JP2001286277A - 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法 - Google Patents
共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法Info
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Abstract
かも虫に対する強度な抵抗性を有する植物体を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】Neotyphodium属の糸状菌から
成る共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビン
である糸状菌を植物体に人工的に導入し、感染・共生さ
せるようにしたものである。
Description
クリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、
植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植
物、植物体への共生菌の導入方法に係るものである。と
くに本発明は、カノクラビンを最終的な代謝物質とする
共生菌、すなわちエンドファイトおよびこのようなエン
ドファイトを牧草等に利用可能な植物に感染・共生させ
るようにした植物とその方法とに関するものである。
は、ペレニアルライグラスから誘導した植物体、例えば
カルス中にエンドファイトが共生しているかどうかを検
定し、エンドファイトが共生していないことを確認した
カルスにエンドファイトを導入した後に、植物体を再生
するようにしたペレニアルライグラスへのエンドファイ
トの人工導入方法が開示されている。
植物組織内に共生する糸状菌であって、このような糸状
菌が感染した植物体は、共生していない個体に比べて害
虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速度、
暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上する
ことが知られている。このことから、エンドファイトの
人工的な感染が、植物に対する形質の改善につながる。
生することが可能な共生菌は、図1に示すような代謝物
質を順次生合成する。そしてこのような代謝の最終物質
として、エルゴバリンやエルゴタミンのようなエルゴペ
プチンが生合成される。
イトの場合には、感染した植物はエルゴットアルカロイ
ドによって毒性を示すことが知られている。このような
毒性は、畜産業の分野では家畜毒性として問題視されて
いる。とくに牧草の分野において、ペレニアルライグラ
スやトールフェスク等のエンドファイトに感染した牧草
が流通し、エルゴットアルカロイド等が原因とする中毒
が報告されている。
ージーランドで最初に報告され、ニュージーランドとオ
ーストラリアのオセアニア2国で主に発生している。夏
から秋にかけての乾燥の厳しさで枯れあがった状態のペ
レニアルライグラスにエンドファイトが感染している場
合には、この牧草を羊等の家畜が摂食した場合にライグ
ラススラッガーが発生する。
家畜が四肢を硬直させ、首や肩、さらには側腹部を震わ
せるようになる。すなわち一種の痙攣であって、この状
態が続くとやがて家畜はその身体が衰弱していき、最悪
の場合には動けなくなって餓死することがある。これま
でにその原因物質が、ロリトレムアルカロイドであるロ
リトレムBであることが判明している。
合衆国南東部で発生した。トールフェスクを摂食した牛
の体重が著しく減少し、牧草を十分に食べなくなった
り、産乳量が低下したり、受胎率が低下する症状を現わ
すことが特徴である。その原因として、牛が摂食した牧
草にエンドファイトが感染しており、エンドファイト感
染個体からエルゴットアルカロイドであるエルゴバリン
が特異的に検出された。そしてエルゴバリンがフェスク
トキシコーシスを引起す原因物質であることが明らかに
なった。
れる植物にエンドファイトを感染させることによって、
害虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速
度、暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上
する反面、家畜に対して有毒な物質をエンドファイトが
生合成し、ライグラススラッガーやフェスクトキシコー
シス等の原因になるという問題がある。
たものであって、植物の形質が改善されるとともに、牧
草に応用した場合において有毒物質を生合成することが
ないようにした共生菌、このような共生菌を人工的に導
入した植物、および共生菌を人工的に導入するようにし
た共生菌の導入方法を提供することを目的とする。
発明は、糸状菌から成る共生菌において、最終的な代謝
