JPH10113181A - シトクロムｂ５レダクターゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属す
る微生物由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコードす
るゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、及びそれを発現させる
シトクロムｂ５レダクターゼの製造方法。 【効果】 ミクロソーム電子伝達系の構成成分であるシ
トクロムｂ５レダクターゼの遺伝子をクローニングする
ことにより、同タンパクを遺伝子工学的に発現すること
が可能となる。このシトクロムｂ５レダクターゼを用い
て、インビトロで電子伝達系を再構成し、デサチュラー
ゼと組み合わせることにより、ヒトの必須脂肪酸等効率
よく製造することが期待できる。また、シトクロムｂ５
レダクターゼを組換えＤＮＡ手法で効率良く生産でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術の分野】本発明は、多くの真核細胞
のミクロソームに局在する特殊な酸化還元酵素系の構成
要素であるシトクロムｂ５レダクターゼをコードする遺
伝子に関し、更に詳細には、本発明はアラキドン酸を菌
体内に著量蓄積することが知られているモルティエレラ
属モルティエレラ亜属に属する微生物のシトクロムｂ５
レダクターゼをコードする遺伝子、及びその遺伝子を用
いるシトクロムｂ５レダクターゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シトクロムｂ５レダクターゼは、ミクロ
ソーム電子伝達系においてＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
の還元力をシトクロムｂ５に伝達するフラビン酵素であ
り、フェリシアニドなどの非生理的電子受容体を強く還
元する活性をもっている。動物の肝細胞ミクロソームな
どから精製されており、１個のフラビンアデニンジヌク
レオチド（ＦＡＤ）を含む分子量約３３,０００のポリ
ペプチドである。この分子は両親媒性で、Ｃ末端部の約
３０残基のアミノ酸が疎水性領域を形成し、それによっ
てミクロソームやリン脂質膜に結合する。シトクロムｂ
５レダクターゼの機能は、ミクロソーム電子伝達系の構
成成分として、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨからシトク
ロムｂ５に電子を供給し、シトクロムｂ５を経て、デサ
チュラーゼ（不飽和化酵素）のようなシアン感受性末端
を持つ酵素に更に電子を供給することである。この電子
を供給するシトクロムｂ５とシトクロムｂ５レダクター
ゼまたはフェリヘモプロテインレダクターゼとを電子伝
達系といい、幾つかのデサチュラーゼはこの電子伝達系
を共有していると考えられている。

【０００３】一方、不飽和脂肪酸（炭素数が１８〜２２
で、二重結合が２以上の脂肪酸）の中でもアラキドン酸
（ＡＲＡ）、ジホモーγーリノレン酸（ＤＧＬＡ）、エ
イコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は種々の生理作用をもつ
生理活性物質（プロスタグランジンおよびトロンボキサ
ン）の前駆体であり、例えばＥＰＡは血栓防止作用ある
いは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市
販されている。また近年、ＡＲＡ及びドコヘキサエン酸
（ＤＨＡ）は母乳中に含まれており、乳児の発育に役立
つとの報告がある（"Advances in Polyunsaturated Fat
ty Acid Research" Elsevier Science Publishers, 199
3, pp.261-264)。さらに、胎児の身長や脳の発育におけ
る重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA,90, 1073-1077(1993), Lancet, 344, 1319-1322(199
4)）。

【０００４】そこで、母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大
きな違いであるＡＲＡ及びＤＨＡを調製粉乳に添加しよ
うとする動きがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】近
年、調製粉乳にＤＨＡを添加する目的で魚油が使用され
ている。しかしながら、魚油は構成脂肪酸として多種類
の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離
することは困難であるため、例えば魚油添加調製粉乳で
はＤＨＡと共にＥＰＡが多量に存在し、ＥＰＡの作用に
より、リノール酸からＡＲＡへの変換が抑制され、生体
内のＡＲＡが減少してしまうという問題が指摘されてい
る。このような問題を解決するため、最近はクロレラ、
藻類、かび（糸状菌）、バクテリア等の微生物を利用し
て不要な脂肪酸を含まず、目的とする不飽和脂肪酸を多
量に生産する方法が注目されている。

