JPH0999A - イネ科植物およびイネ科植物への共生菌の導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ［目的］ 形質が改善されたイネ科植物を提供すること
を目的とする。 ［構成］ 耐虫性インドールアルカロイドを生産する共
生菌から成るエンドファイトをイネ科植物に人工接種し
て人為的に導入し、接種したエンドファイトをイネ科植
物に共生させて感染させるようにしたものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は共生菌を人為的に導入し
て成るイネ科植物、およびイネ科植物への共生菌の導入
方法に関する。なおここで共生菌は糸状菌から成るもの
であって、以降エンドファイトと称する。

【０００２】

【従来の技術】イネ科植物について、従来から行なわれ
ている育種、栽培方法としては、人工交配法、選抜法、
突然変異法、細胞融合法、遺伝子導入法等が存在する。
近年のバイオテクノロジーの進展によって、これまで１
０年以上要した育種期間は数年に短縮されてきている。
とくに形質転換技術である遺伝子導入法は、アグロバク
テリウムによる方法、エレクトロポレーション法、パー
ティクルガン法等が存在し、多くの作物への応用が実施
されている。

【０００３】しかし主要穀物が含まれるイネ科において
は、上記の遺伝子導入法は効率が非常に低いことが指摘
されている。アグロバクテリウム法では、イネ科植物へ
のアグロバクテリウムの感染が困難なために、遺伝子導
入が非常に難しい。またエレクトロポレーション法で
は、イネ科植物のプロトプラストからの再生系の開発が
必須であり、再生が可能であったとしても、培養変異等
によって、本来の植物の形質を損うことが知られてい
る。

【０００４】またパーティクルガン法は、遺伝子をラン
ダムに植物体または培養物に導入するために、与えられ
た植物がキメラになる場合が多いことが知られている。

【０００５】イネ科植物において、細胞融合や遺伝子導
入を含む細胞育種法は、煩雑な操作を必要とし、その効
率も低いために、実用レベルでの開発に成功した例は非
常に少ない。

【０００６】ところで自然界に存在する野生の植物の中
には、内部共生菌である糸状菌、すなわちエンドファイ
トが共生している植物が存在する。植物体の組織中に、
とくに細胞間隙と呼ばれる細胞と細胞との間の間隙で生
育している。

【０００７】このようなエンドファイトは共生する糸状
菌であって、宿主の植物に対して悪影響を及ぼさないば
かりか、宿主植物に対して有用な物質を提供し、環境ス
トレスに対して抵抗性を有する植物を提供するこに貢献
している。

【０００８】すなわちエンドファイトは共生している植
物の耐虫性（Ｓｉｅｇｅｌら、１９８７ Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、２５：２９３−３１
５）、耐病性（Ｇｗｉｎｎ ａｎｄ Ｇａｖｉｎ、１９
９２ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７６：９１１−９
１４）、環境ストレス（乾燥等）耐性（Ａｒａｃｈｅｖ
ａｌｔａら、１９８９ Ａｇｒｏｎ． Ｊ． ８１：８
３−９０）、生長促進（Ｌａｔｃｈら、１９８５ Ｎ．
Ｚ．Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｒｅｓ． ２８：１６５−１
６８）等を向上させることが公知となっている。とくに
エンドファイトが感染したペレニアルライグラスにおい
ては、このエンドファイトが生産する忌避物質やアルカ
ロイドによって耐虫性が向上することが知られている。

【０００９】またニュージーランドのライチ（Ｌａｔｃ
ｈ）らは、ペレニアルライグラスのエンドファイトを収
集調査し、家畜に対して毒性が少なく耐虫性に優れたエ
ンドセーフと呼ばれているエンドファイトの探索を試み
ている。

【００１０】しかしこのようなエンドファイトが共生し
ている多くの植物は、有用性に乏しい野生植物であっ
て、エンドファイトの有効性を有用なイネ科植物に導入
する必要性が生じている。そこで主要牧草であるペレニ
アルライグラスへのエンドファイトの導入がこれまで試
みられてきた。その技術は人工交配法と人工接種法とに
大別される。

【００１１】人工交配法は、エンドファイトに感染して
いる植物を母親として有用形質を花粉によって導入する
方法であるが、従来の方法においては交配の可能な種
間、品質間の導入に限定されている。また人工接種法で
は、植物体や培養組織に分離培養したエンドファイトを
接種感染させる方法である。

【００１２】人工接種法は、人工交配法と比較すると、
導入の範囲が拡大されるが、しかしエンドファイトの栽
培法、接種時の条件、植物体の条件等の手法的な問題か
ら、ペレニアルライグラスに限定されていた。また感染
効率を向上させるために接種する植物体側の組織にカル
スを利用する方法が報告されている。この手法によれ
ば、カルスからの植物体の再生系の開発が要求されるた
めに、やはりペレニアルライグラスへの導入例に止まっ
ている。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】従来の細胞育種法にお
いては、煩雑な操作と熟練とを要する一方、形質転換や
細胞融合によれば、培養変異等の理由によって、導入形
質または導入形質以外の形質に影響を及ぼすために、実
用化が困難であった。

【００１４】また遺伝子導入法において、遺伝子導入に
際し、植物の形質や形態に及ぼす遺伝子が解明されてい
ない場合には、それらの形質を導入することが不可能で
あった。

【００１５】とくに環境ストレス等の複雑な要因に関連
する形質は、遺伝子導入法等の手法では、導入すること
ができなかった。また細胞育種法等によって作出された
植物は、多くの場合に種子稔性の低下が認められてい
る。これはイネ科植物において、種子稔性の低下が収量
の低下を招くために致命的な欠陥になる。

【００１６】このような現状に鑑みて、エンドファイト
を利用した育種法、あるいは形質の改善は、上記の問題
を解決するための全く新しい手法である。

【００１７】エンドファイトの植物への導入において、
人工交配による方法では、宿主の植物が交配可能な範囲
に限定され、一般的には種内の導入に止まざるを得な
い。またエンドファイト側の親（母親）の不要な形質が
後代に導入されるために、必ずしも有用な植物になると
は限らない。

【００１８】また人工接種法においては、エンドファイ
トの探索、培養系の検討等から、ペレニアルライグラス
に限定されており、他の有用なイネ科植物への応用が全
くなされていない。さらにカルス接種法においては、導
入植物の再生系の開発が不可欠である。また接種時にお
いても、エンドファイトの感染効率を向上させる接種条
件が開発されていない。

