JPH09121873A - シトクロムｂ５遺伝子 - Google Patents
シトクロムｂ５遺伝子Info
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- JPH09121873A JPH09121873A JP8203735A JP20373596A JPH09121873A JP H09121873 A JPH09121873 A JP H09121873A JP 8203735 A JP8203735 A JP 8203735A JP 20373596 A JP20373596 A JP 20373596A JP H09121873 A JPH09121873 A JP H09121873A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cytochrome
- sequence
- amino acid
- dna
- genus
- Prior art date
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 モルティレラ・アルピナ由来のシトクロムｂ
５をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、及びそれ
を発現させるシトクロムｂ５の製造方法。 【効果】 ミクロソーム電子伝達系の構成成分であるシ
トクロムｂ５の遺伝子をクローニングすることにより、
同タンパクを遺伝子工学的に発現することが可能とな
る。このシトクロムｂ５を用いて、インビトロで電子伝
達系を再構成し、デサチュラーゼと組み合わせることに
より、ヒトの必須脂肪酸等効率よく製造することが期待
できる。また、シトクロムｂ５を組換えＤＮＡ手法で効
率良く生産できる。
５をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、及びそれ
を発現させるシトクロムｂ５の製造方法。 【効果】 ミクロソーム電子伝達系の構成成分であるシ
トクロムｂ５の遺伝子をクローニングすることにより、
同タンパクを遺伝子工学的に発現することが可能とな
る。このシトクロムｂ５を用いて、インビトロで電子伝
達系を再構成し、デサチュラーゼと組み合わせることに
より、ヒトの必須脂肪酸等効率よく製造することが期待
できる。また、シトクロムｂ５を組換えＤＮＡ手法で効
率良く生産できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術の分野】本発明は、多くの真核細胞
のミクロソームに局在する特殊な酸化還元酵素系の構成
要素であるシトクロムｂ５をコードする遺伝子に関し、
更に詳細には、本発明はアラキドン酸を菌体内に著量蓄
積することが知られているモルティエレラ・アルピナの
シトクロムｂ５をコードする遺伝子、及びその遺伝子を
用いるシトクロムｂ５の製造方法に関する。
のミクロソームに局在する特殊な酸化還元酵素系の構成
要素であるシトクロムｂ５をコードする遺伝子に関し、
更に詳細には、本発明はアラキドン酸を菌体内に著量蓄
積することが知られているモルティエレラ・アルピナの
シトクロムｂ５をコードする遺伝子、及びその遺伝子を
用いるシトクロムｂ５の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シトクロムｂ５は、Ｂ型シトクロムの１
つであり、多くの真核細胞（特に動物の肝細胞）のミク
ロソーム膜に結合している。これまで、ウマ等の数種の
動物肝細胞ミクロソームから精製されたものの一次構造
が決定されている。いずれも１３３個のアミノ酸残基か
ら成るポリペプチドとそれに非共有結合で結合したヘム
から構成されている（分子量１６，０００）。シトクロ
ムｂ５の機能は、ミクロソーム電子伝達系の構成成分と
して、ＮＡＤＨ−シトクロムｂ５レダクターゼを経てＮ
ＡＤＨから、またＮＡＤＰＨ−フェリヘモプロテインレ
ダクターゼを経てＮＡＤＰＨからそれぞれ電子を受け取
り、これをデサチュラーゼ（不飽和化酵素）のようなシ
アン感受性末端を持つ酵素に供給することである。この
電子を供給するシトクロムｂ５とＮＡＤＨ−シトクロム
ｂ５レダクターゼまたはＮＡＤＰＨ−フェリヘモプロテ
インレダクターゼとを電子伝達系といい、幾つかのデサ
チュラーゼはこの電子伝達系を共有していると考えられ
ている。
つであり、多くの真核細胞（特に動物の肝細胞）のミク
ロソーム膜に結合している。これまで、ウマ等の数種の
動物肝細胞ミクロソームから精製されたものの一次構造
が決定されている。いずれも１３３個のアミノ酸残基か
ら成るポリペプチドとそれに非共有結合で結合したヘム
から構成されている（分子量１６，０００）。シトクロ
ムｂ５の機能は、ミクロソーム電子伝達系の構成成分と
して、ＮＡＤＨ−シトクロムｂ５レダクターゼを経てＮ
ＡＤＨから、またＮＡＤＰＨ−フェリヘモプロテインレ
ダクターゼを経てＮＡＤＰＨからそれぞれ電子を受け取
り、これをデサチュラーゼ（不飽和化酵素）のようなシ
アン感受性末端を持つ酵素に供給することである。この
電子を供給するシトクロムｂ５とＮＡＤＨ−シトクロム
ｂ５レダクターゼまたはＮＡＤＰＨ−フェリヘモプロテ
インレダクターゼとを電子伝達系といい、幾つかのデサ
チュラーゼはこの電子伝達系を共有していると考えられ
ている。
【０００３】一方、不飽和脂肪酸（炭素数が１８〜２２
で、二重結合が２以上の脂肪酸）の中でもアラキドン酸
（ＡＲＡ）、ジホモーγーリノレン酸（ＤＧＬＡ）、エ
イコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は種々の生理作用をもつ
生理活性物質（プロスタグランジンおよびトロンボキサ
ン）の前駆体であり、例えばＥＰＡは血栓防止作用ある
いは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市
販されている。また近年、ＡＲＡ及びドコヘキサエン酸
（ＤＨＡ）は母乳中に含まれており、乳児の発育に役立
つとの報告がある（"Advances in Polyunsaturated Fat
ty Acid Research" Elsevier Science Publishers, 199
3, pp.261-264)。さらに、胎児の身長や脳の発育におけ
る重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA,90, 1073-1077(1993), Lancet, 344, 1319-1322(199
4)）。
で、二重結合が２以上の脂肪酸）の中でもアラキドン酸
（ＡＲＡ）、ジホモーγーリノレン酸（ＤＧＬＡ）、エ
イコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は種々の生理作用をもつ
生理活性物質（プロスタグランジンおよびトロンボキサ
ン）の前駆体であり、例えばＥＰＡは血栓防止作用ある
いは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市
販されている。また近年、ＡＲＡ及びドコヘキサエン酸
（ＤＨＡ）は母乳中に含まれており、乳児の発育に役立
つとの報告がある（"Advances in Polyunsaturated Fat
ty Acid Research" Elsevier Science Publishers, 199
3, pp.261-264)。さらに、胎児の身長や脳の発育におけ
る重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA,90, 1073-1077(1993), Lancet, 344, 1319-1322(199
4)）。
【０００４】そこで、母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大
きな違いであるＡＲＡ及びＤＨＡを調製粉乳に添加しよ
うとする動きがある。
きな違いであるＡＲＡ及びＤＨＡを調製粉乳に添加しよ
うとする動きがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】近
年、調製粉乳にＤＨＡを添加する目的で魚油が使用され
ている。しかしながら、魚油は構成脂肪酸として多種類
の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離
することは困難であるため、例えば魚油添加調製粉乳で
はＤＨＡと共にＥＰＡが多量に存在し、ＥＰＡの作用に
より、リノール酸からＡＲＡへの変換が抑制され、生体
内のＡＲＡが減少してしまうという問題が指摘されてい
る。このような問題を解決するため、最近はクロレラ、
藻類、かび（糸状菌）、バクテリア等の微生物を利用し
て不要な脂肪酸を含まず、目的とする不飽和脂肪酸を多
量に生産する方法が注目されている。
年、調製粉乳にＤＨＡを添加する目的で魚油が使用され
ている。しかしながら、魚油は構成脂肪酸として多種類
の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離