物質がカノクラビン(chanoclavine)であ
る共生菌に関するものである。ここで共生菌がNeot
yphodium属であってよい。また共生菌が生工研
寄託番号FERM P−17672、FERM P−1
7673、FERM P−17674の内の何れか1種
または2種以上の菌であってよい。
は、カノクラビンをマーカーとして最終的な代謝物質が
カノクラビンである共生菌をスクリーニングするように
した共生菌のスクリーニング方法に関するものである。
ここでカノクラビンをマーカーとして、薄層クロマトグ
ラフィあるいは液体クロマトグラフィによってスクリー
ニングするようにしてよい。
カノクラビンである共生菌を人工的に導入した植物に関
するものである。ここで共生菌がNeotyphodi
um属の糸状菌であってよい。また共生菌を人工的に導
入した植物がイネ科植物であって、Agrostis、
Festuca、Poa、Loliumの何れかであっ
てよい。またこのような植物から採取される後代種子で
あってよい。また後代種子から生育した植物であってよ
い。あるいはまた上記のような各種の植物または種子を
交配親とする交雑植物であってよい。
に存在する植物体から共生菌を分離する工程と、分離さ
れた共生菌を人工培養する工程と、培養された共生菌を
対象とする植物に導入する工程と、導入された共生菌に
よって植物体に感染させる工程と、感染された共生菌中
の最終代謝物質がカノクラビンである植物体を選抜する
工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に関す
るものである。
然に存在する植物体中から共生菌を分離する工程と、分
離された共生菌を人工培養する工程と、培養された共生
菌から最終代謝物質がカノクラビンである共生菌を選抜
する工程と、選抜された共生菌を対象とする植物に導入
する工程と、導入された共生菌によって植物体に感染さ
せる工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に
関するものである。
れる。このような代謝の中間物質としてカノクラビン
(chanoclavine)が存在する。カノクラビ
ンは図2に示す化学構造を有するクラビンアルカロイド
の一種で各種の薬理効果を示すことが知られている。そ
してこのようなカノクラビンから、エルゴットアルカロ
イド等のエルゴバリンを生産する。ところが本願発明者
等が探索した共生菌の中には、エルゴットアルカロイド
を生合成せず、カノクラビンを最終的な代謝物質として
生産するものが存在した。そして最終的な代謝物質がカ
ノクラビンである共生菌は、エルゴバリン毒性を示さな
い。従ってこのような共生菌を植物に感染・共生せるこ
とによって、エルゴバリン毒性を示さない植物を提供で
きるようになる。
物質として生合成する共生菌に着目し、このような共生
菌を植物体に導入前または導入後にスクリーニングし、
植物体に感染させるようにしたものである。とくにイネ
科植物に感染・共生する共生菌として、Neotyph
odium属の糸状菌が挙げられる。
て、カノクラビンを最終代謝物質として生合成する糸状
菌が植物に感染・共生されることになり、エルゴバリン
毒性を示さないでしかも形質が改善された植物が作出さ
れる。またカノクラビンを最終代謝物質として生合成す
る糸状菌に感染した植物は、カノクラビンを生体内に大
量に蓄積するために、またカノクラビンをマーカーとし
てスクリーニングすることによって、エルゴバリンやロ
リトレムBを生合成しない菌を提供することが可能にな
る。
ノクラビンを特異に生合成するエンドファイト感染個体
の提供と、カノクラビンをマーカーとして、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムBを生合成しないエンド
ファイトのスクリーニングとを含むものである。以下に
この実施の形態をその手順に従って説明する。
の検出と分離工程 (1)エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内
のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エン
ドファイトの存在の有無の確認を行なう。
ンドファイト分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行な
う。
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な特徴で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な特徴で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な特徴で分類する。
科植物であるAgrostis、Festuca、Lo
lium、Poaの何れかの属の植物へ人工的に導入す
