JPH10113178A - 遺伝子の条件的発現のためのベクター - Google Patents
遺伝子の条件的発現のためのベクターInfo
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- JPH10113178A JPH10113178A JP9237453A JP23745397A JPH10113178A JP H10113178 A JPH10113178 A JP H10113178A JP 9237453 A JP9237453 A JP 9237453A JP 23745397 A JP23745397 A JP 23745397A JP H10113178 A JPH10113178 A JP H10113178A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 選択しなくても細胞内に多く保持され、位置
効果の影響無しに発現が制御でき、挿入変異の危険を低
下させるベクターを提供する。 【解決手段】 エピソーム的複製できる非組込ベクター
であって、真核細胞中で遺伝子を条件的発現できるベク
ター。このベクターを用いた１以上の目的遺伝子の条件
的発現方法。
効果の影響無しに発現が制御でき、挿入変異の危険を低
下させるベクターを提供する。 【解決手段】 エピソーム的複製できる非組込ベクター
であって、真核細胞中で遺伝子を条件的発現できるベク
ター。このベクターを用いた１以上の目的遺伝子の条件
的発現方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、真核細胞中でエピ
ソーム的に複製し真核細胞中での遺伝子の条件的発現に
有用なベクター系、このベクター系の使用、及び、真核
細胞中でエピソーム的に複製するベクター系を用いた目
的とする遺伝子の条件的発現の方法に関する。
ソーム的に複製し真核細胞中での遺伝子の条件的発現に
有用なベクター系、このベクター系の使用、及び、真核
細胞中でエピソーム的に複製するベクター系を用いた目
的とする遺伝子の条件的発現の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の機能を研究するために、目的と
する遺伝子を、細胞培地で成長した細胞または試験動物
の細胞中で、特異的にスイッチ-オンまたはスイッチ-オ
フできる方法が求められている。この課題を解決するた
めの試みは、（ｉ）所定の温度においてのみ所定の機能
を発揮するような前記遺伝子の温度感受性変異体の調
製、（ｉｉ）重金属イオンによって活性化されるプロモ
ーターの使用、（ｉｉｉ）ホルモン−誘発プロモータ
ー、または（ｉｖ）ヒトのエストロゲンレセプターとい
ったホルモンレセプターのホルモン結合ドメインへの遺
伝子の融合を含んでいる。
する遺伝子を、細胞培地で成長した細胞または試験動物
の細胞中で、特異的にスイッチ-オンまたはスイッチ-オ
フできる方法が求められている。この課題を解決するた
めの試みは、（ｉ）所定の温度においてのみ所定の機能
を発揮するような前記遺伝子の温度感受性変異体の調
製、（ｉｉ）重金属イオンによって活性化されるプロモ
ーターの使用、（ｉｉｉ）ホルモン−誘発プロモータ
ー、または（ｉｖ）ヒトのエストロゲンレセプターとい
ったホルモンレセプターのホルモン結合ドメインへの遺
伝子の融合を含んでいる。
【０００３】遺伝子発現の誘発のために温度、重金属イ
オン、及びホルモンを使用する上での一般的な問題は、
これらの条件または物質各々の多面的(pleiotropic)影
響である。従って、条件遺伝子発現系は、まず最初に、
その発現条件の要件を満足しなければならず、可能なら
ば望まない副作用を示すべきではない。他の系は、ヘル
ペスウィルス”ビトロンタンパク質１６（ＶＰ１６）”
遺伝子へのｌａｃレセプターの融合のように、真核細胞
への原核系の適応化(adaption)に基づいている。
オン、及びホルモンを使用する上での一般的な問題は、
これらの条件または物質各々の多面的(pleiotropic)影
響である。従って、条件遺伝子発現系は、まず最初に、
その発現条件の要件を満足しなければならず、可能なら
ば望まない副作用を示すべきではない。他の系は、ヘル
ペスウィルス”ビトロンタンパク質１６（ＶＰ１６）”
遺伝子へのｌａｃレセプターの融合のように、真核細胞
への原核系の適応化(adaption)に基づいている。
【０００４】ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）の、その
オペレーター配列（ｔｅｔＯ）に対するテトラサイクリ
ン（Ｔｃ）に依存した結合に基づく系が、Gossen 及び
Bujard (1992)に記載されている。単純ヘルペスＶＰ１
６遺伝子のトランス活性化ドメインへのｔｅｔＲの融合
により、トランスアクチベーター（ｔＴＡ）が生成さ
れ、それはＴｃの不存在下でｔｅｔＯに結合し、隣接す
るプロモーターを活性化する。Ｔｃの存在下では、ｔＴ
ＡのｔｅｔＯに対する結合がなくなり、従ってプロモー
ター活性化が終わる。好ましくは、ｔｅｔＯは７のコピ
ー数で用いられ、”ｔｅｔ０７”と呼ばれる。目的とす
る遺伝子（ＧＯＩ）の条件的発現のため、この系は無傷
のｔＴＡ発現カセット及び無傷のＧＯＩ転写単位を必要
とし、この転写単位は、ｔｅｔＯ−含有プロモーター、
遺伝子のリーディングフレーム、及びポリアデニル化部
位（ＰＡＡ）からなる。
オペレーター配列（ｔｅｔＯ）に対するテトラサイクリ
ン（Ｔｃ）に依存した結合に基づく系が、Gossen 及び
Bujard (1992)に記載されている。単純ヘルペスＶＰ１
６遺伝子のトランス活性化ドメインへのｔｅｔＲの融合
により、トランスアクチベーター（ｔＴＡ）が生成さ
れ、それはＴｃの不存在下でｔｅｔＯに結合し、隣接す
るプロモーターを活性化する。Ｔｃの存在下では、ｔＴ
ＡのｔｅｔＯに対する結合がなくなり、従ってプロモー
ター活性化が終わる。好ましくは、ｔｅｔＯは７のコピ
ー数で用いられ、”ｔｅｔ０７”と呼ばれる。目的とす
る遺伝子（ＧＯＩ）の条件的発現のため、この系は無傷
のｔＴＡ発現カセット及び無傷のＧＯＩ転写単位を必要
とし、この転写単位は、ｔｅｔＯ−含有プロモーター、
遺伝子のリーディングフレーム、及びポリアデニル化部
位（ＰＡＡ）からなる。
【０００５】この系は、試験期間中に十分な量のｔＴＡ
が発現され、ＧＯＩに対する発現カセットが無傷であ
り、ｔＴＡに接近可能、即ちｔＴＡによって活性化され
うる場合にのみ機能することができる。上記の方法は、
国際特許出願ＷＯ９４／２９４４２にも記載され、これ
らの目的を達成するために組込み発現ベクターを使用し
ている。しかしながら、組込み発現ベクターは、多くの
欠点を有する。 ・標的細胞には、物理的なＤＮＡ転移の後に標的細胞の
ゲノムに構造が僅かしか、または全く組み込まれないも
のがある。 ・発現のレベルは、特に組込み部位に影響される（”位
置効果”）。
が発現され、ＧＯＩに対する発現カセットが無傷であ
り、ｔＴＡに接近可能、即ちｔＴＡによって活性化され
うる場合にのみ機能することができる。上記の方法は、
国際特許出願ＷＯ９４／２９４４２にも記載され、これ
らの目的を達成するために組込み発現ベクターを使用し
ている。しかしながら、組込み発現ベクターは、多くの
欠点を有する。 ・標的細胞には、物理的なＤＮＡ転移の後に標的細胞の
ゲノムに構造が僅かしか、または全く組み込まれないも
のがある。 ・発現のレベルは、特に組込み部位に影響される（”位
置効果”）。
【０００６】これまでに、これら２つの欠点は、異なる
組込み位置を持つ極めて多種のトランスフェクタントを
確立し、次いで、通常はｔｅｔ０７−制御されたリポー
ター遺伝子の一過性トランスフェクションの後に、Ｔｃ
−依存性遺伝子発現の試験を通して最適な細胞を決定す
ることによって解消していた。次に、この細胞は、ｔｅ
ｔＯ−含有プロモーターの制御下でのＧＯＩに対する発
現プラスミドを用いたさらに安定なトランスフェクショ
ンアプローチの標的細胞として提供される。安定なトラ
ンスフェクタントは、次いで単一細胞クローニングを受
け、その後単一クローンはＴｃ有無におけるＧＯＩ発現
のレベルを試験される。
組込み位置を持つ極めて多種のトランスフェクタントを
確立し、次いで、通常はｔｅｔ０７−制御されたリポー
ター遺伝子の一過性トランスフェクションの後に、Ｔｃ
−依存性遺伝子発現の試験を通して最適な細胞を決定す
ることによって解消していた。次に、この細胞は、ｔｅ
ｔＯ−含有プロモーターの制御下でのＧＯＩに対する発
現プラスミドを用いたさらに安定なトランスフェクショ
ンアプローチの標的細胞として提供される。安定なトラ
ンスフェクタントは、次いで単一細胞クローニングを受
け、その後単一クローンはＴｃ有無におけるＧＯＩ発現
のレベルを試験される。
【０００７】従って、所望の型でＧＯＩを条件付きで発
現する１つの細胞クローンを決定するために、１０から
１００の細胞クローンをスクリーニングする必要がある
場合があった。しかし、この方法では、細胞培地におけ
る数回の継体の後にも最初の試験と同様の挙動を示す安
定なクローンが得られることが絶対的に確かではない。
一般的な経験によれば、誘発能力及び発現の最大レベル
は、細胞培地における異なった期間の後に再び低下す
る。これらの変化の基礎を構成するメカニズムは、未だ
完全には理解されていない。可能か説明は、プロモータ
ー領域のメチル化；プラスミドの一部の組み換えまたは
欠失；転写因子が接近できないクロマチン配置の採用で
ある。
現する１つの細胞クローンを決定するために、１０から
１００の細胞クローンをスクリーニングする必要がある
場合があった。しかし、この方法では、細胞培地におけ
る数回の継体の後にも最初の試験と同様の挙動を示す安
定なクローンが得られることが絶対的に確かではない。
一般的な経験によれば、誘発能力及び発現の最大レベル
は、細胞培地における異なった期間の後に再び低下す
る。これらの変化の基礎を構成するメカニズムは、未だ
完全には理解されていない。可能か説明は、プロモータ
ー領域のメチル化；プラスミドの一部の組み換えまたは
欠失；転写因子が接近できないクロマチン配置の採用で
ある。
【０００８】最適な条件的発現系の要件は以下の通りで
ある。 ・誘発及びスイッチ-オフに必要な条件が副作用を持た
ないこと。 ・非誘発状態において、制御すべき遺伝子産物（漏れ(l
eakiness)）の量が可能な限り低いこと。 ・数オーダーの大きさに渡る調節能力。
ある。 ・誘発及びスイッチ-オフに必要な条件が副作用を持た
ないこと。 ・非誘発状態において、制御すべき遺伝子産物（漏れ(l
eakiness)）の量が可能な限り低いこと。 ・数オーダーの大きさに渡る調節能力。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
技術から知られている欠点を回避するベクター系を提供
することにある。中でも、本発明で提供されるベクター
系は、選択しなくても細胞内に多く「保持」され、位置
効果の影響無しに発現が制御でき、挿入変異の危険をか
なり低下させることを目指している。
技術から知られている欠点を回避するベクター系を提供
することにある。中でも、本発明で提供されるベクター
系は、選択しなくても細胞内に多く「保持」され、位置
効果の影響無しに発現が制御でき、挿入変異の危険をか
なり低下させることを目指している。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、この目
的は請求項１に詳細に特徴づけられるベクター系によっ
て達成される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求
項から明確である。本発明のさらなる実施態様において
は、本発明で提供されるベクター系を用いて目的とする
１またはそれ以上の遺伝子を条件的発現する方法が提供
される。
的は請求項１に詳細に特徴づけられるベクター系によっ
て達成される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求
項から明確である。本発明のさらなる実施態様において
は、本発明で提供されるベクター系を用いて目的とする
１またはそれ以上の遺伝子を条件的発現する方法が提供
される。
【００１１】以下に、本発明を、好ましい実施態様につ
いて、実際の実施例及び添付した図面を参照して、より
詳細に説明する。以下では、本発明を、特にエピソーマ
ル(episomal)複製可能なＥＢＶヌクレオチド配列につい
て説明するが、本発明で要求されるエピソーマル機能を
提供する他のそのような配列も有用であることが理解さ
れるであろう。図１から２９は、実施例における試験結
果及び後述の実施例で詳細に述べるベクターを示す。
いて、実際の実施例及び添付した図面を参照して、より
詳細に説明する。以下では、本発明を、特にエピソーマ
ル(episomal)複製可能なＥＢＶヌクレオチド配列につい
て説明するが、本発明で要求されるエピソーマル機能を
提供する他のそのような配列も有用であることが理解さ
れるであろう。図１から２９は、実施例における試験結
果及び後述の実施例で詳細に述べるベクターを示す。
【００１２】即ち、本発明によれば、真核細胞中での条
件的発現のために真核細胞中でエピソーム的に複製する
ベクター系を提供し、このベクター系は、１つのＤＮＡ
分子または少なくとも２つの離れたＤＮＡ分子に操作可