することは困難であるため、例えば魚油添加調製粉乳で
はＤＨＡと共にＥＰＡが多量に存在し、ＥＰＡの作用に
より、リノール酸からＡＲＡへの変換が抑制され、生体
内のＡＲＡが減少してしまうという問題が指摘されてい
る。このような問題を解決するため、最近はクロレラ、
藻類、かび（糸状菌）、バクテリア等の微生物を利用し
て不要な脂肪酸を含まず、目的とする不飽和脂肪酸を多
量に生産する方法が注目されている。
【０００６】本発明者等は、糸状菌であるモルティエレ
ラ属のモルティエレラ亜属に属するモルティエレラ・ア
ルピナ（Mortierella alpina）が、菌体内に著量の油脂
を蓄積し、特にＡＲＡの生産性が非常に高いことに着目
し、モルティエレラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５を
コードする遺伝子をクローニングし、これを不飽和脂肪
酸生産能を有する微生物に導入し、微生物による不飽和
脂肪酸の生産性向上に利用することを検討した。
ラ属のモルティエレラ亜属に属するモルティエレラ・ア
ルピナ（Mortierella alpina）が、菌体内に著量の油脂
を蓄積し、特にＡＲＡの生産性が非常に高いことに着目
し、モルティエレラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５を
コードする遺伝子をクローニングし、これを不飽和脂肪
酸生産能を有する微生物に導入し、微生物による不飽和
脂肪酸の生産性向上に利用することを検討した。
【０００７】本発明においては、配列表の配列番号１及
び２のプライマーから作成したプローブを用いてモルテ
ィエレラ・アルピナ（遺伝子源微生物）からシトクロム
ｂ５ゲノム遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングを行うこ
とに成功した。
び２のプライマーから作成したプローブを用いてモルテ
ィエレラ・アルピナ（遺伝子源微生物）からシトクロム
ｂ５ゲノム遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングを行うこ
とに成功した。
【０００８】本発明の遺伝子をミクロソーム電子伝達系
を有する真核細胞に導入することにより、電子伝達系が
増強され、シアン感受性末端の酵素（ＣＳＦ）により多
くの電子が供給されることになり、ＣＳＦによる反応を
効率よく行わせることが可能になる。また他の電子伝達
系の酵素やＣＳＦをコードする遺伝子と組み合わせて導
入することによって、ＣＳＦによる反応を強化すること
が期待できる。特に本発明の遺伝子を単独で又は他の電
子伝達系の酵素やデサチュラーゼをコードする遺伝子と
組み合わせて導入することによって、不飽和脂肪酸の生
産性を向上させることが期待できる。
を有する真核細胞に導入することにより、電子伝達系が
増強され、シアン感受性末端の酵素（ＣＳＦ）により多
くの電子が供給されることになり、ＣＳＦによる反応を
効率よく行わせることが可能になる。また他の電子伝達
系の酵素やＣＳＦをコードする遺伝子と組み合わせて導
入することによって、ＣＳＦによる反応を強化すること
が期待できる。特に本発明の遺伝子を単独で又は他の電
子伝達系の酵素やデサチュラーゼをコードする遺伝子と
組み合わせて導入することによって、不飽和脂肪酸の生
産性を向上させることが期待できる。
【０００９】本発明の遺伝子は、遺伝子組み換え技術に
より適当な発現ベクターを構築し、これによって不飽和
脂肪酸生産能を有する宿主細胞を形質転換し、培養する
ことによって、目的の不飽和脂肪酸を発現させることが
できる。また形質転換により不飽和脂肪酸生産能が付与
された大腸菌や枯草菌、酵母等を宿主細胞として使用す
ることもできる。さらに大豆、ひまわり、アブラナ、ご
ま等の高等植物に本発明の遺伝子を導入することによ
り、目的の不飽和脂肪酸の生産を向上させることが期待
できる。
より適当な発現ベクターを構築し、これによって不飽和
脂肪酸生産能を有する宿主細胞を形質転換し、培養する
ことによって、目的の不飽和脂肪酸を発現させることが
できる。また形質転換により不飽和脂肪酸生産能が付与
された大腸菌や枯草菌、酵母等を宿主細胞として使用す
ることもできる。さらに大豆、ひまわり、アブラナ、ご
ま等の高等植物に本発明の遺伝子を導入することによ
り、目的の不飽和脂肪酸の生産を向上させることが期待
できる。
【００１０】本発明は、モルティエレラ・アルピナ由来
のシトクロムｂ５をコードする遺伝子を提供する。この
遺伝子はｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学
合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また、シトクロム
ｂ５活性を保持しかつシトクロムｂ５のアミノ酸配列の
１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のア
ミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドをコ
ードする遺伝子も本発明に含まれる。
のシトクロムｂ５をコードする遺伝子を提供する。この
遺伝子はｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学
合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また、シトクロム
ｂ５活性を保持しかつシトクロムｂ５のアミノ酸配列の
１又は２以上のアミノ酸を欠失し、置換し、又は他のア
ミノ酸を１又は２以上を付加した修飾ポリペプチドをコ
ードする遺伝子も本発明に含まれる。
【００１１】本発明は、更にシトクロムｂ５をコードす
る遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法により、完全長シト
クロムｂ５、及びシトクロムｂ５活性を保持しかつシト
クロムｂ５のアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を
欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付
加した修飾ポリペプチドの生産方法を提供する。
る遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法により、完全長シト
クロムｂ５、及びシトクロムｂ５活性を保持しかつシト
クロムｂ５のアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を
欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上を付
加した修飾ポリペプチドの生産方法を提供する。
【００１２】本発明のシトクロムｂ５遺伝子は次の方法
でクローニングできる。
でクローニングできる。
【００１３】（遺伝子源）本発明においては遺伝子源と
して使用できる微生物は、モルティエレラ属のアルピナ
種であれば特に株を限定するものではなく、例えば、次
のモルティエレラ・アルピナ種に属する菌株を下記の寄
託番号により、所定の寄託機関から入手できる。
して使用できる微生物は、モルティエレラ属のアルピナ
種であれば特に株を限定するものではなく、例えば、次
のモルティエレラ・アルピナ種に属する菌株を下記の寄
託番号により、所定の寄託機関から入手できる。
【００１４】モルティエレラ・アルピナ（ＡＴＣＣ８９
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等）。
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等）。
【００１５】本発明では、電子伝達系を有する生物を形
質転換することにより、ＣＳＦ（シアン感受性末端の酵
素）への電子伝達が強化された生物を人為的に創製する
ことができる。特に不飽和脂肪酸生産能を有する生物を
形質転換することにより、デサチュラーゼへの電子の供
給が強化されて不飽和脂肪酸高生産生物を人為的に創製
することができる。
質転換することにより、ＣＳＦ（シアン感受性末端の酵
素）への電子伝達が強化された生物を人為的に創製する
ことができる。特に不飽和脂肪酸生産能を有する生物を
形質転換することにより、デサチュラーゼへの電子の供
給が強化されて不飽和脂肪酸高生産生物を人為的に創製
することができる。
【００１６】このような生物としてオメガ３系不飽和脂
肪酸生産能を有する微生物である海洋性クロレラ、微細
紅藻、微細藻類が挙げられ、例えば有色藻門に属するク
リプセコディミウム（Crypthecodimium）属、イソクリ
シス（Isochrysis）属、ナノクロロプシス（Nannochlor
opsis）属、カエトセロス（Chaetoceros）属、ファエオ
ダクチルム（Phaeodactylum）属、アンフィディニウム
（Amphidinium）属、ゴニアウラクス（Gonyaulax）属、
ペリディミウム（Peridimium）属、クロオモナス（Chro