【００１９】エンドファイトの種類において、現在有用
なエンドファイトは、ペレニアルライグラス、トールフ
ェスク、メドウフェスクからしか探索されておらず、導
入の大きな障害となっている。とくにこれらのエンドフ
ァイトは外来の種であり、日本に在来の植物から、日本
の環境に適応したエンドファイトはこれまで発見されて
いない。

【００２０】

【発明の目的】本発明はエンドファイトに感染していな
いイネ科植物にエンドファイト、とくに耐虫性インドー
ルアルカロイドを生産するエンドファイトを人為的に導
入して成るイネ科植物、および該エンドファイトを人工
的にイネ科植物に導入する方法を提供することを目的と
する。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明は、糸状菌から成
る共生菌、すなわちエンドファイトに感染しておらず、
あるいはまた感染されたエンドファイトが除去された植
物にエンドファイトを人為的に導入して成るイネ科植物
に関するものである。ここでイネ科植物に人為的に導入
されるエンドファイトは耐虫性インドールアルカロイド
を生産する共生菌である。なお耐虫性とともに、耐病
性、乾燥等の環境ストレス耐性、生長促進性等の性質を
有するエンドファイトであることを妨げない。

【００２２】このようなエンドファイトは、自然界に生
育する植物中に共生するエンドファイトを探索して発見
するとともに、少なくとも耐虫性の検定を行ない、検定
によって耐虫性が確認されたものを人為的に導入する。
エンドファイトが存在する植物は、自然界に、カヤツリ
グサ科、イグサ科等に存在することが知られている。

【００２３】発明者らによって探索培養されたエンドフ
ァイトであって、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ
−００１、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００
４、またはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００２
（生工研寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９８、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４７９９、およびＦＥＲＭ Ｐ−１４８００）は
何れも耐虫性インドールアルカロイドを生産する共生菌
であって、イネ科植物に導入して共生させることができ
るエンドファイトである。

【００２４】またこのようなエンドファイトが導入され
る植物として、イネ科植物であってしかも有用な植物で
ある次のような植物であってよい。すなわち、Ａｇｒｏ
ｐｙｒｏｎ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏ
ｎ、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅ
ｒｕｍ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ、Ｂｒ
ｏｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔ
ｙｌｉｓ、Ｅｌｙｍｕｓ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｇｌ
ｙｃｅｒｉａ、Ｈｉｅｒｏｃｈｌｏｅ、Ｈｏｒｄｅｕ
ｍ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｓｐａｌｕｍ、
Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｔａｒ
ｉａ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ｚ
ｏｙｓｉａの何れかの属の植物であってよい。すなわち
本発明に係るイネ科植物はこのような属に属するイネ科
の植物であって、エンドファイトが人為的に導入された
イネ科植物に関するものである。ここではその後代も含
まれるものである。

【００２５】このようなエンドファイトが人為的に導入
されるイネ科植物に既にエンドファイトが共生している
場合には、そのエンドファイトを除去するとともに、そ
の後に上記の耐虫性インドールアルカロイドを生産する
エンドファイト導入させることになる。

【００２６】次にイネ科植物への共生菌、すなわちエン
ドファイトの導入方法について説明すると、この方法は
自然界等に存在する植物に共生しているエンドファイト
を分離して人工増殖を行ない、人工増殖されたエンドフ
ァイトをイネ科植物に人工接種する。そして接種された
エンドファイトをイネ科植物に共生させて感染させるこ
とによりイネ科植物へのエンドファイトの導入が行なわ
れる。

【００２７】ここでエンドファイトを人工接種する工程
において、とくにエンドファイトの分生子を用いるよう
にしてよい。また生工研に寄託されている上記のエンド
ファイトの何れかを人工接種するようにしてよい。また
イネ科植物に対するエンドファイトの導入は、必ずしも
１種類のエンドファイトである必要はなく、２種類以上
のエンドファイトを導入してもよい。

【００２８】このようなエンドファイトの導入方法をさ
らに詳細に説明する。

【００２９】段階１ エンドファイトの存在の有無と
分離工程 （１）エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブリー染色液にて染色し、組織内のエ
ンドファイトを光学顕微鏡下にて検出し、エンドファイ
トの存在の有無を確認する。

【００３０】（２）エンドファイトの分離・培養工程 エンドファイトが確認された植物片を滅菌処理後、エン
ドファイト分離培地へ置床し、数ケ月間培養を行なう。

【００３１】（３）エンドファイトの分離工程 分離されたエンドファイトを宿主によって分類する。あ
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な部分で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な部分で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な部分で分類する。またＰ
ＣＲ法を用いて、ＤＮＡレベルでの分類を行なう。

【００３２】段階２ アルカロイドの分析工程 菌単体もしくは植物体との共生下において、エンドファ
イトから生産されるアルカロイドを分析し、とくに耐虫
性の確認を行なう。なおこのときに併せて耐病性、環境
ストレス耐性、生長促進性等についての分析を行なうこ
とを妨げない。

【００３３】段階３ エンドファイトの導入工程 分離したエンドファイトを目的あるいは対象とするイネ
科植物へ人工的に導入する。導入に当って対象となる植
物に既にエンドファイトが存在する場合には、除去処理
を予め行なう。エンドファイトの導入方法は、植物体に
直接接種する方法と、植物体を１度カルス等の未分化の
細胞にした後に接種し、カルスから植物体を再生させる
方法がある。これらはエンドファイトの導入の対象とな
る植物の種類に応じて任意に選択されてよい。

【００３４】段階４ 導入確認工程 エンドファイトを導入した個体は、外植片を染色液で染
色し、光学顕微鏡下において顕境し、さらに酵素免疫測
定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有無
を検出する。

【００３５】段階５ エンドファイトおよびエンドフ
ァイト導入植物の検定工程 （１）拮抗作用検定工程 ｉｎ Ｖｉｔｒｏで対象となる病原菌に対して平板培養
法にて対峙培養を行なう。

【００３６】（２）耐虫性検定工程 エンドファイトを導入して共生させた植物と、エンドフ
ァイトが存在しないかエンドファイトが除去された植物
等を用い、虫害の対象となる昆虫を飼育し、人工的に食
害試験を行なう。同時に自然発生による食害の調査をも
行なう。