能に結合した、テトラサイクリンまたはその誘導体また
は類似体によって調節されうるトランスアクチベーター
（ｔＴＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオ
チド配列を含み、このｔＴＡは、真核細胞中でのトラン
スクリプションを直接的または間接的に活性化するペプ
チドに操作可能に結合した原核細胞ｔｅｔレセプター、
ｔＴＡに結合可能なｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔ
Ｏ）を含むｔＴＡ−応答性プロモーター、少なくとも１
つの目的とする遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌク
レオチド配列、ポリアデニル化部位（ＰＡＡ）、少なく
とも１つの選択マーカーのポリヌクレオチド配列、及
び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピソーム的な
複製を生起するポリヌクレオチド配列を含む。
件的発現のために真核細胞中でエピソーム的に複製する
ベクター系を提供し、このベクター系は、１つのＤＮＡ
分子または少なくとも２つの離れたＤＮＡ分子に操作可
能に結合した、テトラサイクリンまたはその誘導体また
は類似体によって調節されうるトランスアクチベーター
（ｔＴＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオ
チド配列を含み、このｔＴＡは、真核細胞中でのトラン
スクリプションを直接的または間接的に活性化するペプ
チドに操作可能に結合した原核細胞ｔｅｔレセプター、
ｔＴＡに結合可能なｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔ
Ｏ）を含むｔＴＡ−応答性プロモーター、少なくとも１
つの目的とする遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌク
レオチド配列、ポリアデニル化部位（ＰＡＡ）、少なく
とも１つの選択マーカーのポリヌクレオチド配列、及
び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピソーム的な
複製を生起するポリヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の他の実施態様では、ベク
ターの上記の成分は、単一のベクター分子上に結合して
いる。しかし、本発明では、これらの成分を、数個の、
好ましくは２個のエピソーム的複製ベクター上に分配さ
せてもよい。本発明のさらに他の実施態様では、請求項
１において詳細に特徴づけられるベクター系の成分が、
２つのエピソーム的複製ベクター上に分配され、（ａ）
ベクターＩは、ｔＴＡ、少なくとも１つの選択マーカー
のポリヌクレオチド配列、及び、少なくとも真核細胞中
でベクターのエピソーム的な複製を生起するポリヌクレ
オチド配列を含み、（ｂ）ベクターＩＩは、ｔＴＡ、Ｇ
ＯＩ、少なくとも１つの選択マーカーのポリヌクレオチ
ド配列、及び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピ
ソーム的な複製を生起するポリヌクレオチド配列に応答
するプロモーターを含む。
ターの上記の成分は、単一のベクター分子上に結合して
いる。しかし、本発明では、これらの成分を、数個の、
好ましくは２個のエピソーム的複製ベクター上に分配さ
せてもよい。本発明のさらに他の実施態様では、請求項
１において詳細に特徴づけられるベクター系の成分が、
２つのエピソーム的複製ベクター上に分配され、（ａ）
ベクターＩは、ｔＴＡ、少なくとも１つの選択マーカー
のポリヌクレオチド配列、及び、少なくとも真核細胞中
でベクターのエピソーム的な複製を生起するポリヌクレ
オチド配列を含み、（ｂ）ベクターＩＩは、ｔＴＡ、Ｇ
ＯＩ、少なくとも１つの選択マーカーのポリヌクレオチ
ド配列、及び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピ
ソーム的な複製を生起するポリヌクレオチド配列に応答
するプロモーターを含む。
【００１４】好ましくは、ｔＴＡのｔｅｔリプレッサー
は、Ｔｎ１０−誘導ｔｅｔリプレッサーである。真核細
胞中でのトランスクリプションを直接的または間接的に
活性化するポリペプチドは、単純ヘルペスウィルスビリ
オンタンパク質１６から誘導されてもよい。酸性、プロ
リン−リッチ、セリン／トレオニン−リッチ、及びグル
タミン−リッチなトランスクリプションアクチベーター
タンパク質の群の少なくとも１つの成分から選択しても
よい。
は、Ｔｎ１０−誘導ｔｅｔリプレッサーである。真核細
胞中でのトランスクリプションを直接的または間接的に
活性化するポリペプチドは、単純ヘルペスウィルスビリ
オンタンパク質１６から誘導されてもよい。酸性、プロ
リン−リッチ、セリン／トレオニン−リッチ、及びグル
タミン−リッチなトランスクリプションアクチベーター
タンパク質の群の少なくとも１つの成分から選択しても
よい。
【００１５】真核細胞中でのトランスクリプションを直
接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリペプチド
は、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス・ループ・
ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメインからな
る群の少なくとも１つの成分から選択される相互作用ド
メインであってもよい。本発明の１つの実施態様では、
ポリペプチドは、ＴＡＴＡ結合タンパク質の相互作用ド
メインである。ｔＴＡをコードするポリヌクレオチド配
列は、好ましくは、ＣＭＶ、ｔｋ、及びｍｙｃプロモー
ターからなる群の成分から選択されるプロモーターを有
する。
接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリペプチド
は、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス・ループ・
ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメインからな
る群の少なくとも１つの成分から選択される相互作用ド
メインであってもよい。本発明の１つの実施態様では、
ポリペプチドは、ＴＡＴＡ結合タンパク質の相互作用ド
メインである。ｔＴＡをコードするポリヌクレオチド配
列は、好ましくは、ＣＭＶ、ｔｋ、及びｍｙｃプロモー
ターからなる群の成分から選択されるプロモーターを有
する。
【００１６】即ち、テトラサイクリンによって制御され
うるトランスクリプションアクチベーターは、２つのポ
リペプチドから構成される誘導タンパク質（ｔＴＡと呼
ばれる）である。第１のポリペプチドは、ｔｅｔオペレ
ーター配列に結合可能なｔｅｔリプレッサーである。本
発明の１つの実施態様では、それはテトラサイクリンの
不存在下では結合するが、テトラサイクリンの存在下で
は結合せず、本発明の他の実施態様では、ｔｅｔリプレ
ッサーは、テトラサイクリンの存在下ではｔｅｔオペレ
ーター配列に結合するが、テトラサイクリンの不存在下
では結合しない。第２のポリペプチドは、真核細胞中で
のトランスクリプションを直接的または間接的に活性化
する。第２のポリペプチドの好ましい例は、単純ヘルペ
スウィルスビリオンタンパク質１６のトランスクリプシ
ョン−活性化ドメインである。
うるトランスクリプションアクチベーターは、２つのポ
リペプチドから構成される誘導タンパク質（ｔＴＡと呼
ばれる）である。第１のポリペプチドは、ｔｅｔオペレ
ーター配列に結合可能なｔｅｔリプレッサーである。本
発明の１つの実施態様では、それはテトラサイクリンの
不存在下では結合するが、テトラサイクリンの存在下で
は結合せず、本発明の他の実施態様では、ｔｅｔリプレ
ッサーは、テトラサイクリンの存在下ではｔｅｔオペレ
ーター配列に結合するが、テトラサイクリンの不存在下
では結合しない。第２のポリペプチドは、真核細胞中で
のトランスクリプションを直接的または間接的に活性化
する。第２のポリペプチドの好ましい例は、単純ヘルペ
スウィルスビリオンタンパク質１６のトランスクリプシ
ョン−活性化ドメインである。
【００１７】ｔｅｔリプレッサー／オペレーター／イン
デューサー系の開示について、国際特許出願ＷＯ９４／
２９４４２の全体、Gossen 及び Bujardの文献（Proc.
Natl. Acad. Sci., 89巻, 5547-5551頁）、Gossen 等の
文献（Science, 268巻, 1766-1769頁）が注目される。
これらの文献は、その全体を、参考文献として本出願に
取り入れる。
デューサー系の開示について、国際特許出願ＷＯ９４／
２９４４２の全体、Gossen 及び Bujardの文献（Proc.
Natl. Acad. Sci., 89巻, 5547-5551頁）、Gossen 等の
文献（Science, 268巻, 1766-1769頁）が注目される。
これらの文献は、その全体を、参考文献として本出願に
取り入れる。
【００１８】ｔＴＡをコードするポリヌクレオチド配列
は、構造的に活性なプロモーター、好ましくは、ＣＭ
Ｖ、ｔｋ、及びｃ−ｍｙｃプロモーターからなる群の１
つの成分から選択されるプロモーターの制御下にあるの
が好ましく、また、このｔＴＡをコードするポリヌクレ
オチド配列は、ｔＴＡ応答性プロモーターの制御下にあ
る（自己調節）こともできる。
は、構造的に活性なプロモーター、好ましくは、ＣＭ
Ｖ、ｔｋ、及びｃ−ｍｙｃプロモーターからなる群の１
つの成分から選択されるプロモーターの制御下にあるの
が好ましく、また、このｔＴＡをコードするポリヌクレ
オチド配列は、ｔＴＡ応答性プロモーターの制御下にあ
る（自己調節）こともできる。
【００１９】ｔＴＡ応答性プロモーターは、少なくとも
１つのｔｅｔオペレーター配列及びプロモーター好まし
くは目的遺伝子のトランスクリプションを開始する最小
プロモーターからなる。「最小プロモーター」とは、ト
ランスクリプションの出発を決定するがそれ自身は効率
的なトランスクリプションを十分に開始できない部分的
プロモーター配列を意味する。このような最小プロモー
ターの活性は、アクチベーターの、それに操作可能に結
合した結合部位への結合、例えば、テトラサイクリン制
御されたトランスアクチベーターの結合に依存する。
１つのｔｅｔオペレーター配列及びプロモーター好まし
くは目的遺伝子のトランスクリプションを開始する最小
プロモーターからなる。「最小プロモーター」とは、ト
ランスクリプションの出発を決定するがそれ自身は効率
的なトランスクリプションを十分に開始できない部分的
プロモーター配列を意味する。このような最小プロモー
ターの活性は、アクチベーターの、それに操作可能に結
合した結合部位への結合、例えば、テトラサイクリン制
御されたトランスアクチベーターの結合に依存する。
【００２０】ｔＴＡ応答性プロモーターは、プロモータ
ーとして機能する少なくとも１つの配列、及び、オペレ
ーターとして機能し、ｔｅｔＲが結合可能な１つの配列
からなる。本発明の好ましい実施態様では、ｔＴＡ応答
性プロモーターは、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢ
Ｖ）のＴＰプロモーターを含む。本発明の１つの実施態
様では、ｔＴＡ応答性プロモーターは、ＥＢＶのＴＰプ
ロモーターを含み、ｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔ
Ｏ）は、ＥＢＮＡ−２応答性成分が置換または追加され
ている。ＥＢＮＡ−２応答性成分の機能は良く知られて
いる（例えば、Zimber-Strobl 1993,1994 参照）。
ーとして機能する少なくとも１つの配列、及び、オペレ
ーターとして機能し、ｔｅｔＲが結合可能な１つの配列
からなる。本発明の好ましい実施態様では、ｔＴＡ応答
性プロモーターは、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢ
Ｖ）のＴＰプロモーターを含む。本発明の１つの実施態
様では、ｔＴＡ応答性プロモーターは、ＥＢＶのＴＰプ
ロモーターを含み、ｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔ
Ｏ）は、ＥＢＮＡ−２応答性成分が置換または追加され
ている。ＥＢＮＡ−２応答性成分の機能は良く知られて
いる（例えば、Zimber-Strobl 1993,1994 参照）。
【００２１】ｔＴＡ応答性プロモーターは、ｔｅｔオペ
レーター配列（ｔｅｔＯ）に操作可能に結合して存在す
る。好ましくは、ｔｅｔＯは複数のコピー数、特に好ま
しくは７のコピー数で存在する。よって、ｔＴＡ応答性
プロモーターは、ｔｅｔオペレーター配列及び目的遺伝
子のトランスクリプションの開始のためのプロモーター
を含み、前記プロモーターは、最小プロモーターである
のが好ましい。
レーター配列（ｔｅｔＯ）に操作可能に結合して存在す
る。好ましくは、ｔｅｔＯは複数のコピー数、特に好ま
しくは７のコピー数で存在する。よって、ｔＴＡ応答性
プロモーターは、ｔｅｔオペレーター配列及び目的遺伝
子のトランスクリプションの開始のためのプロモーター
