JPH1098942A - ラフブルーグラスおよびラフブルーグラスへの共生菌の導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】優れた形質、とくに耐虫性および耐病性に優れ
たラフブルーグラスを提供することを目的とする。 【解決手段】自然界に存在する野生の植物中に共生して
いる糸状菌から成る共生菌であるエンドファイトを分離
して人工増殖するとともに、人工増殖されたエンドファ
イトをラフブルーグラスに接種感染させて共生させるよ
うにしたものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は共生菌を導入して成
るラフブルーグラスおよびラフブルーグラスへの共生菌
の導入方法に関する。ここでラフブルーグラスとはイネ
科植物中のイチゴツナギ亜科、イチゴツナギ連のイチゴ
ツナギ属に属する植物である。

【０００２】

【従来の技術】ブルーグラスとして、従来よりケンタッ
キーブルーグラス、カナダブルーグラス、スズメノカタ
ビラ、ラフメドウグラス、ブルボウズメドウグラス、ア
ルペンメドウグラス、ウエービーメドウグラス、ウッド
メドウグラス、バルフォースメドウグラス、スワンプメ
ドウグラス、ブロードリーフメドウグラス、ナローリー
フメドウグラス、スムースメドウグラス、スプレッディ
ングメドウグラス、フラッテンドメドウグラス等の植物
が知られている。

【０００３】この中でもとくにラフブルーグラスは、英
名ラフメドウグラス、和名オオスズメノカタビラと呼ば
れている。

【０００４】これらの植物はイネ科植物に含まれるとと
もに、イチゴツナギ亜科中のイチゴツナギ連に属し、し
かもイチゴツナギ連中のイチゴツナギ属の植物である。
例えばラフブルーグラスは学名Ｐｏａ ｔｒｉｖｉａｌ
ｉｓと呼ばれている。なおＰｏａ ｔｒｉｖｉａｌｉｓ
は、Ｃｌａｙｔｏｎら（Ｇｅｎｅｒａ Ｇｒａｍｉｎｉ
ｕｍ， Ｇｒａｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ １９
８６）によって分類された植物に相当する。

【０００５】ブルーグラス中でもとくにラフブルーグラ
スは多くのブルーグラス類の中でも人類にとって重要
で、芝草、牧草等に広く利用されている。

【０００６】ところがラフブルーグラスは利用用途が広
く、しかも使用面積が広大であるために、病害や虫害に
よる被害が大きく、Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｗｅｂｗｏｒ
ｍ（和名シバツトガ）による被害が大きく、ふ化直後の
幼虫に対して薬剤散布が行き届かないところでは一夜に
して芝がなくなるほどの大きな被害が発生している。

【０００７】ところでイネ科植物について、従来から行
なわれている育種、栽培方法としては、人工交配法、選
抜法、突然変異法、細胞融合法、遺伝子導入法等が存在
する。近年のバイオテクノロジーの進歩によって、これ
まで１０年以上要した育種期間は数年に短縮されてい
る。とくに形質転換技術である遺伝子導入法は、アグロ
バクテリウムによる方法、エレクトロポレーション法、
パーティクルガン法等が存在し、多くの作物への応用が
実施されている。

【０００８】しかしイネ科の植物においては、上記の遺
伝子導入法は効率が非常に低いことが指摘されている。
アグロバクテリウム法では、イネ科植物へのアグロバク
テリウムの感染が困難なために、遺伝子導入が非常に難
しい。またエレクトロポレーション法では、イネ科植物
のプロトプラストからの再生系の開発が必須であり、再
生が可能であったとしても、培養変異等によって、本来
の植物の形質を損うことが知られている。

【０００９】またパーティクルガン法は、遺伝子をラン
ダムに植物体または培養物に導入するために、与えられ
た植物がキメラになることが多いことが知られている。

【００１０】ラフブルーグラスを含むブルーグラスにお
いても、細胞融合や遺伝子導入を含む細胞育種法は、煩
雑な操作を必要とし、その効率も低いために、実用レベ
ルでの開発に成功した例は非常に少ない。