【００３７】（３）耐病性検定工程 エンドファイトを導入した植物と、エンドファイトが存
在しないか除去された植物とを用い、病害の対象となる
病原菌を用い、２種類の植物に対して人為的に病原菌の
接種を行なって発病の程度により、病害抵抗性検定を行
なう。同時に自然発生による病害について調査を行な
う。

【００３８】（４）環境ストレス抵抗性検定工程 エンドファイトを導入した植物とエンドファイトが存在
しないかエンドファイトを除去した植物とを用い、人工
的に環境条件を変化させ、乾燥などの環境ストレスに対
する抵抗性を調査する。

【００３９】（５）線虫抵抗性検定工程 エンドファイトを導入した植物と、エンドファイトが存
在しないかエンドファイトを除去した植物を用い、線虫
による被害の程度を調査する。

【００４０】（６）生育量調査工程 エンドファイトを導入した植物とエンドファイトが存在
しないかエンドファイトを除去した植物を用い、同一環
境条件下での生育量の差を測定する。

【００４１】（７）後代を用いた検定工程 エンドファイトが存在する種子を採集し、発芽させ、エ
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。

【００４２】

【実施例】

（１）エンドファイトの検出 野生イネ科植物であって自生するＡｇｒｏｓｔｉｓ属、
Ｐｏａ属、Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅの種子を播
種し、発芽１２０日以上経過した植物体から次の方法で
エンドファイトの検出を行なった。

【００４３】上記のそれぞれの植物の葉および葉鞘部分
の表皮を剥ぎ、光学顕微鏡下において組織内のエンドフ
ァイトの有無の確認を行なった。この確認はスライドガ
ラスに、乳酸５ｍｌ、グリセリン１０ｍｌ、水５ｍｌ、
アニリンブルー水溶液０．０２ｇの染色液を数滴滴下す
る。そして葉鞘部分を剥がし、裏面表皮をピンセットで
葉脈方向に向って剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガ
ラスの上に置き、カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎
で沸騰させ、光学顕微鏡下において組織を観察した。こ
の条件でエンドファイトが存在すれば菌糸が青色に呈色
するために、これによってエンドファイトの検出が行な
われる。

【００４４】図１に示す写真はＡｇｒｏｓｔｉｓ属に共
生するエンドファイトであって後述するＡｃｒｅｍｏｎ
ｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００４（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４７９９）を光学顕微鏡によって拡大して観察した写
真である。

【００４５】（２）エンドファイトの分離 上記の（１）項でエンドファイトが確認されたＡｇｒｏ
ｓｔｉｓ属、Ｐｏａ属、Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓ
ｅの植物体から以下の方法でエンドファイトの分離を行
なった。

【００４６】植物体からのエンドファイトの分離は、葉
および葉鞘部分を水洗後、７０％エタノール水溶液に１
０秒間浸漬し、次に２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶
液に１０分間浸漬した後、滅菌水で３回洗浄し、エンド
ファイト分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養を
行なった。

【００４７】分離培地は、ｐＨ５．６に調整したＰＤＡ
（ポテト デキストロース アガー）培地を１２１℃、
１５分で滅菌後、さらに必要であれば１００ｍｇ／ｌの
カナマイシン硫酸塩を添加し、直径９ｃｍのプラスチッ
クシャーレに２０ｍｌずつ分注して使用した。

【００４８】置床後約３〜８週間後に外植片から菌糸が
分離され、形成されたコロニーを直径が５ｍｍのコルク
ボーラにて取出し、同ＰＤＡ培地に移植して増殖を行な
った。

【００４９】（３）平板培養法による菌叢でのエンドフ
ァイトの分類同定 ＰＤＡ培地へ移植した菌糸は、２５℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、Ａ
ｇｒｏｓｔｉｓ属より分離したエンドファイトは形成さ
れた菌叢から３種類のタイプに分類された。すなわち表
面が白色でわた状のコロニーがドーム状に隆起していく
タイプ（００１）、中央が褐色の粘土状で、外周が白色
でわた状のコロニーで培地中に淡白色の物質を拡散しな
がら増殖し、３種類の中でも増殖が非常に遅いタイプ
（００２）、さらに前者の中で白色・わた状のコロニー
が初めややドーム状に隆起した後、偏平に広がっていく
タイプ（００４）の３種類であった。

【００５０】これらの内ＰＣＲを用いたＤＮＡの分析結
果から、００１と００４は同一のものと判断し、Ａｇｒ
ｏｓｔｉｓ属からは２種類のエンドファイトが分離され
た。

【００５１】Ｐｏａ属からは１種類のエンドファイトが
分離された。培地上での菌叢は、わた状で黄白色のコロ
ニーを形成していた。

【００５２】Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅからは１
種類のエンドファイトＥｐｉｃｈｌｏё ｔｙｐｈｉｎ
ａ（以下Ｅ．ｔｙｐｈｉｎａという）が分離された。菌
叢は表面が白色で、菌糸は一部束になり、中央からＳ字
を描くように増殖し、分離されたエンドファイトの中で
最も増殖が良好であった。

【００５３】これらの内Ａｇｒｏｓｔｉｓ属より分離し
た００２、００４、Ｐｏａ属より分離したエンドファイ
トを工業技術院生命工学工業技術研究所へ寄託を行なっ
た。菌の表示および受託番号は以下に示す通りである。

【００５４】Ａｇｒｏｓｔｉｓ属より分離したエンドフ
ァイト００２ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−０
０２ ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００ Ａｇｒｏｓｔｉｓ属より分離したエンドファイト００４
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００４ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７９９ Ｐｏａ属より分離したエンドファイト Ａｃｒｅｍｏｎ
ｉｕｍ ｓｐ．Ｐｏ−００１ ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９
８ （４）温度による増殖の差 寄託を行なった上記のエンドファイトおよびＥ．ｔｙｐ
ｈｉｎａを２５℃の暗条件下のＰＤＡ培地で２ケ月間培
養後、コロニーを直径が５ｍｍのコルクボーラで取出
し、ＰＤＡ培地およびＣＭＡ（コーンミールアガー）培
地へ移植し、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、
および３０℃の温度条件下でそれぞれ２ケ月間培養し、
温度差による菌叢の変化を調査した。なお条件は総て暗
条件下において行なった。