【０００６】本発明者等は、糸状菌であるモルティエレ
ラ属のモルティエレラ亜属に属するモルティエレラ・ア
ルピナ（Mortierella alpina）が、菌体内に著量の油脂
を蓄積し、特にＡＲＡの生産性が非常に高いことに着目
し、モルティエレラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５レ
ダクターゼをコードする遺伝子をクローニングし、これ
を不飽和脂肪酸生産能を有する微生物に導入し、微生物
による不飽和脂肪酸の生産性向上に利用することを検討
した。

【０００７】本発明においては、配列表の配列番号１及
び２のプライマーから作成したプローブを用いてモルテ
ィエレラ・アルピナ（遺伝子源微生物）からシトクロム
ｂ５レダクターゼをコードするゲノム遺伝子及びｃＤＮ
Ａのクローニングを行うことに成功した。

【０００８】本発明の遺伝子をミクロソーム電子伝達系
を有する真核細胞に導入することにより、電子伝達系が
増強され、シアン感受性末端の酵素（ＣＳＦ）により多
くの電子が供給されることになり、ＣＳＦによる反応を
効率よく行わせることが可能になる。また他の電子伝達
系の酵素やＣＳＦをコードする遺伝子と組み合わせて導
入することによって、ＣＳＦによる反応を強化すること
が期待できる。特に本発明の遺伝子を単独で又は他の電
子伝達系の酵素やデサチュラーゼをコードする遺伝子と
組み合わせて導入することによって、不飽和脂肪酸の生
産性を向上させることが期待できる。

【０００９】本発明の遺伝子は、遺伝子組み換え技術に
より適当な発現ベクターを構築し、これによって不飽和
脂肪酸生産能を有する宿主細胞を形質転換し、培養する
ことにより、目的の不飽和脂肪酸を発現させることがで
きる。また形質転換により不飽和脂肪酸生産能が付与さ
れた大腸菌や枯草菌、酵母等を宿主細胞として使用する
こともできる。さらに大豆、ひまわり、アブラナ、ごま
等の高等植物に本発明の遺伝子を導入することにより、
目的の不飽和脂肪酸の生産を向上させることが期待でき
る。

【００１０】本発明は、モルティエレラ属モルティエレ
ラ亜属に属する微生物由来のシトクロムｂ５レダクター
ゼをコードする遺伝子を提供する。この遺伝子はｍＲＮ
ＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡのい
ずれであってもよい。また、シトクロムｂ５レダクター
ゼ活性を保持しかつシトクロムｂ５レダクターゼのアミ
ノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、
又は他のアミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペ
プチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。

【００１１】本発明は、更にシトクロムｂ５レダクター
ゼをコードする遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法によ
り、完全長シトクロムｂ５レダクターゼ、及びシトクロ
ムｂ５レダクターゼ活性を保持しかつシトクロムｂ５レ
ダクターゼのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を
欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付
加した修飾ポリペプチドの生産方法を提供する。

【００１２】本発明のシトクロムｂ５レダクターゼ遺伝
子は次の方法でクローニングできる。

【００１３】（遺伝子源）本発明においては遺伝子源と
して使用できる微生物は、モルティエレラ属モルティエ
レラ亜属であれば、特に種や株を限定するものではな
く、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属に属す
るアルピナ（alpina）、バイニエリ（bainier i）、エロ
ンガタ（elongata）、エキシグア（exigua）、ミネッテ
ィシマ（minut issima）、バーティシラタ（verticillat
a）、フィグロフィラ（hygrophila）、ポリセファラ（p
olycephala）種等を挙げることができ、またモルティエ
レラ・アルピナ種に属する菌株を下記の寄託番号によ
り、所定の寄託機関から入手できる。

【００１４】モルティエレラ・アルピナ（ＡＴＣＣ８９
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等）。

