JP2001286277A - 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法 - Google Patents
共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】感染された共生菌による家畜毒性を示さず、し
かも虫に対する強度な抵抗性を有する植物体を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から
成る共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビン
である糸状菌を植物体に人工的に導入し、感染・共生さ
せるようにしたものである。
かも虫に対する強度な抵抗性を有する植物体を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から
成る共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビン
である糸状菌を植物体に人工的に導入し、感染・共生さ
せるようにしたものである。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は共生菌、共生菌のス
クリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、
植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植
物、植物体への共生菌の導入方法に係るものである。と
くに本発明は、カノクラビンを最終的な代謝物質とする
共生菌、すなわちエンドファイトおよびこのようなエン
ドファイトを牧草等に利用可能な植物に感染・共生させ
るようにした植物とその方法とに関するものである。
クリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、
植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植
物、植物体への共生菌の導入方法に係るものである。と
くに本発明は、カノクラビンを最終的な代謝物質とする
共生菌、すなわちエンドファイトおよびこのようなエン
ドファイトを牧草等に利用可能な植物に感染・共生させ
るようにした植物とその方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】例えば特開平５−３１７０９２号公報に
は、ペレニアルライグラスから誘導した植物体、例えば
カルス中にエンドファイトが共生しているかどうかを検
定し、エンドファイトが共生していないことを確認した
カルスにエンドファイトを導入した後に、植物体を再生
するようにしたペレニアルライグラスへのエンドファイ
トの人工導入方法が開示されている。
は、ペレニアルライグラスから誘導した植物体、例えば
カルス中にエンドファイトが共生しているかどうかを検
定し、エンドファイトが共生していないことを確認した
カルスにエンドファイトを導入した後に、植物体を再生
するようにしたペレニアルライグラスへのエンドファイ
トの人工導入方法が開示されている。
【０００３】ここで共生菌、すなわちエンドファイトは
植物組織内に共生する糸状菌であって、このような糸状
菌が感染した植物体は、共生していない個体に比べて害
虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速度、
暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上する
ことが知られている。このことから、エンドファイトの
人工的な感染が、植物に対する形質の改善につながる。
植物組織内に共生する糸状菌であって、このような糸状
菌が感染した植物体は、共生していない個体に比べて害
虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速度、
暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上する
ことが知られている。このことから、エンドファイトの
人工的な感染が、植物に対する形質の改善につながる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】植物体に感染させて共
生することが可能な共生菌は、図１に示すような代謝物
質を順次生合成する。そしてこのような代謝の最終物質
として、エルゴバリンやエルゴタミンのようなエルゴペ
プチンが生合成される。
生することが可能な共生菌は、図１に示すような代謝物
質を順次生合成する。そしてこのような代謝の最終物質
として、エルゴバリンやエルゴタミンのようなエルゴペ
プチンが生合成される。
【０００５】またイネ科植物に感染共生するエンドファ
イトの場合には、感染した植物はエルゴットアルカロイ
ドによって毒性を示すことが知られている。このような
毒性は、畜産業の分野では家畜毒性として問題視されて
いる。とくに牧草の分野において、ペレニアルライグラ
スやトールフェスク等のエンドファイトに感染した牧草
が流通し、エルゴットアルカロイド等が原因とする中毒
が報告されている。
イトの場合には、感染した植物はエルゴットアルカロイ
ドによって毒性を示すことが知られている。このような
毒性は、畜産業の分野では家畜毒性として問題視されて
いる。とくに牧草の分野において、ペレニアルライグラ
スやトールフェスク等のエンドファイトに感染した牧草
が流通し、エルゴットアルカロイド等が原因とする中毒
が報告されている。
【０００６】ライグラススラッガーは１９０６年にニュ
ージーランドで最初に報告され、ニュージーランドとオ
ーストラリアのオセアニア２国で主に発生している。夏
から秋にかけての乾燥の厳しさで枯れあがった状態のペ
レニアルライグラスにエンドファイトが感染している場
合には、この牧草を羊等の家畜が摂食した場合にライグ
ラススラッガーが発生する。
ージーランドで最初に報告され、ニュージーランドとオ
ーストラリアのオセアニア２国で主に発生している。夏
から秋にかけての乾燥の厳しさで枯れあがった状態のペ
レニアルライグラスにエンドファイトが感染している場
合には、この牧草を羊等の家畜が摂食した場合にライグ
ラススラッガーが発生する。
【０００７】ライグラススラッガーの症状は、摂食した
家畜が四肢を硬直させ、首や肩、さらには側腹部を震わ
せるようになる。すなわち一種の痙攣であって、この状
態が続くとやがて家畜はその身体が衰弱していき、最悪
の場合には動けなくなって餓死することがある。これま
でにその原因物質が、ロリトレムアルカロイドであるロ
リトレムＢであることが判明している。
家畜が四肢を硬直させ、首や肩、さらには側腹部を震わ
せるようになる。すなわち一種の痙攣であって、この状
態が続くとやがて家畜はその身体が衰弱していき、最悪
の場合には動けなくなって餓死することがある。これま
でにその原因物質が、ロリトレムアルカロイドであるロ
リトレムＢであることが判明している。
【０００８】フェスクトキシコーシスは、主にアメリカ
合衆国南東部で発生した。トールフェスクを摂食した牛
の体重が著しく減少し、牧草を十分に食べなくなった
り、産乳量が低下したり、受胎率が低下する症状を現わ
すことが特徴である。その原因として、牛が摂食した牧
草にエンドファイトが感染しており、エンドファイト感
染個体からエルゴットアルカロイドであるエルゴバリン
が特異的に検出された。そしてエルゴバリンがフェスク
トキシコーシスを引起す原因物質であることが明らかに
なった。
合衆国南東部で発生した。トールフェスクを摂食した牛
の体重が著しく減少し、牧草を十分に食べなくなった
り、産乳量が低下したり、受胎率が低下する症状を現わ
すことが特徴である。その原因として、牛が摂食した牧
草にエンドファイトが感染しており、エンドファイト感
染個体からエルゴットアルカロイドであるエルゴバリン
が特異的に検出された。そしてエルゴバリンがフェスク
トキシコーシスを引起す原因物質であることが明らかに
なった。
【０００９】このように植物、とくに牧草として用いら
れる植物にエンドファイトを感染させることによって、
害虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速
度、暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上
する反面、家畜に対して有毒な物質をエンドファイトが
生合成し、ライグラススラッガーやフェスクトキシコー
シス等の原因になるという問題がある。
れる植物にエンドファイトを感染させることによって、
害虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速
度、暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上
する反面、家畜に対して有毒な物質をエンドファイトが
生合成し、ライグラススラッガーやフェスクトキシコー
シス等の原因になるという問題がある。
【００１０】本発明はこのような問題点に鑑みてなされ
たものであって、植物の形質が改善されるとともに、牧
草に応用した場合において有毒物質を生合成することが
ないようにした共生菌、このような共生菌を人工的に導
入した植物、および共生菌を人工的に導入するようにし
た共生菌の導入方法を提供することを目的とする。
たものであって、植物の形質が改善されるとともに、牧
草に応用した場合において有毒物質を生合成することが
ないようにした共生菌、このような共生菌を人工的に導
入した植物、および共生菌を人工的に導入するようにし
た共生菌の導入方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】共生菌それ自体に関する
発明は、糸状菌から成る共生菌において、最終的な代謝
物質がカノクラビン（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）であ
る共生菌に関するものである。ここで共生菌がＮｅｏｔ
ｙｐｈｏｄｉｕｍ属であってよい。また共生菌が生工研
寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１
７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４の内の何れか１種
または２種以上の菌であってよい。
発明は、糸状菌から成る共生菌において、最終的な代謝