【００５５】この結果、総てのエンドファイトは２５℃
で最も良好な増殖を示し、３０℃の高温下でも比較的良
好な増殖を示した。また５℃以下ではコロニーはほとん
ど形成されなかった。

【００５６】（５）液体増殖培養 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９
９、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００、Ｅ．ｔｙｐｈｉｎａを
２５℃暗条件下においてＰＤＡ培地で２ケ月間培養後、
コロニーを直径が５ｍｍのコルクボーラで取出し、３０
０ｍｌの振とうフラスコにＰＤ（ポテト デキストロー
ス ブロース）培地を１００ｍｌ入れ、１２１℃で１５
分間滅菌したものに各フラスコに１個ずつ入れ、２５℃
で１５０ｒ．ｐ．ｍ．の往復振とうを行なった。

【００５７】この結果総ての菌は１ケ月間でフラスコ一
杯に増殖した。さらにここから１ｍｌずつ取出し、フレ
ッシュなＰＤ培地へ継代し、同条件で培養したところ、
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００で培養４日目から分生子を形
成し、その形成量は５〜１０日でピークに達した。

【００５８】（６）スライドカルチャーによる菌糸の状
態 スライドガラス上に厚さが２〜３ｍｍのＰＤＡ培地を載
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成を調査した。なおこの培養は２５℃、暗条件下におい
て行なった。

【００５９】この結果ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９８、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４７９９、Ｅ．ｔｙｐｈｉｎａのエンドフ
ァイトの菌糸は皆ほぼ直線状に伸長し、しばしば束状集
塊を形成しながら増殖するのが確認された。図２に示す
写真はＰＤＡ培地上で増殖されたＦＥＲＭ Ｐ−１４７
９９の菌糸の顕微鏡写真である。これに対してＦＥＲＭ
Ｐ−１４８００のエンドファイトは、菌糸が激しく波
状にうねりながら伸長し、しばしば束状集塊を形成し、
さらにはそれらがＳ字状に描くように増殖するのが確認
された。

【００６０】菌糸は総て無色であって、幅が１〜２μｍ
で総てに隔壁が観察された。分生子は、総てのエンドフ
ァイトで容易に形成することが可能であった。

【００６１】分生子は菌糸の先端あるいは側面より直立
した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんどが
単生の分生子であった。図３に示す写真はＰＤＡ培地上
で形成されたＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９の菌糸の分生子
の顕微鏡写真である。

【００６２】分生子の色は総て無色で、細胞数も１細胞
性であった。分生子の形状は、Ｅ．ｔｙｐｈｉｎａでや
や楕円形のものが観察されたものの、ほとんどが腎臓形
の形状をなし、大きさは３〜８×１〜３μｍであった。
また形成されたフィアライドは総て円筒形で先端に行く
に従って細くなり、隔壁により菌糸から区切られてい
た。

【００６３】（７）熱処理によるエンドファイトの除去 エンドファイトが存在する種子から熱処理によってエン
ドファイトを除去する操作を次のようにして行なった。

【００６４】１ｍｌのエッペンドルフチューブに水１ｍ
ｌを注入し、ドライブロックにて５７℃に保温した。種
子をエッペンに１０粒ずつ入れ、５７℃で５分間処理を
行なった。そして処理後直ちに水に移して冷却した。

【００６５】次に必要であれば３５℃硫酸で３時間処理
した後、７０％エタノール水溶液に１０秒間浸漬し、次
に２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸漬
した後、滅菌水で３回洗浄して風乾した。

【００６６】（８）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によ
るエンドファイトの検出 種子や植物片から次のような方法によってエンドファイ
トの検出を行なった。

【００６７】植物の外植片の生重量０．５ｇに緩衝液を
入れ、乳鉢で磨砕し、抽出液を得た。５０μｌの抽出液
をマイクロプレートのウェルへ入れ、室温において３０
分間吸着させた。そして未結合の抗原を洗浄した。

【００６８】ウェル内をブロッキング液（３％脱脂粉乳
溶液）で満たし、３０分後に洗浄した。また抗エンドフ
ァイトのウサギ抗血清（１次抗体）をウェルに加え、室
温で６０分間反応させた。そして未結合の抗体を洗浄し
た。

【００６９】希釈した２次抗体（アルカリホスファター
ゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）をウェルに加え、
室温で６０分間反応した。未結合の抗体を洗浄した。こ
の後基質溶液にウェルを加え、アルカリホスファターゼ
反応を起させた。そして０．５ＮのＮａＯＨで反応を停
止し、４０５ｎｍで吸光度を測定した。この結果エンド
ファイトが存在する種子および植物体には呈色反応があ
ったが、エンドファイト存在しない種子および植物体か
らは反応が見られなかった。

【００７０】（９）植物体を用いた人工接種 分離したエンドファイトの内、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９
８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８
００を用いてサンプルとする種物へ人工接種を行なっ
た。なおエンドファイトが存在する植物の種子は予め
（７）項の方法によってエンドファイトを除去し、一部
を（８）項の検出方法で確認した後使用した。

【００７１】またここで用いられたサンプルの植物は次
の通りである。

【００７２】Ａｇｒｏｓｔｉｓ属 Ａｇｒｏｓｔｉｓ
ｓｐ．、Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ、Ａ．ｇｉｇａ
ｎｔｉａ、Ａ．ｔｅｎｕｉｓ Ｐｏａ属 Ｐｏａ ｓｐ．、Ｐ．ｐｒａｔｅｎｓｅ 上述のエンドファイトは（５）項の方法によって増殖し
た後フレッシュなＰＤ培地へ移植し、同条件下で５〜１
２日間培養したものを用いた。接種はＭＳ（Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅ−ｓｋｏｏｇ）培地に３．０％シュークロスと
０．７％ゲランガムを加えたＭＳ基本培地において発芽
させ、１〜２週間後に植物体もしくは長期培養している
ものはランナーおよび分げつ株をメスで切断し、（５）
項で液体培養した菌糸を１ｍｌ滴下した。

【００７３】これらを２５℃および３０℃の暗条件下で
数週間培養した後、１６時間照明下に移すかあるいは直
ちに１６時間照明下に移して培養し、緑色に生長してき
た個体を同組成の培地に移植して１ケ月間培養した。

【００７４】それらの個体に対して、（１）項と（８）
項の方法を用いてエンドファイトの導入を確認した結
果、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７
９９、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００は総て植物への導入が
確認された。