【００１１】ところで自然界に存在する野生の植物の中
には、内部共生菌である糸状菌、すなわちエンドファイ
トが共生している植物が存在する。植物体の組織中に、
とくに細胞間隙と呼ばれる細胞と細胞との間の間隙でこ
のような共生菌が生育している。

【００１２】このような内部共生菌、すなわちエンドフ
ァイトは共生する糸状菌であって、宿主の植物に対して
悪影響を及さないばかりか、宿主植物に対して有用な物
質を提供し、環境ストレスに対して抵抗性を有する性質
を植物に付与することに貢献ている。

【００１３】すなわちエンドファイトは共生している植
物の耐虫性（Ｓｉｅｇｅｌら、１９８７ Ａｎｎ． Ｒ
ｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、２５：２９３−３１
５）、耐病性（Ｇｗｉｎｎ ａｎｄ Ｇａｖｉｎ、１９
９２ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７６：９１１−９
１４）、環境ストレス（乾燥等）耐性（Ａｒａｃｈｅｖ
ａｌｔａら、１９８９ Ａｇｒｏｎ． Ｊ． ８１：８
３−９０）、生長促進（Ｌａｔｃｈら、１９８５ Ｎ．
Ｚ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｒｅｓ． ２８：１６５
−１６８）等を向上させることが公知となっている。と
くにエンドファイトが感染したペレニアルライグラスに
おいては、このエンドファイトが生産する忌避物質やア
ルカロイドによって耐虫性が向上することが知られてい
る。

【００１４】またニュージーランドのライチ（Ｌａｔｃ
ｈ）らは、ペレニアルライグラスのエンドファイトを収
集調査し、家畜に対して毒性が少なく耐虫性に優れたエ
ンドセーフと呼ばれているエンドファイトの探索を試み
ている。

【００１５】しかしこのようなエンドファイトが共生し
ている多くの植物は、人類に対して有用性に乏しい野生
植物であって、エンドファイトの有効性を有用なイネ科
植物に導入する必要性が生じている。そこで主要牧草で
あるペレニアルライグラスへのエンドファイトの導入が
これまで試みられてきた。その技術は人工交配法と人工
接種法とに大別される。

【００１６】人工交配法は、エンドファイトに感染して
いる植物を母親として有用形質を花粉によって導入する
方法であるが、従来の方法においては交配の可能な種
間、品質間の導入に限定されている。また人工接種法で
は、植物体や培養組織に分離培養したエンドファイトを
接種感染させる方法である。

【００１７】人工接種法は、人工交配法と比較すると、
導入の範囲が拡大されるが、しかしエンドファイトの栽
培法、接種時の条件、植物体の条件等の手法的な問題か
ら、ペレニアルライグラスに限定されていた。また感染
効率を向上させるために接種する植物体側の組織にカル
スを利用する方法が報告されている。この方法によれ
ば、カルスからの植物体の再生系の開発が要求されるた
めに、やはりペレニアルライグラスへの導入例に止まっ
ている。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】従来の細胞育種法にお
いては、煩雑な操作と熟練とを要する一方、形質転換や
細胞融合によれば、培養変異等の理由によって、導入形
質または導入形質以外の形質に影響を及すために、実用
化が困難になっていた。

【００１９】また遺伝子導入法において、遺伝子導入に
際し、植物の形質や形態に及ぼす遺伝子が解明されてい
ない場合には、それらの形質を導入することが不可能で
あった。

【００２０】とくに環境ストレス等の複雑な要因に関連
する形質は、遺伝子導入法等の方法では、導入すること
ができなかった。また細胞育種法によって作出された植
物は、多くの場合に種子稔性の低下が認められている。
これはイネ科植物において、種子稔性の低下が収量の低
下を招くために致命的な欠陥になる。

【００２１】このような現状に鑑みて、エンドファイト
を利用した育種法、あるいは形質の改善は、上記の問題
を解決するための全く新しい手法である。

【００２２】エンドファイトの人工接種を行なう場合に
は、エンドファイトの探索、培養系の検討等から、ペレ
ニアルライグラスに限定されており、他の有用なイネ科
植物、例えばラフブルーグラスへの応用が全くなされて
いない。さらにカルス接種法においては、導入植物の再
生系の開発が不可欠である。また接種時においても、エ
ンドファイトの感染効率を向上させる接種条件が開発さ
れていない。