を含み、前記プロモーターは、最小プロモーターである
のが好ましい。
【００２２】本発明のトランスアクチベーターによって
制御されうる目的遺伝子は、ヒト、ウイルス、または細
菌タンパク質をコードすることができる。例えば、目的
遺伝子は、トランスクリプション因子、がん遺伝子、シ
グナル伝達分子、酵素、サイトカイン、細胞接着タンパ
ク質、腫瘍抗原、共刺激シグナル分子(co-stimulatory
signalling molecules)、及び、受容者のものとは異な
るＨＬＡからなる群の少なくとも１つの成分から選択さ
れるポリペプチドをコードすることもできる。サイト会
には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー
−刺激因子、リンホカイン、及び成長因子を含んでよ
い。
制御されうる目的遺伝子は、ヒト、ウイルス、または細
菌タンパク質をコードすることができる。例えば、目的
遺伝子は、トランスクリプション因子、がん遺伝子、シ
グナル伝達分子、酵素、サイトカイン、細胞接着タンパ
ク質、腫瘍抗原、共刺激シグナル分子(co-stimulatory
signalling molecules)、及び、受容者のものとは異な
るＨＬＡからなる群の少なくとも１つの成分から選択さ
れるポリペプチドをコードすることもできる。サイト会
には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー
−刺激因子、リンホカイン、及び成長因子を含んでよ
い。
【００２３】本発明のベクター系で発現されるタンパク
質は、医学上価値のあるタンパク質である場合が多く、
in vivo で治療上有効であるように、細胞から単離され
ても細胞内に保持したままでもよい。本発明のベクター
系は、それ自体は従来から知られている選択マーカーを
含んでいる。このようなマーカーの例は、Ｔｋタンパク
質、ネオマイシンタンパク質、または拝具路マイシンタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
質は、医学上価値のあるタンパク質である場合が多く、
in vivo で治療上有効であるように、細胞から単離され
ても細胞内に保持したままでもよい。本発明のベクター
系は、それ自体は従来から知られている選択マーカーを
含んでいる。このようなマーカーの例は、Ｔｋタンパク
質、ネオマイシンタンパク質、または拝具路マイシンタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２４】本発明のベクター系は、真核細胞中でのベ
クターのエピソーマル複製に応答するようなポリヌクレ
オチド配列を必須に含む。しかし、本発明のベクター系
は、原核細胞中でのべきターの複製を許すようなポリヌ
クレオチド配列も含むので、本発明のベクター系はシャ
トルベクターである。
クターのエピソーマル複製に応答するようなポリヌクレ
オチド配列を必須に含む。しかし、本発明のベクター系
は、原核細胞中でのべきターの複製を許すようなポリヌ
クレオチド配列も含むので、本発明のベクター系はシャ
トルベクターである。
【００２５】本発明の１つの実施態様では、少なくとも
真核細胞中での本発明のベクター系のエピソーマル複製
に応答性のポリヌクレオチドは、ＥＢＶ（ｏｒｉＰ）ま
たはＥＰＶ（ウシパピローマウィルス）の複製起源（ｏ
ｒｉ）を含む。ＥＢＶ系を用いるときは、エピソーマル
複製を維持するために、ＥＢＮＡ１をコードするｏｒｉ
Ｐ以外のポリヌクレオチドが更に必要である。
真核細胞中での本発明のベクター系のエピソーマル複製
に応答性のポリヌクレオチドは、ＥＢＶ（ｏｒｉＰ）ま
たはＥＰＶ（ウシパピローマウィルス）の複製起源（ｏ
ｒｉ）を含む。ＥＢＶ系を用いるときは、エピソーマル
複製を維持するために、ＥＢＮＡ１をコードするｏｒｉ
Ｐ以外のポリヌクレオチドが更に必要である。
【００２６】パッケージング：ベクターのＥＢＶ粒子へ
パックされる能力感染細胞では、ＥＢＶゲノムは２つの
基本的状態で存在する：潜伏状態及びウィルス産生状態
（溶菌状態）である。後者の状態は、ウィルスＤＮＡの
増幅（複製）と、ウィルス粒子の構造タンパク質のよう
な種々のウィルス遺伝子産物の発現によって特徴づけら
れる。ウィルスＤＮＡの溶菌複製は、決定されたＤＮＡ
構造：いわゆる「ＤＮＡ複製の溶菌起源(lytic origin
s)」と呼ばれ、ウィルスゲノム（ｏｒｉｌｙｔ）に重複
して存在するＤＮＡ構造（Hammerschmidt 等, 1988）に
おいて開始される。複製によるウィルスＤＮＡの増幅
は、効率的なパッケージングの必要条件である。さら
に、ウィルスＤＮＡの末端、いわゆる「ターミナルリピ
ート(terminal repeat)」（ＴＲ）は、ウィルス粒子へ
のパッケージングに必要である（Hammerschmidt 等, 19
89）。ウィルス粒子へのパッケージングは、本発明のベ
クターを、これら２つの構造（ｏｒｉｌｙｔ及びＴＲ）
で延長することによって可能になる。ベクターのＥＢＶ
−陽性細胞への転移及び溶菌サイクルの誘発の後、これ
らのベクターはマルチマーの形態の感染粒子にパッケー
ジングされる。次いで、これらの粒子は、ＥＢＶレセプ
ターを有する件線細胞に用いられる。この試みは、所望
の標的細胞が従来の生物物理学的方法でトランスフェク
ションされないときにも使用できる。
パックされる能力感染細胞では、ＥＢＶゲノムは２つの
基本的状態で存在する：潜伏状態及びウィルス産生状態
（溶菌状態）である。後者の状態は、ウィルスＤＮＡの
増幅（複製）と、ウィルス粒子の構造タンパク質のよう
な種々のウィルス遺伝子産物の発現によって特徴づけら
れる。ウィルスＤＮＡの溶菌複製は、決定されたＤＮＡ
構造：いわゆる「ＤＮＡ複製の溶菌起源(lytic origin
s)」と呼ばれ、ウィルスゲノム（ｏｒｉｌｙｔ）に重複
して存在するＤＮＡ構造（Hammerschmidt 等, 1988）に
おいて開始される。複製によるウィルスＤＮＡの増幅
は、効率的なパッケージングの必要条件である。さら
に、ウィルスＤＮＡの末端、いわゆる「ターミナルリピ
ート(terminal repeat)」（ＴＲ）は、ウィルス粒子へ
のパッケージングに必要である（Hammerschmidt 等, 19
89）。ウィルス粒子へのパッケージングは、本発明のベ
クターを、これら２つの構造（ｏｒｉｌｙｔ及びＴＲ）
で延長することによって可能になる。ベクターのＥＢＶ
−陽性細胞への転移及び溶菌サイクルの誘発の後、これ
らのベクターはマルチマーの形態の感染粒子にパッケー
ジングされる。次いで、これらの粒子は、ＥＢＶレセプ
ターを有する件線細胞に用いられる。この試みは、所望
の標的細胞が従来の生物物理学的方法でトランスフェク
ションされないときにも使用できる。
【００２７】本発明のベクター系は、サイトカイン遺伝
子または腫瘍抗原などの治療的価値のある遺伝子を細
胞、特にＢ細胞に導入するためにも用いられる。さら
に、本発明のベクター系は、ヒトの悪性なウィルス疾
患、特にＢ細胞腫瘍を伴う疾患の治療にも採用される。
本発明のベクター系は、特に遺伝子治療において好適に
用いられる。
子または腫瘍抗原などの治療的価値のある遺伝子を細
胞、特にＢ細胞に導入するためにも用いられる。さら
に、本発明のベクター系は、ヒトの悪性なウィルス疾
患、特にＢ細胞腫瘍を伴う疾患の治療にも採用される。
本発明のベクター系は、特に遺伝子治療において好適に
用いられる。
【００２８】本発明のベクター系は、遺伝子構造と呼ん
でもよい。「ベクター系」なる用語は、単一のベクター
並びに少なくとも２つのベクターの組み合わせを含み、
これらのベクター上には、本発明で必要とされるポリヌ
クレオチド配列が分配されている。好ましい実施態様で
は、本発明は、テトラサイクリン−依存性遺伝子調節
と、エピソーマル複製を可能にするＥＢＶベクターを含
む系を用いる。
でもよい。「ベクター系」なる用語は、単一のベクター
並びに少なくとも２つのベクターの組み合わせを含み、
これらのベクター上には、本発明で必要とされるポリヌ
クレオチド配列が分配されている。好ましい実施態様で
は、本発明は、テトラサイクリン−依存性遺伝子調節
と、エピソーマル複製を可能にするＥＢＶベクターを含
む系を用いる。
【００２９】感染細胞でのＥＢＶゲノムは、通常１０か
ら１００のコピー数で存在する。潜伏状態では、ウィル
スゲノムの複製は複製起源（ｏｒｉＰ）において出発す
る（Yates 等, 1984）。さらに、エピソーマル複製の維
持には、ＥＢＮＡ１タンパク質のｏｒｉＰへの結合が必
要である（Yates 等, 1985）。ＥＢＶから誘導されたベ
クターは、例えばｐＢＲ配列または他のプラスミド配
列、ｏｒｉＰ、ＥＢＮＡ１の発現カセット、及び真核細
胞のための選択マーカー（例えばハイグロマイシン耐性
遺伝子）からなる。さらに、これらのベクターは、２０
から３０ｋｂの付加的外来配列を組込む能力も有する。
これらのベクターに基づく構造は、（ｉ）選択しなくて
も細胞内に良好に「保持」され（Middleton 及び Sugde
n, 1994）、（ｉｉ）挿入突然変異の危険性をかなり低
減する。これらのベクターで安定にトランスフェクトさ
れた細胞を得る効率は、プラスミドベクター単独に比較
して増加した。我々は、これらのベクターを用いてトラ
ンスフェクトされた制御可能な遺伝子構造は、その誘発
能力を長期間保持した（Polack 等, 1992; Bouvier等,1
993）。
ら１００のコピー数で存在する。潜伏状態では、ウィル
スゲノムの複製は複製起源（ｏｒｉＰ）において出発す
る（Yates 等, 1984）。さらに、エピソーマル複製の維
持には、ＥＢＮＡ１タンパク質のｏｒｉＰへの結合が必
要である（Yates 等, 1985）。ＥＢＶから誘導されたベ
クターは、例えばｐＢＲ配列または他のプラスミド配
列、ｏｒｉＰ、ＥＢＮＡ１の発現カセット、及び真核細
胞のための選択マーカー（例えばハイグロマイシン耐性
遺伝子）からなる。さらに、これらのベクターは、２０
から３０ｋｂの付加的外来配列を組込む能力も有する。
これらのベクターに基づく構造は、（ｉ）選択しなくて
も細胞内に良好に「保持」され（Middleton 及び Sugde
n, 1994）、（ｉｉ）挿入突然変異の危険性をかなり低
減する。これらのベクターで安定にトランスフェクトさ
れた細胞を得る効率は、プラスミドベクター単独に比較
して増加した。我々は、これらのベクターを用いてトラ
ンスフェクトされた制御可能な遺伝子構造は、その誘発
能力を長期間保持した（Polack 等, 1992; Bouvier等,1
993）。
【００３０】本発明の好ましい実施態様では、本発明の
ベクター系がＥＢＶ−陽性細胞に導入される。ＥＢＶ−
陽性細胞は、本発明のベクター系のエピソーマル複製に
必要なタンパク質を発現する。この場合、例えば、本発
明のベクター系によって発現されるＥＢＮＡ１タンパク
質は必要ではない。
ベクター系がＥＢＶ−陽性細胞に導入される。ＥＢＶ−
陽性細胞は、本発明のベクター系のエピソーマル複製に
必要なタンパク質を発現する。この場合、例えば、本発
明のベクター系によって発現されるＥＢＮＡ１タンパク
質は必要ではない。
【００３１】標的細胞中でエピソーム的に複製する本発
明で用いられるベクターは、従来技術で知られた組込ベ
クターを用いた安定な発現に伴う困難性を回避する。こ
れを示すために、テトラサイクリン−依存性トランスア
クチベーターに対して、ｔＴＡ（構造的プロモーター、
遺伝子（この場合はｔＴＡ）をコードするポリヌクレチ
ド配列、及びポリアデニル化部位）に対する発現カセッ
トは、サイトメガロウィルスである「前初期遺伝子」プ
ロモーター（ＣＭＶ）またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）
プロモーター、各々の制御下において、エプスタイン・
バーウィルス（ＥＢＶ）から誘導されたベクターｐＨＥ
ＢＯＰＬにクローン化される。ｐＨＥＢＯＰＬは、Sugd
en 等 (1985) に記載されたベクターの誘導体（Polack
等, 1991）である。
明で用いられるベクターは、従来技術で知られた組込ベ
クターを用いた安定な発現に伴う困難性を回避する。こ
れを示すために、テトラサイクリン−依存性トランスア
クチベーターに対して、ｔＴＡ（構造的プロモーター、
遺伝子（この場合はｔＴＡ）をコードするポリヌクレチ
ド配列、及びポリアデニル化部位）に対する発現カセッ
トは、サイトメガロウィルスである「前初期遺伝子」プ
ロモーター（ＣＭＶ）またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）
プロモーター、各々の制御下において、エプスタイン・
バーウィルス（ＥＢＶ）から誘導されたベクターｐＨＥ
ＢＯＰＬにクローン化される。ｐＨＥＢＯＰＬは、Sugd
en 等 (1985) に記載されたベクターの誘導体（Polack
等, 1991）である。
【００３２】構造の説明： ＢＣ８９構造の説明 ベクターｐＵＨＤ１５−１、ｔＴＡに対するＣＭＶ発現
ベクター（Gossen 及び Bujard, 1992）を、ＸｈｏＩ及
びＨｐａＩフラグメント（１から１９２４の配列位置）
として、ベクターｐＨＥＢＯＰＬ（Polack 等, 1991 で
最初に報告された）の制限酵素切断部位ＳａｌＩ及びＮ
ａｅＩ（４７から７９の配列位置）にクローン化した。