【００７５】また感染効率は２５℃よりも３０℃の方が
明らかに高かった。

【００７６】（１０）カルスを用いた人工接種 Ａｇｒｏｓｔｉｓ属の植物体のカルスの誘導を行なっ
た。材料としてＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．、Ａ．ｓｔｏ
ｌｏｎｉｆｅｒａを使用し、ＭＳ基本培地にＡｇｒｏｓ
ｔｉｓ ｓｐ．、Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａについて
は２．０ｍｇ／ｌのＰＩＣ（ピクロラム）と０．２ｍｇ
／ｌのＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）を添加し、
カルス誘導培地とした。

【００７７】ＭＳ培地において発芽直後の種子を各カル
ス誘導培地へ移植し、２５℃の暗条件下において２ケ月
間培養することにより、再分化能を有するカルスを得
た。なおＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．は（７）項の方法を
用いて予め感染しているエンドファイトの除去処理を行
なった種子を使用した。

【００７８】ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９、ＦＥＲＭ Ｐ
−１４８００を用いてＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．、Ａ．
ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａのカルスを利用した人工接種を
行なった。各カルスは上述の誘導培地で誘導したもので
あって、得られたカルスを植物ホルモン無添加のＭＳ基
本培地移植した。

【００７９】移植後直ちにカルスをメスで切傷し、
（５）項で増殖させた菌糸を１カルス当り５０μｌ滴下
した。またＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．についてはＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７９９とＦＥＲＭ Ｐ−１４８００の２種
類のエンドファイトの導入を行なった。

【００８０】カルスは２５℃および３０℃の暗条件下で
数週間培養した後に、１６時間照明下に移すかあるいは
直ちに１６時間照明下に移して培養し、再生してできた
個体をフレッシュなＭＳ培地に移植し、１ケ月間培養し
た。これらの（１）項と（８）項の方法を用いてエンド
ファイトの導入を確認した結果、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７
９９、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００の総てについて菌糸の
着色および呈色反応を示し、エンドファイトの導入が確
認された。

【００８１】また感染効率は２５℃より３０℃の方が高
く、明らかに有意な差であった。また（９）項の植物体
に直接導入する方法と比較しても、感染効率が高かっ
た。

【００８２】またＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９とＦＥＲＭ
Ｐ−１４８００の２種類のエンドファイトの導入を行
なって得られた個体の表面に付着したエンドファイトを
完全に除去し、（２）項の方法と同様の方法によって分
離を行なった結果、ＦＥＲＭＰ−１４７９９およびＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４８００の双方のエンドファイトが同一の
外植片から分離され、複数のエンドファイトの導入が可
能になっている。

【００８３】（１１）分生子の大量生産 液体培地で分生子の形成が確認されるＦＥＲＭ Ｐ−１
４８００を用い、分生子の大量生産を行なった。ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４８００を（５）項と同様の方法によって培
養し、フレッシュなＰＤ培地に移植し、分生子の形成能
がピークに達する５〜１０日後に培養液を２０ｍｌ取出
し、２０μｍのメッシュを２枚重ねしたもので不要な菌
糸を除去し、ろ液を１０ｍｌの遠沈管に入れて１０００
ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。遠心分離後の上
清みを捨てて１ｍｌのＰＤ培地を添加し、分生子懸濁液
を得た。

【００８４】（１２）分生子を用いた接種法 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００の分生子懸濁液を（１１）項
のカルス接種法を用いて、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．、
Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａに人工接種を行なった。得
られた個体を（１）項と（８）項の方法で検定した結
果、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．、Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆ
ｅｒａともに高頻度にエンドファイト導入個体が確認さ
れ、それは菌糸を用いた接触法である（１０）項の方法
と比較しても有意な差であった。

【００８５】（１３）対峙培養 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００
を用い、平板培養条件下において対峙培養を行なった。
対象となる病原菌には、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏ
ｌａｎｉ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉ
ｎｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒ
ｐａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．、Ｈｅｌｍｉｎｔ
ｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．を用いた。

【００８６】対峙培養の方法は、直系が９ｃｍの減菌シ
ャーレにＰＤＡ培地を入れ、シャーレ中央に直系が５ｍ
ｍのコルクボーラで抜いたエンドファイトコロニーを１
つ植付け、１ケ月間培養後にコロニー中央から半径３ｃ
ｍのところに同病原菌のコロニーを植付け、２５℃の暗
条件下で３週間培養した。

【００８７】この結果、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９およ
びＦＥＲＭ Ｐ−１４８００の何れについても、総ての
菌に対して一時的に菌の伸長を阻害し、中でもＦＥＲＭ
Ｐ−１４８００に関しては、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．に対し
て強い拮抗作用を示した。

【００８８】（１４）植物体からのアルカロイド分析 エンドファイトが存在する試料として、ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８００をＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．に導入した個体
ＭＩ−１４８００と、エンドファイトを除去したＡｇｒ
ｏｓｔｉｓ ｓｐ．の個体ＭＦとを用い、以下の方法で
アルカロイドの分析を行なった。

【００８９】上記のそれぞれの試料の植物の葉および葉
鞘部分を凍結乾燥後、１００ｍｇをサンプルとして乳鉢
に入れて磨砕し、メタノールとクロロホルムを各１．５
ｍｌずつ加えて混合し、遠沈管へ回収した。そして１８
℃で３０分間ゆっくり混合し、ｎ−ヘキサンと水を３ｍ
ｌずつ加え、３０分間撹拌した。２０００ｒ．ｐ．ｍ．
で１０分間遠心処理した後、有機層と水層と分取した。

【００９０】分取した水層部分は３ｍｌをＢｉｏＲａｄ
ＡＧ２×８とＡｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ Ｂｏｎｄ Ｅ
ｌｕｔ ＣＢＡ のカラムで精製し、濃縮後８０％メタ
ノールを１００μｌ添加し、メルクのシリカゲル６０を
使用した薄層プレートに各サンプルを２０μｌずつ滴下
し、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール：酢
酸：水を２０：１０：１：１の割合で混合したものを使
用し、展開した後にＴＬＣ（薄層クロマトグラフ）法に
より分析を行なった。