る。エンドファイトの導入方法は、植物体に直接接種す
る方法、植物体を一度カルス等の未分化の細胞にした後
に接種し、カルスから植物体を再生させる方法とがあ
る。これらはエンドファイトの導入の対象となる植物の
種類に応じて任意に選択されてよい。
染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫
測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有
無を検出する。
定工程 (1)カノクラビンの検出工程 エンドファイトを感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析し、カノクラビン、エルゴット
アルカロイドおよびロリトレムBの検出を行なう。
に生合成されかつ蓄積されるアルカロイドがカノクラビ
ンかどうかによって、最終的な代謝物質がカノクラビン
であるかどうかの同定を行なう。
の対象となる昆虫を飼育し、人工的に食害試験を行な
う。
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。
でのカノクラビンの生合成工程 (1)エンドファイトの培養工程 分離されたエンドファイト菌単体を平板培養法あるいは
液体培養法を用いて環境条件を変化させた状態で培養を
行ない、アルカロイドを生合成させる。
工程 菌単体を培養した培養物から生合成されたアルカロイド
を分析し、カノクラビン、エルゴットアルカロイド、お
よびロリトレムBの検出を行なう。
るエンドファイトのスクリーニング工程 菌単体もしくは植物体への感染・共生において、エルゴ
ットアルカロイドおよびロリトレムBを生合成せず、カ
ノクラビンのみを生合成しているエンドファイトをスク
リーニングする。
する。上記の段階1〜段階6の実施の形態においては、
エンドファイトに感染・共生させた植物体内で生合成さ
れるアルカロイドを分析することによって、感染された
共生菌がカノクラビンを最終代謝物質として生合成する
共生菌であるかどうかの同定を行なうようにしている
が、このようなステップに代えて、共生菌が植物に人工
的に導入される前に、上記の同定を行なうようにする。
等によって採取した植物から分離されたエンドファイト
を培養した後に、このエンドファイトのアルカロイドを
分析し、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌
であるかどうかの同定を行なうものである。すなわち上
記第1の実施の形態とは、カノクラビンによる同定の工
程の順序が植物体への導入の前に行なわれる点で相違す
る。なおその他の手順は上記第1の実施例と同じであ
る。
分を水洗後、70%エタノール水溶液に10秒間浸漬
し、次いで2.5%次亜塩素酸トリウム水溶液に10分
間浸漬した後に、滅菌水で3回洗滌し、エンドファイト
分離培地上に置床し、25℃暗条件下で培養を行なっ
た。
(ポテト デキストロース アガー)培地を121℃、
15分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンと
をそれぞれ100mg/lの濃度になるように添加し、
直径が9cmのプラスチックシャーレに20mlずつ分
注して使用した。
が分離され、形成されたコロニーを直径が5mmのコル
クボーラで取出し、同PDA培地およびコーンミール寒
天培地に移植して増殖を行なった。
ァイトの分類同定 PDA培地に移植した菌糸は、25℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培
地上での菌叢の表面は総て白色の綿状であって、菌叢の
裏面も白色であった。増殖速度は比較的遅く、コロニー
は1カ月で半径が約3cm程度にまでしか増殖しなかっ
た。コーンミール寒天培地では、PDA培地と比べてさ
らに生育が著しく遅く、1カ月で半径が約1cm程度の
増殖であった。コロニーの形態については、PDA培地
とほぼ同様であった。
工学技術研究所へ寄託した。菌の表示および寄託番号は
次の通りである。
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成とを調査した。なおこの培養は25℃暗条件下におい
て行なった。結果の1例を図3に示す。
が1〜2μm程度で総てに隔壁が観察された。分生子
は、総てのエンドファイトで容易に形成することが可能
であった。また分生子の菌糸の先端あるいは側方より直
立した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんど
が単生の分生子であった。
であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をな
し、大きさは3〜8×1〜3μmであった。また形成さ
れたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従っ