【００１５】本発明では、電子伝達系を有する生物を形
質転換することにより、ＣＳＦ（シアン感受性末端の酵
素）への電子伝達が強化された生物を人為的に創製する
ことができる。特に不飽和脂肪酸生産能を有する生物を
形質転換することにより、デサチュラーゼへの電子の供
給が強化されて不飽和脂肪酸高生産生物を人為的に創製
することができる。

【００１６】このような生物としてオメガ３系不飽和脂
肪酸生産能を有する微生物である海洋性クロレラ、微細
紅藻、微細藻類が挙げられ、例えば有色藻門に属するク
リプセコディミウム（Crypthecodimium）属、イソクリ
シス（Isochrysis）属、ナノクロロプシス（Nannochlor
opsis）属、カエトセロス（Chaetoceros）属、ファエオ
ダクチルム（Phaeodactylum）属、アンフィディニウム
（Amphidinium）属、ゴニアウラクス（Gonyaulax）属、
ペリディミウム（Peridimium）属、クロオモナス（Chro
omonas）属、クリプトモナス（Cryptomonas）属、ヘミ
セルミス（Hemis elmis）属、キロモナス（Chilomonas）
属、緑藻門に属するクロレラ（Chlorella）属、さらに
ヒスチオブランクス（Histiobranchus）属及びコリファ
エノイデス（Coryphaenoides）属に属する微生物を挙げ
ることができる。クリプセコディミウム属では例えば、
クリプセコディミウム・コーニー（Crypthecodimium co
hnii）ＡＴＣＣ３００２１を挙げることができる。この
菌株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションか
ら何らの制限もなく入手することができる。さらに、エ
イコサペンタエン酸の含有率の高い油脂を生産するサバ
の腸内から単離された海洋細菌（Shewanella 属、例え
ば Shewanella putrefaciens）を挙げることができる。

【００１７】またオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有す
る微生物としてγ−リノレン酸生産能を有する微生物や
アラキドン酸生産能を有する微生物が挙げられ、アラキ
ドン酸生産能を有する微生物としては、例えばモルティ
エレラ（Mortierella）属に属するアルピナ（alpin
a）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongat
a）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutis
sima）、バーティシラタ（v erticillata）、フィグロフ
ィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）
種、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム
（Phythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペ
ニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム
(Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリュー
ム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）
属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ
（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinos
porangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属
する微生物を挙げることができ、γ−リノレン酸生産能
を有する微生物としては、モルティエレラ属に属するイ
サベリナ（isabellina）、ビナセア（vinacea）、ラマニ
アナ(ramaniana）、ラマニアナ・アングリスポラ（rama
niana anglispora）、ナナ（nana）種、アビシディア
（Absidia）属、ムコール属、リゾプス（Rizopus）属、
シンセファラストラム（Sy ncephalastrum）属、コアネ
フォラ（Choanephora）属に属する微生物を挙げること
ができる。モルティエレラ属では例えば、モルティエレ
ラ・エロンガタ（Mort ierella elengata）ＩＦＯ８５７
０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierell a exigu
a）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ
（Mortierella hy grophila）ＩＦＯ５９４１、モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＡＴＣＣ８９
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等を挙げることができる。これら
の菌株はいずれも、財団法人発酵研究所からなんら制限
なく入手することができる。また、本発明らが土壌から
分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１
９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９
号）を使用することもできる。

【００１８】（シトクロムｂ５ゲノムＤＮＡのクローニ
ング） モルティエレラ・アルピナのゲノムＤＮＡ抽出及び
コスミドライブラリーの作製 培養、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を破
砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離し、沈殿し、
ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡ
成分を精製する。これらの操作については、「植物バイ
オテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、第２５２
頁」を参照されたい。

【００１９】市販のコスミドベクターキットを用い、そ
の指示書にしたがって上記ゲノムＤＮＡをインサートＤ
ＮＡとしてコスミドベクターに挿入する。得られた組換
えベクターを、市販のパッケージングキットの細菌抽出
液を用いてパッケージングし、宿主細菌に感染させ、増
殖させてコスミドライブラリーを作製する。