ベクター（Gossen 及び Bujard, 1992）を、ＸｈｏＩ及
びＨｐａＩフラグメント（１から１９２４の配列位置）
として、ベクターｐＨＥＢＯＰＬ（Polack 等, 1991 で
最初に報告された）の制限酵素切断部位ＳａｌＩ及びＮ
ａｅＩ（４７から７９の配列位置）にクローン化した。
【００３３】ＢＣ９０構造の説明 ベクターｐＵＨＤ１５−２０、ｔＴＡに対するｔｋ発現
ベクター（Gossen 及び Bujard, 1992）を、ＸｈｏＩ及
びＨｐａＩフラグメント（１から１９２４の配列位置）
として、ベクターｐＨＥＢＯＰＬの制限酵素切断部位Ｓ
ａｌＩ及びＮａｅＩ（４７から７９の配列位置）にクロ
ーン化した（ＢＣ９０）。発現プラスミドＢＣ８９及び
ＢＣ９０は、最初に、ｐＵＨＣ１３−３（Gosen及び Bu
jard, 1992 参照）とともに、Ｒａｊｉ細胞に一過的に
トランスフェクトされた。その後、トランスフェクショ
ンサンプルは、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔ
ｃ）で、またはＴｃ無しで、４８時間処理された。これ
らの細胞の抽出液中のルシフェラーゼ活性の測定によ
り、プラスミドＢＣ８９及びＢＣ９０が、起源のプラス
ミドｐＵＨＤ１５−１及びｐＵＨＤ１５−２０と同様の
方法でｔＴＡを発現することが示された（データは示さ
ない）。
ベクター（Gossen 及び Bujard, 1992）を、ＸｈｏＩ及
びＨｐａＩフラグメント（１から１９２４の配列位置）
として、ベクターｐＨＥＢＯＰＬの制限酵素切断部位Ｓ
ａｌＩ及びＮａｅＩ（４７から７９の配列位置）にクロ
ーン化した（ＢＣ９０）。発現プラスミドＢＣ８９及び
ＢＣ９０は、最初に、ｐＵＨＣ１３−３（Gosen及び Bu
jard, 1992 参照）とともに、Ｒａｊｉ細胞に一過的に
トランスフェクトされた。その後、トランスフェクショ
ンサンプルは、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔ
ｃ）で、またはＴｃ無しで、４８時間処理された。これ
らの細胞の抽出液中のルシフェラーゼ活性の測定によ
り、プラスミドＢＣ８９及びＢＣ９０が、起源のプラス
ミドｐＵＨＤ１５−１及びｐＵＨＤ１５−２０と同様の
方法でｔＴＡを発現することが示された（データは示さ
ない）。
【００３４】さらに、バーキットリンパ腫ラインのＲａ
ｊｉは、ＢＣ８９及びＢＣ９０プラスミドによってトラ
ンスフェクトされる。ハイグロマイシンでの選択より、
数種のサブライン（Ａ−Ｄ）が確立された。このように
得られたサブラインへのｐＵＨＣ１３−３（ＣＭＶ−ｔ
ｅｔ０７−ＬＵＣ）の一過性トランスフェクションは、
Ｔｃ−依存性トランスアクチベーターの安定な発現の証
拠を与えた（図１参照）。
ｊｉは、ＢＣ８９及びＢＣ９０プラスミドによってトラ
ンスフェクトされる。ハイグロマイシンでの選択より、
数種のサブライン（Ａ−Ｄ）が確立された。このように
得られたサブラインへのｐＵＨＣ１３−３（ＣＭＶ−ｔ
ｅｔ０７−ＬＵＣ）の一過性トランスフェクションは、
Ｔｃ−依存性トランスアクチベーターの安定な発現の証
拠を与えた（図１参照）。
【００３５】この実験は、エピソーム的に複製する発現
ベクターのリンパ腫細胞への安定なトランスフェクショ
ンにより有効量のｔＴＡが発現されうることを示した。
ＢＣ８９またはＢＣ９０を用いて得られた、各々４また
は３の異なるトランスフェクタントは、ＣＭＶ−ｔｅｔ
０７プロモーターの基本的活性またはその誘発される能
力に関しては、互いに相違が見られなかった。さらに、
この実験は、ｔｋプロモーター（ＢＣ９０）を用いるこ
とによっては、トランスアクチベーターの十分な発現は
達成できないことを示す。これらの細胞（ＢＣ９０Ａ−
Ｄ）では、ルシフェラーゼ発現は、Ｔｃによって２倍し
か変化しなかったが、ＣＭＶ−ｔＴＡを有するセルライ
ン（ＢＣ８９Ａ−Ｄ）では、６０から１００倍の変化が
得られた。この実験は、ｐＵＨＣ１３−３構造の基本的
活性（即ち、マイナスＴｃ）は、ｔＴＡの両によって実
質的に影響されないことをさらに示している。
ベクターのリンパ腫細胞への安定なトランスフェクショ
ンにより有効量のｔＴＡが発現されうることを示した。
ＢＣ８９またはＢＣ９０を用いて得られた、各々４また
は３の異なるトランスフェクタントは、ＣＭＶ−ｔｅｔ
０７プロモーターの基本的活性またはその誘発される能
力に関しては、互いに相違が見られなかった。さらに、
この実験は、ｔｋプロモーター（ＢＣ９０）を用いるこ
とによっては、トランスアクチベーターの十分な発現は
達成できないことを示す。これらの細胞（ＢＣ９０Ａ−
Ｄ）では、ルシフェラーゼ発現は、Ｔｃによって２倍し
か変化しなかったが、ＣＭＶ−ｔＴＡを有するセルライ
ン（ＢＣ８９Ａ−Ｄ）では、６０から１００倍の変化が
得られた。この実験は、ｐＵＨＣ１３−３構造の基本的
活性（即ち、マイナスＴｃ）は、ｔＴＡの両によって実
質的に影響されないことをさらに示している。
【００３６】非誘発状態（Ｔｃ無し）では、ＣＭＶ−ｔ
ｅｔ０７−ＬＵＣ（ｐＵＨＣ１３−３）は、標準ハツゲ
ンベクターＣＭＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣの約３分の１の活性
を示した（図２）。誘発状態では、ｐＵＨＣ１３−３
は、ＣＭＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣの約９０倍程度の強さを示
した。「基本的活性」及び最大活性は、機能的な分析を
するには高すぎることがわかった。ｐＵＨＣ１３−３に
比較すると、やはりGossen 及び Bujard に従って調製
したｔｅｔ０７を持つｔｋプロモーター（ｐＴ７ｔ８
１）は低い基本的活性を示したが、このベクターを試験
し、やはり最低の活性を示した他のベクターを比較すれ
ば２６倍であった（図３）。
ｅｔ０７−ＬＵＣ（ｐＵＨＣ１３−３）は、標準ハツゲ
ンベクターＣＭＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣの約３分の１の活性
を示した（図２）。誘発状態では、ｐＵＨＣ１３−３
は、ＣＭＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣの約９０倍程度の強さを示
した。「基本的活性」及び最大活性は、機能的な分析を
するには高すぎることがわかった。ｐＵＨＣ１３−３に
比較すると、やはりGossen 及び Bujard に従って調製
したｔｅｔ０７を持つｔｋプロモーター（ｐＴ７ｔ８
１）は低い基本的活性を示したが、このベクターを試験
し、やはり最低の活性を示した他のベクターを比較すれ
ば２６倍であった（図３）。
【００３７】本発明の好ましい目的は、エピソーム的に
複製するベクター系をＢ細胞に採用することである。試
験した２つのプロモーターは、これまではＢ細胞での使
用では不安定であるとされていた。従って、ＥＢＶのＴ
Ｐプロモーターが、Ｔｃに制御されるべき発現ベクター
の構造の基礎として選択されていた。このプロモーター
は、ＥＢＶ−陽性細胞中で、ＥＢＶ−コードされたトラ
ンスクリプション因子ＥＢＮＡ２（Zimber-Strobl 等,
1991）によって極めて有効に制御される。ＴＰプロモー
ターにおけるＤＮＡ成分が、ＲＢＰＪKとの複合体にお
いてＥＢＮＡ２に結合することは周知である（Zimber-S
trobl 等, 1993；Meitinger 等, 1994）。プロモーター
活性の調節は、ＤＮＡ−結合細胞トランスクリプション
因子ＲＢＰＪK（Zimber-Strobl 等, 1994）によって媒
介される。ＴＰプロモーターが、ＥＢＮＡ２の不存在か
では完全に不活性であり、ＥＢＮＡ２によって数オーダ
ーの大きさで活性化できるので、このプロモーターのＥ
ＢＮＡ２−応答性成分は、ｐＵＨＣ１３ー３からのｔｅ
ｔ０７成分で置換された。
複製するベクター系をＢ細胞に採用することである。試
験した２つのプロモーターは、これまではＢ細胞での使
用では不安定であるとされていた。従って、ＥＢＶのＴ
Ｐプロモーターが、Ｔｃに制御されるべき発現ベクター
の構造の基礎として選択されていた。このプロモーター
は、ＥＢＶ−陽性細胞中で、ＥＢＶ−コードされたトラ
ンスクリプション因子ＥＢＮＡ２（Zimber-Strobl 等,
1991）によって極めて有効に制御される。ＴＰプロモー
ターにおけるＤＮＡ成分が、ＲＢＰＪKとの複合体にお
いてＥＢＮＡ２に結合することは周知である（Zimber-S
trobl 等, 1993；Meitinger 等, 1994）。プロモーター
活性の調節は、ＤＮＡ−結合細胞トランスクリプション
因子ＲＢＰＪK（Zimber-Strobl 等, 1994）によって媒
介される。ＴＰプロモーターが、ＥＢＮＡ２の不存在か
では完全に不活性であり、ＥＢＮＡ２によって数オーダ
ーの大きさで活性化できるので、このプロモーターのＥ
ＢＮＡ２−応答性成分は、ｐＵＨＣ１３ー３からのｔｅ
ｔ０７成分で置換された。
【００３８】ＣＲ２７６構造の説明 ＴＰ−ＬＵＣプロモーター構造Ｇａ３８−１４のＥＢＮ
Ａ２−応答部位は、制限酵素切断部位ＮｒｕＩ及びＢｃ
ｌＩを用いて切り出された。突出末端は、クレノウポリ
メラーゼを用いてふさぎ、次いでｔｅｔオペロン（ｔｅ
ｔ０７）を、Gossen Bujard (1992) の起源クローン
（ｐＵＨＣ１３−３）からのＳｍａＩ−ＳｍａＩフラグ
メントとして挿入した。ＣＲ２７６、ＴＰｔｅｔ０７−
ＬＵＣ構造は、ｔＴＡを発現するＲａｊｉセルラインＢ
Ｃ８９Ｃに一過性トランスフェクトされた（図３）。ｐ
ＵＨＣ１３−３との比較により、「基本的活性」は、４
から５倍低下し、最大（誘発）活性は、６から７倍低下
することが示された。
Ａ２−応答部位は、制限酵素切断部位ＮｒｕＩ及びＢｃ
ｌＩを用いて切り出された。突出末端は、クレノウポリ
メラーゼを用いてふさぎ、次いでｔｅｔオペロン（ｔｅ
ｔ０７）を、Gossen Bujard (1992) の起源クローン
（ｐＵＨＣ１３−３）からのＳｍａＩ−ＳｍａＩフラグ
メントとして挿入した。ＣＲ２７６、ＴＰｔｅｔ０７−
ＬＵＣ構造は、ｔＴＡを発現するＲａｊｉセルラインＢ
Ｃ８９Ｃに一過性トランスフェクトされた（図３）。ｐ
ＵＨＣ１３−３との比較により、「基本的活性」は、４
から５倍低下し、最大（誘発）活性は、６から７倍低下
することが示された。
【００３９】本発明の「オールインワン(all-in-one)」
方法 Gossen 及び Bujard (1992) によって示唆された条件遺
伝子発現のための系は、第１に、トランスアクチベータ
ー（ｔＴＡ）を産生するセルラインの調製を含む。最適
なセルラインは、適当なリポーター遺伝子構造の一過性
トランスフェクションによって決定する。第２のトラン
スフェクション段階では、ＧＯＩが、ｔｅｔオペロンの
制御下でこの細胞に導入されるべきである。異なるサブ
ラインを試験することにより、条件付き方法においてＧ
ＯＩを発現する適当なセルラインを同定すべきである。
この試みの前提条件は、組込ベクターを用いて、より長
い期間に渡り一定量のｔＴＡ分子を産生する安定なトラ
ンスフェクタントを多量に調製する可能性である。さら
に、ＧＯＩ構造は、長い時間に渡ってｔＴＡに接近可能
な方法で、宿主ゲノムに組込むことが必要である。
方法 Gossen 及び Bujard (1992) によって示唆された条件遺
伝子発現のための系は、第１に、トランスアクチベータ
ー（ｔＴＡ）を産生するセルラインの調製を含む。最適
なセルラインは、適当なリポーター遺伝子構造の一過性
トランスフェクションによって決定する。第２のトラン
スフェクション段階では、ＧＯＩが、ｔｅｔオペロンの
制御下でこの細胞に導入されるべきである。異なるサブ
ラインを試験することにより、条件付き方法においてＧ
ＯＩを発現する適当なセルラインを同定すべきである。
この試みの前提条件は、組込ベクターを用いて、より長
い期間に渡り一定量のｔＴＡ分子を産生する安定なトラ
ンスフェクタントを多量に調製する可能性である。さら
に、ＧＯＩ構造は、長い時間に渡ってｔＴＡに接近可能
な方法で、宿主ゲノムに組込むことが必要である。
【００４０】この方法は、しばしば、トランスフェクト
されるべき細胞の無能力（例えば、各々Ｂ細胞またはＢ
細胞−誘導腫瘍細胞）によって妨げられる。さらなる問
題は、外来遺伝子の永久に安定な発現によって生ずる。
組込発現プラスミドは、レトロウイルスを介して導入さ
れても、多くの細胞型においてスイッチ・オフされるこ
とがあることは周知である（Xu 等, 1989）。２段階ト
ランスフェクションの問題を回避するために、本発明に
従って産生されたエピソーム的に複製するプラスミド
は、ｔＴＡを発現し、かつＴＰ−ｔｅｔ０７の制御下で
ＧＯＩ（ここでは実験的にルシフェラーゼ遺伝子を用い
る）を有する。このプラスミドによって、１段階でＧＯ
Ｉ（構成ではルシフェラーゼ）の条件的発現が達成され
る。
されるべき細胞の無能力（例えば、各々Ｂ細胞またはＢ
細胞−誘導腫瘍細胞）によって妨げられる。さらなる問
題は、外来遺伝子の永久に安定な発現によって生ずる。
組込発現プラスミドは、レトロウイルスを介して導入さ
れても、多くの細胞型においてスイッチ・オフされるこ
とがあることは周知である（Xu 等, 1989）。２段階ト
ランスフェクションの問題を回避するために、本発明に
従って産生されたエピソーム的に複製するプラスミド
は、ｔＴＡを発現し、かつＴＰ−ｔｅｔ０７の制御下で