て細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。
ater Agar培地)に種子を滅菌して播種し、暗
条件下で培養した。培養開始から3〜7日後に、植物体
の生長点部分にメスで切込みを入れ、PDA培地で培養
した菌糸を挿入した。
8日間培養した後に、15℃、16時間照明下に移して
4日間培養し、さらに25℃、16時間照明下に移して
2日以上培養し、緑色に生長してきた個体を鉢上げ馴化
した。
学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有無の確
認を行なった。この確認は、スライドガラスに乳酸5m
l、グリセリン10ml、水5ml、アニリンブルー水
溶液0.02gの染色液を数滴滴下する。そして葉鞘部
分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に向って
剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に置き、
カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰させ、光学
顕微鏡下において組織を観察した。この条件でエンドフ
ァイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するために、これ
によってエンドファイトの検出が行なわれる。
ostis、Festuca、Poa、Loliumの
それぞれの属の植物からエンドファイトが検出された。
そして菌のライフサイクルから、植物体外へ出ることが
ない無性世代のみのNeotyphodium型エンド
ファイトであることが判明した。
番号FERM P−17672、FERM P−176
73、FERM P−17674の菌株がイネ科植物で
あって、Agrostis、Festuca、Poa、
Loliumのそれぞれの属の植物に感染・共生するこ
とが明らかであることが確認されている。
ostis、Festuca、Poa、Loliumの
それぞれのカルスの誘導を行なった。MS基本培地に
2.0mg/lの2,4−D(2,4−ジクロロフェノ
キシン酢酸)と0.2mg/lのBAP(6−ベンジル
アミノプリン)を添加し、これらの植物のカルス誘導培
地とした。
誘導培地へ移植し、25℃の暗条件下において2カ月間
培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。
各カルスは上記の誘導培地で誘導したものであって、得
られたカルスを植物ホルモン無添加のMS基本培地へ移
植した。
託番号FERM P−17672、FERM P−17
673、FERM P−17674のそれぞれの菌を人
工接種した。人工接種はメスの先に微量の菌糸を取り、
カルスの中央に置床した。
おいてそれぞれ数週間培養した後に、16時間照明下に
移すか、あるいは直ちに16時間証明下に移して培養
し、再生したできた個体をフレッシュなMS培地に移植
し、1カ月間培養した。これらを上記(1)項の方法を
用いてエンドファイトの導入を確認した結果、導入が確
認された。
生合成する菌のスクリーニング方法 生工研寄託番号FERM P−17672、FERM
P−17673、FERM P−17674のそれぞれ
の菌を人工的に感染・共生させた植物およびそれ以外の
菌が感染・共生させた植物の葉および葉鞘をフリーズド
ライ処理したものを、クロロホルム/メタノール/25
%アンモニア水=75/25/0.5溶液で室温で一昼
夜撹拌抽出し、その後瀘紙にて瀘過してエバポレートし
た。これをTLC(薄層クロマトグラフィ)分析を行な
うことによってカノクラビンの存在を確認した。
メタノール/酢酸/水=20/10/1/1の展開溶液
により展開した後に、Rf値が0.5〜0.6付近にU
VおよびEherlich呈色(青紫色に呈色)で検出
されるスポットが図4に示すTLC分析によって確認さ
れている。このスポットはカノクラビンと全く同じRf
値を示し、また図5に示すように、エンドファイト感染
植物抽出物とカノクラビンを重打ちしたTLC分析でも
全く同じRf値にスポットが確認された。
ン15に見られるように、寄託菌以外のエンドファイト
感染植物においては、カノクラビンのスポットは確認さ
れなかった。同図においてレーン3およびレーン16の
ように、レーン2およびレーン15の抽出物にカノクラ
ビンを重打ちしたものには、カノクラビンが検出された
レーンと同様に、カノクラビンのスポットが確認され
た。
m sp. FERM P−17672を含む寄託菌
が、感染・共生した植物体内でカノクラビンを特異に生
合成するとともに蓄積していることが明らかになった。
またこのことから、カノクラビンの生合成および蓄積の
有無をマーカーとして、植物に感染・共生している菌を