【００２３】エンドファイトの種類において、現在有用
なエンドファイトは、ペレニアルライグラス、トールフ
ェスク、メドウフェスクからしか探索されておらず、導
入の大きな障害になっている。とくにこれらのエンドフ
ァイトの宿主植物は外来の種であり、日本に在来の植物
から日本の環境に適応したエンドファイトはこれまで発
見されていない。

【００２４】

【発明の目的】本発明は人為的にエンドファイトを導入
したラフブルーグラス、およびエンドファイトに感染し
ていないラフブルーグラスにエンドファイトを人為的に
導入する方法を提供することを目的とする。

【００２５】

【課題を解決するための手段】本発明は、糸状菌から成
る共生菌、すなわちエンドファイトに感染していないラ
フブルーグラスにエンドファイトを人為的に導入して成
るブルーグラスに関するものである。ここでラフブルー
グラスとはイネ科植物であって、イチゴツナギ亜科中の
イチゴツナギ連に含まれるイチゴツナギ属の植物であ
り、英名ではラフメドウグラス、和名ではオオスズメノ
カタビラと呼ばれるものである。

【００２６】またここでラフブルーグラスは、学名Ｐｏ
ａ ｔｒｉｖｉａｌｉｓ、Ｐｏａｃｏｍｐｒｅｓｓａの
植物を含むものとし、市場に流通しているセイバー、ダ
ークホース、コルト等の品種を含むものとする。

【００２７】このようなラフブルーグラスへのエンドフ
ァイトの導入は、自然界に生育する植物中に共生するエ
ンドファイトを探索発見するとともに、植物中からエン
ドファイトを分離しかつ人工的に培養したものを上記の
ブルーグラスに人為的に導入するものである。なお自然
界に生育する植物であってエンドファイトが存在する植
物は、自然界にカヤツリグサ科、イグサ科等に存在する
ことが知られている。

【００２８】例えば本願発明者らが探索発見するととも
に培養したエンドファイトであって、下記のエンドファ
イトが用いられてよい。

【００２９】Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０
６０（生工研寄託菌 ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２） このようなエンドファイトが導入されるラフブルーグラ
スには、その後代も含まれるものである。

【００３０】次にラフブルーグラスへの糸状菌から成る
共生菌、すなわちエンドファイトの導入方法について説
明すると、この方法は自然界に存在する植物に共生して
いるエンドファイトを分離して人工増殖を行なうととも
に、人工増殖されたエンドファイトをラフブルーグラス
に人工接種するものである。そして人工接種されたエン
ドファイトをラフブルーグラスに感染させて共生させる
ことにより、ラフブルーグラスへのエンドファイトの導
入が行なわれる。

【００３１】ここでエンドファイトを人工接種する工程
において、とくにエンドファイトの分生子を用いるよう
にしてよい。また生工研に寄託されている上記のエンド
ファイトを人工接種するようにしてもよい。

【００３２】

【発明の実施の形態】本発明に係るラフブルーグラスへ
のエンドファイトの導入をその手順に従って詳細に説明
する。

【００３３】段階１ エンドファイトの存在の有無の
検出と分離工程 （１）エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内
のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エン
ドファイトの存在の有無の確認を行なう。

【００３４】（２）エンドファイトの分離・培養工程 エンドファイトが確認された植物片を滅菌処理後に、エ
ンドファイトの分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行な
う。

【００３５】（３）エンドファイトの分類工程 分離されたエンドファイトを宿主によって分類する。あ
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な特徴で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な特徴で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な特徴で分類する。

【００３６】段階２ アルカロイドの分析工程 菌単体もしくは植物体との共生下において、エンドファ
イトから生産されるアルカロイドを分析し、とくに耐虫
性の確認を行なう。このときに併せて耐病性、環境スト
レス耐性、生長促進性等についての検定を行なうことを
妨げない。

【００３７】段階３ エンドファイトの導入工程 分離したエンドファイトを目的あるいは対象とするブル
ーグラスへ人工的に導入する。エンドファイトの導入方
法は、植物体に直接接種する方法と、植物体を１度カル
ス等の未分化の細胞にした後に接種し、カルスから植物
体を再生させる方法とがある。これらはエンドファイト
の導入の対象となる植物の種類に応じて任意に選択され
てよい。

