JP3980074B2 - △９−デサチュラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
［技術分野］
本発明は、脂肪酸Δ９位を不飽和化する活性を有するΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子に関し、更に詳細には、本発明はアラキドン酸をはじめ有用な高度不飽和脂肪酸を菌体内に著量蓄積することが知られているモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子、及びその遺伝子を用いるΔ９−デサチュラーゼの製造方法並びにその遺伝子を含む発現ベクター、その発現ベクターによって形質転換された形質転換体、及びそれらの利用に関する。
［背景技術］
不飽和脂肪酸は、動物、植物、微生物によって合成されるが、高等動物以外では、飽和脂肪酸のパルミチン酸及びステアリン酸が、酸素添加酵素による不飽和化によりシス−Δ９をもつモノ不飽和酸となり、その後に炭素鎖延長と不飽和化を繰り返して生成される。このような不飽和化反応はいずれも、一原子酸素添加反応による好気的不飽和化であって、パルミチン酸、ステアリン酸のような飽和脂肪酸は、酸素原子とＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で不飽和化されてモノエン酸となる。
本明細書では、脂肪酸のΔ９位を不飽和化する活性を有するタンパク質のことを、Δ９−デサチュラーゼ（Δ９−不飽和化酵素）と称する。また、Δ９とは、脂肪酸の二重結合の位置を、その末端カルボキシル基の炭素原子から二重結合のある炭素原子までの炭素数をΔ（デルタ）とともに表記するという規則に従った表記であり、末端カルボキシル基の炭素原子から数えて９番目と１０番目の炭素原子の間が二重結合となっていることを表わしている。なお、二重結合の位置をω（オメガ）に続いて記載する場合があるが、これは脂肪酸のメチル基末端の炭素原子から二重結合のある炭素原子までの炭素数を示している。
このようにして生合成される不飽和脂肪酸の中でもアラキドン酸（以下、「ＡＲＡ」と表記することもある）、ジホモ−γ−リノレン酸（以下、「ＤＧＬＡ」と表記することもある）、エイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」と表記することもある）は種々の生理作用をもつ生理活性物質（プロスタグランジンおよびトロンボキサン）の前駆体であり、例えばＥＰＡは血栓防止作用あるいは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市販されている。また近年、ＡＲＡ及びドコヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」と表記することもある）は母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報告がある（“Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research”Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-264）。さらに、胎児の身長や脳の発育における重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1073-1077（1993）, Lancet, 344, 1319-1322（1994））。
そこで、母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるＡＲＡ及びＤＨＡを調製粉乳に添加しようとする動きがある。
近年、調製粉乳にＤＨＡを添加する目的で魚油が使用されている。しかしながら、魚油は構成脂肪酸として多種類の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離することは困難であるため、例えば魚油添加調製粉乳ではＤＨＡと共にＥＰＡが多量に存在し、ＥＰＡの作用により、リノール酸からＡＲＡへの変換が抑制され、生体内のＡＲＡが減少してしまうという問題が指摘されている。このような問題を解決するため、最近はクロレラ、藻類、かび（糸状菌）、バクテリア等の微生物を利用して不要な脂肪酸を含まず、目的とする不飽和脂肪酸を多量に生産する方法が注目されている。
［発明の開示］
本発明者等は、糸状菌であるモルティエレラ属のモルティエレラ亜属に属するモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が、菌体内に著量の油脂を蓄積し、特にＡＲＡの生産性が非常に高いことに着目し、これらの糸状菌では、様々なデサチュラーゼが存在し、しかもその活性が非常に高いと考え、モルティエレラ・アルピナからΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子をクローニングし、これを不飽和脂肪酸生産能を有する微生物に導入して、微生物による不飽和脂肪酸の生産性向上に利用することを検討した。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡである。
図２は、図１の続きである。
図３は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列である。
図４は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡと、それから推定されるアミノ酸配列との対応を示す。
図５は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡである。
図６は、図５の続きである。
図７は、図６の続きである。
図８は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡと、それによってコードされるアミノ酸配列との対応を示す。
図９は、図８の続きである。
図１０は、実施例３において発現ベクターを構築するために使用されたベクターｐＴＡｅｘ３の制限酵素地図を示す。
本発明においては、配列表の配列番号１及び２のプライマーから作成したプローブを用いてモルティエレラ・アルピナ（遺伝子源微生物）からΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノム遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングを行うことに成功した。
本発明の遺伝子を不飽和脂肪酸生産能を有する細胞に導入することにより、パルミチン酸やステアリン酸から、不飽和脂肪酸の出発物質であるパルミトレイン酸やオレイン酸への変換が強化され、不飽和脂肪酸の生産性を向上させることが期待できる。特に本発明の遺伝子を電子伝達系の酵素や他のデサチュラーゼをコードする遺伝子と組み合わせて導入することによって、不飽和脂肪酸の生産性をさらに向上させることが期待できる。
本発明の遺伝子は、遺伝子組換え技術により適当な発現ベクターを構築し、これによって不飽和脂肪酸生産能を有する宿主細胞を形質転換し、培養することにより、目的とするΔ９−不飽和脂肪酸を産生させることができる。このような宿主細胞としては、不飽和脂肪酸を生産する能力を有しておれば特に限定されないが、大腸菌、枯草菌などのバクテリア、サッカロマイセスなどの担子菌、アスペルギルスなどの糸状菌などが挙げられる。さらに、これらの宿主細胞は不飽和脂肪酸を効率良く生産するように形質転換されていても良い。また、大豆、ひまわり、アブラナ、ごま等の不飽和脂肪酸を生産する高等植物に常法により本発明の遺伝子を導入することにより、目的とするΔ９−不飽和脂肪酸を産生させることもできる。
本発明は、Δ９−デサチュラーゼをコードする、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物由来の遺伝子を提供する。この遺伝子はｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また、Δ９−デサチュラーゼ活性を保持しかつΔ９−デサチュラーゼのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
本発明は、更にΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法により、完全長Δ９−デサチュラーゼ、及びΔ９−デサチュラーゼ活性を保持しかつΔ９−デサチュラーゼのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドの生産方法を提供する。
本発明のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子は次の方法でクローニングできる。
（遺伝子源）