スクリーニングすることが可能であることが証明され
た。
FERM P−17672を含む寄託菌を感染・共生さ
せた植物の後代種子から生育した植物であって、エンド
ファイトの伝播が確認されたものについても、カノクラ
ビンの有無をTLC分析で確認した。その結果後代の植
物体においても、もとの植物体と同様にカノクラビンの
生合成が行なわれていることが示された。
生合成する菌のスクリーニング方法。
ンが生合成された植物体からエンドファイト、例えばN
eotyphodium sp. FERM P−17
672を分離した。分離はエンドファイト感染植物の葉
および葉鞘組織を70%エタノール水溶液に10秒間浸
漬し、次いで2.5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に1
0分間浸漬した後に、滅菌水で3回洗滌し、5mm角の
大きさに切断し、エンドファイト分離培地上に置床し、
25℃暗条件下で培養を行なった。
ース アガー)にペニシリンおよびストレプトマイシン
をそれぞれ100mg/lを添加し、直径が9cmのプ
ラスチックシャーレに20mlずつ分注して使用した。
が分離された。さらに増殖させるために液体培地により
培養した。使用した培地は例えばPD(ポテト デキス
トロース)培地、M102培地、エルゴットアルカロイ
ド生産培地としても知られているSM培地等である。上
述の培地100mlにPDA培地で分離した菌糸塊5m
m角を入れ、2週間から長いもので6カ月間培養した。
植物体と同様に培養物をフリーズドライ処理し、クロロ
ホルム/メタノール/25%アンモニア水=75/25
/0.5の溶液に入れ、室温で一昼夜撹拌抽出し、その
後瀘紙にて瀘過してエバポレートし、TLC分析を行な
った。
レート、クロロホルム/メタノール/酢酸/水=20/
10/1/1の展開溶液により展開した後に、Rf値が
0.5〜0.6付近にUVおよびEherlich呈色
(青紫色に呈色)で検出されるスポットが上記と同様
に、TLC分析によって確認され、カノクラビンを生合
成していることが証明された。
えば生工研寄託菌FERM P−17672、FERM
P−17673、FERM P−17674感染・共
生植物、および非感染個体の葉および葉鞘部分を80%
メタノール水溶液を用いて室温で30分以上振とう抽出
した。抽出液を瀘紙にて瀘過し、その瀘液を80%メタ
ノール水溶液でサスペンドした陰イオン交換樹脂(AG
2×8200〜400mesh)を充填し、25%アン
モニア水で置換したVARIAN BOND ELUT
CBAカラムに載せ、純水で洗滌した。そして5%ぎ
酸溶液によって溶出し、得られた分画をTLC(薄層ク
ロマトグラフィ)分析およびHPLC(高速液体クロマ
トグラフィ)分析に供した。
article size、100×8mm)、UV2
80nm 検出を用いたHPLCで分析した結果、エン
ドファイト感染植物から得られた分画のみに、図7に示
すようにリテンションタイム12分付近に特異的に顕著
なピークが確認されている。なおエンドファイトに感染
していない植物の場合は、図6に示すようにこのような
ピークが確認されていない。
ム/メタノール/酢酸/水=20/10/1/1の展開
溶液により展開した後に、Rf値0.5〜0.6付近に
UVおよびEherlich呈色(青紫色に呈色)で検
出されるスポットがTLC分析によって確認された。T
LCで確認されたスポットもエンドファイト感染植物体
特異なものであって、非感染個体にはこのスポットは見
られなかった。
なった。その結果、フリーズドライサンプルから平均し
て0.06〜0.08%の回収率で回収することができ
た。このフラクションはHPLCの蛍光検出による分析
でも陽性を示し、インドール構造を持つことが示唆され
た。そこでNMR、MSおよびIR(赤外線分析法)を
測定した。
法)の結果、M+ 256が観測され、EI−MSによ
るフラグメントイオンは分子ピークの256の他に、−
H3O+ のm/z237、tricyclic st
able ion に起因するm/z155、154等
クラビンアルカロイドに特徴的な解裂パターンを示し
た。またEI−HR−MSから示唆された分子式から検
索を行なったところ、カノクラビンが分子式、EIによ
るフラグメンテーションパターンともによく一致するこ
とが解った。さらにNMR測定結果を図2のように帰属
し、単離したフラクションはカノクラビンと同定した。
IRでは3400(−OH)、1605(C=C)、1
420、1380cm−1に吸収を示した。
あるエンドファイトがエルゴバリンを生産するかどうか
を確認するものである。まずフリーズドライ処理したエ
ンドファイト感染・共生植物体の葉および葉鞘部分、ま
たは穂の部分を0.01N水酸化ナトリウム水溶液:ク
ロロホルム=1:9の混合液を用い、室温で30分以上
振とう抽出した。抽出液を瀘紙にて瀘過した。ここでク