omonas）属、クリプトモナス（Cryptomonas）属、ヘミ
セルミス（Hemiselmis）属、キロモナス（Chilomonas）
属、緑藻門に属するクロレラ（Chlorella）属、さらに
ヒスチオブランクス（Histiobranchus）属及びコリファ
エノイデス（Coryphaenoides）属に属する微生物を挙げ
ることができる。クリプセコディミウム属では例えば、
クリプセコディミウム・コーニー（Crypthecodimium co
hnii）ＡＴＣＣ３００２１を挙げることができる。この
菌株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションか
ら何らの制限もなく入手することができる。さらに、エ
イコサペンタエン酸の含有率の高い油脂を生産するサバ
の腸内から単離された海洋細菌（Shewanella 属、例え
ば Shewanella putrefaciens）を挙げることができる。
肪酸生産能を有する微生物である海洋性クロレラ、微細
紅藻、微細藻類が挙げられ、例えば有色藻門に属するク
リプセコディミウム（Crypthecodimium）属、イソクリ
シス（Isochrysis）属、ナノクロロプシス（Nannochlor
opsis）属、カエトセロス（Chaetoceros）属、ファエオ
ダクチルム（Phaeodactylum）属、アンフィディニウム
（Amphidinium）属、ゴニアウラクス（Gonyaulax）属、
ペリディミウム（Peridimium）属、クロオモナス（Chro
omonas）属、クリプトモナス（Cryptomonas）属、ヘミ
セルミス（Hemiselmis）属、キロモナス（Chilomonas）
属、緑藻門に属するクロレラ（Chlorella）属、さらに
ヒスチオブランクス（Histiobranchus）属及びコリファ
エノイデス（Coryphaenoides）属に属する微生物を挙げ
ることができる。クリプセコディミウム属では例えば、
クリプセコディミウム・コーニー（Crypthecodimium co
hnii）ＡＴＣＣ３００２１を挙げることができる。この
菌株はアメリカン タイプ カルチャー コレクションか
ら何らの制限もなく入手することができる。さらに、エ
イコサペンタエン酸の含有率の高い油脂を生産するサバ
の腸内から単離された海洋細菌（Shewanella 属、例え
ば Shewanella putrefaciens）を挙げることができる。
【００１７】またオメガ６系不飽和脂肪酸生産能を有す
る微生物としてγ−リノレン酸生産能を有する微生物や
アラキドン酸生産能を有する微生物が挙げられ、アラキ
ドン酸生産能を有する微生物としては、例えばモルティ
エレラ（Mortierella）属に属するアルピナ（alpin
a）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongat
a）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutis
sima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフ
ィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）
種、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム
（Phythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペ
ニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム
(Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリュー
ム（fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）
属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ
（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinos
porangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属
する微生物を挙げることができ、γ−リノレン酸生産能
を有する微生物としては、モルティエレラ属に属するイ
サベリナ（isabellina）、ビナセア（vinacea）、ラマニ
アナ(ramaniana）、ラマニアナ・アングリスポラ（rama
niana anglispora）、ナナ（nana）種、アビシディア
（Absidia）属、ムコール属、リゾプス（Rizopus）属、
シンセファラストラム（Syncephalastrum）属、コアネ
フォラ（Choanephora）属に属する微生物を挙げること
ができる。モルティエレラ属では例えば、モルティエレ
ラ・エロンガタ（Mort ierella elengata）ＩＦＯ８５７
０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierell a exigu
a）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ
（Mortierella hy grophila）ＩＦＯ５９４１、モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＡＴＣＣ８９
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等を挙げることができる。これら
の菌株はいずれも、財団法人発酵研究所からなんら制限
なく入手することができる。また、本発明らが土壌から
分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１
９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９
号）を使用することもできる。
る微生物としてγ−リノレン酸生産能を有する微生物や
アラキドン酸生産能を有する微生物が挙げられ、アラキ
ドン酸生産能を有する微生物としては、例えばモルティ
エレラ（Mortierella）属に属するアルピナ（alpin
a）、バイニエリ（bainieri）、エロンガタ（elongat
a）、エキシグア（exigua）、ミネッティシマ（minutis
sima）、バーティシラタ（verticillata）、フィグロフ
ィラ（hygrophila）、ポリセファラ（polycephala）
種、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム
（Phythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペ
ニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム
(Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリュー
ム（fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）
属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ
（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinos
porangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属
する微生物を挙げることができ、γ−リノレン酸生産能
を有する微生物としては、モルティエレラ属に属するイ
サベリナ（isabellina）、ビナセア（vinacea）、ラマニ
アナ(ramaniana）、ラマニアナ・アングリスポラ（rama
niana anglispora）、ナナ（nana）種、アビシディア
（Absidia）属、ムコール属、リゾプス（Rizopus）属、
シンセファラストラム（Syncephalastrum）属、コアネ
フォラ（Choanephora）属に属する微生物を挙げること
ができる。モルティエレラ属では例えば、モルティエレ
ラ・エロンガタ（Mort ierella elengata）ＩＦＯ８５７
０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierell a exigu
a）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ
（Mortierella hy grophila）ＩＦＯ５９４１、モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＡＴＣＣ８９
７９、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴ
ＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ３２２２３、ＡＴＣＣ３６９
６５、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢ
Ｓ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．
６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢ
Ｓ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８、ＩＦＯ８５６
８、ＩＦＯ３２２８１等を挙げることができる。これら
の菌株はいずれも、財団法人発酵研究所からなんら制限
なく入手することができる。また、本発明らが土壌から
分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１
９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９
号）を使用することもできる。
【００１８】（シトクロムｂ５ゲノムＤＮＡのクローニ
ング） モルティエレラ・アルピナのゲノムＤＮＡ抽出及び
コスミドライブラリーの作製 培養、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を破
砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離し、沈殿し、
ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡ
成分を精製する。これらの操作については、「植物バイ
オテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、第２５２
頁」を参照されたい。
ング） モルティエレラ・アルピナのゲノムＤＮＡ抽出及び
コスミドライブラリーの作製 培養、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を破
砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離し、沈殿し、
ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡ
成分を精製する。これらの操作については、「植物バイ
オテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、第２５２
頁」を参照されたい。
【００１９】市販のコスミドベクターキットを用い、そ
の指示書にしたがって上記ゲノムＤＮＡをインサートＤ
ＮＡとしてコスミドベクターに挿入する。得られた組換
えベクターを、市販のパッケージングキットの細菌抽出
液を用いてパッケージングし、宿主細菌に感染させ、増
殖させてコスミドライブラリーを作製する。
の指示書にしたがって上記ゲノムＤＮＡをインサートＤ
ＮＡとしてコスミドベクターに挿入する。得られた組換
えベクターを、市販のパッケージングキットの細菌抽出
液を用いてパッケージングし、宿主細菌に感染させ、増
殖させてコスミドライブラリーを作製する。
【００２０】プローブの作製 モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrop
hila :ＩＦＯ ５９４１として入手できる）の内部ペプ
チドＫ−１０とＫ−６が他生物のシトクロムｂ５と高い
相同性を示すことに着目し、それらペプチドのアミノ酸
情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作
製する。このプライマーを用い、モルティエレラ・アル
ピナのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う。得られ
る増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、アミノ酸配列に変
換して他生物由来のシトクロムｂ５との相同性および上
記内部ペプチドの部分アミノ酸配列と相同な配列を含む
ことを確認し、アイソトープで標識化しプローブとして
その後の実験に使用する。
hila :ＩＦＯ ５９４１として入手できる）の内部ペプ
チドＫ−１０とＫ−６が他生物のシトクロムｂ５と高い
相同性を示すことに着目し、それらペプチドのアミノ酸
情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作
製する。このプライマーを用い、モルティエレラ・アル
ピナのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う。得られ
る増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、アミノ酸配列に変
換して他生物由来のシトクロムｂ５との相同性および上
記内部ペプチドの部分アミノ酸配列と相同な配列を含む
ことを確認し、アイソトープで標識化しプローブとして
その後の実験に使用する。
【００２１】コスミドライブラリーからのクローニン
グ コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いて
コロニーハイブリダイゼーションを行う。得られるポジ
ティブクローンのコスミドを例えばアルカリ法で調製
し、適当な制限酵素でサザンハイブリダイゼーションを
行い、ポジティブバンドとして得られるＤＮＡ断片をシ
ークエンスして目的ゲノムＤＮＡをクローニングする。
グ コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いて
コロニーハイブリダイゼーションを行う。得られるポジ
ティブクローンのコスミドを例えばアルカリ法で調製
し、適当な制限酵素でサザンハイブリダイゼーションを
行い、ポジティブバンドとして得られるＤＮＡ断片をシ
ークエンスして目的ゲノムＤＮＡをクローニングする。
【００２２】（シトクロムｂ５ ｃＤＮＡのクローニン
グ） ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡライブラリーの作製 培養し、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を
破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出し、ここか
ら適当な方法、例えばオリゴｄＴセルロースカラムを用
いてｍＲＮＡを精製する。
グ） ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡライブラリーの作製 培養し、集菌したモルティエレラ・アルピナ種の菌体を
破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出し、ここか
ら適当な方法、例えばオリゴｄＴセルロースカラムを用
いてｍＲＮＡを精製する。
【００２３】得られるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを
合成し、これを市販のファージベクターに挿入し、さら
に常法によりパッケージングする。
合成し、これを市販のファージベクターに挿入し、さら
に常法によりパッケージングする。
【００２４】 シトクロムｂ５ ｃＤＮＡのクローニ
ング 宿主細菌に上記パッケージングしたｃＤＮＡライブラリ
ーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションにより
ポジティブプラークを得る。得られるクローンをシーク
エンスし、アミノ酸配列に変換し検討することにより、
モルティエレラ・アルピナのシトクロムｂ５遺伝子全長
がクローニングされることが確認できる。
ング 宿主細菌に上記パッケージングしたｃＤＮＡライブラリ
ーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションにより
ポジティブプラークを得る。得られるクローンをシーク
エンスし、アミノ酸配列に変換し検討することにより、
モルティエレラ・アルピナのシトクロムｂ５遺伝子全長
がクローニングされることが確認できる。
【００２５】 シトクロムｂ５の発現 続いて、クローニングしたシトクロムｂ５ ｃＤＮＡを
用いて、シトクロムｂ５の発現を行う。このシトクロム
ｂ５の発現は、適当なプラスミドにシトクロムｂ５ ｃ
ＤＮＡを挿入し、大腸菌を宿主として形質転換し、これ
を培養する公知の組換えＤＮＡの手法によって実施でき
る。例えば、Ｔ７プロモーターをもつｐＥＴシステムに
目的ｃＤＮＡを挿入し、この発現用プラスミドで大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。次いで、形質転
換された大腸菌を適当な培地で培養し、集菌し、菌体を
破砕し、シトクロムｂ５タンパクを分離、精製する。
用いて、シトクロムｂ５の発現を行う。このシトクロム