本発明においては遺伝子源として使用できる微生物は、モルティエレラ属モルティエレラ亜属であれば、特に種や株を限定するものではなく、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属に属するアルピナ（alpina）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongata）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutissima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）種等を挙げることができ、またモルティエレラ・アルピナ種に属する菌株を下記の寄託番号により、所定の寄託機関から入手できる。
モルティエレラ・アルピナ（ＡＴＣＣ８９７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６８、ＩＦＯ３２２８１等）。
本発明では、不飽和脂肪酸生産能を有する生物を形質転換することにより、Δ９−デサチュラーゼ活性が強化された生物を人為的に創製することができる。
不飽和脂肪酸生産能を有する生物としては、オメガ３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物やオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物等を挙げることができ、例えばオメガ３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては海洋性クロレラ、微細紅藻、微細藻類が挙げられ、例えば有色藻門に属するクリプセコディミウム（Crypthecodimium）属、イソクリシス（Isochrysis）属、ナノクロロプシス（Nannochloropsis）属、カエトセロス（Chaetoceros）属、ファエオダクチルム（Phaeodactylum）属、アンフィディニウム（Amphidinium）属、ゴニアウラクス（Gonyaulax）属、ペリディミウム（Peridimium）属、クロオモナス（Chroomonas）属、クリプトモナス（Cryptomonas）属、ヘミセルミス（Hemiselmis）属、キロモナス（Chilomonas）属、緑藻門に属するクロレラ（Chlorella）属、さらにヒスチオブランクス（Histiobranchus）属及びコリファエノイデス（Coryphaenoides）属に属する微生物を挙げることができる。クリプセコディミウム属では例えば、クリプセコディミウム・コーニー（Crypthecodimium cohnii）ＡＴＣＣ３００２１を挙げることができる。この菌株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションから何らの制限もなく入手することができる。さらに、エイコサペンタエン酸の含有率の高い油脂を生産するサバの腸内から単離された海洋細菌（Shewanella属、例えばShewanella putrefaciens）を挙げることができる。
またオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては、γ−リノレン酸生産能を有する微生物やアラキドン酸生産能を有する微生物が挙げられ、アラキドン酸生産能を有する微生物としては、例えばモルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ亜属に属するアルピナ（alpina）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongata）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutissima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）種、及びコニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Phythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属する微生物を挙げることができ、γ−リノレン酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属するイサベリナ（isabellina）、ビナセア（vinacea）、ラマニアナ（ramaniana）、ラマニアナ・アンダリスポラ（ramaniana anglispora）、ナナ（nana）種、アビシディア（Absidia）属、ムコール属、リゾプス（Rizopus）属、シンセファラストラム（Syncephalastrum）属、コアネフォラ（Choanephora）属に属する微生物を挙げることができる。モルティエレラ属モルティエレラ亜属では例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elengata）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＡＴＣＣ８９７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６８、ＩＦＯ３２２８１等を挙げることができ、これらの菌株はいずれも、財団法人発酵研究所からなんら制限なく入手することができる。また、本発明らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２３９）を使用することもできる。
（Δ９−デサチュラーゼゲノムＤＮＡのクローニング）
▲１▼ モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のゲノムＤＮＡ抽出及びコスミドライブラリーの作製
培養、集菌したモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物の菌体を破砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離し、沈殿し、ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡ成分を精製する。これらの操作については、「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、第２５２頁」を参照されたい。
市販のコスミドベクターキットを用い、その指示書にしたがって上記ゲノムＤＮＡをインサートＤＮＡとしてコスミドベクターに挿入する。得られた組換えべクターを、市販のパッケージングキットの細菌抽出液を用いてパッケージングし、宿主細菌に感染させ、増殖させてコスミドライブラリーを作製する。
▲２▼プローブの作製
現在、知られているΔ９−デサチュラーゼのうち、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同性を示すラット及び酵母のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作製し、このプライマーを用い、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。その結果、得られる増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、アミノ酸配列に変換して他生物由来のΔ９−デサチュラーゼとの相同性および上記内部ペプチドの部分アミノ酸配列と相同な配列を含むことを確認し、アイソトープで標識化しプローブとしてその後の実験に使用する。
▲３▼コスミドライブラリーからのクローニング
コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行う。得られるポジティブクローンのコスミドを例えばアルカリ法で調製し、適当な制限酵素でサザンハイブリダイゼーションを行い、ポジティブバンドとして得られるＤＮＡ断片をシークエンスして目的ゲノムＤＮＡをクローニングする。
（Δ９−デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング）
▲１▼ ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡライブラリーの作製
培養し、集菌したモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物の菌体を破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出し、ここから適当な方法、例えばオリゴｄＴセルロースカラムを用いてｍＲＮＡを精製する。
得られるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、これを市販のファージベクターに挿入し、さらに常法によりパッケージングする。