【００９１】有機層部分は１ｍｌのエッペンドルフチュ
ーブにサンプルを２００μｌで、遠心エバポレータにて
一度溶媒を完全に蒸散させた後に、クロロホルムを２０
０μｌ添加し、ペレットを溶解した。そして２％酒石酸
を１５０μｌ添加し、１０〜１５分間混合した。この後
に１００００ｒ．ｐ．ｍ．で３分間遠心し、４ＭのＮａ
ＯＨでｐＨをを９〜１０に調整した。そしてクロロホル
ムを２００μｌ添加し、１０〜１５分間混合した。そし
てこの後に１０００ｒ．ｐ．ｍ．で３分間遠心分離し
た。

【００９２】クロロホルム層を分取し、濃縮した後に薄
層プレートにはメルクのシリカゲル６０を使用し、各サ
ンプルを２０μｌずつ添加し、展開溶媒としてクロロホ
ルム：メタノールを９：１の割合で混合したものを使用
し、ＴＬＣ法によって分析を行なった。

【００９３】水層および有機層の抽出物は、展開後、Ｕ
Ｖで確認し、Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬（ｐ−ジメチルベンズ
アルデヒド１．０ｇを９６％エタノールに溶解したも
の）Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬を用い、呈色反応とＲ
ｆ値を測定した。

【００９４】この結果ＭＩ−１４８００の水層抽出物は
ＵＶ下でＲｆ０．４３に反応があり、Ｅｈｒｌｉｃｈ試
薬を用いた場合には青紫色のスポットが、Ｄｒａｇｅｎ
ｄｏｒｆｆ試薬を用いた場合には、オレンジ色のスポッ
トが同様の位置に確認され、試薬による呈色反応とＲｆ
値とからこれがインドールアルカロイドであることを確
認した。

【００９５】また有機層抽出物は、ＵＶ下でＲｆ０．３
０、０．３７、０．５２、０．５８の４つのスポットに
反応があり、Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬を用いた場合に、青紫
色のスポットが、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬を用いた
場合にオレンジ色のスポットが同様の位置に確認され、
試薬による呈色反応とＲｆ値とからこれらがインドール
アルカロイドであることを確認した。しかしエンドファ
イトの存在しないＭＦでは、Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬、Ｄｒ
ａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬を用いた場合に、水層、有機層
ともに呈色反応は見られず、これらのインドールアルカ
ロイドは、菌単体もしくは植物との共生下でのみ生産さ
れものであることが確認された。

【００９６】（１５）シバツトガに対する抵抗性検定 エンドファイトが存在する植物とエンドファイトが存在
しない植物を用い、シバツトガに対する抵抗性検定を行
なった。検定の試料として、エンドファイトが存在する
ものは、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８００をＡｇｒｏｓｔｉｓ
ｓｐ．に導入した個体ＭＩ−１４８００と、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４７９９をＡｇｒｏｓｔｉｓｓｐ．に導入した
個体ＭＩ−１４７９９と、実生するＡｇｒｏｓｔｉｓ
ｓｐ．より得た実生個体ＭＷと、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８
００をＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａに導
入した個体ＰＣＩ−１４８００と、ＦＥＲＭ Ｐ−１４
７９９をＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａに
導入した個体ＰＣＩ−１４７９９とを用いた。

【００９７】これに対してエンドファイトが存在しない
試料として、エンドファイトを除去したＡｇｒｏｓｔｉ
ｓ ｓｐ．の個体ＭＦと、同じくエンドファイトを除去
したＡｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａの実生
個体ＰＣとを用いた。

【００９８】材料の調整を以下の方法によって行なっ
た。ＭＷおよびＰＣは種子を７０％エタノール水溶液で
１０秒間浸漬し、次に２．５％次亜塩素酸ナトリウム水
溶液に１０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗浄し、風
乾してＭＳ基本培地に移植し、発芽後１ケ月間培養し
た。

【００９９】ＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００およ
びＰＣＩ−１４７９９、ＰＣＩ−１４８００は（１０）
項の方法を用いて作製したものを、ＭＳ基本培地に移植
して１ケ月間培養した。

【０１００】ＭＦは（７）項の方法によってエンドファ
イトを除去した後に、種子を７０％エタノール水溶液に
１０秒間浸漬し、次に２．５％次亜塩素酸ナトリウム水
溶液に１０分間浸漬した後に滅菌水で３回洗浄し、風乾
してＭＳ基本培地に移植し、発芽後１ケ月間培養したも
のを用いた。なお材料は総て（１）項および（８）項に
より検定したものを用いている。

【０１０１】これらの材料を６×６×１０ｃｍのプラン
トボックスに培養土２０ｇと水５ｍｌとを添加し、滅菌
後の材料を１０個体ずつ植込み、２５℃で１６時間日長
条件下で１週間培養したものを材料２とした。

【０１０２】シバツトガの卵を７０％エタノールに１０
秒間浸漬し、滅菌水で３回洗浄し、風乾させたものを材
料２の各プラントボックスに約２００粒ずつ播いた。

【０１０３】この結果卵は１週間でふ化し、食害が始ま
った。シバツトガの幼虫は初めに材料２の総てを食害し
たが、エンドファイトが存在するＭＩ−１４７９９、Ｍ
Ｉ−１４８００、ＰＣＩ−１４７９９、ＰＣＩ−１４８
００およびＭＷは食害が止まり、ＭＦおよびＰＣが３〜
４日で完全に食害されたのに対し、ＭＩ−１４７９９、
ＭＩ−１４８００，ＰＣＩ−１４７９９、ＰＣＩ−１４
８００およびＭＦは総て初期の食害だけであった。また
ＭＷとＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００は同様の効
果であった。

【０１０４】（１６）スジギリヨトウに対する抵抗性検
定 スジギリヨトウの幼虫を各プラントボックスに２匹ずつ
入れ、（１５）項と同様の方法で調整した材料を用い、
食害に対して調査を行なった。

【０１０５】この結果、幼虫は直ちに食害を始め、１／
３程度まで食害が進んだ時点でエンドファイトが存在す
るＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣＩ−１４
７９９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは食害が止ま
り、ＭＦおよびＰＣが２日で完全に食害されたのに対
し、ＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣＩ−１
４７９９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは１／３程度
の食害だけであった。

【０１０６】（１７）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌ
ａｎｉに対する抵抗性検定 ＰＤＡ培地上で２週間培養したＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉの菌叢から５ｍｍ角のコロニーを切出し
（１５）項と同様の材料を用い、各プラントボックス当
り５片ずつ土中へ埋込み、２８℃で１６時間日長条件で
１ケ月間培養した。