物質がカノクラビン（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）であ
る共生菌に関するものである。ここで共生菌がＮｅｏｔ
ｙｐｈｏｄｉｕｍ属であってよい。また共生菌が生工研
寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１
７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４の内の何れか１種
または２種以上の菌であってよい。
【００１２】共生菌のスクリーニング方法に関する発明
は、カノクラビンをマーカーとして最終的な代謝物質が
カノクラビンである共生菌をスクリーニングするように
した共生菌のスクリーニング方法に関するものである。
ここでカノクラビンをマーカーとして、薄層クロマトグ
ラフィあるいは液体クロマトグラフィによってスクリー
ニングするようにしてよい。
は、カノクラビンをマーカーとして最終的な代謝物質が
カノクラビンである共生菌をスクリーニングするように
した共生菌のスクリーニング方法に関するものである。
ここでカノクラビンをマーカーとして、薄層クロマトグ
ラフィあるいは液体クロマトグラフィによってスクリー
ニングするようにしてよい。
【００１３】植物に関する発明は、最終的な代謝物質が
カノクラビンである共生菌を人工的に導入した植物に関
するものである。ここで共生菌がＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉ
ｕｍ属の糸状菌であってよい。また共生菌を人工的に導
入した植物がイネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、
Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの何れかであっ
てよい。またこのような植物から採取される後代種子で
あってよい。また後代種子から生育した植物であってよ
い。あるいはまた上記のような各種の植物または種子を
交配親とする交雑植物であってよい。
カノクラビンである共生菌を人工的に導入した植物に関
するものである。ここで共生菌がＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉ
ｕｍ属の糸状菌であってよい。また共生菌を人工的に導
入した植物がイネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、
Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの何れかであっ
てよい。またこのような植物から採取される後代種子で
あってよい。また後代種子から生育した植物であってよ
い。あるいはまた上記のような各種の植物または種子を
交配親とする交雑植物であってよい。
【００１４】共生菌の導入方法に関する一発明は、天然
に存在する植物体から共生菌を分離する工程と、分離さ
れた共生菌を人工培養する工程と、培養された共生菌を
対象とする植物に導入する工程と、導入された共生菌に
よって植物体に感染させる工程と、感染された共生菌中
の最終代謝物質がカノクラビンである植物体を選抜する
工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に関す
るものである。
に存在する植物体から共生菌を分離する工程と、分離さ
れた共生菌を人工培養する工程と、培養された共生菌を
対象とする植物に導入する工程と、導入された共生菌に
よって植物体に感染させる工程と、感染された共生菌中
の最終代謝物質がカノクラビンである植物体を選抜する
工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に関す
るものである。
【００１５】共生菌の導入方法に関する別の発明は、天
然に存在する植物体中から共生菌を分離する工程と、分
離された共生菌を人工培養する工程と、培養された共生
菌から最終代謝物質がカノクラビンである共生菌を選抜
する工程と、選抜された共生菌を対象とする植物に導入
する工程と、導入された共生菌によって植物体に感染さ
せる工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に
関するものである。
然に存在する植物体中から共生菌を分離する工程と、分
離された共生菌を人工培養する工程と、培養された共生
菌から最終代謝物質がカノクラビンである共生菌を選抜
する工程と、選抜された共生菌を対象とする植物に導入
する工程と、導入された共生菌によって植物体に感染さ
せる工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に
関するものである。
【００１６】共生菌のアルカロイドの代謝は図１に示さ
れる。このような代謝の中間物質としてカノクラビン
（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）が存在する。カノクラビ
ンは図２に示す化学構造を有するクラビンアルカロイド
の一種で各種の薬理効果を示すことが知られている。そ
してこのようなカノクラビンから、エルゴットアルカロ
イド等のエルゴバリンを生産する。ところが本願発明者
等が探索した共生菌の中には、エルゴットアルカロイド
を生合成せず、カノクラビンを最終的な代謝物質として
生産するものが存在した。そして最終的な代謝物質がカ
ノクラビンである共生菌は、エルゴバリン毒性を示さな
い。従ってこのような共生菌を植物に感染・共生せるこ
とによって、エルゴバリン毒性を示さない植物を提供で
きるようになる。
れる。このような代謝の中間物質としてカノクラビン
（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）が存在する。カノクラビ
ンは図２に示す化学構造を有するクラビンアルカロイド
の一種で各種の薬理効果を示すことが知られている。そ
してこのようなカノクラビンから、エルゴットアルカロ
イド等のエルゴバリンを生産する。ところが本願発明者
等が探索した共生菌の中には、エルゴットアルカロイド
を生合成せず、カノクラビンを最終的な代謝物質として
生産するものが存在した。そして最終的な代謝物質がカ
ノクラビンである共生菌は、エルゴバリン毒性を示さな
い。従ってこのような共生菌を植物に感染・共生せるこ
とによって、エルゴバリン毒性を示さない植物を提供で
きるようになる。
【００１７】本願発明は、カノクラビンを最終的な代謝
物質として生合成する共生菌に着目し、このような共生
菌を植物体に導入前または導入後にスクリーニングし、
植物体に感染させるようにしたものである。とくにイネ
科植物に感染・共生する共生菌として、Ｎｅｏｔｙｐｈ
ｏｄｉｕｍ属の糸状菌が挙げられる。
物質として生合成する共生菌に着目し、このような共生
菌を植物体に導入前または導入後にスクリーニングし、
植物体に感染させるようにしたものである。とくにイネ
科植物に感染・共生する共生菌として、Ｎｅｏｔｙｐｈ
ｏｄｉｕｍ属の糸状菌が挙げられる。
【００１８】このような糸状菌を利用することによっ
て、カノクラビンを最終代謝物質として生合成する糸状
菌が植物に感染・共生されることになり、エルゴバリン
毒性を示さないでしかも形質が改善された植物が作出さ
れる。またカノクラビンを最終代謝物質として生合成す
る糸状菌に感染した植物は、カノクラビンを生体内に大
量に蓄積するために、またカノクラビンをマーカーとし
てスクリーニングすることによって、エルゴバリンやロ
リトレムＢを生合成しない菌を提供することが可能にな
る。
て、カノクラビンを最終代謝物質として生合成する糸状
菌が植物に感染・共生されることになり、エルゴバリン
毒性を示さないでしかも形質が改善された植物が作出さ
れる。またカノクラビンを最終代謝物質として生合成す
る糸状菌に感染した植物は、カノクラビンを生体内に大
量に蓄積するために、またカノクラビンをマーカーとし
てスクリーニングすることによって、エルゴバリンやロ
リトレムＢを生合成しない菌を提供することが可能にな
る。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明の第１の実施の形態は、カ
ノクラビンを特異に生合成するエンドファイト感染個体
の提供と、カノクラビンをマーカーとして、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムＢを生合成しないエンド
ファイトのスクリーニングとを含むものである。以下に
この実施の形態をその手順に従って説明する。
ノクラビンを特異に生合成するエンドファイト感染個体
の提供と、カノクラビンをマーカーとして、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムＢを生合成しないエンド
ファイトのスクリーニングとを含むものである。以下に
この実施の形態をその手順に従って説明する。
【００２０】段階１ エンドファイトの存在の有無
の検出と分離工程 （１）エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内
のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エン
ドファイトの存在の有無の確認を行なう。
の検出と分離工程 （１）エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内
のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エン
ドファイトの存在の有無の確認を行なう。
【００２１】（２）エンドファイトの分離・培養工程 エンドファイトが確認された植物片を滅菌処理後に、エ
ンドファイト分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行な
う。
ンドファイト分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行な
う。
【００２２】（３）エンドファイトの分類工程 分離されたエンドファイトを宿主によって分類する。あ
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な特徴で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な特徴で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な特徴で分類する。