【００３８】段階４ 導入確認工程 エンドファイトを導入した個体は、外植片を染色液にて
染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫
測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有
無を検出する。

【００３９】段階５ エンドファイト導入植物の検定
工程 （１）耐虫性検定 エンドファイトを導入して共生させた植物と、エンドフ
ァイトが存在しない植物とを用い、虫害の対象となる昆
虫を飼育し、人工的に食害試験を行なう。

【００４０】（２）耐病性検定工程 エンドファイトを導入したラフブルーグラスと、エンド
ファイトが存在しない同一種類のラフブルーグラスとを
用い、病害の対象となる病原菌を用い、上記２種類の植
物に対して人為的に病原菌の接種を行なって発病の程度
により病害抵抗性検定を行なう。

【００４１】（３）後代を用いた検定 エンドファイトが存在する種子を採集し、発芽させてエ
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。

【００４２】

【実施例１】 （１）エンドファイトの検出 野生のイネ科植物であって自生するＰｏａ属の植物体か
ら次の方法によってエンドファイトの検出を行なった。

【００４３】上記の植物の葉および葉鞘部分の表皮を剥
ぎ、光学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有
無の確認を行なった。この確認はスライドガラスに、乳
酸５ｍｌ、グリセリン１０ｍｌ、水５ｍｌ、アニリンブ
ルー水溶液０．０２ｇの染色液を数滴滴下する。そして
葉鞘部分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に
向って剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に
置き、カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰さ
せ、光学顕微鏡下において組織を観察した。この条件で
エンドファイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するため
に、これによってエンドファイトの検出が行なわれる。

【００４４】検出の結果、１種類のＰｏａ属植物からエ
ンドファイトが検出された。そして菌のライフサイクル
から、植物体外へ出ることのない無性世代のみのＡｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ型エンドファイトであることが判明し
た。

【００４５】（２）エンドファイトの分類 上記（１）項でエンドファイトが確認された１種のＰｏ
ａ属植物体から以下の方法でエンドファイトの分離を行
なった。

【００４６】植物体からのエンドファイトの分離は、葉
および葉鞘部分を水洗後、７０％エタノール水溶液に１
０秒間浸漬し、次いで２．５％次亜塩素酸ナトリウム水
溶液に１０分間浸漬した後、滅菌水で３回洗浄し、エン
ドファイト分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養
を行なった。

【００４７】分離培地は、ｐＨ５．６に調整したＰＤＡ
（ポテト デキストロース アガー）培地を１２１℃、
１５分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンと
をそれぞれ１００ｍｇ／ｌの濃度になるように添加し、
直径９ｃｍのプラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分注
して使用した。

【００４８】置床後約３〜８週間後に外植片から菌糸が
分離され、形成されたコロニーを直径が５ｍｍのコルク
ボーラにて取出し、同ＰＤＡ培地に移植して増殖を行な
った。

【００４９】（３）平板培養法による菌叢でのエンドフ
ァイトの分類同定 ＰＤＡ培地へ移植した菌糸は、２５℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培
地上での菌叢は総て白色の綿状であって、増殖速度は比
較的遅く、コロニーは１カ月で半径が約３ｃｍ程度にま
でしか増殖しなかった。

【００５０】これらの内で、分離した１種類のエンドフ
ァイトを工業技術院生命工学工業技術研究所へ寄託を行
なった。菌の表示および寄託番号は以下に示す通りであ
る。

【００５１】Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０
６０ ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２ （４）スライドカルチャーによる菌糸の状態 スライドガラス上に厚さが２〜３ｍｍのＰＤＡ培地を載
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成とを調査した。なおこの培養は２５℃暗条件下におい
て行なった。

【００５２】調査の結果、菌糸は総て無色であって、幅
が１〜２μｍで総てに隔壁が観察された。分生子は、総
てのエンドファイトで容易に形成することが可能であっ
た。

【００５３】分生子は菌糸の先端あるいは側面より直立
した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんどが
単生の分生子であった。