▲２▼ Δ９−デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング
宿主細菌に上記パッケージングしたｃＤＮＡライブラリーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションによりポジティブプラークを得る。得られるクローンをシークエンスし、アミノ酸配列に変換し検討することにより、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子全長がクローニングされることが確認できる。
▲３▼ Δ９−デサチュラーゼの発現
続いて、クローニングしたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを用いて、Δ９−デサチュラーゼの発現を行う。このΔ９−デサチュラーゼの発現は、適当なプラスミドにΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを挿入し、大腸菌を宿主として形質転換し、これを培養する公知の組換えＤＮＡの手法によって実施できる。例えば、Ｔ７プロモータをもつｐＥＴシステムに目的ｃＤＮＡを挿入し、この発現用プラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。次いで、形質転換された大腸菌を適当な培地で培養し、集菌し、菌体を破砕し、Δ９−デサチュラーゼタンパクを分離、精製する。
また、クローニングしたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを用いて、糸状菌、例えば、麹菌アスペルギルス・オリゼー用のベクター系を用いて糸状菌に属する微生物における発現に適した発現ベクターを構築する。この発現ベクターを常法により糸状菌、例えばアスペルギルス・オリゼーに形質転換し、ステアリン酸からオレイン酸への変換効率の高いクローンを選抜し、形質転換された糸状菌を得る。
この形質転換された菌を培養し、総脂質を抽出して分析したところ、野生型の菌を同様に培養処理した場合と比較して、目的とする不飽和脂肪酸の比率が高いことが確認された。これは、形質転換された菌体内で、導入されたΔ９−デサチュラーゼ遺伝子が発現していることを示している。
本発明を以下の実施例により、更に詳細に説明する。
［実施例１］ ゲノムＤＮＡのクローニング
（１） モルティエレラ・アルピナ1S-4のゲノムＤＮＡ抽出法
（植物バイオテクノロジー実験マニュアル；農村文化社p252参照）
対数増殖期後期の菌体を減圧ろ過で集菌した。菌体を液体窒素中で凍結した後、ホモジェナイザー（ワーリングブレンダー）で破砕した。次いで得られた菌体破砕物を乳鉢に移し液体窒素を加えながらすり潰した。70℃に保温し２％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）液で懸濁し、65℃で3〜4時間インキュベートした。遠心分離した上清に対しフェノール、フエノール・クロロホルム、クロロホルム処理を順次行った。等容のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾後、ＴＥ（１０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。この溶液をリボヌクレアーゼＡ及びリボヌクレアーゼT1で処理してＲＮＡを分解し、続いてフェノール、フェノール・クロロホルム、クロロホルム処理で除タンパク操作を行った。等容のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾後、ＴＥに溶解しゲノムＤＮＡ標品を得た。
（２） コスミドライブラリー作製法
コスミドはSTRATAGENE社のSUPERCOS 1 COSMID VECTOR KITを用いた。コスミドライブラリー作製法はそのプロトコールに従った。コスミドをXbaIで制限酵素処理し、CIP（TAKARA）で脱リン酸化し、BamHIで制限酵素処理することでコスミドアームを調製した。インサートＤＮＡは制限酵素Sau3AIで部分消化することで得た。コスミドアームと部分消化インサートＤＮＡをライゲーションし、次のパッケージング操作へ進んだ。パッケージングはSTRATAGENE社のGIGAPACK II PACKAGING EXTRACTを用いた。宿主大腸菌はXL1-Blue MRを用いた。
（３） プローブの作製
現在、知られているΔ９−デサチュラーゼの内、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同性を示すラットの肝臓と酵母のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作製し、モルティエレラ・アルピナ1S-4のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
その結果増幅した約560bpのＤＮＡ断片をクローン化し塩基配列を決定したところ、その推定されるアミノ酸配列は酵母のΔ９−デサチュラーゼと約48％の高い相同性を示した。よって、本断片をα−32P-dCTPで標識しプローブとして、モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼゲノム遺伝子とｃＤＮＡのクローニングに使用した。
作製した合成オリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであった。
（４） モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼゲノム遺伝子のクローニング
コスミドライブラリーに対して、先のプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、数個の陽性クローンが得られた。その内の一つの陽性クローンのコスミドをアルカリ法で調製し、サザンハイブリダイゼーションを行った。ポジティブバンドとして得られた約3.5kbのSacI断片の塩基配列を決定したところ、Δ９−デサチュラーゼ遺伝子全体を含んでいることが判明した。
［実施例２］ ｃＤＮＡのクローニング
（１） ｍＲＮＡの調製
菌体は対数増殖期前期に集菌し、直ちに液体窒素で凍結後破砕し、AGPC法に従って全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡをオリゴdT-セルロースカラムにアプライすることでｍＲＮＡを精製した（ｍＲＮＡ精製キット：Pharmacia Biotech社）。
（２） ｃＤＮＡライブラリーの作製
得られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡラピッドアダプターライゲーションモジュール（rapid adaptor ligation module）（アマシャム社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡをｃＤＮＡラピッドクローニングモジュール-λgt10（rapid cloning module-λgt10）（アマシャム社）を用いてλgt10に連結した。このλgt10-ｃＤＮＡライブラリーをλＤＮＡインビトロパッキングモジュール（λＤＮＡ in vitro packaging module）（アマシャム社）を用いてパッケージングした。
（３） モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼ ｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡライブラリーに対して、先のプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションを行った結果、数個の陽性プラークが得られた。その内の一つの陽性プラークを用いてλファージを調製し、pBluescript IIにサブクローニングし塩基配列を決定した。
（４） モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子の解析
モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの塩基配列により本Δ９−デサチュラーゼは446個のアミノ酸から成り、分子量50,780であると推定された。本Δ９−デサチュラーゼは酵母のΔ９−デサチュラーゼに対して、402個のアミノ酸にわたって44.5％と高い相同性を示した。また、ゲノム遺伝子の塩基配列から本Δ９−デサチュラーゼはただ一つのイントロンを含むことが判明した。
（５） Δ９−デサチュラーゼの発現
得られたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡで大腸菌を形質転換し、Δ９−デサチュラーゼの発現を確認した。