ロロホルムでコンディショニングしたシリカゲルカラム
(Water Sep−PakPlas Silic
a)に瀘液を載せ、クロロホルムで洗滌した。そしてア
セトン:クロロホルム:酢酸=80:20:0.05の
混合液で溶出した。その溶出液を濃縮乾燥固化させ、
0.1%アスコルビン酸含有33%メタノール水溶液に
再溶出し、HPLC(高速液体クロマトグラフィ)分析
に供した。
particle size, 4.6X75mm)、
Ex(励起波長)310nm、Em(蛍光波長)415
nm蛍光検出を用いた。エルゴバリンの標品である酒石
酸エルゴバリンをHPLC分析した結果、図8に示すよ
うに、リテンションタイム12分付近にエルゴバリンの
ピークが確認された。すなわち標品エルゴバリンの場合
には、リテンションタイム12.35のピークを示すこ
とになる。
生合成の有無は、エンドファイト感染植物から上記の方
法で得られた溶出液に、HPLC分析で標品と同様なリ
テンションタイム12分付近にピークが確認されるかど
うかで判断した。その結果、寄託菌以外のエンドファイ
ト感染植物では、図9に示すように、リテンションタイ
ム12分付近にエルゴバリンが約1ppm(乾燥重量当
り)オーダーで検出された。すなわち寄託菌以外のエン
ドファイト感染植物においては、標品エルゴバリンと同
様なリテンションタイム付近、すなわち12.51にピ
ークがあり、これがエルゴバリンであることを確認し
た。なおここで濃度は乾燥重量当り約1ppmであっ
た。
−17672の寄託菌が感染したエンドファイト感染植
物を用い、上記と同様の方法によってHPLC分析を行
なったところ、図10に示すようにエルゴバリンが検出
されなかった。すなわちFERM P−17672の寄
託菌が感染した感染植物体においては、リテンションタ
イム12分付近に全くピークがなく、エルゴバリンが生
産されないことが確認された。よって以上の結果から、
FERM P−17672に感染した植物体は、家畜毒
性物質であるエルゴバリンを生合成していないことが明
白になった。FERM P−17673、FERM P
−17674においても同様の結果が得られた。
P−17672を上述の方法で感染・共生させたPoa
属植物および寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物
を用いて、芝草の主要害虫であるスジキリヨトウに対す
る耐虫性検定を行なった。
置した9cmシャーレに、ふ化直後のスジキリヨトウの
幼虫を約200匹放ち、25℃の室内に静置し、24時
間後、48時間後にそれぞれ摂食程度を調査した。48
時間後には寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体
はほとんど食害されたのに対して、Neotyphod
ium sp. FERM P−17672を感染・共
生させた植物体は、ほとんど葉が残って強い抵抗性を示
していた。PoaおよびLoliumについての結果が
図11および図12にそれぞれ示される。
p. FERM P−17672を上記の方法で感染・
共生させたLolium属植物および寄託菌以外の菌株
を感染・共生させた同じ植物を用いて、芝草の主要害虫
であるスジキリヨトウに対する耐虫性検定を上述のPo
a属の植物と同様に行なった。
の摂食程度を調査したところ、上記Poa属植物と全く
同様に、寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体は
ほとんど食害されたのに対して、Neotyphodi
um sp. FERM P−17672を感染・共生
させた植物体は、ほとんど葉が残り、強い抵抗性を示し
た。
M P−17673、FERM P−17674を用い
た場合も同様であった。
P−17672、FERM P−17673、FER
M P−17674は感染・共生させた植物体に強度な
耐虫性を付与する特性があることが表1に示すように確
認された。
イトを上記実施例1の(7)項のスクリーニング方法に
よってスクリーニングし、カノクラビンが生合成され、
しかも最終的な代謝物質がカノクラビンであるエンドフ
ァイトを選抜している。そしてこのようにしてスクリー
ニングされた共生菌を上記実施例1の(4)項の方法に
よって上記実施例1と同様の植物、すなわちイネ科のA
grostis、Festuca、Poa、Loliu
mのそれぞれの植物に感染させたものである。感染させ
た植物について、実施例1の(6)項の方法によってス
クリーニングを行なったところ、カノクラビンを最終的
な代謝物質とする共生菌が感染・共生されていることが
確認された。またこのような植物について、実施例1の
(10)項の方法によって耐虫性の検定を行なったとこ
ろ、実施例1とほぼ同様の結果が得られている。
共生菌であって、最終的な代謝物質がカノクラビンであ
る共生菌、およびこのような共生菌が人工的に導入され