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な特徴で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な特徴で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な特徴で分類する。
【００２３】段階２ エンドファイトの導入工程 分離したエンドファイトを目的あるいは対象とするイネ
科植物であるＡｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｌｏ
ｌｉｕｍ、Ｐｏａの何れかの属の植物へ人工的に導入す
る。エンドファイトの導入方法は、植物体に直接接種す
る方法、植物体を一度カルス等の未分化の細胞にした後
に接種し、カルスから植物体を再生させる方法とがあ
る。これらはエンドファイトの導入の対象となる植物の
種類に応じて任意に選択されてよい。
科植物であるＡｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｌｏ
ｌｉｕｍ、Ｐｏａの何れかの属の植物へ人工的に導入す
る。エンドファイトの導入方法は、植物体に直接接種す
る方法、植物体を一度カルス等の未分化の細胞にした後
に接種し、カルスから植物体を再生させる方法とがあ
る。これらはエンドファイトの導入の対象となる植物の
種類に応じて任意に選択されてよい。
【００２４】段階３ 導入確認工程 エンドファイトを導入した個体は、外植片を染色液にて
染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫
測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有
無を検出する。
染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫
測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有
無を検出する。
【００２５】段階４ エンドファイト導入植物の検
定工程 （１）カノクラビンの検出工程 エンドファイトを感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析し、カノクラビン、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムＢの検出を行なう。
定工程 （１）カノクラビンの検出工程 エンドファイトを感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析し、カノクラビン、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムＢの検出を行なう。
【００２６】（２）カノクラビンの同定工程 エンドファイトに感染共生させた植物体内で特異に大量
に生合成されかつ蓄積されるアルカロイドがカノクラビ
ンかどうかによって、最終的な代謝物質がカノクラビン
であるかどうかの同定を行なう。
に生合成されかつ蓄積されるアルカロイドがカノクラビ
ンかどうかによって、最終的な代謝物質がカノクラビン
であるかどうかの同定を行なう。
【００２７】（３）耐虫性検定工程 エンドファイトを感染・共生させた植物を用いて、害虫
の対象となる昆虫を飼育し、人工的に食害試験を行な
う。
の対象となる昆虫を飼育し、人工的に食害試験を行な
う。
【００２８】（４）後代を用いた検定 エンドファイトが存在する種子を採取し、発芽させてエ
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。
【００２９】段階５ エンドファイトの人工培地上
でのカノクラビンの生合成工程 （１）エンドファイトの培養工程 分離されたエンドファイト菌単体を平板培養法あるいは
液体培養法を用いて環境条件を変化させた状態で培養を
行ない、アルカロイドを生合成させる。
でのカノクラビンの生合成工程 （１）エンドファイトの培養工程 分離されたエンドファイト菌単体を平板培養法あるいは
液体培養法を用いて環境条件を変化させた状態で培養を
行ない、アルカロイドを生合成させる。
【００３０】（２）培養物からカノクラビンを検出する
工程 菌単体を培養した培養物から生合成されたアルカロイド
を分析し、カノクラビン、エルゴットアルカロイド、お
よびロリトレムＢの検出を行なう。
工程 菌単体を培養した培養物から生合成されたアルカロイド
を分析し、カノクラビン、エルゴットアルカロイド、お
よびロリトレムＢの検出を行なう。
【００３１】段階６ カノクラビンをマーカーとす
るエンドファイトのスクリーニング工程 菌単体もしくは植物体への感染・共生において、エルゴ
ットアルカロイドおよびロリトレムＢを生合成せず、カ
ノクラビンのみを生合成しているエンドファイトをスク
リーニングする。
るエンドファイトのスクリーニング工程 菌単体もしくは植物体への感染・共生において、エルゴ
ットアルカロイドおよびロリトレムＢを生合成せず、カ
ノクラビンのみを生合成しているエンドファイトをスク
リーニングする。
【００３２】次に本発明の別の実施の形態について説明
する。上記の段階１〜段階６の実施の形態においては、
エンドファイトに感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析することによって、感染された
共生菌がカノクラビンを最終代謝物質として生合成する
共生菌であるかどうかの同定を行なうようにしている
が、このようなステップに代えて、共生菌が植物に人工
的に導入される前に、上記の同定を行なうようにする。
する。上記の段階１〜段階６の実施の形態においては、
エンドファイトに感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析することによって、感染された
共生菌がカノクラビンを最終代謝物質として生合成する
共生菌であるかどうかの同定を行なうようにしている
が、このようなステップに代えて、共生菌が植物に人工
的に導入される前に、上記の同定を行なうようにする。
【００３３】すなわちこの実施の形態においては、探索
等によって採取した植物から分離されたエンドファイト
を培養した後に、このエンドファイトのアルカロイドを
分析し、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌
であるかどうかの同定を行なうものである。すなわち上
記第１の実施の形態とは、カノクラビンによる同定の工
程の順序が植物体への導入の前に行なわれる点で相違す
る。なおその他の手順は上記第１の実施例と同じであ
る。
等によって採取した植物から分離されたエンドファイト
を培養した後に、このエンドファイトのアルカロイドを
分析し、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌
であるかどうかの同定を行なうものである。すなわち上
記第１の実施の形態とは、カノクラビンによる同定の工
程の順序が植物体への導入の前に行なわれる点で相違す
る。なおその他の手順は上記第１の実施例と同じであ
る。
【００３４】
【実施例】実施例１ （１）菌の分析 植物体からのエンドファイトの分離は、葉および葉鞘部
分を水洗後、７０％エタノール水溶液に１０秒間浸漬
し、次いで２．５％次亜塩素酸トリウム水溶液に１０分
間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、エンドファイト
分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養を行なっ
た。
分を水洗後、７０％エタノール水溶液に１０秒間浸漬
し、次いで２．５％次亜塩素酸トリウム水溶液に１０分
間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、エンドファイト
分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養を行なっ
た。
【００３５】分離培地は、ｐＨ５．６に調整したＰＤＡ
（ポテト デキストロース アガー）培地を１２１℃、
１５分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンと
をそれぞれ１００ｍｇ／ｌの濃度になるように添加し、
直径が９ｃｍのプラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分
注して使用した。
（ポテト デキストロース アガー）培地を１２１℃、
１５分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンと
をそれぞれ１００ｍｇ／ｌの濃度になるように添加し、
直径が９ｃｍのプラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分
注して使用した。
【００３６】置床後約３〜８週間後に、外植片から菌糸
が分離され、形成されたコロニーを直径が５ｍｍのコル
クボーラで取出し、同ＰＤＡ培地およびコーンミール寒
天培地に移植して増殖を行なった。
が分離され、形成されたコロニーを直径が５ｍｍのコル
クボーラで取出し、同ＰＤＡ培地およびコーンミール寒
天培地に移植して増殖を行なった。
【００３７】（２）平板培養法による菌叢でのエンドフ
ァイトの分類同定 ＰＤＡ培地に移植した菌糸は、２５℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培
地上での菌叢の表面は総て白色の綿状であって、菌叢の
裏面も白色であった。増殖速度は比較的遅く、コロニー
は１カ月で半径が約３ｃｍ程度にまでしか増殖しなかっ
た。コーンミール寒天培地では、ＰＤＡ培地と比べてさ
らに生育が著しく遅く、１カ月で半径が約１ｃｍ程度の
増殖であった。コロニーの形態については、ＰＤＡ培地
とほぼ同様であった。
ァイトの分類同定 ＰＤＡ培地に移植した菌糸は、２５℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培
地上での菌叢の表面は総て白色の綿状であって、菌叢の
裏面も白色であった。増殖速度は比較的遅く、コロニー
は１カ月で半径が約３ｃｍ程度にまでしか増殖しなかっ
た。コーンミール寒天培地では、ＰＤＡ培地と比べてさ
らに生育が著しく遅く、１カ月で半径が約１ｃｍ程度の
増殖であった。コロニーの形態については、ＰＤＡ培地
とほぼ同様であった。
【００３８】分離したエンドファイトを工業技術院生命