ｂ５の発現は、適当なプラスミドにシトクロムｂ５ ｃ
ＤＮＡを挿入し、大腸菌を宿主として形質転換し、これ
を培養する公知の組換えＤＮＡの手法によって実施でき
る。例えば、Ｔ７プロモーターをもつｐＥＴシステムに
目的ｃＤＮＡを挿入し、この発現用プラスミドで大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。次いで、形質転
換された大腸菌を適当な培地で培養し、集菌し、菌体を
破砕し、シトクロムｂ５タンパクを分離、精製する。
【００２６】シトクロムｂ５タンパクの全長をコードす
るｃＤＮＡを用いる完全な膜結合型シトクロムｂ５は、
その産生を確認できるものの、発現量が低く、封入体の
状態で発現していることが判った。
るｃＤＮＡを用いる完全な膜結合型シトクロムｂ５は、
その産生を確認できるものの、発現量が低く、封入体の
状態で発現していることが判った。
【００２７】そこで、可溶性タンパクとして高発現させ
るために、小胞体膜に結合すると考えられる疎水性の強
いＣ末端を欠失させたＮ末端の９４アミノ酸残基のみを
コードするｃＤＮＡをＰＣＲにより作製し、これをｐＥ
Ｔシステムに挿入し、大腸菌を形質転換して可溶性シト
クロムｂ５タンパクを産生し、これを分離、精製したと
ころ、高い発現量で得られていることが確認できる。
るために、小胞体膜に結合すると考えられる疎水性の強
いＣ末端を欠失させたＮ末端の９４アミノ酸残基のみを
コードするｃＤＮＡをＰＣＲにより作製し、これをｐＥ
Ｔシステムに挿入し、大腸菌を形質転換して可溶性シト
クロムｂ５タンパクを産生し、これを分離、精製したと
ころ、高い発現量で得られていることが確認できる。
【００２８】
【実施例】本発明を以下の実施例により、更に詳細に説
明する。
明する。
【００２９】［実施例１］ ゲノムＤＮＡの作製 （１）モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のゲノムＤＮ
Ａ抽出法 対数増殖期後期の菌体を減圧ろ過で集菌した。液体窒素
中に細かくちぎった菌体を入れ、ホモゲナイザー（ワー
リングブレンダー）で細かく破砕した。ある程度細かく
なった菌体を乳鉢に移し液体窒素を加えながら乳鉢中で
すり潰した。７０℃に保温した２ｘＣＴＡＢ液で懸濁
し、６５℃で３〜４時間インキュベートした。遠心分離
した上清を順次、フェノール、フェノール／クロロホル
ム、クロロホルムで処理し、等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。リボヌクレアーゼＡおよび
リボヌクレアーゼＴ１でＲＮＡを分解し、フェノール、
フェノール／クロロホルム、クロロホルムで順次処理し
て除タンパク操作を行った。等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解しゲノム標品を得た。
Ａ抽出法 対数増殖期後期の菌体を減圧ろ過で集菌した。液体窒素
中に細かくちぎった菌体を入れ、ホモゲナイザー（ワー
リングブレンダー）で細かく破砕した。ある程度細かく
なった菌体を乳鉢に移し液体窒素を加えながら乳鉢中で
すり潰した。７０℃に保温した２ｘＣＴＡＢ液で懸濁
し、６５℃で３〜４時間インキュベートした。遠心分離
した上清を順次、フェノール、フェノール／クロロホル
ム、クロロホルムで処理し、等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。リボヌクレアーゼＡおよび
リボヌクレアーゼＴ１でＲＮＡを分解し、フェノール、
フェノール／クロロホルム、クロロホルムで順次処理し
て除タンパク操作を行った。等容のイソプロパノールで
ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールで洗浄し、風乾
後、ＴＥ緩衝液に溶解しゲノム標品を得た。
【００３０】（２）コスミドライブラリー作製法 コスミドはストラタジーン（STRATAGENE）社製のスーパ
ーコス１コスミド（SUPERCOS 1 COSMID）ベクターキッ
トを用いた。コスミドライブラリー作製法はそのプロト
コールに従った。コスミドをＸｂａＩで制限酵素処理
し、ＣＩＰ（タカラ製）で脱リン酸化し、ＢａｍＨＩで
制限酵素処理することでコスミドアームを調製した。イ
ンサートＤＮＡは制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化する
ことで得た。コスミドアームと部分消化したインサート
ＤＮＡをライゲーションし、次のパッケージング操作へ
進んだ。パッケージングキットはストラタジーン社のギ
ガパックIIパッケージングエキストラクト（GIGAPACK I
I PACKAGING EXTRACT）を用いた。宿主大腸菌はＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲを用いた。
ーコス１コスミド（SUPERCOS 1 COSMID）ベクターキッ
トを用いた。コスミドライブラリー作製法はそのプロト
コールに従った。コスミドをＸｂａＩで制限酵素処理
し、ＣＩＰ（タカラ製）で脱リン酸化し、ＢａｍＨＩで
制限酵素処理することでコスミドアームを調製した。イ
ンサートＤＮＡは制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化する
ことで得た。コスミドアームと部分消化したインサート
ＤＮＡをライゲーションし、次のパッケージング操作へ
進んだ。パッケージングキットはストラタジーン社のギ
ガパックIIパッケージングエキストラクト（GIGAPACK I
I PACKAGING EXTRACT）を用いた。宿主大腸菌はＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲを用いた。
【００３１】（３）モルティエレラ・フィグロフィラの
内部ペプチドＫ−１０及びＫ−６は他生物由来のシトク
ロムｂ５と高い相同性を示した。そこでアミノ酸配列の
情報を基に合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザイ
ンした。モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のゲノムＤ
ＮＡを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行ったところ、
約１１０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。
内部ペプチドＫ−１０及びＫ−６は他生物由来のシトク
ロムｂ５と高い相同性を示した。そこでアミノ酸配列の
情報を基に合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザイ
ンした。モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４のゲノムＤ
ＮＡを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行ったところ、
約１１０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。
【００３２】 ＰＣＲの実施条件 染色体ＤＮＡ ５μｇ センスプライマー ２００ｐｍｏｌ アンチセンスプライマー ２００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ（２ｍＭ） １０μｌ Ｔth ポリメラーゼ緩衝液（ｘ１０） １０μｌ Ｔth ＤＮＡポリメラーゼ ４ユニット Ｈ2Ｏ 合計 １００μｌ ［９４℃−１分、５５℃−２分、７２℃−１分：３５サイクル］
【００３３】本断片をシークエンスし、アミノ酸配列に
転換したところ、他生物由来のシトクロムｂ５と高い相
同性を示すとともに、内部ペプチドの部分アミノ酸配列
の箇所が見いだされた。増幅ＤＮＡ断片をαー32Ｐ-ｄＣ
ＴＰで標識してプローブとし、以後の実験に使用した。
転換したところ、他生物由来のシトクロムｂ５と高い相
同性を示すとともに、内部ペプチドの部分アミノ酸配列
の箇所が見いだされた。増幅ＤＮＡ断片をαー32Ｐ-ｄＣ
ＴＰで標識してプローブとし、以後の実験に使用した。
【００３４】作製した合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーは次の通りであった。
ーは次の通りであった。
【化１】
【化２】
【００３５】（４）コスミドライブラリーからのクロー
ニング コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いて
コロニーハイブリダイゼーションを行った。得られたポ
ジティブクローンのコスミドをアルカリ法で調製し、適
当な制限でサザンハイブリダイゼーションを行った。ポ
ジティブバンドとして得られた約１．６ｋｂのＥｃｏＲ
Ｖ−ＥｃｏＲＶ断片をシークエンスしたところ、シトク
ロムｂ５遺伝子の一部しか含まれていなかったので、さ
らに別にポジティブバンドとして得られた下流域を含む