【００２０】プローブの作製 現在、知られているシトクロムｂ５レダクターゼのう
ち、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同
性を示すウシ及び酵母のシトクロムｂ５レダクターゼｃ
ＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプ
ライマーを作製し、このプライマーを用い、モルティエ
レラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のゲノムＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行う。その結果、得られる増幅
ＤＮＡ断片をシークエンスし、アミノ酸配列に変換して
他生物由来のシトクロムｂ５レダクターゼとの相同性お
よび上記内部ペプチドの部分アミノ酸配列と相同な配列
を含むことを確認し、アイソトープで標識化しプローブ
としてその後の実験に使用する。

【００２１】コスミドライブラリーからのクローニン
グ コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いて
コロニーハイブリダイゼーションを行う。得られるポジ
ティブクローンのコスミドを例えばアルカリ法で調製
し、適当な制限酵素でサザンハイブリダイゼーションを
行い、ポジティブバンドとして得られるＤＮＡ断片をシ
ークエンスして目的ゲノムＤＮＡをクローニングする。

【００２２】（シトクロムｂ５レダクターゼ ｃＤＮＡ
のクローニング） ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡライブラリーの作製 培養し、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を
破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出し、ここか
ら適当な方法、例えばオリゴｄＴセルロースカラムを用
いてｍＲＮＡを精製する。

【００２３】得られるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを
合成し、これを市販のファージベクターに挿入し、さら
に常法によりパッケージングする。

【００２４】 シトクロムｂ５レダクターゼ ｃＤＮ
Ａのクローニング 宿主細菌に上記パッケージングしたｃＤＮＡライブラリ
ーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションにより
ポジティブプラークを得る。得られるクローンをシーク
エンスし、アミノ酸配列に変換し検討することにより、
モルティエレラ・アルピナのシトクロムｂ５レダクター
ゼ遺伝子全長がクローニングされることが確認できる。

【００２５】 シトクロムｂ５レダクターゼの発現 続いて、クローニングしたシトクロムｂ５レダクターゼ
ｃＤＮＡを用いて、シトクロムｂ５レダクターゼの発
現を行う。このシトクロムｂ５レダクターゼの発現は、
適当なプラスミドにシトクロムｂ５レダクターゼ ｃＤ
ＮＡを挿入し、大腸菌を宿主として形質転換し、これを
培養する公知の組換えＤＮＡの手法によって実施でき
る。例えば、Ｔ７プロモーターをもつｐＥＴシステムに
目的ｃＤＮＡを挿入し、この発現用プラスミドで大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。次いで、形質転
換された大腸菌を適当な培地で培養し、集菌し、菌体を
破砕し、シトクロムｂ５レダクターゼタンパクを分離、
精製する。

【００２６】

【実施例】本発明を以下の実施例により、更に詳細に説
明する。

【００２７】［実施例１］ ゲノムＤＮＡの作製 （１）モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のゲノムＤＮ
Ａ抽出法 対数増殖期後期の菌体を減圧ろ過で集菌した。液体窒素
中に細かくちぎった菌体を入れ、ホモゲナイザー（ワー
リングブレンダー）で細かく破砕した。ある程度細かく
なった菌体を乳鉢に移し液体窒素を加えながら乳鉢中で
すり潰した。７０℃に保温した２ｘＣＴＡＢ液で懸濁
し、６５℃で３〜４時間インキュベートした。遠心分離
した上清を順次、フェノール、フェノール／クロロホル
ム、クロロホルムで処理し、等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。リボヌクレアーゼＡおよび
リボヌクレアーゼＴ１でＲＮＡを分解し、フェノール、
フェノール／クロロホルム、クロロホルムで順次処理し
て除タンパク操作を行った。等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解しゲノムＤＮＡ標品を得た。

【００２８】（２）プローブの作製 現在、知られているシトクロムｂ５レダクターゼのう
ち、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同
性を示すウシ及び酵母のシトクロムｂ５レダクターゼｃ
ＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプ
ライマーを作製し、モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
のゲノムＤＮＡを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行っ
た。