工学技術研究所へ寄託した。菌の表示および寄託番号は
次の通りである。
工学技術研究所へ寄託した。菌の表示および寄託番号は
次の通りである。
【００３９】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２ ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３ ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４ （３）スライドカルチャーによる菌糸の状態 スライドガラス上に厚さが２〜３ｍｍのＰＤＡ培地を載
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成とを調査した。なおこの培養は２５℃暗条件下におい
て行なった。結果の１例を図３に示す。
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成とを調査した。なおこの培養は２５℃暗条件下におい
て行なった。結果の１例を図３に示す。
【００４０】調査の結果、菌糸は総て無色であって、幅
が１〜２μｍ程度で総てに隔壁が観察された。分生子
は、総てのエンドファイトで容易に形成することが可能
であった。また分生子の菌糸の先端あるいは側方より直
立した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんど
が単生の分生子であった。
が１〜２μｍ程度で総てに隔壁が観察された。分生子
は、総てのエンドファイトで容易に形成することが可能
であった。また分生子の菌糸の先端あるいは側方より直
立した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんど
が単生の分生子であった。
【００４１】分生子の色は総て無色で、細胞も１細胞性
であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をな
し、大きさは３〜８×１〜３μｍであった。また形成さ
れたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従っ
て細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。
であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をな
し、大きさは３〜８×１〜３μｍであった。また形成さ
れたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従っ
て細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。
【００４２】（４）エンドファト導入方法 接種は水に０．８％のＡｇａｒを添加したＷＡ培地（Ｗ
ａｔｅｒ Ａｇａｒ培地）に種子を滅菌して播種し、暗
条件下で培養した。培養開始から３〜７日後に、植物体
の生長点部分にメスで切込みを入れ、ＰＤＡ培地で培養
した菌糸を挿入した。
ａｔｅｒ Ａｇａｒ培地）に種子を滅菌して播種し、暗
条件下で培養した。培養開始から３〜７日後に、植物体
の生長点部分にメスで切込みを入れ、ＰＤＡ培地で培養
した菌糸を挿入した。
【００４３】これらを２５℃および３０℃の暗条件下で
８日間培養した後に、１５℃、１６時間照明下に移して
４日間培養し、さらに２５℃、１６時間照明下に移して
２日以上培養し、緑色に生長してきた個体を鉢上げ馴化
した。
８日間培養した後に、１５℃、１６時間照明下に移して
４日間培養し、さらに２５℃、１６時間照明下に移して
２日以上培養し、緑色に生長してきた個体を鉢上げ馴化
した。
【００４４】植物の葉および葉鞘部分の表皮を剥ぎ、光
学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有無の確
認を行なった。この確認は、スライドガラスに乳酸５ｍ
ｌ、グリセリン１０ｍｌ、水５ｍｌ、アニリンブルー水
溶液０．０２ｇの染色液を数滴滴下する。そして葉鞘部
分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に向って
剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に置き、
カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰させ、光学
顕微鏡下において組織を観察した。この条件でエンドフ
ァイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するために、これ
によってエンドファイトの検出が行なわれる。
学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有無の確
認を行なった。この確認は、スライドガラスに乳酸５ｍ
ｌ、グリセリン１０ｍｌ、水５ｍｌ、アニリンブルー水
溶液０．０２ｇの染色液を数滴滴下する。そして葉鞘部
分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に向って
剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に置き、
カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰させ、光学
顕微鏡下において組織を観察した。この条件でエンドフ
ァイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するために、これ
によってエンドファイトの検出が行なわれる。
【００４５】検出の結果、イネ科植物であって、Ａｇｒ
ｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの
それぞれの属の植物からエンドファイトが検出された。
そして菌のライフサイクルから、植物体外へ出ることが
ない無性世代のみのＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ型エンド
ファイトであることが判明した。
ｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの
それぞれの属の植物からエンドファイトが検出された。
そして菌のライフサイクルから、植物体外へ出ることが
ない無性世代のみのＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ型エンド
ファイトであることが判明した。
【００４６】接種したエンドファイトの内、生工研寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６
７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４の菌株がイネ科植物で
あって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、
Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれの属の植物に感染・共生するこ
とが明らかであることが確認されている。
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６
７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４の菌株がイネ科植物で
あって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、
Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれの属の植物に感染・共生するこ
とが明らかであることが確認されている。
【００４７】（５）カルスを用いた人工接種 人工接種用の試料として、イネ科植物であって、Ａｇｒ
ｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの
それぞれのカルスの誘導を行なった。ＭＳ基本培地に
２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノ
キシン酢酸）と０．２ｍｇ／ｌのＢＡＰ（６−ベンジル
アミノプリン）を添加し、これらの植物のカルス誘導培
地とした。
ｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの
それぞれのカルスの誘導を行なった。ＭＳ基本培地に
２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノ
キシン酢酸）と０．２ｍｇ／ｌのＢＡＰ（６−ベンジル
アミノプリン）を添加し、これらの植物のカルス誘導培
地とした。
【００４８】ＭＳ培地において発芽直後の種子をカルス
誘導培地へ移植し、２５℃の暗条件下において２カ月間
培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。
各カルスは上記の誘導培地で誘導したものであって、得
られたカルスを植物ホルモン無添加のＭＳ基本培地へ移
植した。
誘導培地へ移植し、２５℃の暗条件下において２カ月間
培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。
各カルスは上記の誘導培地で誘導したものであって、得
られたカルスを植物ホルモン無添加のＭＳ基本培地へ移
植した。
【００４９】これらの植物のカルスに対して、生工研寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４のそれぞれの菌を人
工接種した。人工接種はメスの先に微量の菌糸を取り、
カルスの中央に置床した。
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４のそれぞれの菌を人
工接種した。人工接種はメスの先に微量の菌糸を取り、
カルスの中央に置床した。
【００５０】カルスは２５℃および３０℃の暗条件下に
おいてそれぞれ数週間培養した後に、１６時間照明下に
移すか、あるいは直ちに１６時間証明下に移して培養
し、再生したできた個体をフレッシュなＭＳ培地に移植
し、１カ月間培養した。これらを上記（１）項の方法を
用いてエンドファイトの導入を確認した結果、導入が確
認された。
おいてそれぞれ数週間培養した後に、１６時間照明下に
移すか、あるいは直ちに１６時間証明下に移して培養