約３.２ｋｂのＮｈｅＩ-ＸｈｏＩ断片もシークエンスし
た（図４参照）。このようにしてクローニングしたシト
クロムｂ５ゲノムＤＮＡを図１及び図２に示した。
ニング コスミドライブラリーに対し、上記のプローブを用いて
コロニーハイブリダイゼーションを行った。得られたポ
ジティブクローンのコスミドをアルカリ法で調製し、適
当な制限でサザンハイブリダイゼーションを行った。ポ
ジティブバンドとして得られた約１．６ｋｂのＥｃｏＲ
Ｖ−ＥｃｏＲＶ断片をシークエンスしたところ、シトク
ロムｂ５遺伝子の一部しか含まれていなかったので、さ
らに別にポジティブバンドとして得られた下流域を含む
約３.２ｋｂのＮｈｅＩ-ＸｈｏＩ断片もシークエンスし
た（図４参照）。このようにしてクローニングしたシト
クロムｂ５ゲノムＤＮＡを図１及び図２に示した。
【００３６】［実施例２］ ｃＤＮＡの作製 （１）ｍＲＮＡの調製 菌体は対数増殖期前期に集菌し、直ちに液体窒素で凍結
後破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出した。得
られた全ＲＮＡをオリゴｄＴ-セルロースカラムにかけ
ることにより精製した（ｍＲＮＡ Purification kit; P
harmacia Biotech)。
後破砕し、ＡＧＰＣ法に従って全ＲＮＡを抽出した。得
られた全ＲＮＡをオリゴｄＴ-セルロースカラムにかけ
ることにより精製した（ｍＲＮＡ Purification kit; P
harmacia Biotech)。
【００３７】（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 得られたｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡラピッドアダ
プターライゲーションモジュール（cDNA rapid adaptor
ligation module code RPN1712）（アマシャム社）を
用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡラピッ
ドクローニングモジュール-λｇｔ１０（cDNA rapid cl
oning module-λgt10 code RPN1713）（アマシャム社）
を用いてλｇｔ１０に連結した。このλｇｔ１０-ｃＤ
ＮＡライブラリーをλＤＮＡインビトロパッケージング
モジュール（λDNA invitro packaging module code RP
N1717）（アマシャム社）を用いてパッケージングし
た。
プターライゲーションモジュール（cDNA rapid adaptor
ligation module code RPN1712）（アマシャム社）を
用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡラピッ
ドクローニングモジュール-λｇｔ１０（cDNA rapid cl
oning module-λgt10 code RPN1713）（アマシャム社）
を用いてλｇｔ１０に連結した。このλｇｔ１０-ｃＤ
ＮＡライブラリーをλＤＮＡインビトロパッケージング
モジュール（λDNA invitro packaging module code RP
N1717）（アマシャム社）を用いてパッケージングし
た。
【００３８】（３）シトクロムｂ５ｃＤＮＡのクローニ
ング 宿主大腸菌ＮＭ５１４にλｇｔ１０−ｃＤＮＡライブラ
リーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションによ
りポジティブプラークを得た。但し、ここで用いたプロ
ーブはモルティエレラ・アルピナ１Ｓ-４のシトクロム
ｂ５遺伝子を含む約５００ｂｐの断片を鋳型とし、マル
チプライム法で標識することにより作製した。得られた
クローンをシークエンスし、アミノ酸配列に変換した結
果、上記１Ｓ−４のシトクロムｂ５遺伝子全長のクロー
ニングに成功したことが判明した。得られたｃＤＮＡを
図３に示した。また、このｃＤＮＡから推定されるシト
クロムｂ５のアミノ酸配列を図５に示した。
ング 宿主大腸菌ＮＭ５１４にλｇｔ１０−ｃＤＮＡライブラ
リーを感染させ、プラークハイブリダイゼーションによ
りポジティブプラークを得た。但し、ここで用いたプロ
ーブはモルティエレラ・アルピナ１Ｓ-４のシトクロム
ｂ５遺伝子を含む約５００ｂｐの断片を鋳型とし、マル
チプライム法で標識することにより作製した。得られた
クローンをシークエンスし、アミノ酸配列に変換した結
果、上記１Ｓ−４のシトクロムｂ５遺伝子全長のクロー
ニングに成功したことが判明した。得られたｃＤＮＡを
図３に示した。また、このｃＤＮＡから推定されるシト
クロムｂ５のアミノ酸配列を図５に示した。
【００３９】モルティエレラ・アルピナＡＴＣＣ４２４
３０又はモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８を用
いて、実施例１及び２と同様の方法で、目的とするゲノ
ムＤＮＡ及びｃＤＮＡをクローニングすることができ
る。
３０又はモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８を用
いて、実施例１及び２と同様の方法で、目的とするゲノ
ムＤＮＡ及びｃＤＮＡをクローニングすることができ
る。
【００４０】
【実施例３】 シトクロムｂ５の発現 （１）シトクロムｂ５ ｃＤＮＡの発現プラスミドの構
築 （イ）完全な膜結合型のシトクロムｂ５の発現プラスミ
ドの構築 下記の条件でＰＣＲを行い、増幅した約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片をプラスミドｐＥＴ１６ｂのＮｄｅＩ−Ｂａｍ
ＨＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＣＢ３０ＣＦを構築
した。このｐＭＣＢ３０ＣＦを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）に形質転換した。
築 （イ）完全な膜結合型のシトクロムｂ５の発現プラスミ
ドの構築 下記の条件でＰＣＲを行い、増幅した約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片をプラスミドｐＥＴ１６ｂのＮｄｅＩ−Ｂａｍ
ＨＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＣＢ３０ＣＦを構築
した。このｐＭＣＢ３０ＣＦを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）に形質転換した。
【００４１】（ロ）可溶性シトクロムｂ５の発現プラス
ミドの構築 可溶性タンパク質として高発現させるために、小胞体膜
に結合すると考えられる疎水性の高いＣ末端側を欠失さ
せＮ末端側９４残基のみをコードする組換え体を作製し
た。具体的な方法としては、先と同様の条件でＰＣＲを
行い増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐ
ＥＴ１６ｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しプラ
スミドｐＭＣＢ４０ＣＳを構築した（図６を参照のこ
と）。このｐＭＣＢ４０ＣＳを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）に形質転換した。
ミドの構築 可溶性タンパク質として高発現させるために、小胞体膜
に結合すると考えられる疎水性の高いＣ末端側を欠失さ
せＮ末端側９４残基のみをコードする組換え体を作製し
た。具体的な方法としては、先と同様の条件でＰＣＲを
行い増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐ
ＥＴ１６ｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しプラ
スミドｐＭＣＢ４０ＣＳを構築した（図６を参照のこ
と）。このｐＭＣＢ４０ＣＳを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）に形質転換した。
【００４２】 （ＰＣＲの実施条件） シトクロムｂ５ ｃＤＮＡ １ｎｇ センスプライマー ２００ ｐｍｏｌ アンチセンスプライマー ２００ ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ（５ｍＭ） ２ μｌ 反応緩衝液（ｘ１０） ５ μｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２ ユニットＨ2Ｏ 合 計 ５０ μｌ ［９４℃−１分、５５℃−２分、７２℃−１分：３０サイクル］
【００４３】尚、ＰＣＲには次のセンスプライマー及び
アンチセンスプライマーを用いた。膜結合型シトクロム
ｂ５発現用には下記の（１）（２）を用い、可溶性シト
クロムｂ５発現用としては下記の（１）（３）を用い
た。
アンチセンスプライマーを用いた。膜結合型シトクロム
