVGalを用いた。この対照は、ル
シフェラーゼ遺伝子の代わりに、lacZを発現させたもの
である。

【００１７】この結果、遺伝子導入がされた卵では、胚
及び漿尿膜での強い発光像が確認された（図２右）。一
方、対照においては発光像は検出されなかった（図２
左）。なお、この検出には、2〜3分の時間で十分であ
り、基質となるルシフェリン溶液の浸透圧を等張液（ル
シフェリン 50mM、NaCl 137mM、KCl 2.7mM、NaHPO₄ 4.3
mM、KH₂PO₄ 1.4mM(pH7.4)）に調製することによって、
胚はこの検出後も生存させることが可能であった。

【００１８】

【発明の効果】本発明によって、外来遺伝子の発現を生
体において検出することが可能となった。本発明は、外
来遺伝子が導入された個体を選抜する際、極めて簡便で
優れた方法であり、しかも選抜後に個体を生存させてお
くことが可能である。従って、本発明によりトランスジ
ェニック動物の作成のための画期的な基盤技術が提供さ
れたといえる。

【００１９】また、本発明は、動物の発生過程などにお
ける遺伝子の発現量や局在の変動を検出し、発生・分化
過程における諸現象の解明を行うなど発生工学における
一般的な手法としても大いに利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターで
あるpSVseclucを示す図である。

【図２】図右は、ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクター
を導入したニワトリ初期胚におけるルシフェラーゼの発
光を卵のままで検出した図である。図左は、本実験の対
照として、ルシフェラーゼ遺伝子の代わりに、大腸菌la
cZ遺伝子を含むベクターを導入したニワトリ初期胚を用
いた場合の図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 電圧を瞬間的に印加することによって、
   細胞外部の遺伝子を生体の細胞内部に導入したのち、該
   遺伝子の発現を生体中で観察することを特徴とする、生
   体における導入された遺伝子発現の検出方法。
2. 【請求項２】 導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現
   を生体中で観察することを特徴とする、請求項１記載の
   検出方法。