［実施例３］発現ベクターの構築
（１）ベクターの構築と麹菌への形質転換
ベクターｐＴＡｅｘ３と麹菌宿主アスペルギルス・オリゼーＭ-２-３（Asperigillus oryzae-M-2-3（argB-,w））からなる宿主ベクター系を用いた。
下記の二種の合成オリゴヌクレオチドプライマー
とモルティエレラ・アルピナ 1S-4（Mortierella alpina 1S-4）のΔ９−デサチュラーゼのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen社）に挿入し、塩基配列を確認した。このブラスミドをEco RIで処理して得たＤＮＡ断片をpTAex 3（図１１）のEco RIサイトに挿入することで発現ベクターを構築した。
（２）野性株と形質転換体の作製
アスペルギルス・オリゼー M-2-3（Asperigillus oryzae-M-2-3）にpTAex 3のみを形質転換した株を以下、野性株とした。２０ｍｌ容三角フラスコ中、グルコースあるいはマルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地４ｍｌ中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した。菌体をガラスフィルター（３Ｇ１）でろ過して集め、滅菌水で洗浄した。
菌体をスパーテルで押して脱水し、次いで５０ｍｌ容プラスチックチューブにとり、０．４５μｍのフィルターでろ過したプロトプラスト化溶液（５ｍｇ／ｍｌ Novazym 234、５ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Phosphate buffer、ｐＨ６．０）１０ｍｌを加えて懸濁した。３０℃でゆっくり振還しながら約２時間反応させた後、ガラスフィルター（３Ｇ２）でろ過し、低速遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）でプロトプラストを回収した。０．８Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、遠心によりプロトプラストを得た。
プロトプラストを２ｘ１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるようにＳｏｌ Ｉ（０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、０．２倍量のＳｏｌII（４０％（w/v）PEG 4,000、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加えて混合した。
０．２ｍｌのプロトプラスト液をブラスチックチューブに分注し、（１）で作成した発現ベクターの溶液（最大２０μｌ、ＤＮＡ量としては２０μｇ）を加えて混合後、氷中で３０分間放置した。次に、１ｍｌのＳｏｌIIを加えて混合後、室温で２０分間放置した。続いて１０ｍｌのＳｏｌＩを加えて混合後、低速遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）でプロトプラストを沈殿させた。上清を除き、０．２ｍｌのＳｏｌＩを加え、プロトプラストを均一に懸濁し、最少培地（Glucose２％、ＮａＮＯ3 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、ＫＣｌ ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％）の中央にのせた後、４５℃程度に暖めておいた軟寒天培地を５ｍｌ注ぎ、プロトプラストを手早く均一になるように重層した。
出現したコロニーに対して、常法にしたがって、Δ９−デサチュラーゼ遺伝子をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、数個のクローンを得た。数個の得られたクローンのうち、ステアリン酸からオレイン酸への変換効率の最も高いクローンES-12株を得た。本酵素遺伝子をプローブとしたES-12株のゲノミックサザンハイプリダイゼーションを行ったところ、ポジティブバンドが得られた。pTAex 3には炭素源がマルトースの時に麹菌内で誘導発現されるプロモーターが存在するために、マルトースを炭素源とした。
（３）脂肪酸組成の比較
グルコースあるいはマルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地中で３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した後、常法により乾燥菌体から総脂質を抽出し、メチル化後、ガスクロマトグラフィーで分析した。ES-12株は野性株と比較してパルミトレイン酸とオレイン酸の割合が高く、リノール酸とα-リノレン酸が低かった。さらに、ES-12株においてグルコースよりもマルトースの方がパルミチン酸からパルミトレイン酸、ステアリン酸からオレイン酸への不飽和化反応が速やかに進行していると考えられた。マルトースが炭素源であるとき、野性株ではオレイン酸対ステアリン酸の比は６．９であるのに対して、ES-12株では４８であり野性株の７倍であった（下記の表１参照）。
（４）ＴＬＣによる各脂質画分の分析
３００ｍｌ容三角フラスコ中、マルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地６０ｍｌ中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した。集菌した菌体から、クロロホルム・メタノール法により総脂質を抽出した。
ＴＬＣ分析法（ＴＬＣプレート）により中性脂質画分、トリアシルグリセリ．ド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、リン脂質（ＰＬ）と、極性脂質画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルアミン（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を分画した。各画分をメチル化し、脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにより分析した。ES-12株は野性株よりＴＧの割合が高く、ＰＥの割合が低かった。各画分における脂肪酸組成に関してはES-12株は野性株よりパルミトレイン酸とオレイン酸の割合が高く、リノール酸の割合が低かった（下記の表２参照）。
［産業上の利用可能性］
本発明により、ＡＲＡを菌体内に著量蓄積するモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが与えられる。この遺伝子のクローニングにより、Δ９−デサチュラーゼタンパクを遺伝子工学的に生産できる。また、この遺伝子を用いて微生物細胞及び植物細胞等を形質転換することにより、これら形質転換細胞における不飽和脂肪酸の生産性の向上が期待できる。
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ
配列：
配列番号：２
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ
配列：
配列番号：３
配列の長さ：１７４４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
配列番号：４
配列の長さ：４４５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列：
配列番号：５
配列の長さ：３５１１
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
配列：
配列番号：６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用センスプライマーＤＮＡ
配列：
配列番号：７
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用アンチセンスプライマーＤＮＡ
配列：
本発明は、脂肪酸Δ９位を不飽和化する活性を有するΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子に関し、更に詳細には、本発明はアラキドン酸をはじめ有用な高度不飽和脂肪酸を菌体内に著量蓄積することが知られているモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子、及びその遺伝子を用いるΔ９−デサチュラーゼの製造方法並びにその遺伝子を含む発現ベクター、その発現ベクターによって形質転換された形質転換体、及びそれらの利用に関する。
［背景技術］