ｂ５発現用には下記の（１）（２）を用い、可溶性シト
クロムｂ５発現用としては下記の（１）（３）を用い
た。
【化３】
【００４４】（２）形質転換した大腸菌の培養 アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＬ
Ｂ培地に植菌し、３７℃で８時間培養後、集菌した。集
菌した菌体をバッファーＡ（７５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０.１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０）１ｍｌで懸濁し、
超音波破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍ，１０
分，４℃で遠心後、上清画分と沈殿画分に分画した。こ
れらの画分を各々変性後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
Ｂ培地に植菌し、３７℃で８時間培養後、集菌した。集
菌した菌体をバッファーＡ（７５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０.１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０）１ｍｌで懸濁し、
超音波破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍ，１０
分，４℃で遠心後、上清画分と沈殿画分に分画した。こ
れらの画分を各々変性後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００４５】このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示
す。レーン１はコントロールとしてｐＥＴ１６ｂを持つ
大腸菌を超音波破砕した後、遠心して得られた上清であ
り、レーン２はその沈殿画分である。レーン３はＣ末端
を欠失した可溶性シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡ
を含む大腸菌の超音波破砕後の上清であり、レーン４は
完全な膜結合型シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡを
含む大腸菌の超音波破砕後の沈殿画分である。レーン
３、４の矢印の部分がそれぞれのシトクロムｂ５を示す
バンドである。
す。レーン１はコントロールとしてｐＥＴ１６ｂを持つ
大腸菌を超音波破砕した後、遠心して得られた上清であ
り、レーン２はその沈殿画分である。レーン３はＣ末端
を欠失した可溶性シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡ
を含む大腸菌の超音波破砕後の上清であり、レーン４は
完全な膜結合型シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡを
含む大腸菌の超音波破砕後の沈殿画分である。レーン
３、４の矢印の部分がそれぞれのシトクロムｂ５を示す
バンドである。
【００４６】（３）大腸菌で発現させた可溶性 シトク
ロムｂ５の精製（Novagen社のプロトコール参照） アンピシリン(１００μｇ／ｍｌ）を含む１００ｍｌの
ＬＢ培地に植菌し、３７℃で８時間培養後、集菌した。
集菌した菌体を４ｍｌの氷冷した緩衝液（５ｍＭ ｉｍ
ｉｄａｚｏｌｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９）で懸濁し超音波破砕した。そ
の後、１２，０００ｘｇ，２０分，４℃で遠心し、上清
画分を得た。さらに、３９，０００ｘｇ，２０分，４℃
で遠心し上清画分を得た。続いて、微粒子を除くために
この上清を０.４５ミクロンのフィルターに通した。５
０ｍＭ ＮｉＳＯ4であらかじめ平衡化させた（２.５ｍ
ｌ容量の）Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂カラム（アフィニティ
ーカラム, Novagen社, U.S.A.）に、上記の上清画分を
アプライした。次に、１５ｍｌの緩衝液（６０ｍＭイミ
ダゾール，５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄した。次に、１ｍｌ
の緩衝液（１Ｍ イミダゾール，５００ｍＭ ＮａＣｌお
よび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）)で溶出
させた。この得られた溶出液が、アフィニティーカラム
クロマトグラフィーによる精製 シトクロムｂ５溶出液
である。
ロムｂ５の精製（Novagen社のプロトコール参照） アンピシリン(１００μｇ／ｍｌ）を含む１００ｍｌの
ＬＢ培地に植菌し、３７℃で８時間培養後、集菌した。
集菌した菌体を４ｍｌの氷冷した緩衝液（５ｍＭ ｉｍ
ｉｄａｚｏｌｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９）で懸濁し超音波破砕した。そ
の後、１２，０００ｘｇ，２０分，４℃で遠心し、上清
画分を得た。さらに、３９，０００ｘｇ，２０分，４℃
で遠心し上清画分を得た。続いて、微粒子を除くために
この上清を０.４５ミクロンのフィルターに通した。５
０ｍＭ ＮｉＳＯ4であらかじめ平衡化させた（２.５ｍ
ｌ容量の）Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂カラム（アフィニティ
ーカラム, Novagen社, U.S.A.）に、上記の上清画分を
アプライした。次に、１５ｍｌの緩衝液（６０ｍＭイミ
ダゾール，５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄した。次に、１ｍｌ
の緩衝液（１Ｍ イミダゾール，５００ｍＭ ＮａＣｌお
よび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）)で溶出
させた。この得られた溶出液が、アフィニティーカラム
クロマトグラフィーによる精製 シトクロムｂ５溶出液
である。
【００４７】得られた溶出液をＦＰＬＣのＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ７５ＨＲ１０／３０(Pharmacia, Sweden) にアプラ
イした。５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ ８．０),３００
ｍＭＮａＣｌ，１０％ グリセロール（ｗ／ｖ）から成
る緩衝液を用いて、流速０.５ｍｌ／分で溶出させ、
０．５ｍｌずつ分画した。タンパク吸収のある画分を集
め、（分画分子量１０，０００の）セントリコン（Ａｍ
ｉｃｏｎ社）で濃縮した。
ｅｘ７５ＨＲ１０／３０(Pharmacia, Sweden) にアプラ
イした。５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ ８．０),３００
ｍＭＮａＣｌ，１０％ グリセロール（ｗ／ｖ）から成
る緩衝液を用いて、流速０.５ｍｌ／分で溶出させ、
０．５ｍｌずつ分画した。タンパク吸収のある画分を集
め、（分画分子量１０，０００の）セントリコン（Ａｍ
ｉｃｏｎ社）で濃縮した。
【００４８】図８の表には精製段階１〜３における精製
程度を示す測定値及び収率が示されている。また、１〜
３の各精製段階での可溶性シトクロムｂ５のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを示す。矢印の部分が目的タンパクであり、精製
段階３によって、単一のバンドに精製されていることが
判った。
程度を示す測定値及び収率が示されている。また、１〜
３の各精製段階での可溶性シトクロムｂ５のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを示す。矢印の部分が目的タンパクであり、精製
段階３によって、単一のバンドに精製されていることが
判った。
【００４９】（４）精製した可溶性 シトクロムｂ５の
吸収スペクトル測定による同定 精製した可溶性シトクロムｂ５の約３μｇを用いて、酸
化型のシトクロムｂ５と、ナトリウム ハイドロサルフ
ァイトで還元した還元型のシトクロムｂ５について３８
０ｎｍから６００ｎｍまでの吸収スペクトルを測定し
た。結果を図９に示す。
吸収スペクトル測定による同定 精製した可溶性シトクロムｂ５の約３μｇを用いて、酸
化型のシトクロムｂ５と、ナトリウム ハイドロサルフ
ァイトで還元した還元型のシトクロムｂ５について３８
０ｎｍから６００ｎｍまでの吸収スペクトルを測定し
た。結果を図９に示す。
【００５０】酸化型のシトクロムｂ５は４０９ｎｍに、
還元型のシトクロムｂ５では４２４ｎｍにそれぞれ吸収
極大が認められた。これは同属の糸状菌モルティエレラ
・フィグロフィラ（M. hygrophila）から単離精製され
たシトクロムｂ５の吸収スペクトル（神前ら、Biochim.