【０１０７】この結果、エンドファイトの含有しないＰ
ＣおよびＭＦは接種１週間目から葉腐れが始まり、３週
間で植物体は完全に枯死したのに対し、エンドファイト
を含有するＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣ
Ｉ−１４７９９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは葉枯
れが始まるのが２週間後と遅く、葉の表面に菌糸がクモ
の巣状に存在するのが観察されるものの、病害の進行も
遅く、植物体が完全に枯死することはなく、明らかに有
意な差で抵抗性を示した。

【０１０８】（１８）Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．に
対する抵抗性検定 ＰＤＡ培地上で１ケ月間培養したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｓｐ．の菌叢から表面に形成された分生子をニードル
でかき取り、滅菌液に懸濁し、５０００〜１００００個
／ｍｌに濃度を調整し、（１５）項と同様の材料を用
い、植物体の表面全体に噴霧あるいは塗布し、２８℃で
１６時間日長条件下で１ケ月間培養した。

【０１０９】この結果総ての植物体で培養４日目から葉
先の枯れが見られ始めた。ＰＣ、ＭＦでは葉全体の３／
４程度葉枯れが進行したのに対し、エンドファイトを含
有するＭＩ−１４７９９およびＰＣＩ−１４７９９では
１／３程度で病徴は停止し、ＭＩ−１４８００およびＰ
ＣＩ−１４８００およびＭＷにおいては、微少な病斑が
形成されるに止まった。

【０１１０】（１９）乾燥に対する抵抗性検定 直径が１２ｃｍであって高さが１０ｃｍの透明ポットに
アルミ箔を施して１ｃｍ大の石を３ｃｍの高さに敷き詰
め、その上に川砂を７ｃｍの高さに入れたポットに（１
５）項で調整した材料２を１株ずつ分離して植付け、２
５℃１６時間照明下で管理した。

【０１１１】十分に水を与えながら２週間ほど培養し、
完全に根が土壌中に活着したのを確認した後に、ポット
の中の水分が抜けるまで監視し、目視により水分がなく
なった時点で１００ｍｌの水を添加する処理を繰返して
１ケ月間行なった。

【０１１２】この結果エンドファイトが存在しないＰＣ
およびＭＦでは、始めの水分がなくなった時点でしおれ
が顕著に現われ、１回目の灌水後も植物体の再生はあま
り見られず、２回目の灌水以降はほとんどが枯死した。

【０１１３】これに対してエンドファイトを含有するＭ
Ｉ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣＩ−１４７９
９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは、始めの水分が少
なくなった時点でエンドファイト感染植物独特の葉が針
状に巻く現象を生じ、１ケ月間植物体は緑色の状態で維
持され、乾燥に対して明らかに有意な差が得られた。

【０１１４】（２０）温室内ポット検定 直径が１２ｃｍで高さが１０ｃｍのポットに１ｃｍ大の
石を約３ｃｍの高さに敷き、その上に川砂を約７ｃｍの
高さに入れたポットに（１５）項で調整した材料２を１
株ずつ分離し植付け、温室内に移し、順化栽培を行なっ
た。栽培条件は毎朝の灌水と１ケ月に１度ハイポネック
スを５００倍で与える処理を同一に行ない、３ケ月後に
植物体をポットから取出し、根部に付着した土壌を洗浄
し、地上部の草丈と根量、生体重、病害の発生を測定し
た。

【０１１５】この結果、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．では
エンドファイトを含有するＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１
４８００、ＭＷは何れもエンドファイトの存在しないＭ
Ｆと比較して、草丈、根量、生体重ともに上回り、また
分げつも旺盛であり、増殖に対して明らかに有意な差か
得られた。

【０１１６】Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａでは、エンド
ファイトを含有するＰＣＩ−１４７９９およびＰＣＩ−
１４８００は、エンドファイトが存在しないＰＣと比較
して草丈、根量、生体重ともに上回り、またランナーの
増殖が旺盛な点や、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．による
葉枯れや、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ．やＤｒｅｃ
ｈｓｌｅｒａ ｓｐｐ．による葉枯れ病の発生も明らか
に少なかった。

【０１１７】（２１）刈り込みを行なわない圃場検定 （１５）項で調整した材料と同様のものを圃場に移植
し、生育調査を行なった。１×１ｍの区画に各植物を５
株ずつ植付けて刈込み処理は行なわず、４月から９月ま
での６ケ月間栽培を行なった。

【０１１８】この結果、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．、
Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａともにエンドファイトが存
在しないＭＦ、ＰＣでは、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｐｐ．
によるサビ病が大量発生したのに対し、エンドファイト
を含有するＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣ
Ｉ−１４７９９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは、少
量の夏胞子が観察されたが、病徴が一面に広がることは
なかった。またＭＦおよびＰＣで、葉色の悪化した部分
の根部から多数のネコブセンチュウが採取されたのに対
し、ＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣＩ−１
４７９９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは、少量のセ
ンチュウが観察されただけであった。

【０１１９】（２２）ターフ化による圃場検定 （１５）項で調整した材料と同様のものを３０×６０ｃ
ｍのイネ育苗箱に砂とバーミキュライトを混合した土壌
を２ｃｍの高さに均一に入れ、各材料ごとに高密度に植
付けて定期的に１０ｍｍの高さで刈込みを行ない、３ケ
月間温室内にて栽培を行なった。

【０１２０】３ケ月後の育苗箱の苗は圃場に移植し、生
育調査を行なった。１×１ｍの区画に各育苗苗を５枚ず
つ植付けて刈込みと展圧処理を行ない、４月から９月ま
での６ケ月間栽培を行ない、生育調査を行なった。

【０１２１】この結果、Ａ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａで
は、エンドファイトが存在しないＰＣに５月から６月に
かけて、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎ
ｉｓによるテイクオールパッチが大量発生し、７月から
８月にかけてＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに
よるブラウンパッチと、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏ
ｍｏｅｏｃａｒｐａによるダラースポットが大量発生し
たのに対し、エンドファイトを含有するＰＣＩ−１４７
９９およびＰＣＩ−１４８００ではこれらの病害による
病徴は初期の２０ｃｍ程度の小さなパッチのみで短期間
に回復し、ダラースポットに関してはほとんど病斑が見
られないほどに病害の発生に有意な差が見られた。