【００５４】分生子の色は総て無色で、細胞も１細胞性
であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をな
し、大きさは３〜８×１〜３μｍであった。また形成さ
れたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従っ
て細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。

【００５５】（５）植物体からのアルカロイドの分析 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０６０ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８６２の宿主植物から以下の方法で、アル
カロイドの分析を行なった。

【００５６】各植物の葉および葉鞘部分を凍結乾燥後、
１００ｍｇをサンプルとして乳鉢に入れて磨砕し、メタ
ノールとクロロホルムとをそれぞれ１．５ｍｌずつ加え
て混合し、遠沈管へ回収した。１８℃で３０分間ゆっく
り混合し、この後にｎ−ヘキサンと水とをそれぞれ３ｍ
ｌずつ加え、３０分間撹拌した。次いで２０００ｒ．
ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。これによって有機層
と水とを分取した。

【００５７】分取した水層部分は３ｍｌをＢｉｏＲａｄ
ＡＧ２×８とＡｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ Ｂｌｏｎｄ
Ｅｌｕｔ ＣＢＡのカラムで精製し、濃縮後８０％メタ
ノールを１００μｌ添加し、メルクのシリカゲル６０を
使用した薄層プレートに各サンプルを２０μｌずつ滴下
し、展開触媒として、クロロホルム：メタノール：酢
酸：水を２０：１０：１：１の割合で混合したものを使
用し、展開し、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフ）法により
分析を行なった。

【００５８】有機層部分は２ｍｌをエッペンドルフチュ
ーブにサンプルを各５００μｌずつ入れ、遠心エバポレ
ータにて一度溶媒を完全に蒸散させた後に、クロロホル
ムで最終的に２００μｌに希釈した。希釈後に、薄層プ
レートにはメルクのシリカゲル６０を使用し、各サンプ
ルを３μｌずつ滴下し、展開溶媒として、クロロホル
ム：エタノールを９：１の割合で混合したものを使用
し、ＴＬＣ法によって分析を行なった。

【００５９】水層および有機層の抽出物は展開後に、Ｕ
Ｖで確認し、Ｅｈｒｌｉｃｈ試液（ｐ−ジメチルベンズ
アルデヒド１．０ｇを９６％エタノールに溶解したも
の）とニトロソナフトール試液を用い、呈色反応とＲｆ
値とを測定した。

【００６０】この結果宿主植物からの水層抽出物は、Ｅ
ｈｒｌｉｃｈ試液を用いた場合に青紫色のスポットが確
認され、試薬による呈色反応とＲｆ値とからこれらがイ
ンドールアルカロイドであることを確認した。

【００６１】また宿主植物からの有機層抽出物は、Ｅｈ
ｒｌｉｃｈ試液を用いた総ての植物から青紫色のスポッ
トが、ニトロソナフトール試液を用いた場合に、赤紫色
のスポットが同様の位置に確認され、試薬による呈色反
応からこれらがインドールアルカロイドであることを確
認した。

【００６２】（６）液体増殖培地 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０６０ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８６２の菌糸を２５℃の暗条件下において
ＰＤＡ培地で２カ月間培養後、コロニーを直径が５ｍｍ
のコルクボーラで取出し、３００ｍｌの振とうフラスコ
にＰＤ（ポテトデキストロース ブロース）培地を１０
０ｍｌ入れ、１２１℃で１５分間滅菌したものに各フラ
スコに１個ずつ入れ、２５℃で１５０ｒ．ｐ．ｍ．の往
復振とうを行なった。

【００６３】この結果総ての菌は、２週間でフラスコ一
杯に増殖した。

【００６４】（７）植物体を用いた人工接種 分離したエンドファイトを用いてラフブルーグラスへの
人口接種を行なった。ここで用いられた対象の植物は、
ラフブルーグラス中の品種セイバーを用いた。なおここ
ではタキイ種苗株式会社の販売に係るセイバーを使用し
た。