し、再生したできた個体をフレッシュなＭＳ培地に移植
し、１カ月間培養した。これらを上記（１）項の方法を
用いてエンドファイトの導入を確認した結果、導入が確
認された。
【００５１】（６）植物体内でカノクラビンを特異的に
生合成する菌のスクリーニング方法 生工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４のそれぞれ
の菌を人工的に感染・共生させた植物およびそれ以外の
菌が感染・共生させた植物の葉および葉鞘をフリーズド
ライ処理したものを、クロロホルム／メタノール／２５
％アンモニア水＝７５／２５／０．５溶液で室温で一昼
夜撹拌抽出し、その後瀘紙にて瀘過してエバポレートし
た。これをＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）分析を行な
うことによってカノクラビンの存在を確認した。
生合成する菌のスクリーニング方法 生工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４のそれぞれ
の菌を人工的に感染・共生させた植物およびそれ以外の
菌が感染・共生させた植物の葉および葉鞘をフリーズド
ライ処理したものを、クロロホルム／メタノール／２５
％アンモニア水＝７５／２５／０．５溶液で室温で一昼
夜撹拌抽出し、その後瀘紙にて瀘過してエバポレートし
た。これをＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）分析を行な
うことによってカノクラビンの存在を確認した。
【００５２】シリカゲル６０プレート、クロロホルム／
メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開溶液
により展開した後に、Ｒｆ値が０．５〜０．６付近にＵ
ＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検出
されるスポットが図４に示すＴＬＣ分析によって確認さ
れている。このスポットはカノクラビンと全く同じＲｆ
値を示し、また図５に示すように、エンドファイト感染
植物抽出物とカノクラビンを重打ちしたＴＬＣ分析でも
全く同じＲｆ値にスポットが確認された。
メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開溶液
により展開した後に、Ｒｆ値が０．５〜０．６付近にＵ
ＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検出
されるスポットが図４に示すＴＬＣ分析によって確認さ
れている。このスポットはカノクラビンと全く同じＲｆ
値を示し、また図５に示すように、エンドファイト感染
植物抽出物とカノクラビンを重打ちしたＴＬＣ分析でも
全く同じＲｆ値にスポットが確認された。
【００５３】しかしながら図５中のレーン２およびレー
ン１５に見られるように、寄託菌以外のエンドファイト
感染植物においては、カノクラビンのスポットは確認さ
れなかった。同図においてレーン３およびレーン１６の
ように、レーン２およびレーン１５の抽出物にカノクラ
ビンを重打ちしたものには、カノクラビンが検出された
レーンと同様に、カノクラビンのスポットが確認され
た。
ン１５に見られるように、寄託菌以外のエンドファイト
感染植物においては、カノクラビンのスポットは確認さ
れなかった。同図においてレーン３およびレーン１６の
ように、レーン２およびレーン１５の抽出物にカノクラ
ビンを重打ちしたものには、カノクラビンが検出された
レーンと同様に、カノクラビンのスポットが確認され
た。
【００５４】以上の結果から、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕ
ｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を含む寄託菌
が、感染・共生した植物体内でカノクラビンを特異に生
合成するとともに蓄積していることが明らかになった。
またこのことから、カノクラビンの生合成および蓄積の
有無をマーカーとして、植物に感染・共生している菌を
スクリーニングすることが可能であることが証明され
た。
ｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を含む寄託菌
が、感染・共生した植物体内でカノクラビンを特異に生
合成するとともに蓄積していることが明らかになった。
またこのことから、カノクラビンの生合成および蓄積の
有無をマーカーとして、植物に感染・共生している菌を
スクリーニングすることが可能であることが証明され
た。
【００５５】またＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ．
ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を含む寄託菌を感染・共生さ
せた植物の後代種子から生育した植物であって、エンド
ファイトの伝播が確認されたものについても、カノクラ
ビンの有無をＴＬＣ分析で確認した。その結果後代の植
物体においても、もとの植物体と同様にカノクラビンの
生合成が行なわれていることが示された。
ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を含む寄託菌を感染・共生さ
せた植物の後代種子から生育した植物であって、エンド
ファイトの伝播が確認されたものについても、カノクラ
ビンの有無をＴＬＣ分析で確認した。その結果後代の植
物体においても、もとの植物体と同様にカノクラビンの
生合成が行なわれていることが示された。
【００５６】（７）人工培地上でカノクラビンを特異に
生合成する菌のスクリーニング方法。
生合成する菌のスクリーニング方法。
【００５７】エンドファイト感染植物体内でカノクラビ
ンが生合成された植物体からエンドファイト、例えばＮ
ｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６７２を分離した。分離はエンドファイト感染植物の葉
および葉鞘組織を７０％エタノール水溶液に１０秒間浸
漬し、次いで２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１
０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、５ｍｍ角の
大きさに切断し、エンドファイト分離培地上に置床し、
２５℃暗条件下で培養を行なった。
ンが生合成された植物体からエンドファイト、例えばＮ
ｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６７２を分離した。分離はエンドファイト感染植物の葉
および葉鞘組織を７０％エタノール水溶液に１０秒間浸
漬し、次いで２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１
０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、５ｍｍ角の
大きさに切断し、エンドファイト分離培地上に置床し、
２５℃暗条件下で培養を行なった。
【００５８】分離培地は、ＰＤＡ（ポテト デキストロ
ース アガー）にペニシリンおよびストレプトマイシン
をそれぞれ１００ｍｇ／ｌを添加し、直径が９ｃｍのプ
ラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分注して使用した。
ース アガー）にペニシリンおよびストレプトマイシン
をそれぞれ１００ｍｇ／ｌを添加し、直径が９ｃｍのプ
ラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分注して使用した。
【００５９】培養開始後３〜８週間で植物組織から菌糸
が分離された。さらに増殖させるために液体培地により
培養した。使用した培地は例えばＰＤ（ポテト デキス
トロース）培地、Ｍ１０２培地、エルゴットアルカロイ
ド生産培地としても知られているＳＭ培地等である。上
述の培地１００ｍｌにＰＤＡ培地で分離した菌糸塊５ｍ
ｍ角を入れ、２週間から長いもので６カ月間培養した。
が分離された。さらに増殖させるために液体培地により
培養した。使用した培地は例えばＰＤ（ポテト デキス
トロース）培地、Ｍ１０２培地、エルゴットアルカロイ
ド生産培地としても知られているＳＭ培地等である。上
述の培地１００ｍｌにＰＤＡ培地で分離した菌糸塊５ｍ
ｍ角を入れ、２週間から長いもので６カ月間培養した。
【００６０】カノクラビンの生合成を確認するために、
植物体と同様に培養物をフリーズドライ処理し、クロロ
ホルム／メタノール／２５％アンモニア水＝７５／２５
／０．５の溶液に入れ、室温で一昼夜撹拌抽出し、その
後瀘紙にて瀘過してエバポレートし、ＴＬＣ分析を行な
った。
植物体と同様に培養物をフリーズドライ処理し、クロロ
ホルム／メタノール／２５％アンモニア水＝７５／２５
／０．５の溶液に入れ、室温で一昼夜撹拌抽出し、その
後瀘紙にて瀘過してエバポレートし、ＴＬＣ分析を行な
った。
【００６１】また上記の試験と同様にシリカゲル６０プ
レート、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝２０／
１０／１／１の展開溶液により展開した後に、Ｒｆ値が
０．５〜０．６付近にＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色
（青紫色に呈色）で検出されるスポットが上記と同様
に、ＴＬＣ分析によって確認され、カノクラビンを生合
成していることが証明された。
レート、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝２０／
１０／１／１の展開溶液により展開した後に、Ｒｆ値が
０．５〜０．６付近にＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色
（青紫色に呈色）で検出されるスポットが上記と同様
に、ＴＬＣ分析によって確認され、カノクラビンを生合
成していることが証明された。
【００６２】（８）カノクラビンの同定 フリーズドライ処理したエンドファイト感染植物体、例
えば生工研寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４感染・共
生植物、および非感染個体の葉および葉鞘部分を８０％
メタノール水溶液を用いて室温で３０分以上振とう抽出
した。抽出液を瀘紙にて瀘過し、その瀘液を８０％メタ
ノール水溶液でサスペンドした陰イオン交換樹脂（ＡＧ