不飽和脂肪酸は、動物、植物、微生物によって合成されるが、高等動物以外では、飽和脂肪酸のパルミチン酸及びステアリン酸が、酸素添加酵素による不飽和化によりシス−Δ９をもつモノ不飽和酸となり、その後に炭素鎖延長と不飽和化を繰り返して生成される。このような不飽和化反応はいずれも、一原子酸素添加反応による好気的不飽和化であって、パルミチン酸、ステアリン酸のような飽和脂肪酸は、酸素原子とＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で不飽和化されてモノエン酸となる。
本明細書では、脂肪酸のΔ９位を不飽和化する活性を有するタンパク質のことを、Δ９−デサチュラーゼ（Δ９−不飽和化酵素）と称する。また、Δ９とは、脂肪酸の二重結合の位置を、その末端カルボキシル基の炭素原子から二重結合のある炭素原子までの炭素数をΔ（デルタ）とともに表記するという規則に従った表記であり、末端カルボキシル基の炭素原子から数えて９番目と１０番目の炭素原子の間が二重結合となっていることを表わしている。なお、二重結合の位置をω（オメガ）に続いて記載する場合があるが、これは脂肪酸のメチル基末端の炭素原子から二重結合のある炭素原子までの炭素数を示している。
このようにして生合成される不飽和脂肪酸の中でもアラキドン酸（以下、「ＡＲＡ」と表記することもある）、ジホモ−γ−リノレン酸（以下、「ＤＧＬＡ」と表記することもある）、エイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」と表記することもある）は種々の生理作用をもつ生理活性物質（プロスタグランジンおよびトロンボキサン）の前駆体であり、例えばＥＰＡは血栓防止作用あるいは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市販されている。また近年、ＡＲＡ及びドコヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」と表記することもある）は母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報告がある（“Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research”Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-264）。さらに、胎児の身長や脳の発育における重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1073-1077（1993）, Lancet, 344, 1319-1322（1994））。
そこで、母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるＡＲＡ及びＤＨＡを調製粉乳に添加しようとする動きがある。
近年、調製粉乳にＤＨＡを添加する目的で魚油が使用されている。しかしながら、魚油は構成脂肪酸として多種類の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離することは困難であるため、例えば魚油添加調製粉乳ではＤＨＡと共にＥＰＡが多量に存在し、ＥＰＡの作用により、リノール酸からＡＲＡへの変換が抑制され、生体内のＡＲＡが減少してしまうという問題が指摘されている。このような問題を解決するため、最近はクロレラ、藻類、かび（糸状菌）、バクテリア等の微生物を利用して不要な脂肪酸を含まず、目的とする不飽和脂肪酸を多量に生産する方法が注目されている。
［発明の開示］
本発明者等は、糸状菌であるモルティエレラ属のモルティエレラ亜属に属するモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が、菌体内に著量の油脂を蓄積し、特にＡＲＡの生産性が非常に高いことに着目し、これらの糸状菌では、様々なデサチュラーゼが存在し、しかもその活性が非常に高いと考え、モルティエレラ・アルピナからΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子をクローニングし、これを不飽和脂肪酸生産能を有する微生物に導入して、微生物による不飽和脂肪酸の生産性向上に利用することを検討した。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡである。
図２は、図１の続きである。
図３は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列である。
図４は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡと、それから推定されるアミノ酸配列との対応を示す。
図５は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡである。
図６は、図５の続きである。
図７は、図６の続きである。
図８は、本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡと、それによってコードされるアミノ酸配列との対応を示す。
図９は、図８の続きである。
図１０は、実施例３において発現ベクターを構築するために使用されたベクターｐＴＡｅｘ３の制限酵素地図を示す。
本発明においては、配列表の配列番号１及び２のプライマーから作成したプローブを用いてモルティエレラ・アルピナ（遺伝子源微生物）からΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノム遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングを行うことに成功した。
本発明の遺伝子を不飽和脂肪酸生産能を有する細胞に導入することにより、パルミチン酸やステアリン酸から、不飽和脂肪酸の出発物質であるパルミトレイン酸やオレイン酸への変換が強化され、不飽和脂肪酸の生産性を向上させることが期待できる。特に本発明の遺伝子を電子伝達系の酵素や他のデサチュラーゼをコードする遺伝子と組み合わせて導入することによって、不飽和脂肪酸の生産性をさらに向上させることが期待できる。
本発明の遺伝子は、遺伝子組換え技術により適当な発現ベクターを構築し、これによって不飽和脂肪酸生産能を有する宿主細胞を形質転換し、培養することにより、目的とするΔ９−不飽和脂肪酸を産生させることができる。このような宿主細胞としては、不飽和脂肪酸を生産する能力を有しておれば特に限定されないが、大腸菌、枯草菌などのバクテリア、サッカロマイセスなどの担子菌、アスペルギルスなどの糸状菌などが挙げられる。さらに、これらの宿主細胞は不飽和脂肪酸を効率良く生産するように形質転換されていても良い。また、大豆、ひまわり、アブラナ、ごま等の不飽和脂肪酸を生産する高等植物に常法により本発明の遺伝子を導入することにより、目的とするΔ９−不飽和脂肪酸を産生させることもできる。
本発明は、Δ９−デサチュラーゼをコードする、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物由来の遺伝子を提供する。この遺伝子はｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また、Δ９−デサチュラーゼ活性を保持しかつΔ９−デサチュラーゼのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
本発明は、更にΔ９−デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法により、完全長Δ９−デサチュラーゼ、及びΔ９−デサチュラーゼ活性を保持しかつΔ９−デサチュラーゼのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドの生産方法を提供する。
本発明のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子は次の方法でクローニングできる。
（遺伝子源）
本発明においては遺伝子源として使用できる微生物は、モルティエレラ属モルティエレラ亜属であれば、特に種や株を限定するものではなく、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属に属するアルピナ（alpina）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongata）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutissima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）種等を挙げることができ、またモルティエレラ・アルピナ種に属する菌株を下記の寄託番号により、所定の寄託機関から入手できる。
モルティエレラ・アルピナ（ＡＴＣＣ８９７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６８、ＩＦＯ３２２８１等）。