【００２９】 ＰＣＲの実施条件 染色体ＤＮＡ ５μｇ センスプライマー ２００ｐｍｏｌ アンチセンスプライマー ２００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ（２ｍＭ） １０μｌ Ｔth ポリメラーゼ緩衝液（ｘ１０） １０μｌ Ｔth ＤＮＡポリメラーゼ ４ユニット Ｈ₂Ｏ 合計 １００μｌ ［９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分：３５サイクル］ その結果、得られた増幅した約２５０ｂｐのＤＮＡ断片
をクローン化し、塩基配列を決定したところ、その推定
されるアミノ酸配列は酵母のシトクロムｂ５レダクター
ゼと６０％以上の高い相同性を示した。よって、モルテ
ィエレラ・アルピナ１Ｓ−４のシトクロムｂ５レダクタ
ーゼゲノム遺伝子の一部を含む本断片をα−³²Ｐ−ｄＣ
ＴＰで標識し、プローブとしてｃＤＮＡのクローニング
に使用した。

【００３０】作製した合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーは次の通りであった。

【化１】

【化２】 （尚、上記式中Ｉはイノシンを表す。）

【００３１】［実施例２］ ｃＤＮＡの作製 （１）ｍＲＮＡの調製 菌体は対数増殖期前期に集菌し、直ちに液体窒素で凍結
後破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出した。得
られた全ＲＮＡをオリゴｄＴ-セルロースカラムにかけ
ることにより精製した（ｍＲＮＡ Purification kit; P
harmacia Biotech）。

【００３２】（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 得られたｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡラピッドアダ
プターライゲーションモジュール（cDNA rapid adaptor
ligation module code RPN1712）（アマシャム社）を
用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡラピッ
ドクローニングモジュール-λｇｔ１０（cDNA rapid cl
oning module-λgt10 code RPN1713）（アマシャム社）
を用いてλｇｔ１０に連結した。このλｇｔ１０-ｃＤ
ＮＡライブラリーをλＤＮＡインビトロパッケージング
モジュール（λDNA invitro packaging module code RP
N1717）（アマシャム社）を用いてパッケージングし
た。

【００３３】（３）シトクロムｂ５レダクターゼｃＤＮ
Ａのクローニング ｃＤＮＡライブラリーに対して、先のプローブを用いた
プラークハイブリダイゼーションを行った結果、数個の
陽性プラークが得られた。その内の１つの陽性プラーク
を用いλファージを調製し、pBluescript II にサブク
ローニングし、その塩基配列を決定した。得られたｃＤ
ＮＡは１０９２個のヌクレオチドで構成されており、本
シトクロムｂ５レダクターゼは２９８個のアミノ酸から
成り分子量約３万２千であると推定された。得られたｃ
ＤＮＡを図１に示した。また、このｃＤＮＡから推定さ
れるシトクロムｂ５のアミノ酸配列を図２に示した。さ
らに、上記ｃＤＮＡと上記推定アミノ酸配列との対応を
図３に示した。

【００３４】モルティエレラ・アルピナＡＴＣＣ４２４
３０又はモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８を用
いて、実施例１及び２と同様の方法で、目的とするゲノ
ムＤＮＡ及びｃＤＮＡをクローニングすることができ
る。

【００３５】（４）シトクロムｂ５レダクターゼの発現 得られたシトクロムｂ５レダクターゼｃＤＮＡで大腸菌
を形質転換し、シトクロムｂ５レダクターゼの発現を確
認した。

【００３６】［実施例３］ モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のゲノム遺伝子のク
ローニング （１）ゲノムＤＮＡの作製 実施例１の（１）と同様な方法によりＤＮＡ標品を得
た。

【００３７】（２）コスミドライブラリーの作製 コスミドはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＳＵＰＥＲＣＯＳ
１ ＣＯＳＭＩＤＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴを用いた。コス
ミドライブラリー作製法はそのプロトコールに従った。
コスミドをＸｂａＩで制限酵素処理し、ＣＩＰ（ＴＡＫ
ＡＲＡ）で脱リン酸化し、ＢａｍＨＩで制限酵素処理す
ることでコスミドアームを調製した。インサートＤＮＡ
は制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化することで得た。コ
スミドアームと部分消化インサートＤＮＡとをライゲー
ションし、次のパッケージング操作へ進んだ。パッケー
ジングはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＧＩＧＡＰＡＣＫII
ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ ＥＸＴＲＡＣＴを用いた。宿主大
腸菌はＸＬ１-Ｂｌｕｅ ＭＲを用いた。