２×８２００〜４００ｍｅｓｈ）を充填し、２５％アン
モニア水で置換したＶＡＲＩＡＮ ＢＯＮＤ ＥＬＵＴ
ＣＢＡカラムに載せ、純水で洗滌した。そして５％ぎ
酸溶液によって溶出し、得られた分画をＴＬＣ（薄層ク
ロマトグラフィ）分析およびＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィ）分析に供した。
えば生工研寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４感染・共
生植物、および非感染個体の葉および葉鞘部分を８０％
メタノール水溶液を用いて室温で３０分以上振とう抽出
した。抽出液を瀘紙にて瀘過し、その瀘液を８０％メタ
ノール水溶液でサスペンドした陰イオン交換樹脂（ＡＧ
２×８２００〜４００ｍｅｓｈ）を充填し、２５％アン
モニア水で置換したＶＡＲＩＡＮ ＢＯＮＤ ＥＬＵＴ
ＣＢＡカラムに載せ、純水で洗滌した。そして５％ぎ
酸溶液によって溶出し、得られた分画をＴＬＣ（薄層ク
ロマトグラフィ）分析およびＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィ）分析に供した。
【００６３】得られた分画をＣ１８カラム（５μｍ ｐ
ａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ、１００×８ｍｍ）、ＵＶ２
８０ｎｍ 検出を用いたＨＰＬＣで分析した結果、エン
ドファイト感染植物から得られた分画のみに、図７に示
すようにリテンションタイム１２分付近に特異的に顕著
なピークが確認されている。なおエンドファイトに感染
していない植物の場合は、図６に示すようにこのような
ピークが確認されていない。
ａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ、１００×８ｍｍ）、ＵＶ２
８０ｎｍ 検出を用いたＨＰＬＣで分析した結果、エン
ドファイト感染植物から得られた分画のみに、図７に示
すようにリテンションタイム１２分付近に特異的に顕著
なピークが確認されている。なおエンドファイトに感染
していない植物の場合は、図６に示すようにこのような
ピークが確認されていない。
【００６４】またシリカゲル６０プレート、クロロホル
ム／メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開
溶液により展開した後に、Ｒｆ値０．５〜０．６付近に
ＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検
出されるスポットがＴＬＣ分析によって確認された。Ｔ
ＬＣで確認されたスポットもエンドファイト感染植物体
特異なものであって、非感染個体にはこのスポットは見
られなかった。
ム／メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開
溶液により展開した後に、Ｒｆ値０．５〜０．６付近に
ＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検
出されるスポットがＴＬＣ分析によって確認された。Ｔ
ＬＣで確認されたスポットもエンドファイト感染植物体
特異なものであって、非感染個体にはこのスポットは見
られなかった。
【００６５】このフラクションをＨＰＴＬＣで分取を行
なった。その結果、フリーズドライサンプルから平均し
て０．０６〜０．０８％の回収率で回収することができ
た。このフラクションはＨＰＬＣの蛍光検出による分析
でも陽性を示し、インドール構造を持つことが示唆され
た。そこでＮＭＲ、ＭＳおよびＩＲ（赤外線分析法）を
測定した。
なった。その結果、フリーズドライサンプルから平均し
て０．０６〜０．０８％の回収率で回収することができ
た。このフラクションはＨＰＬＣの蛍光検出による分析
でも陽性を示し、インドール構造を持つことが示唆され
た。そこでＮＭＲ、ＭＳおよびＩＲ（赤外線分析法）を
測定した。
【００６６】ＦＤ−ＭＳ（電界脱離イオン化分子量測定
法）の結果、Ｍ＋ ２５６が観測され、ＥＩ−ＭＳによ
るフラグメントイオンは分子ピークの２５６の他に、−
Ｈ３Ｏ＋ のｍ／ｚ２３７、ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｓｔ
ａｂｌｅ ｉｏｎ に起因するｍ／ｚ１５５、１５４等
クラビンアルカロイドに特徴的な解裂パターンを示し
た。またＥＩ−ＨＲ−ＭＳから示唆された分子式から検
索を行なったところ、カノクラビンが分子式、ＥＩによ
るフラグメンテーションパターンともによく一致するこ
とが解った。さらにＮＭＲ測定結果を図２のように帰属
し、単離したフラクションはカノクラビンと同定した。
ＩＲでは３４００（−ＯＨ）、１６０５（Ｃ＝Ｃ）、１
４２０、１３８０ｃｍ−１に吸収を示した。
法）の結果、Ｍ＋ ２５６が観測され、ＥＩ−ＭＳによ
るフラグメントイオンは分子ピークの２５６の他に、−
Ｈ３Ｏ＋ のｍ／ｚ２３７、ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｓｔ
ａｂｌｅ ｉｏｎ に起因するｍ／ｚ１５５、１５４等
クラビンアルカロイドに特徴的な解裂パターンを示し
た。またＥＩ−ＨＲ−ＭＳから示唆された分子式から検
索を行なったところ、カノクラビンが分子式、ＥＩによ
るフラグメンテーションパターンともによく一致するこ
とが解った。さらにＮＭＲ測定結果を図２のように帰属
し、単離したフラクションはカノクラビンと同定した。
ＩＲでは３４００（−ＯＨ）、１６０５（Ｃ＝Ｃ）、１
４２０、１３８０ｃｍ−１に吸収を示した。
【００６７】（９）エルゴバリンの同定 ここでは、エンドファイトに感染した植物中の共生菌で
あるエンドファイトがエルゴバリンを生産するかどうか
を確認するものである。まずフリーズドライ処理したエ
ンドファイト感染・共生植物体の葉および葉鞘部分、ま
たは穂の部分を０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液：ク
ロロホルム＝１：９の混合液を用い、室温で３０分以上
振とう抽出した。抽出液を瀘紙にて瀘過した。ここでク
ロロホルムでコンディショニングしたシリカゲルカラム
（Ｗａｔｅｒ Ｓｅｐ−ＰａｋＰｌａｓ Ｓｉｌｉｃ
ａ）に瀘液を載せ、クロロホルムで洗滌した。そしてア
セトン：クロロホルム：酢酸＝８０：２０：０．０５の
混合液で溶出した。その溶出液を濃縮乾燥固化させ、
０．１％アスコルビン酸含有３３％メタノール水溶液に
再溶出し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析
に供した。
あるエンドファイトがエルゴバリンを生産するかどうか
を確認するものである。まずフリーズドライ処理したエ
ンドファイト感染・共生植物体の葉および葉鞘部分、ま
たは穂の部分を０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液：ク
ロロホルム＝１：９の混合液を用い、室温で３０分以上
振とう抽出した。抽出液を瀘紙にて瀘過した。ここでク
ロロホルムでコンディショニングしたシリカゲルカラム
（Ｗａｔｅｒ Ｓｅｐ−ＰａｋＰｌａｓ Ｓｉｌｉｃ
ａ）に瀘液を載せ、クロロホルムで洗滌した。そしてア
セトン：クロロホルム：酢酸＝８０：２０：０．０５の
混合液で溶出した。その溶出液を濃縮乾燥固化させ、
０．１％アスコルビン酸含有３３％メタノール水溶液に
再溶出し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析
に供した。
【００６８】ＨＰＬＣ分析は、Ｃ１８カラム（３μｍ
ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ， ４．６Ｘ７５ｍｍ）、
Ｅｘ（励起波長）３１０ｎｍ、Ｅｍ（蛍光波長）４１５
ｎｍ蛍光検出を用いた。エルゴバリンの標品である酒石
酸エルゴバリンをＨＰＬＣ分析した結果、図８に示すよ
うに、リテンションタイム１２分付近にエルゴバリンの
ピークが確認された。すなわち標品エルゴバリンの場合
には、リテンションタイム１２．３５のピークを示すこ
とになる。
ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ， ４．６Ｘ７５ｍｍ）、
Ｅｘ（励起波長）３１０ｎｍ、Ｅｍ（蛍光波長）４１５
ｎｍ蛍光検出を用いた。エルゴバリンの標品である酒石
酸エルゴバリンをＨＰＬＣ分析した結果、図８に示すよ
うに、リテンションタイム１２分付近にエルゴバリンの
ピークが確認された。すなわち標品エルゴバリンの場合
には、リテンションタイム１２．３５のピークを示すこ
とになる。
【００６９】エンドファイト感染植物体のエルゴバリン
生合成の有無は、エンドファイト感染植物から上記の方
法で得られた溶出液に、ＨＰＬＣ分析で標品と同様なリ
テンションタイム１２分付近にピークが確認されるかど
うかで判断した。その結果、寄託菌以外のエンドファイ
ト感染植物では、図９に示すように、リテンションタイ
ム１２分付近にエルゴバリンが約１ｐｐｍ（乾燥重量当
り）オーダーで検出された。すなわち寄託菌以外のエン
ドファイト感染植物においては、標品エルゴバリンと同
様なリテンションタイム付近、すなわち１２．５１にピ
ークがあり、これがエルゴバリンであることを確認し
た。なおここで濃度は乾燥重量当り約１ｐｐｍであっ
た。
生合成の有無は、エンドファイト感染植物から上記の方
法で得られた溶出液に、ＨＰＬＣ分析で標品と同様なリ
テンションタイム１２分付近にピークが確認されるかど
うかで判断した。その結果、寄託菌以外のエンドファイ
ト感染植物では、図９に示すように、リテンションタイ
ム１２分付近にエルゴバリンが約１ｐｐｍ（乾燥重量当
り）オーダーで検出された。すなわち寄託菌以外のエン
ドファイト感染植物においては、標品エルゴバリンと同
様なリテンションタイム付近、すなわち１２．５１にピ
ークがあり、これがエルゴバリンであることを確認し
た。なおここで濃度は乾燥重量当り約１ｐｐｍであっ
た。
【００７０】これに対して生工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１７６７２の寄託菌が感染したエンドファイト感染植
物を用い、上記と同様の方法によってＨＰＬＣ分析を行
なったところ、図１０に示すようにエルゴバリンが検出
されなかった。すなわちＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２の寄
託菌が感染した感染植物体においては、リテンションタ