本発明では、不飽和脂肪酸生産能を有する生物を形質転換することにより、Δ９−デサチュラーゼ活性が強化された生物を人為的に創製することができる。
不飽和脂肪酸生産能を有する生物としては、オメガ３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物やオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物等を挙げることができ、例えばオメガ３系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては海洋性クロレラ、微細紅藻、微細藻類が挙げられ、例えば有色藻門に属するクリプセコディミウム（Crypthecodimium）属、イソクリシス（Isochrysis）属、ナノクロロプシス（Nannochloropsis）属、カエトセロス（Chaetoceros）属、ファエオダクチルム（Phaeodactylum）属、アンフィディニウム（Amphidinium）属、ゴニアウラクス（Gonyaulax）属、ペリディミウム（Peridimium）属、クロオモナス（Chroomonas）属、クリプトモナス（Cryptomonas）属、ヘミセルミス（Hemiselmis）属、キロモナス（Chilomonas）属、緑藻門に属するクロレラ（Chlorella）属、さらにヒスチオブランクス（Histiobranchus）属及びコリファエノイデス（Coryphaenoides）属に属する微生物を挙げることができる。クリプセコディミウム属では例えば、クリプセコディミウム・コーニー（Crypthecodimium cohnii）ＡＴＣＣ３００２１を挙げることができる。この菌株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションから何らの制限もなく入手することができる。さらに、エイコサペンタエン酸の含有率の高い油脂を生産するサバの腸内から単離された海洋細菌（Shewanella属、例えばShewanella putrefaciens）を挙げることができる。
またオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては、γ−リノレン酸生産能を有する微生物やアラキドン酸生産能を有する微生物が挙げられ、アラキドン酸生産能を有する微生物としては、例えばモルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ亜属に属するアルピナ（alpina）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongata）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutissima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）種、及びコニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Phythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属する微生物を挙げることができ、γ−リノレン酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属するイサベリナ（isabellina）、ビナセア（vinacea）、ラマニアナ（ramaniana）、ラマニアナ・アンダリスポラ（ramaniana anglispora）、ナナ（nana）種、アビシディア（Absidia）属、ムコール属、リゾプス（Rizopus）属、シンセファラストラム（Syncephalastrum）属、コアネフォラ（Choanephora）属に属する微生物を挙げることができる。モルティエレラ属モルティエレラ亜属では例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elengata）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＡＴＣＣ８９７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６８、ＩＦＯ３２２８１等を挙げることができ、これらの菌株はいずれも、財団法人発酵研究所からなんら制限なく入手することができる。また、本発明らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２３９）を使用することもできる。
（Δ９−デサチュラーゼゲノムＤＮＡのクローニング）
▲１▼ モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のゲノムＤＮＡ抽出及びコスミドライブラリーの作製
培養、集菌したモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物の菌体を破砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離し、沈殿し、ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡ成分を精製する。これらの操作については、「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、第２５２頁」を参照されたい。
市販のコスミドベクターキットを用い、その指示書にしたがって上記ゲノムＤＮＡをインサートＤＮＡとしてコスミドベクターに挿入する。得られた組換えべクターを、市販のパッケージングキットの細菌抽出液を用いてパッケージングし、宿主細菌に感染させ、増殖させてコスミドライブラリーを作製する。
▲２▼プローブの作製
現在、知られているΔ９−デサチュラーゼのうち、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同性を示すラット及び酵母のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作製し、このプライマーを用い、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。その結果、得られる増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、アミノ酸配列に変換して他生物由来のΔ９−デサチュラーゼとの相同性および上記内部ペプチドの部分アミノ酸配列と相同な配列を含むことを確認し、アイソトープで標識化しプローブとしてその後の実験に使用する。
▲３▼コスミドライブラリーからのクローニング
コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行う。得られるポジティブクローンのコスミドを例えばアルカリ法で調製し、適当な制限酵素でサザンハイブリダイゼーションを行い、ポジティブバンドとして得られるＤＮＡ断片をシークエンスして目的ゲノムＤＮＡをクローニングする。
（Δ９−デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング）
▲１▼ ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡライブラリーの作製
培養し、集菌したモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物の菌体を破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出し、ここから適当な方法、例えばオリゴｄＴセルロースカラムを用いてｍＲＮＡを精製する。
得られるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、これを市販のファージベクターに挿入し、さらに常法によりパッケージングする。
▲２▼ Δ９−デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング
宿主細菌に上記パッケージングしたｃＤＮＡライブラリーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションによりポジティブプラークを得る。得られるクローンをシークエンスし、アミノ酸配列に変換し検討することにより、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子全長がクローニングされることが確認できる。
▲３▼ Δ９−デサチュラーゼの発現