【００６５】また上記のエンドファイトは（２）項の方
法によって増殖した後に、フレッシュなＰＤＡ培地へ移
植し、同条件下において５〜１２日間培養したものを用
いた。接種は水に０．８％のＡｇａｒを添加したＷＡ培
地（Ｗａｔｅｒ Ａｇａｒ培地）に種子を滅菌して播種
し、暗条件で培養した。培養開始から３〜７日後に、植
物体の生長点部分にメスで切込みを入れ、ＰＤＡ培地で
培養した菌糸を挿入した。

【００６６】これらを２５℃および３０℃の暗条件下で
８日間培養した後に、１５℃、１６時間照明下に移して
４日間は培養し、さらに２５℃の１６時間照明下に移し
て２日以上培養し、緑色に成長してきた個体を鉢上げ馴
化した。。

【００６７】これらの個体に対して、（１）項の方法を
用いてエンドファイトの導入を確認した結果、植物への
導入が確認された。また感染効率は２５℃よりも３０℃
の方が明らかに高かった。

【００６８】（８）カルスを用いた人工接種 人工接種用の試料として、ラフブルーグラスのカルス誘
導を行なった。材料はラフブルーグラス中の品種セイバ
ーを使用し、ＭＳ基本培地に２．０ｍｇ／ｌの２，４−
Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）と０．２ｍｇ／
ｌのＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）を添加し、カ
ルス誘導培地とした。

【００６９】ＭＳ培地において発芽直後の種子をカルス
誘導培地へ移植し、２５℃の暗条件下において２カ月間
培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。

【００７０】Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０
６０ ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２を用いてラフブルーグ
ラスののカルスを用いた人工接種を行なった。各カルス
は上述の誘導培地で誘導したものであって、得られたカ
ルスを植物ホルモン無添加のＭＳ基本培地へ移植した。

【００７１】そして移植後直ちにカルスをメスで切断
し、（６）項で増殖させた菌糸を１カルス当り５０μｌ
滴下した。

【００７２】カルスは２５℃および３０℃の暗条件下で
それぞれ数週間培養した後に、１６時間照明下に移すか
あるいは直ちに１６時間照明下に移して培養し、再生し
てできた個体をフレッシュなＭＳ培地に移植し、１カ月
間培養した。これらを（１）項の方法を用いてエンドフ
ァイトの導入を確認した結果、導入が確認された。

【００７３】（９）分生子の大量生産 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０６０ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８６２を用い、分生子の大量生産を行なっ
た。すなわちこの菌を（６）項と同様の方法によって培
養し、フレッシュなＰＤ培地に移植し、分生子の形成能
がピークに達する５〜１２日後に培養液を２０ｍｌ取出
し、２０μｍのメッシュを２枚重ねしたもので不要な菌
糸を除去し、瀘液を１０ｍｌの遠沈管に入れて１０００
ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。遠心分離の後の
上清み液を捨てて１ｍｌのＰＤ培地を添加し、分生子懸
濁液を得た。

【００７４】（１０）分生子を用いた接種法 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｏ−０６０ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８６２の分生子懸濁液を（８）項のカルス
接種法を用いてラフブルーグラスの品種セイバーに人工
接種を行なった。得られた個体を（１）項の方法で検定
した結果、高頻度にエンドファイト導入個体が確認さ
れ、それらは菌糸を用いた接種法である（８）項の方法
と比較しても大きな有意差が認められた。

【００７５】（１１）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に
よるエンドファイトの検出 （７）項、（８）項、および（９）項の人工接種法によ
ってエンドファイトが確認された植物体の葉片から次の
ような方法でエンドファイトの検出を行なった。

【００７６】植物の外植片の生重量の０．５ｇに緩衝液
を入れ、乳鉢で磨砕し、抽出液を得た。５０μｌの抽出
液をマイクロプレートのウェルへ入れ、室温において３
０分間吸着させた。そして未結合の抗原を洗浄した。

【００７７】ウェル内をブロッキング液（３％脱脂粉乳
溶液）で満たし、３０分後に洗浄した。また抗エンドフ
ァイトのウサギ抗血清（１次抗体）をウェルに加え、室
温で６０分間反応させた。そして未結合の抗体を洗浄し
た。

【００７８】希釈した２次抗体（アルカリホスファター
ゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）をウェルに加え、
室温で６０分間反応させた。未結合の抗体を洗浄した。
この後に基質溶液にウェルを加え、アルカリホスファタ
ーゼ反応を起させた。そして０．５ＮのＮａＯＨで反応
を停止し、４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。