Biophy. Acta 1256: 319-326 (1995)）と極めてよく似
ていることが確認された。
還元型のシトクロムｂ５では４２４ｎｍにそれぞれ吸収
極大が認められた。これは同属の糸状菌モルティエレラ
・フィグロフィラ（M. hygrophila）から単離精製され
たシトクロムｂ５の吸収スペクトル（神前ら、Biochim.
Biophy. Acta 1256: 319-326 (1995)）と極めてよく似
ていることが確認された。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、ＡＲＡを菌体内に著量蓄
積するモルティエラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５を
コードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが与えられる。
この遺伝子のクローニングにより、シトクロムｂ５タン
パクを遺伝子工学的に生産できる。また、この遺伝子を
用いることにより、デサチュラーゼのようなシアン感受
性末端酵素に電子を供給する電子伝達系の構築またはそ
の系を増強し、それによって不飽和脂肪酸の生産性の向
上が期待できる。
積するモルティエラ・アルピナ由来のシトクロムｂ５を
コードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが与えられる。
この遺伝子のクローニングにより、シトクロムｂ５タン
パクを遺伝子工学的に生産できる。また、この遺伝子を
用いることにより、デサチュラーゼのようなシアン感受
性末端酵素に電子を供給する電子伝達系の構築またはそ
の系を増強し、それによって不飽和脂肪酸の生産性の向
上が期待できる。
【００５２】
【００５３】配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：３４８０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇＤＮＡ 配列：
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：５４０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列：
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：１３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列：
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ用プライマーＤＮＡ 配列：
【図１】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５をコードするゲノムＤＮＡであ
る。
由来のシトクロムｂ５をコードするゲノムＤＮＡであ
る。
【図２】 上記ゲノムＤＮＡを示す図１の続きである。
【図３】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡである。
由来のシトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡである。
【図４】 本発明のゲノムＤＮＡのスクリーニング方法
を説明するもの、及び当該ゲノムＤＮＡの制限酵素地図
である。
を説明するもの、及び当該ゲノムＤＮＡの制限酵素地図
である。
【図５】 本発明のモルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４
由来のシトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡから推測さ
れたアミノ酸配列である。
由来のシトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡから推測さ
れたアミノ酸配列である。
【図６】 本発明で構築した発現プラスミドｐＭＣＢ４
０ＣＳの構造を示す。
０ＣＳの構造を示す。
【図７】 本発明の組換えＤＮＡ手法で発現させたシト
クロムｂ５タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
クロムｂ５タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図８】 本発明で発現させた可溶性シトクロムｂ５の
各精製段階における精製度及び収率を示す表、並びに各
精製段階でのシトクロムｂ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。
各精製段階における精製度及び収率を示す表、並びに各
精製段階でのシトクロムｂ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。
【図９】 本発明で産生、精製されたシトクロムｂ５の
吸収スペクトルを示すグラフである。
吸収スペクトルを示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１１月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】 本発明の組換えＤＮＡ手法で発現させたシト
クロムｂ５タンパクの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の
結果を示す写真である。
クロムｂ５タンパクの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の
結果を示す写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】 本発明で発現させた可溶性シトクロムｂ５タ
ンパクの各精製段階における精製度及び収率を示す表、
並びに各精製段階のシトクロムｂ５タンパクの電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
ンパクの各精製段階における精製度及び収率を示す表、
並びに各精製段階のシトクロムｂ５タンパクの電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (9)
- 【請求項１】 モルティエレラ・アルピナ由来のシトク
ロムｂ５をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 請求項１の核酸でコードされたアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 配列番号：５のアミノ酸配列からなるポ
リペプチド、又はシトクロムｂ５の活性を保持しかつ配
列番号：５のアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸を
欠失し、置換し、又は他のアミノ酸を１又は２以上付加
した修飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 配列番号：５のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 配列番号：５のアミノ酸配列のアミノ酸
番号１〜９４のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 配列番号：４のヌクレオチド配列、又は
そのヌクレオチド配列の１又は２以上のヌクレオチドを
欠失し、置換し、又は他のヌクレオチドを１又は２以上
を付加した修飾ヌクレオチド配列でありかつその配列に
よってコードされるポリペプチドがシトクロムｂ５活性
を持つヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列。 - 【請求項７】 配列番号：４のヌクレオチド配列のヌク
レオチド番号３７〜４２６のヌクレオチドからなる請求
項６記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 配列番号：４のヌクレオチド配列のヌク
レオチド番号３７〜３１８のヌクレオチドからなる請求
項６記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項９】 配列番号：３のヌクレオチド配列からな
るＤＮＡ配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8203735A JPH09121873A (ja) | 1995-08-01 | 1996-08-01 | シトクロムｂ５遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-196868 | 1995-08-01 | ||
| JP19686895 | 1995-08-01 | ||
| JP8203735A JPH09121873A (ja) | 1995-08-01 | 1996-08-01 | シトクロムｂ５遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121873A true JPH09121873A (ja) | 1997-05-13 |
Family
ID=26510030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8203735A Pending JPH09121873A (ja) | 1995-08-01 | 1996-08-01 | シトクロムｂ５遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09121873A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2513319A1 (en) * | 2009-12-17 | 2012-10-24 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant genes associated with seed oil content and methods of their use |
| JP2020005614A (ja) * | 2018-07-12 | 2020-01-16 | ヤヱガキ醗酵技研株式会社 | 脂質および脂肪酸組成物の製造方法、ならびに脂肪酸組成物 |
-
1996
- 1996-08-01 JP JP8203735A patent/JPH09121873A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2513319A1 (en) * | 2009-12-17 | 2012-10-24 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant genes associated with seed oil content and methods of their use |
| EP2513319A4 (en) * | 2009-12-17 | 2013-05-08 | Univ Missouri | PLANT GENES ASSOCIATED WITH SEED OIL CONTENT AND METHODS OF USE |
| JP2020005614A (ja) * | 2018-07-12 | 2020-01-16 | ヤヱガキ醗酵技研株式会社 | 脂質および脂肪酸組成物の製造方法、ならびに脂肪酸組成物 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051101 |
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| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060104 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060126 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060104 |