続いて、クローニングしたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを用いて、Δ９−デサチュラーゼの発現を行う。このΔ９−デサチュラーゼの発現は、適当なプラスミドにΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを挿入し、大腸菌を宿主として形質転換し、これを培養する公知の組換えＤＮＡの手法によって実施できる。例えば、Ｔ７プロモータをもつｐＥＴシステムに目的ｃＤＮＡを挿入し、この発現用プラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。次いで、形質転換された大腸菌を適当な培地で培養し、集菌し、菌体を破砕し、Δ９−デサチュラーゼタンパクを分離、精製する。
また、クローニングしたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡを用いて、糸状菌、例えば、麹菌アスペルギルス・オリゼー用のベクター系を用いて糸状菌に属する微生物における発現に適した発現ベクターを構築する。この発現ベクターを常法により糸状菌、例えばアスペルギルス・オリゼーに形質転換し、ステアリン酸からオレイン酸への変換効率の高いクローンを選抜し、形質転換された糸状菌を得る。
この形質転換された菌を培養し、総脂質を抽出して分析したところ、野生型の菌を同様に培養処理した場合と比較して、目的とする不飽和脂肪酸の比率が高いことが確認された。これは、形質転換された菌体内で、導入されたΔ９−デサチュラーゼ遺伝子が発現していることを示している。
本発明を以下の実施例により、更に詳細に説明する。
［実施例１］ ゲノムＤＮＡのクローニング
（１） モルティエレラ・アルピナ1S-4のゲノムＤＮＡ抽出法
（植物バイオテクノロジー実験マニュアル；農村文化社p252参照）
対数増殖期後期の菌体を減圧ろ過で集菌した。菌体を液体窒素中で凍結した後、ホモジェナイザー（ワーリングブレンダー）で破砕した。次いで得られた菌体破砕物を乳鉢に移し液体窒素を加えながらすり潰した。70℃に保温し２％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）液で懸濁し、65℃で3〜4時間インキュベートした。遠心分離した上清に対しフェノール、フエノール・クロロホルム、クロロホルム処理を順次行った。等容のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾後、ＴＥ（１０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。この溶液をリボヌクレアーゼＡ及びリボヌクレアーゼT1で処理してＲＮＡを分解し、続いてフェノール、フェノール・クロロホルム、クロロホルム処理で除タンパク操作を行った。等容のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾後、ＴＥに溶解しゲノムＤＮＡ標品を得た。
（２） コスミドライブラリー作製法
コスミドはSTRATAGENE社のSUPERCOS 1 COSMID VECTOR KITを用いた。コスミドライブラリー作製法はそのプロトコールに従った。コスミドをXbaIで制限酵素処理し、CIP（TAKARA）で脱リン酸化し、BamHIで制限酵素処理することでコスミドアームを調製した。インサートＤＮＡは制限酵素Sau3AIで部分消化することで得た。コスミドアームと部分消化インサートＤＮＡをライゲーションし、次のパッケージング操作へ進んだ。パッケージングはSTRATAGENE社のGIGAPACK II PACKAGING EXTRACTを用いた。宿主大腸菌はXL1-Blue MRを用いた。
（３） プローブの作製
現在、知られているΔ９−デサチュラーゼの内、推定されるアミノ酸配列がお互いに比較的高い相同性を示すラットの肝臓と酵母のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作製し、モルティエレラ・アルピナ1S-4のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
作製した合成オリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであった。
コスミドライブラリーに対して、先のプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、数個の陽性クローンが得られた。その内の一つの陽性クローンのコスミドをアルカリ法で調製し、サザンハイブリダイゼーションを行った。ポジティブバンドとして得られた約3.5kbのSacI断片の塩基配列を決定したところ、Δ９−デサチュラーゼ遺伝子全体を含んでいることが判明した。
［実施例２］ ｃＤＮＡのクローニング
（１） ｍＲＮＡの調製
菌体は対数増殖期前期に集菌し、直ちに液体窒素で凍結後破砕し、AGPC法に従って全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡをオリゴdT-セルロースカラムにアプライすることでｍＲＮＡを精製した（ｍＲＮＡ精製キット：Pharmacia Biotech社）。
（２） ｃＤＮＡライブラリーの作製
得られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡラピッドアダプターライゲーションモジュール（rapid adaptor ligation module）（アマシャム社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡをｃＤＮＡラピッドクローニングモジュール-λgt10（rapid cloning module-λgt10）（アマシャム社）を用いてλgt10に連結した。このλgt10-ｃＤＮＡライブラリーをλＤＮＡインビトロパッキングモジュール（λＤＮＡ in vitro packaging module）（アマシャム社）を用いてパッケージングした。
（３） モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼ ｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡライブラリーに対して、先のプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションを行った結果、数個の陽性プラークが得られた。その内の一つの陽性プラークを用いてλファージを調製し、pBluescript IIにサブクローニングし塩基配列を決定した。
（４） モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼ遺伝子の解析
モルティエレラ・アルピナ1S-4のΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡの塩基配列により本Δ９−デサチュラーゼは446個のアミノ酸から成り、分子量50,780であると推定された。本Δ９−デサチュラーゼは酵母のΔ９−デサチュラーゼに対して、402個のアミノ酸にわたって44.5％と高い相同性を示した。また、ゲノム遺伝子の塩基配列から本Δ９−デサチュラーゼはただ一つのイントロンを含むことが判明した。
（５） Δ９−デサチュラーゼの発現
得られたΔ９−デサチュラーゼｃＤＮＡで大腸菌を形質転換し、Δ９−デサチュラーゼの発現を確認した。
［実施例３］発現ベクターの構築
（１）ベクターの構築と麹菌への形質転換
ベクターｐＴＡｅｘ３と麹菌宿主アスペルギルス・オリゼーＭ-２-３（Asperigillus oryzae-M-2-3（argB-,w））からなる宿主ベクター系を用いた。
下記の二種の合成オリゴヌクレオチドプライマー
（２）野性株と形質転換体の作製
アスペルギルス・オリゼー M-2-3（Asperigillus oryzae-M-2-3）にpTAex 3のみを形質転換した株を以下、野性株とした。２０ｍｌ容三角フラスコ中、グルコースあるいはマルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地４ｍｌ中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した。菌体をガラスフィルター（３Ｇ１）でろ過して集め、滅菌水で洗浄した。
菌体をスパーテルで押して脱水し、次いで５０ｍｌ容プラスチックチューブにとり、０．４５μｍのフィルターでろ過したプロトプラスト化溶液（５ｍｇ／ｍｌ Novazym 234、５ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Phosphate buffer、ｐＨ６．０）１０ｍｌを加えて懸濁した。３０℃でゆっくり振還しながら約２時間反応させた後、ガラスフィルター（３Ｇ２）でろ過し、低速遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）でプロトプラストを回収した。０．８Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、遠心によりプロトプラストを得た。