【００７９】この結果（７）項、（８）項、および
（９）項で作出したエンドファイト導入個体の全てから
呈色反応が確認され、これらのエンドファイトのラフブ
ルーグラスへの導入が証明された。

【００８０】（１２）シバツトガによる抵抗性検定 （７）項によりエンドファイトＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
ｓｐ． Ｐｏ−０６０ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２を導入
したラフブルーグラス（品種セイバー）（以下セイバー
Ｅ＋という）を用い、シバツトガに対する抵抗性検定を
行なった。

【００８１】セイバーＥ＋は接種後２カ月目の個体を馴
化し、対照区として接種を行なっていないセイバーの種
子（以下セイバーＥ−）を７０％エタノールに１０秒間
浸漬し、次に２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１
０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗浄し、風乾し、Ｍ
Ｓ基本培地に移植し、発芽後２カ月間培養したものを馴
化して使用した。

【００８２】セイバーＥ＋とセイバーＥ−の葉片をそれ
ぞれ約１ｃｍの長さに切片し、直径９ｃｍのシャーレ内
に各３枚ずつ並べ、ふ化直後のシバツトガの幼虫を約２
００匹を入れ、２４時間後に葉片の食害の有無を調査し
た。この結果セイバーＥ−は食害が見られたのに対し、
セイバーＥ＋は全く食害されなかった。

【００８３】（１３）葉枯れ病に対する抵抗性検定 ラフブルーグラスに発生した葉枯れ病より分離した病原
菌Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｐ． 、Ｃｕｒｖｕｌａｒ
ｉａ ｓｐ． 、およびＢｉｐｏｌａｒｉｓｓｐ． を
それぞれＰＤＡ培地上で２週間培養し、菌叢の表面に形
成された分生子をニードルでかき取り、滅菌水に懸濁し
て５０００〜１００００個／ｍｌに濃度を調整した。

【００８４】セイバーＥ＋は接種後２カ月目の個体を、
対照区は接種を行なっていないセイバーＥ−の種子を、
７０％エタノールに１０秒間浸漬し、次に２．５％次亜
塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸漬した後、滅菌水
で３回洗浄し、風乾した後、ＭＳ基本培地に移植し、発
芽後２カ月間培養したものを６×６×１０ｃｍのプラン
トボックスに滅菌した培養土を入れ、材料を１０個体ず
つ植込み、２週間培養を行なった。

【００８５】病原菌の接種は、植物体の表面全体に噴霧
あるいは塗布し、２８℃で１６時間日長条件下で１カ月
間培養した。

【００８６】この結果総ての菌でエンドファイトの含有
しない対照区は、接種１週間目から葉の先端から葉腐れ
が始まり、３週間で植物体は完全に枯死したのに対し、
エンドファイトを含有するセイバーＥ＋は、葉に直径２
ｍｍほどの感染初期の黒色のスポット、および葉の先端
１ｃｍ程度の葉枯れが検出されたが、その後の病斑の広
がりはほとんどなく、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｐ．
、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．、およびＢｉｐｏｌ
ａｒｉｓ ｓｐ．による葉枯れ病の発生に対して、明ら
かに有意な差が見られた。

【００８７】（１４）さび病に対する抵抗性検定 黒さび病に感染したラフブルーグラスの葉に形成された
夏胞子を、５×５ｍｍの湿った瀘紙の上に付着させた。
夏胞子のついた瀘紙を（１２）項と同様の方法にて調整
したセイバーＥ＋および対照区の植物の葉に貼付け、接
種を行なった。接種した植物は湿度の高い２０℃、暗条
件下で１２時間インキュベートした後、１６時間照明下
に移し、３週間培養した。

【００８８】この結果接種１０日後に、セイバーＥ＋お
よび対照区の双方の葉の表面に夏胞子堆が形成された。
その後対照区は、２週間で植物体全体が２次的に形成さ
れた大量の夏胞子堆で覆われたのに対してセイバーＥ＋
においては、新たに形成された夏胞子堆は極少量で植物
体全体が夏胞子堆で覆われることはなく、病徴の発生に
明らかに有意な差が見られた。