ＧＯＩ（ここでは実験的にルシフェラーゼ遺伝子を用い
る）を有する。このプラスミドによって、１段階でＧＯ
Ｉ（構成ではルシフェラーゼ）の条件的発現が達成され
る。
【００４１】ＢＣ３１５の説明 まず、ＴＰ−ｔｅｔ０７プロモーター及びルシフェラー
ゼ遺伝子の一部が、ＸｍｎＩ−ＣｌａＩフラグメントと
してＢＣ８９に、またＸｍｎＩ及びＣｌａＩ部位を介し
てクローン化された（ＢＣ２５０）。ルシフェラーゼ遺
伝子は、ＢｇｌＩＩ及びＣｌａＩによってＢＣ２５０か
ら取り除かれ、ＢｇｌＩＩリンカー（"New England Bio
labs" #1066）が挿入された（ＢＣ２５２）。ルシフェ
ラーゼ遺伝子は、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント
として、ＢＣ２５２のＢｇｌＩＩ制限部位にＳＶ４０ポ
リアデニル化部位とともにクローン化された（ＢＣ３１
５）。さらに、クローンＢＣ３１５は、ルシフェラーゼ
遺伝子が反対向きに含まれる制御プラスミドとして調製
された。ＢＣ３１５構造では、ＴＰｔｅｔ０７プロモー
ターが１００倍活性化されることが観察された。この結
果は、ベクター部分（ｏｒｉＰ、ハイグロマイシン耐性
遺伝子）もｔＴＡ発現カセットも、このプロモーターの
誘発を阻害しないことを示す。従って、ＢＣ３１５を有
する安定なＲａｊｉトランスフェクタントが確立され、
ルシフェラーゼ活性が、Ｔｃ処理の前後で測定された
（図５）。
ゼ遺伝子の一部が、ＸｍｎＩ−ＣｌａＩフラグメントと
してＢＣ８９に、またＸｍｎＩ及びＣｌａＩ部位を介し
てクローン化された（ＢＣ２５０）。ルシフェラーゼ遺
伝子は、ＢｇｌＩＩ及びＣｌａＩによってＢＣ２５０か
ら取り除かれ、ＢｇｌＩＩリンカー（"New England Bio
labs" #1066）が挿入された（ＢＣ２５２）。ルシフェ
ラーゼ遺伝子は、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント
として、ＢＣ２５２のＢｇｌＩＩ制限部位にＳＶ４０ポ
リアデニル化部位とともにクローン化された（ＢＣ３１
５）。さらに、クローンＢＣ３１５は、ルシフェラーゼ
遺伝子が反対向きに含まれる制御プラスミドとして調製
された。ＢＣ３１５構造では、ＴＰｔｅｔ０７プロモー
ターが１００倍活性化されることが観察された。この結
果は、ベクター部分（ｏｒｉＰ、ハイグロマイシン耐性
遺伝子）もｔＴＡ発現カセットも、このプロモーターの
誘発を阻害しないことを示す。従って、ＢＣ３１５を有
する安定なＲａｊｉトランスフェクタントが確立され、
ルシフェラーゼ活性が、Ｔｃ処理の前後で測定された
（図５）。
【００４２】図５に示した実験は、前述の系の以下の本
質的な特徴を示している。 ・導入されたプラスミド上の注文通りのクロマチン構造
の形成を伴う安定なトランスフェクションの後でも、プ
ロモーターは誘発されうる。ｔＴＡ分子の発現を確実に
するＣＭＶプロモーター／エンハンサー領域のＴＰｔｅ
ｔ０７プロモーターへの空間的な近接は、もはや変化し
ないような方法で、その構造的発現を導かない。 ・互いに独立に生成された４つのサブラインは、基本的
活性及びルシフェラーゼ活性の誘発に関して、低い程度
の変異しか示さない。
質的な特徴を示している。 ・導入されたプラスミド上の注文通りのクロマチン構造
の形成を伴う安定なトランスフェクションの後でも、プ
ロモーターは誘発されうる。ｔＴＡ分子の発現を確実に
するＣＭＶプロモーター／エンハンサー領域のＴＰｔｅ
ｔ０７プロモーターへの空間的な近接は、もはや変化し
ないような方法で、その構造的発現を導かない。 ・互いに独立に生成された４つのサブラインは、基本的
活性及びルシフェラーゼ活性の誘発に関して、低い程度
の変異しか示さない。
【００４３】安定なＢＣ３２２−２ラインは、経時的及
び投与量依存的関係について、更に詳細に試験された。
細胞は、異なる濃度のＴｃで処理され、４、８、１６、
２４、及び４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定し
た。この実験の結果（図６）は、１μｇ／ｍｌのＴｃで
４８時間後に最大応答が達成されることを示している。
ルシフェラーゼＲＮＡ並びにタンパク質の安定性が実験
の結果に寄与するので、この実験に基づいて、プロモー
ター活性の調節の実際の速度について予測することはで
きない。ルシフェラーゼタンパク質の安定性に関する我
々の公表していない観察によると、タンパク質の半減期
は数時間である。従って、プロモーター活性の最大調節
は、Ｔｃ添加後数時間以内に既に起こっていると仮定す
ることができる。
び投与量依存的関係について、更に詳細に試験された。
細胞は、異なる濃度のＴｃで処理され、４、８、１６、
２４、及び４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定し
た。この実験の結果（図６）は、１μｇ／ｍｌのＴｃで
４８時間後に最大応答が達成されることを示している。
ルシフェラーゼＲＮＡ並びにタンパク質の安定性が実験
の結果に寄与するので、この実験に基づいて、プロモー
ター活性の調節の実際の速度について予測することはで
きない。ルシフェラーゼタンパク質の安定性に関する我
々の公表していない観察によると、タンパク質の半減期
は数時間である。従って、プロモーター活性の最大調節
は、Ｔｃ添加後数時間以内に既に起こっていると仮定す
ることができる。
【００４４】上記の系を用いたｃ−ｍｙｃ遺伝子の条件
的発現 ＢＣ構造の説明 ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の第１、第２および第３のエクソ
ン並びにポリアデニル化部位（Gazin 等, 1984 による
４０７７から８０８２配列位置）を、ＢａｍＨＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとして、ＢＣ２５２ベクターのＢａ
ｌＩＩ制限部位にクローン化した。ｃ−ｍｙｃ遺伝子
は、バーキットリンパ腫ＢＬ６０（Polack等, 1991）か
ら誘導した。ＮｈｅＩ（位置４０７７）におけるＢａｍ
ＨＩ制限部位が、リンカーを用いて導入された（ＢＣ２
５３）。ＥｃｏＲＩの３’（ｃ−ｍｙｃの８０８２配列
位置）に位置するＢａｍＨＩ制限部位は、ベクターのポ
リリンカーから誘導された。ＢＣ２６６によるｍｙｃの
条件的発現を、一過性トランスフェクション、次いで、
ウェスタンブロット分析によって決定した（データ示さ
ず）。
的発現 ＢＣ構造の説明 ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の第１、第２および第３のエクソ
ン並びにポリアデニル化部位（Gazin 等, 1984 による
４０７７から８０８２配列位置）を、ＢａｍＨＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとして、ＢＣ２５２ベクターのＢａ
ｌＩＩ制限部位にクローン化した。ｃ−ｍｙｃ遺伝子
は、バーキットリンパ腫ＢＬ６０（Polack等, 1991）か
ら誘導した。ＮｈｅＩ（位置４０７７）におけるＢａｍ
ＨＩ制限部位が、リンカーを用いて導入された（ＢＣ２
５３）。ＥｃｏＲＩの３’（ｃ−ｍｙｃの８０８２配列
位置）に位置するＢａｍＨＩ制限部位は、ベクターのポ
リリンカーから誘導された。ＢＣ２６６によるｍｙｃの
条件的発現を、一過性トランスフェクション、次いで、
ウェスタンブロット分析によって決定した（データ示さ
ず）。
【００４５】ＢＣ２６６によるｍｙｃの条件的発現をさ
らに詳細に実験するために、ＥＲ／ＥＢ２−５セルライ
ン（Kempkes 等, 1995）をＢＣ２６６によって安定にト
ランスフェクトした。ＥＲ／ＥＢ２−５標的細胞は、こ
のセルラインにおいて、ｃ−ｍｙｃの発現がＥＢＮＡ２
遺伝子の条件的変異体の制御下にあるので選択された。
条件的ＥＢＮＡ２変異体（ＥＲ／ＥＢＮＡ２）は、それ
をヒトエストロゲンレセプターのエストロゲン結合部分
に融合させることによって形成した。ＥＲ−ＥＢＮＡ２
は、細胞培養媒質中のエストロゲンの存在に依存する。
この細胞において、内因性ｍｙｃ発現は、エストロゲン
涸渇によって殆ど完全にスイッチ・オフされる（Kempke
s 等, 1995）。
らに詳細に実験するために、ＥＲ／ＥＢ２−５セルライ
ン（Kempkes 等, 1995）をＢＣ２６６によって安定にト
ランスフェクトした。ＥＲ／ＥＢ２−５標的細胞は、こ
のセルラインにおいて、ｃ−ｍｙｃの発現がＥＢＮＡ２
遺伝子の条件的変異体の制御下にあるので選択された。
条件的ＥＢＮＡ２変異体（ＥＲ／ＥＢＮＡ２）は、それ
をヒトエストロゲンレセプターのエストロゲン結合部分
に融合させることによって形成した。ＥＲ−ＥＢＮＡ２
は、細胞培養媒質中のエストロゲンの存在に依存する。
この細胞において、内因性ｍｙｃ発現は、エストロゲン
涸渇によって殆ど完全にスイッチ・オフされる（Kempke
s 等, 1995）。
【００４６】このトランスフェクションのサブライン
（ＢＣ４９３−６）は、更に詳細に試験した。このセル
ラインにおけるｍｙｃ発現は、細胞培養媒質中にＴｃを
添加することにより、かなり変化させることができる
（図７）。ｍｙｃのＴｃ媒介のスイッチ・オフは、増殖
抑制を伴う。図７に示した実験は、エストロゲン無し
で、即ち、ＥＢＮＡ２の機能がスイッチ・オフされたと
き行った。この状態では、内因性ｃ−ｍｙｃ遺伝子は殆
ど無傷である。この実施例は、非リポーター遺伝子（ｃ
−ｍｙｃ）の条件的発現が、ベクターＢＣ２５２を用い
て達成されることを示している。
（ＢＣ４９３−６）は、更に詳細に試験した。このセル
ラインにおけるｍｙｃ発現は、細胞培養媒質中にＴｃを
添加することにより、かなり変化させることができる
（図７）。ｍｙｃのＴｃ媒介のスイッチ・オフは、増殖
抑制を伴う。図７に示した実験は、エストロゲン無し
で、即ち、ＥＢＮＡ２の機能がスイッチ・オフされたと
き行った。この状態では、内因性ｃ−ｍｙｃ遺伝子は殆
ど無傷である。この実施例は、非リポーター遺伝子（ｃ
−ｍｙｃ）の条件的発現が、ベクターＢＣ２５２を用い
て達成されることを示している。
【００４７】テトラサイクリンによって転写的に活性化
されたベクターの発生 Gossen 等 (1995) は、彼らの系の改善を提案してい
る。Ｔｃ−制御されたトランスアクチベーターｔＴＡ
は、突然変異誘発によって修飾され、もはやＴｃによっ
て抑制されずに活性化されるようにされた。この分子
（ｒｔＴＡ）は、細胞培養媒質中にＴｃが添加された後
にオペレーター（ｔｅｔ０７）に結合する。
されたベクターの発生 Gossen 等 (1995) は、彼らの系の改善を提案してい
る。Ｔｃ−制御されたトランスアクチベーターｔＴＡ
は、突然変異誘発によって修飾され、もはやＴｃによっ
て抑制されずに活性化されるようにされた。この分子
（ｒｔＴＡ）は、細胞培養媒質中にＴｃが添加された後
にオペレーター（ｔｅｔ０７）に結合する。
【００４８】ＢＣ２５２ｒｅｖ構造の説明 ＢｓｐＩ４０７及びＳｐｌＩを用い、ＢＣ２５２のＣＭ
Ｖプロモーターの大部分及びｔＴＡコード領域を、ｐＵ
ＨＤ１７２−１からのｒｔＴＡによって、ＢｓｐＩ４０
７及びＳｐｌＩも用いて置換した。このようにして得ら
れたプラスミドＢＣ２５２ｒｅｖに、ＢＣ３１１からの
ルシフェラーゼ遺伝子及びポリアデニル化部位を、Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとして、ＢｌＩＩ部位を用いてクロ
ーン化した（ＭＳ２ａ）。Ｒａｊｉ細胞は、ＭＳ２ａに
よって安定にトランスフェクトされた。８つの安定なト
ランスフェクタントの試験の結果を、図７に示した。こ
こに提供した２つのベクター系（ＢＣ２５２及びＢＣ２
５２ｒｅｖ）は、ＥＢＶ−陽性細胞中での任意の遺伝子
の条件的発現を達成するために用いられる。ＥＢＶ−陰
性細胞については、細胞中で第２のプラスミドによって
発現されるべきＥＢＮＡ−１またはＥＢＮＡ−１発現カ
セットのいずれかを、ベクターＢＣ２５２及びＢＣ２５
２ｒｅｖにさらに挿入しなければならない。
Ｖプロモーターの大部分及びｔＴＡコード領域を、ｐＵ
ＨＤ１７２−１からのｒｔＴＡによって、ＢｓｐＩ４０
７及びＳｐｌＩも用いて置換した。このようにして得ら
れたプラスミドＢＣ２５２ｒｅｖに、ＢＣ３１１からの
ルシフェラーゼ遺伝子及びポリアデニル化部位を、Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとして、ＢｌＩＩ部位を用いてクロ
ーン化した（ＭＳ２ａ）。Ｒａｊｉ細胞は、ＭＳ２ａに
よって安定にトランスフェクトされた。８つの安定なト
ランスフェクタントの試験の結果を、図７に示した。こ
こに提供した２つのベクター系（ＢＣ２５２及びＢＣ２
５２ｒｅｖ）は、ＥＢＶ−陽性細胞中での任意の遺伝子
の条件的発現を達成するために用いられる。ＥＢＶ−陰
性細胞については、細胞中で第２のプラスミドによって
発現されるべきＥＢＮＡ−１またはＥＢＮＡ−１発現カ
セットのいずれかを、ベクターＢＣ２５２及びＢＣ２５
２ｒｅｖにさらに挿入しなければならない。
【００４９】Ｒａｆ変異体ＢＸＢの条件的発現 ＢＣ３９２構造の説明 Ｒａｆ変異体ＢＸＢ（Bruder 等, 1992）のｃＤＮＡ
を、ＳｆｉＩ−ＳｆｉＩフラグメントとして、ＢＣ３６
４のＳｆｉＩ制限部位にクローン化した。ＢＣ３６４