た植物、および植物に対する共生菌の導入方法に関する
ものである。
人工的に感染・共生された植物がエルゴバリン等のエル
ゴットアルカロイドおよびロリトレムB等の毒性物質を
生合成することがなく、このために牧草に応用した場合
に家畜毒性を生ずることがなくなる。従ってライグラス
スラッガーやフェスクトキシコーシスの発生を未然に防
止することが可能になる。しかも感染・共生されたエン
ドファイトによってとくに虫に対して強度な抵抗性を示
すことになり、耐虫性に優れるとともに家畜毒性をもた
ない植物体が提供されることになる。
ートである。
び解析図である。
び解析図である。
ラフである。
ラフである。
ラフである。
ラフである。
グラフである。
Claims (14)
- 【請求項1】糸状菌から成る共生菌において、最終的な
代謝物質がカノクラビンであることを特徴とする共生
菌。 - 【請求項2】共生菌がNeotyphodium属であ
る請求項1に記載の共生菌。 - 【請求項3】共生菌が生工研寄託番号FERM P−1
7672、FERM P−17673、FERM P−
17674の内の何れか1種または2種以上の菌である
ことを特徴とする請求項1または請求項2に記載の共生
菌。 - 【請求項4】カノクラビンをマーカーとして最終的な代
謝物質がカノクラビンである共生菌をスクリーニングす
ることを特徴とする共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項5】カノクラビンをマーカーとして、薄層クロ
マトグラフィによってスクリーニングすることを特徴と
する請求項4に記載の共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項6】カノクラビンをマーカーとして、液体クロ
マトグラフィによってスクリーニングすることを特徴と
する請求項4に記載の共生菌のスクリーニング方法。 - 【請求項7】最終的な代謝物質がカノクラビンである共
生菌を人工的に導入した植物。 - 【請求項8】共生菌がNeotyphodium属の糸
状菌であることを特徴とする請求項7に記載の植物。 - 【請求項9】共生菌を人工的に導入した植物がイネ科植
物であって、Agrostis、Festuca、Po
a、Loliumの何れかであることを特徴とする請求
項7または請求項8に記載の植物。 - 【請求項10】請求項7〜請求項9の何れかの植物から
採取された後代種子。 - 【請求項11】請求項10の種子から生育した植物。
- 【請求項12】請求項7〜請求項11の植物または種子
を交配親とする交雑植物。 - 【請求項13】天然に存在する植物体から共生菌を分離
する工程と、 分離された共生菌を人工培養する工程と、 培養された共生菌を対象とする植物に導入する工程と、 導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、 感染された共生菌中の最終代謝物質がカノクラビンであ
る植物体を選抜する工程と、 を具備する植物体への共生菌の導入方法。 - 【請求項14】天然に存在する植物体中から共生菌を分
離する工程と、 分離された共生菌を人工培養する工程と、 培養された共生菌から最終代謝物質がカノクラビンであ
る共生菌を選抜する工程と、 選抜された共生菌を対象とする植物に導入する工程と、 導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、 を具備する植物体への共生菌の導入方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61502373A (ja) * | 1984-06-01 | 1986-10-23 | シエ−リング アクチエンゲゼルシヤフト | カノクラビンの製法 |
JPH1098924A (ja) * | 1996-09-27 | 1998-04-21 | Iseki & Co Ltd | 苗植付装置 |
JPH10271930A (ja) * | 1997-03-28 | 1998-10-13 | Nippon Shiryo Sakumotsu Shiyushi Kyokai | フェスクおよびフェスクへの共生菌の導入方法 |
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JPH10271930A (ja) * | 1997-03-28 | 1998-10-13 | Nippon Shiryo Sakumotsu Shiyushi Kyokai | フェスクおよびフェスクへの共生菌の導入方法 |
JPH11302112A (ja) * | 1998-04-23 | 1999-11-02 | Kumiai Chem Ind Co Ltd | 植物生長調節剤組成物 |
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