【００８９】

【実施例２】 （１）スジギリヨトウによる抵抗性検定 上記実施例１の（７）項によりエンドファイトを導入し
たラフブルーグラスを用い、スジギリヨトウでの耐虫性
検定を行なった。この検定は、（１２）項と同様の方法
で、幼虫にふ化直後のスジギリヨトウ２００匹を用いて
２４時間後に食害の有無を調査した。

【００９０】調査の結果、セイバーＥ−は完全に食害さ
れたのに対し、セイバーＥ＋はごく一部が摂食されただ
けであった。

【００９１】次に（１２）項と同様の植物を２０×３０
ｃｍのポットに入れ、セイバーＥ＋とセイバーＥ−の１
０ｃｍ×１０ｃｍのターフを作成し、ふ化後２週間経過
した幼虫を約５０匹入れ、４日後に食害の有無を調査し
た。

【００９２】調査の結果、セイバーＥ−は完全に食害さ
れたのに対し、セイバーＥ＋は充分に緑色の葉を保持し
た状態であった。

【００９３】さらに同様の芝を栄養繁殖させ、屋外にセ
イバーＥ＋とセイバーＥ−の４０ｃｍ×４０ｃｍのター
フを作成し、ふ化後３週間以上経過した幼虫を各ブロッ
ク毎に７匹ずつ放ち、食害の有無を調査した。

【００９４】調査の結果、徐々に食害が現われ、セイバ
ーＥ−は４日後には完全に食害されたのに対し、セイバ
ーＥ＋は充分に緑色の葉を保った状態であった。

【００９５】（２）エンドファイト導入植物の後代を用
いた耐虫性検定 エンドファイトの人工接種を行なったセイバーＥ＋と対
照区のセイバーＥ−の出穂後の種子を回収し、それらを
発芽させた後に実施例１の（１）項の方法でエンドファ
イトを検出し、実施例１の（１２）項と同様の方法で耐
虫性検定を行なった。検定の結果、セイバーＥ＋の発芽
後の植物体の葉片は全く食害されず、これに対してセイ
バーＥ−は完全に食害された。このことからエンドファ
イトの存在により得られる効果は、種子を通して後代へ
伝播した場合も同様であることが確認された。

【００９６】

【発明の効果】以上のように本発明は、糸状菌から成る
共生菌、すなわちエンドファイトが存在しないラフブル
ーグラスにエンドファイトを人為的に導入して成るラフ
ブルーグラスおよび人為的にラフブルーグラスに対して
エンドファイトを導入する方法に関するものである。

【００９７】従って本発明によれば、ラフブルーグラス
に対してエンドファイトを導入し、ラフブルーグラス内
においてエンドファイトを共生させることにより、少な
くとも耐虫性および耐病性を付与することが可能にな
る。従ってラフブルーグラスの形質改善が図られるとと
もに、優れた形質を有する有用なラフブルーグラスの提
供が可能になる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糸状菌から成る共生菌が存在しない個体に
   糸状菌から成る共生菌を人為的に導入して成るラフブル
   ーグラス。
2. 【請求項２】前記ラフブルーグラスに導入された共生菌
   がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｐｏ−０６０（生工研
   寄託菌 ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２）であることを特徴
   とする請求項１の記載のラフブルーグラス。
3. 【請求項３】植物に共生している糸状菌から成る共生菌
   を分離して人工増殖する工程と、 人工増殖された共生菌をラフブルーグラスに人工接種す
   る工程と、 人工接種された共生菌をラフブルーグラスに共生させて
   感染させる工程と、 をそれぞれ具備するラフブルーグラスへの共生菌の導入
   方法。
4. 【請求項４】共生菌の分生子を前記接種する工程で人工
   接種することを特徴とする請求項３に記載のラフブルー
   グラスへの共生菌の導入方法。
5. 【請求項５】前記ラフブルーグラスに人工接種する共生
   菌がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｐｏ−０６０（生工
   研寄託菌 ＦＥＲＭ Ｐ−１５８６２）であることを特
   徴とする請求項３に記載のラフブルーグラスへの共生菌
   の導入方法。