【００３８】（３）プローブの作製 実施例２で得たモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のシ
トクロムｂ５レダクターゼｃＤＮＡをα−³²Ｐ−ｄＣＴ
Ｐで標識しプローブとして、モルティエレラ・アルピナ
１Ｓ−４のシトクロムｂ５レダクターゼゲノム遺伝子の
クローニングに使用した。

【００３９】（４）モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
のシトクロムｂ５レダクターゼゲノム遺伝子のクローニ
ング コスミドライブラリーに対して、先のプローブを用いた
コロニーハイブリダイゼーションを行った結果、数個の
陽性クローンが得られた。その内の一つの陽性クローン
のコスミドをアルカリ法で調製し、サザンハイブリダイ
ゼーションを行った。ポジティブバンドとして得られた
約３.３ ｋｂのＳｐｈＩ断片の塩基配列を決定したとこ
ろ、シトクロムｂ５レダクターゼ遺伝子全体を含んでい
ることが判明した。本シトクロムｂ５レダクターゼ遺伝
子は、四つのイントロンを含む五つのエクソンから成る
ことが明らかとなった。解析されたゲノム遺伝子の全塩
基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を図４〜図
６に示す。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、ＡＲＡを菌体内に著量蓄
積するモルティエレラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５
レダクターゼをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ
が与えられる。この遺伝子のクローニングにより、シト
クロムｂ５レダクターゼタンパクを遺伝子工学的に生産
できる。また、この遺伝子を用いることにより、デサチ
ュラーゼのようなシアン感受性末端酵素に電子を供給す
る電子伝達系の構築またはその系を増強し、それによっ
て不飽和脂肪酸の生産性の向上が期待できる。

【００４１】

【配列表】

【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：

【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：

【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：１０９２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列：

【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：２９９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列：

【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：３２８４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコードするｃＤＮ
Ａである。

【図２】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコードするｃＤＮ
Ａから推定されたアミノ酸配列である。

【図３】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコードするｃＤＮ
Ａと、それから推定されるアミノ酸配列との対応を示
す。

【図４】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコードするゲノム
ＤＮＡと、それによってコードされるアミノ酸配列との
対応を示す。

【図５】 図４の続きである。

【図６】 図５の続きである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モルティエレラ属モルティエレラ亜属に
   属する微生物由来のシトクロムｂ５レダクターゼをコー
   ドするＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 請求項１の核酸でコードされたアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 配列番号：４のアミノ酸配列からなるポ
   リペプチド、又はシトクロムｂ５レダクターゼの活性を
   保持しかつ配列番号：４のアミノ酸配列の１又は２以上
   のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又
   は２以上付加した修飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ
   配列。
4. 【請求項４】 配列番号：４のアミノ酸配列をコードす
   るＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 配列番号：３のヌクレオチド配列、又は
   そのヌクレオチド配列の１又は２以上のヌクレオチドを
   欠失し、置換し、又は他のヌクレオチドを１又は２以上
   を付加した修飾ヌクレオチド配列でありかつその配列に
   よってコードされるポリペプチドがシトクロムｂ５レダ
   クターゼ活性を持つヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配
   列。
6. 【請求項６】 配列番号：３のヌクレオチド配列からな
   るＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 配列番号：５のヌクレオチド配列、又は
   そのヌクレオチド配列の１又は２以上のヌクレオチドを
   欠失し、置換し、又は他のヌクレオチドを１又は２以上
   を付加した修飾ヌクレオチド配列でありかつその配列に
   よってコードされるポリペプチドがシトクロムｂ５レダ
   クターゼ活性を持つことを特徴とするヌクレオチド配列
   からなるＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 配列番号５：のヌクレオチド配列からな
   るＤＮＡ配列。