は、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ）及びポリアデニル化部位を更に有する
ＢＣ２５２誘導体である。
を、ＳｆｉＩ−ＳｆｉＩフラグメントとして、ＢＣ３６
４のＳｆｉＩ制限部位にクローン化した。ＢＣ３６４
は、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ）及びポリアデニル化部位を更に有する
ＢＣ２５２誘導体である。
【００５０】ＥＲ／ＥＢ２−５細胞におけるＢＸＢの条
件的発現 ＢＣ３９２構造を、ＥＲ／ＥＢ２−５セルラインにトラ
ンスフェクトした。ハイグロマイシンで選択した後、２
つの安定なライン、ＢＣ４１５−１及びＢＣ４１５−２
を確立した。これらのセルラインは、エストロゲン及び
Ｔｃの存在下または不存在下で、図８に示した時間培養
し、タンパク質抽出液を得た。タンパク質抽出液は、ウ
ェスタンブロット技術を用いて評価した。図８に示した
ように、ＢＸＢは、ＢＣ４１５−１及び−２のいずれで
も、細胞培養媒質中のＴｃの存在に依存して発現され
た。
件的発現 ＢＣ３９２構造を、ＥＲ／ＥＢ２−５セルラインにトラ
ンスフェクトした。ハイグロマイシンで選択した後、２
つの安定なライン、ＢＣ４１５−１及びＢＣ４１５−２
を確立した。これらのセルラインは、エストロゲン及び
Ｔｃの存在下または不存在下で、図８に示した時間培養
し、タンパク質抽出液を得た。タンパク質抽出液は、ウ
ェスタンブロット技術を用いて評価した。図８に示した
ように、ＢＸＢは、ＢＣ４１５−１及び−２のいずれで
も、細胞培養媒質中のＴｃの存在に依存して発現され
た。
【００５１】ＥＲ／ＥＢ２−５細胞は、細胞培養媒質に
エストロゲンが存在するときのみ成長することができる
（Kempkes 等, 1995）。エストロゲンの涸渇は、増殖抑
制を導く。ＴＰｔｅｔ０７プロモーターの発現は、細胞
の増殖状態に影響されない。従って、このベクターは、
休止細胞においても発現することができる。
エストロゲンが存在するときのみ成長することができる
（Kempkes 等, 1995）。エストロゲンの涸渇は、増殖抑
制を導く。ＴＰｔｅｔ０７プロモーターの発現は、細胞
の増殖状態に影響されない。従って、このベクターは、
休止細胞においても発現することができる。
【００５２】参考文献： １．Bouvier, G., Hergenhahn, M., Polack, A., Bornk
amm, G.W., 及び Bartsch, H., (1993). 「腫瘍プロモ
ーター及びＥＢＶインデューサ検出の２つの試験系の確
認：ＤＲ−ＣＡＴ Ｒａｊｉ細胞及びヒト顆粒球中での
数種の試薬の相対的応答(Validation of two test syst
ems for detecting turmour promoters and EBV induce
rs: comparative responses of several agents in DR-
CAT Raji cells and in human granulocytes.)」 Carci
nogenesis 14, 1573-1578. ２．Bruder, J.T., Heidecker 及び U.R. Rapp, 「Ａｐ
−１／Ｅｔｓ−駆動性の血清−、ＴＰＡ−、及びＲＡＳ
−誘発発現はＲａｆ−１キナーゼを必要とする(serum-T
PA-, and Ras-induced expression from Ap-1/Ets-driv
en promoters requires Raf-1 kinase.)」 Genes De
v., 6: 545-56 (1992). ３．Gazin, C., Dinechin, S.D., Hampe, A., MAsson,
J.M., Martin, P., Stehelin, D., 及び Galibert, F.
(1984). 「ヒトｃ−ｍｙｃ座の核酸配列：第１のエクソ
ン内のおとりオープンリーディングｅ(Nucleotide sequ
ence of human c-myc locus: provocative open readin
g e within the first exon.)」 EMBO J., 3, 383-38
7.
amm, G.W., 及び Bartsch, H., (1993). 「腫瘍プロモ
ーター及びＥＢＶインデューサ検出の２つの試験系の確
認：ＤＲ−ＣＡＴ Ｒａｊｉ細胞及びヒト顆粒球中での
数種の試薬の相対的応答(Validation of two test syst
ems for detecting turmour promoters and EBV induce
rs: comparative responses of several agents in DR-
CAT Raji cells and in human granulocytes.)」 Carci
nogenesis 14, 1573-1578. ２．Bruder, J.T., Heidecker 及び U.R. Rapp, 「Ａｐ
−１／Ｅｔｓ−駆動性の血清−、ＴＰＡ−、及びＲＡＳ
−誘発発現はＲａｆ−１キナーゼを必要とする(serum-T
PA-, and Ras-induced expression from Ap-1/Ets-driv
en promoters requires Raf-1 kinase.)」 Genes De
v., 6: 545-56 (1992). ３．Gazin, C., Dinechin, S.D., Hampe, A., MAsson,
J.M., Martin, P., Stehelin, D., 及び Galibert, F.
(1984). 「ヒトｃ−ｍｙｃ座の核酸配列：第１のエクソ
ン内のおとりオープンリーディングｅ(Nucleotide sequ
ence of human c-myc locus: provocative open readin
g e within the first exon.)」 EMBO J., 3, 383-38
7.
【００５３】４．Gossen, M., Freundlieb, S., Bemde
r, G., Muller, G., Hillen, W., 及びBujard, H., (19
95). 「哺乳類細胞中でのテトラサイクリンによる転写
活性化(Transcriptional activation by tetracyclines
in mammalian cells.)」 Science, 268, 1766-1769. ５．Gossen, M., 及び Bujard, H. (1992). 「テトラ
サイクリン−応答性プロモーターによる哺乳類細胞中で
の遺伝子発現の緊縮制御(Tight control of geneexpres
sion in mammalian cells by tetracycline-responsive
promoters.)」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 5
547-5551. ６．Hammerschmidt, W. 及び Sudden, B. (1988). 「エ
プスタインバーウィルスのＤナ複製の溶菌起源、ｏｒｉ
Ｌｙｔの同定及び特性化(Indentification and charact
erization of oriLyt, a lytic origin of DNA replica
tion of Epstain-Barr virus.)」 Cell, 55, 427-433.
r, G., Muller, G., Hillen, W., 及びBujard, H., (19
95). 「哺乳類細胞中でのテトラサイクリンによる転写
活性化(Transcriptional activation by tetracyclines
in mammalian cells.)」 Science, 268, 1766-1769. ５．Gossen, M., 及び Bujard, H. (1992). 「テトラ
サイクリン−応答性プロモーターによる哺乳類細胞中で
の遺伝子発現の緊縮制御(Tight control of geneexpres
sion in mammalian cells by tetracycline-responsive
promoters.)」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 5
547-5551. ６．Hammerschmidt, W. 及び Sudden, B. (1988). 「エ
プスタインバーウィルスのＤナ複製の溶菌起源、ｏｒｉ
Ｌｙｔの同定及び特性化(Indentification and charact
erization of oriLyt, a lytic origin of DNA replica
tion of Epstain-Barr virus.)」 Cell, 55, 427-433.
【００５４】７．Hammerschmidt, W. 及び Sugden, B.
(1989). 「ヒトＢリンパ球におけるエプスタインバーウ
ィルスの不朽化機能の遺伝子的分析(Genetic analysis
of immortalizing functions of Epstain-Barr virus i
n human B lymphocytes.)」 Nature, 340, 393-397. ８．Kempkes, B., Spitkovsky, D., Jansen-Durr, P.,
Ellwart, J.W., Kremmer, E., Delecluse, H.-J., Rott
enberger, C., Borkamm, G.W., 及び Hammerschmidt,
W. (1995). 「ＥＢＮＡ２条件のエプスタインバーウィ
ルス変異体によるＢ細胞増殖と初期Ｇ１調節タンパク質
の誘発(B-cell proliferation and induction of early
G1-regulating proteins by Epstein-Barr virus muta
nts conditional for EBNA2.)」 EMBO J., 14, 88-69. ９．Meitinger, C., Strobl. L.J., Marschall, G., Bo
rnkamm, G.W., 及び Zimber-Strobl, U. (1994). 「Ｅ
ＢＮＡ２媒介トランスアクチベーション及びＥＢＮＡ２
とその応答性成分との相互作用のためのエプスタインバ
ーウィルスＴＰ１プロモーター内の決定的配列(Crucial
sequences within the Epstein Barr virus TP1 promo
ter for EBNA2-mediated transactivation and interac
tion of EBNA2 with its responsive element.)」 J.
Virol., 68, 7497-7506. １０．Middleton, T. 及び Sugden, B. (1994). 「哺
乳類細胞でのプラスミドＤＮＡの保持は、エプスタイン
バーウィルス複製タンパク質のＥＢＮＡ２への結合によ
って促進される(Retention of plasmid DNA in mammali
an cells is enhanced by binding of Epstein-Barr vi
rus replication protein to ENBA1.)」J. Virol., 68,
4067-4071.
(1989). 「ヒトＢリンパ球におけるエプスタインバーウ
ィルスの不朽化機能の遺伝子的分析(Genetic analysis
of immortalizing functions of Epstain-Barr virus i
n human B lymphocytes.)」 Nature, 340, 393-397. ８．Kempkes, B., Spitkovsky, D., Jansen-Durr, P.,
Ellwart, J.W., Kremmer, E., Delecluse, H.-J., Rott
enberger, C., Borkamm, G.W., 及び Hammerschmidt,
W. (1995). 「ＥＢＮＡ２条件のエプスタインバーウィ
ルス変異体によるＢ細胞増殖と初期Ｇ１調節タンパク質
の誘発(B-cell proliferation and induction of early
G1-regulating proteins by Epstein-Barr virus muta
nts conditional for EBNA2.)」 EMBO J., 14, 88-69. ９．Meitinger, C., Strobl. L.J., Marschall, G., Bo
rnkamm, G.W., 及び Zimber-Strobl, U. (1994). 「Ｅ
ＢＮＡ２媒介トランスアクチベーション及びＥＢＮＡ２
とその応答性成分との相互作用のためのエプスタインバ
ーウィルスＴＰ１プロモーター内の決定的配列(Crucial
sequences within the Epstein Barr virus TP1 promo
ter for EBNA2-mediated transactivation and interac
tion of EBNA2 with its responsive element.)」 J.