イム１２分付近に全くピークがなく、エルゴバリンが生
産されないことが確認された。よって以上の結果から、
ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２に感染した植物体は、家畜毒
性物質であるエルゴバリンを生合成していないことが明
白になった。ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７６７４においても同様の結果が得られた。
−１７６７２の寄託菌が感染したエンドファイト感染植
物を用い、上記と同様の方法によってＨＰＬＣ分析を行
なったところ、図１０に示すようにエルゴバリンが検出
されなかった。すなわちＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２の寄
託菌が感染した感染植物体においては、リテンションタ
イム１２分付近に全くピークがなく、エルゴバリンが生
産されないことが確認された。よって以上の結果から、
ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２に感染した植物体は、家畜毒
性物質であるエルゴバリンを生合成していないことが明
白になった。ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７６７４においても同様の結果が得られた。
【００７１】（１０）耐虫性による他の菌との比較検証 例えばＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７２を上述の方法で感染・共生させたＰｏａ
属植物および寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物
を用いて、芝草の主要害虫であるスジキリヨトウに対す
る耐虫性検定を行なった。
Ｐ−１７６７２を上述の方法で感染・共生させたＰｏａ
属植物および寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物
を用いて、芝草の主要害虫であるスジキリヨトウに対す
る耐虫性検定を行なった。
【００７２】耐虫性検定は上述のそれぞれの切葉片を静
置した９ｃｍシャーレに、ふ化直後のスジキリヨトウの
幼虫を約２００匹放ち、２５℃の室内に静置し、２４時
間後、４８時間後にそれぞれ摂食程度を調査した。４８
時間後には寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体
はほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄ
ｉｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を感染・共
生させた植物体は、ほとんど葉が残って強い抵抗性を示
していた。ＰｏａおよびＬｏｌｉｕｍについての結果が
図１１および図１２にそれぞれ示される。
置した９ｃｍシャーレに、ふ化直後のスジキリヨトウの
幼虫を約２００匹放ち、２５℃の室内に静置し、２４時
間後、４８時間後にそれぞれ摂食程度を調査した。４８
時間後には寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体
はほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄ
ｉｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を感染・共
生させた植物体は、ほとんど葉が残って強い抵抗性を示
していた。ＰｏａおよびＬｏｌｉｕｍについての結果が
図１１および図１２にそれぞれ示される。
【００７３】また例えばＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓ
ｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を上記の方法で感染・
共生させたＬｏｌｉｕｍ属植物および寄託菌以外の菌株
を感染・共生させた同じ植物を用いて、芝草の主要害虫
であるスジキリヨトウに対する耐虫性検定を上述のＰｏ
ａ属の植物と同様に行なった。
ｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を上記の方法で感染・
共生させたＬｏｌｉｕｍ属植物および寄託菌以外の菌株
を感染・共生させた同じ植物を用いて、芝草の主要害虫
であるスジキリヨトウに対する耐虫性検定を上述のＰｏ
ａ属の植物と同様に行なった。
【００７４】検定開始から２４時間後のスジキリヨトウ
の摂食程度を調査したところ、上記Ｐｏａ属植物と全く
同様に、寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体は
ほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉ
ｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を感染・共生
させた植物体は、ほとんど葉が残り、強い抵抗性を示し
た。
の摂食程度を調査したところ、上記Ｐｏａ属植物と全く
同様に、寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体は
ほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉ
ｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７２を感染・共生
させた植物体は、ほとんど葉が残り、強い抵抗性を示し
た。
【００７５】このような結果は、その他の寄託菌ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４を用い
た場合も同様であった。
Ｍ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７４を用い
た場合も同様であった。
【００７６】以上の結果から、生工研寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７６７４は感染・共生させた植物体に強度な
耐虫性を付与する特性があることが表１に示すように確
認された。
Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７６７４は感染・共生させた植物体に強度な
耐虫性を付与する特性があることが表１に示すように確
認された。
【００７７】
【表１】 実施例２ この実施例は、植物体に感染・共生する前のエンドファ
イトを上記実施例１の（７）項のスクリーニング方法に
よってスクリーニングし、カノクラビンが生合成され、
しかも最終的な代謝物質がカノクラビンであるエンドフ
ァイトを選抜している。そしてこのようにしてスクリー
ニングされた共生菌を上記実施例１の（４）項の方法に
よって上記実施例１と同様の植物、すなわちイネ科のＡ
ｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕ
ｍのそれぞれの植物に感染させたものである。感染させ
た植物について、実施例１の（６）項の方法によってス
クリーニングを行なったところ、カノクラビンを最終的
な代謝物質とする共生菌が感染・共生されていることが
確認された。またこのような植物について、実施例１の
（１０）項の方法によって耐虫性の検定を行なったとこ
ろ、実施例１とほぼ同様の結果が得られている。
イトを上記実施例１の（７）項のスクリーニング方法に
よってスクリーニングし、カノクラビンが生合成され、
しかも最終的な代謝物質がカノクラビンであるエンドフ
ァイトを選抜している。そしてこのようにしてスクリー
ニングされた共生菌を上記実施例１の（４）項の方法に
よって上記実施例１と同様の植物、すなわちイネ科のＡ
ｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕ
ｍのそれぞれの植物に感染させたものである。感染させ
た植物について、実施例１の（６）項の方法によってス
クリーニングを行なったところ、カノクラビンを最終的
な代謝物質とする共生菌が感染・共生されていることが
確認された。またこのような植物について、実施例１の
（１０）項の方法によって耐虫性の検定を行なったとこ
ろ、実施例１とほぼ同様の結果が得られている。
【００７８】
【発明の効果】以上のように本発明は、糸状菌から成る
共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビンであ
る共生菌、およびこのような共生菌が人工的に導入され
た植物、および植物に対する共生菌の導入方法に関する
ものである。
共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビンであ
る共生菌、およびこのような共生菌が人工的に導入され
た植物、および植物に対する共生菌の導入方法に関する
ものである。
【００７９】従ってこのような発明によれば、共生菌が
人工的に感染・共生された植物がエルゴバリン等のエル
ゴットアルカロイドおよびロリトレムＢ等の毒性物質を
生合成することがなく、このために牧草に応用した場合
に家畜毒性を生ずることがなくなる。従ってライグラス
スラッガーやフェスクトキシコーシスの発生を未然に防
止することが可能になる。しかも感染・共生されたエン
ドファイトによってとくに虫に対して強度な抵抗性を示
すことになり、耐虫性に優れるとともに家畜毒性をもた
ない植物体が提供されることになる。
人工的に感染・共生された植物がエルゴバリン等のエル
ゴットアルカロイドおよびロリトレムＢ等の毒性物質を
生合成することがなく、このために牧草に応用した場合
に家畜毒性を生ずることがなくなる。従ってライグラス
スラッガーやフェスクトキシコーシスの発生を未然に防
止することが可能になる。しかも感染・共生されたエン
ドファイトによってとくに虫に対して強度な抵抗性を示
すことになり、耐虫性に優れるとともに家畜毒性をもた
ない植物体が提供されることになる。
【図１】共生菌のアルカロイドの代謝を示すフローチャ
ートである。
ートである。
【図２】カノクラビンの化学構造を示す構造図である。
【図３】糸状菌の形態を示す写真である。
【図４】薄層クロマトグラフィのデータを示す写真およ
び解析図である。
び解析図である。
【図５】薄層クロマトグラフィのデータを示す写真およ
び解析図である。
び解析図である。