【０１２２】またエンドファイトが存在しないＰＣで
は、根部にコガネムシの幼虫による被害がかなり見られ
たが、ＰＣＩ−１４７９９およびＰＣＩ−１４８００に
おいては、ターフの根部にはコガネムシの幼虫による被
害は観察されなかった。

【０１２３】Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐ．ではエンドファ
イトの存在しないＭＦで、７月から９月にかけてＲｈｉ
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐ．による葉腐病、Ｃｕｒｖｕｌ
ａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ ｓｐｐ．による葉枯れ病、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ
ｐ．による赤焼病、ピシウムブライトが発生したが、エ
ンドファイトを含有するＭＩ−１４７９９、ＭＩ−１４
８００、ＭＷは発生初期の小さなパッチが見られたもの
の、それらは短期間で消滅し、病害の発生と回復力に有
意な差が見られた。

【０１２４】また７月中旬と９月中旬にシバツトガの自
然発生に伴う食害が観察された。すなわち日没とともに
ターフ上に無数のシバツトガが産卵のために飛来した。
飛来のピークからおよそ３〜４日目からエンドファイト
の存在しないＰＣおよびＭＦでシバツトガの幼虫による
食害が観察され始め、１週間後にはターフのおよそ２／
３が食害された。

【０１２５】これに対してエンドファイトに感染したＭ
Ｉ−１４７９９、ＭＩ−１４８００、ＰＣＩ−１４７９
９、ＰＣＩ−１４８００およびＭＷは、産卵直後に葉の
上に植付けられた卵が確認されたが、その後は食害が全
く見られず、シバツトガの食害に対して明らかに有意な
差が見られた。

【０１２６】（２３）エンドファイト導入植物の後代を
用いた耐虫性検定 エンドファイトの人工接種を行なったＭＩ−１４８０
０、ＰＣＩ−１４８００の種子を回収し、それらを発芽
させた後、（１）項と（８）項の方法によってエンドフ
ァイトの存在した株を選抜し、（１５）項の方法と同様
の方法によりシバツトガ対する抵抗検定を行なった。な
お対象区にはＭＦとＰＣとを用いた。

【０１２７】この結果シバツトガの幼虫は始め総ての植
物を食害したが、ＭＩ−１４８００およびＰＣＩ−１４
８００の実生個体は食害が止まり、ＭＦとＰＣが３〜４
日で完全に食害されたのに対し、ＭＩ−１４８００およ
びＰＣＩ−１４８００の実生個体は初期の食害だけであ
って、（１５）項の結果と同様の結果が得られ、エンド
ファイト存在により得られる効果は種子を通して後代へ
伝搬した場合も同様であることが確認された。

【０１２８】

【発明の効果】以上のように本発明は、糸状菌から成る
共生菌、すなわちエンドファイトが存在しない植物にエ
ンドファイト、とくに耐虫性インドールアルカロイドを
生産するエンドファイトを人為的に導入して成るイネ科
植物および人工的にイネ科植物に対してエンドファイト
を導入するための方法に関するものである。

【０１２９】従って本発明によれば、イネ科植物に対し
て人為的に耐虫性を有するインドールアルカロイドを導
入させてイネ科植物に対して少なくとも耐虫性を付与す
ることが可能になる。さらにエンドファイトの人為的な
感染によって耐病性と環境ストレス耐性とをも付与する
ことが可能になり、イネ科植物の形質の改善につながる
ことになり、あるいはまた優れた形質を有する有用なイ
ネ科植物を提供できるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】植物に共生するエンドファイトを染色して観察
した顕微鏡写真である。

【図２】ＰＤＡ培地上で増殖された菌糸の顕微鏡写真で
ある。

【図３】ＰＤＡ培地上で形成された分生子の顕微鏡写真
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糸状菌から成る共生菌が存在しない植物に
   糸状菌から成る共生菌を人為的に導入して成るイネ科植
   物。
2. 【請求項２】前記イネ科植物に導入された共生菌が耐虫
   性インドールアルカロイドを生産する共生菌であること
   を特徴とする請求項１に記載のイネ科植物。
3. 【請求項３】前記イネ科植物に導入された共生菌がＡｃ
   ｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−００１、Ａｃｒｅｍ
   ｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００４、またはＡｃｒｅｍｏ
   ｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００２（生工研寄託菌ＦＥＲＭ
   Ｐ−１４７９８、ＦＥＲＭＰ−１４７９９、またはＦ
   ＥＲＭ Ｐ−１４８００）であることを特徴とする請求
   項１に記載のイネ科植物。
4. 【請求項４】共生菌が導入されるイネ科植物が、Ａｇｒ
   ｏｐｙｒｏｎ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏ
   ｎ、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅ
   ｒｕｍ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ、Ｂｒ
   ｏｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔ
   ｙｌｉｓ、Ｅｌｙｍｕｓ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｇｌ
   ｙｃｅｒｉａ、Ｈｉｅｒｏｃｈｌｏｅ、Ｈｏｒｄｅｕ
   ｍ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｓｐａｌｕｍ、
   Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｔａｒ
   ｉａ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ｚ
   ｏｙｓｉａの何れかの属の植物であることを特徴とする
   請求項１に記載のイネ科植物。
5. 【請求項５】植物に共生している糸状菌から成る共生菌
   を分離して人工増殖する工程と、 人工増殖された共生菌をイネ科植物に人工接種する工程
   と、 人工接種した共生菌をイネ科植物に共生させて感染させ
   る工程と、 をそれぞれ具備するイネ科植物への共生菌の導入方法。
6. 【請求項６】共生菌の分生子を前記接種する工程で人工
   接種することを特徴とする請求項５に記載のイネ科植物
   への共生菌の導入方法。
7. 【請求項７】前記イネ科植物に人工接種する共生菌がＡ
   ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−００１、Ａｃｒｅ
   ｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００４、またはＡｃｒｅｍ
   ｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｍ−００２（生工研寄託菌ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１４７９８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９９、また
   はＦＥＲＭ Ｐ−１４８００）であることを特徴とする
   請求項５に記載のイネ科植物への共生菌の導入方法。
8. 【請求項８】１種の共生菌または２種類以上の共生菌を
   人工導入することを特徴とする請求項５に記載のイネ科
   植物への共生菌の導入方法。