Virol., 68, 7497-7506. １０．Middleton, T. 及び Sugden, B. (1994). 「哺
乳類細胞でのプラスミドＤＮＡの保持は、エプスタイン
バーウィルス複製タンパク質のＥＢＮＡ２への結合によ
って促進される(Retention of plasmid DNA in mammali
an cells is enhanced by binding of Epstein-Barr vi
rus replication protein to ENBA1.)」J. Virol., 68,
4067-4071.
【００５５】１１．Polack, A., Strobl, L., Feederl
e, R., Schweizer, M., Koch, e., Eick, D., Wiegand,
H., 及び Bornkamm, G.W. (1991) 「イムノグロブリン
κ遺伝子のイントロンエンハンサーは、ｃ．ｍｙｃを活
性化するが、バーキット特異的プロモーターシフトは誘
発しない(The intron enhancer of the immunogloblink
appa gene activates c.myc but does not induce the
Burkitt specific promoter shift.)」 Oncogene, 6,
2033-2040. １２．Polack, A., Laux, G., Hergenhahn, M., Kloz,
U., Rosner, H., Hecker, E., 及び Bornkamm, G.W. (1
992) 「条件ガン原検出の短時間アッセイＩ：ＤＲ−Ｃ
ＡＴ Ｒａｊｉ細胞の構造及びテスター細胞としてのそ
れらのいくつかの特性(Short-term assays for detecti
on of conditional cancerogens I. Construction of D
R-CAT Raji cells and some of their characteristics
as testercels.)」 １３．Sgden, B., Marsh, K., 及び Yates, J. (1985).
「プラスミドとして複製し、エプスタインバーウィル
スによってトランスフォームされたＢ−リンパ球におい
て効率的に選択されるベクター(A vector that replica
tes as a plasmidand can be efficiently selected in
B-lymphoblasts transformed by Epstein-Barr viru
s.)」 Mol. Cell Biol., 5, 410-413.
e, R., Schweizer, M., Koch, e., Eick, D., Wiegand,
H., 及び Bornkamm, G.W. (1991) 「イムノグロブリン
κ遺伝子のイントロンエンハンサーは、ｃ．ｍｙｃを活
性化するが、バーキット特異的プロモーターシフトは誘
発しない(The intron enhancer of the immunogloblink
appa gene activates c.myc but does not induce the
Burkitt specific promoter shift.)」 Oncogene, 6,
2033-2040. １２．Polack, A., Laux, G., Hergenhahn, M., Kloz,
U., Rosner, H., Hecker, E., 及び Bornkamm, G.W. (1
992) 「条件ガン原検出の短時間アッセイＩ：ＤＲ−Ｃ
ＡＴ Ｒａｊｉ細胞の構造及びテスター細胞としてのそ
れらのいくつかの特性(Short-term assays for detecti
on of conditional cancerogens I. Construction of D
R-CAT Raji cells and some of their characteristics
as testercels.)」 １３．Sgden, B., Marsh, K., 及び Yates, J. (1985).
「プラスミドとして複製し、エプスタインバーウィル
スによってトランスフォームされたＢ−リンパ球におい
て効率的に選択されるベクター(A vector that replica
tes as a plasmidand can be efficiently selected in
B-lymphoblasts transformed by Epstein-Barr viru
s.)」 Mol. Cell Biol., 5, 410-413.
【００５６】１４．Xu, L., Yee, J.K., Wolff, J.A.,
Friedmann, T. (1989). 「モロニーのネズミ白血病ウ
ィルスに基づくベクターの長期間安定性に影響する因子
(Factors affecting long-term stability of Moloney
murine leukemia virus-basedvectors.)」 Virology, 1
71, 331-341. １５．Yates, J., Warren, N., Reisman, D., 及び Sug
den, B. (1984). 「せっｂざいてきに感染された細胞中
で組み換えプラスミドの安定な複製を可能にするエプス
タインバーウィルス遺伝子からのシス−活性因子(A cis
-acting elementfrom the Epstein-Barr virus genome
that permits stable replication of recombinant pla
smids in latently infected cells.)」 Proc. Natl. A
cad. Sci.U.S.A., 81, 3806-3810. １６．Yates, J.L., Warren, N. 及び Sugden, B. (198
4). 「種々の哺乳類細胞におけるエプスタインバーウィ
ルスから誘導されたプラスミドの安定な複製(Stable re
plication of plasmids derived from Epstein-Barr vi
rus in various mammalian cells.)」 Nature, 313, 81
2-815.
Friedmann, T. (1989). 「モロニーのネズミ白血病ウ
ィルスに基づくベクターの長期間安定性に影響する因子
(Factors affecting long-term stability of Moloney
murine leukemia virus-basedvectors.)」 Virology, 1
71, 331-341. １５．Yates, J., Warren, N., Reisman, D., 及び Sug
den, B. (1984). 「せっｂざいてきに感染された細胞中
で組み換えプラスミドの安定な複製を可能にするエプス
タインバーウィルス遺伝子からのシス−活性因子(A cis
-acting elementfrom the Epstein-Barr virus genome
that permits stable replication of recombinant pla
smids in latently infected cells.)」 Proc. Natl. A
cad. Sci.U.S.A., 81, 3806-3810. １６．Yates, J.L., Warren, N. 及び Sugden, B. (198
4). 「種々の哺乳類細胞におけるエプスタインバーウィ
ルスから誘導されたプラスミドの安定な複製(Stable re
plication of plasmids derived from Epstein-Barr vi
rus in various mammalian cells.)」 Nature, 313, 81
2-815.
【００５７】１７．Zimber-Strobl, U., Kremmer, E.,
Grasser, F., Marscall, G., Laux, G., 及び Bornkam
m, G.W. (1993). 「末端タンパク質１遺伝子プロモータ
ーのシス−因子に応答するＥＢＮＡ２と相互作用するエ
プスタインバーウィルス核抗原２ (The Epstein-Barr
virus nuclear antigen 2 interacts with an EBNA2 re
sponsive cis-element of the terminal protein 1 gen
e promoter.)」 EMBO J., 12, 167-175. １８．Zimber-Strobl, U., Strobl, L.J., Meitinger,
C., Hinrichs, R., Sakai, T., Furukawa, T., Honjo,
T. 及び Bornkamm, G.W. (1994). 「エプスタインバー
ウィルス核抗原２は、組み換えシグナル結合タンパク質
ＲＢＰ−Ｊκ、ヘアレスのショウジョウバエとの相互作
用を介してそのトランスアクチベーション活性を発揮す
る(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 exerts its
transactivating function through interaction with
recombination signal binding protein RBP-J kappa,
the homologue of Drosophila Suppressor of Hairles
s.)」 EMBO J., 13, 4973-4982. １９．Zimber-Strobl, U., Suentzenich, K.-O., Laux,
G., Eick, D., Cordier, M., Calender, A., Billaud,
M., Lenoir, G.M., 及び Bornkamm, G.M. (1991).
「エプスタインバーウィルス核抗原２は、末端タンパク
質遺伝記の転写を活性化する(Epstein-Barr virus nucl
ear antigen 2 activates transcription ofthe termin
al protein gene.)」 J. Virol., 65, 415-.
Grasser, F., Marscall, G., Laux, G., 及び Bornkam
m, G.W. (1993). 「末端タンパク質１遺伝子プロモータ
ーのシス−因子に応答するＥＢＮＡ２と相互作用するエ
プスタインバーウィルス核抗原２ (The Epstein-Barr
virus nuclear antigen 2 interacts with an EBNA2 re
sponsive cis-element of the terminal protein 1 gen
e promoter.)」 EMBO J., 12, 167-175. １８．Zimber-Strobl, U., Strobl, L.J., Meitinger,
C., Hinrichs, R., Sakai, T., Furukawa, T., Honjo,
T. 及び Bornkamm, G.W. (1994). 「エプスタインバー
ウィルス核抗原２は、組み換えシグナル結合タンパク質
ＲＢＰ−Ｊκ、ヘアレスのショウジョウバエとの相互作
用を介してそのトランスアクチベーション活性を発揮す
る(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 exerts its
transactivating function through interaction with
recombination signal binding protein RBP-J kappa,
the homologue of Drosophila Suppressor of Hairles
s.)」 EMBO J., 13, 4973-4982. １９．Zimber-Strobl, U., Suentzenich, K.-O., Laux,
G., Eick, D., Cordier, M., Calender, A., Billaud,
M., Lenoir, G.M., 及び Bornkamm, G.M. (1991).
「エプスタインバーウィルス核抗原２は、末端タンパク
質遺伝記の転写を活性化する(Epstein-Barr virus nucl
ear antigen 2 activates transcription ofthe termin
al protein gene.)」 J. Virol., 65, 415-.
【図１】 ＢＣ８９またはＢＣ９０で各々安定にトラン
スフェクトされた異なるセルライン（ＢＣ８９Ａ−Ｄ及
びＢＣ９０Ａ−Ｃ）における、ｐＵＨＣ１３−３（ＣＭ
Ｖ−ｔｅｔＯ−ＬＵＣ）の一過性トランスフェクション
後の、Ｔｃによって変化したルシフェラーゼ活性を表す
グラフである。
スフェクトされた異なるセルライン（ＢＣ８９Ａ−Ｄ及
びＢＣ９０Ａ−Ｃ）における、ｐＵＨＣ１３−３（ＣＭ
Ｖ−ｔｅｔＯ−ＬＵＣ）の一過性トランスフェクション
後の、Ｔｃによって変化したルシフェラーゼ活性を表す
グラフである。
【図２】 ｐＵＨＣ１３−３のプロモーター活性の、Ｂ
Ｃ８９への一過性トランスフェクション後の、ＣＭＶ−
ＬＴＲ−ＬＵＣのプロモーター活性との比較を示すグラ
フである。
Ｃ８９への一過性トランスフェクション後の、ＣＭＶ−
ＬＴＲ−ＬＵＣのプロモーター活性との比較を示すグラ
フである。
【図３】 ＢＣ８９への一過性トランスフェクション後
に示された構造のプロモーター活性の比較を示すグラフ
である。
に示された構造のプロモーター活性の比較を示すグラフ
である。
【図４】 ＢＣ３１５Ａ及びＢのＲａｊｉへの一過性ト
ランスフェクションを示すグラフである。
ランスフェクションを示すグラフである。
【図５】 Ｔｃ処理前後におけるＢＣ３１５Ａで安定に
トランスフェクトされたＲａｊｉ細胞の異なるサブライ
ン（ＢＣ３２２−１から４）でのルシフェラーゼ活性を
示すグラフである。
トランスフェクトされたＲａｊｉ細胞の異なるサブライ
ン（ＢＣ３２２−１から４）でのルシフェラーゼ活性を
示すグラフである。
【図６】 異なる濃度のＴｃで処理したサブラインＢＣ
３２２−２（Ｒａｊｉ×ＢＣ３１５Ａ）を示すグラフで
ある。各濃度で３つの異なるサンプルを別々に測定し
た。異なる印は平均値を示し、黒線は測定の標準偏差の
半分を示す。
３２２−２（Ｒａｊｉ×ＢＣ３１５Ａ）を示すグラフで
ある。各濃度で３つの異なるサンプルを別々に測定し
た。異なる印は平均値を示し、黒線は測定の標準偏差の
半分を示す。
【図７】 ＢＣ２６６で安定にトランスフェクトされた
ＥＲ／ＥＢ２−５細胞におけるｃ−ｍｙｃ条件的発現
（Ｐ４９３−６）を示すグラフである。Ａ）ウェスタン
ブロット分析：Ｔｃ有り（＋）及び無し（−）で４８時
間処理した後のＰ４９３−６細胞抽出液Ｍｙｃ及びＥＢ
ＮＡ１タンパク質の検出。Ｂ）細胞サイクル分布：Ｔｃ
でのＰ４９３−６細胞の４８時間の処理後には、大多数