【図６】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図７】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図８】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図９】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図１０】高速液体クロマトグラフィによる結果を示す
グラフである。
グラフである。
【図１１】耐虫性の検定を示す写真である。
【図１２】耐虫性の検定を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 比留間 直也 静岡県富士宮市万野原新田3278番地26号サ ングリーン荻原Ａ−201号 (72)発明者 栗原 庸輔 静岡県富士宮市大岩177番地２号コーポ桑 山201号 (72)発明者 篠崎 聡 東京都中央区勝どき５丁目13番２号の1012 (72)発明者 島池 美帆 東京都品川区南大井６丁目18番２号−510 (72)発明者 水谷 純也 北海道札幌市西区西野７条６丁目14番22号 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB01 CD03 CD06 CD09 CD15 CD17 4B065 AA58X AC20 CA18 CA53
Claims (14)
- 【請求項１】糸状菌から成る共生菌において、最終的な
代謝物質がカノクラビンであることを特徴とする共生
菌。 - 【請求項２】共生菌がＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属であ
る請求項１に記載の共生菌。 - 【請求項３】共生菌が生工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
７６７２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ Ｐ−
１７６７４の内の何れか１種または２種以上の菌である
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の共生
菌。 - 【請求項４】カノクラビンをマーカーとして最終的な代
謝物質がカノクラビンである共生菌をスクリーニングす
ることを特徴とする共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項５】カノクラビンをマーカーとして、薄層クロ
マトグラフィによってスクリーニングすることを特徴と
する請求項４に記載の共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項６】カノクラビンをマーカーとして、液体クロ
マトグラフィによってスクリーニングすることを特徴と
する請求項４に記載の共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項７】最終的な代謝物質がカノクラビンである共
生菌を人工的に導入した植物。 - 【請求項８】共生菌がＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸
状菌であることを特徴とする請求項７に記載の植物。 - 【請求項９】共生菌を人工的に導入した植物がイネ科植
物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏ
ａ、Ｌｏｌｉｕｍの何れかであることを特徴とする請求
項７または請求項８に記載の植物。 - 【請求項１０】請求項７〜請求項９の何れかの植物から
採取された後代種子。 - 【請求項１１】請求項１０の種子から生育した植物。
- 【請求項１２】請求項７〜請求項１１の植物または種子
を交配親とする交雑植物。 - 【請求項１３】天然に存在する植物体から共生菌を分離
する工程と、 分離された共生菌を人工培養する工程と、 培養された共生菌を対象とする植物に導入する工程と、 導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、 感染された共生菌中の最終代謝物質がカノクラビンであ
る植物体を選抜する工程と、 を具備する植物体への共生菌の導入方法。 - 【請求項１４】天然に存在する植物体中から共生菌を分
離する工程と、 分離された共生菌を人工培養する工程と、 培養された共生菌から最終代謝物質がカノクラビンであ
る共生菌を選抜する工程と、 選抜された共生菌を対象とする植物に導入する工程と、 導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、 を具備する植物体への共生菌の導入方法。
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|---|---|---|---|
| JP2000103599A JP4514280B2 (ja) | 2000-04-05 | 2000-04-05 | 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法 |
| US09/824,590 US6805859B2 (en) | 2000-04-05 | 2001-04-03 | Symbiotic fungus |
| EP01303224A EP1142986A3 (en) | 2000-04-05 | 2001-04-05 | Chanoclavine-producing endophytic fungi of the genus Neotyphodium, and artificially endophyte-infected plants |
| US10/671,731 US20040117873A1 (en) | 2000-04-05 | 2003-09-29 | Plant into which symbiotic fungus is artificially introduced, and method of introducing symbiotic fungus into plant |
| US12/073,482 US8017111B2 (en) | 2000-04-05 | 2008-03-06 | Method of introducing symbiotic fungus into plant |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2000103599A JP4514280B2 (ja) | 2000-04-05 | 2000-04-05 | 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000103599A Expired - Fee Related JP4514280B2 (ja) | 2000-04-05 | 2000-04-05 | 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6805859B2 (ja) |
| EP (1) | EP1142986A3 (ja) |
| JP (1) | JP4514280B2 (ja) |
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| AU2008216407A1 (en) | 2007-02-12 | 2008-08-21 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Fungal endophytes of Elymus canadensis |
| CA2673696A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-25 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Enhancement of biomass and productivity in grasses |
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| JPH10271930A (ja) * | 1997-03-28 | 1998-10-13 | Nippon Shiryo Sakumotsu Shiyushi Kyokai | フェスクおよびフェスクへの共生菌の導入方法 |
| JPH11302112A (ja) * | 1998-04-23 | 1999-11-02 | Kumiai Chem Ind Co Ltd | 植物生長調節剤組成物 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH1098942A (ja) * | 1996-09-27 | 1998-04-21 | Nippon Shiryo Sakumotsu Shiyushi Kyokai | ラフブルーグラスおよびラフブルーグラスへの共生菌の導入方法 |
-
2000
- 2000-04-05 JP JP2000103599A patent/JP4514280B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-04-03 US US09/824,590 patent/US6805859B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-05 EP EP01303224A patent/EP1142986A3/en not_active Ceased
-
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- 2003-09-29 US US10/671,731 patent/US20040117873A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-03-06 US US12/073,482 patent/US8017111B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| JPS61502373A (ja) * | 1984-06-01 | 1986-10-23 | シエ−リング アクチエンゲゼルシヤフト | カノクラビンの製法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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