プロトプラストを２ｘ１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるようにＳｏｌ Ｉ（０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、０．２倍量のＳｏｌII（４０％（w/v）PEG 4,000、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加えて混合した。
０．２ｍｌのプロトプラスト液をブラスチックチューブに分注し、（１）で作成した発現ベクターの溶液（最大２０μｌ、ＤＮＡ量としては２０μｇ）を加えて混合後、氷中で３０分間放置した。次に、１ｍｌのＳｏｌIIを加えて混合後、室温で２０分間放置した。続いて１０ｍｌのＳｏｌＩを加えて混合後、低速遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）でプロトプラストを沈殿させた。上清を除き、０．２ｍｌのＳｏｌＩを加え、プロトプラストを均一に懸濁し、最少培地（Glucose２％、ＮａＮＯ3 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、ＫＣｌ ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％）の中央にのせた後、４５℃程度に暖めておいた軟寒天培地を５ｍｌ注ぎ、プロトプラストを手早く均一になるように重層した。
出現したコロニーに対して、常法にしたがって、Δ９−デサチュラーゼ遺伝子をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、数個のクローンを得た。数個の得られたクローンのうち、ステアリン酸からオレイン酸への変換効率の最も高いクローンES-12株を得た。本酵素遺伝子をプローブとしたES-12株のゲノミックサザンハイプリダイゼーションを行ったところ、ポジティブバンドが得られた。pTAex 3には炭素源がマルトースの時に麹菌内で誘導発現されるプロモーターが存在するために、マルトースを炭素源とした。
（３）脂肪酸組成の比較
グルコースあるいはマルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地中で３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した後、常法により乾燥菌体から総脂質を抽出し、メチル化後、ガスクロマトグラフィーで分析した。ES-12株は野性株と比較してパルミトレイン酸とオレイン酸の割合が高く、リノール酸とα-リノレン酸が低かった。さらに、ES-12株においてグルコースよりもマルトースの方がパルミチン酸からパルミトレイン酸、ステアリン酸からオレイン酸への不飽和化反応が速やかに進行していると考えられた。マルトースが炭素源であるとき、野性株ではオレイン酸対ステアリン酸の比は６．９であるのに対して、ES-12株では４８であり野性株の７倍であった（下記の表１参照）。
（４）ＴＬＣによる各脂質画分の分析
３００ｍｌ容三角フラスコ中、マルトース２％、ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ｐＨ５．８の培地６０ｍｌ中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで培養した。集菌した菌体から、クロロホルム・メタノール法により総脂質を抽出した。
ＴＬＣ分析法（ＴＬＣプレート）により中性脂質画分、トリアシルグリセリ．ド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、リン脂質（ＰＬ）と、極性脂質画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルアミン（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を分画した。各画分をメチル化し、脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにより分析した。ES-12株は野性株よりＴＧの割合が高く、ＰＥの割合が低かった。各画分における脂肪酸組成に関してはES-12株は野性株よりパルミトレイン酸とオレイン酸の割合が高く、リノール酸の割合が低かった（下記の表２参照）。
本発明により、ＡＲＡを菌体内に著量蓄積するモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物由来のΔ９−デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが与えられる。この遺伝子のクローニングにより、Δ９−デサチュラーゼタンパクを遺伝子工学的に生産できる。また、この遺伝子を用いて微生物細胞及び植物細胞等を形質転換することにより、これら形質転換細胞における不飽和脂肪酸の生産性の向上が期待できる。
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ
配列：
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ
配列：
配列の長さ：１７４４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
配列の長さ：４４５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列：
配列の長さ：３５１１
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
配列：
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用センスプライマーＤＮＡ
配列：
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＰＣＲ用アンチセンスプライマーＤＮＡ
配列：
Claims (14)
- 配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はΔ９−デサチュラーゼの活性を保持しかつ配列番号：４のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は数個付加した修飾ポリペプチドをコードする単離または精製されたＤＮＡ。
- 配列番号：４のアミノ酸配列をコードする単離または精製されたＤＮＡ。
- 配列番号：３のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列の１又は数個のヌクレオチドを欠失し、置換し、又は他のヌクレオチドを１又は数個を付加した修飾ＤＮＡ配列であり、かつその配列によってコードされるポリペプチドがΔ９−デサチュラーゼ活性を持つＤＮＡ配列からなる単離または精製されたＤＮＡ。
- 配列番号：３に記載の配列からなる単離または精製されたＤＮＡ。
- 配列番号：５のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列の１又は数個のヌクレオチドを欠失し、置換し、又は他のヌクレオチドを１又は数個を付加した修飾ＤＮＡ今配列であり、かつその配列によってコードされるポリペプチドがΔ９−デサチュラーゼ活性を持つことを特徴とするＤＮＡ配列からなる単離または精製されたＤＮＡ。
- 配列番号５：のヌクレオチド配列からなる単離または精製されたＤＮＡ。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
- 前記組換え発現ベクターが糸状菌に属する微生物を宿主とする発現に適したことを特徴とする請求項７記載のベクター。
- 前記微生物がアスペルギルス属に属する糸状菌である、請求項８記載のベクター。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼーである請求項９記載のベクター。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクターによって形質転換された微生物。
- 前記形質転換された微生物が、糸状菌に属する微生物であることを特徴とする請求項１１記載の形質転換された微生物。
- 前記形質転換された微生物がアスペルギルス属に属する糸状菌であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換された微生物。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼーである請求項１３記載の形質転換された微生物。
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