の細胞がＧ１段階にあった。
ＥＲ／ＥＢ２−５細胞におけるｃ−ｍｙｃ条件的発現
（Ｐ４９３−６）を示すグラフである。Ａ）ウェスタン
ブロット分析：Ｔｃ有り（＋）及び無し（−）で４８時
間処理した後のＰ４９３−６細胞抽出液Ｍｙｃ及びＥＢ
ＮＡ１タンパク質の検出。Ｂ）細胞サイクル分布：Ｔｃ
でのＰ４９３−６細胞の４８時間の処理後には、大多数
の細胞がＧ１段階にあった。
【図８】 ＢＣ３９２で安定にトランスフェクトしたＥ
Ｒ／ＥＢ２−５細胞における条件的ＢＸＢ発現を示す図
である（ＢＣ４１５−１及び−２）。ウェスタンブロッ
ト分析：Ｔｃ有り（＋）またはＴｃ無し（−）で２４ま
たは４８時間、あるいは、エストロゲン有り（＋）また
はエストロゲン無し（−）で４、２４、４８、及び７２
時間、各々処理したＢＣ４１５−１細胞またはＢＣ４１
５−２細胞各々の、抽出液中でのＢＸＢタンパク質の検
出。Ｒａｆ変異体、ＢＸＢは、細胞によって産生された
内因性Ｒａｆ−１より小さかった。非トランスフェクト
出発細胞（ＥＲ／ＥＢ２−５）では、Ｒａｆ−１に対す
るモノクローナル抗体によてＲａｆ−１タンパク質のみ
が検出される。ＢＣ４１５−１及び−２では、追加的タ
ンパク質が染色され、そのサイズは変異体ＢＸＢに相当
する。細胞培養媒質にＴｃを添加することにより、この
タンパク質の発現は４８時間後に完全に消滅した。これ
らの細胞における増殖停止を導くエストロゲンの涸渇は
（Kempkes等, 1995）、ＢＸＢ発現にも内因性Ｒａｆ−
１の発現にも影響しない。
Ｒ／ＥＢ２−５細胞における条件的ＢＸＢ発現を示す図
である（ＢＣ４１５−１及び−２）。ウェスタンブロッ
ト分析：Ｔｃ有り（＋）またはＴｃ無し（−）で２４ま
たは４８時間、あるいは、エストロゲン有り（＋）また
はエストロゲン無し（−）で４、２４、４８、及び７２
時間、各々処理したＢＣ４１５−１細胞またはＢＣ４１
５−２細胞各々の、抽出液中でのＢＸＢタンパク質の検
出。Ｒａｆ変異体、ＢＸＢは、細胞によって産生された
内因性Ｒａｆ−１より小さかった。非トランスフェクト
出発細胞（ＥＲ／ＥＢ２−５）では、Ｒａｆ−１に対す
るモノクローナル抗体によてＲａｆ−１タンパク質のみ
が検出される。ＢＣ４１５−１及び−２では、追加的タ
ンパク質が染色され、そのサイズは変異体ＢＸＢに相当
する。細胞培養媒質にＴｃを添加することにより、この
タンパク質の発現は４８時間後に完全に消滅した。これ
らの細胞における増殖停止を導くエストロゲンの涸渇は
（Kempkes等, 1995）、ＢＸＢ発現にも内因性Ｒａｆ−
１の発現にも影響しない。
【図９】 ドキシサイクリン(Doxycicline)（ＤＣ）での
処理の前後におけるＭＳ２ａによって安定にトランスフ
ェクトされたＲａｊｉ細胞の異なるサブライン（ＢＣ３
８９−２から−１０）におけるルシフェラーゼ活性を示
すグラフである。
処理の前後におけるＭＳ２ａによって安定にトランスフ
ェクトされたＲａｊｉ細胞の異なるサブライン（ＢＣ３
８９−２から−１０）におけるルシフェラーゼ活性を示
すグラフである。
【図１０】 ＢＣ８９の構造を示す図である。
【図１１】 ＰＵＨＤ１５−１の構造を示す図である。
【図１２】 ＰＵＨＤ１５−２０の構造を示す図であ
る。
る。
【図１３】 ＰＨＥＢＯＰＬの構造を示す図である。
【図１４】 ＢＣ９０の構造を示す図である。
【図１５】 ＰＵＨＣ１３−３の構造を示す図である。
【図１６】 Ｇａ３８−１４の構造を示す図である。
【図１７】 ＢＣ２５０の構造を示す図である。
【図１８】 ＢＣ３１５Ａの構造を示す図である。
【図１９】 ＢＣ３１１の構造を示す図である。
【図２０】 ＣＲ２７６の構造を示す図である。
【図２１】 ｔｅｔｒｕｎｉｖＡの構造を示す図であ
る。
る。
【図２２】 ＢＣ２５２の構造を示す図である。
【図２３】 ＢＣ２５３Ａの構造を示す図である。
【図２４】 ＢＣ２６６Ａの構造を示す図である。
【図２５】 ＢＣＢＣ２５２ｒｅｖの構造を示す図であ
る。
る。
【図２６】 ＰＵＨＤ１７２−１の構造を示す図であ
る。
る。
【図２７】 ＢＣ３６４の構造を示す図である。
【図２８】 ＢＣ３９２の構造を示す図である。
【図２９】 ＣＲ２７６ｒｉの構造を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 バーバラ・クリストフ ドイツ・Ｄ−80798・ミュンヘン・61ア ー・ルイゼンシュトラーセ（番地なし) (72)発明者 ベッティーナ・ケンプス アメリカ合衆国・マサチューセッツ・ 02167・チェストナット・ヒル・ゲリー・ ロード・168
Claims (33)
- 【請求項１】 真核細胞中での遺伝子の条件的発現のた
めの非組込みかつ真核細胞中でエピソーム的に複製する
ベクターであって、 １つのＤＮＡ分子または少なくとも２つの離れたＤＮＡ
分子に操作可能に結合した、テトラサイクリンまたはそ
の誘導体または類似体によって調節されうるトランスア
クチベーター（ｔＴＡ）をコードする少なくとも１つの
ポリヌクレオチド配列を含み、このｔＴＡは、真核細胞
中でのトランスクリプションを直接的または間接的に活
性化するペプチドに操作可能に結合した原核細胞ｔｅｔ
レセプター、ｔＴＡに結合可能なｔｅｔオペレーター配
列（ｔｅｔＯ）を含むｔＴＡ−応答性プロモーター、少
なくとも１つの目的とする遺伝子（ＧＯＩ）をコードす
るポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化部位（ＰＡ
Ａ）、少なくとも１つの選択マーカーのポリヌクレオチ
ド配列、及び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピ
ソーム的な複製を生起するポリヌクレオチド配列を含む
ベクター。 - 【請求項２】 前記ベクターが２つのエピソーム的複製
ベクターＩ及びＩＩからなり、（ａ）ベクターＩは、ｔ
ＴＡ、少なくとも１つの選択マーカーのポリヌクレオチ
ド配列、及び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピ
ソーム的な複製を生起するポリヌクレオチド配列を含
み、かつ、（ｂ）ベクターＩＩは、ｔＴＡ、ＧＯＩ、少
なくとも１つの選択マーカーのポリヌクレオチド配列、
及び、少なくとも真核細胞中でベクターのエピソーム的
な複製を生起するポリヌクレオチド配列に応答するプロ
モーターを含むことを特徴とする請求項１記載のベクタ
ー。 - 【請求項３】 前記ｔＴＡのｔｅｔリプレッサーが、Ｔ
ｎ１０−誘導ｔｅｔリプレッサーであることを特徴とす
る請求項１または２記載のベクター。 - 【請求項４】 前記真核細胞におけるトランスクリプシ
ョンを直接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリペ
プチドが、単純ヘペスウィルスビリオンタンパク質１６
から誘導されることを特徴とする請求項１記載のベクタ
ー。 - 【請求項５】 前記真核細胞におけるトランスクリプシ
ョンを直接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリペ
プチドが、酸性、プロリン−リッチ、セリン／トレオニ
ン−リッチ、及びグルタミン−リッチのトランスクリプ
ション活性化ポリペプチドからなる群の少なくとも１つ
の成分から選択されることを特徴とする請求項１記載の
ベクター。 - 【請求項６】 前記真核細胞中におけるトランスクリプ
ションを直接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリ
ペプチドが、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス・
ループ・ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメイ
ンからなる群の少なくとも１つの成分から選択される相
互作用ドメインであることを特徴とする請求項１記載の
ベクター。 - 【請求項７】 前記真核細胞中におけるトランスクリプ
ションを直接的または間接的に活性化するｔＴＡのポリ
ペプチドが、ＴＡＴＡ結合タンパク質の相互作用ドメイ
ンであることを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項８】 前記ｔＴＡをコードするポリヌクレオチ
ド配列が、構造的に活性なプロモーター、好ましくは、
ＣＭＶ、ｔｋ、及びｃ−ｍｙｃプロモーターからなる群
の１つの成分から選択されるプロモーターの制御下にあ
るか、または、ｔＴＡ応答性プロモーターの制御下にあ
ることを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項９】 目的遺伝子が、ヒト、ウイルス、または
細菌タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴と
する請求項１記載のベクター。 - 【請求項１０】 目的遺伝子が、トランスクリプション
因子、がん遺伝子、シグナル伝達分子、酵素、サイトカ
イン、細胞接着タンパク質、腫瘍抗原、共刺激シグナル
分子、及び、受容者のものとは異なるＨＬＡからなる群
の少なくとも１つの成分から選択されるポリペプチドを
コードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載
のベクター。 - 【請求項１１】 前記サイトカインが、インターロイキ
ン、インターフェロン、コロニー−刺激因子、リンホカ
イン、及び成長因子からなる群の少なくとも１つの成分
から選択されることを特徴とする請求項１０記載のベク
ター。 - 【請求項１２】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターが最
小プロモーターを含むことを特徴とする請求項１記載の
ベクター。 - 【請求項１３】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターが少
なくともＥＢＶのＴＰプロモーター、ＣＭＶ、ｔｋ、ま
たはｃ−ｍｙｃプロモーターを含むことを特徴とする請
求項１記載のベクター。 - 【請求項１４】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターがＥ
ＢＶのＴＰプロモーターを含み、ｔｅｔオペレーター配
列（ｔｅｔＯ）がＥＢＮＡ２−応答性成分で置換または
追加されていることを特徴とする請求項１記載のベクタ
ー。 - 【請求項１５】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターがｔ
ｅｔＯに操作可能に結合した最小プロモーターであるこ
とを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項１６】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターがＣ
ＭＶまたはｔｋ最小プロモーターまたはＥＢＶのＴＰ最
小プロモーターであり、各々がｔｅｔＯに操作可能に結
合したことを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項１７】 前記ｔＴＡ−応答性プロモーターがｔ
ｅｔＯに操作可能に結合したｃ−ｍｙｃＰ１プロモータ
ーである請求項１記載のベクター。 - 【請求項１８】 前記ｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔ
Ｏ）が、複数のコピー数、好ましくは７のコピー数で存
在することを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項１９】 選択マーカーをコードする前記ポリヌ
クレオチド配列が、ｔｋ遺伝子またはネオマイシン耐性
遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子であることを
特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項２０】 少なくとも真核細胞中でベクターのエ
ピソーム的複製を生起する前記ポリヌクレオチド配列
が、ＥＢＶ（ｏｒｉＰ）またはＢＰＶの複製起源（ｏｒ
ｉ）を含むことを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項２１】 少なくとも真核細胞中でベクターのエ
ピソーム的複製を生起する前記ポリヌクレオチド配列
が、ＥＢＮＡ１をコードするポリヌクレオチド配列であ
ることを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項２２】 前記ベクターが、ＥＢＶの溶菌起源の
配列、及びパッケージング配列として機能する末端繰り
返し構造を含むことを特徴とする請求項１記載のベクタ
ー。 - 【請求項２３】 前記ベクターが、その細菌内での複製
を可能にする配列を含むことを特徴とする請求項１記載
のベクター。 - 【請求項２４】 ｔＴＡ応答性プロモーターの前記ｔｅ
ｔＯが、ｔｅｔリプレッサーの結合によって、ポジティ
ブまたはネガティブな方法で制御可能であるこおとを特
徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項２５】 請求項１記載のベクターによって感染
またはトランスフェクトされた真核細胞または原核細
胞。 - 【請求項２６】 請求項１記載のベクターによって感染
またはトランスフェクトされ、ＥＢＶ陽性であってもよ
いＢ細胞。 - 【請求項２７】 請求項１記載のベクターによって感染
またはトランスフェクトされ、ＥＢＶ陽性であるＢ細
胞。 - 【請求項２８】 請求項１記載のベクターの治療または
診断薬としての使用。 - 【請求項２９】 請求項１記載のベクターでトランスフ
ェクトまたは感染された細胞の治療薬としての使用。 - 【請求項３０】 １またはそれ以上の目的とする遺伝子
条件的発現の方法であって、（ａ）請求項１記載のベク
ターを真核細胞に、安定または一過性形態でトランスフ
ェクトし、（ｂ）細胞を、所望の目的遺伝子の発現を可
能にするのに十分な濃度のテトラサイクリンまたはその
誘導体または類似体で処理し、（ｃ）任意に、細胞から
産生されたタンパク質を単離する段階からなる方法。 - 【請求項３１】 １またはそれ以上の目的とする遺伝子
の条件的発現の方法であって、（ａ）請求項２２または
２３記載のベクターをＥＢＶ−陽性細胞にトランスフェ
クトし、（ｂ）溶菌サイクルを誘発し、（ｃ）上澄みを
取り、（ｄ）任意に上澄みを濃縮し、（ｅ）ＥＢＶ−レ
セプター含有細胞を感染させ、（ｆ）細胞を、所望の目
的遺伝子の発現を可能にするのに十分な濃度のテトラサ
イクリンまたはその誘導体または類似体で処理し、
（ｇ）任意に、細胞から産生されたタンパク質を単離す
る段階からなる方法。 - 【請求項３２】 前記細胞として、Ｂ細胞から誘導され
たＢ細胞または腫瘍細胞であることを特徴とする請求項
３１記載の方法。 - 【請求項３３】 請求項１記載のベクターを１または複
数含有するＥＢＶウィルス粒子。
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